BG107975A - Глюкуронил с5-епимераза, днк, която я кодира и нейните приложения - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до нова пречистена С5-епимераза, нейни фрагменти, нуклеинови киселини, които я кодират, и неин рекомбинантен продукт. Изобретението се отнася също и до фрагменти на тази епимераза, по-специално N-крайни фрагменти, които са приложими за получаване на фузионни протеинови структури за повишаване активността на рекомбинантно получени хетероложни епимеразни ензими. а

Description

Изобретението е от областта на рекомбинантните протеини и по- специално, глюкуронил С5- епимераза и нейното използване за модификация на глюкозаминогликани.

Ниво на изобретението

Глюкуронил С5- епимеразата (тук, “С5-епимераза) катализира превръщането на D- глюкуроновата киселина (GlcA) в L- идуронова киселина (IdoA) във втория етап на полимерна модификация на хепарин/хепарин сулфатната (HS) синтеза. Епимеразата включена в хепарин/HS синтеза има едно абсолютно изискване за N- сулфат в нередуциращото място на мишенния НехА, формирането на който се катализира от N- деацетилазо- N- сулфотрансфераза (NDST) в първия (предшевстващ) етап на биосинтетична полимерна модификация. Така също, епимеразата се инхибира чрез Осулфатни групи в близост до нейното място на действие, така че етапите на 0- сулфатизация по- късно в хепариновата биосинтеза инхибира епимеризацията или обратната- епимеризация. Реакцията включва обратимо отстраняване или обратимо добавяне на протон при С5 от мишенната хексуронова киселина, чрез карбанионно междинно съединение, и се счита, че включва две полипротични основни амино киселини (по- специално Lys).

03/396/02/ПБ

• · · · · · • · · ·

С5- епимеразата, като други ензими включена в хепарин/HS биосинтезата, явно е мембранно- свързана или асоциирана в апарата на Голджи. Интересно е това, че солюбилизирана епимераза катализира и двете (обратими) реакции, но от микрозомалните фракции не може да бъде установена обратна епимеризация. С5- епимеразният активен протеин най- напред е пречистен и охарактеризиран от черен дроб (Campbell et al., J. Biol. Chem. 269: 26953- 26958 (1994)).

Campbell et al., докладват пречистването на D- глюкуронил C5епимераза от говежди черен дроб (Campbell et al., J. Biol. Chem. 269: 26953- 26958 (1994)) и са докладвани няколко ДНК последователности. Доколкото предсказаният размер на говеждата епимераза от геномна и сДНК последователости е 70.1 KD (618 амино киселини) (обсъдено по- долу), най- пречистеният нативен препарат, екстрахиран като този по- горе, съдържа предоминантни видове от 52 и 20 kDa, което показва, че може да протече протеолитичното разграждане. Установяването на активността в поголеми MW (200 kDa) фракции чрез ситова хроматография показва, че може да протече агрегация или олигомеризация. Ензима има широк pH интервал (6.5- 7.5) на активност, с оптимум от 7.4. Ензима не изисква метален йон или друг кофакторен елемент. Кинетичните изследвания неочаквано показват, че К_т се повишава с повишаване на ензимната концентрация, вероятно свързано с полимерния субстрат и етерични пречки, и/ или олигомеризация на епимеразните молекули.

Наскоро, Lindahl, U and Li, J-P., W098/48006, са пречистили 52 kDa С5- епимеразата от говежди черен дроб и са получили частична амино киселинна последователност. Създадени са праймери срещу една вътрешна последователност и са използвани за

03/396/02/ПБ • · · • · · ·

амплифициране на последователност от говежди чернодробен сДНК препара. Говеждата чернодробна последователност е използвана за скрининг на говежда белодробна сДНК библиотека. Намерена е оследователност, притежаваща отворена четяща рамка от 444 амино киселини, която съответства на полипептид от 49.9 kDa. Твърди се, че ензима, изолиран по- рано от говежди черен дроб е срязан от нативния протеин. Анализирана е тотална РНК от говежди черен дроб, бял дроб и миша мастоцитома чрез хибридизация към говеждия белодробен епимеразен сДНК клон. И двата- говежди черен дроб и говежди бял дроб, дават идентични резултати, с доминантен транскрибт от около 9 kb и слаба 5 kb връзка. Мишата мастоцитомна РНК показва само транскрибт от около 5 kb.

Доклада от клонирането на сДНК, кодираща С5- епимераза от говежди бял дроб е публикуван в Li et al. J. Biol. Chem 272: 2815828163 91997). Li et al. клонират и експресират говеждата белодробна епимераза в бакуловирус/ насекомна клетъчна система, която първа показва активност срещу клонирана (рекомбинантна) последователност. Активният рекомбинантен протеин не е пречистен за дефинитивно назначение.

Докладвани са С5- епимеразни сДНК последователности от Drosophila (GenBank Accession Number AAF573773), C. elegans (GenBank Accession Number P46555) и Methanococcus (GenBank Accession Number U67555).

Ензимната активност на рекомбинантната говежда епимераза, докладвана от Lindahl et al. е относително ниска. Обаче, опитите за експресия на говеждата белодробна С5- епимераза, самостоятелно клонираната епимераза от бозайник, в системи които може да доведат до по- добра продуктивност са се провалили. Направени са опити за експресия в клетки на бозайник, Saccharomices cerevisiae,

03/396/02/ПБ • ·

and Е. coli. Към настоящата дата, няма докладвани случаи за успешно продуциране на разтворима, активна С5- епимераза. Поради това, не е било възможно да се разширят резултатите от ранни бакуловирусни клетъчни системи до други рекомбинантни системи или да се използват конвенционални методи за експресия като бозайници, дрожди и бактерии за експресия на този ензим.

Така, остава необходимостта от високо активна С5епимераза, и за методи за продуциране на по- големи количества от нея.

Общо за изобретението

Установявайки факта, че съществуват проблеми с недефинирана природа, свързани с експресията на рекомбинантните епимерази, с произхожд от бозайници и знанието за необходимостта от полезен метод за експресиране и продуциране на полезни количества от С5-епимераза, изобретателите са изследвали методи за получаване на рекомбинантна С5- епимераза. Изследванията са завършили с откриването на нов миши ген, и миши С5- епимеразен протеин, кодиран от него. Мишата С5V епимераза от изобретението е уникална, inter alia, по това, че съдържа допълнителни последователности в техния N- край в сравнение с известните последователности на С5- епимеразния протеин. Неочаквано е установено, че сливането на мишият С5епимеразен N- краен фрагмент, или негова скъсена версия, в N- края на други епимерази, много силно повишава активността на такива други рекомбинантни С5- епимерази. Така, разширението на мишият N- край може да бъде използвано за улеснение експресията на последователности, които са оперативно свързани към тях, и по03/396/02/ПБ

специално, експресията на нативна (чернодробен) и хетероложна (както миша, така и не- миша не- чернодробна) форми на С5епимерази в рекомбинантни системи.

Съответно, в първи вариант на изпълнение, изобретението е насочено към пречистени и/ или изолирани полинуклеотиди, кодиращи миша чернодробна С5- епимераза, и рекомбинантни вектори и гостоприемници за нейното поддържането и експресия.

В следващ вариант на изпълнение, изобретението е насочено към пречистен и/или изолиран миши С5- епимеразен протеин, кодиран чрез такива полинуклеотиди, или препарати, които ги съдържат.

В следващ вариант на изпълнение, изобретението е насочено към методи за продуциране на миша С5- епимераза с помощта на такива полинуклеотиди и рекомбинантните вектори и гостоприемници от изобретението за нейната експресия.

В следващ вариант на изпълнение, изобретението е насочено към полинуклеотиди, по- специално пречистени и/или изолирани полинуклеотиди, кодиращи фузионен протеин, като фузионен протеин съдържащ N- крайната последователност на С5- епимераза, оперативно свързана в рамка към амино киселинната последователност от желания протеин, и по- специално, хетероложна С5- епимеразна последователност и вектори и гостоприемници за поддържането и експресията на такива полинуклеотиди.

В следващ вариант на изпълнение, изобретението е насочено към пречистен и/или изолиран С5- епимеразен фузионен протеин, кодиран от такива полинуклеотиди.

В следващ вариант на изпълнение, изобретението е насочено към методи за продуциране на желан протеин, чрез оперативно

03/396/02/ПБ свързване на полинуклеотид, който кодира мишата С5- епимераза, или нейната N- крайна последователност, към полинуклеотид, който кодира такъв желан протеин, и към експресиране на същия в рекомбинантен гостоприемник от изобретението.

В следващ вариант на изпълнение, изобретението е насочено към полинуклеотидни последователности и вектори, които предоставят полинуклеотиди, кодиращи фрагмента на N- крайната полинуклеотидна последователност на миша С5- епимераза, като полинуклеотиди и вектори, притежаващи желаните места на рестрикция при 3’- края на фрагмента за инсерция (свързване) на чг желаната последователност, по- специално, последователност която кодира желан протеин, и по- специално, друга епимеразна последователност.

В друг вариант на изпълнение, изобретението се отнася до методи за използване на N- крайна последователност от миша С5епимераза за експресирането на нативни и хетероложни последователности, свързани към нея.

Кратко описание на фигурите v Фигура 1. ДНК последователност на фузионен протеин, притежаващ последователността на говеждата С5- епимераза (с неудебелени букви) и N- края на миша С5- епимераза (удебелени). Отворената четяща рамка (ORF), показваща полипептида, който кодира последователността е подчертана.

Фигура 2. Пълната ДНК последователност на миша С5епимераза.

03/396/02/ПБ

Фигура 3. Пълната амино киселинна последователност на миша С5- епимераза.

Фигура 4. Анализ на подреждането на миша С5- епимераза спрямо други последователности, показващи участъци на хомоложност. Отчитането е показано на горната линия и е изброено в колона след източника на последователностите. Последователностите са взети от следните източници: линия 2: миши черен дроб; линия 3: говежди бял дроб; линия 4: човешки EST; линия 5: Drosophila; линия 6: С. elegans; линия 7: Methanococcus.

Фигура 5. Диаграмно представяне на домейн структурата на миша С5- епимераза. Плътна правоъгълна кутия при N- края: сигнална последователност (силно хидрофобна трансмембранна (ТМ) последователност); защтриховани правоъгълни кутии: в рамките на пептида: консервативни пептидни последователности, притежаващи повече от 50% сходство с С. elegans 71.9 KD хипотетичен протеин.

к. Фигура 6А- 6В. Фигура 6А: Диаграмно представяне на продуктите на белязаните рекомбинантни (говежди) С5- епимеразни структури. I: Първа активна белязана рекомбинантна (говежда) С5епимеразна структура. Специфичната активност е 5 х 10⁵ cpm/mg/h. ii: Най- активната рекомбинантна (напълно миша) С5 структура. Специфичната активност е 2 х 10⁹ cpm/mg/h. iii: Химерна структура, притежаваща и миша, и говежда последователности. Активността е 87% от активността на мишата последователност с пълна дължина, iv: Срязана миша структура. Активността е същата както на

03/396/02/ПБ говеждата структура в “i”. Фигура 6В: последователност и домейн информация за удължението, което предшевства всяка рекомбинантна структура на Фигура 6А.

Фигура 7. Резултати от изпитването на активността на миша С5- епимераза (тС5).

Фигура 8. Оцветяване по Western с анти- FLAG. Линия 1: стандарти на молекулярно тегло (New England Biolabs’ Broad Range, предварително оцветяване). Линия 2: Проба на миша С5- епимераза w (тС5).

Фигура 9: Оцветяване по Western на протеините в средата от стабилни клетъчни линии на клонове, съдържащи различни маркирани рекомбинанти С5- епимерази, оцветени с анти- FLAG антитяло.

Подробно описание на предпочитаните варианти на изпълнение w Клонира се миши чернодробен ген, кодиращ С5- епимераза.

Нуклеотидната последователност е показана на Фигура 2. Установено е, че амино киселинната последователност на мишия чернодробен С5- епимеразен протеин е с дължина 518 амино киселини (Фигура 3), с молекулно тегло от 71, 180.1 далтона (71.18 кОа).Мишата С5- епимераза има изоелектрична точка от 8.25 и натоварване при pH 7 от +4.01.

Амино киселинната последователност на миша чернодробна С5- епимеразна последователност, без която и да е N- крайна

03/396/02/ПБ екстензия е хомоложна (>96% амино киселинна идентичност) на говеждата С5- епимеразна последоватленост. Обаче, секвенционният анализ показа, че N- края на ензима, който е кодиран от мишата геномна последователност, съдържа допълнителни 154 амино киселини (аа), които “липсват” от клонираната говежда последователност.

Мишата кодираща последователност показва > 95% пептидна идентичност с кореспондиращата говежда и човешка (експресирано секвенционно удължение от сДНК библиотека от мозък) последователности, >50% сходство с хипотетичен 71.9 kDa протеин от експресирана последоватлност от С. elegans, и 38% сходство с протеин от експресирана последователност от Methanococcus sp.

Предсказаната трансмембранна топология на мишия С5епимеразен ензим подсказва сходство с NDST. Тези и други наблюдения (напр. скорост на хепариновата синтеза) показват, че С5- епимеразата и други ензими от хепариновата биосинтеза са вероятно свързани в комплекс in vivo.

Рекомбинантната миша С5- епимераза, както е експресирана и секретирана от един инсектициден клетъчен сигнал, от бакуловирусна инсектицидна клетъчна система, е най- стабилна в w среда при 4°С. Пречистването на рекомбинатната С5- епимераза може да включва, но не се ограничава до, такива процеси като обмяна на катиони или афинитетна хроматография. Например, рекомбинантният протеин може да бъде конструиран така, че да съдържа FLAG- удължение или His- удължение, което да е разположено в който и да е край от рекомбинантния протеин. Както би преценил специалиста в областта в такива случаи, рекомбинантния протеин може да бъде пречистен с помощта на търговско достъпни смоли, които използват, например, анти- FLAG

03/396/02/ПБ

W· моноклонални антитела за улавяне на рекомбинантния протеин, съдържащ FLAG епитопа.

Най- добре е изпитан ензима чрез двуфазова екстракция на тритий, освободен он С5- маркиран субстрат в един органичен сцинтилационен коктейл, и преброяване, макар окончателното потвърждение на активността да става чрез NMR анализ на превърнатия продукт, както е описано в примерите.

Нативния чернодробен ензим има специфична активност от 510 X 10⁹ cpm/mg/h, докато този на рекомбинантната форма на мишия ензим е около 2 х 10⁹ cpm/mg/h. За сравнение, рекомбинантният говежди ензим има специфична активност от около 0.5- 1.0 х 10⁶ cpm/mg/h. Поради това, рекомбинантният миши ензим е една специално активна С5- епимераза.

Неочаквано е установено, че 154 амино киселинният (аа) IMкрай от мишата С5- епимераза, и негови специфични фрагменти, имат способността да бъдат повече способни да повишат ензимната С5- епимеразна активност на други С5- епимерази, когато бъдат сляти в- рамка към техния N- край. Този допълнителен 154 аминокиселинен (аа) фрагмент явно има най- малко три характеристики, които са желателни за рекомбинантната експресия и секреция на една активна С5- епимераза. Първо, тя включва последователност, която се счита че функционира като сигнална последователност, обхваната от първите 33- 34 остатъка (амино киселини 1- 33 или 1- 34 от Фигура 3). Второ, осигуряват се допълнителни цистеинови остатъци, които не са способни да формират дисулфидни мостове и да стабилизират вторична протеинова структура. Трето, осигурява се място на амидиране, което е съседно на мястото, приложимо за посттранслационна протеолитична обработка.

03/396/02/ПБ • · · · · · • * · ·

Фрагменти от 154 амино киселинната последователност, която не притежава сигналната последователност, все още притежават способността да подсилват активността на хетероложните епимерази, и по- специално С5- епимерази, към които са оперативно свързани. Например, както е показано в примерите, фузионен протеин който съдържа амино киселини 34- 154 директно свързан в рамка към N- края на говеждата С5- епимераза, подсилва активността на говеждата С5- епимераза над 100-кратно.

Молекули нуклеинови киселини

Настоящето изобретение предлага изолирани молекули нуклеинови киселини, включващи:

(1) полинуклеотид, кодиращ мишия чернодробен С5епимеразен полипептид, притежаващ амино киселинната последователност, показана на Фигура 3.

(2) Полинуклеотид, кодиращ полезни фрагменти на мишия чернодробен С5- епимеразен полипептид, притежаващ амино киселинната последователност, показана на фигура 3, такива полезни фрагменти включващи, но не и ограничени до (а) фрагменти, които осигуряват сигналната последователност от амино киселини 1-33 или 1-34; (б) фрагменти, които осигуряват зрялата миша чернодробна С5- епимеразна протеинова последователност, и по- специално амино киселини 33- 618 и (с) фрагменти, които осигуряват последователността на стимулиращия активността Nкраен фрагмент с амино киселини 1- 154 и включваща нейни фрагменти като амино киселини 33- 154 или 34- 154, които притежават способността да засилват активността на дре С5епимерази, към които са оперативно свързани.

03/396/02/ПБ • ♦ · ·

Доколкото друго не е означено, всички нуклеотидни последователности, определени чрез секвениране на ДНК молекулата, тук са определени както е описано в примерите, и всички амино киселинни последователности на полипептидите, кодирани от ДНК молекулите, определени тук, са предсказани чрез транслация на ДНК последователността, определена както по- горе. Поради това, както е известно в областта за която и да е ДНК последователност, определена с този подход, която и да е определена тук нуклеотидна последователност може да включва някои грешки. Нуклеотидните последователности са обикновено наймалко около 90% идентични, още повече най- малко 95% до наймалко 99.9% идентични на актуалната нуклеотидна последователност от секвенираната ДНК молекула. Актуалната последователност може да бъде по- внимателно определена с други подходи, включително методите на мануално ДНК секвениране, които са добре известни в областта. Както се знае от специалистите в областта, единична инсерция или делеция в детерминирана нуклеотидна последователност, в сравнение с актуалната последователност ще причини рамково разместване в транслацията на нуклеотидната последователност така, че предсказаната амино киселинна последователност, кодирана от определена нуклеотидна последователност ще бъде напълно различна от амино киселинната последователност, актуално кодирана от секвенираната ДНК молекула, започвайки от мястото на такава инсерция или делеция.

Под “нуклеотидна последоватленост” на молекула нуклеинова киселина или полинуклеотид се предполага ДНК молекула или полинуклеотид, последователност на дезоксирибонуклеотиди, и РНК молекула или полинуклеотид, съответната последователност на рибонуклеотиди (A, G, С и U), където всеки тимидинов

03/396/02/ПБ • · · · · · дезоксирибонуклеотид (Т) в специфичната дезоксирибонуклеотидна последователност е заместен от рибонуклеотида уридин (U).

С помощта на информацията, предложена тук, като нуклеотидните последователности, изложени на Фигурите и секвенционния листинг, молекула нуклеинова киселина от настоящето изобретение кодираща С5- епимеразния полипептид, или негова химерна структура, може да бъде получена с помощта на стандартни процедури на клониране и скриниране, като тези за клониране на сДНК с помощта на тРНК като изходен материал. Като илюстрация на изобретението, С5- епимеразната молекула нуклеинова киселина, описана на фигури 2 и 3, е открита в сДНК библиотека, получена от мишачернодробна тъкан.

Определената нуклеинова киселина от С5- епимеразната ДНК на Фигура 2 съдържа отворена четяща рамка, кодираща протеин около 168 амино киселинни остатъка, с инициаторен кодон в нуклеотидна позиция 1 от нуклеотидните последователности на Фигура 2.

Както става ясно за специалиста в областта , благодарение на възможността на съгласуване на грешките, обсъждани по- горе, актуалния пълен С5- епимеразен полипептид, кодиран от последователността от фигура 2, който включва около 618 амино киселини както е показано на фигура 3, може да бъде по- къс или подълъг. В някои случаи, както е описано по- долу, изобретението понататък предлага полипептиди с различни остатъци, делетирани от N- края или С- края на пълния полипептид, включително полипептидите, на които липсват една или повече амино киселини от N- края или С- края на екстрацелуларната област, описана тук.

Молекулите нуклеинова киселина от изобретението включват такива, които кодират С5- епимеразна сигнална последователност,

03/396/02/ПБ • * · · » · • · · · · ·

Чин както е показано на Фигура 3, която е с 1-33 или 1-34 от амино киселинната последователност, показана на Фигура 3. такива молекули могат да бъдат оперативно свързани в рамка към която и да е от описаните нуклеотидни последователности, по- специално такава, която кодира желан протеин , който да се секретира от гостоприемник, където С5- епимеразната сигнална последователност е способна да секретира.

В допълнение, молекулите нуклеинова киселина от изобретението включват тези, които кодират миши чернодробна “засилващи хетероложната активност” С5- епимеразна последователност, която представлява 1-154 или най- малко 30 амино киселини от нея, както е показано на Фигура З.Това, което се има предвид с термина “хетероложна” нуклеинова киселина, е добре известно на специалиста в областта, като получена нуклеинова киселина от различни видове. За предпочитане, такива молекули нуклеинова киселина 1-154, 33- 154 или 34- 154 както е показано на Фигура 3, плюс или минус 1,2,3,4,5,6,7,8,9 или 10 амино киселини от единия или и от двата края. Нуклеинова киселина, кодираща такъв полипептид може да бъде оперативно свързан, в рамка, към кодираща последователност за друга епимераза, по- специално друга С5- епимерази, с резултата, че фузионен протеи е кодиран от структурата на нуклеиновата киселина. В предпочитан вариант на изпълнение, хетероложните засилващи активността последователности се експресират в N- края на фузионния протеин и са свързани към N- края на друг протеин, чиято активност е повишена от пирсъствието на мишата последователност, поспециално не- миша С5- епимераза или изозим от мишата Сепимераза.

03/396/02/ПБ «« ···· ·♦ ···· • ··· ·,.· · .......

Както е показано, молекулите нуклеинови киселини от настоящето изобретение могат да бъдат под формата на РНК, като мРНК, или под формата на ДНК, включително например, сДНК и геномна ДНК, получена чрез клониране или продуцирана синтетично. ДНК може да бъде двойно- верижна или едноверижна. Едноверижната ДНК или РНК може да бъде кодираща верига, известна също като смислова верига, или може да бъде некодираща верига, отнасяна също като безсмислова верига.

Под “изолирани” молекули нуклеинова киселина се подразбира молекула нуклеинова киселина, ДНк или РНК, които са отделени от тяхната естествена околна среда. Например, Рекомбинантните молекули нуклеинова киселина, включени във вектор се считат за изолирани за целите на настоящето изобретение. Други примери на Изолирани ДНК молекули включват рекомбинантни ДНК молекули, поддържани в хетероложни гостоприемникови клетки или пречистени (частично или по същество) ДНК молекули в разтвор. Изолираните РНК молекули включват in vivo или in vitro РНК транскрибти на ДНК молекули от настоящето изобретение. Изолирани молекули нуклеинова киселина съгласно настоящето изобретение по- нататък включват такива молекули, които са продуцирани синтетично.

Изолирани молекули нуклеинова киселина от настоящето изобретение включват ДНК молекули, които съдържат отворена четяща рамка (ORF), кодираща С5- епимеразен протеин или фузионен протеин от изобретението. ДНК молекулите, включващи кодиращата последователност за С5- епимеразния протеин, както е показано на Фигура 2, или желан негов фрагмент, и ДНК молекули, които включват последователност, по същество различна от описаните по- горе, но които, благодарение на дегенерацията на

03/396/02/ПБ <· ···· ^β· ···· ···· генетичния код, все още кодират С5- епимеразната протеинова амино киселинна последователност, както е показана на Фигура 3. Разбира се, генетичният код е добре известен на специалистите в областта. Така, би било рутинно за специалиста да генерира варианти. В друг вариант на изпълнение, предложени са молекули нуклеинова киселина, които кодират С5- епимеразния полипептид както по- горе, но на който липсва Ν- крайния метионин, или сигналната последователност, кодирана от амино киселини 1-33 или 1-34 както е показано на Фигура 3, или притежаваща кодираща последователност с различна (хетероложна) сигнална последователност, оперативно свързана към първата.

Изобретението по- нататък предлага не само молекулите нуклеинова киселина, описани по- горе, но също и такива, които са комплементарни на горните последователности. Такива изолирани молекули, по- специално ДНК молекули, са приложими като сонди за картиране на гени, чрез in situ хибридизация с хромозоми, и за откриване на експресията на С5- епимеразния ген в различни видове и тъкани, например, чрез Northern blot анализ.

Настоящето изобретение по- нататък е насочено към фрагменти от изолираните молекули нуклеинови киселини, описани тук, които притежават желани свойства или които кодират полипептид, притежаващ желаното свойство или активност. Под фрагмент от изолирана молекула нуклеинова киселина, както е описано по- горе, се разбира фрагменти с размер най- малко около 15 нуклеотида (nt), за предпочитане най- малко около 20 nt, и още по- добре около 30 nt, и дори още по- добре около 40 nt в дължина, които са приложими като диагностични сонди и праймери, както бе дискутирано по- горе, или за осигуряване на желан мотив или области за сливане на протеинови структури. Разбира се, по- големи

03/396/02/ПБ ······ ······ · ···· 17 • · · · · · · · · • · · ··· ··· • · · · · · · · · · ·· · ·· · ·· ·· фрагменти 5- 300 nt, или дори 600 nt в дължина също са приложими съгласно настоящето изобретение, тъй като са фрагменти, съответстващи на по- голямата част, но не на цялата нуклеотидна последователност, показана на фигура 2 или кодиращи амино киселинната последователност от Фигура 3. Под фрагмент с големина най- малко 20 nt дължина, сравнен с този от фигура 2, например, се разбират фрагменти, които включват 20 или повече съседни бази от нуклеотидната последователност, както е показана на Фигура 2.

По- специално, изобретението предлага полинуклеотиди, притежаващи нуклеотидна последователност, представляваща частта от тази, показана на Фигура 2 или кодираща амино киселинната последователност, показана на Фигура 3. Имат се предвид също и полинуклеотиди, кодиращи С5- епимеразни пептиди, които не съдържат амино краен метионин. Полипептиди, кодирани от такива полинуклеотиди също са предложени, като тези полинуклеотиди включват амино киселинна последователност в позиции 2 до 618 от амино киселинната последователност, показана на фигура 3, но не съдържат амино краен метионин.

В друг аспект, изобретението предлага изолирана молекула нуклеинова киселина, съдържаща полинукпеотид, който се хибридизира при строги хибридизационни условна към част или за предпочитане целия полинукпеотид в молекула нуклеинова киселина от описаното по- горе изобретение. Под част се разбира която и да е желана част, например, полинуклеотида от Фигура 2, който кодира амино киселини 1-154 или 33- 154 или 34- 154. Под “строги хибридизационни условия” се разбира инкубация в продължение на една нощ при 42°С в разтвор, съдържащ: 50% формамид, 5х SSC (750 mM NaCI, 75 тМ тринатриев цитрат), 50 тМ

03/3 96/02/ПБ ······ ······ ······18 ··· ······ ··· ···· ♦ · · · ··· · · ····· ·· · ·· · ·· · · натриев фосфат (pH 7.6№р 5х разтвор на Денхардт, 10% декстранов сулфат и 20 pg/ml денатурирана спермална ДНК от пъстърва , последвано от промиване на филтрите в 0.1 х SSC при около 65°С.

Под полинуклеотид, който се хибридизира към “част” от полинуклеотид се предполага полинуклеотид (както ДНК, така и РНК), който се хибридизира към най- малко около 15 нуклеотида (nt), и за предпочитане най- малко около 30 nt, и дори повече предпочитано около 30- 70 (напр. 50) nt от предпочитания полинуклеотид. Те са приложими като диагностични сонди и праймери както е обсъдено по- горе в повече подробности по- долу.

Од част от полинуклеотид с “най- малко 20 nt дължина”, например, се разбира 20 или повече съседни нуклеотида от нуклеотидната последователност на референтния полинуклеотид (напр. нуклеотидната последователност както е показана на Фигура 2). Разбира се, полинуклеотид който се хибридизира само към поли А последователност, или към комплементарна част от Т (или U) остатъците, няма да бъде включена в полинуклеотид от изобретението, използван да се хибридизира към част от нуклеинова киселина от изобретението, доколкото такъв полинуклеотид би се хибридизирал към която и да е от молекулите нуклеинова киселина, съдържаща поли (А) частта или нейния комплемент (напр. практически всеки двойно- верижен сДНК клон).

Както е посочено, молекулите нуклеинова киселина от настоящето изобретение, които кодират С5- епимеразния полипептид може да включват, но не са ограничени до кодиращата последователност за полипептида (наричана още зряла С5епимераза, когато не съдържа секреционен сигнал); кодиращата последователност за полипептида и допълнителни последователности, като тези кодиращи лидерна или секреторна

03/396/02/ПБ ··· ··· ···· ·· · ·· · ·· · · последователност, като пре-, или про- или препро- протеинова последователност; кодиращата последователност от полипептида, с или без посочените по- горе допълнителни кодиращи последователности, заедно с допълнителни, не- кодиращи последователности, включително например, но без да се ограничават до интрони и не- кодиращи 5’ и 3’ последователности, като транскрибирани, нетранскрибирани последователности, които играят роля в транскрибцията, тРНК - структуриране, включително сплис или полиаденилационни сигнали, например- рибозомно свързване и стабилност на тРНК; допълнителна кодираща последователност, която кодира допълнителни амино киселини, като тези които осигуряват допълнителни функционалности. Така например, полипептида може да бъде слят към маркерна последователност, като пептид, който улеснява пречистването на слят (маркер съдържащ) полипептид. В определени предпочитани варианти на изпълнение в този аспект от изобретението, маркерната последователност е хекса- хистидинов пептид, като удължението, осигурена pQE вектора {Qiagen, Inc.), сред другите, много от които са търговско достъпни. Както е описано в Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821- 824 (1989), например, хекса- хистидина осигурява удобно пречистване на фузонния протеин. “НА” удължението е друг пептид, приложим за пречистване, който съответства на един епитоп, получен от грипния хемаглутининов протеин, който е описан от Wilson et al., Cell 37: 767- 778 (1984).

Вариантни и мутантни полинуклеотиди

Настоящето изобретение се отнася по- нататък до варианти на молекули нуклеинови киселини от настоящето изобретение, които

03/396/02/ПБ • · • · · · кодират части, аналози, или производни на С5- епимеразата. Вариантите може да се срещат естествено в природата, като природен алелен вариант. Под “алелен вариант” се предполага един от няколко различни форми на гена, окупиращ даден локус върху хромозомата на даден организъм. Genes II, Lewin, В., ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Варианти, които не се срещат в природата могат да бъдат продуцирани с помощта на известни в областта техники на мутагенеза.

Такива варианти включват получените от нуклеотидни замествания, делеции или добавяния. Заместванията, делециите или добавянията може да включват един или повече нуклеотиди. Вариантите могат да бъдат изменени в кодиращите участъци, некодиращите участъци или и в двата. Промените в кодиращите участъци може да доведат до консервативни или не- консервативни амино киселинни замествания, делеции или добавяния. Специално предпочитани сред тях са тихите замествания, добавяния и делеции, които не променят свойствата и активността на С5- епимеразния полипептид или неговата част. Така също специално предпочитани в това отношение са консервативните замествания.

Други варианти на изобретението включват изолирана молекула нуклеинова киселина, която включва полинуклеотид, притежаващ нуклеотидна последоватлност, кодираща полипептид, амино киселинната последователност на която е най- малко 80% идентична на, и повече предпочитано най- малко 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичност спрямо референтна амино киселинна последователност, избрана от групата, състояща се от : (а) амино киселини 1 до 118 от Фигура 3; (б) амино киселини 1 до 119 от Фигура 3; (с) амино киселини 1 до 120 от фигура 3; (d) амино киселини 1 до 121 от фигура 3; (е) амино киселини 119 до 618 от

03/396/02/ПБ • · · · • · · · · ·

• · · ··· ···· ··· · · · · · · ·

Фигура 3; (f) амино киселини 120 до 618 от Фигура 3; (д) амино киселини 34 до 147 от фигура 3; (j) амино киселини 35 до 154 от Фигура 3; амино киселини 34 до 154 от фигура 3; и (I) амино киселини 1 до 154 от фигура 3; (т) пълната амино киселинна последователност, показана на Фигура 3.

Други варианти на изпълнение на изобретението включват изолирани молекули на нуклеинови киселини, които обхващат полинуклеотид, който се хибридизира при строги хибридизационни условия към полинуклеотид в (а), (б), (с), (d), (е), (f), (g), (j), (к), (I), (m) и (n), по- горе. Този полинуклеотид, който хибридизира не се хибридизира при строги хибридизационни условия към полинуклеотид, притежаващ нуклеотидна последователност, състояща се само от А остатъци или само от Т остатъци.

Под полинуклеотид, притежаващ нуклеотидна последователност най- малко, например, 95% “идентична” на референтна нуклеотидна последователност, която кодира С5епимеразен полипептид се разбира, че нуклеотидната последователност на полинуклеотида е идентична на референтната последователност с изключение на това, че полинуклеотидната последователност може да включва до пет точкови мутации за вески 100 нуклеотида от референтната нуклеотидна последователност, кодираща С5- епимеразния полипептид. С други думи, за получаване на полинуклеотид с нуклеотидна последователност, която е най- малко 95% идентична на референтна нуклеотидна последователност, до 5% от нуклеотидите в референтната последователност може да бъдат делетирани или заместени с друг нукпеотид, или множество нуклеотиди до 5% от тоталните нуклеотиди в референтната последователност може да бъдат инсертирани в референтната последователност. Тези мутации на

03/396/02/ПБ • * · · · · • · ·· • · ·· « · «·· · · · · • · « · · · ··· • · · ··· · · · · ·· β ♦ · · · · ·· референтната последователност може да станат при в позициите на 5’ или 3’ края от референтната нуклеотидна последователност или където и да е между тези крайни позиции, разпроъснати както индивидуално сред нуклеотидите в референтната последователност, така и в една или повече от съседните групи в рамките на референтната последователност.

Практически, дали която и да е молекула нуклеинова киселина е най- малко 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична на, например, нуклеотидната последователност, показана на Фигура 2, може да бъде определено по обичаен начин с помощта на известни компютърни програми като програмата Besfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). Besfit използва локален алгоритъм за хомоложност на Smith and Wareman, Advances in Applied Mathematics 2: 482- 489 (1981), за намиране на най- добрия сегмент на хомоложност между две последователности. При използване на Besfit или друга програма за сравняване за определяне на това дали определена последователност е, например, 95% идентична на референтна последователност съгласно настоящето изобретение, параметрите са така нагласени, че процента на идентичност се изчислява спрямо пълната дължина на референтната нуклеотидна последователност и празнините в хомологията до 5% от тоталния брой нуклеотиди в референтната последователност се оставят.

Настоящето описание е насочено към молекули нуклеинова киселина, най- малко 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична например на, нуклеотидната последователност, показана на Фигура 2, независимо от това дали кодира полипеептид с С5- епимеразна активност. Това се дължи на факта, че дори ако определена

03/396/02/ПБ ·♦ ··»· • · ·« · · • « · · ·»· · · · · · · ♦ • · 4 «» · · · ·« молекула нуклеинова киселина не кодира полипептид с С5епимеразна активност, специалиста в областта все още ще знае как да използва молекулата нуклеинова киселина, например, като хибридизационна сонда или праймер за полимеразна верижна реакция (PCR). Приложения на молекули нуклеинова киселина от настоящето изобретение, които не кодират полипептид с С5епимеразна активност включват, inter alia: (1) изолиране на С5епимеразен ген или негов алелен вариант в сДНК библиотека; (2) in situ хибридизация, например “FISH”) към метафазни хромозомни нишки за осигуряване на прецизно локализиране на С5епимеразния ген в хромозомата, както е описано в Verma et al., Human Hromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); and Northern blot анализ за откриване на С5епимеразна тРНК експресия в специфични тъкани.

Предпочитани, обаче, са молекули нуклеинова киселина с последователности най- малко 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентични на последователността от нуклеинови киселини, показана на Фигура 2, която, фактически кодира полипептид с С5- епимеразна активност. Под “полипептид с С5- епимеразна активност” се разбира полипептид, проявяващ активност сходна, но не и задължително идентична на активността на С5- епимеразата от изобретението (както протеин с пълна дължина, така и за предпочитане идентифицираният амино киселинен фрагмент, съдържащ амино киселини 33- 618 или 34- 618), както е измерено в определена биологична проба.

Разбира се, благодарение на дегенерацията на биологичния код, специалиста в областта незабавно ще установи, че голям брой от молекулите нуклеинови киселини, притежаващи последователност най- малко 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или

03/396/02/ПБ • · · · • · · · · · • · · · · · ···· • · · ·· · ·· ··

99% идентична на последователността на нуклеиновите киселини на депозирана сДНК или последователността от нуклеинови киселин, показана на Фигура 2, ще кодира полипептид, “притежаващ С5- епимеразна протеинова активност”. Фактически, доколкото дегенеративни варианти на тези нуклеотидни последователности всички кодират същия полипептид, за специалиста в областта това ще бъде ясно дори без осъществяване на по- горе описаното изследване за сравнение. Освен това е ясно за специалиста, че за такива молекули нуклеинови киселини които не са дегенеративни варианти, резонен брой също ще кодира полипептид с С5епимеразна протеинова активност. Това се дължи на факта, че специалиста е напълно наясно, че амино киселинните замествания, както повече, така и по- малко значимо повлияват протеиновата функция (напр. заместване на една алифатна амино киселина с друга алифатна амино киселина) както е описано по- долу.

Вектори и гостоприемникови клетки

Настоящето изобретение се отнася също до вектори, които включват изолирани ДНК молекули от настоящето изобретение, гостоприемникови клетки, които са резултат на генно инженерство с рекомбинантните вектори от изобретението и получаването на С5епимеразните полипептиди или техните фрагменти чрез рекомбинантни техники.

Полинуклеотидите могат да бъдат присъединени към вектор, съдържащ селективен маркер за размножаване в гостоприемник. Най- общо, плазмиден вектор се въвежда в преципитат, като калциево фосфатен преципитат, или в комплекс с зареден липид. Ако вектора е вирус, той може да бъде опакован in vitro с помощта на

03/396/02/ПБ ·· ···· ·· ···· ·» ···· 25 • · · · · ··· · ··· ··· ··· ··· ··· ···· •· · ·· · ···· подходяща клетъчна линия и след това да бъде трансдуцирана в гостоприемникови клетки.

ДНК инсерта следва да бъде опретивно свързан с подходящ промотор, като фаговия ламбда PL промотор, Е. coli lac, trp и tac промотори, SV40 ранните и късни промотори и промотори на ретровирусни LTRs. Експресионните структури по- нататък ще съдържат места за начало на транскрибцията, терминационен и транскрибционен участък, място за свързване на рибозомите за транслация. Кодиращата част от зрелите транскрибти, експресирани от стректерите за предпочитане ще включват транслационен иницииращ в началото и терминационен кодон (UAA, UGA UAG), подходящо позиционирани в края на полипептида, който ще бъде транслиран.

Както е означено, експресионните вектори за предпочитане включват най- малко един селективен маркер. Такива маркери включват дихидрофолат редуктаза или неомицинова резстентност за еукариотична клетъчна култура и гени за резистентност на тетрациклин или ампицилин за култивиране в Е. coli и други бактерии. Представителни примери за подходящите гостоприемници включват, но не са ограничени до, бактериални клетки; фунгални клетки, като Aspergillus, Aspergillus niger, или Trichoderma или дрождеви клетки като Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae; клетки на инсекти като клетки на Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; животински клетки като СНО, COS и клетки на Bowes меланома, както и растителни клетки. Предпочитани гостоприемници включват клетки на инсекти. Подходящите културални среди и условия за описаните по- горе гостоприемникови клетки са добре известни в областта.

03/396/02/ПБ • · • · • · · · • · · ·

-f' ··· ··· ···· • · · ·· · · · · ·

Сред предпочитаните вектори за използване в бактерии са pQE70, pQE60 pQE-9, достъпни от Qiagen; векторите pBS, Phagescript, Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, от Stratagene; и ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, доставени от Pharmacia. Сред предпочитаните еукариотни вектори са pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, рХТ1 и pSG, доставени от Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доставени от Pharmacia. Вирусните вектори включват, но не се ограничават до ретровирусни вектори, рох вирусни вектори, включително ваксинален вирус и аденовирусни вектори. Други подходящи вектори ще са очевидни за специалиста в областта.

Въвеждането на структурите в гостоприемниковата кретка може да бъде повлияно от калциево- фосфатна трансфекция, катийоно- липид- лимитирана трансфекция, електропорация, трансдукция, инфекция и други методи. Такива методи са описани в много ръкаводства за лабораторна работа, като Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).

Полипептиди и Фрагменти

Чш··

Изобретението по- нататък предлага изолиран или пречистен С5- епимеразен полипептид, притежаващ амино киселинната последователност, кодирана от амино киселинните последователности на Фигура 3, или пептид или полипептид, включващ част от горния полипептид, по- специално както е описано по- горе и кодиран от молекула нуклеинова киселина, описана погоре.

Изобретението по- нататък предлага фузионни протеини, съдържащи функционална част от N- края на миша С5- епимераза,

03/396/02/ПБ ,**.”*; ,’· ···· ·· ···· 27 ··· · · · · · · ··· ···· ··· .

··· ··· * · · · • · · ·· · ·· ·· слята в нейния С- край към N- края на желан протеин, например, сигналната последователност от амино киселини 1-33 или 1-34 както е показано на Фигура 3 или повишаваща активността последователност от амино киселини 1- 154, 33- 154 или 34- 154, както е показано на Фигура 3. В един вариант на изпълнение, протеина е слят към част от N- края, който съдържа от 30 до 154 амино киселини от N- края на миша С5- епимераза от Фигура 3, и поспециално амино киселини 33- 154 или 34- 154. В друг предпочитан вариант на изпълнение, желаният протеин е слят към функционална #** част от N- края, която съдържа остатъците 33- 154 от w

последователността, показана на Фигура 3. В един особено предпочитан вариант на изпълнение, желаният протеин е слят към функционална част от N- края, който съдържа секреционен сигнал от амино киселини 1- 33 или 1- 34, както е показано на последователността от Фигура 3.

Полипептида може да бъде експресиран в модифицирана форма, като фузионен протеин, и може да включва не само секреционни сигнали, но също допълнителни хетероложни функционални участъци. Това, което се разбира под термина “хетероложен” полипептид е добре известно на специалиста в областта, като получен от различни видове. Така например, участък от допълнителни амино киселини, по- специално натоварени амино киселини, може да бъде добавен към N- края на полипептид за подобряване стабилността и постоянството в гостоприемниковата клетка, по време на пречистването или по време на последващото съхранение. Така също, пептидни количества могат да бъдат добавяни към полипептида за улесняване на пречистването. Такива участъци може да бъдат отстранени преди финалното получаване на полипептида. Добавянето на пептидни количества към

03/396/02/ПБ

полипептиди за пораждане на секреция или екскреция, за подобряване на стабилността и за улесняване на пречистването, между другото, са известни и рутинни техники в областта.

С5- епимеразен или фузионен протеин, съдържащ негов фрагмент, могат да бъдат възстановени или пречистени от рекомбинантни клетъчни култури по добре известни методи, включващи преципитация с амониев сулфат или етанол, екстракция с киселини, анион или катионо обменна хроматография, фосфоцелулозна хроматография, хидрофобна хроматография, афинитетна хроматография и лектинова хроматография.

Пептиди от настоящето изобретение включват природни пречистени продукти, продукти на химична синтеза и продукти, получени по рекомбинантни техники от прокариотичен или еукариотичен гостоприемник, включително, например, бактерии, дрожди, висши растения, насекоми и бозайници. В зависимост от използвания в рекомбинантната процедура гостоприемник, полипептидите от настоящето изобретение може да бъдат гликозилирани или не- гликозилирани. В допълнение, полипептидите от изобретението може да включват също изходен модифициран метионинов остатък, в някои случаи като резултат от медиирани от гостоприемника процеси. Полипептида от инстантното изобретение може да включват също модификация от хистидин или полихистидин, добавен към края на процедурите за пречистване на протеина.

С5- епимеразните полинуклеотиди и полипептиди могат да бъдат използвани в съответствие с настоящето изобретение за различни приложения, по- специално такива, които използвант химичните и биологични свойства на С5- епимеразата. Поспециално, рекомбинантните епимерази от настоящето изобретение

03/396/02/пб .··.···: .··.···: .··.···: 29 могат да бъдат използвани за получаване на хепарин/или хепаринов сулфат, които могат да бъдат приложими като антикоагуланти в голям мащаб. Така също, епимеразите от настоящето изобретение може да бъдат използвани в експериментални постановки за изследване на ефектите от екстрацелуларни матриксни молекули като хепарин и хепаринов сулфат в такива процеси като ембриологични, ангиогенеза и туморна прогресия. Например, ензима може да модулира съотношението на остатъците от D- глюкуронова киселина/ L- идуронова киселина или хепаринов сулфат. Lидуроновите киселинни остатъци, благодарение на тяхните уникални конформационни свойства се счита, че промотират взаимодействия на полизахариди с протеини. В допълнение, епимеразите от настоящето изобретение може да бъдат използвани също за модифициране на индустриално приложими захари, които може да бъдат използвани като стабилизиращо или желиращо средство в някои храни.

Вариантни и мутантни полипептиди

За подобряване или изменение на характеристиките на С5епимеразен полипептид, може да се използва конструрина не протеина с помощта на рекомбинантна ДНК технология. Последната е известна на специалистите в областта, които с леснота биха могли да създадат нови мутантни протеини или “мутеини”, включително единични или множество амино киселинни замествания, делеции, добавяния или фузионни протеини. Такива модифицирани полипептиди може да покажат, напр., повишена активност или повишена стабиллност. В допълнение, те могат да бъдат пречистени в по- високи добиви и да покажат по- добра разтворимост в

03/396/02/ПБ • · • · · · • · · · сравнение със съответния природен полипептид, най- малкото при определени условия на пречистване е съхранение.

N- крайни и С- крайни делеционни мутанти

Например, за много протеини, включително екстрацелуларния домейн на мембранно асоцииран протеин или зрялата форма(и) на секретиран протен, е известно в областта, че една или повече амино киселини могат да бъдат делетирани от N- края или С- края без съществена загуба на биологична функция. Например, Ron et al., J. Biol. Chem., 268: 2984- 2988 (1993), докладват модифицирани KGF протеини, които имат активност за свързване на хепарин дари ако 3, 8 или 17 аминокрайни амино киселинни остатъци липсват.

Обаче, дори ако делецията на една или повече амино киселини от N- края на протеина доведе до модификация или загуба на една или повече биологични функции на протеина, други биологични активности могат все още да бъдат запазени. Така, способността на съкратения протеин да индуцира и/или да се свързва към антитела, които разпознават пълния или част от С5епимеразния протеин, ще бъде съхранена когато по- малко от всички остатъци от пълния протеинов или екстрацелуларен домейн са отстранени от N- края. Дали определен полипептид, на който липсват N- крайни остатъци от пълния протеин съхранява такива имунологични активности, може лесно да бъде определено по рутинни методи, описани тук и и звестни на специалистите в областта.

Съответно, настоящето изобретение по- нататък предлага пептиди, притежаващи една или повече остатъци, делетирани от

03/396/02/ПБ

амино края на амино киселинната последователност, показана на Фигура 3.

Обаче, дори ако делеция на еда или повече амино киселини от С- края на протеина води до модификация или загуба на една или повече биологични функции на протеина, други биологични активности могат да бъдат съхранени. Така, способността на съкратен протеин да индуцира и/или да се свърже към антитела, които разпознават пълната или зряла форма на протеина, най- общо ще бъде съхранена когато по- малко от всички остатъци на пълната или зряла форма на протеина бъдат отстранени от С- края. Дали определен полипептид, на който липсват С- крайни остатъци от пълния протеин, съхранява такива имунологични активности, може лесно да бъде определно по рутинни методи от специалистите в областта.

Изобретението предлага също полипептиди, притежаващи една или повече амино киселини, делетирани както от амино, така и от карбокси края.

Други мутанти

В допълнение към крайни делетирани форми на дискутираният по- горе протеин, следва да се знае от специалистите в областта, че някои амино киселинни последователности от С5- епимеразния полипептид може да варират без значителен ефект върху структурата или функцията на протеините. Ако такива различия в последователностите бъдат потвърдени, следва да се помни, че има критични области в протеина, които определят активността. Така, изобретението по- нататък включва вариации на С5- епимеразния полипептид, което показва съществена активност на С5

03/396/02/ПБ • · • · · · • · • · · · епимеразния полипептид или който включва участъци от С5епимеразния протеин като протеинови участъци, дискутирани подолу. Ръководство за това кои амино киселинни изменения са вероятно фенотипно тихи, може да бъде намерено в Bowie, J. U. et al., “Deciphering the message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions”, Science 247: 1306- 1310 (1990).

Така фрагмент, производно или аналог на полипептида от Фигура 3 или фузионен протеин който го съдържа, може да бъдат: 1) такъв, в който една или повече от амино киселинните остатъци са заместени с консервативни или не- консервативни амино киселинни остатъци (за предочитане консервативни амино киселинни остатъци, и повече предпочитан най- малко един, но по- малко от десет консервативни омино киселинни остатъци, и такива заместени амино киселинни остатъци могат да бъдат или да не бъдат кодирани от генетичния код; или 2) такъв, където една или повече от амино киселинните остатъци включва заместваща група; или 3) такъв, в който зрелият или разтворим екстрацелуларен полипептид е слят с друго съединение, като съединение за повишаване на степента на полу- живот (например, полиетилен гликол); или 4) такъв, в който допълнителните амино киселини са сляти към лидерна или секреторна последователност или последователност, която се използва за пречистване на зряла полипептидна или про протеинова последоватленост. Такива фрагменти, производни и аналози се приемат във възможностите на специалиста в областта на основата на изложеното тук.

Така, С5- епимеразата от настоящето изобретение може да включва една или повече амино киселинни замествания, делеции или добавки, както от природни мутации, така и от манипулации на човека. Както е означено тук, измененията са обикновено

03/396/02/ПБ консервативни амино киселинни замествания, които не повлияват на огъванията или активността на протеина (виж Таблица 1).

Таблица 1. Консервативни амино киселинни замествания

Ароматни	Фенилаланин Триптофан Тирозин
Хидрофобни	Левцин Изолевцин Валин
Полярни	Глутамин Аспарагин
Основни	Аргинин Лизин
Кисели	ХистидинАспарагинова киселина Глутаминова киселина
Малки	Аланин Серин Треонин Метионин Глицин

Амино киселини в С5- епимеразния протеин от настоящето изобретение, които са съществени за функциата, могат да бъдат идентифицирани по методи, известни на специалистите в областта, като сайт- насочена мутагенеза или аланин- сканираща мутагенеза (Cunnigham and Wells, Science 244: 1081- 1085 (1989). Последната процедура индуцира единични аланинови мутации при всеки остатък в молекулата. Получените мутантни молекули след това се тестват за биологична активност като рецепторно свързване или in vitro пролиферационна активност.

• · • · · · • · · ·

03/396/02/ПБ ··· ··· ···· ·· · ·· · ·· ·· рекомбинантно продуцирана версия на С5- епимеразния полипептид може да бъде по същество пречистен с едноетапен метод, описан в Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988). За предпочитане, полипептида от изобретението е пречистен до степен, достатъчна за секвенционен анализ, или толкова, че да представлява 99% от протеиновия материал в препарата.

Изобретателите на настоящето изобретение са установили, че мишият С5- епимеразен ген и протеин, и този за С5- епимеразния полипептид е протеин с 618 остатъка, демонстриращ една N- крайна Q 154 амино киселинна област, и по- специално 33 или 34 амино киселинна област, съдържаща амино киселини 1-33 или 1-34, които са включени в секретирането и стабилизирането на амино киселинните последователности, които са свързани към тях. Съответно, този участък, или функционална част от тях, са приложими за експресия и секреция на протеини като С5епимеразата, или който и да е друг протеин, по- специално протеин който се асоциира с Голджиевия апарат или се свързва по друг начин с хепариновата или хепарин- сулфатната синтеза.

Изобретателите са установили също, че N- края на мишия С5епимеразен протеин, и по- специално амино киселини 1- 154, 33- 154 или 34- 154, са специално приложими за повишаване активността на други ензими, по- специално други С5- епимерази. Съответно, този домейн, или функционална част от него, е приложим за експресия и секреция на фузионни протеини, които включват С5- епимеразни последователности, хетероложни на този, показан на Фигура 3, поспециално говеждата С5- епимераза.

Полипептидите от изобретението включват С5- епимеразния полипептид и фрагменти, както е обсъдено по- горе, чиято амино киселинна последователност е най- малко 80% идентична на

03/396/02/ПБ ··« ··· ···· • · · ·· · ·· · · последователността, избрана от групата, състояща се от (а) амино киселини 1 до 118 от Фигура 3; (Ь) амино киселини 1 до 119 от фигура 3; (с) амино киселини 1 до 120 от фигура 3; (d) амино киселини 1 до 121 от фигура 3; (е) амино киселини 119 до 618 от фигура 3; (f) амино киселини 120 до 618 от фигура 3; (д) амино киселини 121 до 618 от фигура 3; (h) амино киселини 122 до 618 от фигура 3; (i) амино киселини 34 до 147 от фигура 3; (j) амино киселини 35 до 154 от фигура 3; (к) амино киселини 34 до 154 от фигура 3; (I) амино киселини 1 до 154 от фигура 3; (т) пълната *** амино киселинна последователност, както е показана на Фигура 3.

Изобретението включва полипептиди, които са най- малко 80% идентични, повече предпочитано 90% или 95% идентични, още повече предпочитани 96%, 97%, 98% или 99% идентични на полипептидите, описани по- горе, и включват също части на такива полипептиди с най- малко 30 амино киселини и с повече предпочитание най- малко 50 амино киселини.

Под полипептид, притежаващ една амино киселина, която е най- малко, например, 95% “идентична” на референтна амино киселинна последователност от С5- епимеразен полипептид, се разбира, че амино киселинната последователност на полипептида е w идентична на референтна последователност с изключение на това, че полипептидната последователност може да включва до пет амино киселинни изменения на всеки 100 амино киселини от референтната амино киселина на С5- епимеразния полипептид. С други думи, за получаване на полипептид, една амино киселинна последователност с най- малко 95% идентичност спрямо референтна амино киселинна последователност, може да бъде делетирана или заместена с друга амино киселина, или множество амино киселини с до 5% от тоталните амино киселинни остатъци в референтната • · · · · · • · • · · ·

03/396/02/ПБ ··« · · · · · · · • · · «· · · · · · последователност, може да бъде инсертирана в референтната последователност. Тези изменения на референтната последователност може да станат при амино или карбокси края на референтната амино киселинна последователност или където и да е между тези крайни позиции, разпръснати както индивидуално между остатъците в референтната последователност или в една или повече съседни групи в рамките на референтната последователност.

Практически, дали даден определен полипептид е най- малко 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентични например на амино киселинната последователност, показана на Фигура 3, може да бъде определено по конвенционален начин с помощта на известни компютърни програми като праграма Bestfit (Wiskonsin Sequence Analysis Package, version 8 for Unix, genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). Когато се използва програма Bestfit или която и да е друга секвенционна програма съгласно настоящето изобретение, параметрите са нагласени, разбира се така, че процента на идентичност да бъде изчислена за пълната дължина на референтната амино киселинна последователност, като такива пропуски в хомологията, които възлизат до 5% от тоталния брой амино киселинни остатъци в референтната последователност, се оставят.

Полипептите от настоящето изобретение, които притежават С5- епимеразна активност, могат да бъдат използвани за осигуряване на същата in vitro, например, при осъществяване на изследвания на същата или в стандартизационни изследвания за използване с повече комплексни системи. Сигналната последователност от изобретението може да бъде използвана за • · · · · · • · · · · · • · · ·

03/396/02/ПБ ··· · · · ♦ · · · • · · »· · ·· ·· секретиране на хомоложния С5- епимеразен ензим от еукариотични рекомбинантни гостоприемници, или за секретиране на хетероложни последователности, които са оперативно свързани към тях. Последователността от изобретението, която повишава активността може да бъде използвана за повишаване на онаследена епимеразна активност от рекомбинантни препарати от други С5- епимерази, и като такава, най- добре е да бъде предложена под формата на ген, кодиращ фузионен протеин за същата.

г Антитела

Антитела, специфични за С5- епимеразния протеин, могат да бъдат създадени съгласно изобретението, срещу интактни С5епимеразни протеини или антигенен полипептиден негов фрагмент, който може да бъде представен заедно с носещ протеин, като албумин, спрямо животинска система (като заешка или миша) или, ако е достатъчно дълъг (най- малко около 25 амино киселини), без носител, или в липозоми или комплекси с PEG за засилване на циркулаторен полу- живот.

Както е използван тук, терминът “антитяло” (АЬ) или “монокпонално антитяло” (МаЬ) означава интактни молекули, а така също и антитяло фрагменти (като например, Fb и F(ab’)₂), които са способни на специфично свързване към С5- епимеразен протеин. Fb и F(ab’)₂ фрагменти не съдържат Fc фрагмента от интактното антитяло и може да имат по- малко неспецифично тъканно свързване на интактно антитяло (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316325 (1983)). Така, тези фрагменти са предпочитани.

Антителата от настоящето изобретение могат да бъдат изготвени по различни методи. Например, клетки експресиращи С5·· ···· ·· ···· « · ··«·

03/396/02/ПБ ··· · · · · · · · • · · ♦ · · · · · · епимеразния протеин или негов антигенен фрагмент, могат да бъдат приложени на дадено животно с оглед индуциране продукцията на серум съдържащи поликлонални антитела. В един предпочитан метод, получаването и пречистването на С5- епимеразен протеин се осъществява така, че да граничи с по същество свободен от природни контаминанти. Такъв препарат след това се прилага на животно за получаване на поликлонален антисерум с по- висока специфична активност.

В най- предпочитаният метод, антителата от настоящето изобретение са моноклонални антитела. Такива моноклонални антитела могат да бъдат получени с помощта на хибридомна технология (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal antibodies and T- Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. (1981) pp. 563-681). Най- общо, такива процедури включват имунизиране на животно (за предпочитане мишка) с антиген срещу С5- епимераза или, за предпочитане, с С5епимеразна протеин- експресираща клетка. Подходящи клетки могат да бъдат разпознати по тяхната способност да свързват анти- С5епимеразно протеиново антитяло. Такива клетки могат да бъдат

W култивирани в която и да е подходяща тъканно културално среда; обаче, предпочита се култивирането на клетките в ранна модифицирана среда на Eagle, заместена с 10% фетален телешки серум (инактивирана при около 56°С) и заместена с около 10 g/l неесенциални амино киселини, около 1000 U/ml пеницилин, и около 100 цд/т1 стрептомицин. Спленоцитите от такава мишка се екстрахират и сливат с подходяща миеломна клетъчна линия. Всяка подходяща миеломна клетъчна линия може да бъде използвана в съответствие с настоящето изобретение; обаче, предочита се ·· ···· ·· ···· • · ····

03/396/02/ПБ * · · · · · · · · · •« · ·« · ·· «· използването на родителска миеломна клетъчна линия (SP20), достъпна от ATCC, Manassas, Virginia. След сливането, получените хибридомни клетки са селективно поддържани в среда НАТ, и след това се клонират чрез лимитиращи разреждания, както са описани от Wands et al., Gastroenterology 80:225-232 (1981). Хибридомните клетки, получени чрез такава селекция след това се изпитват за идентифициране на клонове, които секретират антитела, способни да свържат желаният С5- епимеразен антиген.

Обратно, допълнителни антитела, които са способни да се * свързват към С5- епимеразния антиген, могат да бъдат продуцирани в двуетапна процедура чрез използване на анти- идиотипични антитела. Такъв метод прави използването на факта че антителата са сами по себе си антигени, и че поради това, става възможно получаването на антитяло, което се свързва към второ антитяло. В съответствие с този метод, С5- епимеразно- протеин- специфични антитела, се използват за имунизиране на животни, за предпочитане мишки. Спленоцити от такова животни след това се използват за продуциране на хибридомни клетки, и след това се скринират за идентифициране на клонове, които продуцират антитяло, чиято способност да се свързват към С5- епимеразното протеин- специфично антитяло могат да бъдат блокирони от С5епимеразния протеино антиген. Такива антитела включват антиидиотипни антитела срещу С5- епимеразто протеин- специфично антитяло и могат да бъдат използвани за имунизиране на едно животно за индуциране на формиране на други С5- епимеразни протеин- специфични антитела.

Следва да се оцени факта, че съгласно методите описани тук, могат да бъдат използвани Fb и F(ab’)2 и други фрагменти на антитела от настоящето изобретение. Такива фрагменти са типично

03/396/02/ПБ • ···

продуцирани чрез протеолитично разграждане, с помощта на ензими като папаин (за пордуциране на Fab фрагменти) или пепсин (за продуциране на F(ab’)₂)- Едноверижни антитела, като леко и тежко верижни антитела, също са включени в обхвата на това изобретение. Обратно, С5- епимеразни протеин- свързващи фрагменти могат да бъдат родуцирани чрез прилагане на рекомбинантна ДНК технология или чрез методите на синтетичната химия. Такива антитела биха включили, но без да се ограничават до рекомбинантни антитела, които включват комплементарни детерминиращи участъци (CDRs), които имат различни свързващи специфики или CDRs, които са модифицирани чрез прилагане на рекомбинантна ДНК технология или чрез методите на синтетичната химия за модифициране на спецификата на свързване към антителата.

За in vivo използване на анти- С5- епимераза в хора, за предпочитане се използват “хуманизирани” химерни моноклонални антитела. Такива антитела могат да бъдат продуцирани с помощта на генетични структури, получени от хибридомни клетки, продуциращи моноклоналните антитела, описани по- горе. Методи за продуциране на химерни антитела са известни в областа. Виж, например, Morrison, Science 229: 1202 91985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly et al., U.S. Patent No. 4 816 567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 8702671; Boulianne et al., Nature 312: 643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985).

Бифункционални антитела са антителата, които имат антиген свързващи области към различни епитопи или са получени от различни видове, и са обхванати от изобретениет.Антитела с Fc участъци, получени от видове, различни от Fab участъците, също са

03/396/02/ПБ • · · ·

визирани и могат да бъдат използвани в процедурите на имуноспецифична имунизация. От настоящето изобретение са обхванати също антитела с прикрепени маркери като флуоресцеин, Тексаско червено, родамин, пероксидаза, злато, магнитни маркери, алкална фосфатаза, радиоизотопи или химични маркери.

Имайки предвид описаното в изобретението, същото ще бъде по- лесно разбрано чрез препратка към следните примери, които са представени за илюстрация и не предполагат ограничаване на обхвата на изобретението.

Примери

Пример 1

Изолиране и секвениране на миши геномни клонове

Миша геномна библиотека (FIX II, Stratagene) се скринира с ДНК сонда от говежда последователност, кодираща С5- епимераза. Сондата се маркира с [a³²P]dCTP (NEN Life Science Products). Приблизително 2 x 10⁶ фага се посяват в 20 х 20 см панички и от w всяка паничка се изготвят дубликатни найлонови филтри. Провежда се скрининг с висока разделителна способност чрез хибридизация в 5 х Denhardts, съдържащ 100 цд спермална ДНК/ml при 60°С. Финалните промивки се осъществяват в 0.1 х SSC (1х SSC и 150 тМ NaCI, 15 тМ натриев цитрат, pH 7.0 съдържащ 0.1% SDS). Плаките, които продуцират позитивни сигнали се подбират за втори и трети кръг на скриниране, и се изолират ултимативно пет позитивни клона. Установено е, че два от клоновете имат сходна дължина от около 16 kb, докато другите три са относително по- къси, около 10-12 kb. Най43

03/396/02/ПБ ····

···· дългият клон (клон 64) се разгражда със Sac1 и рестрикционните фрагменти се клонират в pBlueScript. Вторият най- дълъг клон (клон

5А) се разгражда с EcoRI и получените фрагменти се клонират в pUC119 за по- нататъшно охарактеризиране.

Инсерта, съдържащ плазмид се пречиства с помощта на плазмидния кит QIAGEN . Реакцията на нуклеотидно съгласуване се осъществява с помощта на ди- дезокси терминационен метод, и се провежда със секвенатор ABI 310. Екзоните и интроните се определят чрез праймерно придвижване по двете вериги, и размера на интроните се оценява чрез секвениране в комбинация с агарозна гел електрофореза. Установени са само 3 екзона, кодиращи С5епимеразата, с най- дългия екзон, кодиращ повече от 50% от протеина. Екзон- интронните връзки (сплис местата) прецизно следват консенсусното правила gt-ag. На основата на наличието на интрони и точното съвпадение между екзоните и сДНК последователността, ние вярваме че идентифицираният геномен клон представя функционалният ген на С5- епимеразата.

Клониране на миша С5- епимеразна сДНК

Констуирани са двойка праймери, които са основани на нуклеотидната последователност, получена чрез секвениране на екзоните на геномния клон. Смисловия праймер съответства на Ьр 126 от мишият ORF, стартирайки от изходния кодон ITG. Безсмисловия праймер съответства на Ьр 1829- 1854 без включване на стоп кодона. PCR се провежда чрез използване на миши чернодробен QUICK- Clone™ сДНК (Clontech) като матрица при условията: 1 цикъл от 94°С за 1 мин, 30 цикъла всеки от 94°С за 30 сек, 60°С за 45 сек и 72°С за 1 мин, и крайна екстензия при 72°С за 10 мин. Получена е строга ивица от около 2 kb, която се клонира в

03/396/02/ПБ

····

ТОРО™- ТА клониращ вектор (Invitrogen) и се амплифицира и след това секвенира. Чрез секвениране на двойната верига е установено, че мишият С5- епимеразен клон е 1875 Ьр дълъг, със строго хидрофобен домейн при N- края на дедуктивния пептид.

Анализ чрез оцветяване по Northern

Миша мулти- тъканна тРНк се закупува от Clontech. ДНК сондата от говежди сДНК клон се маркира с [a³²P]dCTP чрез Klenow ензим от Boehringer Mannheim. Хибридизацията се осъществява в ExpressHyb (Clontech) при 60°С за един час и се промива при строго определени условия. Мембраната се подлага на експониране на филм Кодак при -70°С за една нощ. С5- епимеразния ген се експресира във всички изпитани тъкани и транскрибта е около 5 kb. Изглежда, че черния дроб има най- високата експресия за транскрибта, докато слезката експресира относително ниско ниво на β- актин в същата мембрана.

Анализ чрез оцветяване по Southern

Анализ чрез оцветяване по Southern се провежда съгласно Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989). Миша геномна ДНК се изготвя с кит Easy Prep (Pharmacia Biotech). 20 pg геномна ДНК се разгражда с рестрикционния ензим Sacl, и се разделя върху 0.8% агарозен гел чрез електрофореза. След електрофорезата, гелът се третира с 0.1 N NaOH за 30 мин и се неутрализира в Tris-HCI буфер. ДНК фрагментите се прехвърлят върху найлонова мембрана. 837 Ьр фрагмент от говежда С5- епимеразна сДНК се маркира с [a³²P]dCTP с Klenow ензим от Boehringer Mannheim и се използва като сонда.

03/396/02/ПБ ··· • · ··

Хибридизационните условия се провеждат както е описано за анализ по Northern. Времето за експозицията е 3 дни.

За определяне колко гени могат потенциално да кодират С5 епимераза, двадесет микрограма миша геномна ДНК, пречистена от миши черни дроб, се разгражда с рестрикционните ензими Apal,

BamHI, EcoRV, Hindlll, Ncol и Xbal, съответно и се разделят върху

0.8% агарозен гел с електрофореза. ДНК, разделена в гела, се прехвърля върху найлонова мембрана и след това се хибридизира с ДНК сонда от говеждата кодираща последователност (1407 Ьр). Рестрикционната карта от С5- епимеразната геномна ДНК предполага, че е налице само един ген, кодиращ С5- епимеразния ензим в мишка.

Анализ на ензимната активност

Активността на С5- епимеразата се изпитва съгласно протокола, както е описано в Malmstrom et al., J. Biol. Chem. 255: 3878- 3883 (1980), включен в приложената литературна справка. Накратко, мишка, трансплантирана с мастоцитомни клетки интрамускулно, се аевтаназират чрез цервикална дислокация и след това се подлагат на дисекция. Съответните тъкани, включително ксенотрансплантанти, се взимат и незабавно се хомогенизират в буфер от 50 mM HEPES, съдържащ 100 тМ KCI, 15 тМ EDTA, 1% Triton Х-100 и протеазни инхибитори. Хомогенатите се разклащат при 4°С за 30 минути и се центрофугират. Супернатантата се събира. Тоталната протеинова концентрация се определя чрез QuantyGold анализ, и специфичната активност на С5- епимеразата се анализира на основата на освобождаването на ³Н (възстановен като ³Н₂О) от субстратния полизахарид съгласно описаната процедура от Li et al. (Li et al.,1997). C5- субстрата, използван в теста

03/396/02/ПБ • · · · ♦· · * · · · ·· за специфична активност се анализира най- малко веднъж месечно чрез измерване на 50 μΙ С5- субстратен работещ разтвор без какъвто и да е ензим.

Ако изходната активност на пробата е >2000 срт/50 μΙ, това е индикация че пробата е наситена и има нужда от разреждане. Факторите на разреждане зависи от използваната проба, насищането на пробите и от концентрацията на соли. Пробата следва да съдържа не повече от 50 тМ сол (NaCI или KCI), тъй като С5- епимеразната активност е частично или напълно инхибиран при по- високи концентрации на соли.

Използвани са позитивни и негативни контроли в изследванията на С5- епимеразна активност. Позитивната контрола следва да бъде стандартизирана на всеки два месеца за да бъде сигурно, че стабилността е съхранена. Само вектор, продуциран в същите клетки като проба, може да бъде използван като негативна контрола. Например, за С5- пробите, продуцирани чрез бакуловирусно/ инсектицидна клетъчна експресионна система, като негативна контрола се използва ацетилхолинестераза, продуцирана със същата система.

Ако е необходимо, по време на предварителното затопляне на С5- субстратния разтвор, пробите се разреждат. 50 μΙ проба (ензим) се добавя към предварително затоплен субстрат и се инкубира точно за 1 час при + 37°С. След инкубация, към субстратноензимната смес се добавят 100 μΙ от стоп разтвора на ензимната реакция и тази реакционна смес се прехвърля към 10 ml сцинтилационна епруветка Wallac. 13 ml епимеразен коктейл за изпитване се добавя към епруветките и се завъртат за 10 сек. Радиоактивността се измерва в трипликатна проба с Wallav 1415

03/396/02/ПБ • · ·

Liquid Scintillation Counter за 2 минути всяка, след инкубация в продължение на 1 нощ. Сцинтилационният брояч дава резултатите като срт/ реакционен обем (50 μΙ). Ако пробата е разредена, активността на буфера за разреждане средва да бъде извадена от активността на пробата. При всички случаи, активността на празната проба се изважда от активността на пробата преди анализиране на резултатите.

Специфичната активност се измерва чрез разделяне на общата активност (cpm/μΙ). Тоталната протеинова концентрация се измерва чрез QuantiGold проба съгласно Stoschek, С.М., Anal. Biochem. 160: 301- 305 (1987), който е включен в приложената литературна справка. Единицата специфична активност е cpm/pg/h, където h (часове) описва времето на ензимната реакция.

Пример 2

Идентифициране на правилния N- край от С5- епимераза от анализа на кодиращата последователност на миши ген и експресия на клонирана сДНК

На основата на клониране и предварителен секвенционен анализ на вероятния С5- епимеразен ген, идентифициран в Пример 1, и на основата на подреждането на предварително публикувана говежда сДНК последователност, е изолирана допълнителна 5’фланкираща ДНК последователност, и е клонирана сДНК, която съдържа тази 5’- фланкираща ДНК последователност.

За определяне на това дали тази 5’- фланкираща ДНК последователност може да кодира допълнителни N- крайни пептидни последователности, които биха представили правилния Nкрай от С5- епимеразата, кодирана от мишия ген, мишата

03/396/02/ПБ ··· ···· последователност (текста с удебелени букви в нуклеотидната последователност, показана на фигура 1) се добавя към говеждата сДНК последователност, която е вече в компютърен файл, използвайки говеждата последователност и изхождайки от точката на най- голямо съхранение (> 96% амино киселинна идентичност). Тогава, Ген инспектиращата програма (Textco, USA) се използва за изследване на отворените четящи рамки (ORF), които са потенциални полипептид кодиращи последователности в събраната последователност. Резултата от секвенционното подреждане е показан на Фигура 1 и анализа на ORF е показан на Фигура 2.

На Фигура 1, мястото на сливане между новата миша последователност и говеждата последователност е означено от двоен кодон последователността, започваща след двойния кодо е говеждата сДНК последователност. Последователността (с удебелени букви) 5’ до мястото на сливане е допълнителната миша 5’- фланкираща ДНК последователност, изолирана както е описано по- горе. Подчертаната последователнот е намерената отворена четяща рамка, която показва полипептидната кодираща последователност.

Известно е, че нативният С5- епимеразен ензим е локализиран в мембранозният Голджиев апарат на клетките (от черен дроб). Поради това, нативната миша последователност следва да съдържа подходящ N-краен сигнал за транслокация при тази органела. За анализиране на това се използва алгоритъма на Nielsen eta!., Protein Engineering 10: 1-6 (1997). Алгоритъмът анализира “сигналният” потенциал на първите 40-60 амино киселини от горната полипептидна последователност. Същата програма се използва за тестване на първите 40 остатъка от мишата синдекан-1 полипептидна последователност, доколкото е известно, че съдържа

03/396/02/ПБ

секреционен сигнал, като начин на контрол за ефективност на програмата, и програмата позитивно го идентифицира (данни не са показани). Анализът показва силен сигнален потенциал за първите 33 остатъка.

Освен отбелязаната 33- амино киселинна сигнална последователност, допълнителните 154 N- крайни остатъка включват допълнителни цистеинови остатъка, които може да формират дисулфидни мостове и да стабилизират огъването на протеина, и предсказано място на амидиране (остатъци 118- 121), което може да бъде релевантно на посттранслационно протеолитично образуване. Следващи анализи на пълната последователност за С5- епимеразата предсказва хидрофобни участъци от полипептида, които могат да бъдат пробият или пресекат мембраната(те).

Анализът на подреждането срямо други последователности, установени в базата данни, показва горещи точки на хомоложност. Тези резултати са обобщени на Фигури 4 и 5.

Фигура 5 е диаграмно представяне на мишата С5- епимеразна полипептидна последователност. Както е показано на Фигура 5, найголямото еволюционно съхранение (“горещи точки” на хомоложност) на последователността се намира в повечето С- крайни части, във високо хидрофобни участъци между амино киселинни остатъци Тгр497 или Leu523, за които се предполага че сапробити в огъната структура на протеина или са пресекли мембраната, вероятно в лумена на апарата на Голджи, където ензима е известно че действа. Другият най-значим и разширен участък на съхранение се явява между остатъците Leu545 и His580, и може да съдържа или обхваща активното място на ензима. Функционаланата значимост на съхранението на полипептидната последователност (идентичност)

03/396/02/ПБ

>22% е установена чрез публикуваните изследвания на други протеини с известна функция (Branden, С., and Tooze, J., Introduction to Protein Structure, Garland Publishing, NY and London, pp. 100- 101 (1991)), u Wilson, Kreychman, and Gerstein и другите автори цитирани тук, в “Quantifying the relations between protein sequence, structure, and function through traditional and probabilistic scores”, достъпни в http://bioinfo. mbb. vale, edu/e-print/ann-xfer-imb/preprint. html. Доколкото е обяснено в тази статия, няма съхранена ясна функция за секвенционна идентичност по- ниска от 20- 25%. Под 20%, общото сходство вече не е запазено). Понастоящем, SWISS- MODEL ще генерира модели за последователности, които отговарят на тези критерии: BLAST степен на Р търсене: < 0.00001; Обща степен на секвенционна идентичност (SIM): > 25% и модел на минимална дължина - 25 амино киселин.

На основата на това е видно, че последователността на Drosophila е по- тясно свързана (46.6%) в сравнение с последователността на С. elegans (39.6%) спрямо мишата последователност.

В друг тип секвенционен анализ, предполагаемата тридименсионална структура на мишата С5- епимеразна ’W··' последователност се “третира” срещу 3D структура на Kelley, L.A., et al., Mol. Biol. 299(2): 499-520 (2000). Това сравнение показва, че С5епимеразната последователност има значително отношение с хондроитиназния домейн (хондроитин АС/алгинат лиаза), който е един алфа/алфа тороид. Хондроитин АС лиазата е представител на семейство гликозаминогликан разграждащи ензими, и са изведени структурно/ функционални отношения с кристалография (Fethiere et el., J. Mol. Biol. 288: 635- 647 (1999). Забележителното е, че найзначителното 3D сходство c хондроитиназната последователност е

03/396/02/ПБ • · · · • ··· установено че се разпростира от А1а408, в близост до С- края от мишата С5- епимеразна последователност, и че този участък съдържа повечето от съхранената секвенционна конверсия, вероятно означава че е участък, съдържащ активното място.

На основата на всички секвенционни анализи по- горе, са създадени нови С5- епимеразни структури, в допълнение към първата удължена рекомбинантна (говежда) С5- епимеразна структура, за хетероложна секреция- експресия от бакуловирус и InsectSelect (Invitrogen, USA) експресионни системи. Продуктите от клонираните инсектицидни клетъчни линии, така охарактеризирани,

War са обобщени на Фигура 6А. Показани са 4 структури. Първата структура е удължената рекомбинантна говежда С5- епимераза. Втората структура е удължената миша С5- епимераза с пълна дължина. Третата структура е удължена, химерна структура между мишата и говежда С5- епимеразни структури. Четвъртата структура е удължена, срязана миша последователност.

Във всяка от рекомбинантните структури С5- епимеразата е удължена. При удължаване, 05- епимеразната последователност е предшевствана от последователност, както е показано на Фигура 6В, която съдържа EGT сигнален пептид, свързан към EGT сигнално разграждане, едно ентерокиназно място на разграждане, шест хистидина и накрая rTEV протеазното място. EGT сигнала е от бакуловирусен протеин (който инфектира инсектицидни клетки). FLAG последователността е едно епитоп- удължение, използвано за откриване и пречистване на рекомбинантния протеин съгласно инструкциите на производителя (Sigma) (Hopp, Т. et al., Biotechnology 6: 1204- 1210 (1988)). Ентерокиназата е един ензим, използван за разграждане на последователността, предшевстваща нейното място на разпознаване. Шестте последователни хистидина са друго

03/396/02/ПБ • ··· удължение. rTEV (рекомбинантен тютюнев фирус) протеазното място също е използвано за отстраняване на предходните последователности. Сигнала EGT и FLAG™- удължението (IBI) са получени от структури, създадени в модифициран pFastBacTM (Life Technologies) вектор, осигурен от Dr. Christian Oker- Blom, VTT Biotechnology, P.O. Box 1500, FIN-02044, VTT, Finland. Пречистването на всички рекомбинантни протеини, описани в настоящето описание е основано на FLAG-удължението.

Представителните данни от изследването на активността и протеиновите анализи на тези удължени рекомбинантни С5епимерази е показано на Фигура 7, и таблица 1 и Таблица 2. Фигура 7 показва резултатите от изпитването на активността на миша С5епимераза (тС5), които са пречистени на анти- FLAG М1 съгласно предложения от производителите протокол.

Изследването на С5- епимеразната активност на хетероложен протеин се осъществява както в Пример 1 по- горе. Накратко, тотален протеин е екстрахиран от култури, трансформирани с всяка от рекомбинантните С5- епимеразни структури, които са индивидуално инокулирани в клетки на насекоми с помощта на експресионна система InsectSelect. След като клетките достигнат сливане, те се събират и лизират и тоталния протеин се изолира и определя количествено. С5- епимеразната активност се измерва като ³Н освобождаване от епимеразния субстрат в сцинтилационен брояч. Епимеразната активност се измерва спрямо тоталния протеин. Фигура 7 показва активността с повишен обем на пробата (разреждане 1: 2000). Общата активност е 6360 cpm/μΙ.

Протеиновият анализ (с помощта на QuantiGold, Diversified Biotech) се анализира съгласно Stoschek, С.М. Anal. Biochem. 160:301- 305

03/396/02/ПБ • ·α* (1987) и означава, че концентрацията на протеин е 3.2 pg/ml. Поради това, специфичната активност е 2.0 х 10⁹cpm/mg/h.

Фигура 8 показва оцветяване по Western с анти-FLAG. Линия 1 съдържа стандарти на молекулно тегло (New England Biolabs, Broad Range, prestained). Линия 2 съдържа миша C5- епимераза c пълна дължина. Удължената миша С5- епимераза с пълна дължина (която съдържа N- крайни допълнителни последователности, установени тук) има дължина 618 амино киселини, молекулно тегло (далтони) от 71189.1, изоелектрична точка (pl) 8.25 и нетно натоварване при pH 7 от +4.01.

Шит·

Фигура 9 е оцветяване по Western на културална среда, взета от стабилна клетъчна линия от инсекти от различни клонове за четирите удължени рекомбинантни С5- епимеразите, описани погоре, оцветени с анти- FLAG антитяло (020300). Линия 1 съдържа стандарти на молекулно тегло както на Фигура 8, с молекулните тегла, отбелязани на страната на гела. Линия 2 съдържа срязаната миша С5- епимераза. Линия 3 съдържа оригиналната С5- епимераза. Линия 4 съдържа мишата: говежда химерна С5- епимераза, в която N- крайните миши последователности са сляти в рамка към говеждите последователности, както е показано на Фигури 2 и 3.

'’w

Линия 5 съдържа миша С5- епимераза с пълна дължина. Може да се види, че химерната миша: говежда структура е приблизително еднаква по размер с мишата структура в пълна дължина.

Относителната активност на различните рекомбинантни структури са изчислени на базата на изследванията на активността и на дензитометричния анализ на оцветяванията по Western и е показана на Таблица 1, по- долу. “ТгипсС5” е съкратената миша С5епимеразна амино киселинна последователност, където първите 154 амино киселини са отстранени така, че “ТгипсС5”

03/396/02/ПБ • · · ·

• · • · ·· последователността има същия N- край както рекомбинантната говежда последователност. “ExtC5” е рекомбинантният говежди С5епимеразен полипептид, докато “chC5” се отнася до мишата:

говежда химерна С5- епимеразна структура, кодирана от последователността нуклеинова киселина както е показано на Фигура 1. “тС5 се отнася до мишата С5- епимеразна последователност с пълна дължина.

г Таблица 1.

w

Относителни активности на различни рекомбинантни С5епимерази

Проба	Плътност	Проба (μΙ)	Плътност/μΙ	Активност (cpm/μΙ)	Активност/плътност (срт/ дензитометрична единица)
truncC5	15984	12	1332.020	20	0.015
extC5	6451	12	537.6	7	0.013
chC5	14960	12	1246.7	3455	2.771
мС5	13804	12	1150.3	3681	3.200

Специфичните активности на различните частично пречистени рекомбинантни С5- епимерази е показано на Таблица 2.

03/396/02/ПБ

Таблица 2.

Специфични активности на различните частично пречистени рекомбинантни С5- епимерази

Проба	Тотална активност (cpm/μΙ)	Линеарност (R2)	Протеин mg/ml	Специфична активност (cpm/mg/h)
truncC5	39.5	0.9905	0.0129	3.06 хЮ6
extC5	9.1	0.9978	0.0092	9.89 х10ь
chC5	919.7	0.9964	0.0026	3.54x10“
мС5	2019	0.9969	0.0042	4.81 х 108

'W

Създадената химерна миша:говежда структура съдържа амино киселинни остатъци 34- 154 от N- крайната последователност на мишата полипептидна последователност, непосредствено следваща елементите EGT-FLAG-His-RTEV, както е показано на фигура 6В. Независимо от това, че рекомбинантният ензим е явно получен в цитозол, вероятно това се дължи на сигналния потенциал на мишата последователност.

Заключение:

Добавянето на N- краен фрагмент от полипептид (Asp34 до Asp154) от мишата генетична структура повишава активността на рекомбинантния С5- епимеразен ензим чрез разпореждане за значимостта, макар тази част от последователността да не съдържа най- голямото междувидово запазване. Възможният ефект на удълженията върху ефективността на първата рекомбинантна говежда структура е адресиран (чрез отстраняване на удължението; данни не са показани) и може да се отчете за малък фактор на

03/396/02/ПБ • ♦ · ·

• · различието, но не и за размера на разпореждането за значимостта на различията в специфичните активности между по- дългите и покъси форми на рекомбинантната С5- епимераза. Понастоящем се работи върху неудължените експресионни структури и изследванията върху структура и функция за по- добро определяне основата и механизма за контролиране активността на този много важен рекомбинантен ензим.

Claims (32)

1. Изолиран полинуклеотид, характеризиращ се с това, че включва нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, чиято амино киселинна последователност е наймалко 95% идентична на референтна амино киселинна последователност, състояща се от амино киселини 1- 618 от фигура 3.

2. Полинуклеотид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че представлява ДНК

3. Полинуклеотид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че представлява РНК

4. Полинуклеотид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съдържа и хетероложен полинуклеотид

5. Полинуклеотид съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че посоченият хетероложен полинуклеотид кодира хетероложен полипептид

6. Полинуклеотид съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че посоченият хетероложен полинуклеотид е позициониран при 3’ края на посочената нуклеотидна последователност.

7. Вектор, характеризиращ се с това, че включва полинуклеотида от която и да е претенция 1- 6.

8. Вектор съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че посоченият полинуклеотид е оперативно свързан с хетероложен регулаторен полинуклеотид.

9. Гостоприемникова клетка, включваща полинуклеотида от която и да е претенции 1- 6.

03/396/02/ПБ

10. Гостоприемникова клетка, характеризираща се с това, че посоченият изолиран полинуклеотид е оперативно свързан към хетероложен регулаторен полинуклеотид.

11. Метод за получаване на протеин, характеризиращ се с това, че включва култивиране на гостоприемниковата клетка от претенция 10 при условия на експресия на посочения протеин и възстановяването му.

12. Изолиран С5- епимеразен полипептид, характеризиращ се с това, че неговата амино киселинна последователност е най- малко 95% идентична на последователност, състояща се от амино киселини 1- 618 от Фигура 3.

13. Изолиран С5- епимеразен полипептид съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че е продуциран или се съдържа в рекомбинантна гостоприемникова клетка.

14. Изолиран С5- епимеразен полипептид съгласно ретенция 13, характеризиращ се с това, че посочената рекомбинантна гостоприемникова клетка е инсектицидна клетка.

15. Изолиран полинуклеотид, който включва нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, характеризиращ се с това, че неговата амино киселинна последователност е наймалко 95% идентична на референтна амино киселинна последователност, избрана от групата, състояща се от:

а) амино киселини 1 до 154 от Фигура 3;

б) амино киселини 35 до 154 от Фигура 3;

с) амино киселини 34 до 154 от Фигура 3;

16. Полинуклеотид съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че представлява ДНК

03/396/02/ПБ

17.

Полинуклеотид съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че представлява РНК

18. Полинуклеотид съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че включва и хетероложен полинуклеотид

19. Полинуклеотид съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че посоченият хетероложен полинуклеотид кодира хетероложен полипептид

20. Полинуклеотид съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че посоченият хетероложен полинуклеотид е позициониран при 3’ края на посочената нуклеотидна последователност.

21. Вектор, характеризиращ се с това, че включва полинуклеотида от която и да е претенция 15- 20.

22. Вектор съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че посоченият полинуклеотид е оперативно свързан с хетероложен регулаторен полинуклеотид.

23. Гостоприемникова клетка, включваща полинуклеотида от която и да е претенции 15- 20.

24. Гостоприемникова клетка съгласно претенция 23, характеризираща се с това, че посоченият изолиран полинуклеотид е оперативно свързан към хетероложен регулаторен полинуклеотид.

25. Метод за получаване на протеин, характеризиращ се с това, че включва култивиране на гостоприемниковата клетка от претенция 24 при условия на експресия на посочения протеин и възстановяването му.

26. Изолиран С5- епимеразен полипептид, който включва Nкраен фрагмент, характеризиращ се с това, че неговата амино киселинна последователност е най- малко 95% идентична на

03/396/02/ПБ амино киселинна последователност, избрана от групата, състояща се от:

а) амино киселини 1 до 154 от Фигура 3;

б) амино киселини 35 до 154 от Фигура 3;

с) амино киселини 34 до 154 от Фигура 3;

27. Изолиран С5- епимеразен полипептид съгласно претенция 26, характеризиращ се с това, че е продуциран или се съдържа в рекомбинантна гостоприемникова клетка.

28. Изолиран С5- епимеразен полипептид съгласно ретенция 26, характеризиращ се с това, че посочената рекомбинантна гостоприемникова клетка е инсектицидна клетка.

29. Метод за значително повишаване активността на С5епимераза, характеризиращ се с това, че включва:

а) осигуряване на първи полинуклеотид, който включва нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, чиято амино киселинна последователност е най- малко 90% идентична на референтна амино киселинна амино киселинна последователност, избрана от групата, състояща се от амино киселини 35 до 154 от Фигура 3 и амино киселини 34 до 154 от фигура 3;

б) прикрепяне на този първи полинуклеотид от а) към втори полинуклеотид, кодиращ С5- епимераза; и

с) експресия на фузионния полинуклеотид.

30. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че посоченият първи полинуклеотид включва нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, чиято амино киселинна последователност е амино киселини 35 до 154 от Фигура 3.

03/396/02/ПБ ·· ····

31. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че посоченият първи полинуклеотид включва нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, чиято амино киселинна последователност е амино киселини 34 до 154 от Фигура 3.

32. Метад съгласно която и да е от претенциии 29- 31, характеризиращ се с това, че С5- епимеразата е говежда С5епимераза.