JP2004515239A - グルクロニルｃ５−エピメラーゼ、それをコードするｄｎａおよびその使用 - Google Patents
グルクロニルｃ５−エピメラーゼ、それをコードするｄｎａおよびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、新規の精製マウスＣ５−エピメラーゼ、その断片、それをコードする核酸、およびその組換え的産生に向けられる。本発明は、このようなエピメラーゼの断片、特に組換え的産生異種エピメラーゼ酵素の活性を強化するための融合タンパク質構築物において有用であるＮ末端断片にも向けられる。
Description
【０００１】
産業上の利用分野
本発明は、組換えタンパク質、特にグルクロニルＣ５−エピメラーゼおよびグリコサミノグリカンの修飾のためのその使用の分野である。
【０００２】
発明の背景
グルクロニルＣ５−エピメラーゼ（本明細書中では「Ｃ５−エピメラーゼ」）は、ヘパリン／ヘパラン（ＨＳ）合成の第二ポリマー修飾段階におけるＬ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）へのＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）の転換を触媒する。ヘパリン／ＨＳ合成に関与するエピメラーゼは、生合成的ポリマー修飾の第一（先行）段階においてその精製がＮ−デアセチラーゼ−Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（ＮＤＳＴ）により触媒される標的ＨｅｘＡの非還元側でＮ−スルフェートに対する絶対要件を有する。さらにエピメラーゼは、その作用部位近くでＯ−スルフェート基により阻害され、それでＯ−硫酸化段階は後にヘパリン生合成経路において、エピマー化または逆エピマー化を阻害する。当該反応は、カルボアニオンを介した標的ヘキスロン酸のＣ５での陽子の可逆的引き抜きおよび再付加を包含し、２つの多プロトン性塩基性アミノ酸（特にＬｙｓ）を包含すると考えられる。
【０００３】
Ｃ５−エピメラーゼは、ヘパリン／ＨＳ生合成に関与する他の酵素と同様に、ゴルジ体中で膜結合または会合されると思われる。興味深いことに、可溶化エピメラーゼは両（可逆的）反応を触媒するが、しかし逆エピマー化はミクロソーム分画からは検出可能でない。Ｃ５−エピメラーゼ活性タンパク質は肝臓から最初に精製され、特性化された（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ２６９５３−２６９５８ （１９９４））。
【０００４】
Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｐ等は、ウシ肝臓からのＤ−グルクロニルＣ５−エピメラーゼの精製を報告し（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ２６９５３−２６９５８ （１９９４））、そしていくつかのＤＮＡ配列も報告されている。ゲノムおよびｃＤＮＡ配列からのウシＣ５−エピメラーゼの予測サイズは、７０．１ ＫＤ（６１８個のアミノ酸）（以下で考察）であり、前記のように抽出されるほとんどの精製ネイティブ調製物は５２および２０ｋＤａの優勢種を含有したが、このことは、タンパク質分解的切断（プロセシング）が起き得たことを示す。サイズ排除クロマトグラフィーからの大型ＭＷ（２００ ｋＤａ）分画中の活性の検出は、集合またはオリゴマー化が起こり得ることを示した。酵素は、活性の広範なｐＨ範囲（６．５〜７．５）を有し、最適ｐＨは７．４である。酵素は金属イオンまたはその他の補因子要件を有さない。動力学試験は、予期せぬことに、おそらくは高分子基質および立体障害、および／またはエピメラーゼ分子のオリゴマー化に関連する酵素濃度の増大に伴ってＫｍが増大する、ということを明示した。
【０００５】
近年、Ｌｉｎｄａｈｌ， Ｕ． ａｎｄ Ｌｉ， Ｊ−Ｐ．（ＷＯ９８／４８００６）は、ウシ肝臓から５２ ｋＤａのＣ５−エピメラーゼを精製し、部分アミノ酸配列を得た。プライマーは内部配列に対して作製され、ウシ肝臓ｃＤＮＡ調製物からの配列を増幅するために用いられた。ウシ肝臓配列は、ウシ肺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられた。４４４個のアミノ酸のオープンリーディングフレームを有する配列が見出されたが、これは４９．９ ｋＤａのポリペプチドに対応する。ウシ肝臓から以前に単離された酵素は、ネイティブタンパク質の切頭化形態であった、と記述された。ウシの肝臓、肺およびマウス肥満細胞腫からの総ＲＮＡは、ウシ肺エピメラーゼｃＤＮＡクローンとのハイブリダイゼーションにより分析された。ウシ肝臓およびウシ肺はともに同一結果を生じ、約９ ｋｂの優勢転写体および弱い５ ｋｂ帯域を有した。マウス肥満細胞腫ＲＮＡのみは、約５ ｋｂで転写体を示した。
【０００６】
ウシ肺からのＣ５−エピメラーゼをコードするｃＤＮＡのクローニングの報告は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ２８１５８−２８１６３ （１９９７）にも記載されている。Ｌｉ等は、最初に活性をクローン化（組換え）配列に割り当てたバキュロウイルス／昆虫細胞系中でウシ肺エピメラーゼをクローン化し、発現した。活性組換えタンパク質は、限定的割り当てのために精製されなかった。
【０００７】
ショウジョウバエ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＦ５７３７３）、線虫Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ４６５５５）およびメタノコッカス（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ６７５５５）からのＣ５−エピメラーゼｃＤＮＡ配列が報告されている。
【０００８】
Ｌｉｎｄａｈｌ等により報告された組換えウシエピメラーゼの酵素活性は、相対的に低かった。しかしながら、より良好な産生を生じ得る系における単独クローン化哺乳類エピメラーゼであるウシ肺Ｃ５−エピメラーゼを発現する試みは、失敗した。哺乳類細胞、ビール酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉにおける発現が試みられた。今日まで、可溶性活性Ｃ５−エピメラーゼの産生の成功例は報告されていない。したがって、初期バキュロウイルス細胞系結果を他の組換え系に広げることはできなかったし、あるいはこの酵素の発現のための哺乳類、酵母および細菌系のような慣用的発現方法を用いることができなかった。
【０００９】
したがって、高活性Ｃ５−エピメラーゼに対する、そしてその大量の産生のための方法に対する必要性が当業界には依然として存在する。
【００１０】
発明の要約
非限定的性質の問題は哺乳類起源の組換えエピメラーゼの発現に伴って存在することを認識し、そして有用量のＣ５−エピメラーゼを発現し、産生するための有用な方法の必要性に気づいて、本発明人等は、組換えＣ５−エピメラーゼ産生方法を研究した。その研究は、新規のマウス遺伝子、ならびにそこにコードされるマウスＣ５−エピメラーゼタンパク質の発見で絶頂に達した。本発明のマウスＣ５−エピメラーゼは、とりわけ、それが、当業界で既知のＣ５−エピメラーゼタンパク質配列と比較した場合、そのＮ末端に付加的配列を含有する、という点で独特である。マウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端断片またはその短縮化バージョンの、他のＣ５−エピメラーゼのＮ末端との融合が、大きさにしたがって他の組換えＣ５−エピメラーゼ活性を大いに増強する、ということが予期せず発見された。したがってマウスＮ末端延長を用いて、それと操作可能的に連結される配列の発現、特に組換え系におけるネイティブ（ネズミ肝臓）および異種（非ネズミおよびネズミ非肝臓）形態のＣ５−エピメラーゼの発現を促し得る。
【００１１】
したがって第一の実施態様では、本発明は、マウス（ネズミ）肝臓Ｃ５−エピメラーゼをコードする精製および／または単離ポリヌクレオチド、ならびにその維持および発現のための組換えベクターおよび宿主に向けられる。
【００１２】
さらなる実施態様では、本発明は、このようなポリヌクレオチドによりコードされる精製および／または単離マウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼタンパク質、あるいはそれを含有する調製物に向けられる。
さらなる実施態様では、本発明は、このようなポリヌクレオチド、ならびにそれを発現するための本発明の組換えベクターおよび宿主を用いたマウスＣ５−エピメラーゼの産生方法に向けられる。
【００１３】
さらなる実施態様では、本発明は、融合タンパク質、例えば所望のタンパク質のアミノ酸配列に枠内で操作可能的に連結されるマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端配列、特に異種Ｃ５−エピメラーゼ配列を含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、特に精製および／または単離ポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの維持および発現のためのベクターおよび宿主に向けられる。
【００１４】
さらなる実施態様では、本発明は、このようなポリヌクレオチドによりコードされる精製および／または単離Ｃ５−エピメラーゼ融合タンパク質に向けられる。
【００１５】
さらなる実施態様では、本発明は、所望のタンパク質の産生方法であって、このような当該所望タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、マウスＣ５−エピメラーゼをコードするポリヌクレオチドまたはそのＮ末端配列を操作可能的に連結し、そして本発明の組換え宿主内でそれを発現することによる方法に向けられる。
【００１６】
さらなる実施態様では、本発明は、ポリヌクレオチド配列、ならびにマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端断片ポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチドを提供するベクターに向けられ、このようなポリヌクレオチドおよびベクターは、それへの所望の配列、特に当該タンパク質をコードする配列、特に別のエピメラーゼ配列の挿入（連結）のための断片の３’末端に所望の制限部位を有する。
【００１７】
さらなる実施態様では、本発明は、ネイティブ配列およびそれに連結される異種配列の発現のためのマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端配列の使用方法に向けられる。
好ましい実施態様の詳細な説明
Ｃ５−エピメラーゼをコードするマウス肝臓遺伝子をクローン化した。ヌクレオチド配列は、図２に示されている。マウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼタンパク質のアミノ酸配列は、６１８アミノ酸長（図３）であり、７１，１８０．１ダルトン（７１．１８ ｋＤａ）の分子量を有することが判明した。マウスＣ５−エピメラーゼは、８．２５の等電点を有し、正味電荷はｐＨ７で＋４．０１である。
【００１８】
いかなるＮ末端延長も有さないマウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼ配列のアミノ酸配列は、ウシＣ５−エピメラーゼ配列と相同（＞９６％アミノ酸同一性）である。しかしながら、マウスゲノム配列によりコードされる酵素のＮ末端は、クローン化ウシ配列からは「失われている」付加的な１５４個のアミノ酸（ａａ）を含有する、ということを配列分析は明示した。
【００１９】
マウスコード配列は、対応するウシおよびヒト（脳ｃＤＮＡライブラリーからの発現化配列タグ）配列との＞９５％ペプチド同一性、線虫の発現化配列からの仮説的７１．９ ｋＤａタンパク質との＞５０％類似性、ならびにメタノコッカス種の発現化配列からのタンパク質との３８％類似性を示した。
【００２０】
マウスＣ５−エピメラーゼ酵素の予測膜貫通トポロジー（疎水性プロット）は、ＮＤＳＴのものと類似する。これらのおよびその他の観察（例えばヘパリン合成速度）は、ヘパリン生合成のＣ５−エピメラーゼおよびその他の酵素がｉｎ ｖｉｖｏで複合体に関連すると思われる、ということを示した。
【００２１】
組換えマウスＣ５−エピメラーゼは、バキュロウイルス昆虫細胞系から、昆虫細胞シグナルにより発現され、分泌される場合、４℃の培地中で最も安定している。組換えＣ５−エピメラーゼの精製としては、例えば陽イオン交換またはアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。例えば組換えタンパク質は、組換えタンパク質のいずれかの末端で起こるＦＬＡＧ−タグまたはＨｉｓ−タグをタンパク質が含有するよう工学処理され得る。当業者が理解するように、このような場合、組換えタンパク質は、例えば抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を利用してＦＬＡＧエピトープを含む組換えタンパク質を捕捉する市販の樹脂を用いて精製され得る。
【００２２】
酵素は、Ｃ５標識化基質から有機シンチレーションカクテル中へのトリチウムの二相抽出ならびに計数により、最も迅速に検定されるが、しかし活性の最終的確証は、実施例に記載されるように、転換生成物のＮＭＲ分析による。
【００２３】
ネイティブマウス肝臓酵素は５〜１０ｘ１０９ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈの特異的活性を有するが、一方、組換え形態のマウス酵素の場合は、約２ｘ１０９ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈであった。比較により、組換えウシ酵素は約０．５〜１．０ｘ１０６ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈの特異的活性を有する。したがって組換えマウス酵素は、特に活性なＣ５−エピメラーゼである。
【００２４】
予期せぬことに、マウスＣ５−エピメラーゼの１５４個のアミノ酸（ａａ）Ｎ末端、特にそのある種の断片は、そのＮ末端と枠内で融合されると、他のＣ５−エピメラーゼの酵素的Ｃ５−エピメラーゼ活性を大いに強化し得る能力を有する、ということが判明した。この付加的１５４個のアミノ酸（ａａ）断片は、活性Ｃ５−エピメラーゼの組換え発現および分泌のために望ましい少なくとも３つの特徴を有すると思われる。第一に、それは、最初の３３〜３４残基（図３のアミノ酸１〜３３または１〜３４）からなるシグナル配列として機能すると考えられる配列を含む。第二に、それは、ジスルフィド結合の形成を、そして二次タンパク質構造の安定化を受け入れる付加的システイン残基を提供する。第三に、それは、翻訳後タンパク質分解的プロセシングに有用な部位と一致するアミド化部位を提供する。
【００２５】
シグナル配列を欠く１５４アミノ酸配列の断片は、それらが操作可能的に連結される異種エピメラーゼ、特にＣ５−エピメラーゼの活性を強化する能力を依然として保有する。例えば実施例に示されるように、ウシＣ５−エピメラーゼのＮ末端に、枠内で、直接連結されるアミノ酸３４〜１５４を含有する融合タンパク質は、ウシＣ５−エピメラーゼの活性を１００倍以上強化した。
【００２６】
核酸分子
本発明は、単離核酸分子であって、以下の：
（１）図３に示したアミノ酸配列を有するマウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；そして
（２）図３に示したアミノ酸配列を有するマウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドの有用な断片をコードするポリヌクレオチド
を含む核酸分子を提供する。有用な断片としては、（ａ）アミノ酸１〜３３または１〜３４のシグナル配列を提供する断片；（ｂ）成熟マウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼタンパク質配列、特にアミノ酸３３〜６１８または３４〜６１８を提供する断片；ならびに（ｃ）アミノ酸１〜１５４を有する活性刺激Ｎ末端断片の配列を提供する断片、例えばそれらが操作可能的に連結される他のＣ５−エピメラーゼの活性を強化する能力を保有するアミノ酸３３〜１５４または３４〜１５４のようなその断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
別記しない限り、本明細書中でＤＮＡ分子をシーケンシングすることにより確定されるヌクレオチド配列はすべて、実施例に記載したように確定され、そして本明細書中で確定されたＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列はすべて、前記のように確定されたＤＮＡ配列の翻訳により予測された。したがって、このアプローチにより確定された任意のＤＮＡ配列に関して当業界で既知であるように、本明細書中で確定される任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含有し得る。自動化により確定されるヌクレオチド配列は、典型的には、シーケンシング化ＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、さらに典型的には少なくとも約９５〜９９．９％同一である。実際の配列は、他のアプローチ、例えば当業界で周知である手動ＤＮＡシーケンシング法によりさらに精確に確定され得る。同じく当業界で既知であるように、実際の配列と比較される確定ヌクレオチド配列における単一挿入または欠失は、確定ヌクレオチド配列によりコードされる予測アミノ酸配列が、このような挿入または欠失の点で開始するシーケンシング化ＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸分子とは完全に異なるよう、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こす。
【００２８】
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドの配列を、ならびにＲＮＡ分子またはポリヌクレオチド、リボヌクレオチドの対応する配列（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）を意図するが、この場合、特定のデオキシリボヌクレオチド配列中の各チミジンでオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドウリジン（Ｕ）により置換される。
【００２９】
図および配列表に記述されたヌクレオチド配列のような本明細書中で提供される情報を用いて、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドをコードする本発明の核酸分子またはそのキメラ構築物は、標準クローニングおよびスクリーニング手法、例えば出発物質としてｍＲＮＡを用いたｃＤＮＡのクローニングのための方法を用いて得られる。本発明の例証として、図２および３に記載されたＣ５−エピメラーゼ核酸分子が、ネズミ肝臓組織由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。
【００３０】
図２のＣ５−エピメラーゼＤＮＡの確定ヌクレオチド配列は、約６１８アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有し、図２におけるヌクレオチド配列のヌクレオチド位置１に開始コドンを有する。
【００３１】
当業者が理解するように、前記のシーケンシングエラーの可能性のために、図３に示されたような約６１８個のアミノ酸を含む図２の配列によりコードされる実際の完全Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドは、多少長いかまたは短い。いずれにしても、以下でさらに考察されるように、本発明はさらに、完全ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失された種々の残基を有するポリペプチド、例えば本明細書中に記載された細胞外ドメインのＮ末端またはＣ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸を欠くポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明の核酸分子としては、図３に示されているようなＣ５−エピメラーゼシグナル配列をコードするものが挙げられるが、これは、図３に示されたアミノ酸配列のアミノ酸１〜３３またはアミノ酸１〜３４である。このような分子は、任意の所望のヌクレオチド配列と、特にＣ５−エピメラーゼシグナル配列が分泌可能である宿主から分泌されるのが望ましい当該タンパク質をコードするものと、枠内で操作可能的に連結され得る。
【００３３】
さらに、本発明の核酸分子としては、図３に示されたようなアミノ酸１〜１５４またはその少なくとも３０アミノ酸であるマウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼの「異種活性強化」配列をコードするものが挙げられる。「異種」核酸という用語により意味されるものは、異なる種の核酸由来のものであるとして当業者に周知である。好ましくはこのような核酸分子は、図３に示されたようなアミノ酸１〜１５４、３３〜１５４または３４〜１５４に、一端または両端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸をプラスまたはマイナスしたものをコードする。このようなポリペプチドをコードする核酸は、別のエピメラーゼ、特に別のＣ５−エピメラーゼに関するコード配列と枠内で操作可能的に連結されて、融合タンパク質が核酸構築物によりコードされるという結果を伴う。好ましい実施態様では、異種活性強化配列は融合タンパク質のＮ末端で発現され、マウス配列の存在によりその活性が強化される別のタンパク質、特に非マウスＣ５−エピメラーゼまたはマウスＣ５−エピメラーゼのイソ酵素のＮ末端に連結される。
【００３４】
示されたように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの形態であるか、またはＤＮＡ、例えばクローニングにより得られるかまたは合成的に産生されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても既知のコード鎖であり得るし、あるいはそれは、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり得る。
【００３５】
「単離」核酸分子（単数または複数）とは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えばベクター中に含入される組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞または溶液中の精製（部分的または実質的に）ＤＮＡ分子中に維持される組換えＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写体が挙げられる。本発明による単離核酸分子はさらに、合成的に産生されるこのような分子を包含する。
【００３６】
本発明の単離核酸分子としては、本発明のＣ５−エピメラーゼタンパク質または融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；図２に示されるようなＣ５−エピメラーゼタンパク質に関するコード配列またはその所望の断片を含むＤＮＡ分子；ならびに前記のものとは実質的に異なる配列を含むが、しかし遺伝暗号の縮重のために、図３に示されたようなＣ５−エピメラーゼタンパク質アミノ酸配列を依然としてコードするＤＮＡ分子が挙げられる。もちろん、遺伝暗号は当業界で周知である。したがってこのような縮重変異体を当業者が生成することは、日常的仕事である。さらなる実施態様では、前記のようなＣ５−エピメラーゼポリペプチドをコードするが、しかしＮ末端メチオニンを、または図３で示されたようなアミノ酸１〜３３または１〜３４によりコードされるシグナル配列を欠いている、あるいはそれに操作可能的に連結された異なる（異種）シグナル配列のコード配列を有する核酸分子が提供される。
【００３７】
本発明はさらに、前記の核酸分子だけでなく、前記の配列と相補的な配列を有する核酸分子も提供する。このような単離分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのための、そして例えばノーザンブロット分析による種々の種および組織におけるＣ５−エピメラーゼ遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。
【００３８】
本発明はさらに、所望の特性を保持するかあるいは所望の特性または活性を保持するポリペプチドをコードする本明細書中に記載された単離核酸分子の断片に向けられる。前記のような単離核酸分子の断片とは、本明細書中で考察されたような、または融合タンパク質構築物に所望のモチーフまたはドメインを提供するための診断プローブおよびプライマーとして有用である長さが少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約４０ｎｔの断片を意図する。もちろん、５０〜３００ｎｔ長の大型断片、または６００ｎｔ長という長い断片でさえも、図２に示されたまたは図３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列の、全部でないとしてもほとんどに対応する断片である場合、本発明に有用である。少なくとも２０ｎｔ長の断片とは、例えば図２のものと比較した場合、図２に示されたようなヌクレオチド配列のヌクレオチド配列からの２０またはそれ以上の連続塩基を含む断片を意図する。
【００３９】
特に本発明は、図２に示されるかまたは図３に示されたアミノ酸配列をコードするものの部分を示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。アミノ末端メチオニンを欠くＣ５−エピメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも意図される。このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも提供され、このようなポリペプチドは、図３に示されたアミノ酸配列の位置２〜６１８のアミノ酸配列を含むが、しかしアミノ末端メチオニンを欠く。
【００４０】
別の局面では、本発明は、全キノ本発明の核酸分子中のポリヌクレオチドの一部分または好ましくは全部と緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。一部分とは、任意の所望部分、例えばアミノ酸１〜１５４または３３〜１５４または３４〜１５４をコードする図２のポリヌクレオチドであり得る。「緊縮ハイブリダイゼーション条件」とは、以下の：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ ｍＭＮａＣｌ、７５ ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一夜インキュベートし、その後約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄することを意図する。
ポリヌクレオチドの「一部分」とハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらに好ましくは約３０〜７０（例えば５０）ｎｔとハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意図する。これらは、前記のような、そして以下でさらに詳述されるような診断プローブおよびプライマーとして有用である。
【００４１】
例えば「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部分とは、参照ポリヌクレオチド（例えば図２に示されたようなヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列からの２０またはそれ以上の連続ヌクレオチドを意図する。もちろん、ポリＡ配列とまたはＴ（またはＵ）残基の相補鎖とだけハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）鎖またはその相補体（例えば実際的に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含有する任意の核酸分子とハイブリダイズするため、本発明の核酸の一部分とハイブリダイズするために用いられる本発明のポリヌクレオチド中には含まれない。
【００４２】
前記のように、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドをコードする本発明の核酸分子としては、ポリペプチドに関するコード配列、単独（それが分泌シグナルを欠く場合には成熟Ｃ５−エピメラーゼとも呼ばれる）；ポリペプチドに関するコード配列および付加的配列、例えばリーダーまたは分泌配列をコードするもの、例えばプレ−またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列；付加的非コード配列、例えばイントロンおよび非コード５’および３’配列、例えば転写、ｍＲＮＡプロセシング−例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル−リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定において一役を演じる転写化、非翻訳化配列（これらに限定されない）と一緒に、前記の付加的コード配列を伴うかまたは伴わないポリペプチドのコード配列；付加的アミノ酸をコードする付加的コード配列、例えば付加的機能性を提供するものが挙げられ得るが、これらに限定されない。したがって、例えばポリペプチドは、融合（マーカー含有）ポリペプチドの精製を促すマーカー配列、例えばペプチドと融合され得る。本発明のこの局面のある種の好ましい実施態様では、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）であり、とりわけ、その多くは市販されている。例えばＧｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８２１−８２４ （１９８９）に記載されているように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８ （１９８４）により記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する精製に有用な別のペプチドである。
【００４３】
変異体および突然変異体ポリヌクレオチド
本発明はさらに、Ｃ５−エピメラーゼの部分、類似体または誘導体をコードする本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」とは、生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替的形態のうちの１つを意図する（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ， Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．， ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８５））。非天然変異体は、当業界で既知の突然変異誘発技法を用いて産生され得る。
【００４４】
このような変異体としては、ヌクレオチド置換、欠失または付加により産生されるものが挙げられる。置換、欠失または付加は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを包含し得る。変異体は、コード領域、非コード領域またはその両方で変更され得る。コード領域における変化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、無症候性置換、付加および欠失であり、これはＣ５−エピメラーゼポリペプチドまたはその一部分の特性および活性を変えない。その上、この点で特に好ましいのは、保存的置換である。
【００４５】
本発明のさらなる実施態様としては、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸分子であって、そのアミノ酸配列が、以下の：（ａ）図３のアミノ酸１〜１１８；（ｂ）図３のアミノ酸１〜１１９；（ｃ）図３のアミノ酸１〜１２０；（ｄ）図３のアミノ酸１〜１２１；（ｅ）図３のアミノ酸１１９〜６１８；（ｆ）図３のアミノ酸１２０〜６１８；（ｇ）図３のアミノ酸１２１〜６１８；（ｈ）図３のアミノ酸１２２〜６１８；（ｉ）図３のアミノ酸３４〜１４７；（ｊ）図３のアミノ酸３５〜１５４；（ｋ）図３のアミノ酸３４〜１５４；（ｌ）図３のアミノ酸１〜１５４；（ｍ）図３に示された全アミノ酸配列からなる群から選択される参照アミノ酸と少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子が挙げられる。
【００４６】
本発明のさらなる実施態様としては、前記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）のポリヌクレオチドと緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子が挙げられる。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない。
【００４７】
Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と例えば少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であるが、但し、ポリヌクレオチド配列が、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５つまでの点突然変異を含み得ることを意図する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されるかまたは別のヌクレオチドで置換され、あるいは参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で、あるいはそれらの末端位置間のどこかで、参照配列中のヌクレオチド間に別々に散在されて、あるいは参照配列内の１つまたはそれ以上の連続基中に起こり得る。
【００４８】
実際には、任意の特定の核酸分子が、図２に示されたヌクレオチド配列と例えば少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、慣用的には既知のコンピュータープログラム、例えばベストフィットＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）を用いて確定され得る。ベストフィットは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同の最良セグメントを見つける。ベストフィットまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて特定の配列、例えば本発明の参照配列と９５％同一である配列が存在するか否かを確定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長に亘って算定され、そして参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同におけるギャップが許されるよう、設定される。
【００４９】
本出願は、Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、図２に示された核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に向けられる。これは、特定の核酸分子がＣ５−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしない場合でも、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして核酸分子を用いる方法を当業者はすでに知っているためである。Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、特に以下のものが挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＣ５−エピメラーゼ遺伝子またはその対立遺伝子変異体の単離；（２）Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）に記載されているようなＣ５−エピメラーゼ遺伝子の精確な染色体位置を提供するための中期染色体スプレッドとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば「ＦＩＳＨ」）；ならびに特定組織中のＣ５−エピメラーゼｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット。
【００５０】
しかしながら好ましいのは、Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを実際にコードする図２に示された核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する核酸分子である。「Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的検定で測定した場合に、本発明のＣ５−エピメラーゼ（全長タンパク質あるいは好ましくはアミノ酸３３〜６１８または３４〜６１８を含有する同定アミノ酸断片）の活性と類似するがしかし必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドを意図する。
【００５１】
もちろん、遺伝暗号の縮重のために、寄託ｃＤＮＡの核酸配列または図２に示された核酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が「Ｃ５−エピメラーゼタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードする、ということを当業者は直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体がすべて同一ポリペプチドをコードするため、これは、前記の比較検定を実施しない場合でさえ、当業者には明らかである。さらに、縮重変異体でないこのような核酸分子に関して、合理的数がＣ５−エピメラーゼタンパク質活性を有するポリペプチドもコードする、と言うことが当業界で認識される。これは、以下でさらに記載されるように、タンパク質機能を有意に実行するとはあまり思われないかまたは思われないアミノ酸置換（例えばある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換する）に当業者が十分気づいているためである。
【００５２】
ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明の単離ＤＮＡ分子を含むベクター、本発明の組換えベクターを用いて遺伝子工学処理される宿主細胞、ならびに組換え技法によるＣ５−エピメラーゼポリペプチドまたはその断片の産生にも関する。
【００５３】
ポリヌクレオチドは、宿主中での増殖のために選択可能マーカーを含有するベクターと連結され得る。一般にプラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物中に、あるいは荷電脂質との複合体中に導入される。ベクターがウイルスである場合、それは、適切なパッキング細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにパックされ、次に宿主中に形質導入され得る。
【００５４】
ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーター、例えば２〜３名前を挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターと操作可能的に連結される必要がある。その他の適切なプロモーターは、当業者に既知である。発現構築物はさらに、転写開始、終結のための部位を、ならびに、転写化領域では、翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。構築物により発現される成熟転写体のコード部分は、好ましくはその始まりに翻訳開始コドンを、そして翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００５５】
前記のように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養のためのジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、ならびに大腸菌およびその他の細菌における培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌、コリネバクテリア、ストレプトミセスおよびネズミチフス菌Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えばアスペルギルス属、黒色アスペルギルスＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはトリコデルマ属、酵母細胞、例えばサッカロミセス属、ビール酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；昆虫細胞例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい宿主としては、昆虫細胞が挙げられる。前記宿主細胞のための適切な培地および条件は、当業界で既知である。
【００５６】
細菌中で用いるための好ましいベクターとしては、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）；ｐＢＳベクター、ファゲスクリプトＰｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ブルースクリプトＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。好ましい真核生物ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、痘瘡ウイルスベクター、例えばワクシニアウイルスおよびアデノウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。その他の適切なベクターは、当業者には用意に明らかになる。
【００５７】
宿主細胞中への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染またはその他の方法により実行され得る。このような方法は、多数の標準実験室マニュアル、例えばＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）に記載されている。
【００５８】
ポリペプチドおよび断片
本発明はさらに、図３中のアミノ酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有する単離または精製Ｃ５−エピメラーゼポリペプチド、あるいは特に前記のようなそして前記の核酸分子によりコードされる前記のポリペプチドの一部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。
【００５９】
本発明はさらに、図３に示されたようなアミノ酸１〜３３または１〜３４のシグナル配列、あるいは図３に示されたようなアミノ酸１〜１５４、３３〜１５４または３４〜１５４の活性強化配列のような、当該タンパク質のＮ末端にそのＣ末端で融合されるマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端の機能的部分を含有する融合タンパク質を提供する。位置実施態様では、当該タンパク質は、図３のマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端の３０〜１５４アミノ酸を含有するＮ末端の部分、特にアミノ酸３３〜１５４または３４〜１５４に融合される。別の好ましい実施態様では、当該タンパク質は、図３に示された配列の残基３３〜１５４を含有するＮ末端の機能的部分に融合される。非常に好ましい実施態様では、当該タンパク質は、図３における配列に示されたようなアミノ酸１〜３３または１〜３４の分泌シグナルを含有するＮ末端の機能的部分に融合される。
【００６０】
ポリペプチドは、修飾化形態で、例えば融合タンパク質で発現され、分泌シグナルだけでなく、付加的異種機能的領域も含み得る。「異種」ポリペプチドという用語が意味することは、異なる種由来のものであるとして当業者に周知である。したがって例えば付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域がポリペプチドのＮ末端に付加されて、精製中またはその後の取り扱いおよび貯蔵中の宿主細胞中での安定性および持続性を改良し得る。さらにペプチド部分は、精製を促すためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製前に除去され得る。分泌または排出を引き起こすための、安定性を改良するための、そして精製を促すため等のポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当業界でよく知られたルーチンの技法である。
【００６１】
Ｃ５−エピメラーゼまたはその断片を含有する融合タンパク質は、周知の技法により、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーにより組換え細胞培養から回収され、精製され得る。
【００６２】
本発明のポリペプチドとしては、天然精製産物、化学合成手法の産物、ならびに原核生物または真核生物、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞から組換え技法により産生される産物が挙げられる。組換え産生手法に用いられる宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化または非グリコシル化される。さらに本発明のポリペプチドは、いくつかの場合には宿主媒介性過程の結果として、初期修飾化メチオニン残基も含み得る。本発明のポリペプチドは、タンパク質精製手法のために末端に付加されるヒスチジンまたはポリヒスチジンの修飾も含み得る。
【００６３】
Ｃ５−エピメラーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、種々の用途のために、特にＣ５−エピメラーゼの化学的および生物学的特性を用いる用途のために、本発明にしたがって用いられ得る。特に本発明の組換えエピメラーゼは、大規模で、抗凝血薬として有用であり得るヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸塩を製造するために用いられ得る。さらに本発明のエピメラーゼは、発生学、新脈管形成および腫瘍進行に及ぼすヘパリンおよびヘパラン硫酸塩のような細胞外マトリクス分子の作用を研究するための実験設定に有用であり得る。例えば酵素は、ヘパリンまたはヘパラン硫酸塩中のＤ−グルクロン酸／Ｌ−イズロン酸残基の比を調整し得る。Ｌ−イズロン酸残基は、それらの独特の配座特性のために、タンパク質との多糖の相互作用を促すと考えられる。さらに本発明のエピメラーゼは、いくつかの食品中の安定剤またはゲル化剤として用いられ得る工業的に有用な糖を修飾するためにも用いられ得る。
【００６４】
変異体および突然変異体ポリペプチド
Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドの特徴を改良または変更するために、タンパク質工学処理が用いられ得る。当業者に既知の組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば単一または多アミノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含めた新規の突然変異体タンパク質または「ムテイン」を作製し得る。このような修飾化ポリペプチドは、例えば活性強化または安定性増大を示し得る。さらにそれらは、少なくともある種の精製および貯蔵条件下で、対応する天然ポリペプチドより高収率で精製され、そしてより良好な溶解性を示す。
【００６５】
Ｎ末端およびＣ末端欠失突然変異体
例えば、膜関連タンパク質または成熟形態（単数または複数）の分泌タンパク質の細胞外ドメインを含めた多数の特性に関して、１つまたはそれ以上のアミノ酸が生物学的機能の実質的損失を伴わずにＮ末端またはＣ末端から欠失され得る、ということが当業界で既知である。例えばＲｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８： ２９８４−２９８８ （１９９３）は、３、８または２７個の末端アミノ酸残基が失われている場合でもヘパリン結合活性を有する修飾化ＫＧＦタンパク質を報告した。
【００６６】
しかしながら、タンパク質のＮ末端からの１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失がタンパク質の１つまたはそれ以上の生物学的機能の修飾または損失を生じる場合でも、その他の生物学的活性は依然として保持され得る。したがってＣ５−エピメラーゼタンパク質の全体または部分を認識する抗体を誘導しおよび／または結合する短縮化タンパク質の能力は、一般に、大多数より少ない完全タンパク質の残基または細胞外ドメインがＮ末端から除去された場合、保持される。完全タンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが依然としてこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載のルーチン方法によりならびに当業界で既知の別の方法で容易に確定され得る。
【００６７】
したがって本発明はさらに、アミノ酸配列のアミノ末端から欠失される１つまたはそれ以上の残基を有するポリペプチドを提供する。
【００６８】
しかしながらタンパク質のＣ末端からの１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失がタンパク質の生物学的機能の修飾または損失を生じる場合でも、その他の生物学的活性は依然として保持され得る。したがって完全または成熟形態のタンパク質を認識する抗体を誘導しおよび／または結合する短縮化タンパク質の能力は、一般に、大多数未満の完全または成熟形態タンパク質の残基がＣ末端から除去される場合に、保持される。完全タンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが依然としてこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載のルーチン方法によりならびに当業界で既知の別の方法で容易に確定され得る。
【００６９】
本発明は、アミノおよびカルボキシル末端の両方から欠失される１つまたはそれ以上のアミノ酸を有するポリペプチドも提供する。
【００７０】
その他の突然変異体
前記の末端欠失形態のタンパク質のほかに、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能に有意の影響を及ぼさずに変更され得る、ということも当業者に認識される。配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を確定するタンパク質上の重要な領域が存在することを思い起こす必要がある。したがって本発明はさらに、実質的Ｃ５−エピメラーゼポリペプチド活性を示し、あるいは下記のタンパク質部分のようなＣ５−エピメラーゼタンパク質の領域を含むＣ５−エピメラーゼポリペプチドの変異を包含する。このような突然変異体としては、欠失、挿入、逆位、反復およびタイプ置換が挙げられる。アミノ酸変化が表現型敵に無症候性であると思われる指針は、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ． ｅｔ ａｌ．， “Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７： １３０６−１３１０ （１９９０）に見出され得る。
【００７１】
したがって図３のポリペプチドの断片、誘導体または類似体あるいはそれを含有する融合タンパク質は、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基（単数または複数）、さらに好ましくは少なくとも１つのしかし１０未満の保存アミノ酸残基（単数または複数））で置換されるものであり、このような置換アミノ酸残基（単数または複数）は、遺伝暗号によりコードされるものであり得るし、またはあり得ない；あるいは（ｉｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの；あるいは（ｉｉｉ）成熟または可溶性細胞外ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増大するための化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合されるもの；あるいは（ｉｖ）付加的アミノ酸がリーダーまたは分泌配列あるいは成熟ポリペプチドの精製のために用いられる配列またはプロタンパク質配列と融合されるものであり得る。このような断片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。
【００７２】
したがって本発明のＣ５−エピメラーゼは、天然突然変異または人的操作による、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。前記のように、変化は、好ましくは小さいものであり、例えばタンパク質のフォールディングまたは活性に有意の影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である（表１参照）。
【００７３】
【表１】
【００７４】
機能に不可欠な本発明のＣ５−エピメラーゼタンパク質中のアミノ酸は、当業界で既知の方法により、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５ （１９８９））。後者の手法は、分子中のすべての残基に単一アラニン突然変異を導入する。その結果生じる突然変異体分子は、次に、受容体結合またはｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖活性といった生物学的活性に関して試験される。
【００７５】
特に興味深いのは、別の荷電アミノ酸による、ならびに中性または負荷電アミノ酸による変化アミノ酸の置換である。後者は、正電荷低減を示すタンパク質を生じて、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質の特徴を改良する。集合の防止は、非常に望ましい。タンパク質の集合は、活性損失を生じるだけでなく、それらが免疫原性であり得るために、製剤処方物を調製する場合にも問題を生じ得る（Ｐｉｎｃｋａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：３３１−３４０ （１９６７）； Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６： ８３８−８４５ （１９８７）； Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０： ３０７−３７７ （１９９３））。
【００７６】
アミノ酸の置換は、細胞表面受容体とのリガンドの結合の選択性も変え得る。例えばＯｓｔａｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６１： ２６６−２６８ （１９９３）は、２つの既知の種類のＴＮＦ受容体のうちの１つだけとのＴＮＦ−αの選択的結合を生じるある種の突然変異を記載する。リガンド−受容体結合のために重要である部位は、構造分析、例えば結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識によっても確定され得る（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４ （１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２ （１９９２））。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離形態で提供される。「単離ポリペプチド」とは、そのネイティブ環境から単離されたポリペプチドを意図する。組換え宿主細胞内で産生されおよび／または含有されるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。「単離ポリペプチド」は、組換え宿主細胞から、部分的にまたは実質的に、精製されたポリペプチドであるとも意図される。例えば組換え的産生バージョンのＣ５−エピメラーゼポリペプチドは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７： ３１−４０ （１９８８）に記載された一段階法により実質的に精製され得る。好ましくは本発明のポリペプチドは、配列分析に十分な程度に、あるいはそれが調製物中のタンパク質様物質の９９％を示すよう精製される。
【００７８】
本発明は、マウスＣ５−エピメラーゼ遺伝子およびタンパク質を、そしてＣ５−エピメラーゼポリペプチドが、Ｎ末端１５４アミノ酸ドメイン、特にそれに連結されるアミノ酸配列の分泌および安定化に関与するアミノ酸１〜３３または１〜３４を含有する３３または３４アミノ酸ドメインを示す６１８残基タンパク質であることを発見した。したがってこのドメインまたはその機能的部分は、Ｃ５−エピメラーゼのようなタンパク質、または任意のその他のタンパク質、特にゴルジ装置に関連するタンパク質、あるいは相でない場合はヘパリンまたはヘパラン硫酸塩合成に関連するタンパク質の発現および分泌のために有用である。
【００７９】
本発明は、マウスＣ５−エピメラーゼタンパク質のＮ末端、特にアミノ酸１〜１５４，３３〜１５４または３４〜１５４が、その他の酵素、特にその他のＣ５−エピメラーゼの活性を強化するのに有用である、ということも発見した。したがってこのドメインまたはその機能的部分は、図３に示されたものと異種であるＣ５−エピメラーゼ配列、特にウシＣ５−エピメラーゼを含む融合タンパク質の発現および分泌のために有用である。
【００８０】
本発明のポリペプチドとしては、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドおよび前記のような断片であって、そのアミノ酸配列が以下の：（ａ）図３のアミノ酸１〜１１８；（ｂ）図３のアミノ酸１〜１１９；（ｃ）図３のアミノ酸１〜１２０；（ｄ）図３のアミノ酸１〜１２１；（ｅ）図３のアミノ酸１１９〜６１８；（ｆ）図３のアミノ酸１２０〜６１８；（ｇ）図３のアミノ酸１２１〜６１８；（ｈ）図３のアミノ酸１２２〜６１８；（ｉ）図３のアミノ酸３４〜１４７；（ｊ）図３のアミノ酸３５〜１５４；（ｋ）図３のアミノ酸３４〜１５４；（ｌ）図３のアミノ酸１〜１５４；（ｍ）図３に示された全アミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、同一であるポリペプチドが挙げられる。
【００８１】
本発明は、前記のポリペプチドと少なくとも８０％同一である、さらに好ましくは少なくとも９０％または９５％、さらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドを包含し、そして少なくとも３０アミノ酸、さらに好ましくは５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの一部分も包含する。
Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドの参照アミノ酸配列と例えば少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であるが、但し、ポリペプチド配列が、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たり５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを意図する。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸の５％までが欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換され、あるいは参照配列中の総アミノ酸の５％までの多数のアミノ酸が参照配列中に挿入され得る。
【００８２】
参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で、あるいはそれらの末端位置間のどこかで、参照配列中の残基間に別々に散在されて、あるいは参照配列内の１つまたはそれ以上の連続基中に起こり得る。
実際には、任意の特定のポリペプチドが、図３に示されたアミノ酸配列と例えば少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、慣用的には既知のコンピュータープログラム、例えばベストフィットＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）を用いて確定され得る。ベストフィットまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて特定の配列、例えば本発明の参照配列と９５％同一である配列が存在するか否かを確定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長に亘って算定され、そして参照配列中のアミノ酸の総数の５％までの相同におけるギャップが許されるよう、設定される。
【００８３】
Ｃ５−エピメラーゼ活性を保有する本発明のポリペプチドを用いて、例えばそれに関する検定を開発する場合に、またはより複雑な系とともに用いるための検定を標準化する場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそれを提供し得る。本発明のシグナル配列は、真核生物組換え宿主から同種Ｃ５−エピメラーゼ酵素を分泌するために、またはそれと操作可能的に連結される異種配列を分泌するために用いられ得る。本発明の活性強化配列は、他のＣ５−エピメラーゼの組換え調製物の固有のエピメラーゼ活性を強化するために用いられ、そういうものとして、それに関する融合タンパク質をコードする遺伝子の形態で最良に提供され得る。
【００８４】
抗体
本発明に用いるためのＣ５−エピメラーゼタンパク質特異的抗体は、無傷Ｃ５−エピメラーゼタンパク質またはその抗原性ポリペプチド断片に対して産生され得るが、これは、担体タンパク質、例えばアルブミンと一緒に動物系（例えばウサギまたはマウス）に提示され得るか、あるいはそれが十分長い（少なくとも約２５アミノ酸）場合には、担体を伴わずに、またはリポソーム中に提示されて、あるいはＰＥＧと複合されて、循環半減期を強化し得る。
【００８５】
本明細書中で用いる場合、「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）という用語は、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質と特異的に結合し得る無傷分子ならびに抗体断片（例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、無傷抗体のＦｃ断片を欠き、循環からより迅速に出て行き、そして無傷抗体の非素機器特異的結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２４： ３１６−３２５ （１９８３））。したがってこれらの断片が好ましい。
【００８６】
本発明の抗体は、任意の種々の方法により調製され得る。例えばＣ５−エピメラーゼタンパク質またはその抗原性断片を発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために、動物に投与され得る。好ましい方法では、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質の調製物が調製され、精製されて、それが天然夾雑物を実質的に含有しないようにする。このような調製物は次に、より大きい特異的活性を有するポリクローナル抗血清を産生するために、動物に導入される。
【００８７】
最も好ましい方法では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法を用いて調製され得る（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５ （１９７５）； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ５１１ （１９７６）； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ２９２ （１９７６）； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， （１９８１） ｐｐ． ５６３−６８１）。概してこのような手法は、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質抗原で、さらに好ましくはＣ５−エピメラーゼタンパク質発現細胞で動物（好ましくはマウス）を免疫感作することを包含する。適切な細胞は、抗Ｃ５−エピメラーゼタンパク質抗体を結合するそれらの能力により認識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培地中で培養され得るが、しかしながら、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で不活性化）を補足し、ならびに約１０ ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１０００ Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび約１００μ ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したイーグルの変法イーグル培地中で細胞を培養するのが好ましい。このようなマウスの脾臓細胞が抽出され、適切な黒色腫細胞株と融合される。任意の適切な黒色腫細胞株が、本発明にしたがって用いられ得る。しかしながらアメリカ培養細胞コレクションＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手可能な親黒色腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いるのが好ましい。融合後、その結果生じたハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地中に選択的に維持され、次にＷａｎｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０： ２２５−２３２ （１９８１）により記載されているように希釈を限定することによりクローン化される。このような選択により得られたハイブリドーマ細胞は次に、所望のＣ５−エピメラーゼ抗原を結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するために検定される。
【００８８】
あるいは、Ｃ５−エピメラーゼ抗原と結合し得る付加的抗体は、抗イディオタイプ抗体の使用により二段階手法で産生され得る。このような方法は、抗体がそれ自体抗原であるという、したがって二次抗体と結合する抗体を得ることが可能であるという事実を用いる。この方法によれば、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質特異的抗体は、動物を、好ましくはマウスを免疫感作するために用いられる。このような動物の脾臓細胞は次に、ハイブリドーマ細胞を産生するために用いられ、そしてハイブリドーマ細胞がスクリーニングされて、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質特異的抗体と結合するその能力がＣ５−エピメラーゼタンパク質抗原により遮断され得る抗体を産生するクローンを同定する。このような抗体は、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫監査してさらなるＣ５−エピメラーゼタンパク質特異的抗体の生成を誘導するために用いられ得る。
【００８９】
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびにその他の断片は、本明細書中に開示された方法にしたがって用いられ得る、と理解される。このような断片は、典型的には、酵素、例えばパパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２を産生するため）を用いて、タンパク質分解的切断により産生される。一本鎖抗体、例えば軽または重鎖抗体も、本発明に包含される。あるいはＣ５−エピメラーゼタンパク質結合断片は、組換えＤＮＡ技術の適用により、または合成化学により産生され得る。このような抗体としては、例えば異なる結合特異性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を、あるいは抗体の結合特異性を修飾するために組換え技術の適用によりまたは合成化学により修飾されたＣＤＲを含む組換え抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
ヒトにおける抗Ｃ５−エピメラーゼのｉｎ ｖｉｖｏ使用のためには、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を用いるのが好ましい。このような抗体は、前記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞由来の遺伝子構築物を用いて産生され得る。キメラ抗体の産生方法は、当業界で既知である（再検討のためには、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９： １２０２ （１９８５）； Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４： ２１４ （１９８６）； 米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ等）；欧州特許第１７１４９６号（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等）；欧州特許第１７３４９４号（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等）；ＷＯ ８６０１５３３（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等）；ＷＯ８７０２６７１（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等）； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６４３ （１９８４）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２６８ （１９８５）参照）。
【００９１】
二重特異性抗体は、異なるエピトープに対するまたは異なる種由来の抗原結合ドメインを有する抗体であり、本発明に包含される。Ｆａｂ領域とは異なる種由来のＦｃ領域を有する抗体も意図され、免疫特異的クロマトグラフィー手法に用いられ得る。結合標識、例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ペルオキシダーゼ、金、磁気標識、アルカリ性ホスファターゼ、放射性同位元素または化学発光標識を伴う抗体も本発明に包含される。
【００９２】
本発明を一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより本発明はより容易に理解される。以下の実施例は例証であって、本発明を限定するものではない。
実施例
実施例１
マウスゲノムクローンの単離およびシーケンシング
Ｃ５−エピメラーゼをコードするウシ配列からのＤＮＡプローブを用いて、マウスゲノムライブラリー（ＦＩＸ ＩＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングした。プローブを［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で標識した。約２ｘ１０６ファージを２０ｘ２０ ｃｍプレート中でプレート化し、各プレートから複製ナイロンフィルターを調製した。６０℃で１００ μｇのサケ精子ＤＮＡ／ｍｌを含有する５ｘデンハートＤｅｎｈａｒｄｔ中でのハイブリダイゼーションにより、高緊縮スクリーニングを実施した。最終洗浄は、０．１ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは１５０ ｍＭＮａＣｌ、１５ ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１％ＳＤＳ含有）中であった。両レプリカ上に陽性シグナルを生じたプラークを、第２および第３回スクリーニングに関して選択し、最後に５つの陽性クローンを単離した。クローンのうちの２つは約１６ ｋｂという同様の長さを有するが、一方、他の３つは相対的に短く、約１０〜１２ ｋｂであった、ということが判明した。最長クローン（クローン６４）をＳａｃｌで消化し、制限断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ中でクローン化した。二番目に長いクローン（クローン５Ａ）をＥｃｏＲＩで消化し、その結果生じた断片をさらなる特性化のためにｐＵＣ１１９中でクローン化した。
【００９３】
挿入物含有プラスミドをＱＩＡＧＥＮプラスミドキットを用いて精製し、そしてシーケンシングした。ヌクレオチドシーケンシング反応をチェインターミネーター法を用いて実施し、そしてＡＢＩ ３１０シーケンサーを用いて実行した。両鎖上でのプライマーウォーキングによりエキソンおよびイントロンを確定し、そしてアガロースゲル電気泳動と組合せたシーケンシングによりイントロンのサイズを概算した。Ｃ５−エピメラーゼをコードするエキソンは３つだけ存在すると考えられ、５０％より多いタンパク質をコードする最長エキソンを伴った。エキソン−イントロン接合部（スプライス部位）は、ｇｔ−ａｇコンセンサス規則に精確に従う。イントロンの存在ならびにエキソンとｃＤＮＡ配列との間の精確な適合に基づいて、同定されたゲノムクローンはＣ５−エピメラーゼの機能的遺伝子を表す、とわれわれは考える。
【００９４】
マウスＣ５−エピメラーゼｃＤＮＡのクローニング
一対のプライマーを設計し、ゲノムクローンのエキソンをシーケンシングすることにより得たヌクレオチド配列の基礎とした。センスプライマーは、マウスＯＲＦの塩基１〜２６に対応し、開始コドンＡＴＧから開始する。アンチセンスプライマーは、塩基１８２９〜１８５４に対応し、停止コドンを含まない。以下の条件：９４℃で１分を１回、９４℃で３０秒、６０℃で４５秒および７２℃で１分を各々３０回、そして７２℃で１０分間で最終延長：で、鋳型としてマウス肝臓ＱＵＩＣＫ−クローン（商標）ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いることにより、ＰＣＲを実施した。約２ ｋｂの強い帯域を得て、これをＴＯＰＯ（商標）−ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でクローン化して、増幅し、その後シーケンシングした。二本鎖シーケンシングにより、マウスＣ５−エピメラーゼクローンが１８７５ ｂｐ長であり、推定ペプチドのＮ末端に強疎水性ドメインを有する、ということが判明した。
【００９５】
ノーザンブロット分析
マウス多組織ｍＲＮＡブロットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ウシｃＤＮＡクローンからのＤＮＡプローブを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからのクレノウ酵素により［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。６０℃で１時間、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でハイブリダイゼーションを実行し、高緊縮で洗浄した。膜を−７０℃で一夜、コダックフィルムに露出した。Ｃ５−エピメラーゼ酵素は、検査したすべての組織で発現され、転写体は約５ ｋｂである。肝臓は転写体に関して最高発現を示すが、一方、脾臓は同一膜中でのβ−アクチンと比較して相対的に低いレベルを発現する、と思われる。
【００９６】
サザンブロット分析
Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）にしたがって、サザンブロット分析を実施した。Ｅａｓｙ Ｐｒｅｐキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、マウスゲノムＤＮＡを調製した。２０ μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで消化して、電気泳動により０．８％アガロースゲル上で分離した。電気泳動後、ゲルを０．１ ＮＮａＯＨで３０分間処理し、トリス−ＨＣｌ緩衝液中で中和した。ＤＮＡ断片をナイロン膜上に移した。ウシＣ５−エピメラーゼｃＤＮＡの８３７ ｂｐ断片をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからのクレノウ酵素により［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、プローブとして用いた。ハイブリダイゼーション条件を、ノーザン分析に関して記載したように実行した。露出時間は３日間であった。
【００９７】
多数の遺伝子が如何にＣ５−エピメラーゼをコードし得るかを確定するために、マウス肝臓から精製した２０ μｇのマウスゲノムＤＮＡを、それぞれＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩの制限酵素で消化し、電気泳動により０．８％アガロースゲル上で分離した。ゲル中に分離されたＤＮＡをナイロン膜に移し、その後、ウシコード配列（１４０７ ｂｐ）からのＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。Ｃ５−エピメラーゼゲノムＤＮＡの制限マップは、マウスにおけるＣ５−エピメラーゼ酵素をコードする遺伝子が１つだけ存在する、ということを示唆する。
【００９８】
酵素活性分析
Ｍａｌｍｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５： ３８７８−３８８３ （１９８０）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に開示されたようなプロトコールにしたがって、Ｃ５−エピメラーゼの活性を査定した。要するに、筋肉内に肥満細胞腫細胞を移植されたマウスを、頚部脱臼により安楽死させて、その後、解剖した。異種移植片を含めたそれぞれの組織を採取し、直ちに、１００ ｍＭＫＣｌ、１５ ｍＭＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤を含有する５０ ｍＭＨＥＰＥＳの緩衝液中で均質化した。ホモジネートを４℃で３０分間振盪し、遠心分離した。上清を収集した。総タンパク質濃度をＱｕａｎｔｉＧｏｌｄ検定により確定し、Ｌｉ等（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）により記載された手法にしたがって、基質多糖からの３Ｈ（３Ｈ２Ｏとして回収される）の放出に基づいてＣ５−エピメラーゼの特異的活性を分析した。特異的活性試験に用いたＣ５−基質を、酵素を含有しない５０ μｌのＣ５−基質作業溶液のみを測定することにより、少なくとも１ヶ月に１回、分析する。
【００９９】
試料の初期活性が＞２０００ ｃｐｍ／５０ μｌである場合、これは、試料が飽和され、希釈される必要があるという指標である。希釈因子は、用いられる試料、試料の飽和および塩濃度によっている。試料は、Ｃ５−エピメラーゼ活性がより高い塩濃度で部分的にまたは完全に阻害されるため、５０ ｍＭ以下の塩（ＮａＣｌまたはＫＣｌ）を含有しなければならない。
【０１００】
Ｃ５−エピメラーゼ活性検定には、正および負の対照が用いられる。正の対照は、安定性が保存されていたことを確実にするために、２ヶ月毎に標準化されねばならない。試料と同一細胞中で産生されるベクターのみが、負の対照として用いられ得る。例えばバキュロウイルス／昆虫細胞発現系により産生されるＣ５−試料に関しては、同一系を用いて産生されるアセチルコリンエステラーゼが負の対照として用いられた。
【０１０１】
Ｃ５基質溶液の予熱中に、必要な場合には試料を希釈した。５０ μｌの試料（酵素）を予熱基質に付加し、＋３７℃で正確に１時間、インキュベートした。インキュベーション後、酵素反応の停止溶液１００ μｌを基質−酵素混合物に付加し、この反応混合物をＷａｌｌａｃの２０ ｍｌシンチレーションバイアルに移した。エピメラーゼ検定シンチレーションカクテル１３ ｍｌをバイアルに付加し、１０秒間撹拌した。一夜インキュベーション語、Ｗａｌｌａｃ１４１５液体シンチレーション計数器を用いて各々２分間、三重反復試験で放射能を測定した。シンチレーション計数器は、結果をｃｐｍ／反応容積（５０ μｌ）として示す。試料が希釈されていた場合、希釈緩衝液の活性を試料の活性から差し引く必要がある。いかなる場合でも、結果を分析する前に、ブランクの活性を試料の活性から差し引いた。
【０１０２】
総活性（ｃｐｍ／μｌ）を総タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で割ることにより、特異的活性を測定した。総タンパク質濃度は、Ｓｔｏｓｃｈｅｋ， Ｃ．Ｍ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６０： ３０１−３０５ （１９８７）（この記載内容を、本明細書中に援用する）にしたがって、ＱｕａｎｔｉＧｏｌｄ検定により測定した。特異的活性の単位はｃｐｍ／ｍｇ／ｈで、この場合、ｈ（時間）は酵素反応の時間を記載する。
【０１０３】
実施例２
マウス遺伝子のコード配列分析からのＣ５−エピメラーゼの真のＮ末端の同定ならびにクローン化ｃＤＮＡの発現
実施例１で同定された推定マウスＣ５−エピメラーゼ遺伝子の国および予備配列分析に基づいて、そして前に発表されたウシｃＤＮＡ配列に対するアラインメントを基礎にして、付加的ネズミ５’−フランキングＤＮＡ配列を単離し、この５’−フランキングＤＮＡ配列を含有するｃＤＮＡをクローン化した。
【０１０４】
この５’−フランキングＤＮＡ配列が、マウス遺伝子によりコードされるＣ５−エピメラーゼの真のＮ末端を表す付加的Ｎ−末端ペプチド配列をコードし得るか否かを確定するために、マウス配列（図１に示したコンパイル済ヌクレオチド配列中の太字文字列）を、ウシ配列を用いて、最大保存（＞９６％アミノ酸同一性）の点から出発して、コンピューターファイル中にすでに存在するウシｃＤＮＡ配列に付加した。次にＧｅｎｅ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒプログラム（Ｔｅｘｔｃｏ， ＵＳＡ）を用いて、コンパイル済み配列中で、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（考え得るポリペプチドコード配列である）に関して検索した。配列アラインメントの結果を図１に示す。ＯＲＦ分析は、図２に示した結果を生じた。
【０１０５】
図１において、新規のマウス配列とウシ配列との間の融合部位を、二重コロン“ ”で示す。二重コロンの後ろで開始する配列は、ウシｃＤＮＡ配列である。配列（太字）５’〜融合部位は、前記のように単離された付加的ネズミ５’−フランキングＤＮＡ配列である。非下線配列は、見出されたオープンリーディングフレームであり、ポリペプチドコード配列を示す。
【０１０６】
ネイティブＣ５−エピメラーゼ酵素が細胞（肝臓から）の膜性ゴルジ「区画」（ミクロソーム分画）に局在する、ということは既知である。したがってネイティブマウス配列は、この区画への転位のための適切なＮ末端を含有する必要がある。これを分析するために、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０： １−６ （１９９７）のアルゴリズム（プログラム）を用いた。当該アルゴリズムは、前記のポリペプチド配列の各々からの最初の４０〜６０アミノ酸の「シグナル電位」を分析した。同一プログラムを用いて、マウスシンデカン−１ポリペプチド配列の最初の４０残基を試験したが、プログラムの効力に関する対照の一種として、これが分泌シグナルを含有することが既知である場合、プログラムはこれを陽性に同定した（データは示されていない）。分析は、最初の３３残基に関して強シグナル電位を実証した。
【０１０７】
前記の３３アミノ酸シグナル配列のほかに、１５４の付加的Ｎ末端残基は、ジスルフィド結合を形成し、タンパク質フォールディングを安定化し得る付加的システイン残基、ならびに翻訳後タンパク質分解的プロセシングに関連し得る予測アミド化部位（残基１１８〜１２１）を包含する。Ｃ５−エピメラーゼに関する全配列のさらなる分析は、埋没され得るかまたは膜（単数または複数）を横断するポリペプチドの疎水性鎖を予測する。
【０１０８】
データベース中で見出されたその他の配列に対するアラインメント分析は、相同のホットスポットを明示する。これらの結果は、図４および５に要約されている。
【０１０９】
図５は、マウスＣ５−エピメラーゼポリペプチド配列の略図である。図５に示したように、配列の最大進化的保存（相同の「ホットスポット」）は、タンパク質の折りたたまれた構造中に埋没されるかまたは膜を横断して、おそらくは酵素が作用することが既知であるゴルジの管腔に入ると予測されるアミノ酸残基Ｔｒｐ４９７およびＬｅｕ５２３間の高疎水性鎖中で、より多くのＣ末端部分で起きた。保存のその他の最も有意で且つ延長された鎖（「ホットスポット」）は、残基Ｌｅｕ５４６およびＨｉｓ５８０間に生じ、酵素の活性部位を含有または包含し得る。≧２２％のポリペプチド配列保存（同一性）の機能的意義は、既知の機能についての他のタンパク質の発表済み研究により（Ｂｒａｎｄｅｎ， Ｃ．， ａｎｄ Ｔｏｏｚｅ， Ｊ．， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ＮＹ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ， ｐｐ．１００−１０１ （１９９１））、ならびにｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍｂｂ．ｖａｌｅ．ｅｄｕ／ｅ−ｐｒｉｎｔ／ａｎｎ−ｘｆｅｒ−ｊｍｂ／ｐｒｅｐｒｉｎｔ．ｈｔｍｌから利用可能な“Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｓｃｏｒｅｓ，”におけるＷｉｌｓｏｎ、ＫｒｅｙｃｈｍａｎおよびＧｅｒｓｔｅｉｎならびにそこに引用されたその他の著者等により確立されている。この文献中で説明されているように、精確な機能は３０〜４０％より低い配列同一性を保存されるとは思えないが、一方、機能的種類は２０〜２５％という低い配列同一性に関して保存される。２０％より低いと、一般的類似性はもはや保存されない。目下、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬは、これらの判定基準に応答する配列に関するモデルを生じている：ＢＬＡＳＴ検索Ｐ値：＜０．００００１；配列同一性（ＳＩＭ）の包括的程度：＞２５％ならびに最小計画モデル長−２５アミノ酸。
【０１１０】
これに基づいて、マウス配列に対してショウジョウバエ配列（４６．６％）は線虫配列（３９．６％）より密接に関連する、ということが分かる。
別の種類の配列分析では、マウスＣ５−エピメラーゼ配列の予測三次元（３Ｄ）構造はＫｅｌｌｅｙ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９９（２）： ４９９−５２０ （２０００）の３Ｄ構造に対して「スレッド化」された。この比較は、Ｃ５−エピメラーゼ配列が、α／αトロイドであるコンドロイチナーゼ（コンドロイチンＡＣ／アルギン酸リアーゼ）ドメインとの有意の関係を有する、ということを示した。コンドロイチンＡＣリアーゼは、グリコサミノグリカン分解酵素の一ファミリーを代表するものであり、構造／機能関係は結晶学から明らかにされている（Ｆｅｔｈｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８８： ６３５−６４７ （１９９９））。コンドロイチナーゼ配列との最も有意の３Ｄ類似性は、内部疎水性（膜貫通）鎖のＣ末端付近のＡｌａ４０８から、マウスＣ５−エピメラーゼ配列のＣ末端に伸びることが判明したことは顕著であり、そして、この鎖が保存配列保存のほとんどを含有することは、それが活性部位を含有するドメインであることを示すと思われる。
【０１１１】
前記配列分析結果のすべてを基礎にして、バキュロウイルスおよびＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＳＡ）発現系からの異種分泌−発現のための一次活性タグ化組換え体（ウシ）Ｃ５−エピメラーゼ構築物のほかに、新規の組換えＣ５−エピメラーゼ構築物が作製された。今までに特性化されたクローン化昆虫細胞株からの生成物を、図６Ａに要約する。４つの構築物が示されている。最初の構築物は、タグ化組換え体ウシＣ５−エピメラーゼである。第二の構築物は、タグ化全長マウスＣ５−エピメラーゼである。第三の構築物は、マウスおよびウシＣ５−エピメラーゼ配列間のタグ化キメラ構築物である。第四の構築物は、タグ化切頭化マウス配列である。
【０１１２】
組換え構築物の各々において、Ｃ５−エピメラーゼをタグ化した。タグ化した場合、Ｃ５−エピメラーゼ配列は、ＥＧＴシグナル切断に連結されたＥＧＴシグナルペプチド、エンテロキナーゼ切断部位、６個のヒスチジンおよび最後にｒＴＥＶプロテアーゼ部位を含有する図６Ｂに示されたような配列により先行された。ＥＧＴシグナルは、バキュロウイルス（昆虫細胞に感染する）のタンパク質からである。ＦＬＡＧ配列は、メーカー示唆プロトコール（Ｓｉｇｍａ）にしたがって組換えタンパク質を検出し、精製するために用いられるエピトープタグである（Ｈｏｐｐ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０ （１９８８））。エンテロキナーゼは、その認識部位に先行する配列を切断するために用いられる酵素である。６個の連続ヒスチジンは、もうひとつのタグである。ｒＴＥＶ（組換え体タバコエッジウイルス）プロテアーゼ部位も、先行配列を除去するために用いた。ＥＧＴシグナルおよびＦＬＡＧ（商標）−タグ（ＩＢＩ）は、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｏｋｅｒ−Ｂｌｏｍ博士（ＶＴＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １５００， ＦＩＮ−０２０４４， ＶＴＴ， ＦＩＮＬＡＮＤ）により提供された修飾ｐＦａｓｔＢａｃＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ベクター中で作製された構築物から得られた。本出願中に記載されたすべての組換えタンパク質の精製は、ＦＬＡＧ−タグベースであった。
【０１１３】
これらのタグ化組換え体Ｃ５−エピメラーゼの活性検定およびタンパク質分析からの代表的データを、図７ならびに表Ｉおよび表ＩＩに示す。図７は、メーカー示唆プロトコールにしたがって抗ＦＬＡＧ Ｍ１全体で精製されたマウスＣ５−エピメラーゼ（ｍＣ５）の活性検定結果を示す。
【０１１４】
異種タンパク質の活性を測定するためのＣ５−エピメラーゼ活性検定を、前記の実施例１と同様に実施した。要するに、ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ発現系を用いて昆虫細胞中に別々に接種された組換え体Ｃ５−エピメラーゼ構築物の各々で形質転換させた培養から、総タンパク質を抽出した。細胞が集密に達した後、それらを収穫し、溶解して、総タンパク質を単離し、定量した。Ｃ５−エピメラーゼ活性は、シンチレーション計数器でエピメラーゼ基質からの３Ｈ放出として測定した。エピメラーゼ活性は、総タンパク質に対して測定した。図７は、試料（１：２０００希釈）の容積増大に伴う活性を示す。総活性は６３６０ ｃｐｍ／μｌであった。Ｓｔｏｓｃｈｅｋ， Ｃ．Ｍ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６０： ３０１−３０５ （１９８７）にしたがってタンパク質分析（ＱｕａｎｔｉＧｏｌｄ， Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ使用）を分析し多。タンパク質の濃度は３．２ μｇ／ｍｌであった。したがって特異的活性は２．０ｘ１０９ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈであった。
【０１１５】
図８は、抗−ＦＬＡＧで染色したウエスタンブロットを示す。レーン１は、分子量標準（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ’ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ、予備染色）を含有する。レーン２は、全長マウスＣ５−エピメラーゼを含有する。タグ化全長マウスＣ５−エピメラーゼ（本明細書中に見出されるＮ末端付加配列を含有する）は、６１８アミノ酸長、７１１８９．１の分子量（ダルトン）、８．２５の等電点（ｐＩ）および＋４．０１のｐＨ７での正味電荷を有する。
【０１１６】
図９は、抗ＦＬＡＧ抗体（０２０３００）で染色された前記の４つのタグ化組換えＣ５−エピメラーゼに関する異なるクローンの安定昆虫細胞株から採取した培地のウエスタンブロットである。レーン１は、図８の場合と同様の分子量標準を含有し、ゲルの側面に分子量を書きとめた。レーン２は、切頭化マウスＣ５−エピメラーゼを含有する。レーン３は、オリジナルウシＣ５−エピメラーゼを含有する。レーン４は、図２および３に示されているように、Ｎ末端マウス配列が枠内でウシ配列と融合されるマウス：ウシキメラＣ５−エピメラーゼを含有する。レーン５は、全長マウスＣ５−エピメラーゼを含有する。キメラマウス：ウシ構築物は全長マウス構築物のサイズとほぼ同一サイズである、ということが分かる。
【０１１７】
活性検定およびウエスタンブロットの濃度計分析に基づいて異なる組換え構築物の相対活性を算定した。結果を以下の表Ｉに示す。「ＴｒｕｎｃＣ５」は、短縮化マウスＣ５−エピメラーゼアミノ酸配列であり、この場合、「ＴｒｕｎｃＣ５」配列が組換えウシ配列と同一Ｎ末端を有するよう、最初の１５４アミノ酸は除去されている。「ＥｘｔＣ５」は組換えウシＣ５−エピメラーゼポリペプチドであり、一方、「ｃｈＣ５」は、図１に示したような核酸配列によりコードされるマウス：ウシキメラＣ５−エピメラーゼ構築物を指す。「ｍＣ５」は、全長マウスＣ５−エピメラーゼ配列を指す。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
異なる部分精製組換えＣ５−エピメラーゼの特異的活性を、表ＩＩに示す。
【表３】
【０１２０】
作製されたキメラマウス：ウシ構築物は、図６Ｂに示したようないいＧＴ−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ−ＲＴＥＶ素子の直後にマウスポリペプチド配列のＮ末端配列のアミノ酸残基３４〜１５４を含有する。しかしながら、その組換え酵素は、おそらくはマウス細胞のシグナリング電位のために、細胞質ゾル中に主に保持されると考えられた。
【０１２１】
結論
マウス遺伝子配列からのポリペプチド（Ａｓｐ３４〜Ａｓｐ１５４）のＮ末端断片の付加は、配列のこの小片が最大種間保存を含有しない場合でも、数オーダーの大きさで組換えＣ５−エピメラーゼ酵素の活性を強化する。一次組換えウシ構築物の活性に及ぼすタグの考え得る作用が取り扱われ（タグ除去による；データは示されていない）、差異の最小因子を説明し得るが、しかしより長いおよびより短い形態の組換えＣ５−エピメラーゼ間の特異的活性における上記数オーダーの大きさの差の程度を説明しない。この非常に重要な組換え酵素の活性を制御するための基礎およびメカニズムをより良好に限定するために、非タグ化発現構築物および構造−機能試験が目下進行中である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ウシＣ５−エピメラーゼの配列（非太字）およびマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端（太字）を有する融合タンパク質のＤＮＡ配列である。ポリペプチドコード配列を示すオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）には下線を付す。
【図２】
図２は、マウスＣ５−エピメラーゼの完全ＤＮＡ配列である。
【図３】
図３は、マウスＣ５−エピメラーゼの完全アミノ酸配列である。
【図４】
図４は、相同の領域を示すその他の配列に対するマウスＣ５−エピメラーゼのアラインメント分析である。スコアは上部ライン上に示されており、配列の供給源の後ろの欄に列挙されている。配列は以下の供給源から得られる：ライン２：マウス肝臓；ライン３：ウシ肺；ライン４：ヒトＥＳＴ；ライン５：ショウジョウバエ；ライン６：線虫；ライン７：メタノコッカス。
【図５】
図５は、マウスＣ５−エピメラーゼのドメイン構造の略図である。Ｎ末端の中黒長方形枠：シグナル配列（高疎水性膜貫通（ＴＭ）配列）；陰影長方形枠：疎水性膜貫通（ＴＭ）または埋没配列；ペプチド内の中黒長方形枠：線虫７１．９ ＫＤ仮説タンパク質と５０％より多くの類似性を有する保存ペプチド配列。
【図６】
図６Ａ〜６Ｂ。図６Ａ：タグ化組換え（ウシ）Ｃ５−エピメラーゼ構築の生成物の略図。ｉ：一次活性タグ化組換え（ウシ）Ｃ５−エピメラーゼ構築物。特異的活性は５ｘ１０５ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈであった。ｉｉ：最活性組換え（全マウス）Ｃ５構築。特異的活性は２ｘ１０９ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈであった。ｉｉｉ：マウスおよびウシ配列の両方を有するキメラ構築物。活性は全長マウス配列の活性の８７％であった。ｉｖ：切頭化マウス構築物。活性は「ｉ」におけるウシ構築物と同一である。図６Ｂ：図６Ａにおける組換え構築物の各々に先行したタグの配列およびドメイン情報。
【図７】
図７は、マウスＣ５−エピメラーゼ（ｍＣ５）の活性検定結果である。
【図８】
図８は、抗−ＦＬＡＧで染色したウエスタンブロットである。レーン１：分子量標準（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ’ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ、予備染色）。レーン２：マウスＣ５−エピメラーゼ（ｍＣ５）試料。
【図９】
図９は、抗ＦＬＡＧ抗体で染色された異なるタグ化組換えＣ５−エピメラーゼを含有するクローンの安定昆虫細胞株からの培地中のタンパク質のウエスタンブロットである。
産業上の利用分野
本発明は、組換えタンパク質、特にグルクロニルＣ５−エピメラーゼおよびグリコサミノグリカンの修飾のためのその使用の分野である。
【０００２】
発明の背景
グルクロニルＣ５−エピメラーゼ（本明細書中では「Ｃ５−エピメラーゼ」）は、ヘパリン／ヘパラン（ＨＳ）合成の第二ポリマー修飾段階におけるＬ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）へのＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）の転換を触媒する。ヘパリン／ＨＳ合成に関与するエピメラーゼは、生合成的ポリマー修飾の第一（先行）段階においてその精製がＮ−デアセチラーゼ−Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（ＮＤＳＴ）により触媒される標的ＨｅｘＡの非還元側でＮ−スルフェートに対する絶対要件を有する。さらにエピメラーゼは、その作用部位近くでＯ−スルフェート基により阻害され、それでＯ−硫酸化段階は後にヘパリン生合成経路において、エピマー化または逆エピマー化を阻害する。当該反応は、カルボアニオンを介した標的ヘキスロン酸のＣ５での陽子の可逆的引き抜きおよび再付加を包含し、２つの多プロトン性塩基性アミノ酸（特にＬｙｓ）を包含すると考えられる。
【０００３】
Ｃ５−エピメラーゼは、ヘパリン／ＨＳ生合成に関与する他の酵素と同様に、ゴルジ体中で膜結合または会合されると思われる。興味深いことに、可溶化エピメラーゼは両（可逆的）反応を触媒するが、しかし逆エピマー化はミクロソーム分画からは検出可能でない。Ｃ５−エピメラーゼ活性タンパク質は肝臓から最初に精製され、特性化された（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ２６９５３−２６９５８ （１９９４））。
【０００４】
Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｐ等は、ウシ肝臓からのＤ−グルクロニルＣ５−エピメラーゼの精製を報告し（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ２６９５３−２６９５８ （１９９４））、そしていくつかのＤＮＡ配列も報告されている。ゲノムおよびｃＤＮＡ配列からのウシＣ５−エピメラーゼの予測サイズは、７０．１ ＫＤ（６１８個のアミノ酸）（以下で考察）であり、前記のように抽出されるほとんどの精製ネイティブ調製物は５２および２０ｋＤａの優勢種を含有したが、このことは、タンパク質分解的切断（プロセシング）が起き得たことを示す。サイズ排除クロマトグラフィーからの大型ＭＷ（２００ ｋＤａ）分画中の活性の検出は、集合またはオリゴマー化が起こり得ることを示した。酵素は、活性の広範なｐＨ範囲（６．５〜７．５）を有し、最適ｐＨは７．４である。酵素は金属イオンまたはその他の補因子要件を有さない。動力学試験は、予期せぬことに、おそらくは高分子基質および立体障害、および／またはエピメラーゼ分子のオリゴマー化に関連する酵素濃度の増大に伴ってＫｍが増大する、ということを明示した。
【０００５】
近年、Ｌｉｎｄａｈｌ， Ｕ． ａｎｄ Ｌｉ， Ｊ−Ｐ．（ＷＯ９８／４８００６）は、ウシ肝臓から５２ ｋＤａのＣ５−エピメラーゼを精製し、部分アミノ酸配列を得た。プライマーは内部配列に対して作製され、ウシ肝臓ｃＤＮＡ調製物からの配列を増幅するために用いられた。ウシ肝臓配列は、ウシ肺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられた。４４４個のアミノ酸のオープンリーディングフレームを有する配列が見出されたが、これは４９．９ ｋＤａのポリペプチドに対応する。ウシ肝臓から以前に単離された酵素は、ネイティブタンパク質の切頭化形態であった、と記述された。ウシの肝臓、肺およびマウス肥満細胞腫からの総ＲＮＡは、ウシ肺エピメラーゼｃＤＮＡクローンとのハイブリダイゼーションにより分析された。ウシ肝臓およびウシ肺はともに同一結果を生じ、約９ ｋｂの優勢転写体および弱い５ ｋｂ帯域を有した。マウス肥満細胞腫ＲＮＡのみは、約５ ｋｂで転写体を示した。
【０００６】
ウシ肺からのＣ５−エピメラーゼをコードするｃＤＮＡのクローニングの報告は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ２８１５８−２８１６３ （１９９７）にも記載されている。Ｌｉ等は、最初に活性をクローン化（組換え）配列に割り当てたバキュロウイルス／昆虫細胞系中でウシ肺エピメラーゼをクローン化し、発現した。活性組換えタンパク質は、限定的割り当てのために精製されなかった。
【０００７】
ショウジョウバエ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＦ５７３７３）、線虫Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ４６５５５）およびメタノコッカス（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ６７５５５）からのＣ５−エピメラーゼｃＤＮＡ配列が報告されている。
【０００８】
Ｌｉｎｄａｈｌ等により報告された組換えウシエピメラーゼの酵素活性は、相対的に低かった。しかしながら、より良好な産生を生じ得る系における単独クローン化哺乳類エピメラーゼであるウシ肺Ｃ５−エピメラーゼを発現する試みは、失敗した。哺乳類細胞、ビール酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉにおける発現が試みられた。今日まで、可溶性活性Ｃ５−エピメラーゼの産生の成功例は報告されていない。したがって、初期バキュロウイルス細胞系結果を他の組換え系に広げることはできなかったし、あるいはこの酵素の発現のための哺乳類、酵母および細菌系のような慣用的発現方法を用いることができなかった。
【０００９】
したがって、高活性Ｃ５−エピメラーゼに対する、そしてその大量の産生のための方法に対する必要性が当業界には依然として存在する。
【００１０】
発明の要約
非限定的性質の問題は哺乳類起源の組換えエピメラーゼの発現に伴って存在することを認識し、そして有用量のＣ５−エピメラーゼを発現し、産生するための有用な方法の必要性に気づいて、本発明人等は、組換えＣ５−エピメラーゼ産生方法を研究した。その研究は、新規のマウス遺伝子、ならびにそこにコードされるマウスＣ５−エピメラーゼタンパク質の発見で絶頂に達した。本発明のマウスＣ５−エピメラーゼは、とりわけ、それが、当業界で既知のＣ５−エピメラーゼタンパク質配列と比較した場合、そのＮ末端に付加的配列を含有する、という点で独特である。マウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端断片またはその短縮化バージョンの、他のＣ５−エピメラーゼのＮ末端との融合が、大きさにしたがって他の組換えＣ５−エピメラーゼ活性を大いに増強する、ということが予期せず発見された。したがってマウスＮ末端延長を用いて、それと操作可能的に連結される配列の発現、特に組換え系におけるネイティブ（ネズミ肝臓）および異種（非ネズミおよびネズミ非肝臓）形態のＣ５−エピメラーゼの発現を促し得る。
【００１１】
したがって第一の実施態様では、本発明は、マウス（ネズミ）肝臓Ｃ５−エピメラーゼをコードする精製および／または単離ポリヌクレオチド、ならびにその維持および発現のための組換えベクターおよび宿主に向けられる。
【００１２】
さらなる実施態様では、本発明は、このようなポリヌクレオチドによりコードされる精製および／または単離マウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼタンパク質、あるいはそれを含有する調製物に向けられる。
さらなる実施態様では、本発明は、このようなポリヌクレオチド、ならびにそれを発現するための本発明の組換えベクターおよび宿主を用いたマウスＣ５−エピメラーゼの産生方法に向けられる。
【００１３】
さらなる実施態様では、本発明は、融合タンパク質、例えば所望のタンパク質のアミノ酸配列に枠内で操作可能的に連結されるマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端配列、特に異種Ｃ５−エピメラーゼ配列を含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、特に精製および／または単離ポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの維持および発現のためのベクターおよび宿主に向けられる。
【００１４】
さらなる実施態様では、本発明は、このようなポリヌクレオチドによりコードされる精製および／または単離Ｃ５−エピメラーゼ融合タンパク質に向けられる。
【００１５】
さらなる実施態様では、本発明は、所望のタンパク質の産生方法であって、このような当該所望タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、マウスＣ５−エピメラーゼをコードするポリヌクレオチドまたはそのＮ末端配列を操作可能的に連結し、そして本発明の組換え宿主内でそれを発現することによる方法に向けられる。
【００１６】
さらなる実施態様では、本発明は、ポリヌクレオチド配列、ならびにマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端断片ポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチドを提供するベクターに向けられ、このようなポリヌクレオチドおよびベクターは、それへの所望の配列、特に当該タンパク質をコードする配列、特に別のエピメラーゼ配列の挿入（連結）のための断片の３’末端に所望の制限部位を有する。
【００１７】
さらなる実施態様では、本発明は、ネイティブ配列およびそれに連結される異種配列の発現のためのマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端配列の使用方法に向けられる。
好ましい実施態様の詳細な説明
Ｃ５−エピメラーゼをコードするマウス肝臓遺伝子をクローン化した。ヌクレオチド配列は、図２に示されている。マウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼタンパク質のアミノ酸配列は、６１８アミノ酸長（図３）であり、７１，１８０．１ダルトン（７１．１８ ｋＤａ）の分子量を有することが判明した。マウスＣ５−エピメラーゼは、８．２５の等電点を有し、正味電荷はｐＨ７で＋４．０１である。
【００１８】
いかなるＮ末端延長も有さないマウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼ配列のアミノ酸配列は、ウシＣ５−エピメラーゼ配列と相同（＞９６％アミノ酸同一性）である。しかしながら、マウスゲノム配列によりコードされる酵素のＮ末端は、クローン化ウシ配列からは「失われている」付加的な１５４個のアミノ酸（ａａ）を含有する、ということを配列分析は明示した。
【００１９】
マウスコード配列は、対応するウシおよびヒト（脳ｃＤＮＡライブラリーからの発現化配列タグ）配列との＞９５％ペプチド同一性、線虫の発現化配列からの仮説的７１．９ ｋＤａタンパク質との＞５０％類似性、ならびにメタノコッカス種の発現化配列からのタンパク質との３８％類似性を示した。
【００２０】
マウスＣ５−エピメラーゼ酵素の予測膜貫通トポロジー（疎水性プロット）は、ＮＤＳＴのものと類似する。これらのおよびその他の観察（例えばヘパリン合成速度）は、ヘパリン生合成のＣ５−エピメラーゼおよびその他の酵素がｉｎ ｖｉｖｏで複合体に関連すると思われる、ということを示した。
【００２１】
組換えマウスＣ５−エピメラーゼは、バキュロウイルス昆虫細胞系から、昆虫細胞シグナルにより発現され、分泌される場合、４℃の培地中で最も安定している。組換えＣ５−エピメラーゼの精製としては、例えば陽イオン交換またはアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。例えば組換えタンパク質は、組換えタンパク質のいずれかの末端で起こるＦＬＡＧ−タグまたはＨｉｓ−タグをタンパク質が含有するよう工学処理され得る。当業者が理解するように、このような場合、組換えタンパク質は、例えば抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を利用してＦＬＡＧエピトープを含む組換えタンパク質を捕捉する市販の樹脂を用いて精製され得る。
【００２２】
酵素は、Ｃ５標識化基質から有機シンチレーションカクテル中へのトリチウムの二相抽出ならびに計数により、最も迅速に検定されるが、しかし活性の最終的確証は、実施例に記載されるように、転換生成物のＮＭＲ分析による。
【００２３】
ネイティブマウス肝臓酵素は５〜１０ｘ１０９ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈの特異的活性を有するが、一方、組換え形態のマウス酵素の場合は、約２ｘ１０９ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈであった。比較により、組換えウシ酵素は約０．５〜１．０ｘ１０６ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈの特異的活性を有する。したがって組換えマウス酵素は、特に活性なＣ５−エピメラーゼである。
【００２４】
予期せぬことに、マウスＣ５−エピメラーゼの１５４個のアミノ酸（ａａ）Ｎ末端、特にそのある種の断片は、そのＮ末端と枠内で融合されると、他のＣ５−エピメラーゼの酵素的Ｃ５−エピメラーゼ活性を大いに強化し得る能力を有する、ということが判明した。この付加的１５４個のアミノ酸（ａａ）断片は、活性Ｃ５−エピメラーゼの組換え発現および分泌のために望ましい少なくとも３つの特徴を有すると思われる。第一に、それは、最初の３３〜３４残基（図３のアミノ酸１〜３３または１〜３４）からなるシグナル配列として機能すると考えられる配列を含む。第二に、それは、ジスルフィド結合の形成を、そして二次タンパク質構造の安定化を受け入れる付加的システイン残基を提供する。第三に、それは、翻訳後タンパク質分解的プロセシングに有用な部位と一致するアミド化部位を提供する。
【００２５】
シグナル配列を欠く１５４アミノ酸配列の断片は、それらが操作可能的に連結される異種エピメラーゼ、特にＣ５−エピメラーゼの活性を強化する能力を依然として保有する。例えば実施例に示されるように、ウシＣ５−エピメラーゼのＮ末端に、枠内で、直接連結されるアミノ酸３４〜１５４を含有する融合タンパク質は、ウシＣ５−エピメラーゼの活性を１００倍以上強化した。
【００２６】
核酸分子
本発明は、単離核酸分子であって、以下の：
（１）図３に示したアミノ酸配列を有するマウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；そして
（２）図３に示したアミノ酸配列を有するマウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドの有用な断片をコードするポリヌクレオチド
を含む核酸分子を提供する。有用な断片としては、（ａ）アミノ酸１〜３３または１〜３４のシグナル配列を提供する断片；（ｂ）成熟マウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼタンパク質配列、特にアミノ酸３３〜６１８または３４〜６１８を提供する断片；ならびに（ｃ）アミノ酸１〜１５４を有する活性刺激Ｎ末端断片の配列を提供する断片、例えばそれらが操作可能的に連結される他のＣ５−エピメラーゼの活性を強化する能力を保有するアミノ酸３３〜１５４または３４〜１５４のようなその断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
別記しない限り、本明細書中でＤＮＡ分子をシーケンシングすることにより確定されるヌクレオチド配列はすべて、実施例に記載したように確定され、そして本明細書中で確定されたＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列はすべて、前記のように確定されたＤＮＡ配列の翻訳により予測された。したがって、このアプローチにより確定された任意のＤＮＡ配列に関して当業界で既知であるように、本明細書中で確定される任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含有し得る。自動化により確定されるヌクレオチド配列は、典型的には、シーケンシング化ＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、さらに典型的には少なくとも約９５〜９９．９％同一である。実際の配列は、他のアプローチ、例えば当業界で周知である手動ＤＮＡシーケンシング法によりさらに精確に確定され得る。同じく当業界で既知であるように、実際の配列と比較される確定ヌクレオチド配列における単一挿入または欠失は、確定ヌクレオチド配列によりコードされる予測アミノ酸配列が、このような挿入または欠失の点で開始するシーケンシング化ＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸分子とは完全に異なるよう、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こす。
【００２８】
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドの配列を、ならびにＲＮＡ分子またはポリヌクレオチド、リボヌクレオチドの対応する配列（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）を意図するが、この場合、特定のデオキシリボヌクレオチド配列中の各チミジンでオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドウリジン（Ｕ）により置換される。
【００２９】
図および配列表に記述されたヌクレオチド配列のような本明細書中で提供される情報を用いて、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドをコードする本発明の核酸分子またはそのキメラ構築物は、標準クローニングおよびスクリーニング手法、例えば出発物質としてｍＲＮＡを用いたｃＤＮＡのクローニングのための方法を用いて得られる。本発明の例証として、図２および３に記載されたＣ５−エピメラーゼ核酸分子が、ネズミ肝臓組織由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。
【００３０】
図２のＣ５−エピメラーゼＤＮＡの確定ヌクレオチド配列は、約６１８アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有し、図２におけるヌクレオチド配列のヌクレオチド位置１に開始コドンを有する。
【００３１】
当業者が理解するように、前記のシーケンシングエラーの可能性のために、図３に示されたような約６１８個のアミノ酸を含む図２の配列によりコードされる実際の完全Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドは、多少長いかまたは短い。いずれにしても、以下でさらに考察されるように、本発明はさらに、完全ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失された種々の残基を有するポリペプチド、例えば本明細書中に記載された細胞外ドメインのＮ末端またはＣ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸を欠くポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明の核酸分子としては、図３に示されているようなＣ５−エピメラーゼシグナル配列をコードするものが挙げられるが、これは、図３に示されたアミノ酸配列のアミノ酸１〜３３またはアミノ酸１〜３４である。このような分子は、任意の所望のヌクレオチド配列と、特にＣ５−エピメラーゼシグナル配列が分泌可能である宿主から分泌されるのが望ましい当該タンパク質をコードするものと、枠内で操作可能的に連結され得る。
【００３３】
さらに、本発明の核酸分子としては、図３に示されたようなアミノ酸１〜１５４またはその少なくとも３０アミノ酸であるマウス肝臓Ｃ５−エピメラーゼの「異種活性強化」配列をコードするものが挙げられる。「異種」核酸という用語により意味されるものは、異なる種の核酸由来のものであるとして当業者に周知である。好ましくはこのような核酸分子は、図３に示されたようなアミノ酸１〜１５４、３３〜１５４または３４〜１５４に、一端または両端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸をプラスまたはマイナスしたものをコードする。このようなポリペプチドをコードする核酸は、別のエピメラーゼ、特に別のＣ５−エピメラーゼに関するコード配列と枠内で操作可能的に連結されて、融合タンパク質が核酸構築物によりコードされるという結果を伴う。好ましい実施態様では、異種活性強化配列は融合タンパク質のＮ末端で発現され、マウス配列の存在によりその活性が強化される別のタンパク質、特に非マウスＣ５−エピメラーゼまたはマウスＣ５−エピメラーゼのイソ酵素のＮ末端に連結される。
【００３４】
示されたように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの形態であるか、またはＤＮＡ、例えばクローニングにより得られるかまたは合成的に産生されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても既知のコード鎖であり得るし、あるいはそれは、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり得る。
【００３５】
「単離」核酸分子（単数または複数）とは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えばベクター中に含入される組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞または溶液中の精製（部分的または実質的に）ＤＮＡ分子中に維持される組換えＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写体が挙げられる。本発明による単離核酸分子はさらに、合成的に産生されるこのような分子を包含する。
【００３６】
本発明の単離核酸分子としては、本発明のＣ５−エピメラーゼタンパク質または融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；図２に示されるようなＣ５−エピメラーゼタンパク質に関するコード配列またはその所望の断片を含むＤＮＡ分子；ならびに前記のものとは実質的に異なる配列を含むが、しかし遺伝暗号の縮重のために、図３に示されたようなＣ５−エピメラーゼタンパク質アミノ酸配列を依然としてコードするＤＮＡ分子が挙げられる。もちろん、遺伝暗号は当業界で周知である。したがってこのような縮重変異体を当業者が生成することは、日常的仕事である。さらなる実施態様では、前記のようなＣ５−エピメラーゼポリペプチドをコードするが、しかしＮ末端メチオニンを、または図３で示されたようなアミノ酸１〜３３または１〜３４によりコードされるシグナル配列を欠いている、あるいはそれに操作可能的に連結された異なる（異種）シグナル配列のコード配列を有する核酸分子が提供される。
【００３７】
本発明はさらに、前記の核酸分子だけでなく、前記の配列と相補的な配列を有する核酸分子も提供する。このような単離分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのための、そして例えばノーザンブロット分析による種々の種および組織におけるＣ５−エピメラーゼ遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。
【００３８】
本発明はさらに、所望の特性を保持するかあるいは所望の特性または活性を保持するポリペプチドをコードする本明細書中に記載された単離核酸分子の断片に向けられる。前記のような単離核酸分子の断片とは、本明細書中で考察されたような、または融合タンパク質構築物に所望のモチーフまたはドメインを提供するための診断プローブおよびプライマーとして有用である長さが少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約４０ｎｔの断片を意図する。もちろん、５０〜３００ｎｔ長の大型断片、または６００ｎｔ長という長い断片でさえも、図２に示されたまたは図３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列の、全部でないとしてもほとんどに対応する断片である場合、本発明に有用である。少なくとも２０ｎｔ長の断片とは、例えば図２のものと比較した場合、図２に示されたようなヌクレオチド配列のヌクレオチド配列からの２０またはそれ以上の連続塩基を含む断片を意図する。
【００３９】
特に本発明は、図２に示されるかまたは図３に示されたアミノ酸配列をコードするものの部分を示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。アミノ末端メチオニンを欠くＣ５−エピメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも意図される。このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも提供され、このようなポリペプチドは、図３に示されたアミノ酸配列の位置２〜６１８のアミノ酸配列を含むが、しかしアミノ末端メチオニンを欠く。
【００４０】
別の局面では、本発明は、全キノ本発明の核酸分子中のポリヌクレオチドの一部分または好ましくは全部と緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。一部分とは、任意の所望部分、例えばアミノ酸１〜１５４または３３〜１５４または３４〜１５４をコードする図２のポリヌクレオチドであり得る。「緊縮ハイブリダイゼーション条件」とは、以下の：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ ｍＭＮａＣｌ、７５ ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一夜インキュベートし、その後約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄することを意図する。
ポリヌクレオチドの「一部分」とハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらに好ましくは約３０〜７０（例えば５０）ｎｔとハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意図する。これらは、前記のような、そして以下でさらに詳述されるような診断プローブおよびプライマーとして有用である。
【００４１】
例えば「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部分とは、参照ポリヌクレオチド（例えば図２に示されたようなヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列からの２０またはそれ以上の連続ヌクレオチドを意図する。もちろん、ポリＡ配列とまたはＴ（またはＵ）残基の相補鎖とだけハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）鎖またはその相補体（例えば実際的に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含有する任意の核酸分子とハイブリダイズするため、本発明の核酸の一部分とハイブリダイズするために用いられる本発明のポリヌクレオチド中には含まれない。
【００４２】
前記のように、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドをコードする本発明の核酸分子としては、ポリペプチドに関するコード配列、単独（それが分泌シグナルを欠く場合には成熟Ｃ５−エピメラーゼとも呼ばれる）；ポリペプチドに関するコード配列および付加的配列、例えばリーダーまたは分泌配列をコードするもの、例えばプレ−またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列；付加的非コード配列、例えばイントロンおよび非コード５’および３’配列、例えば転写、ｍＲＮＡプロセシング−例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル−リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定において一役を演じる転写化、非翻訳化配列（これらに限定されない）と一緒に、前記の付加的コード配列を伴うかまたは伴わないポリペプチドのコード配列；付加的アミノ酸をコードする付加的コード配列、例えば付加的機能性を提供するものが挙げられ得るが、これらに限定されない。したがって、例えばポリペプチドは、融合（マーカー含有）ポリペプチドの精製を促すマーカー配列、例えばペプチドと融合され得る。本発明のこの局面のある種の好ましい実施態様では、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）であり、とりわけ、その多くは市販されている。例えばＧｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８２１−８２４ （１９８９）に記載されているように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８ （１９８４）により記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する精製に有用な別のペプチドである。
【００４３】
変異体および突然変異体ポリヌクレオチド
本発明はさらに、Ｃ５−エピメラーゼの部分、類似体または誘導体をコードする本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」とは、生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替的形態のうちの１つを意図する（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ， Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．， ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８５））。非天然変異体は、当業界で既知の突然変異誘発技法を用いて産生され得る。
【００４４】
このような変異体としては、ヌクレオチド置換、欠失または付加により産生されるものが挙げられる。置換、欠失または付加は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを包含し得る。変異体は、コード領域、非コード領域またはその両方で変更され得る。コード領域における変化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、無症候性置換、付加および欠失であり、これはＣ５−エピメラーゼポリペプチドまたはその一部分の特性および活性を変えない。その上、この点で特に好ましいのは、保存的置換である。
【００４５】
本発明のさらなる実施態様としては、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸分子であって、そのアミノ酸配列が、以下の：（ａ）図３のアミノ酸１〜１１８；（ｂ）図３のアミノ酸１〜１１９；（ｃ）図３のアミノ酸１〜１２０；（ｄ）図３のアミノ酸１〜１２１；（ｅ）図３のアミノ酸１１９〜６１８；（ｆ）図３のアミノ酸１２０〜６１８；（ｇ）図３のアミノ酸１２１〜６１８；（ｈ）図３のアミノ酸１２２〜６１８；（ｉ）図３のアミノ酸３４〜１４７；（ｊ）図３のアミノ酸３５〜１５４；（ｋ）図３のアミノ酸３４〜１５４；（ｌ）図３のアミノ酸１〜１５４；（ｍ）図３に示された全アミノ酸配列からなる群から選択される参照アミノ酸と少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子が挙げられる。
【００４６】
本発明のさらなる実施態様としては、前記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）のポリヌクレオチドと緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子が挙げられる。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない。
【００４７】
Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と例えば少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であるが、但し、ポリヌクレオチド配列が、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５つまでの点突然変異を含み得ることを意図する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されるかまたは別のヌクレオチドで置換され、あるいは参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で、あるいはそれらの末端位置間のどこかで、参照配列中のヌクレオチド間に別々に散在されて、あるいは参照配列内の１つまたはそれ以上の連続基中に起こり得る。
【００４８】
実際には、任意の特定の核酸分子が、図２に示されたヌクレオチド配列と例えば少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、慣用的には既知のコンピュータープログラム、例えばベストフィットＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）を用いて確定され得る。ベストフィットは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同の最良セグメントを見つける。ベストフィットまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて特定の配列、例えば本発明の参照配列と９５％同一である配列が存在するか否かを確定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長に亘って算定され、そして参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同におけるギャップが許されるよう、設定される。
【００４９】
本出願は、Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、図２に示された核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に向けられる。これは、特定の核酸分子がＣ５−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしない場合でも、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして核酸分子を用いる方法を当業者はすでに知っているためである。Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、特に以下のものが挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＣ５−エピメラーゼ遺伝子またはその対立遺伝子変異体の単離；（２）Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）に記載されているようなＣ５−エピメラーゼ遺伝子の精確な染色体位置を提供するための中期染色体スプレッドとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば「ＦＩＳＨ」）；ならびに特定組織中のＣ５−エピメラーゼｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット。
【００５０】
しかしながら好ましいのは、Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを実際にコードする図２に示された核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する核酸分子である。「Ｃ５−エピメラーゼ活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的検定で測定した場合に、本発明のＣ５−エピメラーゼ（全長タンパク質あるいは好ましくはアミノ酸３３〜６１８または３４〜６１８を含有する同定アミノ酸断片）の活性と類似するがしかし必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドを意図する。
【００５１】
もちろん、遺伝暗号の縮重のために、寄託ｃＤＮＡの核酸配列または図２に示された核酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が「Ｃ５−エピメラーゼタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードする、ということを当業者は直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体がすべて同一ポリペプチドをコードするため、これは、前記の比較検定を実施しない場合でさえ、当業者には明らかである。さらに、縮重変異体でないこのような核酸分子に関して、合理的数がＣ５−エピメラーゼタンパク質活性を有するポリペプチドもコードする、と言うことが当業界で認識される。これは、以下でさらに記載されるように、タンパク質機能を有意に実行するとはあまり思われないかまたは思われないアミノ酸置換（例えばある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換する）に当業者が十分気づいているためである。
【００５２】
ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明の単離ＤＮＡ分子を含むベクター、本発明の組換えベクターを用いて遺伝子工学処理される宿主細胞、ならびに組換え技法によるＣ５−エピメラーゼポリペプチドまたはその断片の産生にも関する。
【００５３】
ポリヌクレオチドは、宿主中での増殖のために選択可能マーカーを含有するベクターと連結され得る。一般にプラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物中に、あるいは荷電脂質との複合体中に導入される。ベクターがウイルスである場合、それは、適切なパッキング細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにパックされ、次に宿主中に形質導入され得る。
【００５４】
ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーター、例えば２〜３名前を挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターと操作可能的に連結される必要がある。その他の適切なプロモーターは、当業者に既知である。発現構築物はさらに、転写開始、終結のための部位を、ならびに、転写化領域では、翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。構築物により発現される成熟転写体のコード部分は、好ましくはその始まりに翻訳開始コドンを、そして翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００５５】
前記のように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養のためのジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、ならびに大腸菌およびその他の細菌における培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌、コリネバクテリア、ストレプトミセスおよびネズミチフス菌Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えばアスペルギルス属、黒色アスペルギルスＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはトリコデルマ属、酵母細胞、例えばサッカロミセス属、ビール酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；昆虫細胞例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい宿主としては、昆虫細胞が挙げられる。前記宿主細胞のための適切な培地および条件は、当業界で既知である。
【００５６】
細菌中で用いるための好ましいベクターとしては、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）；ｐＢＳベクター、ファゲスクリプトＰｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ブルースクリプトＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。好ましい真核生物ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、痘瘡ウイルスベクター、例えばワクシニアウイルスおよびアデノウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。その他の適切なベクターは、当業者には用意に明らかになる。
【００５７】
宿主細胞中への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染またはその他の方法により実行され得る。このような方法は、多数の標準実験室マニュアル、例えばＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）に記載されている。
【００５８】
ポリペプチドおよび断片
本発明はさらに、図３中のアミノ酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有する単離または精製Ｃ５−エピメラーゼポリペプチド、あるいは特に前記のようなそして前記の核酸分子によりコードされる前記のポリペプチドの一部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。
【００５９】
本発明はさらに、図３に示されたようなアミノ酸１〜３３または１〜３４のシグナル配列、あるいは図３に示されたようなアミノ酸１〜１５４、３３〜１５４または３４〜１５４の活性強化配列のような、当該タンパク質のＮ末端にそのＣ末端で融合されるマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端の機能的部分を含有する融合タンパク質を提供する。位置実施態様では、当該タンパク質は、図３のマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端の３０〜１５４アミノ酸を含有するＮ末端の部分、特にアミノ酸３３〜１５４または３４〜１５４に融合される。別の好ましい実施態様では、当該タンパク質は、図３に示された配列の残基３３〜１５４を含有するＮ末端の機能的部分に融合される。非常に好ましい実施態様では、当該タンパク質は、図３における配列に示されたようなアミノ酸１〜３３または１〜３４の分泌シグナルを含有するＮ末端の機能的部分に融合される。
【００６０】
ポリペプチドは、修飾化形態で、例えば融合タンパク質で発現され、分泌シグナルだけでなく、付加的異種機能的領域も含み得る。「異種」ポリペプチドという用語が意味することは、異なる種由来のものであるとして当業者に周知である。したがって例えば付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域がポリペプチドのＮ末端に付加されて、精製中またはその後の取り扱いおよび貯蔵中の宿主細胞中での安定性および持続性を改良し得る。さらにペプチド部分は、精製を促すためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製前に除去され得る。分泌または排出を引き起こすための、安定性を改良するための、そして精製を促すため等のポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当業界でよく知られたルーチンの技法である。
【００６１】
Ｃ５−エピメラーゼまたはその断片を含有する融合タンパク質は、周知の技法により、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーにより組換え細胞培養から回収され、精製され得る。
【００６２】
本発明のポリペプチドとしては、天然精製産物、化学合成手法の産物、ならびに原核生物または真核生物、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞から組換え技法により産生される産物が挙げられる。組換え産生手法に用いられる宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化または非グリコシル化される。さらに本発明のポリペプチドは、いくつかの場合には宿主媒介性過程の結果として、初期修飾化メチオニン残基も含み得る。本発明のポリペプチドは、タンパク質精製手法のために末端に付加されるヒスチジンまたはポリヒスチジンの修飾も含み得る。
【００６３】
Ｃ５−エピメラーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、種々の用途のために、特にＣ５−エピメラーゼの化学的および生物学的特性を用いる用途のために、本発明にしたがって用いられ得る。特に本発明の組換えエピメラーゼは、大規模で、抗凝血薬として有用であり得るヘパリンおよび／またはヘパラン硫酸塩を製造するために用いられ得る。さらに本発明のエピメラーゼは、発生学、新脈管形成および腫瘍進行に及ぼすヘパリンおよびヘパラン硫酸塩のような細胞外マトリクス分子の作用を研究するための実験設定に有用であり得る。例えば酵素は、ヘパリンまたはヘパラン硫酸塩中のＤ−グルクロン酸／Ｌ−イズロン酸残基の比を調整し得る。Ｌ−イズロン酸残基は、それらの独特の配座特性のために、タンパク質との多糖の相互作用を促すと考えられる。さらに本発明のエピメラーゼは、いくつかの食品中の安定剤またはゲル化剤として用いられ得る工業的に有用な糖を修飾するためにも用いられ得る。
【００６４】
変異体および突然変異体ポリペプチド
Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドの特徴を改良または変更するために、タンパク質工学処理が用いられ得る。当業者に既知の組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば単一または多アミノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含めた新規の突然変異体タンパク質または「ムテイン」を作製し得る。このような修飾化ポリペプチドは、例えば活性強化または安定性増大を示し得る。さらにそれらは、少なくともある種の精製および貯蔵条件下で、対応する天然ポリペプチドより高収率で精製され、そしてより良好な溶解性を示す。
【００６５】
Ｎ末端およびＣ末端欠失突然変異体
例えば、膜関連タンパク質または成熟形態（単数または複数）の分泌タンパク質の細胞外ドメインを含めた多数の特性に関して、１つまたはそれ以上のアミノ酸が生物学的機能の実質的損失を伴わずにＮ末端またはＣ末端から欠失され得る、ということが当業界で既知である。例えばＲｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８： ２９８４−２９８８ （１９９３）は、３、８または２７個の末端アミノ酸残基が失われている場合でもヘパリン結合活性を有する修飾化ＫＧＦタンパク質を報告した。
【００６６】
しかしながら、タンパク質のＮ末端からの１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失がタンパク質の１つまたはそれ以上の生物学的機能の修飾または損失を生じる場合でも、その他の生物学的活性は依然として保持され得る。したがってＣ５−エピメラーゼタンパク質の全体または部分を認識する抗体を誘導しおよび／または結合する短縮化タンパク質の能力は、一般に、大多数より少ない完全タンパク質の残基または細胞外ドメインがＮ末端から除去された場合、保持される。完全タンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが依然としてこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載のルーチン方法によりならびに当業界で既知の別の方法で容易に確定され得る。
【００６７】
したがって本発明はさらに、アミノ酸配列のアミノ末端から欠失される１つまたはそれ以上の残基を有するポリペプチドを提供する。
【００６８】
しかしながらタンパク質のＣ末端からの１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失がタンパク質の生物学的機能の修飾または損失を生じる場合でも、その他の生物学的活性は依然として保持され得る。したがって完全または成熟形態のタンパク質を認識する抗体を誘導しおよび／または結合する短縮化タンパク質の能力は、一般に、大多数未満の完全または成熟形態タンパク質の残基がＣ末端から除去される場合に、保持される。完全タンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが依然としてこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載のルーチン方法によりならびに当業界で既知の別の方法で容易に確定され得る。
【００６９】
本発明は、アミノおよびカルボキシル末端の両方から欠失される１つまたはそれ以上のアミノ酸を有するポリペプチドも提供する。
【００７０】
その他の突然変異体
前記の末端欠失形態のタンパク質のほかに、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能に有意の影響を及ぼさずに変更され得る、ということも当業者に認識される。配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を確定するタンパク質上の重要な領域が存在することを思い起こす必要がある。したがって本発明はさらに、実質的Ｃ５−エピメラーゼポリペプチド活性を示し、あるいは下記のタンパク質部分のようなＣ５−エピメラーゼタンパク質の領域を含むＣ５−エピメラーゼポリペプチドの変異を包含する。このような突然変異体としては、欠失、挿入、逆位、反復およびタイプ置換が挙げられる。アミノ酸変化が表現型敵に無症候性であると思われる指針は、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ． ｅｔ ａｌ．， “Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７： １３０６−１３１０ （１９９０）に見出され得る。
【００７１】
したがって図３のポリペプチドの断片、誘導体または類似体あるいはそれを含有する融合タンパク質は、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基（単数または複数）、さらに好ましくは少なくとも１つのしかし１０未満の保存アミノ酸残基（単数または複数））で置換されるものであり、このような置換アミノ酸残基（単数または複数）は、遺伝暗号によりコードされるものであり得るし、またはあり得ない；あるいは（ｉｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの；あるいは（ｉｉｉ）成熟または可溶性細胞外ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増大するための化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合されるもの；あるいは（ｉｖ）付加的アミノ酸がリーダーまたは分泌配列あるいは成熟ポリペプチドの精製のために用いられる配列またはプロタンパク質配列と融合されるものであり得る。このような断片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。
【００７２】
したがって本発明のＣ５−エピメラーゼは、天然突然変異または人的操作による、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。前記のように、変化は、好ましくは小さいものであり、例えばタンパク質のフォールディングまたは活性に有意の影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である（表１参照）。
【００７３】
【表１】
機能に不可欠な本発明のＣ５−エピメラーゼタンパク質中のアミノ酸は、当業界で既知の方法により、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５ （１９８９））。後者の手法は、分子中のすべての残基に単一アラニン突然変異を導入する。その結果生じる突然変異体分子は、次に、受容体結合またはｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖活性といった生物学的活性に関して試験される。
【００７５】
特に興味深いのは、別の荷電アミノ酸による、ならびに中性または負荷電アミノ酸による変化アミノ酸の置換である。後者は、正電荷低減を示すタンパク質を生じて、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質の特徴を改良する。集合の防止は、非常に望ましい。タンパク質の集合は、活性損失を生じるだけでなく、それらが免疫原性であり得るために、製剤処方物を調製する場合にも問題を生じ得る（Ｐｉｎｃｋａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：３３１−３４０ （１９６７）； Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６： ８３８−８４５ （１９８７）； Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０： ３０７−３７７ （１９９３））。
【００７６】
アミノ酸の置換は、細胞表面受容体とのリガンドの結合の選択性も変え得る。例えばＯｓｔａｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６１： ２６６−２６８ （１９９３）は、２つの既知の種類のＴＮＦ受容体のうちの１つだけとのＴＮＦ−αの選択的結合を生じるある種の突然変異を記載する。リガンド−受容体結合のために重要である部位は、構造分析、例えば結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識によっても確定され得る（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４ （１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２ （１９９２））。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離形態で提供される。「単離ポリペプチド」とは、そのネイティブ環境から単離されたポリペプチドを意図する。組換え宿主細胞内で産生されおよび／または含有されるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。「単離ポリペプチド」は、組換え宿主細胞から、部分的にまたは実質的に、精製されたポリペプチドであるとも意図される。例えば組換え的産生バージョンのＣ５−エピメラーゼポリペプチドは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７： ３１−４０ （１９８８）に記載された一段階法により実質的に精製され得る。好ましくは本発明のポリペプチドは、配列分析に十分な程度に、あるいはそれが調製物中のタンパク質様物質の９９％を示すよう精製される。
【００７８】
本発明は、マウスＣ５−エピメラーゼ遺伝子およびタンパク質を、そしてＣ５−エピメラーゼポリペプチドが、Ｎ末端１５４アミノ酸ドメイン、特にそれに連結されるアミノ酸配列の分泌および安定化に関与するアミノ酸１〜３３または１〜３４を含有する３３または３４アミノ酸ドメインを示す６１８残基タンパク質であることを発見した。したがってこのドメインまたはその機能的部分は、Ｃ５−エピメラーゼのようなタンパク質、または任意のその他のタンパク質、特にゴルジ装置に関連するタンパク質、あるいは相でない場合はヘパリンまたはヘパラン硫酸塩合成に関連するタンパク質の発現および分泌のために有用である。
【００７９】
本発明は、マウスＣ５−エピメラーゼタンパク質のＮ末端、特にアミノ酸１〜１５４，３３〜１５４または３４〜１５４が、その他の酵素、特にその他のＣ５−エピメラーゼの活性を強化するのに有用である、ということも発見した。したがってこのドメインまたはその機能的部分は、図３に示されたものと異種であるＣ５−エピメラーゼ配列、特にウシＣ５−エピメラーゼを含む融合タンパク質の発現および分泌のために有用である。
【００８０】
本発明のポリペプチドとしては、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドおよび前記のような断片であって、そのアミノ酸配列が以下の：（ａ）図３のアミノ酸１〜１１８；（ｂ）図３のアミノ酸１〜１１９；（ｃ）図３のアミノ酸１〜１２０；（ｄ）図３のアミノ酸１〜１２１；（ｅ）図３のアミノ酸１１９〜６１８；（ｆ）図３のアミノ酸１２０〜６１８；（ｇ）図３のアミノ酸１２１〜６１８；（ｈ）図３のアミノ酸１２２〜６１８；（ｉ）図３のアミノ酸３４〜１４７；（ｊ）図３のアミノ酸３５〜１５４；（ｋ）図３のアミノ酸３４〜１５４；（ｌ）図３のアミノ酸１〜１５４；（ｍ）図３に示された全アミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、同一であるポリペプチドが挙げられる。
【００８１】
本発明は、前記のポリペプチドと少なくとも８０％同一である、さらに好ましくは少なくとも９０％または９５％、さらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドを包含し、そして少なくとも３０アミノ酸、さらに好ましくは５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの一部分も包含する。
Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドの参照アミノ酸配列と例えば少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であるが、但し、ポリペプチド配列が、Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たり５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを意図する。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸の５％までが欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換され、あるいは参照配列中の総アミノ酸の５％までの多数のアミノ酸が参照配列中に挿入され得る。
【００８２】
参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で、あるいはそれらの末端位置間のどこかで、参照配列中の残基間に別々に散在されて、あるいは参照配列内の１つまたはそれ以上の連続基中に起こり得る。
実際には、任意の特定のポリペプチドが、図３に示されたアミノ酸配列と例えば少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、慣用的には既知のコンピュータープログラム、例えばベストフィットＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）を用いて確定され得る。ベストフィットまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて特定の配列、例えば本発明の参照配列と９５％同一である配列が存在するか否かを確定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長に亘って算定され、そして参照配列中のアミノ酸の総数の５％までの相同におけるギャップが許されるよう、設定される。
【００８３】
Ｃ５−エピメラーゼ活性を保有する本発明のポリペプチドを用いて、例えばそれに関する検定を開発する場合に、またはより複雑な系とともに用いるための検定を標準化する場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそれを提供し得る。本発明のシグナル配列は、真核生物組換え宿主から同種Ｃ５−エピメラーゼ酵素を分泌するために、またはそれと操作可能的に連結される異種配列を分泌するために用いられ得る。本発明の活性強化配列は、他のＣ５−エピメラーゼの組換え調製物の固有のエピメラーゼ活性を強化するために用いられ、そういうものとして、それに関する融合タンパク質をコードする遺伝子の形態で最良に提供され得る。
【００８４】
抗体
本発明に用いるためのＣ５−エピメラーゼタンパク質特異的抗体は、無傷Ｃ５−エピメラーゼタンパク質またはその抗原性ポリペプチド断片に対して産生され得るが、これは、担体タンパク質、例えばアルブミンと一緒に動物系（例えばウサギまたはマウス）に提示され得るか、あるいはそれが十分長い（少なくとも約２５アミノ酸）場合には、担体を伴わずに、またはリポソーム中に提示されて、あるいはＰＥＧと複合されて、循環半減期を強化し得る。
【００８５】
本明細書中で用いる場合、「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）という用語は、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質と特異的に結合し得る無傷分子ならびに抗体断片（例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、無傷抗体のＦｃ断片を欠き、循環からより迅速に出て行き、そして無傷抗体の非素機器特異的結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２４： ３１６−３２５ （１９８３））。したがってこれらの断片が好ましい。
【００８６】
本発明の抗体は、任意の種々の方法により調製され得る。例えばＣ５−エピメラーゼタンパク質またはその抗原性断片を発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために、動物に投与され得る。好ましい方法では、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質の調製物が調製され、精製されて、それが天然夾雑物を実質的に含有しないようにする。このような調製物は次に、より大きい特異的活性を有するポリクローナル抗血清を産生するために、動物に導入される。
【００８７】
最も好ましい方法では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法を用いて調製され得る（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５ （１９７５）； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ５１１ （１９７６）； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ２９２ （１９７６）； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， （１９８１） ｐｐ． ５６３−６８１）。概してこのような手法は、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質抗原で、さらに好ましくはＣ５−エピメラーゼタンパク質発現細胞で動物（好ましくはマウス）を免疫感作することを包含する。適切な細胞は、抗Ｃ５−エピメラーゼタンパク質抗体を結合するそれらの能力により認識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培地中で培養され得るが、しかしながら、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で不活性化）を補足し、ならびに約１０ ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１０００ Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび約１００μ ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したイーグルの変法イーグル培地中で細胞を培養するのが好ましい。このようなマウスの脾臓細胞が抽出され、適切な黒色腫細胞株と融合される。任意の適切な黒色腫細胞株が、本発明にしたがって用いられ得る。しかしながらアメリカ培養細胞コレクションＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手可能な親黒色腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いるのが好ましい。融合後、その結果生じたハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地中に選択的に維持され、次にＷａｎｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０： ２２５−２３２ （１９８１）により記載されているように希釈を限定することによりクローン化される。このような選択により得られたハイブリドーマ細胞は次に、所望のＣ５−エピメラーゼ抗原を結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するために検定される。
【００８８】
あるいは、Ｃ５−エピメラーゼ抗原と結合し得る付加的抗体は、抗イディオタイプ抗体の使用により二段階手法で産生され得る。このような方法は、抗体がそれ自体抗原であるという、したがって二次抗体と結合する抗体を得ることが可能であるという事実を用いる。この方法によれば、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質特異的抗体は、動物を、好ましくはマウスを免疫感作するために用いられる。このような動物の脾臓細胞は次に、ハイブリドーマ細胞を産生するために用いられ、そしてハイブリドーマ細胞がスクリーニングされて、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質特異的抗体と結合するその能力がＣ５−エピメラーゼタンパク質抗原により遮断され得る抗体を産生するクローンを同定する。このような抗体は、Ｃ５−エピメラーゼタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫監査してさらなるＣ５−エピメラーゼタンパク質特異的抗体の生成を誘導するために用いられ得る。
【００８９】
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびにその他の断片は、本明細書中に開示された方法にしたがって用いられ得る、と理解される。このような断片は、典型的には、酵素、例えばパパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２を産生するため）を用いて、タンパク質分解的切断により産生される。一本鎖抗体、例えば軽または重鎖抗体も、本発明に包含される。あるいはＣ５−エピメラーゼタンパク質結合断片は、組換えＤＮＡ技術の適用により、または合成化学により産生され得る。このような抗体としては、例えば異なる結合特異性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を、あるいは抗体の結合特異性を修飾するために組換え技術の適用によりまたは合成化学により修飾されたＣＤＲを含む組換え抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
ヒトにおける抗Ｃ５−エピメラーゼのｉｎ ｖｉｖｏ使用のためには、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を用いるのが好ましい。このような抗体は、前記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞由来の遺伝子構築物を用いて産生され得る。キメラ抗体の産生方法は、当業界で既知である（再検討のためには、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９： １２０２ （１９８５）； Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４： ２１４ （１９８６）； 米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ等）；欧州特許第１７１４９６号（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等）；欧州特許第１７３４９４号（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等）；ＷＯ ８６０１５３３（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等）；ＷＯ８７０２６７１（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等）； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６４３ （１９８４）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２６８ （１９８５）参照）。
【００９１】
二重特異性抗体は、異なるエピトープに対するまたは異なる種由来の抗原結合ドメインを有する抗体であり、本発明に包含される。Ｆａｂ領域とは異なる種由来のＦｃ領域を有する抗体も意図され、免疫特異的クロマトグラフィー手法に用いられ得る。結合標識、例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ペルオキシダーゼ、金、磁気標識、アルカリ性ホスファターゼ、放射性同位元素または化学発光標識を伴う抗体も本発明に包含される。
【００９２】
本発明を一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより本発明はより容易に理解される。以下の実施例は例証であって、本発明を限定するものではない。
実施例
実施例１
マウスゲノムクローンの単離およびシーケンシング
Ｃ５−エピメラーゼをコードするウシ配列からのＤＮＡプローブを用いて、マウスゲノムライブラリー（ＦＩＸ ＩＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングした。プローブを［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で標識した。約２ｘ１０６ファージを２０ｘ２０ ｃｍプレート中でプレート化し、各プレートから複製ナイロンフィルターを調製した。６０℃で１００ μｇのサケ精子ＤＮＡ／ｍｌを含有する５ｘデンハートＤｅｎｈａｒｄｔ中でのハイブリダイゼーションにより、高緊縮スクリーニングを実施した。最終洗浄は、０．１ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは１５０ ｍＭＮａＣｌ、１５ ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１％ＳＤＳ含有）中であった。両レプリカ上に陽性シグナルを生じたプラークを、第２および第３回スクリーニングに関して選択し、最後に５つの陽性クローンを単離した。クローンのうちの２つは約１６ ｋｂという同様の長さを有するが、一方、他の３つは相対的に短く、約１０〜１２ ｋｂであった、ということが判明した。最長クローン（クローン６４）をＳａｃｌで消化し、制限断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ中でクローン化した。二番目に長いクローン（クローン５Ａ）をＥｃｏＲＩで消化し、その結果生じた断片をさらなる特性化のためにｐＵＣ１１９中でクローン化した。
【００９３】
挿入物含有プラスミドをＱＩＡＧＥＮプラスミドキットを用いて精製し、そしてシーケンシングした。ヌクレオチドシーケンシング反応をチェインターミネーター法を用いて実施し、そしてＡＢＩ ３１０シーケンサーを用いて実行した。両鎖上でのプライマーウォーキングによりエキソンおよびイントロンを確定し、そしてアガロースゲル電気泳動と組合せたシーケンシングによりイントロンのサイズを概算した。Ｃ５−エピメラーゼをコードするエキソンは３つだけ存在すると考えられ、５０％より多いタンパク質をコードする最長エキソンを伴った。エキソン−イントロン接合部（スプライス部位）は、ｇｔ−ａｇコンセンサス規則に精確に従う。イントロンの存在ならびにエキソンとｃＤＮＡ配列との間の精確な適合に基づいて、同定されたゲノムクローンはＣ５−エピメラーゼの機能的遺伝子を表す、とわれわれは考える。
【００９４】
マウスＣ５−エピメラーゼｃＤＮＡのクローニング
一対のプライマーを設計し、ゲノムクローンのエキソンをシーケンシングすることにより得たヌクレオチド配列の基礎とした。センスプライマーは、マウスＯＲＦの塩基１〜２６に対応し、開始コドンＡＴＧから開始する。アンチセンスプライマーは、塩基１８２９〜１８５４に対応し、停止コドンを含まない。以下の条件：９４℃で１分を１回、９４℃で３０秒、６０℃で４５秒および７２℃で１分を各々３０回、そして７２℃で１０分間で最終延長：で、鋳型としてマウス肝臓ＱＵＩＣＫ−クローン（商標）ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いることにより、ＰＣＲを実施した。約２ ｋｂの強い帯域を得て、これをＴＯＰＯ（商標）−ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でクローン化して、増幅し、その後シーケンシングした。二本鎖シーケンシングにより、マウスＣ５−エピメラーゼクローンが１８７５ ｂｐ長であり、推定ペプチドのＮ末端に強疎水性ドメインを有する、ということが判明した。
【００９５】
ノーザンブロット分析
マウス多組織ｍＲＮＡブロットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ウシｃＤＮＡクローンからのＤＮＡプローブを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからのクレノウ酵素により［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。６０℃で１時間、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でハイブリダイゼーションを実行し、高緊縮で洗浄した。膜を−７０℃で一夜、コダックフィルムに露出した。Ｃ５−エピメラーゼ酵素は、検査したすべての組織で発現され、転写体は約５ ｋｂである。肝臓は転写体に関して最高発現を示すが、一方、脾臓は同一膜中でのβ−アクチンと比較して相対的に低いレベルを発現する、と思われる。
【００９６】
サザンブロット分析
Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）にしたがって、サザンブロット分析を実施した。Ｅａｓｙ Ｐｒｅｐキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、マウスゲノムＤＮＡを調製した。２０ μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで消化して、電気泳動により０．８％アガロースゲル上で分離した。電気泳動後、ゲルを０．１ ＮＮａＯＨで３０分間処理し、トリス−ＨＣｌ緩衝液中で中和した。ＤＮＡ断片をナイロン膜上に移した。ウシＣ５−エピメラーゼｃＤＮＡの８３７ ｂｐ断片をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからのクレノウ酵素により［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、プローブとして用いた。ハイブリダイゼーション条件を、ノーザン分析に関して記載したように実行した。露出時間は３日間であった。
【００９７】
多数の遺伝子が如何にＣ５−エピメラーゼをコードし得るかを確定するために、マウス肝臓から精製した２０ μｇのマウスゲノムＤＮＡを、それぞれＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩの制限酵素で消化し、電気泳動により０．８％アガロースゲル上で分離した。ゲル中に分離されたＤＮＡをナイロン膜に移し、その後、ウシコード配列（１４０７ ｂｐ）からのＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。Ｃ５−エピメラーゼゲノムＤＮＡの制限マップは、マウスにおけるＣ５−エピメラーゼ酵素をコードする遺伝子が１つだけ存在する、ということを示唆する。
【００９８】
酵素活性分析
Ｍａｌｍｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５： ３８７８−３８８３ （１９８０）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に開示されたようなプロトコールにしたがって、Ｃ５−エピメラーゼの活性を査定した。要するに、筋肉内に肥満細胞腫細胞を移植されたマウスを、頚部脱臼により安楽死させて、その後、解剖した。異種移植片を含めたそれぞれの組織を採取し、直ちに、１００ ｍＭＫＣｌ、１５ ｍＭＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤を含有する５０ ｍＭＨＥＰＥＳの緩衝液中で均質化した。ホモジネートを４℃で３０分間振盪し、遠心分離した。上清を収集した。総タンパク質濃度をＱｕａｎｔｉＧｏｌｄ検定により確定し、Ｌｉ等（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）により記載された手法にしたがって、基質多糖からの３Ｈ（３Ｈ２Ｏとして回収される）の放出に基づいてＣ５−エピメラーゼの特異的活性を分析した。特異的活性試験に用いたＣ５−基質を、酵素を含有しない５０ μｌのＣ５−基質作業溶液のみを測定することにより、少なくとも１ヶ月に１回、分析する。
【００９９】
試料の初期活性が＞２０００ ｃｐｍ／５０ μｌである場合、これは、試料が飽和され、希釈される必要があるという指標である。希釈因子は、用いられる試料、試料の飽和および塩濃度によっている。試料は、Ｃ５−エピメラーゼ活性がより高い塩濃度で部分的にまたは完全に阻害されるため、５０ ｍＭ以下の塩（ＮａＣｌまたはＫＣｌ）を含有しなければならない。
【０１００】
Ｃ５−エピメラーゼ活性検定には、正および負の対照が用いられる。正の対照は、安定性が保存されていたことを確実にするために、２ヶ月毎に標準化されねばならない。試料と同一細胞中で産生されるベクターのみが、負の対照として用いられ得る。例えばバキュロウイルス／昆虫細胞発現系により産生されるＣ５−試料に関しては、同一系を用いて産生されるアセチルコリンエステラーゼが負の対照として用いられた。
【０１０１】
Ｃ５基質溶液の予熱中に、必要な場合には試料を希釈した。５０ μｌの試料（酵素）を予熱基質に付加し、＋３７℃で正確に１時間、インキュベートした。インキュベーション後、酵素反応の停止溶液１００ μｌを基質−酵素混合物に付加し、この反応混合物をＷａｌｌａｃの２０ ｍｌシンチレーションバイアルに移した。エピメラーゼ検定シンチレーションカクテル１３ ｍｌをバイアルに付加し、１０秒間撹拌した。一夜インキュベーション語、Ｗａｌｌａｃ１４１５液体シンチレーション計数器を用いて各々２分間、三重反復試験で放射能を測定した。シンチレーション計数器は、結果をｃｐｍ／反応容積（５０ μｌ）として示す。試料が希釈されていた場合、希釈緩衝液の活性を試料の活性から差し引く必要がある。いかなる場合でも、結果を分析する前に、ブランクの活性を試料の活性から差し引いた。
【０１０２】
総活性（ｃｐｍ／μｌ）を総タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で割ることにより、特異的活性を測定した。総タンパク質濃度は、Ｓｔｏｓｃｈｅｋ， Ｃ．Ｍ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６０： ３０１−３０５ （１９８７）（この記載内容を、本明細書中に援用する）にしたがって、ＱｕａｎｔｉＧｏｌｄ検定により測定した。特異的活性の単位はｃｐｍ／ｍｇ／ｈで、この場合、ｈ（時間）は酵素反応の時間を記載する。
【０１０３】
実施例２
マウス遺伝子のコード配列分析からのＣ５−エピメラーゼの真のＮ末端の同定ならびにクローン化ｃＤＮＡの発現
実施例１で同定された推定マウスＣ５−エピメラーゼ遺伝子の国および予備配列分析に基づいて、そして前に発表されたウシｃＤＮＡ配列に対するアラインメントを基礎にして、付加的ネズミ５’−フランキングＤＮＡ配列を単離し、この５’−フランキングＤＮＡ配列を含有するｃＤＮＡをクローン化した。
【０１０４】
この５’−フランキングＤＮＡ配列が、マウス遺伝子によりコードされるＣ５−エピメラーゼの真のＮ末端を表す付加的Ｎ−末端ペプチド配列をコードし得るか否かを確定するために、マウス配列（図１に示したコンパイル済ヌクレオチド配列中の太字文字列）を、ウシ配列を用いて、最大保存（＞９６％アミノ酸同一性）の点から出発して、コンピューターファイル中にすでに存在するウシｃＤＮＡ配列に付加した。次にＧｅｎｅ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒプログラム（Ｔｅｘｔｃｏ， ＵＳＡ）を用いて、コンパイル済み配列中で、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（考え得るポリペプチドコード配列である）に関して検索した。配列アラインメントの結果を図１に示す。ＯＲＦ分析は、図２に示した結果を生じた。
【０１０５】
図１において、新規のマウス配列とウシ配列との間の融合部位を、二重コロン“ ”で示す。二重コロンの後ろで開始する配列は、ウシｃＤＮＡ配列である。配列（太字）５’〜融合部位は、前記のように単離された付加的ネズミ５’−フランキングＤＮＡ配列である。非下線配列は、見出されたオープンリーディングフレームであり、ポリペプチドコード配列を示す。
【０１０６】
ネイティブＣ５−エピメラーゼ酵素が細胞（肝臓から）の膜性ゴルジ「区画」（ミクロソーム分画）に局在する、ということは既知である。したがってネイティブマウス配列は、この区画への転位のための適切なＮ末端を含有する必要がある。これを分析するために、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０： １−６ （１９９７）のアルゴリズム（プログラム）を用いた。当該アルゴリズムは、前記のポリペプチド配列の各々からの最初の４０〜６０アミノ酸の「シグナル電位」を分析した。同一プログラムを用いて、マウスシンデカン−１ポリペプチド配列の最初の４０残基を試験したが、プログラムの効力に関する対照の一種として、これが分泌シグナルを含有することが既知である場合、プログラムはこれを陽性に同定した（データは示されていない）。分析は、最初の３３残基に関して強シグナル電位を実証した。
【０１０７】
前記の３３アミノ酸シグナル配列のほかに、１５４の付加的Ｎ末端残基は、ジスルフィド結合を形成し、タンパク質フォールディングを安定化し得る付加的システイン残基、ならびに翻訳後タンパク質分解的プロセシングに関連し得る予測アミド化部位（残基１１８〜１２１）を包含する。Ｃ５−エピメラーゼに関する全配列のさらなる分析は、埋没され得るかまたは膜（単数または複数）を横断するポリペプチドの疎水性鎖を予測する。
【０１０８】
データベース中で見出されたその他の配列に対するアラインメント分析は、相同のホットスポットを明示する。これらの結果は、図４および５に要約されている。
【０１０９】
図５は、マウスＣ５−エピメラーゼポリペプチド配列の略図である。図５に示したように、配列の最大進化的保存（相同の「ホットスポット」）は、タンパク質の折りたたまれた構造中に埋没されるかまたは膜を横断して、おそらくは酵素が作用することが既知であるゴルジの管腔に入ると予測されるアミノ酸残基Ｔｒｐ４９７およびＬｅｕ５２３間の高疎水性鎖中で、より多くのＣ末端部分で起きた。保存のその他の最も有意で且つ延長された鎖（「ホットスポット」）は、残基Ｌｅｕ５４６およびＨｉｓ５８０間に生じ、酵素の活性部位を含有または包含し得る。≧２２％のポリペプチド配列保存（同一性）の機能的意義は、既知の機能についての他のタンパク質の発表済み研究により（Ｂｒａｎｄｅｎ， Ｃ．， ａｎｄ Ｔｏｏｚｅ， Ｊ．， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ＮＹ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ， ｐｐ．１００−１０１ （１９９１））、ならびにｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍｂｂ．ｖａｌｅ．ｅｄｕ／ｅ−ｐｒｉｎｔ／ａｎｎ−ｘｆｅｒ−ｊｍｂ／ｐｒｅｐｒｉｎｔ．ｈｔｍｌから利用可能な“Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｓｃｏｒｅｓ，”におけるＷｉｌｓｏｎ、ＫｒｅｙｃｈｍａｎおよびＧｅｒｓｔｅｉｎならびにそこに引用されたその他の著者等により確立されている。この文献中で説明されているように、精確な機能は３０〜４０％より低い配列同一性を保存されるとは思えないが、一方、機能的種類は２０〜２５％という低い配列同一性に関して保存される。２０％より低いと、一般的類似性はもはや保存されない。目下、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬは、これらの判定基準に応答する配列に関するモデルを生じている：ＢＬＡＳＴ検索Ｐ値：＜０．００００１；配列同一性（ＳＩＭ）の包括的程度：＞２５％ならびに最小計画モデル長−２５アミノ酸。
【０１１０】
これに基づいて、マウス配列に対してショウジョウバエ配列（４６．６％）は線虫配列（３９．６％）より密接に関連する、ということが分かる。
別の種類の配列分析では、マウスＣ５−エピメラーゼ配列の予測三次元（３Ｄ）構造はＫｅｌｌｅｙ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９９（２）： ４９９−５２０ （２０００）の３Ｄ構造に対して「スレッド化」された。この比較は、Ｃ５−エピメラーゼ配列が、α／αトロイドであるコンドロイチナーゼ（コンドロイチンＡＣ／アルギン酸リアーゼ）ドメインとの有意の関係を有する、ということを示した。コンドロイチンＡＣリアーゼは、グリコサミノグリカン分解酵素の一ファミリーを代表するものであり、構造／機能関係は結晶学から明らかにされている（Ｆｅｔｈｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８８： ６３５−６４７ （１９９９））。コンドロイチナーゼ配列との最も有意の３Ｄ類似性は、内部疎水性（膜貫通）鎖のＣ末端付近のＡｌａ４０８から、マウスＣ５−エピメラーゼ配列のＣ末端に伸びることが判明したことは顕著であり、そして、この鎖が保存配列保存のほとんどを含有することは、それが活性部位を含有するドメインであることを示すと思われる。
【０１１１】
前記配列分析結果のすべてを基礎にして、バキュロウイルスおよびＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＳＡ）発現系からの異種分泌−発現のための一次活性タグ化組換え体（ウシ）Ｃ５−エピメラーゼ構築物のほかに、新規の組換えＣ５−エピメラーゼ構築物が作製された。今までに特性化されたクローン化昆虫細胞株からの生成物を、図６Ａに要約する。４つの構築物が示されている。最初の構築物は、タグ化組換え体ウシＣ５−エピメラーゼである。第二の構築物は、タグ化全長マウスＣ５−エピメラーゼである。第三の構築物は、マウスおよびウシＣ５−エピメラーゼ配列間のタグ化キメラ構築物である。第四の構築物は、タグ化切頭化マウス配列である。
【０１１２】
組換え構築物の各々において、Ｃ５−エピメラーゼをタグ化した。タグ化した場合、Ｃ５−エピメラーゼ配列は、ＥＧＴシグナル切断に連結されたＥＧＴシグナルペプチド、エンテロキナーゼ切断部位、６個のヒスチジンおよび最後にｒＴＥＶプロテアーゼ部位を含有する図６Ｂに示されたような配列により先行された。ＥＧＴシグナルは、バキュロウイルス（昆虫細胞に感染する）のタンパク質からである。ＦＬＡＧ配列は、メーカー示唆プロトコール（Ｓｉｇｍａ）にしたがって組換えタンパク質を検出し、精製するために用いられるエピトープタグである（Ｈｏｐｐ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０ （１９８８））。エンテロキナーゼは、その認識部位に先行する配列を切断するために用いられる酵素である。６個の連続ヒスチジンは、もうひとつのタグである。ｒＴＥＶ（組換え体タバコエッジウイルス）プロテアーゼ部位も、先行配列を除去するために用いた。ＥＧＴシグナルおよびＦＬＡＧ（商標）−タグ（ＩＢＩ）は、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｏｋｅｒ−Ｂｌｏｍ博士（ＶＴＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １５００， ＦＩＮ−０２０４４， ＶＴＴ， ＦＩＮＬＡＮＤ）により提供された修飾ｐＦａｓｔＢａｃＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ベクター中で作製された構築物から得られた。本出願中に記載されたすべての組換えタンパク質の精製は、ＦＬＡＧ−タグベースであった。
【０１１３】
これらのタグ化組換え体Ｃ５−エピメラーゼの活性検定およびタンパク質分析からの代表的データを、図７ならびに表Ｉおよび表ＩＩに示す。図７は、メーカー示唆プロトコールにしたがって抗ＦＬＡＧ Ｍ１全体で精製されたマウスＣ５−エピメラーゼ（ｍＣ５）の活性検定結果を示す。
【０１１４】
異種タンパク質の活性を測定するためのＣ５−エピメラーゼ活性検定を、前記の実施例１と同様に実施した。要するに、ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ発現系を用いて昆虫細胞中に別々に接種された組換え体Ｃ５−エピメラーゼ構築物の各々で形質転換させた培養から、総タンパク質を抽出した。細胞が集密に達した後、それらを収穫し、溶解して、総タンパク質を単離し、定量した。Ｃ５−エピメラーゼ活性は、シンチレーション計数器でエピメラーゼ基質からの３Ｈ放出として測定した。エピメラーゼ活性は、総タンパク質に対して測定した。図７は、試料（１：２０００希釈）の容積増大に伴う活性を示す。総活性は６３６０ ｃｐｍ／μｌであった。Ｓｔｏｓｃｈｅｋ， Ｃ．Ｍ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６０： ３０１−３０５ （１９８７）にしたがってタンパク質分析（ＱｕａｎｔｉＧｏｌｄ， Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ使用）を分析し多。タンパク質の濃度は３．２ μｇ／ｍｌであった。したがって特異的活性は２．０ｘ１０９ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈであった。
【０１１５】
図８は、抗−ＦＬＡＧで染色したウエスタンブロットを示す。レーン１は、分子量標準（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ’ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ、予備染色）を含有する。レーン２は、全長マウスＣ５−エピメラーゼを含有する。タグ化全長マウスＣ５−エピメラーゼ（本明細書中に見出されるＮ末端付加配列を含有する）は、６１８アミノ酸長、７１１８９．１の分子量（ダルトン）、８．２５の等電点（ｐＩ）および＋４．０１のｐＨ７での正味電荷を有する。
【０１１６】
図９は、抗ＦＬＡＧ抗体（０２０３００）で染色された前記の４つのタグ化組換えＣ５−エピメラーゼに関する異なるクローンの安定昆虫細胞株から採取した培地のウエスタンブロットである。レーン１は、図８の場合と同様の分子量標準を含有し、ゲルの側面に分子量を書きとめた。レーン２は、切頭化マウスＣ５−エピメラーゼを含有する。レーン３は、オリジナルウシＣ５−エピメラーゼを含有する。レーン４は、図２および３に示されているように、Ｎ末端マウス配列が枠内でウシ配列と融合されるマウス：ウシキメラＣ５−エピメラーゼを含有する。レーン５は、全長マウスＣ５−エピメラーゼを含有する。キメラマウス：ウシ構築物は全長マウス構築物のサイズとほぼ同一サイズである、ということが分かる。
【０１１７】
活性検定およびウエスタンブロットの濃度計分析に基づいて異なる組換え構築物の相対活性を算定した。結果を以下の表Ｉに示す。「ＴｒｕｎｃＣ５」は、短縮化マウスＣ５−エピメラーゼアミノ酸配列であり、この場合、「ＴｒｕｎｃＣ５」配列が組換えウシ配列と同一Ｎ末端を有するよう、最初の１５４アミノ酸は除去されている。「ＥｘｔＣ５」は組換えウシＣ５−エピメラーゼポリペプチドであり、一方、「ｃｈＣ５」は、図１に示したような核酸配列によりコードされるマウス：ウシキメラＣ５−エピメラーゼ構築物を指す。「ｍＣ５」は、全長マウスＣ５−エピメラーゼ配列を指す。
【０１１８】
【表２】
異なる部分精製組換えＣ５−エピメラーゼの特異的活性を、表ＩＩに示す。
【表３】
作製されたキメラマウス：ウシ構築物は、図６Ｂに示したようないいＧＴ−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ−ＲＴＥＶ素子の直後にマウスポリペプチド配列のＮ末端配列のアミノ酸残基３４〜１５４を含有する。しかしながら、その組換え酵素は、おそらくはマウス細胞のシグナリング電位のために、細胞質ゾル中に主に保持されると考えられた。
【０１２１】
結論
マウス遺伝子配列からのポリペプチド（Ａｓｐ３４〜Ａｓｐ１５４）のＮ末端断片の付加は、配列のこの小片が最大種間保存を含有しない場合でも、数オーダーの大きさで組換えＣ５−エピメラーゼ酵素の活性を強化する。一次組換えウシ構築物の活性に及ぼすタグの考え得る作用が取り扱われ（タグ除去による；データは示されていない）、差異の最小因子を説明し得るが、しかしより長いおよびより短い形態の組換えＣ５−エピメラーゼ間の特異的活性における上記数オーダーの大きさの差の程度を説明しない。この非常に重要な組換え酵素の活性を制御するための基礎およびメカニズムをより良好に限定するために、非タグ化発現構築物および構造−機能試験が目下進行中である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ウシＣ５−エピメラーゼの配列（非太字）およびマウスＣ５−エピメラーゼのＮ末端（太字）を有する融合タンパク質のＤＮＡ配列である。ポリペプチドコード配列を示すオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）には下線を付す。
【図２】
図２は、マウスＣ５−エピメラーゼの完全ＤＮＡ配列である。
【図３】
図３は、マウスＣ５−エピメラーゼの完全アミノ酸配列である。
【図４】
図４は、相同の領域を示すその他の配列に対するマウスＣ５−エピメラーゼのアラインメント分析である。スコアは上部ライン上に示されており、配列の供給源の後ろの欄に列挙されている。配列は以下の供給源から得られる：ライン２：マウス肝臓；ライン３：ウシ肺；ライン４：ヒトＥＳＴ；ライン５：ショウジョウバエ；ライン６：線虫；ライン７：メタノコッカス。
【図５】
図５は、マウスＣ５−エピメラーゼのドメイン構造の略図である。Ｎ末端の中黒長方形枠：シグナル配列（高疎水性膜貫通（ＴＭ）配列）；陰影長方形枠：疎水性膜貫通（ＴＭ）または埋没配列；ペプチド内の中黒長方形枠：線虫７１．９ ＫＤ仮説タンパク質と５０％より多くの類似性を有する保存ペプチド配列。
【図６】
図６Ａ〜６Ｂ。図６Ａ：タグ化組換え（ウシ）Ｃ５−エピメラーゼ構築の生成物の略図。ｉ：一次活性タグ化組換え（ウシ）Ｃ５−エピメラーゼ構築物。特異的活性は５ｘ１０５ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈであった。ｉｉ：最活性組換え（全マウス）Ｃ５構築。特異的活性は２ｘ１０９ ｃｐｍ／ｍｇ／ｈであった。ｉｉｉ：マウスおよびウシ配列の両方を有するキメラ構築物。活性は全長マウス配列の活性の８７％であった。ｉｖ：切頭化マウス構築物。活性は「ｉ」におけるウシ構築物と同一である。図６Ｂ：図６Ａにおける組換え構築物の各々に先行したタグの配列およびドメイン情報。
【図７】
図７は、マウスＣ５−エピメラーゼ（ｍＣ５）の活性検定結果である。
【図８】
図８は、抗−ＦＬＡＧで染色したウエスタンブロットである。レーン１：分子量標準（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ’ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ、予備染色）。レーン２：マウスＣ５−エピメラーゼ（ｍＣ５）試料。
【図９】
図９は、抗ＦＬＡＧ抗体で染色された異なるタグ化組換えＣ５−エピメラーゼを含有するクローンの安定昆虫細胞株からの培地中のタンパク質のウエスタンブロットである。
Claims (18)
- ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、そのアミノ酸配列が以下の：
（ａ）図３のアミノ酸１〜１１８
（ｂ）図３のアミノ酸１〜１１９
（ｃ）図３のアミノ酸１〜１２０
（ｄ）図３のアミノ酸１〜１２１
（ｅ）図３のアミノ酸１１９〜６１８
（ｆ）図３のアミノ酸１２０〜６１８
（ｇ）図３のアミノ酸１２１〜６１８
（ｈ）図３のアミノ酸１２２〜６１８
（ｉ）図３のアミノ酸３４〜１４７
（ｊ）図３のアミノ酸３５〜１５４
（ｋ）図３のアミノ酸３４〜１５４
（ｌ）図３のアミノ酸１〜１５４
（ｍ）図３のアミノ酸１５５〜６１８および
（ｎ）図３のアミノ酸１〜６１８
から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド。 - ＤＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
- ＲＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
- 異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
- 前記異種ポリヌクレオチドが異種ポリペプチドをコードする、請求項４記載のポリヌクレオチド。
- 前記異種ポリヌクレオチドが前記ヌクレオチド配列の３’に位置する、請求項５記載のポリヌクレオチド。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 前記ポリヌクレオチドが異種調節ポリヌクレオチドに操作可能的に連結される、請求項７記載のベクター。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 前記単離ポリヌクレオチドが異種調節ポリヌクレオチドと操作可能的に連結される、請求項９記載の宿主細胞。
- タンパク質の産生方法であって、前記タンパク質が発現されるような条件下で請求項１０記載の宿主細胞を培養し、そして前記タンパク質を回収することを包含する方法。
- 単離Ｃ５−エピメラーゼポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が以下の：
（ａ）図３のアミノ酸１〜１１８
（ｂ）図３のアミノ酸１〜１１９
（ｃ）図３のアミノ酸１〜１２０
（ｄ）図３のアミノ酸１〜１２１
（ｅ）図３のアミノ酸１１９〜６１８
（ｆ）図３のアミノ酸１２０〜６１８
（ｇ）図３のアミノ酸１２１〜６１８
（ｈ）図３のアミノ酸１２２〜６１８
（ｉ）図３のアミノ酸３４〜１４７
（ｊ）図３のアミノ酸３５〜１５４
（ｋ）図３のアミノ酸３４〜１５４
（ｌ）図３のアミノ酸１〜１５４
（ｍ）図３のアミノ酸１５５〜６１８および
（ｎ）図３のアミノ酸１〜６１８
から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一である単離ポリペプチド。 - 組換え宿主細胞中で産生されまたは含有される、請求項１２記載の単離ポリペプチド。
- 前記組換え宿主細胞が昆虫細胞である、請求項１３記載の単離ポリペプチド。
- Ｃ５−エピメラーゼの活性の増大方法であって、以下の：
（ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一次ポリヌクレオチドであって、そのアミノ酸配列が図３のアミノ酸３５〜１５４および図３のアミノ酸３４〜１５４から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチドを提供し；
（ｂ）（ａ）の前記一次ポリヌクレオチドをＣ５−エピメラーゼをコードする二次ポリヌクレオチドに結合し；そして
（ｃ）融合ポリヌクレオチドを発現する
ことを包含する方法。 - 前記一次ポリヌクレオチドがポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、そのアミノ酸配列が図３のアミノ酸３５〜１５４である、請求項１５記載の方法。
- 前記一次ポリヌクレオチドがポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、そのアミノ酸配列が図３のアミノ酸３４〜１５４である、請求項１５記載の方法。
- Ｃ５−エピメラーゼをコードする前記二次ポリヌクレオチドがウシＣ５−エピメラーゼをコードする、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
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