SK286819B6 - Izolovaný polynukleotid, izolovaný C5-epimerázový polypeptid, spôsob produkcie proteínu a spôsob zvýšenia aktivity C5-epimerázy - Google Patents

Abstract

Je opísaný izolovaný polynukeotid, ktorý obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň z 95 % zhodná s referenčnou aminokyselinovou sekvenciou skladajúcou sa z aminokyselín 1 až 618 zo SEQ ID NO:1, ďalej sú opísané vektor a hostiteľská bunka a spôsob produkcie proteínu kultiváciou hostiteľskej bunky v podmienkach, za ktorých sa exprimuje tento proteín.

Description

Predložený vynález sa týka rekombinantných proteínov, predovšetkým glukuronyl-C5-epimerázy, a ich použitia na modifikáciu glukosaminoglykánov.

Doterajší stav techniky

Glukuronyl-C5-epimeráza (ďalej „C5-epimeráza“) katalyzuje premenu D-glukurónovej kyseliny (GlcA) na L-idurónovú kyselinu (IdoA) v druhom kroku modifikácie polyméru pri heparínovej/heparinsulfátovej (HS) syntéze. Epimeráza podieľajúca sa na heparinovej/HS syntéze bezpodmienečne vyžaduje .V-sulíát na neredukujúcej strane cieľovej HexA, ktorej tvorba je katalyzovaná A-deacetylázou-N-sulfotransferázou (NDST) v prvom (predchádzajúcom) kroku biosyntetickej modifikácie polyméru. Epimeráza je tiež inhibovaná O-sulfátovými skupinami blízko svojho miesta účinku a to tak, že neskoršie O-sulfatačné kroky pri biosyntetickej dráhe heparínu inhibujú epimerizáciu alebo spätnú epimerizáciu. Reakcia zahrnuje reverzibilné odobratie a readíciu protónu v polohe C5 cieľovej hexurónovej kyseliny cez karbaniónový medziprodukt a predpokladá sa, že na tomto mechanizme sa podieľajú dve polyprotické základné aminokyseliny (predovšetkým Lys).

C5-epimeráza, rovnako ako ďalšie enzýmy podieľajúce sa na heparínovej/HS biosyntéze je viazaná na membránu alebo asociovaná s Golgiho aparátom. Rozpustená epimeráza katalyzuje obe (reverzibilné) reakcie, ale spätná epimerizácia nebola pri mikrosomálnych frakciách detegovaná. Aktívny proteín C5-epimerázy bol najskôr purifikovaný a charakterizovaný z pečene (Campbell et al., J. Biol. Chem.269:26953-26958 (1994)).

Campbell, P. et al. publikovali purifikáciu D-glukuronyl-C5-epimerázy z hovädzích pečení (Campbell et al., J. Biol. Chem.269:26953-26958 (1994)) a ďalej bolo publikovaných niekoľko DNA-sekvencií. Aj keď predpokladaná veľkosť hovädzej C5-epimerázy z genómovej sekvencie a cDNA-sekvencií je 70,1 KD (618 aminokyselín) (pozri nižšie), najlepšie purifikovaný natívny preparát extrahovaný uvedeným spôsobom mal prevažne 52 a 20 kDa, čo znamená, že môže dochádzať k proteolytickému štiepeniu (úprave). Detegovaním aktivity frakcií s väčšími molekulovými hmotnosťami (200 kDa) pri gélovej chromatografii sa ukázalo, že by mohlo dochádzať k agregácii alebo oligomerizácii. Enzým je aktívny v širokom rozmedzí pH (6,5-7,5), pričom optimum je 7,4. Enzým nevyžaduje ión kovu alebo iný kofaktor. Podľa kinetických štúdií so vzrastajúcou koncentráciou enzýmu vzrastá hodnota K_m, čo pravdepodobne súvisí s polymémym substrátom a priestorovou bariérou a/alebo oligomerizáciou molekúl epimerázy.

Nedávno Lindahl U. a Li, J-P., W098/480006, purifikovali 52 kDa C5-epimerázu z hovädzích pečení a získali čiastočnú aminokyselínovú sekvenciu. Priméry boli pripravené oproti vnútornej sekvencii a používané na amplifikáciu sekvencie z cDNA-preparátu z hovädzích pečeni. Sekvencia z hovädzích pečení slúžila na skréning hovädzej pľúcnej knižnice cDNA. Bola nájdená sekvencia majúca otvorený čítací rámec zo 444 aminokyselín, ktorá zodpovedala polypeptidu s 49,9 kDa. Bolo konštatované, že enzým skôr izolovaný z hovädzích pečení bol skrátenou verziou natívneho proteínu. Bola analyzovaná celková RNA mastocytómu z hovädzích pečeni a pľúc a myšieho mastocytómu hybridizáciou s cDNA-klonom hovädzej pľúcnej epimerázy. SRNA z hovädzích pľúc a pečení bolo dosiahnuté rovnakých výsledkov, pričom dominantný transkript mal pás 9 kb a slabý pás 5 kb. RNA z myšieho mastocytómu mala len transkript pri 5 kb.

V publikácii Li et al. J. Biol. Chem. 272: 28158-28163 (1997) bolo tiež spomenuté klonovanie cDNA kódujúce hovädziu pľúcnu C5-epimerázu. Li et al. klonovali a exprimovali hovädziu pľúcnu epimerázu v systéme bakulovírovus/hmyzie bunky, čím sa prvýkrát určila aktivita klonovanej (rekombinantnej) sekvencie. Aktívny rekombinantný proteín nebol ku konečnému určeniu purifikovaný.

Boli publikované cDNA-sekvencie C5-epimerázy z Drosophila (GenBank Accession Number AAF57373). C. elegans (GenBank Accession Number P46555) a Methanococcus (GenBank Accession Number U67555).

Enzymatická aktivita rekombinantnej hovädzej epimerázy publikovaná Lindhalom et al. bola relatívne nízka. Predsa však pokusy exprimovať hovädziu pľúcnu C5-epimerázu, čo je jediná klonovaná epimeráza cicavcov, v systémoch, v ktorých by bola možná lepšia produkcia, zlyhali. Boli uskutočnené pokusy o expresiu v bunkách cicavcoch, Saccharomyces cerevisiae a E. coli. Dodnes nebola publikovaná žiadna úspešná produkcia rozpustnej, aktívnej C5-epimerázy. Teda nebolo možné rozšíriť výsledky dosiahnuté s prvotným systémom bakulovírus/hmyzie bunky na ďalšie rekombinantné systémy alebo nebolo možné použiť štandardné metódy expresie, napr. cicavčie, kvasinkové alebo bakteriálne systémy, na expresiu tohto enzýmu.

Teda tu existuje potreba po vysoko aktívnej C5-epimeráze a spôsoboch jej prípravy vo väčších množstvách.

Podstata vynálezu

Kvôli problémom pri expresii rekombinantných epimeráz cicavčieho pôvodu a vďaka potrebe mať použiteľný spôsob expresie a produkcie použiteľných množstiev C5-epimerázy, zamerali sa pôvodcovia na výskum spôsobov produkcie rekombinantnej C5-epimerázy. Štúdie vyvrcholili objavom nového myšieho génu a ním kódovaného myšieho C5-epimerázového proteínu. Myšia C5-epimeráza podľa predloženého vynálezu je okrem iného unikátna tým, že v porovnaní so sekvenciou C5-epimerázového proteínu podľa doterajšej techniky obsahuje ďalšie sekvencie na svojom N-konci. Bolo prekvapivo zistené, že fúzia N-konconvého fragmentu z myšej C5-epimerázy alebo jej skrátenej verzie, s N-koncom iných C5-epimeráz veľmi zvyšuje aktivitu tejto vniknutej rekombinantnej C5-epimerázy o niekoľko rádov. Teda predĺženie o myší N-koncový fragment môže byť používané na uľahčenie expresie sekvencií, ktoré sú k nemu funkčne pripojené, a predovšetkým potom k expresii natívnych (z myších pečení) a heterológnych (nemyších aj myších nehepatických) foriem C5-epimeráz v rekombinantných systémoch.

V prvom uskutočnení sa vynález týka izolovaného polynukleotidu, ktorý obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň z 95 % zhodná s referenčnou aminokyselinovou sekvenciou skladajúcou sa z aminokyselín 1 až 618 zo SEQ ID NO:1.

V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka izolovaného C5-epimerázového polypeptidu, ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň z 95 % zhodná so sekvenciou skladajúcou sa z aminokyselín 1 až 618 zo SEQ ID NO:1.

Ďalej sa opisuje vektor, ktorý obsahuje izolovaný polynukleotid a hostiteľská bunka obsahujúca tento vektor.

V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu produkcie proteínu, v ktorom sa kultivuje hostiteľská bunka za takých podmienok, v ktorých je uvedený proteín exprimovaný, a získa sa uvedený proteín.

V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka polynukleotidov, predovšetkým purifíkovaných a/alebo izolovaných polynukleotidov, kódujúcich fúzny proteín, kde taký fúzny proteín obsahujúci N-koncovú sekvenciu myšej C5-epimerázy je v rámci funkčne pripojený na aminokyselinovú sekvenciu požadovaného proteínu, a predovšetkým potom sekvenciu heterológnej C5-epimerázy, a vektorov a hostiteľov pre prechovávanie a expresiu takých polynukleotidov.

V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka izolovaného C5-epimerázového polypeptidu, ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň z 95 % zhodná so sekvenciou skladajúcou sa z aminokyselín 1 až 618 zo SEQ ID NO:1.

V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu produkcie požadovaného proteínu pomocou funkčného pripojenia polynukleotidu, ktorý kóduje myšiu C5-epimerázu alebo jej N-koncovú sekvenciu, k polynukleotidu, ktorý kóduje požadovaný proteín, a jeho expresiu v rekombinantnom hostiteľovi podľa predloženého vynálezu.

V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka polynukleotidových sekvencií a vektorov, ktoré poskytujú polynukleotidy kódujúce polynukleotidovú sekvenciu N-koncového fragmentu myšej C5-epimerázy, napr. polynukleotidy a vektoroy majúce požadované reštrikčné miesta na 3'-konci fragmentu pre inzerciu (pripojenie) požadovanej sekvencie do týchto miest, predovšetkým potom sekvencie, ktoré kóduje požadovaný proteín a najvýhodnejšie ďalšiu epimerázovú sekvenciu.

V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu použitia N-koncovej sekvencie z myšej C5-epimerázy na expresiu natívnych a heterológnych sekvencií k nej pripojených. Bol klonovaný gén z myších pečení kódujúci C5-epimerázu. Nukleotidová sekvencia je uvedená na obrázku 2. Bolo zistené, že aminokyselinová sekvencia C5-epimerázového proteínu z myších pečení má 618 aminokyselín (obrázok 3), molekulovú hmotnosť 71 180,1 daltonov (71,18 kDa). Myšia C5-epimeráza má izoelektrický bod 8,25 a výsledný náboj pri pH 7 +4,01.

Aminokyselinová sekvencia z C5-epimerázovej sekvencie z myších pečeni je bez akejkoľvek N-koncovej extenzie homológna (>96 % zhoda aminokyselín) so sekvenciou z hovädzej C5-epimerázy. Predsa však sekvenčná analýza odhalila, že N-koniec enzýmu, ktorý je kódovaný myšou génomickou sekvenciou obsahoval ďalších 154 aminokyselín (aa), ktoré chýbali pri klonovanej hovädzej sekvencií.

Myšia kódujúca sekvencia mala > 95 % zhodu peptidov so zodpovedajúcimi hovädzími a ľudskými (exprimovaná sekvenčná značka z mozgovej cDNA-knižnice) sekvenciami, > 50 % podobnosť s hypotetickým 71,9 kDa proteínom z exprimovanej sekvencie C.elegans a 38 % podobnosť sproteínom z exprimovanej sekvencie z Methanococcus sp.

Predpokladaná transmembránová topológia (grafické znázornenie hydrofobicidy) myšej C5-epimerázy sa podobá NDST. Tieto a ďalšie pozorovania (napr. rýchlosť syntézy heparínu) ukazovali, že C5-epimeráza a ďalšie enzýmy heparínovej biosyntézy sú pravdepodobne spojené v in vivo komplexe.

Rekombinantná myšia C5-epimeráza, ako je exprimovaná a sekrétovaná na signál z myších buniek zo systému bakulovírus/hmyzej bunky, je najstabilnejšia v médiu pri teplote 4 °C. Purifikácia rekombinantnej

SK 286819 Β6

C5-epimerázy môže zahrnovať, ale nie je to nijak limitované, také procesy ako katexovú a afmitnú chromatografiu. Rekombinantný proteín môže byť skonštruovaný napr. takým spôsobom, aby obsahoval FLAGznačku alebo HIS-značku, ktorá sa vyskytuje tiež na konci rekombinantného proteínu. Ako iste odborník v odbore v takýchto prípadoch ocení, môže byť rekombinantný proteín purifikovaný na komerčne dostupných živiciach, ktoré využívajú napríklad monoklonálne protilátky anti-FLAG na zachytenie rekombinantného proteínu obsahujúceho FLAG-epitop.

Enzým sa najrýchlejšie stanoví bifázickou extraxiou trítia uvoľňovaného z C5-značeného substrátu do organického scintilačného kokteilu a zmeraním tejto aktivity, aj keď konečný výsledok, ako je opísané v príkladoch, je získaný NMR analýzou konvertovaného produktu.

Natívny enzým z myších pečení mal špecifickú aktivitu 5-10 x 10⁹ cpm/mg/h, zatiaľ čo špecifická aktivita rekombinantnej formy myšieho enzýmu bola 2 x 10⁹ cpm/mg/h. Na porovnanie, rekombinantný hovädzí enzým má špecifickú aktivitu 0,5-1,0 x 10⁶ cpm/mg/h. Teda rekombinantný myší enzým je veľmi aktívna myšia C5-epimeráza.

Prekvapivo bolo zistené, že 154 aminokyselinový koniec myšej C5-epimerázy, a predovšetkým potom určité jeho fragment}', má schopnosť veľmi ochotne zvyšovať enzymatickú aktivitu C5-epimerázy iných C5-epimeráz, pokiaľ sú kondezované v rámci s jej N-koncom. Zdá sa, že tento ďalší 154 aminokyselinový fragment (aa) má aspoň tri charakteristické rysy, ktoré sú žiaduce pre rekombinantnú expresiu a sekréciu aktívnej C5-epimerázy. Prvý charakteristický rys zahrnuje sekvenciu, ktorá najskôr funguje ako signálna sekvencia zložená z prvých 33 až 34 zostatkov (aminokyseliny 1 až 33 alebo 1 až 34 zo SEQ ID NO:1). Druhý charakteristický rys pozostáva v prítomnosti ďalších cysteínových zostatkov, ktoré sú zodpovedné za tvorbu disulfidových mostíkov a stabilizáciu sekundárnej štruktúry proteínu. Tretí charakteristický rys pozostáva v mieste amidácie, ktoré je zhodné s miestom na posttranslačnú proteolytickú úpravu.

Fragmenty zo 154 aminokyselinovej sekvencie, ktoré nemajú signálnu sekvenciu, si zachovávajú schopnosť zvyšovať aktivitu hetrológnych epimeráz, predovšetkým potom C5-epimeráz, ku ktorým sú funkčne pripojené. Napríklad, ako je uvedené v príkladoch, fúzny proteín, ktorý obsahoval aminokyseliny 34 až 154 priamo pripojené v rámci s N-koncom hovädzej C5-epimerázy, zvyšoval aktivitu hovädzej C5-epimerázy stonásobne.

Molekuly nukleovej kyseliny

Predložený vynález rieši izolované molekuly nukleovej kyseliny pozostávajúce z:

(1) polynukleotidu kódujúceho C5-epimerázový polypeptid z myších pečaminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO:1, (2) polynukleotid kódujúci použiteľné fragmenty C5-epimerázového polypeptidu z myších pečení majúcich aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO:1, kde tieto použiteľné fragmenty zahrnujú, ale nie je to nijak limitované, (a) fragmenty, ktoré poskytujú signálnu sekvenciu aminokyselín 1 až 33 alebo 1 až 34: (b) fragmenty, ktoré poskytujú materskú sekvenciu C5-epimerázového proteínu z myších pečení, a predovšetkým potom aminokyseliny 33 až 618 alebo 34 až 618, a (c) fragmenty, ktoré poskytujú sekvenciu N-koncového fragmentu stimulujúce aktivitu, ktorá obsahuje aminokyseliny 1 až 154, a vrátane ich fragmentov, napr. aminokyseliny 33 až 154 alebo 34 až 154, ktoré majú schopnosť zvyšovať aktivitu iných C5-epimeráz, na ktoré sú funkčne pripojené.

Ak nie je uvedené inak, všetky uvedené nukleotidové sekvencie stanovené sekvenovaním molekuly DNA boli určené podľa spôsobov opísaných v príkladoch a ďalej všetky uvedené aminokyselinové sekvencie polypeptidov kódovaných molekulami DNA boli predikované transláciou zhora určenej DNA-sekvencie. Ktorákoľvek nukleotidová sekvencia môže obsahovať chyby. Automaticky určené nukleotidové sekvencie sú typicky aspoň z 90 % zhodné, typickejšie aspoň z 95 % až 99,9 % zhodné, so skutočnou nukleotidovou sekvenciou sekventované molekuly DNA. Skutočná sekvencia môže byť určená presnejšie inými spôsobmi, vrátane manuálnych sekvenčných metód DNA, ktoré sú v odbore dobre známe. Ďalej sa vie, že jednoduchá inzercia alebo delécia v určenej nukleotidovej sekvencii v porovnaní so skutočnou sekvenciou bude spôsobovať posun čítacieho rámca v translácii nukleotidovej sekvencie takým spôsobom, že predpokladaná aminokyselinová sekvencia kódovaná určenou nukleotidovou sekvenciou bude od miesta tejto inzercie alebo delácie celkom iná, než aminokyselinová sekvencia skutočne kódovaná sekvenovanou molekulou DNA.

Termín „nukleotidová sekvencia“ molekuly nukleovej kyseliny alebo polynukleotidu zahrnuje molekulu DNA alebo polynukleotid, sekvenciu deoxyribonukleotidov, molekulu RNA alebo polynukleotid, zodpovedajúci sekvencii ribonukleotidov (A, G, C a U), kde každý tiamidínový deoxyribonukleotid (T) v špecifikovanej deoxyribonukleotidovej sekvencii je nahradený uridínovým ribonukleotidom (U).

Podľa informácií uvedených v predloženom vynáleze, napr. nukleotidová sekvencia uvedená na obrázkoch a dát zo sekvenčnej analýzy, môže byť molekula nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu kódujúceho C5-epimerázový polypeptid alebo jeho chimérický konštrukt, získaná štandardnými metódami klonovania a skríningu, napr. metódami na klonovanie cDNA pomocou mRNA ako východiskového materiálu.

SK 286819 Β6

Názorným príkladom predloženého vynálezu je molekula nukleovej kyseliny C5-epimerázy opísaná na obrázkoch 2 a 3, ktorá bola objavená v cDNA-knižnici získanej z myšieho hepatického (pečeňového) tkaniva.

Určená nukleotidová sekvencia DNA C5-epimerázy z obrázka 2 obsahuje otvorený čítací rámec kódujúci proteín so 618 aminokyselinovými zostatkami, kde iniciačný kodón v nukleotidovej pozícii 1 nukleotidových sekvencií je rovnako uvedený na obrázku 2.

Ako iste odborník v odbore ocení, vďaka možnosti opisovaných sekvenčných chýb, môže byť skutočný kompletný C5-epimerázový polypeptid kódovný sekvenciou z obrázka 2, ktorý zahrnuje 618 aminokyselín uvedených v SEQ ID NO:1, niekedy dlhší alebo kratší. Ale v každom prípade, ako je uvedené, poskytuje predložený vynález polypeptidy majúce rôzne zostatky vynechané z N-konca alebo C-konca kompletného polypeptidu, vrátane polypeptidov postrádajúcich jednu alebo viacej aminokyselín z N-konca alebo C-konca tu opísanej extracelulárnej domény.

Molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu kódujú signálnu sekvenciu C5-epimerázy uvedenú v SEQ ID NO:1, čo sú aminokyseliny 1 až 33 alebo aminokyseliny 1 až 34 z aminokyselinovej sekvencie uvedenej na obrázku 3. Tieto molekuly môžu byť funkčne pripojené v rámci k akejkoľvek požadovanej nukleotidovej sekvencii, predovšetkým potom molekuly, ktoré kódujú žiadaný proteín, ktorý je treba sekrétovať z hostiteľa schopného sekrécie takej signálnej sekvencie C5-epimerázy.

Ďalej molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu kódujú C5-epimerázovú sekvenciu z myších pečení „zvyšujúcich heterológnu aktivitu“, čo sú aminokyseliny 1 až 154 alebo aspoň 30 aminokyselín z nich, ktoré sú uvedené na obrázku 3. Termín „heterológna“ nukleová kyselina, ako je známe odborníkom v odbore, znamená nukleovú kyselinu odvodenú od nukleovej kyseliny rôznych druhov. Výhodne také molekuly nukleovej kyseliny kódujú aminokyseliny 1 až 154, 33 až 154 alebo 34 až 154 zo SEQ ID NO:1, bez alebo s 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 alebo 10 aminokyselinami buď z jedného, alebo oboch koncov. Nukleová kyselina kódujúca taký polypeptid môže byť funkčne pripojená v rámci na kódujúcu sekvenciu pre ďalšiu epimerázu, predovšetkým potom ďalšie C5-epimerázy, s tým, že fúzny proteín je kódovaný konštruktom nukleovej kyseliny. Vo výhodnom uskutočnení sú sekvencie zvyšujúce heterológnu aktivitu exprimované na N-konci fúzneho proteinu a sú pripojené k N-koncu ďalšieho proteínu, ktorého aktivita je zvýšená prítomnosťou myšej sekvencie, najlepšie nemyšia C5-epimeráza alebo izozým myšej C5-epimerázy.

Ako je uvedené, môžu byť molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu vo forme RNA, napr. mRNA alebo vo forme DNA, vrátane napr. cDNA a genómickej DNA získanej klonovaním alebo pripravené synteticky. DNA môže byť dvojreťazcová alebo jednoreťazcová. Jednoreťazcová DNA alebo RNA môže byť kódujúci reťazec, tiež známy ako DNA-reťazec majúci zmysel alebo môže byť nekódujúci DNA-reťazec, tiež označovaný ako kódujúci DNA-reťazec.

Termín „izolovaná“ molekula(y) nukleovej kyseliny zahrnuje molekulu nukleovej kyseliny, DNA alebo RNA, ktorá bola odstránená zo svojho prirodzeného prostredia. Na účely predloženého vynálezu, sú napr. molekuly rekombinantnej DNA obsiahnuté vo vektore izolované. Ďalšie príklady izolovaných molekúl DNA zahrnujú molekuly rekombinantnej DNA prechovávané v heterológnych hostiteľských bunkách alebo purifikované molekuly DNA (čiastočne alebo podstatne) v roztoku. Izolované molekulu RNA zahrnujú in vivo alebo in vitro RNA transkripty molekúl DNA podľa predloženého vynálezu. Izolované molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu ďalej zahrnujú molekulu nukleovej kyseliny pripravenej syntetickým spôsobom.

Izolované molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu zahrnujú molekuly DNA obsahujúce otvorený čítací rámec (ORF), ktorý kóduje C5-epimerázový proteín alebo fúzny proteín podľa predloženého vynálezu. Molekuly DNA, ktoré obsahujú kódujúcu sekvenciu pre C5-epimerázový proteín z obrázka 2 alebo jej požadované fragmenty, a molekuly DNA, ktoré v dôsledku degenerácie genetického kódu obsahujú sekvencie podstatne odlišné od opísaných sekvencií, stále kódujú aminokyselinovú sekvenciu C5-epimerázového proteínu zo SEQ ID NO:1. Genetický kód sám o sebe je v odbore dobre známy. Takže by malo byť pre odborníka v odbore rutinou vytvoriť takéto degenerované varianty. V ďalšom uskutočnení zahrnujú molekuly nukleovej kyseliny také molekuly, ktoré kódujú opísaný C5-epimerázový polypeptid, ale nemajú N-koncový metionín alebo signálnu sekvenciu kódovanú aminokyselinami 1 až 33 alebo 1 až 34 zo SEQ ID NO:1, alebo ktoré majú kódujúce sekvencie z rôznych (heterológnych) signálnych sekvencii na seba funkčne pripojené.

Predložený vynález ďalej poskytuje okrem opísaných molekúl nukleové kyseliny, tiež molekuly nukleovej kyseliny majúce sekvencie komplementárne k uvedeným sekvenciám. Tieto izolované molekuly, predovšetkým molekuly DNA, sú použiteľné ako sondy na génové mapovanie in situ hybridizáciou s chromozómami a na detekciu expresie génu C5-epimerázy v rôznych spéciách a tkanivách, napr. Northem blotting.

Predložený vynález ďalej rieši fragmenty izolovaných molekúl tu opísanej nukleovej kyseliny, ktoré si uchovávajú požadované vlastnosti alebo ktoré kódujú polypeptid, ktorý si zachováva požadované vlastnosti alebo aktivitu. Termín „fragment“ izolovanej opísanej molekuly nukleovej kyseliny zahrnuje fragmenty s dĺžkou aspoň 15 nukleotidov (nt), výhodnejšie aspoň 20 nt, ešte výhodnejšie aspoň 30 nt, a ešte výhodnej šie aspoň 40 nt, ktoré sú použiteľné ako opísané diagnostické sondy a priméry alebo ktoré poskytujú požadovaný motív alebo domény pre konštrukt fúzneho proteínu. Samozrejme, že väčšie fragmenty s veľkosťou 50 až 300 nt alebo 600 nt sú tiež podľa predloženého vynálezu rovnako tak použiteľné ako fragmenty zodpovedajúce väčšine fragmentov, pokiaľ nie všetkým, z nukleotidovej sekvencie DNA uvedené na obrázku 2 alebo kódujúce aminokyselinové sekvencie zo SEQ ID NO:1. Termín fragment s veľkosťou aspoň 20 nt, pokiaľ je porovnaný napr. s fragmentom z obrázka 2, zahrnuje fragmenty, ktoré obsahujú 20 alebo viacej za sebou idúcich báz nukleotidovej sekvencie z nukleotidovej sekvencie uvedenej na obrázku 2.

Predovšetkým predložený vynález rieši polynukleotidy majúce nukleotidovú sekvenciu reprezentujúcu časť uvedenú na obrázku 2 alebo kódujúce aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 3. Patria sem tiež polynukleotidy kódujúce C5-epimerázový polypeptid, postrádajúce amino-koncový metionín. Rovnako sem patria tiež polypeptidy kódované takými polynukleotidmi, napr. polypeptidmi, ktoré obsahujú aminokyselinovú sekvenciu v polohách 2 až 618 aminokyselinovej sekvencie na obrázku 3, ale nemajú amino-koncový metionín.

V ďalšom aspekte poskytuje predložený vynález izolovanú molekulu nukleovej kyseliny obsahujúcu polynukleotid, ktorý hybridizuje za striktných hybridizačných podmienok s časťou polynukleotidu alebo výhodne s celým polynukleotidom opísanej molekule nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu. Časťou sa rozumie akákoľvek požadovaná časť, napr. polynukleotid z obrázka 2, ktorý kóduje aminokyseliny 1 až 154 alebo 33 až 154, alebo 34-154. Termín „striktné hybridizačné podmienky“ zahrnuje inkubáciu pri teplote 42 °C cez noc v roztoku obsahujúcom 50 % formamid, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM trojsodnú soľ citrátu), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtov roztok, 10 % sulfát dextránu a 20 gg/'ml denaturovanej, rozštiepenej DNA lososích spermii a následne premytie filtrov v 0,1 x SSC pri teplote 65 °C.

Termín polynukleotid, ktorý hybridizuje s „časťou“ polynukleotidu, zahrnuje polynukleotid (buď DNA alebo RNA) hybridizujúci aspoň s 15 nukleotidmi (nt), výhodnejšie aspoň s 20 nt, ešte výhodnejšie s 30 nt, a ešte výhodnejšie s 30 až 70 (napr. 50) nt referenčného polynukleotidu. Tieto polynukleotidy sú použiteľné ako diagnostické sondy a priméry, ako je uvedené skôr a v detailoch i neskôr.

Termín časť polynukleotidu „s dĺžkou aspoň 20 nt“ zahrnuje napr. 20 alebo viacej za sebou idúcich nukleotidov z nukleotidovej sekvencie referenčného polynukleotidu (napr. nukleotidová sekvencia z obrázka 2). Samozrejme, že polynukleotid, ktorý hybridizuje len s poly(A)-sekvenciou alebo s komplementárnym reťazcom T (alebo U) zostatkov, by nemal byť zahrnutý do polynukleotidu podľa predloženého vynálezu používaného na hybridizáciu s časťou nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu, pretože takýto polynukleotid by hybridizoval s akoukoľvek molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou poly(A)-reťazec alebo jej komplement (napr. prakticky akýkoľvek kloň dvojreťazcovej cDNA).

Molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu, ktoré kódujú C5-epimerázový polypeptid, môžu zahrnovať, ale nie je to nijak limitované, samotnú kódujúcu sekvenciu pre polypeptid (tiež označovanú ako materská C5-epimeráza, pokiaľ postrádanemá sekrečný signál); kódujúci sekvenciu pre polypeptid a ďalšie sekvencie, napr. tie, ktoré kódujú vedúcu sekrečnú sekvenciu, napr. preproteínová, proproteínová alebo preproproteínová sekvencia; kódujúce sekvencie polypeptidu, vrátane alebo bez uvedených ďalších kódujúcich sekvencií spoločne s ďalšími nekódujúcimi sekvenciami, vrátane napríklad, ale nie je to nijak limitované, intrónov a nekódujúcich 5a 3 '-sekvencií, napr. transkribované, nepreložené sekvencie, ktoré majú určitú rolu pri transkripcii, posttranskripčnej úprave - vrátane zostrihu a polyadenylačných signálov, napr. väzba na ribozómy a stabilita mRNA; ďalšie kódujúce sekvencie, ktoré kódujú ďalšie aminokyseliny, napr. tie, ktoré poskytujú ďalšie funkčné možnosti. Napríklad polypeptid môže byť teda fúzovaný s markerovou sekvenciou, napr. peptidom, ktorý uľahčuje purifikáciu fúzovaného (marker obsahujúceho) polypeptidu. V určitých výhodných uskutočneniach tohto aspktu predloženého vynálezu je markerovou sekvenciou hexahistidínový peptid, okrem iného napríklad značka v pQE vektore (Qiagen, Inc.), kde valná väčšina je komerčne dostupných. Napríklad Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989) opisuje hexahistidíny ako vhodné na purifikáciu fúzneho proteínu. Značka „HA“ je ďalší peptid použiteľný na purifikáciu, ktorý zodpovedá epitopu odvodenému od hemaglutinínového proteínu chrípkového vírusu, ktorý bol opísaný Wilsonome/ al., Celí 37: 767-778 (1984).

Varianty a mutantné polynukleotidy

Predložený vynález sa ďalej dotýka jednotlivých variantov molekúl nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu, ktoré kódujú časti analóga alebo deriváty C5-epimerázy. Jednotlivé varianty môžu byť prirodzené, napr. prirodzený alelický variant. Termín „alelický variant“ zahrnuje jednu z niekoľkých alternatívnych foriem génu, ktorý obsadzuje daný lokus na chromozóme organizmu. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Prirodzene sa nevyskytujúce varianty môžu byť pripravené štandardnými technikami mutagenézie.

Takéto varianty vznikajú substitúciou, deléciou alebo adíciou nukleotidov. Substitúcia, delécia alebo adícia sa môžu dotýkať jedného alebo viacej nukleotidov. Varianty sa môžu líšiť v kódujúcich oblastiach, nekódujúcich oblastiach alebo v obidvoch. Alterácie v kódujúcich oblastiach môžu vytvárať konzervované alebo nekonzervované aminokyselinové substitúcie, delécie alebo adície. Z nich sú predovšetkým výhodné tiché substitúcie, adície a delécie, ktoré nemenia vlastnosti a aktivitu C5-epimerázového polypeptidu a jeho časti. Z tohto pohľadu sú tiež veľmi výhodné konzervované substitúcie.

Ďalšie uskutočnenia predloženého vynálezu zahrnujú izolovanú molekulu nukleovej kyseliny obsahujúcu polynukleotid majúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid, kde jeho aminokyselinová sekvencia je aspoň z 80 % zhodná, výhodnejšie aspoň z 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % zhodná, s referenčnou aminokyselinovou sekvenciou vybranou zo skupiny skladajúcej z: (a) aminokyselín 1 až 118 zo SEQ 1D NO:1; (b) aminokyselín 1 až 119 zo SEQ ID NO:1; (c) aminokyselín 1 až 120 zo SEQ ID NO:1; (d) aminokyselín 1 až 121 zo SEQ ID NO:1; (e) aminokyselín 119 až 618 zo SEQ ID NO:1; (Q aminokyselín 120 až 618 zo SEQ ID NO:1; (g) aminokyselín 121 až 618 zo SEQ ID NO:1; (h) aminokyselín 122 až 618 zo SEQ ID NO:1; (i) aminokyselín 34 až 147 zo SEQ ID NO:1; (j) aminokyselín 35 až 154 zo SEQ ID NO:1; (k) aminokyselín 34 až 154 zo SEQ ID NO:1; (1) aminokyselín 1 až 154 zo SEQ ID NO:1; (m) kompletná aminokyselinová sekvencia zo SEQ ID NO: 1.

Ďalšie uskutočnenia podľa predloženého vynálezu zahrnujú izolované molekuly nukleovej kyseliny, ktoré obsahujú polynukleotid, ktorý hybridizuje za prísnych hybridizačných podmienok s polynukleotidom v bode (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1), (m), (n. Tento hybridizujúci polynukleotid nehybridizuje za prísnych hybridizačných podmienok s polynukleotidom majúcim nukleotidovú sekvenciu skladajúcu sa iba z A-zostatkov alebo iba z T-zostatkov.

Termín polynukleotid majúci nukleotidovú sekvenciu napr. aspoň z 95 % „zhodnú“ s referenčnou nukleotidovou sekvenciou kódujúcou C5-epimerázový polypeptid zahrnuje nukleotidovú sekvenciu polynukleotidu, ktorá je zhodná s referenčnou sekvenciou s výnimkou toho, že polynukleotidová sekvencia môže zahrnovať až päť bodových mutácií na každých 100 nukleotidov referenčnej nukleotidovej sekvencie kódujúcej C5-epimerázový polypeptid. Inými slovami získať polynukleotid majúci nukleotidovú sekvenciu aspoň z 95 % zhodnú s referenčnou nukleotidovou sekvenciou znamená, že až 5 % nukleotidov v referenčnej sekvencii môže byť deletovaných alebo substituovaných iným nukleotidom alebo že až 5 % nukleotidov z celkových nukleotidov v referenčnej sekvencii môže byť vpravených do tejto referenčnej sekvencie. Tieto mutácie referenčnej sekvencie sa môžu vyskytovať na 5alebo 3 '-koncových polohách referenčnej nukleotidovej sekvencie alebo kdekoľvek medzi týmito koncovými polohami, rozptýlené buď individuálne medzi nukleotidy v referenčnej sekvencii, alebo v jednej alebo viacej za sebou idúcich skupinách v referenčnej sekvencii.

Pokiaľ ktorákoľvek konkrétna molekula nukleovej kyseliny je aspoň z 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % zhodná, môže byť napr. nukleotidová sekvencia uvedená na obrázku 2 štandardne determinovaná pomocou známych počítačových programov, napr. program Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Program Bestfit využíva algoritmus lokálnej homológie podľa Smitha a Watermana, Advances in Applied Mathemetics 2: 482-489 (1981) na nájdenie najlepšieho segmentu homológie medzi dvoma sekvenciami. Pokiaľ sa používa program Bestfit alebo akýkoľvek iný program na určenie napr. 95 % zhody s referenčnou sekvenciou podľa predloženého vynálezu, sú parametre samozrejme nastavené tak, aby percentuálna zhoda bola vypočítaná z celkovej dĺžky referenčnej nukleotidovej sekvencie, a aby medzery v homológii boli prípustné až do 5 % z celkového počtu nukleotidov v referenčnej sekvencii.

Predložený vynález rieši molekuly nukleovej kyseliny, ktoré sú aspoň z 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % zhodné so sekvenciou nukleovej kyseliny uvedenej na obrázku 2 bez ohľadu na to, či kódujú polypeptid majúci C5-epimerázovú aktivitu. To je preto, že pokiaľ by konkrétna molekula nukleovej kyseliny nekódovala polypeptid majúci C5-epimerázovú aktivitu, odborník v odbore by mal vedieť, ako ju využiť, napr. ako hybridizačnú sondu alebo ako primér pre polymerázovú reťazovú reakciu (PCR). Využitie molekúl nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu, ktoré nekódujú polypeptid majúci C5-epimerázovú aktivitu, zahrnuje okrem iného: (i) izoláciu génu C5-epimerázy alebo jeho alelických variantov v cDNA-knižnici; (2) in situ hybridizácia (napr. „FISH“) na metafázu množenia chromozómov na účely získania presnej lokalizácie génu C5-epimerázy, ako je opísané vo Verma eí al., Human Chromosomes: AManual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); aNorthem blotting na účely detekcie expresie mRNA C5-epimerázy v špecifických tkanivách.

Ale výhodné sú molekuly nukleovej kyseliny majúce sekvencie aspoň z 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, % alebo 99 % zhodné so sekvenciou nukleovej kyseliny na obrázku 2, ktorá v skutočnosti kóduje polypeptid majúci C5-epimerázovú aktivitu. Termín „polypeptid majúci C5-epimerázovú aktivitu“ zahrnuje polypeptidy majúce aktivitu, ktorá je podobná, ale nie je nutne zhodná, aktivite C5-epimerázy podľa predloženého vynálezu (buď celý proteín, alebo výhodne identifikovaný aminokyselinový fragment obsahujúci aminokyseliny 33 až 618 alebo 34 až 618), zmeranú v konkrétnom biologickom teste.

V dôsledku degenerácie genetického kódu samozrejme odborník v odbore okamžite rozpozná, že väčší počet molekúl nukleovej kyseliny majúcich sekvencie aspoň z 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo % zhodné so sekvenciou nukleovej kyseliny vloženej cDNA alebo sekvencie nukleovej kyseliny uvedené na obrázku 2 bude kódovať polypeptid „majúci aktivitu C5-epimerázového proteínu“. Pretože v skutočnosti

SK 286819 Β6 všetky degenerované varianty týchto nukleotidových sekvencií kódujú rovnaký polypeptid, čo je odborníkovi v odbore jasné aj bez uskutočnenia opísaného porovnávacieho testu. Ďalej je z doterajších poznatkov o molekulách nukleovej kyseliny, ktoré nie sú degenerovanými variantmi, jasné, že primerané množstvá molekúl bude kódovať polypeptid majúci aktivitu C5-epimerázového proteínu. To je preto, že amonokyselinové substitúcie, ktoré sú buď málo pravdepodobné, alebo nepravdepodobné, výrazne neovplyvňujú funkciu proteinu (napr. nahradenie jednej alifatickej aminokyseliny inou alifatickou aminokyselinou), ako je ďalej vysvetlené.

Vektory a hostiteľské bunky

Predložený vynález tiež rieši vektory, ktoré zahrnujú izolované molekuly DNA podľa predloženého vynálezu, hostiteľských buniek, ktoré sú génovo manipulované s rekombinantnými vektormi podľa predloženého vynálezu a produkcie C5-epimerázového polypeptidu alebo jeho fragmentov rekombinantnými technikami.

Polynukleotidy môžu byť spojené s vektorom obsahujúcim marker pre propagáciu v hostiteľovi. Všeobecne plazmidový vektor je zavádzaný v precipitáte, napr. precipitát fosforečnanu vápenatého alebo v komplexe s nabitým lipidom. Pokiaľ je vektor vírus, môže byť zapuzdrený in vitro pomocou vhodnej zapuzdrovacej bunkovej línie a následne transdukovaný do hostiteľských buniek.

DNA-inzert by mal byť operatívne pripojený na vhodný promótor, napr. fágový lambda PL promótor, E. coli lac, trp a tac promótory, SV40 skoré a neskoré promótory a promótory retrovírusové LTR. Ďalšie vhodné promótory sú odborníkom v odbore určite známe. Expresívne konštrukty budú ďalej obsahovať miesta na iniciáciu transkripcie, termináciu a transkribovanej oblasti miesto na naviazanie na ribozóm pre transláciu. Kódujúca časť materských transkriptov exprimovaných konštruktami bude výhodne zahrnovať tansláciu iniciovanú na začiatku a terminačným kodón (UAA, ĽGA alebo UAG) vhodne umiestnený na konci polypeptidu, ktorý má byť preložený.

Ako je uvedené, expresívne vektory budú výhodne zahrnovať aspoň jeden voliteľný marker. Tieto markery zahrnujú dihydrofolátreduktázu alebo nyomicín-rezistentné eukaryotické bunkové kultúry a tetracyklína ampicilín-rezistentné gény alebo na kultiváciu v E. coli a ďalších baktériách. Reprezentatívne príklady vhodných hostiteľov zahrnujú, ale nie je to nijak limitované, bakteriálne bunky, napr. E. coli, Corynebacterium, Streptomyces a Salmonella typhimurium, fungálne bunky, napr. Aspergillus, Aspergillus niger alebo Trichoderma alebo kvasnicové bunky, napr. Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae; hmyzie bunky, napr. Drosophila S2 a Spodoptera sfP; zvieracie bunky, napr. bunky CHO, COS a Bowesove bunky malanómu; a rastlinné bunky. Preferovaní hostitelia zahrnujú hmyzie bunky. Vhodné kultivačné médiá a podmienky pre uvedené hostiteľské bunky sú v odbore známe.

Medzi vhodné vektory na použitie v baktériách patrí pQE70, pQE60 a pQE-9 k nákupu v Qiangene; pBS vektory, Phagescript vektory, Bluescript vektory, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, k nákupu v Stratagene; a ptrc99c, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 k nákupu vo Pharmacii. Medzi výhodné eukaryotické vektory patrí pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl a pSG k nákupu v Stratagene; a pSVK3, pBPV, pMSG a pSVL k nákupu vo Pharmacii. Vírusové vektory zahrnujú, ale nie je to nijak limitované, retrovírusové vektory, poxvírusové vektory, vrátane vakcíniových a adenovírusových vektorov. Ďalšie vhodné vektory budú odborníkovi v odbore určite známe.

Zavedenie konštruktu do hostiteľskej bunky môže byť ovplyvnené tranfekciou fosforečnanom vápenatým, tranfekciou sprostredkovanou DEAE-dextránom, transfekciou sprostredkovanou katiónaktívnym lipidom, elektroporáciou, transdukciou, infekciou alebo inými metódami, ktoré sú opísané v mnohých štandardných laboratórnych manuáloch, napr. Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).

Polypeptidy a fragmenty

Predložený vynález ďalej poskytuje izolovaný alebo purifikovaný C5-epimerázový polypeptid majúci aminikyselinové sekvencie kódované aminokysclinovými sekvenciami zo SEQ ID NO:1 alebo peptid, alebo polypeptid obsahujúci časť z polypeptidu skôr, predovšetkým potom zhora popísaný a kódovaný zhora opísanou molekulou nukleovej kyseliny.

Predložený vynález ďalej poskytuje fuzne proteíny obsahujúce funkčnú časť zN-konca myšej C5-epimerázy fúzovanou na svojom C-konci s N-koncom požadovaného proteínu, napr. signálna sekvencia aminokyselín 1 až 33 alebo 1 až 34 zo SEQ ID NO:1 alebo sekvencia aminokyselín 1 až 154, 33 až 154 alebo 34 až 154 zo SEQ ID NO:1 zvyšujúce aktivitu. V rámci jedného uskutočnenia je požadovaný proteín fuzovaný s časťou N-konca, ktorá obsahuje 30 až 154 aminokyselín N-konca myšej C5-epimerázy zo SEQ ID NO: 1, predovšetkým potom aminokyselín 33 až 154 alebo 34 až 154. V rámci ďalšieho uskutočnenia je požadovaný proteín fúzovaný s časťou N-konca, ktorý obsahuje zostatky 33 až 154 zo sekvencie uvedenej v SEQ ID NO:1. Vo veľmi výhodnom uskutočnení je požadovaný proteín fúzovaný s funkčnou časťou N-konca, ktorá obsahuje sekrečný signál aminokyselín 1 až 33 alebo 1 až 34 zo sekvencie v SEQ ID NO: 1.

Polypeptid môže byť exprimovaný v modifikovanej forme, napr. fúzny proteín a môže zahrnovať nielen sekrečné signály, ale tiež ďalšie heterológne funkčné oblasti. Termín „heterológny“ polypeptid, ako určite odborník v odbore pozná, zahrnuje polypeptid získaný z rôznych species. Napríklad oblasť s dodatočnými aminokyselinami, predovšetkým nabité aminokyseliny, môže byť pridaná k N-koncu polypeptidu na účely zlepšenia stability a perzistencie v hostiteľskej bunke počas purifikácie alebo počas následnej manipulácie a skladovania. Na uľahčenie purifikácie môžu byť k polypeptidu tiež pridané peptidové časti. Pred finálnou prípravou polypeptidu môžu byť tieto oblasti odstránené. Adície peptidových častí do polypeptidu na vyvolanie sekrécie alebo exkrécie uskutočnené okrem iného kvôli zlepšeniu stability a uľahčeniu purifikácie patrí medzi známe a rutinné techniky v odbore.

C5-epimeráza alebo fuzny proteín obsahujúci jej fragment môžu byť regenerované apurifikované z rekombinantných bunkových kultúr známymi metódami, vrátane precipitácie síranom amónnym alebo etanolom, kyslou extrakciou, anexovou alebo katexovou chromatografiou, chromatografiou na fosfocelulóze, chromatografiou na reverzné fázy, afinitnou chromatografiou, chromatografiou na hydroxylapatite a chromatografiou na lektíne.

Polypeptidy podľa predloženého vynálezy zahrnujú prirodzene purifikované produkty, produkty chemickej syntézy a produkty produkované rekombinantnými technikami z prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľov, vrátane napr. bakteriálnych, kvasnicových, hmyzích, cicavčích buniek a buniek vyšších rastlín. V závislosti od používaného hostiteľa pri rekombinantných technikách môžu byť polypeptidy podľa predloženého vynálezu glykosylované alebo neglykosylované. Navyše môžu polypeptidy podľa predloženého vynálezu tiež zahrnovať iniciálne modifikovaný metionínový zostatok, v niektorých prípadoch v dôsledku procesov sprostredkovaných hostiteľom. Polypeptid podľa predloženého vynálezu môže tiež zahrnovať modifikácie histidínu alebo polyhistidínu pridaných ku koncu kvôli procedúram pri purifikácii proteínu.

C5-epimerázové polynukleotidy a polypeptidy môžu byť používané podľa predloženého vynálezu na rôzne aplikácie, predovšetkým na tie, ktoré využívajú chemické alebo biologické vlastnosti C5-epimerázy. Špeciálne môžu byť rekombinantné epimerázy podľa predloženého vynálezu používané na produkciu heparínu a/alebo heparín-sulfátu v priemyselnom meradle, ktoré môžu byť účinné ako antikoagulans. Epimerázy podľa predloženého vynálezu môžu byť tiež použiteľné pri experimentálnej práci na štúdiu účinkov molekúl extracelulámej matrix, napr. heparínu a heparín-sulfátu, na takých procesoch, ako je embryológia, angiogenéza a progrese nádoru. Enzým môže napríklad modulovať pomer zostatkov D-glukorónovej kyseliny/L-ídurónovej kyseliny v heparíne alebo heparín-sulfáte. Predpokladá sa, že zostatky L-idurónovej kyseliny vďaka svojim výnimočným konformačným vlastnostiam napomáhajú interakciám polysacharidov s proteínmi. Ďalej môžu byť epimerázy podľa predloženého vynálezu tiež používané na modifikáciu cukrov využiteľných v priemysle, ktoré môžu byť používané ako stabilizátory alebo gelujúce aditíva v niektorých potravinách.

Varianty a mutantné polypeptidy

Génové inžinierstvo môže byť používané na zlepšenie alebo zmenu charakteristických vlastností C5-epimerázového polypeptidu. Odborníkom v odbore určite známa rekombinantná DNA-technológia môže byť používaná na vytvorenie nových mutantných proteínov alebo „muteínov“, vrátane jedinej alebo mnohonásobnej aminokyselinovej substitúcie, delécie, adície alebo fuznych proteínov. Takto modifikované polypeptidy môžu mať napr. zvýšenú aktivitu alebo zvýšenú stabilitu. Navyše môžu byť purifikované s vyššími výťažkami a mať väčšiu rozpustnosť než zodpovedajúci prirodzený polypeptid aspoň za určitých purifikačných a skladovacích podmienok.

N-koncové a C-koncové deletované mutanty

Pri mnohých proteínoch, vrátane extracelulámej domény proteínu asocivovaného s membránou alebo materské formy(iem) sekrétovaného proteínu, je z literatúry známe, že jedna alebo viacej aminokyselín môže byť vynechaných z N-konca alebo C-konca bez výraznej straty biologickej funkcie. Napríklad Ron et al., J. Biol. Chem., 268: 2984-2988 (1993) publikoval modifikované KDF proteíny, ktoré mali heparínovú väzobnú aktivitu len za predpokladu, že chýbalo 3, 8 alebo 27 amino-koncových aminokyselinových zostatkov.

Ale, aj keby delécia jednej alebo viacerých aminokyselín z N-konca proteínu viedla k modifikácii alebo strate jednej alebo viacerých biologických funkcií proteínu, ďalšie biologické aktivity proteínu budú zachované. Teda aj schopnosť skráteného proteínu vyvolať a/alebo viazať sa na protilátky, ktoré rozpoznávajú kompletnú alebo časť C5-epimerázového proteínu, bude všeobecne zachovaná za predpokladu, že menšia než majoritná časť zostatkov kompletného proteínu alebo extracelulámej domény bude odstránená z jeho(ich) N-konca. Či si konkrétny polypeptid nemajúci N-koncové zostatky kompletného proteínu udrží také imunologickej aktivity, možno stanoviť rutinnými metódami opísanými v predloženom vynáleze, ktoré sú inak známe z literatúry.

Predložený vynález ďalej poskytuje polypeptidy majúce jeden alebo viacej zostatkov vynechaných z amino-konca aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQ ID NO:1.

Ale, aj keby delécia jednej alebo viacerých aminokyselín z C-konca proteínu viedla k modifikácii alebo strate jednej alebo viacerých biologických funkcií proteínu, ďalšie biologické aktivity proteínu budú zacho vané. Teda aj schopnosť skráteného proteínu vyvolať a/alebo viazať sa na protilátky, ktoré rozpoznávajú kompletnú alebo materskú formu proteínu, bude všeobecne zachovaná za predpokladu, že menšia než majoritná časť zostatkov kompletnej alebo materskej formy proteínu bude odstránená z C-konca. Či si konkrétny polypeptid nemajúci C-koncové zostatky kompletného proteínu udrží také imunologické aktivity, možno stanoviť rutinnými metódami opísanými v predloženom vynáleze, ktoré sú inak známe z literatúry.

Ďalšie mutanty

Okrem koncových delečných foriem opísaného proteínu, iste odborníci v odbore poznajú, že niektoré aminokyselinové sekvencie C5-epimerázového polypeptidu môžu byť odlišné, bez toho, aby došlo k signifikantnému vplyvu na štruktúru alebo funkciu proteínov. Pokiaľ sú takéto rozdiely v sekvencii zamýšľané, malo by byť uvedené, že existujú kruciálne oblasti proteínu, ktoré determinujú jeho aktivitu. Predložený vynález teda ďalej zahrnuje varianty C5-epimerázového polypeptidu, ktoré majú podstatnú aktivitu C5epimerázového polypeptidu, alebo ktoré zahrnujú oblasti C5-epimerázového proteínu, napr. časti proteínu uvedené nižšie. Takéto mutanty vznikajú deléciou, inzerciou, inverziou, repetíciou a substitúciami určitého typu. Podrobnosti o aminokyselinových zmenách, ktoré sú pravdepodobne fenotypálne tiché, možno nájsť v Bowie, J. U. et al., „Dcciphcring the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,“ Science 247:1306-1310 (1990).

Teda fragment, derivát alebo analóg polypeptidu zo SEQ 1D NO:1, alebo fúzny protein je obsahujúci, môže byť: (i) ten, v ktorom jeden alebo viacej aminokyselinových zostatkov je substituovaných konzervovaným alebo nekonzervovaným aminokyselinovým zostatkom (výhodne konzervované aminokyselinové zostatky(tok), výhodnejšie aspoň jeden, ale menej než desať konzervovaných aminokyselinových zostatkov) a tento substituovaný aminokyselinový zostatok(ky) môže alebo nemôže byť kódovaný genetickým kódom; alebo (ii) ten, v ktorom jeden alebo viacej aminokyselinových zostatkov zahrnuje skupinu substituenta; alebo (iii) ten, v ktorom je materský alebo rozpustiteľný extracelulámy polypeptid fuzovaný s ďalšou zlúčeninou, napr. zlúčenina, na účely zvýšenia polčasu polypeptidu (napr. polyetylénglykol); alebo (iv) ten, v ktorom ďalšie aminokyseliny sú fúzované s vedúcou alebo sekrečnou sekvenciou alebo sekvenciou, ktorá je používaná na purifikáciu materského polypeptidu alebo s proproteínovou sekvenciou. Určenie takýchto fragmentov, derivátov a analóg spadá do rozsahu odborných skúseností vytvorených na základe tohto textu.

Teda C5-epimeráza podľa predloženého vynálezu môže zahrnovať jednu alebo viacej aminokyselinových substitúcií, delécií alebo adícií, a to buď z prirodzených mutácií, alebo ľudskou manipuláciou. Ako je uvedené, majú zmeny výhodne minoritný charakter, napr. substitúcia konzervovaných aminokyselín, ktoré výrazne neovplyvňujú funkčnosť alebo aktivitu proteínu (pozri tabuľka 1).

Tabuľka 1

Substitúcia konzervovaných aminokyselín

Aromatické	Fenylalanín
	Tryptofán
	Tyrosín
Hydrofóbne	Leucín
	Izoleucín
	Valín
Poláme	Glutamin
	Asparagín
Bázické	Arginín
	Lysín
	Histidín
Kyslé	Aspartová kyselina
	Glutamová kyselina
Malé	Alanín
	Serín
	Treonín
	Metionín
	Glycín

Aminokyseliny v C5-epimerázovomproteíne podľa predloženého vynálezu, ktoré sú esenciálne pre funkciu, môžu byť identifikované štandardnými metódami, napr. miestne cielená mutagenéza alebo alanínskenovacia mutagenéza (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). Posledný spomenutý pos

SK 286819 Β6 tup zavádza jednoduché alanínové mutácie do každého zostatku v molekule. Výsledné mutantné molekuly sú potom testované na biologickú aktivitu, napr. väzba na receptor alebo in vitro proliferatívna aktivita.

Mimoriadny záujem je o substitúcie nabitých aminokyselín s ďalšími nabitými aminokyselinami a s neutrálnymi alebo negatívne nabitými aminokyselinami, čo vedie k proteinom s redukovaným pozitívnym nábojom, ktoré majú zlepšené vlastnosti C5-epimerázového pratému. Veľmi žiaduca je prevencia agregácie. Agregácia proteínov nevedie iba k zníženiu aktivity, ale pokiaľ sa pripravujú farmaceutické formulácie, môže tiež byť problematická v dôsledku imunogenity. (Pinckard et al., Clin Exp. Immunol. 2: 331 až 340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377 (1993)).

Nahradenie aminokyselín môže tiež zmeniť selektivitu väzby ligandu na receptory bunkového povrchu. Napríklad Ostade et al., Náture 361: 266-268 (1993), opisuje určité mutácie vyplývajúce zo selektvity väzby TNF-α na iba jeden z dvoch známych typov TNF receptorov. Miesta, ktoré sú kruciálne pre väzbu ligandrcccptor môžu byť tiež determinované štruktúrnou analýzou, napr. kryštalizáciou, nukleárnou magnetickou rezonanciou alebo fotoafinitným značením (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) a de Vos et al., Science 255: 306-312 (1992).

Polyeptidy podľa predloženého vynálezu sú výhodne v izolovanej forme. Termín „izolovaný polypeptid“ zahrnuje polypeptid odstránený zo svojho prirodzeného prostredia. Na účely predloženého vynálezu je polypeptid produkovaný a/alebo obsiahnutý v rekombinantnej hostiteľskej bunke izolovaný. Do termínu „izolovaný polypeptid“ rovnako patria polypeptidy, ktoré boli purifikované, čiastočne alebo podstatne, z rekombinantných hostiteľských buniek. Napríklad rekombinantne produkovaná verzia C5-epimerázového polypeptidu môže byť podstatne purifikovaná jednokrokovou metódou opísanou v Smith and Johnson, Gene 67: 31-40 (1988). Výhodne je polypeptid podľa predloženého vynálezu purifikovaný do takého stupňa, ktorý je dostatočný pre sekvenčnú analýzu, alebo ktorý reprezentuje 99 % proteínového materiálu v preparáte.

Pôvodcovia objavili myší gén C5-epimerázy a C5-epimerázový proteín a ďalej, že C5-epimerázový polypeptid je proteín s 618 zvyškami majúci N-koncovú 154 aminokyselinovú doménu, predovšetkým potom 33 alebo 34 aminokyselinová doména obsahujúca aminokyseliny 1 až 33 alebo 1 až 34 podieľajúce sa na sekrécii a stabilizácii aminokyselinových sekvencii, ktoré sú na ňu pripojené.

Teda táto doména alebo jej funkčná časť je použiteľná na expresiu a sekréciu proteínov, napr. C5-epimerázy alebo ktoréhokoľvek iného proteínu, predovšetkým proteínu asociovaného s Golgiho aparátom alebo inak zapojeného do heparínovej alebo heparín-sulfátovej syntézy.

Vynálezcovia ďalej objavili, že N-koniec myšieho C5-epimerázového proteínu predovšetkým potom aminokyseliny 1 až 154, 33 až 154 alebo 34 až 154, sú predovšetkým použiteľné na zvýšenie aktivity ďalších enzýmov, obzvlášť potom iných C5-epimeráz. Teda táto doména alebo jej funkčná časť je použiteľná na expresiu a sekréciu fúznych proteínov, ktoré zahrnujú C5-epimerázové sekvencie, ktoré sú heterológne k sekvencii uvedenej na obrázku 3, predovšetkým potom k hovädzej C5-epimeráze.

Polypeptidy podľa predloženého vynálezu zahrnujú uvedený C5-epimerázový polypeptid a fragmenty, ktorých aminokyselinová sekvencia je aspoň z 80 % zhodná so sekvenciou zo skupiny skladajúcej sa z: (a) aminokyselín 1 až 118 zo SEQ ID NO: 1; (b) aminokyselín 1 až 119 zo SEQ ID NO: 1; (c) aminokyselín 1 až 120 zo SEQ ID NO:1; (d) aminokyselín 1 až 121 zo SEQ ID NO:1; (e) aminokyselín 119 až 618 zo SEQ ID NO:1; (f) aminokyselín 120 až 618 zo SEQ ID NO:1; (g) aminokyselín 121 až 618 zo SEQ ID NO:1; (h) aminokyselín 122 až 618 zo SEQ ID NO:1; (i) aminokyselín 34 až 147 zo SEQ ID NO:1; (j) aminokyselín 35 až 154 zo SEQ ID NO:1; (k) aminokyselín 34 až 154 zo SEQ ID NO:1; (1) aminokyselín 1 až 154 zo SEQ ID NO:1; (m) 3; kompletná aminokyselinová sekvencia zo SEQ ID NO:1.

Predložený vynález zahrnuje polypeptidy, ktoré sú aspoň z 80 % zhodné, výhodnejšie aspoň z 90 % alebo 95 %, ešte výhodnejšie z 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 %, zhodné s opísaným polypeptidom, a tiež zahrnujú časti takého polypeptidu s aspoň 30 aminokyselinami, výhodnejšie s aspoň 50 aminokyselinami.

Polypeptidom majúcim aminokyselinovú sekvenciu napr. aspoň z 95 % „zhodnú“ s referenčnou aminokyseline vou sekvenciou z C5-epimerázového polypeptidu je myslená aminokyselinová sekvencia polypeptidu, ktorá je zhodná s referenčnou sekvenciou s výnimkou toho, že polypeptidová sekvencia môže zahrnovať až päť aminikyselinových alternácií na každých 100 aminokyselín z referenčnej aminokyseliny C5-epimerázového polypeptidu. Inými slovami získať polynukleotid majúci aminokyselinovú sekvenciu aspoň z 95 % zhodnú s referenčnou aminokyselinovou sekvenciou znamená, že až 5 % aminokyselinových zostatkov v referenčnej sekvencii môže byť deletovaných alebo substituovaných inou aminokyselinou, alebo že až 5 % z celkových aminokyselinových zostatkov v referenčnej sekvencii môže byť vpravených do tejto referenčnej sekvencie. Tieto alterácie referenčnej sekvencie sa môžu vyskytovať na amino- alebo karboxy- koncových polohách referenčnej aminokyselinovej sekvencie alebo kdekoľvek medzi týmito koncovými polohami, rozptýlené buď individuálne medzi zostatky v referenčnej sekvencii alebo, v jednej alebo viacej za sebou idúcich skupinách v referenčnej sekvencii.

Pokiaľ ktorýkoľvek konkrétny polypeptid je aspoň z 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % zhodný, môže byť aminokyselinová sekvencia uvedená v SEQ ID NO:1 štandardne determinovaná pomocou známych počítačových programov, napr. program Bestfit (Wisconsin Sequence analysis Package, Version 8 for Unix Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Pokiaľ sa používa program Bestfit alebo ktorýkoľvek iný program na určenie napr. 95 % zhody s referenčnou sekvenciou podľa predloženého vynálezu, sú parametre samozrejme nastavené tak, aby percentuálna zhoda bola vypočítaná z celkovej dĺžky referenčnej aminokyselinovej sekvencie, a aby medzery v homológii boli prípustné až do 5 % z celkového počtu aminokyselinových zostatkov v referenčnej sekvencii.

Polypeptidy podľa predloženého vynálezu, ktoré majú C5-epimerázovú aktivitu, môžu byť používané samy osebe in vitro, napr. pri vyvíjaní testov pre tieto polypeptidy alebo štandardizačných testoch pre použitie s komplexnejšími systémami. Signálna sekvencia podľa predloženého vynálezu môže byť používaná na sekréciu homológneho C5-epimerázového enzýmu z eukaryotických rekombinantných hostiteľov alebo na sekréciu heterológnych sekvencii, ktoré sú na ňu funkčne pripojené. Sekvencia podľa predloženého vynálezu zvyšujúca aktivitu môže byť používaná na zvýšenie inherentnej epimerázovej aktivity rekombinantných preparátov z iných C5-epimeráz a sama osebe je najlepšie používaná vo forme génu kódujúceho fúzny proteín pre túto sekvenciu.

Protilátky

Špecifické protilátky proti C5-epimerázovému proteínu na použitie podľa predloženého vynálezu môžu byť získané expozíciou proti intaktným C5-epimerázovým proteínom alebo ich antigénnemu peptidovému fragmentu, ktoré môžu byť prítomné spoločne s nosičovým proteínom, napr. albumín, vo zvieracom systéme (napr. králik alebo myš), alebo pokiaľ sú dostatočne dlhé (aspoň 25 aminokyselín), môžu byť prítomné bez nosiča alebo v lipozómoch, alebo komplexované s PEG na zvýšenie cirkulačného polčasu.

Termín „protilátka“ (Ab) alebo „monoklonálna protilátka“ (Mab), ako je používaný v predloženom vynáleze, zahrnuje intaktné molekuly i fragmenty protilátky (napr. Fab a F(ab')₂ fragmenty), ktoré sú schopné špecifickej väzby na C5-epimerázový proteín. Fab a F(ab')₂ fragmenty nemajú Fc fragment intaktnej protilátky, odstupujú rýchlejšie z cirkulácie a môžu mať menšiu nešpecifickú tkanivovú väzbu intaktnej protilátky (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24'.2>\6-325 (1983)). Teda preferované sú tieto fragmenty.

Protilátky podľa predloženého vynálezu môžu byť pripravené ktorýmikoľvek rôznymi spôsobmi. Napríklad bunky exprimujúce C5-epimerázový proteín alebo jeho antigénny fragment môžu byť podávané zvieracím subjektom na účely vyvolania tvorby séra obsahujúceho polyklonálne protilátky. Vo výhodnom spôsobe je kvôli odstráneniu prirodzených nečistôt preparát C5-epimerázového proteínu purifikovaný. Takýto preparát je potom zavedený do zvieraťa na účely produkcie polyklonálneho antiséra s väčšou špecifickou aktivitou.

V najvýhodnejšom spôsobe sú protilátky podľa predloženého vynálezu monoklonálne protilátky. Tieto monoklonálne protilátky môžu byť pripravené hybridómovou technológiou (Kôhler et al., Náture 256: 459 (1975); Kôhler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kôhler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976): Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., (1981) 563-681). Všeobecne tieto procedúry zahrnujú imunizáciu zvieraťa (výhodne myší) antigénom C5-epimerázového proteínu alebo výhodnejšie bunkami exprimujúcimi C5-epimerázový proteín. Vhodné bunky môžu byť rozpoznané podľa svojej schopnosti viazať protilátku proti anti-C5-epimerázovému proteínu. Tieto bunky môžu byť kultivované v akomkoľvek vhodnom tkanivovom kultivačnom médiu, ale je výhodné kultivovať bunky v Earlem modifikovanom Eaglovom médiu doplnenom o 10 % fetálne hovädzie sérum (inaktivované pri 56 °C) a doplnené 10 g/1 neesenciálnych aminokyselín, 1 000 U/ml penicilínu a 10 jtg/ml streptomycínu. Splenocyty týchto myší sú extrahované a fúzované s vhodnou myelómovou bunkovou líniou. Podľa predloženého vynálezu môže byť používaná akákoľvek vhodná myelómová bunková línia, aleje výhodné používať materskú myelómovú bunkovú líniu (SP20) dostupnú v Američan Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Po fúzii sú výsledné hybridné bunky selektívne udržiavané v HAT médiu a následne klonované limitovaným zriedením podľa Wands et al., Gastroenterology 80: 225-232 (1981). Hybridné bunky pripravené touto selekciou sú potom testované na identifikácii klonov, ktoré secretujú protilátky schopné väzby požadovaného C5-epipmerázového antigénu.

Alternatívne môžu byť ďalšie protilátky schopné väzby na C5-epimerázový antigén produkované dvojstupňovým procesom pri použití anti-idotypických protilátok. Táto metóda využíva fakt, že protilátky samotné sú antigény a teda je možné získať protilátku, ktorá sa viaže na sekundárnu protilátku. Podľa tejto metódy sú využívané špecifické protilátky proti C5-epimerázovému proteínu na imunizáciu zvierat, výhodne myší. Splenocyty týchto zvierat sú potom používané na produkciu hybridných buniek, pri ktorých je uskutočnený skríning na identifikáciu klonov, ktoré produkujú protilátku, ktorej schopnosť viazať sa na špecifickú protilátku proti C5-epimerázovému proteínu môže byť blokovaná antigénom C5-epímerázového proteínu. Tieto protilátky obsahujú anti-idiotypické protilátky proti špecifickej protilátke proti C5-epimerázovému proteínu a môžu byť používané na imunizáciu zvieraťa na účely vyvolania tvorby ďalších špecifických protilátok proti C5-epimerázovému proteínu.

SK 286819 Β6

Iste bude ocenené, že Fab a F(ab')₂ a ďalšie fragmenty protilátok podľa predloženého vynálezu môžu byť používané podľa metód v predloženom vynáleze. Tieto fragmenty sú typicky produkované proteolytickým štiepením enzýmami, napr. papaín (produkuje Fab fragmenty) alebo pepsin (produkuje F(ab')₂ fragmenty). Jednoreťazcové protilátky, napr. ľahký a ťažký reťazec protilátky, sú rovnako zahrnuté do predloženého vynálezu. Alternatívne môžu byť väzbové fragmenty C5-epimerázového proteínu produkované aplikáciou rekombinantnej DNA-technológie alebo syntetickou chémiou. Takéto protilátky by mali zahrnovať, ale nie je to nijak limitované, rekombinantné protilátky obsahujúce komplementaritu determinujúce oblasti (CDR), ktoré majú rozdielne väzbové špecifity alebo CDR, ktoré boli modifikované aplikáciou rekombinantnej DNA-technológie alebo syntetickou chémiou.

Pre in vivo použitie anti-C5-epimerázy u ľudí môže byť výhodné používať „humanizované“ chimérické monoklonálne protilátky. Tieto protilátky môžu byť produkované genetickými konštruktami odvodenými od hybridných buniek produkujúcich popísané monoklonálne protilátky. Metódy produkcie chimérických protilátok sú dostupné z literatúry. Pozri napríklad Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Cabilly et al., U. S. Patent No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 870 2671; Boulianne et al., Náture 312: 643 (1984); Neuberger et al., Náture 314: 268 (1985).

Bifunkčné látky sú protilátky, ktoré majú antigén-viažuci domény pre rôzne epitopy alebo odvodené od rôznych species a spadajú do predloženého vynálezu. Patria sem tiež protilátky s Fc oblasťami odvodené od species líšiacich sa od seba Fab oblasťami. Tieto protilátky môžu byť využívané pri imunošpecifických chromatografických technikách. Ďalej do predloženého vynálezu spadajú protilátky s pripojenou značkou, napr. fluóresceín, texaská červeň, rodamín, peroxidáza, zlato, magnetické značky, alkalická fosfatáza, rádioizotopy alebo chemiluminiscenčné značky.

Teraz, keď bol predložený vynález všeobecne opísaný, bude doterajší opis zrozumiteľnejší vďaka príkladom, ktoré sú len ilustratívne a nemajú nijak predložený vynález limitovať.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: DNA-sekvencia fúzneho proteínu majúceho sekvenciu hovädzej C5-epimerázy (netučne) a N-konca myšej C5-epimerázy (tučné). Otvorený čítací rámec (ORF) ukazujúci sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid, je podčiarknutý.

Obrázok 2: Kompletná DNA-sekvencia myšej C5-epimerázy.

Obrázok 3: Kompletnú aminokyselinová sekvencia myšej C5-epimerázy.

Obrázok 4: Porovnávacia analýza myšej C5-epimerázy s ďalšími sekvcnciami ukazujúca oblasti homológie. Skóre sú uvedené hore a v stĺpci nasledujúcom po pôvode sekvencie. Sekvencie majú nasledujúci pôvod: riadok 2: myšia pečeň; riadok 3: hovädzie pľúca; riadok 4: ľudská EST; riadok 5: Drosophila·, riadok 6: C. elegans·, riadok 7: Methanococcus.

Obrázok 5: Grafické znázornenie štruktúry domény myšej C5-epimerázy. Plný obdĺžnik na N-konci: signálna sekvencia (vysoko hydrofóbna transmembránová (TM) sekvencia); šrafované obdĺžniky: hydrofóbna transmembrána (TM) alebo skryté sekvencie; plné obdĺžniky v peptide; konzervované peptidové sekvencie majúce viacej než 50 % podobnosť s 71,9 KD hypotetickým proteínom z C. elegans.

Obrázok 6A-6B:

Obrázok 6A: Grafické znázornenie produktov značených konštruktov rekombinantnej (hovädzích) C5-epimerázy. i: prvý aktívny značený rekombinantný (hovädzí) konštrukt. Špecifická aktivita bola 5 x 10⁵ cpm/mg/h). ii: najaktívnejší rekombinantný (kompletne myší) C5 konštrukt. Špecifická aktivita bola 2 x 10⁹ cpm/mg/h. iii: chimérický konštrukt majúci myšiu aj hovädziu sekvenciu. Aktivita bola 87 % aktivity kompletnej myšej sekvencie. iv: skrátený myší konštrukt. Aktivita je rovnaká ako hovädzí konštrukt v bode „i“. Obrázok 6B: Informácie o sekvencii a doméne značky, ktorá predchádza každému z rekombinantných konštruktov na obrázku 6A.

Obrázok 7: Výsledky z testov aktivity myšej C5-epimerázy (mC5).

Obrázok 8: Westem blotting s anti-FLAG. Riadok 1: štandardy molekulových hmotností (New England Biolab's Broad Range, dopredu značené). Riadok 2: vzorka myšej C5-epimerázy (mC5).

Obrázok 9: Westem blotting s proteínmi v médiu z klonov línii stálych hmyzích buniek obsahujúcich rôzne značené rekombinantné C5-epimerázy odfarbené protilátkou proti anti-FLAG.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia a sekvenovanie myších genómických klonov

Bol uskutočnený skríning myšej genómickej knižnice (FIX II, Stratagene) pomocou DNA-sondy z hovädzej sekvencie kódujúcej C5-epimerázu. Sonda bola označená [cŕ²P]dCTP (NEN Life Science Products). Približne 2 x 10⁶ fágov bolo nanesených na doštičku s rozmermi 20 x 20 cm a z každej doštičky boli duplicitne pripravené nylonové filtre. Bol uskutočnený veľmi presne riadený sckríning hybridizáciou v 5 x x Denhardtoch obsahujúcich 100 gg DNA lososích spermií pri teplote 60 °C. Finálne premývanie bolo uskutočnené v 0,1 SSC (1 x SSC je 150 mM NaCl, 15 mM citrátu sodného, pH 7,0 obsahujúceho 0,1 % SDS). Plaky, ktoré produkovali pozitívne signály na oboch replikách .boli vybrané pre druhý a tretí skríning a nakoniec bolo izolovaných päť pozitívnych klonov. Bolo zistené, že dva klony majú podobnú dĺžku (asi 16 kb), zatiaľ čo ostatné tri boli relatívne krátke, okolo 10-12 kb. Najdlhší kloň (kloň 64) bol štiepený Sací a reštrikčné fragmenty boli klonované do pBlueScriptu. Druhý najdlhší kloň (kloň 5A) bol štiepený EcoRI a výsledné fragmenty boli klonované do pUC119 na ďalšiu charakterizáciu. Inzert obsahujúci plazmid bol purifikovaný pomocou plazmidového kitu QIAGEN a sckvenovaný. Nukleotidová sekvenčná reakcia bola uskutočnená pomocou di-deoxy terminačnej metódy a uskutočnená sa sekvencéri ABI 310. Exóny a intróny boli stanovené primérom postupujúcim po oboch reťazcoch a veľkosť intrónov bola stanovená sekvenovaním v kombinácii s elektroforézou na aragózovom géli. Boli zistené len 3 exóny kódujúce C5-epimerázu, kde najdlhší exón kódoval viac než 50 % proteínu. Exón-intrón spojenie (miesta zostrihu) presne kopírujú gt-ag konvenčné pravidlo. Pôvodcovia veria, že na základe prítomnosti intrónov a presného párovania medzi exónmi a cDNA-sekvenciou reprezentuje identifikovaný genómický kloň funkčný gén C5-epimerázy.

Klonovanie myšej C5-epimerázovej cDNA

Bol určený jeden pár primérov a na základe nukleotidovej sekvencie získaný sekvenovaním exónov zgenómického klonu. Kódujúci primér zodpovedal bp 1 až 26 z myšej ORF, pričom sa vychádzalo z iniciačného kodónu ATG. Nekódujúci primér zodpovedal 1 829 až 1 854 bez terminačného kodónu . PCR bola uskutočnená pomocou QUICK-Clone ™ c DNA (Clontech) z myších pečení ako templátu za nasledujúcich podmienok: 1 cyklus pri teplote 94 °C počas 1 minúty, 30 cyklov každý pri teplote 94 °C počas 30 s, 60 °C počas 45 s a 72 °C počas 1 minúty a finálna extcnzia pri teplote 72 °C počas 10 minút. Bol získaný silný pás s približne 2 kb, ktorý bol naklonovaný do klonovacieho vektora TOPO™-TA (Invitrogén) a amplifikovaný a následne sekvenovaný. Sekvenovaním oboch reťazcov bolo zistené, že kloň myšej C5-epimerázy je 1 875 bp dlhý a má silne hydrofóbnu doménu na N-konci zodpovedajúceho peptidu.

Northem blotting

Myší multitkanivový mRNA blot bol zakúpený vo firme Clontech. DNA-sonda z klonu hovädzej cDNA bola značená [o³²P]dCTP pomocou Klenowovho enzýmu od firmy Boehringer Mannheim. Hybridizácia bola uskutočňovaná v Expresshybe (Clontech) pri teplote 60 °C počas jednej hodiny a následne bola premývaná za veľmi prísnych podmienok. Membrána bola vystavená Kodak filmu pri teplote -70 °C cez noc. Enzým C5-epimeráza bol exprimovaný vo všetkých skúmaných tkanivách a veľkosť transkriptu bola 5 kb. V pečeni dochádzalo k najvyššej expresii transkriptu, zatiaľ čo v slezine boli pozorované nižšie hladiny vzhľadom na /3-aktín v rovnakej membráne.

Southem blotting

Southem blotting bol uskutočnený podľa Sambrooka et al. (Sambrook et al., 1898). Myšia genómická DNA bola pripravená pomocou kitu Easy Prep (Pharmacia Biotech). Genómická DNA (20 fíg) bola štiepená reštrikčným enzýmom Sací a separovaná elektroforézou na 8,0 % aragózového géli. Po elektroforéze bol gél podrobený 0,lN NaOH počas 30 minút a neutralizovaný Tris-HCl pufrom. DNA fragmenty boli prevedené do nylonovej membrány. Fragment 837 bp z hovädzej C5-epimerázovej cDNA bol značený [ď²P]dCTP pomocou Klenowho enzýmu zakúpeného u Boehringer Mannheim a používaný ako sonda. Podmienky hybridizácie boli stanovené podľa Northern blottingu. Čas expozície bol 3 dni.

Na určenie počtu génov, ktoré môžu potenciálne kódovať C5-epimerázu, bolo 20 gg purifiované myšou genómickou DNA z myších pečení štiepených reštrikčnými enzýmami Apal, resp. BamHI, EcoRI, EcoRV, HindlII, Ncol a Xbai a separovaných elektroforézou na 0,8 % agarózovom géli. DNA separovaná v géli bola prevedená na nylonovú membránu a následne hybridizovaná DNA-sondou z kódujúcej hovädzej sekvencie (1407 bp). Reštrikčná mapa C-5 epimerázovej genómickej DNA ukazuje, že existuje len jeden gén kódujúci C-5 epimerázu.

SK 286819 Β6

Analýza enzýmovej aktivity

Aktivita C5-epimerázy bola stanovená podľa spôsobu publikovaného Malmstromom et al,, J. Biol. Chem. 255:3878-3883 (1980), tuje uvedený ako odkaz. Myš s intramuskulárne transplantovanými bunkami mastocytómu bola usmrtená cervikálnou dislokáciou a následne pitvaná. Príslušné tkanivá, vrátane xenoimplantátu, boli odobraté a okamžite homogenizované vpufri 50 mM HEPES obsahujúceho 100 mM KCL, 15 mM EDTA, 1 % Triton X-100 a inhibítory proteázy. Homogenáty boli trepane pri teplote 4 °C počas 30 minút a centrifugované. Supematant bol odobratý. Celková koncentrácia proteínu bola určená testom QuantiGold a špecifická aktivita C5-epimerázy bola analyzovaná na základe uvoľňovania ³H (regenerovaný ako ³H₂O) zo substrátového polysacharidu podľa spôsobu opísaného Li et al. (Li et al. 1997). C5-substrát používaný pri stanovení špecifickej aktivity bol aspoň raz mesačne analyzovaný zmeraním len 50 μΐ C5-substrátového pracovného roztoku bez prítomnosti akéhokoľvek enzýmu.

Pokiaľ iniciálna aktivita vzorky bola väčšia ako 2 000 cpm/50 μΐ, znamenalo to, že vzorka je nasýtená a treba ju zriediť. Faktory zriedenia záviseli od použitých vzoriek, nasýtenia vzorky a od koncentrácie soli. Vzorky nesmú obsahovať viac ako 50 mM soli (NaCl alebo KC1), pretože aktivita C5-epimerázy je čiastočne alebo celkom inhibovaná pri vyšších koncentráciách soli.

Pri stanovení aktivity C5-epimerázy boli používané pozitívne alebo negatívne kontroly. Pozitívna kontrola by mala byť štandardizovaná každé dva mesiace kvôli udržaniu stability. Ako negatívna kontrola môže byť používaný len vektor produkovaný rovnakými bunkami. Napríklad bola ako negatívna kontrola pre C5- vzorky produkované v expresívnom systéme bakulovírus/hmyzie bunky používaná acetylcholínesteráza produkovaná rovnakým systémom.

Pokiaľ bolo treba, boli vzorky počas temperácie C5 substrátového roztoku zriedené. K temperovanému substrátu bola pridaná 50 μΐ vzorka (enzým) a inkubovaná presne počas 1 hodiny pri teplote 37 °C. Po inkubácii bolo k zmesi substrát-enzým pridaných 100 μΐ roztoku zastavujúceho enzýmovú reakciu a táto reakčná zmes bola prevedená do Wallaceho 20 ml scintilačných vialok. Do vialok bolo pridaných 13 ml epimerázového testovacieho scintilačného kokteilu a vialky boli vortexované počas 10 s. Po inkubácii cez noc bola rádioaktivita meraná trojmo na prístroji Wallac 1415 Liquid Scintillation Counter každá počas 2 minút. Zo scintilačného počítača boli získané výsledky vo forme cpm/reakčný objem (50 μΐ). Pokiaľ bola vzorka zriedená, mala byť aktivita riediaceho pufra odpočítaná od aktivity vzorky. V každom prípade bola pred analýzou výsledkov odpočítaná aktivita slepého pokusu od aktivity vzorky.

Špecifická aktivita bola meraná delením celkovej aktivity (cpm/μΐ) celkovou koncentráciou proteínu (mg/ml). Koncentrácia celkového proteínu bola meraná testom QuantiGold podľa Stoscheka, C. M., Anál. Biochem. 160: 301-305 (1987), tuje uvedené ako odkaz. Jednotka špecifickej aktivity je cpm/mg/h, kde h (hodina) udáva čas enzýmovej reakcie.

Príklad 2

Identifikácia skutočného N-konca C5-epimerázy na základe analýzy kódujúcej sekvencie myšieho génu a expresie klonovanej cDNA.

Na základe klonovania a predbežnej sekvenčnej analýzy putatívneho myšieho génu C5-epimerázy identifikovaného v príklade 1 a podľa už skôr publikovanej hovädzej sekvencie cDNA, boli izolované ďalšie myšie 5 '-lemovacie DNA-sekvencie a cDNA bola klonovaná tak, aby obsahovala túto 5 '-lemovaciu DNA-sekvenciu.

Kvôli stanoveniu, či táto 5 '-lemovacia sekvencia môže kódovať ďalšie N-koncové peptidové sekvencie, ktoré by mohli predstavovať skutočný N-koniec C5-epimerázy kódovanej myším génom, bola myšia sekvencia (tučné v kompilovanej nukleotidovej sekvencii uvedené na obrázku 1) pridaná do hovädzej cDNA-sekvencie, ktorá už bola v súbore, pri použití hovädzej sekvencie a vychádzajúc z bodu najväčšej konzervácie (>96 % aminokyselinová zhoda). Na vyhľadávanie otvorených čítacích rámcov, čo sú potenciálne sekvencie kódujúce polypeptid v kompilovanej sekvencii, bol používaný program Gene Inšpektor (Texcto, USA). Výsledky zo sekvenčnej analýzy sú uvedené na obrázku 1 a výsledky z analýzy ORF sú uvedené na obrázku 2.

Na obrázku 1 je miesto fúzie medzi novou myšou sekvenciou a hovädzou sekvenciou označené štvorbodkou Sekvencia začínajúca sa po štvorbodke je hovädzia cDNA-sekvencia. Sekvencia (hrubo) 5' k miestu fúzie je ďalšia opísaná, izolovaná myšia 5 -lemovacia DNA-sekvencia izolovaná podľa uvedeného spôsobu. Podčiarknutá sekvencia je zistený otvorený čítací rámec, ukazujúci polypeptidovú kódujúcu sekvenciu.

Je známe, že natívna C5-epimeráza je lokalizovaná v membránovitých Golgiho „kompartmentových“ (mikrozomálna frakcia) bunkách (z pečení). Preto by natívna myšia sekvencia mala obsahovať vhodný N-koncový signál pre translokáciu do tohto kompartmentu. Na jeho analýzu bol používaný algoritmus (program) Nielsena et al., Proteín Engineering 70:1-6 (1997). Algoritmus analyzuje „signálny“ potenciál prvých 40-60 aminokyselín z každej z uvedených polypeptidových sekvencii. Rovnaký program bol používaný na testovanie prvých 40 zostatkov myšej polypeptidovej sekvencie syndecan-1, o ktorej sa vie, že obsahuje sek rečný signál, ako kontrolná skupina účinnosti programu, pričom ju program jasne identifikoval (dáta nie sú uvedené). Analýza ukazuje silný signálny potenciál pre prvých 33 zostatkov.

Okrem už spomenutej 33 aminokyselinovej signálnej sekvencie zahrnuje 154 ďalších N-koncových zostatkov ďalšie cysteínové zostatky, ktoré môžu tvoriť disulfidové mostíky a stabilizovať komformáciu proteínu a predikovať miesto amidácie (zostatky 118-121), ktoré sa môže dotýkať posttranslačného proteolytického spracovania. Ďalšie analýzy kompletnej C5-epimerázovej sekvencie ukazujú hydrofóbne úseky polypeptidu, ktoré môžu byť skryté alebo prestupovať cez membrány.

Sekvenčná analýza s ďalšími sekvenciami nájdenými v databázach odhaľuje horúce miesta homológie. Tieto výsledky sú zhrnuté na obrázkoch 4 a 5.

Na obrázku 5 je grafické znázornenie polypeptidovej sekvencie myšej C5-epimerázy. Ako je uvedené na obrázku 5, najväčšia evolučná konzervácia („horúce miesta“ homológie) sekvencie sa vyskytla viacej pri C-koncovej časti, v priestore s veľmi hydrofóbnym úsekom medzi aminokyselinovými zostatkami Trp497 a Leu523, čo ukazuje na to, že má byť skrytá v štruktúre podobnej proteínu alebo prebieha cez membránu, možno do lumenu golgiho aparátu, kde sa vie, že enzým pôsobí. Ďalší najdôležitejší a extendovaný konzervovaný úsek („horúce miesto“) sa vyskytuje medzi zostatkami Leu546 a His580 a môže obsahovať alebo zahrnovať aktívne miesto enzýmu. Funkčná signifikácia konzervácie polypeptidovej sekvencie (identita) >22 % bola upravená podľa publikovaných štúdii iných proteínov so známou funkciou (Branden, C a Tooze, J., Introduction to Proteín Structure, Garland Publishing, NY and London, 100-101 (1991)) a Wislon, Kreychman a Gerstein a ďalší autori citovaní v „Quantifying the relations between proteín sequence, structure, and function through traditional and probabilistic scores“ dostupné na http://bioinfo.mbb.yale.edu/e-print/ann-xferjmb/preprint.html. Ako je vysvetlené v tomto článku, neukázalo sa, žc presná funkcia je konzervovaná menej než z 30 až 40 % sekvenčnej zhody, ale funkčná trieda je konzervovaná z hľadiska sekvenčnej zhody z 20 25 % (pod 20 % už nie je všeobecná podobnosť konzervovaná). V súčastnej dobe SWISS-MODEL vytvára modely pre sekvencie, ktoré zodpovedajú týmto kritériám: BLAST hľadanie hodnoty P: <0.00001; globálny stupeň sekvenčnej zhody (SIM): >25 % a minimálna dĺžka predpokladaného modelu - 25 aminokyselín.

Na základe týchto skutočností je vidieť, že sekvencia z Drosophilla sa viacej podobá skvencii z myši (46,6 %) než sekvencii z C. elegans (39,6 %).

V inom type sekvenčnej analýzy bola predpokladaná trojrozmerná (3D) štruktúra sekvencie myšej C5-epimerázy porovnávaná s 3D štruktúrami podľa Kelleyho, L. A. et al., Mol. Biol. 299(2): 499-520 (2000). Z týchto porovnaní sa vychádza, že sekvencia C5-epimerázy má signifikantný vzťah k doméne chondroitinázy (chondroitín AC/alginát lyáza), ktorá je alfa/alfa toroídna. Chondroitín-AC-lyáza predstavuje rodinu enzýmov degradujúcich glykosamínglykany a súvislosť medzi štruktúrou a funkciou bola objasnená vďaka kryštalografickým štúdiám (Fetheire et al., J. Mol. Biol. 288: 635-647 (1999). Bolo zistené, že najvýraznejšia podobnosť 3D štruktúry so sekvenciou chondroitinázy je extendovaná z Ala408 blízko C-konca vnútorného hydrofóbneho (transmembránového) úseku do C-konca sekvencie myšej C5-epimerázy, a tak tento úsek obsahuje väčšinu konzervácie konzervovanej sekvencie, čo pravdepodobne ukazuje na doménu obsahujúcu aktívne miesto.

V každom z rekombinantných konštruktov bola C5-epimeráza značená. Pokiaľ bola značená, potom C5-epimerázovej sekvencii predchádzala sekvencia uvedená na obrázku 6B, ktorá obsahovala EGT signálny peptid pripojený na štiepiace miesto EGT signálu, enterokinázové štiepiace miesto, šesť histidínov a nakoniec rTEV protézové miesto. ETG signál je z proteínu bakulovírusu (ktorý infikuje hmyzie bunky). FLAG-sekvencia je epitop-značka používaná na detekciu a purifikáciu rekombinantného proteínu podľa výrobcom doporučeného spôsobu (Sigma) (Hopp, T. et al., Biotechnology 6:1204-1210 (1988)). Enterokináza je enzým používaný na odštiepenie sekvencie predchádzajúcej rozpoznávaciemu miestu enterokinázy. Ďalšou značkou je šesť po sebe idúcich histidínov. Na odstránenie predchádzajúcich sekvencii bolo využité tiež rTEV („recombinant tobacco edge vírus“) preoteázové miesto. EGT signál a FLAG™-znčka (IBI) boli získané z konštruktov pripravených v modifikovanom pFastBacTM (Life Technologies) vektore získanom od Dr. Christiana Oker-Bloma, VTT Biotechnology, P. O. Box 1500, VTT, Fmland. Purifikácia všetkých rekombinantných proteínov opísaných v tejto prihláške bola uskutočnená pomocou FLAG-značky.

Reprezentatívne dáta z testov aktivity a proteínovej analýzy týchto značených rekombinantných C5-epimeráz sú uvedené na obrázku 7, v tabuľke I a II. Na obrázku 7 sú uvedené výsledky z testov aktivity myšej C5-epimerázy (mC5), ktorá bola purifikovaná nad anti-FLAG Ml podľa výrobcom doporučeného spôsobu.

Test C5-epimerázovej aktivity na účely zmerania aktivity heterológneho proteínu bol uskutočňovaný podľa uvedeného príkladu 1. Celkový proteín bol extrahovaný z kultúr transformovaných s každým z konštruktov rekombinantnej C5-epimerázy, ktoré boli jednotlivo inokulované do hmyzích buniek pomocou expresívneho systému InsectSelect. Potom, čo bunky dosiahli konfluenciu, boli odobraté a lyzované a celkový proteín bol izolovaný a kvantifikovaný. Aktivita C5-epimerázy bola meraná vo forme uvoľňovania ³H z epimerázového substrátu v scintilačnom počítači. Epimerázová aktivita bola zmeraná oproti celkovému proteínu. Na obrázku 7 je uvedená aktivita so zvyšujúcim sa objemom vzorky (zriedenie 1 : 2 000). Celková aktivita bola 6 360 cpm/μΐ. Proteínová analýza (uskutočnená pomocou QuantiGold, Diversified Biotech) bola analyzovaná spôsobom podľa Stoscheka, C. M., Anál. Biochem. 760:301-305 (1987) a indikovala 3,2 μg/ml koncentráciu proteínu. Teda špecifická aktivita bola 2,0 x 10⁹ cpm/mg/h.

Na obrázku 8 je uvedený Westem blotting s anti-FLAG. Stĺpec 1 obsahuje štandardy molekulových hmotností (New England Biolabs, Broad Range, značené dopredu). Stĺpec 2 obsahuje celú myšiu C5-epimerázu. Značená celá myšia C5-epimeráza (obsahujúca zistené N-koncové dodatočné sekvencie) má dĺžku 618 aminokyselín, molekulovú hmotnosť (v daltonoch) 71 189,1, izoelektrický bod (pl) 8,25 a pri pH 7 výsledný náboj +4,01.

Na obrázku 9 je uvedený Westem blotting kultivačného média odobratého zo stálych hmyzích bunkových línii z rôznych klonov pre štyri značené rekombinantné C5-epimerázy opísané skôr, ktoré sú značené protilátkou proti anti-FLAG (020300). Stĺpec 1 obsahuje štandardy molekulových hmotností ako na obrázku 8, kde molekulové hmotnosti sú uvedené v ľavom stĺpci. Stĺpec 2 obsahuje skrátenú myšiu C5-epimerázu. Stĺpec 3 obsahuje pôvodnú hovädziu C5-epimerázu. Stĺpec 4 obsahuje myšiu : hovädziu chimérickú C5-epimerázu, v ktorej sú N-koncové myšie sekvencie vpravené do rámca hovädzích sekvencií, ako je uvedené na obrázkoch 2 a 3. Stĺpec 5 obsahuje celú myšiu C5-epimerázu. Chimérický myší : hovädzí konštrukt má približne rovnakú veľkosť ako konštrukt z celej myšej C5-epimerázy.

Relatívna aktivita rôznych rekombinantných konštruktov bola spočítaná na základe testov aktivity a denzitometrického merania Westem blottingu a je uvedená v tabuľke I. „truncC5“ je skrátená aminokyselinová sekvencia myšej C5-epimerázy, kde prvých 154 aminokyselín bolo odstránených takým spôsobom, že „TruncC5“ sekvencia má rovnaký N-koniec ako rekombinantná hovädzia sekvencia. „ExtC5“ je rekombinantný hovädzí C5-epimerázový polypeptid, ale „chC5“ označuje konštrukt myšej : hovädzej chimérickej C5-epimerázy kódovaný sekvenciou nukleovej kyseliny, ako je uvedené na obrázku 1. „mC5“ označuje sekvenciu celkovej myšej C5-epimerázy.

Tabuľka I

Relatívne aktivity rôznych rekombinantných C5-epimeráz

Vzorka	Hustota	Vzorka (μΐ)	Hustota/μΐ	Aktivita (cpm/μΐ)	Aktivita/hustota (Cpm/denzitometrická jedn.)
truncC5	15984	12	1332,0	20	0,015
extC5	6451	12	537,6	7	0,013
chC5	14960	12	1246,7	3455	2,771
mC5	13804	12	1150,3	3681	3,200

Špecifické aktivity rôznych čiastočne purifikovaných rekombinantných C5-epimeráz sú uvedené v tabuľke II.

Tabuľka II

Špecifické aktivity čiastočne purifikovaných rekombinantných C5-epimeráz

Vzorka	Celková Aktivita	Linearita (R2)	Proteín (mg/ml)	Špecifická aktivita (cpm/mg/h)
truncC5	39,5	0,9905	0,0129	3,06 x 106
extC5	9,1	0,9978	0,0092	9,89 x 105
chC5	919,7	0,9964	0,0026	3,54 x 108
mC5	2019	0,9969	0,0042	4,81 x 108

Ako je uvedené na obrázku 6B, pripravený chimérický myší : hovädzí konštrukt obsahoval aminokyselinové zostatky 34 až 154 N-koncovej sekvencie z myšej polypeptidovej sekvencie, ktoré bezprostredne nadväzovali na EGT-FLAG-His-RTEV elementy z obrázka 6B. Ale bolo zistené, že je tento rekombinantný enzým prevažne zadržiavaný v cytosole, pravdepodobne v dôsledku signálneho potenciálu myšej sekvencie.

Záver

Pridanie N-koncového fragmentu polypeptidu (Asp34 až Aspl54) z myšej génovej sekvencie zvyšuje aktivitu rekombinantnej C5-epimerázy o niekoľko rádov, aj keď táto časť sekvencie neobsahuje najväčší medzidruhový konzervovaný úsek. Bol ukázaný možný účinok značiek na aktivitu prvého rekombinantného hovädzieho konštruktu (odstránením značky; dáta nie sú uvedené) a môže zdôvodňovať malú mieru rozdielu, ale nie rozdiely v špecifických aktivitách medzi dlhšími a kratšími formami rekombinantnej C5-epimerázy o niekoľko rádov. V súčastnej dobe sa uskutočňujú štúdie na neznačených expresívnych konštruktoch a štúdie štruktúry a funkcie k lepšiemu definovaniu základu a mechanizmu regulácie aktivity tohto veľmi dôležitého rekombinantného enzýmu.

Výpis sekvencie <110> Biotie Therapies Corp.

<120> Glukuronyl-C5-epimeráza, DNA ji kódující a její použití <130>37186 <140>US 60/304,180 <141> 2000-12-08 <150>US 09/732,026 <151> 2000-12-08 <160> 2 < 170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 1854 <212>DNA <213> Mus Musculus <220>

<221>CDS <222> (1)..(1854) <400> 1

atg Met 1

cgt Arg

tgt Cys

ttg gca

get Ala

cgg gtc aac tat aag act ttg att

atc íle 15

atc íle

4 8

Leu

Ala 5

Arg Val

Asn Tyr Lys Thr Leu íle 10

tgt

gcg

cta

ttc

act

ttg

gtc

aca

gta

ctt

. ttg

í tgg

aat

aag

tgt

tcc

96

Cys

Ala

Leu

Phe

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Leu

i Leu

i Trp

Asn

. Lys

Cys

Ser

20

25

30

agc

gac

aaa

gca

atc

cag

ttt

cct

cgg

cac

ttg

agt

agt

gga

ttc

aga

144

Ser

Asp

Lys

Ala

íle

Gin

Phe

Pro

Arg

His

Leu

Ser

Ser

Gly

Phe

Arg

35

40

45

gtg

gat

gga

tta

gaa

aaa

aga

tca

gca

gča

tet

gaa

agt

aac

cac

tat

192

Val

Asp

Gly

Leu

G1U

Lys

Arg

Ser

Ala

Ala

Ser

Glu

Ser

Asn

His

Tyr

50

55

60

gcc

aac

cac

ata

gcc

aaa

cag

cag

tca

gaa

gag

gca

ttt

cct

cag

gaa

240

Ala

Asn

His

íle

Ala

Lys

Gin

Gin

Ser

Glu

Glu

Ala

Phe

Pro

Gin

Glu

65

70

75

80

caa

cag

aag

gca

ccc

cct

gtt

gtt

ggg

ggc

ttc

aat

agc

aac

ggg

gga

28 8

Gin

Gin

Lys

Ala

Pro

Pro

Val

Val

Gly

Gly

Phe

Asn

Ser

Asn

Gly

Gly

85

90

95

agc

aag

gtg

tta

ggg

ctc

aaa

tat

gaa

gag

att

gac

tgt

ctc

ata

aac

336

Ser

Lys

Val

Leu

Gly

Leu

Lys

Tyr

Glu

Glu

íle

Asp

Cys

Leu

íle

Asn

100

105

110

gat

gag

cac

acc

att

aaa

ggg

aga

ega

gag

ggg

aat

gaa

gtt

ttc

ctt

384

Asp

Glu

His

Thr

íle

Lys

Gly

Arg

Arg

Glu

Gly

Asn

Glu

Val

Phe

Leu

115

120

125

cca

ttc

act

tgg

gta

gag

aaa

tac

ttt

gat

gtt

tat

gga

aaa

gtg

gtc

432

Pro

Phe

Thr

Trp

Val

Glu

Lys

Tyr

Phe

Asp

Val

Tyr

Gly

Lys

Val

Val

130

135

140

cag

tat

gac

ggc

tat

gat

ega

ttt

gaa

ttc

tet

cat

agc

tat

t CC

aaa

480

Gin

Tyr

Asp

Gly

Tyr

Asp

Arg

Phe

Glu

Phe

Ser

His

Ser

Tyr

Ser

Lys

145

150

155

160

SK 286819 Β6

gtc Val

tat gca

cag Gin

aga tca Arg Ser 165

cct tat cac

cct gac ggt gtg ttt atg

tcc Ser

526

Tyr

Ala

Pro

Tyr

His

Pro 170

Asp

Gly

Val Phe

Met 175

ttt

gaa

ggc

tac

aat

gtg

gaa

gtc

ega

gac

aga

gtc

aaa

tgt

ata

agt

576

Phe

Glu

Gly Tyr

Asn

Val

Glu

Val

Arg

Asp

Arg

Val

Lys

Cys

íle

Ser

160

185

190

gga

gtt

gaa

ggt

gtg

cca

tta

tct

acc

cag

tgg

ggg

cct

caa

ggc

tat

624

Gly

Val

Glu

Gly

Val

Pro

Leu

Ser

Thr

Gin

Trp

Gly

Pro

Gin

Gly

Tyr

195

200

205

ttc

tac

cca

atc

cag

att

gca

cag

tat

ggg

cta

agt

cat

tac

age

aag

672

Phe

Tyr

Pro

íle

Gin

íle

Ala

Gin

Tyr

Gly

Leu

Ser

His

Tyr

Ser

Lys

210

215

220

aat

cta

acc

gag

aaa

ccc

cct

cac

ata

gaa

gta

tat

gaa

aca

gca

gaa

720

Äsn

Leu

Thr

Glu

Lys

Pro

Pro

His

íle

Glu

Val

Tyr

Glu

Thr

Ala

Glu

225

230

235

240

gac

agg

gac

aga

aac

atc

aga

cct

aat

gaa

tgg

act

gtg

ccc

aag

ggg

768

Asp

Arg

Asp

Arg

Asn

íle

Arg

Pro

Asn

Glu

Trp

Thr

Val

Pro

Lys

Gly

245

250

255

tgc

ttc

atg

gcc

agt

gtg

gca

gac

aag

tct

aga

tcc

acc

aat

gtt

aaa

616

cys

Phe

Met

Ala

Ser

Val

Ala

Asp

Lys

Ser

Arg

Ser

Thr

Asn

Val

Lys

260

265

270

cag Gin

ttt Phe

att get cca íle Ala Pro 275

gaa Glu

acc agt gaa ggt gtg

tct ttg cag

ctg Leu

gga Gly

8 64

Thr

Ser 280

Glu

Gly Val

Ser

Leu 285

Gin

aac

aca

aaa

gac

ttc

att

att

tca

ttt

gac

ctc

aag

ctt

tta

aca

aat

912

Asn

Thr

Lys

Asp Phe

íle

íle

Ser

Phe

Asp

Leu

Lys

Leu

Leu

Thr

Asn

290

295

300

ggg

agt

gtg

tct

gtg

gtt

ctg

gag

acc

aca

gaa

aag

aat

cag

ctc

ttc

960

Gly

Ser

Val

Ser

Val

Val

Leu

Glu

Thr

Thr

Glu

Lys

Asn

Gin

Leu

Phe

305

310

315

320

act

gtg

cat

tat

gtc

tca

aac

acc

cag

ctg

att

get

ttc

aga

gac

agg

looe

Thr

Val

His

Tyr

Val

Ser

Asn

Thr

Gin

Leu

íle

Ala

Phe

Arg

Asp Arg

325

330

335

gac

ata

tac

tac

ggc

att

ggg

ccc

aga

act

tca

tgg

agt

aca

gtt

acc

1056

Asp

íle

Tyr

Tyr

Gly

íle

Gly

Pro

Arg

Thr

Ser

Trp

Ser

Thr

Val

Thr

340

345

350

aga

gac

ctg

gtc

act

gac

ctc

agg

aaa

gga

gtg

ggc

ctt

tct

aac

aca

1104

Arg Asp

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

Arg

Lys

Gly 'Val

Gly

Leu

Ser

Asn

Thr

355

360

365

aaa

get

gtc

aag

cca

acc

aaa

atc

atg

ccc

aaa

aag

gtg

gtt

agg

ttg

1152

Lys

Ala

Val

Lys

Pro

Thr

Lys

íle

Met

Pro

Lys

Lys

Val

Val

Arg

Leu

370

375

380

att

gca

aaa

ggg

aag

gga

ttc

ctg

gac

aac

att

acc

atc

tca

acc

aca

1200

íle

Ala

Lys

Gly

Lys

Gly

Phe

Leu

Asp

Asn

íle

Thr

íle

Ser

Thr

Thr

385

390

395

400

gcc

cac

atg

get

gca

ttc

ttt

get

gca

agt

gac

tgg

cta

gtg

agg

aac

1248

Ala

His

Met

Ala

Ala

Phe

Phe

Ala

Ala

Ser

Asp

Trp

Leu

Val

Arg

Asn

405

410

415

cag

gat

gag

aaa

ggt

ggc

tgg

cca

att

atg

gtg

acc

cgg

aag

tta

ggg

1296

Gin

Asp

Glu

Lys

Gly

Gly

Trp

Pro

íle

Met

Val

Thr

Arg

Lys

Leu

Gly

420

425

430

SK 286819 Β6

gaa Glu

ggg Gly

ttt aaa

tct Ser

tta Leu

gaa Glu

cca gga tgg tac tct

gcc atg gca Ala Met Ala 445

caa Gin

1344

Phe 435

Lys

Pro 440

Gly

Trp

Tyr

Ser

ggg

caa

gcc

atc

tct

acc

tta

gtc

agg

gcc

tat

ctt

cta

acg

aaa

gac

1392

Gly

Gin

Ala

íle

Ser

Thr

Leu

Val

Arg

Ala

Tyr

Leu

Leu

Thr

Lys

Asp

450

455

460

tat

gta

ttc

ctc

agt

tca

get

tta

agg

gca

aca

gcc

cca

tac

aag

ttt

14 40

Tyr

Val

Phe

Leu

Ser

Ser

Ala

Leu

Arg

Ala

Thr

Ala

Pro

Tyr

Lys

Phe

465

470

475

480

ccg

tca

gag

cag

cat

gga

gtt

cää

gcc

gtg

ttc

atg

aat

aaa

cat

gac

14 88

Pro

Ser

Glu

Gin

His

Gly

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Met

Asn

Lys

His

Asp

485

490

4 95

tgg

tat

gaa

gaa

tat

cca

acc

aca

cct

age

tct

ttt

gtt

tta

aat

ggc

1536

Trp

Tyr

Glu

Glu

Tyr

Pro

Thr

Thr

Pro

Ser

Ser

Phe

Val

Leu

Asn

Gly

50C

505

510

ttt

atg

tat

tct

tta

att

ggg

ctg

tat

gac

cta

aaa

gaa

aca

gca

ggg

1584

Phe

Met

Tyr

Ser

Leu

íle

Gly

Leu

Tyr

Asp

Leu

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

515

520

525

gag

aca

ctt

ggg

aaa

gaa

gca

agg

tcc

ttg

tac

gag

cgc

ggc

atg

gaa

1632

Glu

Thr

Leu

Gly

Lys

Glu

Ala

Arg

Ser

Leu

Tyr

Glu

Arg

Gly

Met

Glu

530

535

540

tct

ctt

aaa

gcc

atg

ctg

ccc

ttg

tat

gat

act

ggc

tcc

ggg

acc

atc

1680

Ser

Leu

Lys

Ala

Met

Leu

Pro

Leu

Tyr

Asp

Thr

Gly

Ser

Gly

Thr

íle

545

550

555

560

tat

gac

ctc

cgc

cac

ttc

atg

ctt

ggc

att

get

ccc

aac

ctg

gcc

cgc

1728

Tyr Asp

Leu

Arg

His

Phe

Met

Leu

Gly

íle

Ala

Pro

Asn

Leu

Ala

Arg

565

570

575

tgg

gac

tat

cac

acc

acc

cac

att

aac

cag

ctg

cag

ctg

ctc

age

acc

1776

Trp

Asp

Tyr

His

Thr

Thr

His

íle

Asn

Gin

Leu

Gin

Leu

Leu

Ser

Thr

580

585

590

atc

gat

gag

tcc

cca

atc

ttc

aaa

gaa

ttt

gtc

aag

agg

tgg

aaa

age

1824

íle

Asp

Glu

Ser

Pro

íle

Phe

Lys

Glu

Phe

Val

Lys

Arg

Trp

Lys

Ser

595

600

605

tac

ctt

aaa

ggc

agt

agg

gca

aag

cac

aac

1854

Tyr

Leu

Lys

Gly

Ser

Arg

Ala

Lys

His

Asn

610

615

5	<210> 2 <211> 618 <212>PRT <213> Mus musculus <400> 2
	Met Arg Cys Leu Ala Ala Arg Val Asn Tyr Lys Thr Leu íle íle íle 15 10 15
	Cys Ala Leu Phe Thr Leu Val Thr Val Leu Leu Trp Asn Lys Cys Ser 20 25 30

SK 286819 Β6

Ser

Asp

Lys Ala 35

íle

Gin

Phe

Pro Arg 40

His

Leu Ser

Ser Gly 45

Phe

Arg

Val

Asp

Gly

Leu

Glu

Lys

Arg

Ser

Ala

Ala

Ser

Glu

Ser

Asn

His

Tyr

50

55

60

Ala

Asn

His

íle

Ala

Lys

Gin

Gin

Ser

Glu

Glu

Ala

Phe

Pro

Gin

Glu

65

70

75

80

Gin Gin Lys Ala

Pro Pro Val Val Gly Gly Phe Asn Ser A.sn Gly Gly 85 90 95

Ser

Lys

Val

Leu

Gly

Leu

Lys

Tyr

Glu

Glu

íle

Asp

Cys

Leu

íle

Asn

100

105

110

Asp

Glu

His

Thr

íle

Lys

Gly

Arg

Arg

Glu

Gly

Asn

Glu

Val

Phe

Leu

115

120

125

Pro

Phe

Thr

Trp

Val

Glu

Lys

Tyr

Phe

Asp

Val

Tyr

Gly

Lys

Val

Val

130

135

140

Gin

Tyr

Asp

Gly

Tyr

Asp

Arg

Phe

Glu

Phe

Ser

His

Ser

Tyr

Ser

Lys

145

150

155

160

Val

Tyr

Ala

Gin

Arg

Ser

Pro

Tyr

His

Pro

Asp

Gly

Val

Phe

Met

Ser

165

170

175

Phe

Glu

Gly

Tyr

Asn

Val

Glu

Val

Arg

Asp

Arg

Val

Lys

Cys

íle

Ser

180

185

190

Gly

Val

Glu

Gly

Val

Pro

Leu

Ser

Thr

Gin

Trp

Gly

Pro

Gin

Gly

Tyr

195

200

205

Phe

Tyr

Pro

íle

Gin

íle

Ala

Gin

Tyr

Gly

Leu

Ser

His

Tyr

Ser

Lys

210

215

220

Asn Leu Thr Glu 225

Lys

Pro Pro 230

His

íle

Glu Val 235

Tyr Glu

Thr Ala Glu 240

Asp

Arg

A.sp

Arg

Asn

íle

Arg

Pro

Asn

Glu

Trp

Thr

Val

Pro

Lys

Gly

245

250

255

Cys

Phe

Met

Ala

Ser

Val

Ala

Asp

Lys

Ser

Arg

Ser

Thr

Asn

Val

Lys

260

265

270

Gin

Phe

íle 275

Ala

Pro

Glu Thr

Ser 280

Glu

Gly

Val

Ser

Leu 285

Gin

Leu

Gly

Asn

Thr

Lys

Asp

Phe

íle

íle

Ser

Phe

Asp

Leu

Lys

Leu

Leu

Thr

Asn

290

295

300

Gly

Ser

Val

Ser

Val

Val

Leu

Glu

Thr

Thr

Glu

Lys

Asn

Gin

Leu

Phe

305

310

315

320

Thr Val His Tyr Val

Ser

.Asn

Thr Gin Leu 330

íle AJ.a

Phe Arg

Asp 335

Arg

325

Asp

íle

Tyr

Tyr

Gly

íle

Gly

Pro

Arg

Thr

Ser

Trp

Ser

Thr

Val

Thr

340

345

350

Arg

Asp

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

Arg

Lys

Gly

Val

Gly

Leu

Ser

Asn

Thr

355

/350

365

Lys

Ala

Val

Lys

Pro

Thr

Lys

íle

Met

Pro

Lys

Lys

Val

Val

Arg

Leu

370

375

380

íle

Ala

Lys

Gly

Lys

Gly

Phe

Leu

Asp

Asn

íle

Thr

íle

Set

Thr

Thr

385

390

395

400

Ala

His

Met

Ala

Ala

Phe

Phe

Ala

Ala

Ser

Asp

Trp

Leu

Val

Arg

Asn

405

410

415

Gin

Asp

Glu

Lys

Gly

Gly

Trp

Pro

íle

Met

Val

Thr

Arg

Lys

Leu

Gly

420

425

430

Glu

Gly

Phe

Lys

Ser

Leu

Glu

Pro

Gly

Trp

Tyr

Ser

Ala

Met

Ala

Gin

435

440

445

Gly

Gin

Ala

íle

Ser

Thr

Leu

Val

Arg

Ala

Tyr

Leu

Leu

Thr

Lys

Asp

450

455

460

Tyr

Val

Phe

Leu

Ser

Ser

Ala

Leu

Arg

Ala

Thr

Ala

Pro

Tyr

Lys

Phe

465

470

475

480

Pro

Ser

Glu

Gin

His

Gly

Val

Lys

Ala

Val

Phe

Met

Asn

Lys

His

Asp

485

490

495

Trp

Tyr

Glu

Glu

Tyr

Pro

Thr

Thr

Pro

Ser

Ser

Phe

Val

Leu

Asn

Gly

500

505

510

Phe

Met

Tyr

Ser

Leu

íle

Gly

Leu

Tyr

Asp

Leu

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

515

520

525

Glu

Thr

Leu

Gly

Lys

Glu

Äla

Arg

Ser

Leu

Tyr

Glu

Arg

Gly

Met

Glu

530

535

54 0

Ser

Leu

Lys

Äla

Met

Leu

Pro

Leu

Tyr

Asp

Thr

Gly

Ser

Gly

Thr

íle

545

550

555

560

Tyr

Asp

Leu

Arg

His

Phe

Met

Leu

Gly

íle

Ala

Pro

Asn

Leu

Ala

Arg

565

570

575

Trp

Asp

Tyr

His

Thr

Thr

His

íle

Asn

Gin

Leu

Gin

Leu

Leu

Ser

Thr

5B0

585

590

íle

Asp

Glu

Ser

Pro

íle

Phe

Lys

Glu

Phe

Val

Lys

Arg

Trp

Lys

Ser

595

600

605

Tyr

Leu

Lys

Gly

Ser

Arg

Ala

Lys

His

Asn

610

615

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný polynukleotid, ktorý obsahuje nukleotidová sekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň z 95 % zhodná s referenčnou aminokyselinovou sekvenciou skladajúcou sa z aminokyselín 1 až 618 zo SEQ ID NO:1.
2. 2. Polynukleotid podľa nároku 1, ktorý je DNA.
3. 3. Polynukleotid podľa nároku 1, ktorý je RNA.
4. 4. Polynukleotid podľa nároku 1, ktorý ďalej obsahuje heterológny polynukleotid.
5. 5. Polynukleotid podľa nároku 4, kde uvedený heterológny polynukleotid kóduje heterológny polypeptid.
6. 6. Polynukleotid podľa nároku 5, kde heterológny polynukleotid je umiestnený na 3'-konci nukleotidovej sekvencie.
7. 7. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6.
8. 8. Vektor podľa nároku 7, kde uvedený polynukleotid je funkčne pripojený na heterológny regulačný polynukleotid.
9. 9. Hostiteľská bunka obsahujúca polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6.
10. 10. Hostiteľská bunka podľa nároku 9, kde izolovaný polynukleotid je funkčne pripojený na heterológny regulačný polynukleotid.
11. 11. Spôsob produkcie proteínu, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje hostiteľská bunka podľa nároku 10 za takých podmienok, v ktorých je uvedený proteín exprimovaný, a získa sa uvedený proteín.
12. 12. Izolovaný C5-epimerázový polypeptid, ktorého aminokyselmová sekvencia je aspoň z 95 % zhodná so sekvenciou skladajúcou sa z aminokyselín 1 až 618 zo SEQ ID NO:1.
13. 13. Izolovaný polypeptid podľa nároku 12, ktorý je produkovaný alebo obsiahnutý v rekombinantnéj hostiteľskej bunke.
14. 14. Izolovaný polypeptid podľa nároku 13, kde rekombinantná hostiteľská bunka je hmyzia bunka.
15. 15. Izolovaný polynukleotid, ktorý obsahuje nukleotidová saekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň z 95 % zhodná s referenčnou aminokyselinovou sekvenciou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z:

    (a) aminokyselín 1 až 154 zo SEQ ID NO:1, (b) aminokyselín 35 až 154 zo SEQ ID NO:1, (c) aminokyselín 34 až 154 zo SEQ ID NO:1.

    SK 286819 Β6
16. 16. Polynukleotid podľa nároku 15, ktorý je DNA.
17. 17. Polynukleotid podľa nároku 15, ktorý je RNA.
18. 18. Polynukleotid podľa nároku 15, ktorý ďalej obsahuje heterológny polynukleotid.
19. 19. Polynukleotid podľa nároku 18, kde uvedený heterológny polynukleotid kóduje heterológny polypeptid.
20. 20. Polynukleotid podľa nároku 19, kde heterológny polynukleotid je umiestnený na 3'-konci nukleotidovej sekvencie.
21. 21. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 20.
22. 22. Vektor podľa nároku 21, kde uvedený polynukleotid je funkčne pripojený na heterológny regulačný polynukleotid.
23. 23. Hostiteľská bunka obsahujúca polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 20.
24. 24. Hostiteľská bunka podľa nároku 23, kde izolovaný polynukleotid je funkčne pripojený na heterológny regulačný polynukleotid.
25. 25. Spôsob produkcie proteínu, vyznačujúci sa tým, že sa kultivujú hostiteľské bunky podľa nároku 24 za takých podmienok, v ktorých sa uvedený protein exprimuje, a získa sa uvedený protein.
26. 26. Izolovaný C5-epimerázový polypeptid obsahujúci N-koncový fragment, ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň z 95 % zhodná so sekvenciou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z:

    (d) aminokyselín 1 až 154 zo SEQ ID NO:1, (e) aminokyselín 35 až 154 zo SEQ ID NO:1, (f) aminokyselín 34 až 154 zo SEQ ID NO: 1.
27. 27. Izolovaný polypeptid podľa nároku 26, ktorý je produkovaný alebo obsiahnutý v rekombinantnej hostiteľskej bunke.
28. 28. Izolovaný polypeptid podľa nároku 26, kde rekombinantná hostiteľská bunka je hmyzia bunka.
29. 29. Spôsob významného zvýšenia aktivity C5-epimerázy, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:

    a) získanie prvého polynukleotidu obsahujúceho nukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň z 90 % zhodná s referenčnou aminokyselinovou sekvenciou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z aminokyselín 35 až 154 zo SEQ ID NO:1 a aminokyselín 34 až 154 zo SEQ ID NO:1;

    b) pripojenie uvedeného prvého polynukleotidu definovaného v (a) na druhý polynukleotid kódujúci C5-epimerázu a

    c) expresiu fúzovaného polynukleotidu.
30. 30. Spôsob významného zvýšenia aktivity C5-epimerázy podľa nároku 29, vyznačujúci sa t ý m , že prvý polynukleotid obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia obsahuje aminokyseliny 35 až 154 zo SEQ ID NO:1.
31. 31. Spôsob významného zvýšenia aktivity C5-epimerázy podľa nároku 29, vyznačujúci sa t ý m , že prvý polynukleotid obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia obsahuje aminokyseliny 34 až 154 zo SEQ ID NO:1.
32. 32. Spôsob významného zvýšenia aktivity C5-epimerázy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 29 až 31, v y značujúci sa tým, že C5-epimeráza je hovädzia C5-epimeráza.