CZ20031809A3 - Glukuronyl-C5-epimeráza, DNA ji kódující a způsob jejího použití - Google Patents
Glukuronyl-C5-epimeráza, DNA ji kódující a způsob jejího použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20031809A3 CZ20031809A3 CZ20031809A CZ20031809A CZ20031809A3 CZ 20031809 A3 CZ20031809 A3 CZ 20031809A3 CZ 20031809 A CZ20031809 A CZ 20031809A CZ 20031809 A CZ20031809 A CZ 20031809A CZ 20031809 A3 CZ20031809 A3 CZ 20031809A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- epimerase
- polynucleotide
- sequence
- polypeptide
- protein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 79
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 123
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 117
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 114
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 113
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 97
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 96
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 84
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 84
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 84
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 50
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 50
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 15
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 46
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 41
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 38
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 abstract description 23
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 abstract description 23
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 18
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 92
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 90
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 87
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 85
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 30
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 23
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 10
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 10
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 4
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N l-iduronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N 0.000 description 4
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 3
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 241000203353 Methanococcus Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010026719 Chondroitin Lyases Proteins 0.000 description 2
- 108010023736 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000011413 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- PSLCKQYQNVNTQI-BHFSHLQUSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O PSLCKQYQNVNTQI-BHFSHLQUSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-KLVWXMOXSA-N (2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5-tetrahydroxy-6-oxohexanoic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-KLVWXMOXSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000018963 Chondroitin Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102100028697 D-glucuronyl C5-epimerase Human genes 0.000 description 1
- 101710201144 D-glucuronyl C5-epimerase Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 230000010556 Heparin Binding Activity Effects 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 102000003705 Syndecan-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000058 Syndecan-1 Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009858 acid secretion Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012866 crystallographic experiment Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000005222 photoaffinity labeling Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108010004131 poly(beta-D-mannuronate) lyase Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
- C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
- C12Y501/03012—UDP-glucuronate 5'-epimerase (5.1.3.12)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Position Input By Displaying (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Glukuronyl-C5-epimeráza, DNA ji kódující a způsob jejího použití
Oblast techniky
Předložený vynález se týká rekombinantních proteinů, zejména pak glukuronyl-C5-epimeráz a jejich použití pro modifikaci glukosaminglykanů.
Dosavadní stav techniky
Glukuronyl-C5-epimeráza (dále „C5-epimeráza“) katalyzuje přeměnu D-glukuronové kyseliny (GIcA) na L-iduronovou kyselinu (IdoA) v druhém kroku modifikace polymeru při heparinové/heparinsulfátové (HS) syntéze. Epimeráza podílející se na heparinové/HS syntéze bezpodmínečně vyžaduje /V-sulfát na neredukující straně cílové HexA, jejíž tvorba je katalyzována /V-deacetylázou-/Vsulfotransferázou (NDST) v prvním (předcházejícím) kroku biosyntetické modifikace polymeru. Epimeráza je také inhibována O-sulfátovými skupinami blízko svého místa účinku a to tak, že pozdější O-sulfatační kroky při biosyntetické dráze heparinu inhibují epimerizaci nebo zpětnou epimerizaci. Reakce zahrnuje reverzibilní odejmutí a readici protonu v poloze C5 cílové hexuronové kyseliny přes karbanionový meziprodukt a předpokládá se, že na tomto mechanizmu se podílejí dvě polyprotické základní aminokyseliny (zejména Lys).
C5-epimeráza, stejně tak jako další enzymy podílející se na heparinové/HS biosyntéze je vázána k membráně nebo asociována s Golgiho aparátem. Rozpuštěná epimeráza katalyzuje obě (reverzibilní) reakce, ale zpětná epimerizace nebyla u mikrosomálních frakcí detegována. Aktivní protein C5-epimerázy byl nejdříve purifikován a charakterizován z jater (Campbell et a/., J. Biol. Chem. 269:26953-26958 (1994)).
Campbell, P. et al. publikovali purifikací D-glukuronyl-C5-epimerázy z hovězích jater (Campbell et al., J. Biol. Chem. 269:26953-26958 (1994)) a dále bylo publikováno několik DNA-sekvencí. Ikdyž předpokládaná velikost hovězí
C5-epimerázy zgenomové sekvence a cDNA-sekvencí je 70,1 KD (618
-2aminokyselin) (viz níže), nejlépe purifikovaný nativní preparát extrahovaný shora uvedeným způsobem měl převážně 52 a 20 kDa, což znamená, že může docházet k proteolytickému štěpení (úpravě). Detegováním aktivity frakcí o větších mol. hmotnostnech (200 kDa) při gelové chromatografií se ukázalo, že by mohlo docházet k agregaci nebo oligomerizaci. Enzym je aktivní v širokém rozmezí pH (6,5-7,5), přičemž optimum je 7,4. Enzym nevyžaduje ion kovu nebo jiný kofaktor. Podle kinetických studií se vzrůstající koncentrací enzymu vzrůstá hodnota Km, což pravděpodobně souvisí s polymerním substrátem a prostorovou bariérou, a/nebo oligomerizaci molekul epimerázy.
Nedávno Lindahl U. a Li, J-P., W098/480006, purifikovali 52 kDa C5-epimerázu z hovězích jater a získali částečnou aminokyselinovou sekvenci. Primery byly připraveny oproti vnitřní sekvenci a používány k amplifikaci sekvence z cDNA-preparátu z hovězích jater. Sekvence z hovězích jater sloužila ke screeningu hovězí plicní knihovny cDNA. Byla nalezena sekvence mající otevřený čtecí rámec z 444 aminokyselin, která odpovídala polypeptidu o 49,9 kDa. Bylo konstatováno, že enzym dříve izolovaný z hovězích jater, byl zkrácenou verzí nativního proteinu. Byla analyzována celková RNA mastocytomu z hovězích jater a plic a myšího mastocytomu hybridizací s cDNA-klonem hovězí plicní epimerázy. S RNA z hovězích plic i jater bylo dosaženo stejných výsledků, přičemž dominantní transkript měl pás 9kb a slabý pás 5 kb. RNA z myšího mastocytomu měla pouze transkript při 5 kb.
V publikaci Li et al. J. Bio!. Chem. 272: 28158-28163 (1997) bylo také zmíněno klonování cDNA kódující hovězí plicní C5-epimerázu. Li et al. klonovali a exprimovali hovězí plicní epimerázu v systému bakulovirovus/hmyzí buňky, čímž se poprvé určila aktivita klonované (rekombínantní) sekvence. Aktivní rekombinantní protein nebyl ke konečnému určení purifikován.
Byly publikovány cDNA-sekvence C5-epimerázy z Drosophila (GenBank Accession Number AAF57373), C. elegans (GenBank Accession Number P46555) a Methanococcus (GenBank Accession Number U67555).
Enzymatická aktivita rekombinantní hovězí epimerázy publikovaná Lindahlem et al. byla relativně nízká. Nicméně pokusy exprimovat hovězí plicní
-3C5-epimerázu, což je jedinná klonovaná savčí epimeráza, v systémech, ve kterých by byla možná lepší produkce, selhaly. Byly učiněny pokusy o expresi v savčích buňkách, Saccharomyces cerevisiae a E. coli. Do dneška nebyla publikována žádná úspěšná produkce rozpustné, aktivní C5-epimerázy. Tudíž nebylo možné rozšířit výsledky dosažené s prvotním systémem bakulovirus/hmyzí buňky na další rekombinantní systémy nebo nebylo možné použít standardní metody exprese, např. savčí, kvasinkové nebo bakteriální systémy, pro expresi tohoto enzymu.
Tudíž zde existuje potřeba po vysoce aktivní C5-epimeráze a způsobech její přípravy ve větších množství.
Podstata vynálezu
Kvůli problémům při expresi rekombinantních epimeráz savčího původu a díky potřebě mít použitelný způsob exprese a produkce použitelných množství C5-epimerázy, zaměřili se vynálezci na výzkum způsobů produkce rekombinantní C5-epimerázy. Studie vyvrcholily objevem nového myšího genu a jím kódovaného myšího C5-epimerázového proteinu. Myší C5-epimeráza podle předloženého vynálezu je kromě jiného unikátní tím, že v porovnání se sekvencí C5-epimerázového proteinu podle dosavadní techniky obsahuje další sekvence na svém N-konci. Bylo překvapivě zjištěno, že fúze N-koncového fragmentu z myší C5-epimerázy, nebo její zkrácené verze, s N-koncem jiných C5-epimeráz velmi zvyšuje aktivitu této vzniklé rekombinantní C5-epimerázy o několik řádů. Tudíž prodloužení o myší N-koncový fragment může být používáno k usnadnění exprese sekvencí, které jsou k němu proveditelně připojené, a zejména pak k expresi nativních (z myších jater) a heterologních (nemyších i myších nehepatických) forem
C5-epimeráz v rekombinantních systémech.
V prvním provedení se předložený vynález týká purifikovaných a/nebo izolovaných polynukleotidů kódujících myší jaterní C5-epimerázu a rekombinantních vektorů a hostitelů pro jejich přechovávání a expresi.
-4• ···· ·· ·· ·· ···· • · · · · · · · * · • · ·· ···· · · · • ··· ······ · · • · · · ·····
V dalším provedení se předložený vynález týká purifikovaného a/nebo izolovaného C5-epimerázového proteinu z myších jater kódovaného takovými polynukleotidy, nebo preparátů ho obsahujících.
V dalším provedení se předložený vynález týká způsobů produkce myší C5-epimerázy pomocí polynukleotidů a rekombinantních vektorů a hostitelů podle předloženého vynálezu za účelem její exprese.
V dalším provedení se předložený vynález týká polynukleotidů, zejména purifikovaných a/nebo izolovaných polynukleotidů, kódujících fúzní protein, kde takový fúzní protein obsahující N-koncovou sekvenci myší C5-epimerázy je v rámci proveditelně připojen k aminokyselinové sekvenci požadovaného proteinu, a zejména pak sekvenci heterologní C5-epimerázy, a vektorů a hostitelů pro přechovávání a expresi takových polynukleotidů.
V dalším provedení se předložený vynález týká purifikovaného a/nebo izolovaného C5-epimerázového fúzního proteinu kódovaného takovými polynukleotidy.
V dalším provedení se předložený vynález týká způsobů produkce požadovaného proteinu pomocí proveditelného připojení polynukleotidů, který kóduje myší C5-epimerázu, nebo její N-koncovou sekvenci, k polynukleotidů, který kóduje požadovaný protein, a jeho expresi v rekombinantním hostiteli podle předloženého vynálezu.
V dalším provedení se předložený vynález týká polynukleotidových sekvencí a vektorů, které poskytují polynukleotidy kódující polynukleotidovou sekvenci N-koncového fragmentu myší C5-epimerázy, např. polynukleotidy a vektory mající požadovaná restrikční místa na 3'-konci fragmentu pro inzerci (připojení) požadované sekvence do těchto míst, zejména pak sekvence, která kóduje požadovaný protein, a nejvýhodněji další epimerázovou sekvenci.
V dalším provedení se předložený vynález týká způsobů použití N-koncové sekvence z myší C5-epimerázy pro expresi nativních a heterologních sekvencí k ní připojených.
• 4 44 4 ·· · · ··
4 4 4 4 4 4 · • ··· 4 4 4 · * • 4 4 4 444444 • · · · · · ······ 4· 44 44
-5Stručný přehled obrázků
Obrázek 1. DNA-sekvence fúzního proteinu majícího sekvenci hovězí C5-epimerázy (netučně) a N-konce myší C5-epimerázy (tučně). Otevřený čtecí rámec (ORF) ukazující sekvenci, která kóduje polypeptid, je podtržen.
Obrázek 2. Kompletní DNA-sekvence myší C5-epimerázy.
Obrázek 3. Kompletní aminokyselinová sekvence myší C5-epimerázy.
Obrázek 4. Srovnávací analýza myší C5-epimerázy s dalšími sekvencemi ukazující oblasti homologie. Skóre jsou uvedena nahoře a ve sloupci následujícím po původu sekvence. Sekvence mají následující původ: řádek 2: myší játra; řádek 3: hovězí plíce; řádek 4: lidská EST; řádek 5: Drosophila; řádek 6: C. elegans; řádek 7: Methanococcus.
Obrázek 5. Grafické znázornění struktury domény myší C5-epimerázy. Plný obdélník na N-konci: signální sekvence (vysoce hydrofóbní transmembránová (TM) sekvence); šrafované obdélníky: hydrofóbní transmembrána (TM) nebo skryté sekvence; plné obdélníky v peptidu: konzervované peptidové sekvence mající více než 50% podobnost s 71,9 KD hypotetickým proteinem z C. elegans.
Obrázek 6A-6B. Obrázek 6A: Grafické znázornění produktů značených konstruktů rekombinantní (hovězích) C5-epimerázy. i: první aktivní značený rekombinantní (hovězí) konstrukt Specifická aktivita byla 5 x 10 5 cpm/mg/h). ii: nejaktivnější rekombinantní (kompletně myší) C5 konstrukt. Specifická aktivita byla 2x109 cpm/mg/h. iii: chimérický konstrukt mající myší i hovězí sekvence. Aktivita byla 87% aktivity kompletní myší sekvence, iv: zkrácený myší konstrukt. Aktivita je stejná jako hovězí konstrukt v bodě „i“. Obrázek 6B: Informace o sekvenci a doméně značky, která předchází každému z rekombinantních konstruktů na obrázku 6A.
-6···· • · ·
Obrázek 7. Výsledky z testů aktivity myší C5-epimerázy (mC5).
Obrázek 8. Western blotting s anti-FLAG. Řádek 1: standary molekulových hmotností (New England Biolab's Broad Range, předem značené). Řádek 2: vzorek myší C5-epimerázy (mC5).
Obrázek 9. Western blotting s proteiny v médiu z klonů linií stálých hmyzích buněk obsahující různě značené rekombinantní C5-epimerázy odbarvené protilátkou proti anti-FLAG.
Podrobný popis výhodných provedení
Byl klonován gen z myších jater kódující C5-epimerázu. Nukleotidová sekvence je uvedena na obrázku 2. Bylo zjištěno, že aminokyselinová sekvence C5-epimerázového proteinu z myších jater má 618 aminokyselin (obrázek 3), molekulovou hmotnost 71180,1 daltonů (71,18 kDa). Myší C5-epimeráza má izoelektrický bod 8,25 a výsledný náboj při pH 7 +4,01.
Aminokyselinová sekvence z C5-epimerázové sekvence z myších jater je bez jakékoliv N-koncové extenze homologní (>96% shoda aminokyselin) se sekvencí z hovězí C5-epimerázy. Nicméně sekvenční analýza odhalila, že N-konec enzymu, který je kódován myší genomickou sekvencí obsahoval dalších 154 aminokyselin (aa), jenž scházeli u klonované hovězí sekvence.
Myší kódující sekvence vykazovala > 95% shoda peptidů s odpovídajícími hovězími a lidskými (exprimovaná sekvenční značka z mozkové cDNA-knihovny) sekvencemi, > 50% podobnost s hypotetickým 71,9 kDa proteinem z exprimované sekvence C.elegans a 38% podobnost s proteinem z exprimované sekvence z Methanococcus sp.
Předpokládaná transmembránová topologie (grafické znázornění hydrofobicity) myší C5-epimerázy se podobá NDST. Tato a další pozorování (např. rychlost syntézy heparinu) ukazovaly, že C5-epimeráza a další enzymy heparinové biosyntézy jsou pravděpodobně spojeny v in vivo komplexu.
• · ··· ·
-7• 9999 99 99 · · 9 9 9 9 9 9 9
999 · ·· · · · · • · · · ······ · · • 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 99 9 9 99 99
Rekombinantí myší C5-epimeráza, jak je exprimována a sekretována na signál z hmyzích buněk ze systému bakulovirus/hmyzí buňky, je nejstabilnější v médiu při teplotě 4°C. Purifikace rekombinantní C5-epimerázy může zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, takové procesy jako katexovou a afinitní chromatografií. Rekombinantní protein může být zkonstruován např. takovým způsobem, aby obsahoval FLAG-značku nebo His-značku, jenž se vyskytuje také na konci rekombinantního proteinu. Jak jistě odborník v oboru v takových případech ocení, může být rekombinantní protein purifikován na komerčně dostupných pryskyřicích, které využívají například monoklonální protilátky anti-FLAG k zachycení rekombinantního proteinu obsahujícího FLAG-epitop.
Enzym se nejrychleji stanoví bifázickou extrakcí tritia uvolňovaného z C5-značeného substrátu do organického scintilačního koktajlu a změřením této aktivity, ačkoliv konečný výsledek, jak je popsáno v příkladech, je získán NMR analýzou konvertovaného produktu.
Nativní enzym z myších jater měl specifickou aktivitu 5-10 X 109 cpm/mg/h, zatímco specifická aktivita rekombinantní formy myšího enzymu byla 2 X 109 cpm/mg/h. Pro srovnání, rekombinantní hovězí enzym má specifickou aktivitu 0,51,0 X 106 cpm/mg/h. Tudíž rekombinantní myší enzym je velmi aktivní C5-epimeráza.
Překvapivě bylo zjištěno, že 154 aminokyselinový N-konec myší C5-epimerázy, a zejména pak určité jeho fragmenty, má schopnost velmi ochotně zvyšovat enzymatickou aktivitu C5-epimerázy jiných C5-epimeráz, pokud jsou kondezovány v rámci s jejím N-koncem. Zdá se, že tento další 154 aminokyselinový fragment (aa) má alespoň tři charakteristické rysy, které jsou žádoucí pro rekombinantní expresi a sekreci aktivní C5-epimerázy. První charakteristický rys zahrnuje sekvenci, která nejspíš funguje jako signální sekvence složená z prvních 33 až 34 zbytků (aminokyseliny 1 až 33 nebo 1 až 34 z obrázku 3). Druhý charakteristický rys spočívá v přítomnosti dalších cysteinových zbytků, které jsou odpovědné za tvorbu disulfidových můstků a stabilizaci sekundární struktury proteinu. Třetí charakteristický rys spočívá v místě
-8«444 4 4 44 «444
444 4 44 4
444 4 444
4 4 4
4 4·· · amidace, které je shodné s místem použitelným k posttranslační proteolytické úpravě.
Fragmenty z 154 aminokyselinové sekvence, které nemají signální sekvenci, si zachovávají schopnost zvyšovat aktivitu heterologních epimeráz, zejména pak C5-epimeráz, ke kterým jsou proveditelně připojeny. Například, jak je uvedeno v příkladech, fúzní protein, který obsahoval aminokyseliny 34 až 154 přímo připojené v rámci s N-koncem hovězí C5-epimerázy, zvyšoval aktivitu hovězí C5-epimerázy stonásobně.
Molekuly nukleové kyseliny
Předložený vynález se týká izolovaných molekul nukleové kyseliny sestávajících z:
(1) polynukleotidu kódujícího C5-epimerázový polypeptid z myších jater mající amonikyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 3.
(2) polynukleotid kódující použitelné fragmenty C5-epimerázového polypeptidu z myších jater mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 3, kde tyto použitelné fragmenty, zahrnují, ale není to nikterak limitováno, (a) fragmenty, které poskytují signální sekvenci aminokyselin 1 až 33 nebo 1 až 34; (b) fragmenty, které poskytují mateřskou sekvenci C5-epimerázového proteinu z myších jater, a zejména pak aminokyseliny 33 až 618 nebo 34 až 618, a (c) fragmenty, které poskytují sekvenci N-koncového fragmentu stimulující aktivitu, která obsahuje aminokyseliny 1 až 154, a včetně jejich fragmentů, např. aminokyseliny 33 až 154 nebo 34 až 154, které mají schopnost zvyšovat aktivitu jiných C5-epimeráz, ke kterým jsou proveditelně připojeny.
Není-li uvedeno jinak, všechny uvedené nukleotidové sekvence stanovené sekvenováním molekuly DNA byly určeny podle způsobů popsaných v příkladech a dále všechny uvedené aminokyselinové sekvence polypeptidů kódovaných molekulami DNA byly predikovány translací shora určené DNA-sekvence. Kterákoliv nukleotidová sekvence může obsahovat chyby. Automaticky určené nukleotidové sekvence jsou typicky alespoň z 90% shodné, typičtěji alespoň z 95% až 99,9% shodné, se skutečnou nukleotidovou sekvencí sekvenované • ·
-9·♦·· ·· • ······ 9
9 9 9999 99 9
999 999999 9 9
9 9 · 9 · · · ·· ·· ·· ·· molekuly DNA. Skutečná sekvence může být určena přesněji jinými způsoby, včetně manuálních sekvenční metod DNA, které jsou v oboru dobře známy. Dále se ví, že prostá inzerce nebo delece v určené nukleotidové sekvenci v porovnání se skutečnou sekvencí bude způsobovat posun čtecího rámce v translaci nukleotidové sekvence takovým způsobem, že předpokládaná aminokyselinová sekvence kódovaná určenou nukleotidovou sekvencí bude od místa této inzerce nebo delece zcela jiná než aminokyselinová sekvence skutečně kódovaná sekvenovanou molekulou DNA.
Termín „nukleotidové sekvence“ molekuly nukleové kyseliny nebo polynukleotidu zahrnuje molekulu DNA nebo polynukleotid, sekvencí deoxyribonukleotidů, molekulu RNA nebo polynukleotid, odpovídající sekvenci ribonukleotidů (A, G, C a U), kde každý thymidinový deoxyribonukleotid (T) ve specifikované deoxyribonukleotidové sekvenci je nahrazen uridinovým ribonukleotidem (U).
Podle informací uvedených v předloženém vynálezu, např. nukleotidové sekvence uvedená na obrázcích a dat ze sekvenční analýzy, může být molekula nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu kódující C5-epimerázový polypeptid, nebo jeho chimérický konstrukt, získána standardními metodami klonování a screeningu, např. metodami pro klonování cDNA pomocí mRNA jako výchozího materiálu. Názorným příkladem předloženého vynálezu je molekula nukleové kyseliny C5-epimerázy popsaná na obrázcích 2 a 3, která byla objevena v cDNA-knihovně získané z myší hepatické (jaterní) tkáně.
Určená nukleotidové sekvence DNA C5-epimerázy z obrázku 2 obsahuje otevřený čtecí rámec kódující protein o 618 aminokyselinových zbytcích, kde iniciační kodon v nukleotidové pozici 1 nukleotidových sekvencí je rovněž uveden na obrázku 2.
Jak jistě odborník v oboru ocení, díky možnosti sekvenční chyb popisovaných výše, může být skutečný kompletní C5-epimerázový polypeptid kódovaný sekvencí z obrázku 2, který zahrnuje 618 aminokyselin uvedených na obrázku 3, někdy delší nebo kratší. Nicméně v každém případě, jak je uvedeno níže, poskytuje předložený vynález polypeptidy mající různé zbytky vynechané
-10·· ♦ ·· · ·««· ·<
• · ··· · · · · · · 9
9 9 9 999 9 9 · · • ·· · · · · · • 0« · · 9 · 9 9 99 z N-konce nebo C-konce kompletního polypeptidu, včetně polypeptidů postrádajících jednu nebo více aminokyselin z N-konce nebo C-konce zde popsané extracelulární domény.
Molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu kódují signální sekvenci C5-epimerázy uvedenou na obrázku 3, což jsou aminokyseliny 1 až 33 nebo aminokyseliny 1 až 34 z aminokyselinové sekvence uvedené na obrázku 3. Tyto molekuly mohou být proveditelně připojeny v rámci k jakékoliv požadované nukleotidové sekvenci, zejména pak molekuly, které kódují žádaný protein, jenž je třeba sekretovat z hostitele schopného secrece takové signální sekvence C5-epimerázy.
Dále molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu kódují C5-epimerázovou sekvenci z myších jater „zvyšující heterologní aktivitu“, což jsou aminokyseliny 1 až 154, nebo alespoň 30 aminokyselin z nich, jenž jsou uvedeny na obrázku 3. Termín „heterologní“ nukleová kyselina, jak je známo odborníkům v oboru, znamená nukleovou kyselinou odvozenou od nukleové kyseliny různých druhů. Výhodně takové molekuly nukleové kyseliny kódují aminokyseliny 1 až 154, 33 až 154 nebo 34 až 154 z obrázku 3, bez nebo s 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 aminokyselinami buď z jednoho nebo obou konců. Nukleová kyselina kódující takový polypeptid může být proveditelně připojena v rámci ke kódující sekvenci pro další epimerázu, zejména pak další C5-epimerázy, s tím, že fúzní protein je kódován konstruktem nukleové kyseliny. Ve výhodném provedení jsou sekvence zvyšující heterologní aktivitu exprimovány na N-konci fúzního proteinu a jsou připojeny k N-konci dalšího proteinu, jehož aktivita je zvýšena přítomností myší sekvence, nejlépe nemyší C5-epimeráza nebo izozym myší C5-epimerázy.
Jak je uvedeno, mohou být molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu ve formě RNA, např. mRNA, nebo ve formě DNA, včetně např. cDNA a genomické DNA získané klonováním nebo připravené synteticky. DNA může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová. Jednořetězcová DNA nebo RNA může být kódující DNA-řetězec, také znám jako DNA-řetězec mající smysl, nebo může být nekódující DNA-řetězec, také označovaný jako kódující DNA-řetězec.
• · · · · ·
-11 • ·«·· «ΜΙ ·· • · · · · · · · · · • · ·« · · · · · · · • · « « ·«·«·« · · • · · · · ♦ · · · ··· ·« ·· ·· ·· ··
Termín „izolovaná“ molekula(y) nukleové kyseliny zahrnuje molekulu nukleové kyseliny, DNA nebo RNA, která byla odstraněna ze svého přirozeného prostředí. Pro účely předloženého vynálezu, jsou např. molekuly rekombinantní DNA obsažené ve vektoru izolovány. Další příklady izolovaných molekul DNA zahrnují molekuly rekombinantní DNA přechovávané v heterologních hostitelských buňkách nebo purifikované molekuly DNA (částeně nebo podstatně) v roztoku. Izolované molekuly RNA zahrnují in vivo nebo in vitro RNA transkripty molekul DNA podle předloženého vynálezu. Izolované molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu dále zahrnují molekuly nukleové kyseliny připravené syntetickým způsobem.
Izolované molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu zahrnují molekuly DNA obsahující otevřený čtecí rámec (ORF), který kóduje C5-epimerázový protein nebo fúzní protein podle předloženého vynálezu. Molekuly DNA, které obsahují kódující sekvenci pro C5-epimerázový protein z obrázku 2, nebo její požadované fragmenty, a molekuly DNA, které v důsledku degenerace genetického kódu obsahují sekvence podstatně odlišné od sekvencí popsaných výše, stále kódují aminokyselinovou sekvenci C5-epimerázového proteinu z obrázku 3. Genetický kód jako takový je v oboru dobře znám. Tudíž by mělo být pro odborníka v oboru rutinou vytvořit takové degenerované varianty. V dalším provedeni zahrnují molekuly nukleové kyseliny takové molekuly, které kódují shora popsaný C5-epimerázový polypeptid, ale postrádají N-koncový methionin, nebo signální sekvenci kódovanou aminokyselinami 1 až 33 nebo 1 až 34 z obrázku 3, nebo které mají kódující sekvence z různých (heterologních) signálních sekvencí na sebe proveditelně připojené.
Předložený vynález dále poskytuje kromě shora popsaných molekul nukleové kyseliny, také molekuly nukleové kyseliny mající sekvence komplementární k výše uvedeným sekvencím. Tyto izolované molekuly, zejména molekuly DNA, jsou použitelné jako sondy pro genové mapování in šitu hybridizací s chromosomy a pro detekci exprese genu C5-epimerázy v různých species a tkáních, např. Northern blotting.
• · · * · ·
-12• ·*·· ·* »* ··· · · « · ·· · • · · » « « · 9 · · · • » · · ··««·« · · • ··· · » · · · ······ ·· ·· «· ··
Předložený vynález se dále týká fragmentů izolovaných molekul zde popsané nukleové kyseliny, které se uchovávají požadované vlastnosti, nebo které kódují polypeptid, jenž si zachovává požadované vlastnosti nebo aktivitu. Termín „fragment“ izolované, shora popsané molekuly nukleové kyseliny zahrnuje fragmenty o délce alespoň 15 nukleotidů (nt), výhodněji alespoň 20 nt, ještě výhodněji alespoň 30 nt, a ještě výhodněji alespoň 40 nt, které jsou použitelné jako popsané diagnostické sondy a primery, nebo které poskytují požadovaný motiv nebo domény pro konstrukt fúzního proteinu. Samozřejmě, že větší fragmenty o velikosti 50 až 300 nt, nebo o 600 nt, jsou také podle předloženého vynálezu stejně tak použitelné jako fragmenty odpovídající většině fragmentům, pokud ne všem, z nukleotidové sekvence DNA uvedené na obrázku 2 nebo kódující aminokyselinové sekvence z obrázku 3. Termín fragment o velikosti alespoň 20 nt, pokud je srovnán např. s fragmentem z obrázku 2, zahrnuje fragmenty, které obsahují 20 nebo více za sebou jdoucích bází nukleotidové sekvence z nukleotidové sekvence uvedené na obrázku 2.
Zejména se předložený vynález týká polynukleotidů majících nukleotidovou sekvenci reprezentující část uvedenou na obrázku 2 nebo kódujících aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 3. Patří sem také polynukleotidy kódující C5-epimerázový polypeptid, postrádající amino-koncový methionin. Rovněž sem patří také polypeptidy kódované takovými polynukleotidy, např. polypeptidy, které obsahují aminokyselinovou sekvenci v polohách 2 až 618 aminokyselinové sekvence na obrázku 3, ale postrádají amino-koncový methionin.
V dalším apektu poskytuje předložený vynález izolovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující polynukleotid, který hybridizuje za striktních hybridizačních podmínek s částí polynukleotidu nebo výhodně s celým polynukleotidem ve shora popsané molekule nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu. Částí se rozumí jakákoliv požadovaná část, např. polynukleotid z obrázku 2, který kóduje aminokyseliny 1 až 154 nebo 33 až 154 nebo 34-154. Termín „striktní hybridizační podmínky“ zahrnuje inkubaci při teplotě 42°C přes noc v roztoku obsahujícím 50% formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM trojsodnou sůl citrátu), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtův • * · • 999 ** 99 • · · * • * 9 9
9 99 »
9 9
9 «»·
-13roztok, 10% sulfát dextranu a 20 pg/ml denaturované, rozštěpené DNA lososího spermatu a následně promytí filtrů v 0,1 x SSC při teplotě 65°C.
Termín polynukleotid, který hybridizuje s „částí“ polynukleotidu, zahrnuje polynukleotid (buď DNA nebo RNA) hybridizující alespoň s 15 nukleotidy (nt), výhodněji alespoň s 20 nt, ještě výhodněji s 30 nt, a ještě výhodněji s 30 až 70 (např. 50) nt referenčního polynukleotidu. Tyto polynukleotidy jsou použitelné jako diagnostické sondy a primery, jak je uvedeno výše a v detailech i níže.
Termín část polynukleotidu „o délce alespoň 20 nt“ zahrnuje např. 20 nebo více za sebou jdoucích nukleotidů z nukleotidové sekvence referenčního polynukleotidu (např. nukleotidová sekvence z obrázku 2). Samozřejmě, že polynukleotid, který hybridizuje pouze s poly(A)-sekvencí, nebo s komplementárním řetězcem T (nebo U) zbytků, by neměl být zahrnut do polynukleotidu podle předloženého vynálezu používaného k hybridizaci s částí nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, poněvadž takový polynukleotid by hybridizoval s jakoukoliv molekulou nukleové kyseliny obsahující poly(A)řetězec nebo její komplement (např. prakticky jakýkoliv klon dvouřetězcové cDNA).
Molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, které kódují C5-epimerázový polypeptid, mohou zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, samotnou kódující sekvenci pro polypeptid (také označovanou jako mateřská C5-epimeráza, pokud postrádá sekreční signál); kódující sekvenci pro polypeptid a další sekvence, např. ty, které kódují vedoucí nebo sekreční sekvenci, např. preproteinová, proproteinová nebo preproproteinová sekvence; kódující sekvence polypeptidu, včetně nebo bez shora uvedených dalších kódujících sekvencí spoleně s dalšími nekódujícími sekvencemi, včetně například, ale není to nikterak limitováno, intronů a nekódujících 5'- a 3'-sekvencí, např. transkribované, nepřeložené sekvence, které mají určitou roli při transkripci, posttranskripční úpravě - včetně sestřihu a polyadenylačních signálů, např. vazba na ribosomy a stabilita mRNA; další kódující sekvence, které kódují další aminokyseliny, např. ty, které poskytují další funkční možnosti. Například polypeptid může být tedy fúzován s markerovou sekvencí, např. peptidem, který usnadňuje purifikaci fúzovaného • rfrfrf* rfrf ** *· rfrfrf ·· · rfrfrfrf * rf • ··· rfrfrfrf rfrf · rf rfrfrfrf rfrfrf « · · rf rfrfrf rfrfrfrf rfrfrf rfrfrf rfrf rfrf rfrf rfrf
- 14(marker obsahujícího) polypeptidu. V určitých výhodných provedeních tohoto aspektu předloženého vynálezu je markerovou sekvencí hexa-histidinový peptid, mimo jiné například značka v pQE vektoru (Qiagen, lne.), kde valná většina je komerčně dostupných. Například Gentz et a/., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 821824 (1989) popisuje hexa-histidiny jako vhodné pro purifikaci fúzního proteinu. Značka „HA“ je další peptid použitelný pro purifikaci, jenž odpovídá epitopu odvozenému od hemaglutininového proteinu chřipkového viru, který byl popsán Wilsonem etal., Cell 37: 767-778 (1984).
Varianty a mutantní polynukleotidy
Předložený vynález se dále týká jednotlivých variant molekul nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, které kódují, části, analoga nebo deriváty C5-epimerázy. Jednotlivé varianty mohou být přirozené, např. přirozená alelická varianta. Termín „alelická varianta“ zahrnuje jednu z několika alternativních forem genu, který obsazuje daný lokus na chromosomu organizmu. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Přirozeně se nevyskytující varianty mohou být připraveny standardními technikami mutageneze.
Takové varianty vznikají substitucí, delecí nebo adicí nukleotidů. Substituce, delece nebo adice se mohou týkat jednoho nebo více nukleotidů. Varianty se mohou lišit v kódujících oblastech, nekódujících oblastech nebo v obou. Alterace v kódujících oblastech mohou vytvářet konzervované nebo nekonzervované aminokyselinové substituce, delece nebo adice. Z nich jsou zejména výhodné tiché substituce, adice a delece, které nemění vlastnosti a aktivitu C5-epimerázového polypeptidu a jeho části. Z tohoto pohledu jsou také velmi výhodné konzervované substituce.
Další provedení předloženého vynálezu zahrnují izolovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, kde jeho aminokyselinová sekvence je alespoň z 80% shodná, výhodněji alespoň z 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99% shodná, s referenční aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající z: (a) aminokyselin 1 až 118 z obrázku 3; (b) aminokyselin 1 až 119 z obrázku 3; (c) aminokyselin 1 až • rf rfrf • · · · · · 4 4 ·· ···· • ······ · • 44 4 44 4 4 4 4 •44 444444 4 4 • 44 4 4444
- 15120 z obrázku 3; (d) aminokyselin 1 až 121 z obrázku 3; (e) aminokyselin 119 až 618 z obrázku 3; (f) aminokyselin 120 až 618 z obrázku 3; (g) aminokyselin 121 až 618 z obrázku 3; (h) aminokyselin 122 až 618 z obrázku 3; (i) aminokyselin 34 až 147 z obrázku 3; (j) aminokyselin 35 až 154 z obrázku 3; (k) aminokyselin 34 až 154 z obrázku 3; (I) aminokyselin 1 až 154 z obrázku 3; (m) kompletní aminokyselinové sekvence z obrázku 3.
Další provedení předloženého vynálezu zahrnují izolované molekuly nukleové kyseliny, které obsahují polynukleotid, který hybridizuje za přísných hybridizačních podmínek s polynukleotidem v bodě (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (0, (j). (k), (I), (m), (n), výše. Tento hybridizující polynukleotid nehybridizuje za přísných hybridizačních podmínek s polynukleotidem majícím nukleotidovou sekvenci skládající se pouze z A-zbytků nebo pouze z T-zbytků.
Termín polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci např. alespoň z 95% „shodnou“ s referenční nukleotidovou sekvencí kódující C5-epimerázový polypeptid zahrnuje nukleotidovou sekvenci polynukleotidu, která je shodná s referenční sekvencí s výjimkou toho, že polynukleotidová sekvence může zahrnovat až pět bodových mutací na každých 100 nukleotidů referenční nukleotidové sekvence kódující C5-epimerázový polypeptid. Jinými slovy získat polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci alespoň z 95% shodnou s referenční nukleotidovou sekvencí znamená, že až 5% nukleotidů v referenční sekvenci může být deletováno nebo substituováno jiným nukleotidem, nebo že až 5% nukleotidů z celkových nukleotidů v referenční sekvenci může být vpraveno do této referenční sekvence. Tyto mutace referenční sekvence se mohou vyskytovat na 5'- nebo 3'-koncových polohách referenční nukleotidové sekvence nebo kdekoliv mezi těmito koncovými polohami, rozptýlené buď individuálně mezi nukleotidy v referenční sekvenci nebo v jedné nebo více za sebou jdoucích skupinách v referenční sekvenci.
Pokud kterákoliv konkrétní molekula nukleové kyseliny je alespoň z 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99% shodná, může být např. nukleotidová sekvence uvedená na obrázku 2 standardně determinována pomocí známých počítačových programů, např. program Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version • · • ·· ·
for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). Program Bestfit využívá algoritmus lokální homologie podle Smithe a Watermana, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981) k nalezení nejlepšího segmentu homologie mezi dvěma sekvencemi. Pokud se používá program Bestfit nebo jakýkoliv jiný program k určení např. 95% shody s referenční sekvencí podle předloženého vynálezu, jsou parametry samozřejmě nastaveny tak, aby procentuální shoda byla vypočtena z celkové délky referenční nukleotidové sekvence, a aby mezery v homologii byly přípustné až do 5% z celkového počtu nukleotidů v referenční sekvenci.
Předložený vynález se týká molekul nukleové kyseliny, které jsou alespoň z 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99% shodné se sekvencí nukleové kyseliny uvedené na obrázku 2 bez ohledu na to, zda kódují polypeptid mající C5-epimerázovou aktivitu. To je proto, že pokud by konkrétní molekula nukleové kyseliny nekódovala polypeptid mající C5-epimerázovou aktivitu, odborník v oboru by měl vědět, jak ji využít, např. jako hybridizační sondu nebo jako primer pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Využití molekul nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, které nekódují polypeptid mající C5-epimerázovou aktivitu, zahrnuje mimo jiné: (i) izolaci genu C5-epimerázy nebo jeho alelických variant v cDNA-knihovně; (2) in šitu hybridizace (např. „FISH“) k metafázi množení chromosomů za účelem získání přesné lokalizace genu C5-epimerázy, jak je popsáno v Verma et a/., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); a Northern blotting za účelem detekce exprese mRNA C5-epimerázy ve specifických tkání.
Nicméně výhodné jsou molekuly nukleové kyseliny mající sekvence alespoň z 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99% shodné se sekvencí nukleové kyseliny na obrázku 2, která ve skutečnosti kóduje polypeptid mající C5-epimerázovou aktivitu. Termín „polypeptid mající C5-epimerázovou aktivitu“ zahrnuje polypeptidy vykazující aktivitu, která je podobná, ale ne nutně shodná, aktivitě C5-epimerázy podle předloženého vynálezu (buď celý protein nebo výhodně identifikovaný aminokyselinový fragment obsahující aminokyseliny 33 až 618 nebo 34 až 618), změřenou v konkrétním biologickém testu.
• · • · · · • ···
-17V důsledku degenerace genetického kódu samozřejmě odborník v oboru okamžitě rozpozná, že větší počet molekul nukleové kyseliny majících sekvence alespoň z 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99% shodné se sekvencí nukleové kyseliny vložené cDNA nebo sekvence nukleové kyseliny uvedené na obrázku 2 bude kódovat polypeptid „mající aktivitu C5-epimerázového proteinu“. Poněvadž ve skutečnosti všechny degenerované varianty těchto nukleotidových sekvencí kódují stejný polypeptid, což je odborníkovi v oboru jasné i bez provedení výše pospaného srovnávacího testu. Dále je z dosavadních poznatků o molekulách nukleové kyseliny, které nejsou degenerovanými variantami, jasné, že přiměřené množství molekul bude kódovat polypeptid mající aktivitu C5-epimerázového proteinu. To je proto, že aminokyselinové substituce, které jsou buď málo pravděpodobné nebo nepravděpodobné, výrazně neovlivňují funkci proteinu (např. nahrazení jedné alifatické aminokyseliny jinou alifatickou aminokyselinou), jak je dále vysvětleno.
Vektory a hostitelské buňky
Předložený vynález se také týká vektorů, které zahrnují izolované molekuly DNA podle předloženého vynálezu, hostitelských buněk, které jsou genově manipulovány s rekombinantními vektory podle předloženého vynálezu, a produkce C5-epimerázového polypeptidu nebo jeho fragmentů rekombinantními technikami.
Polynukleotidy mohou být spojeny s vektorem obsahujícím markér pro propagaci v hostiteli. Obecně plazmidový vektor je zaváděn v precipitátu, např. precipitát fosforečnanu vápenatého, nebo v komplexu s nabitým lipidem. Pokud je vektor virus, může být zapouzdřen in vitro pomocí vhodné zapouzdřovací buněčné linie a následně transdukován do hostiteských buněk.
DNA-inzert by měl být operativně připojen k vhodnému promotoru, např. fágový lambda PL promotor, E. coli lac, trp a tac promotéry, SV40 časné a pozdní promotory a promotory retrovirové LTR. Další vhodné promotory jsou odborníkům v oboru jistě známy. Expresívní konstrukty budou dále obsahovat místa pro iniciaci transkripce, terminaci a v transkribované oblasti místo k navázání na ribosom pro • · · · • ·
-18translaci. Kódující část mateřských transkriptů exprimovaných konstrukty bude výhodně zahrnovat translaci iniciovanou na začátku a terminačním kodon (UAA, UGA nebo UAG) vhodně umístněný na konci polypeptidu, který má být přeložen.
Jak je uvedeno, expresívní vektory budou výhodně zahrnovat alespoň jeden volitelný markér. Tyto markéry zahrnují dihydrofolátreduktázu nebo nyomycin-rezistentní eukaryotické buněčné kultury a tetracyklin- a ampicilinrezistentní geny nebo pro kultivaci v E. coli a dalších bakteriích. Reprezentativní příklady vhodných hostitelů zahrnují, ale není to nikterak limitováno, bakteriální buňky, např. E. coli, Corynebacterium, Streptomyces a Salmonella typhimurium; fungální buňky, např. Aspergillus, Aspergillus niger nebo Trichoderma, nebo kvasinkové buňky, např. Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae·, hmyzí buňky, např. Drosophila S2 a Spodoptera sf9; zvířecí buňky, např. buňky CHO, COS a Bowesovy buňky melanomu; a rostlinné buňky. Preferovaní hostitelé zahrnují hmyzí buňky. Vhodná kultivační média a podmínky pro shora uvedené hostitelské buňky jsou v oboru známa.
Mezi výhodné vektory pro použití v bakteriích patří pQE70, pQE60 a pQE-9 ke koupi u Qiagen; pBS vektory, Phagescript vektory, Bluescript vektory, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ke koupi u Stratagene; a ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 ke koupi u Pharmacie. Mezi výhodné eukaryotické vektory patří pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 a pSG ke koupi u Stratagene; a pSVK3, pBPV, pMSG a pSVL ke koupi u Pharmacie. Virové vektory zahrnují, ale není to nikterak limitováno, retrovirové vektory, poxvirové vektory, včetně vakciniových a adenovirových vektorů. Další vhodné vektory budou odborníkovi v oboru jistě patrné.
Zavedení konstruktu do hostitelské buňky může být ovlivněno transfekci fosforečnanem vápenatým, transfekci zprostředkovanou DEAE-dextranem, transfekci zprostředkovanou kationaktivním lipidem, elektroporací, transdukci, infekcí nebo jinými metodami, které jsou popsány v mnoha standardních laboratorních manuálech, např. Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).
• · ····
| * | • · · · |
| • · | • |
| • | ··· |
| • | • |
| • | • |
Polypeptidy a fragmenty
Předložený vynález dále poskytuje izolovaný nebo purifikovaný C5-epimerázový polypeptid mající aminokyselinové sekvence kódované aminokyselinovými sekvencemi z obrázku 3 nebo peptid nebo polypeptid obsahující část z polypeptidu výše, zejména pak shora popsaný a kódovaný shora popsanou molekulou nukleové kyseliny.
Předložený vynález dále poskytuje fúzní proteiny obsahující funkční část z N-konce myší C5-epimerázy fúzovanou na svém C-konci s N-koncem požadovaného proteinu, např. signální sekvence aminokyselin 1 až 33 nebo 1 až 34 z obrázku 3 nebo sekvence aminokyselin 1 až 154, 33 až 154 nebo 34 až 154 z obrázku 3 zvyšující aktivitu. V rámci jednoho provedení je požadovaný protein fúzován s částí N-konce, která obsahuje 30 až 154 aminokyselin N-konce myší C5-epimerázy z obrázku 3, zejména pak aminokyselin 33 až 154 nebo 34 až 154. V rámci dalšího provedení je požadovaný protein fúzován s částí N-konce, který obsahuje zbytky 33 až 154 ze sekvence uvedené na obrázku 3. Ve velmi výhodném provedení je požadovaný protein fúzován s funkční částí N-konce, která obsahuje sekreční signál aminokyselin 1 až 33 nebo 1 až 34 ze sekvence na obrázku 3.
Polypeptid může být exprimován v modifikované formě, např. fúzní protein, a může zahrnovat nejenom sekreční signály, ale také další heterologní funkční oblasti. Termín „heterologní“ polypeptid, jak jistě odborník v oboru zná, zahrnuje polypeptid získaný z různých species. Například oblast s dodatečnými aminokyselinami, zejména nabité aminokyseliny, může být přidána k N-konci polypeptidu za účelem zlepšení stability a perzistence v hostitelské buňce během purifikace nebo během následné manipulace a skladování. K usnadnění purifikace mohou být k polypeptidu také přidány peptidové části. Před finální přípravou polypeptidu mohou být tyto oblasti odstraněny. Adice peptidových částí do polypeptidu k vyvolání sekrece nebo exkrece provedené mimo jiné kvůli zlepšení stability a usnadnění purifikace patří mezi známé a rutinní techniky v oboru.
C5-epimeráza nebo fúzní protein obsahující její fragment mohou být regenerovány a purifikovány z rekombinantních buněčných kultur známými • · · · ··♦ • ·
·· metodami, včetně precipitace síranem amonným nebo ethanolem, kyselou extrakcí, anexovou nebo katexovou chromatografií, chromatografií na fosfocelulose, chromatografií na reverzní fázy, afinitní chromatografií, chromatografií na hydroxylapatitu a chromatografií na lektinu.
Polypeptídy podle předloženého vynálezu zahrnují přirozeně purifikované produkty, produkty chemické syntézy a produkty produkované rekombinantními technikami z prokaryotických nebo eukaryotických hostitelů, včetně např. bakteriálních, kvasinkových, hmyzích, savčích buněk a buněk vyšších rostlin. V závislosti na používaném hostiteli při rekombinantních technikách mohou být polypeptídy podle předloženého vynálezu glykosylované nebo neglykosylované. Navíc mohou polypeptídy podle předloženého vynálezu také zahrnovat iniciální modifikovaný methioninový zbytek, v některých případech v důsledku procesů zprostředkovaných hostitelem. Polypeptid podle předloženého vynálezu může také zahrnovat modifikace histidinu nebo polyhistidinu přidaných ke konci kvůli procedurám při purifikaci proteinu.
C5-epimerázové polynukleotidy a polypeptídy mohou být používány podle předloženého vynálezu k různými aplikacím, zejména k těm, které využívají chemických nebo biologických vlastností C5-epimerázy. Speciálně mohou být rekombinantní epimerázy podle předloženého vynálezu používány k produkci heparinu a/nebo heparin-sulfátu v průmyslovém měřítku, které mohou být účinné jako antikoagulans. Epimerázy podle předloženého vynálezu mohou být také použitelné při experimentální práci na studiu účinků molekul extracelulární matrix, např. heparinu a heparin-sulfátu, na takových procesech jako je embryologie, angiogeneze a progrese nádoru. Enzym může například modulovat poměr zbytků D-glukuronové kyseliny/L-iduronové kyseliny v heparinu nebo heparin-sulfátu. Předpokládá se, že zbytky L-íduronové kyseliny díky svým výjimečným konformačním vlastnostem napomáhají interakcím polysacharidů s proteiny. Dále mohou být epimerázy podle předloženého vynálezu také používány k modifikaci cukrů využitelných v průmyslu, jenž mohou být používány jako stabilizátory nebo gelující aditiva v některých potravinách.
• · · · • · · · · ·
-21 Varianty a mutantní polypeptidy
Genové inženýrství může být používáno ke zlepšení nebo změně charakteristických vlastností C5-epimerázového polypeptidu. Odborníkům v oboru jistě známá rekombinantní DNA-technologie může být používána k vytvoření nových mutantních proteinů nebo „muteinů“, včetně jediné nebo mnohonásobné aminokyselinové substituce, delece, adice nebo fúzních proteinů. Takto modifikované polypeptidy mohou vykazovat např. zvýšenou aktivitu nebo zvýšenou stabilitu. Navíc mohou být purifikovány s vyššími výtěžky a vykazovat větší rozpustnost než odpovídající přirozený polypeptid alespoň za určitých purifikačních a skladovacích podmínek.
N-koncové a C-koncové deletované mutanty
U mnoha proteinů, včetně extracelulární domény proteinu asocivovaného s membránou nebo mateřské formy(em) sekretovaného proteinu, je z literatury známo, že jedna nebo více aminokyselin může být vynechána z N-konce nebo C-konce bez výrazné ztráty biologické funkce. Například Ron et al., J. Biol. Chem., 268: 2984-2988 (1993) publikoval modifikované KDF proteiny, které měly heparinovou vazebnou aktivitu jen za předpokladu, že chybělo 3, 8 nebo 27 amino-koncových aminokyselinových zbytků.
Nicméně, i kdyby delece jedné nebo více aminokyselin z N-konce proteinu vedla k modifikaci nebo ztrátě jedné nebo více biologických funkcí proteinu, další biologické aktivity proteinu budou zachovány. Tudíž schopnost zkráceného proteinu vyvolat a/nebo vázat se na protilátky, které rozpoznávají kompletní nebo část C5-epimerázového proteinu, bude obecně zachována za předpokladu, že menší než majoritní část zbytků kompletního proteinu nebo extracelulární domény bude odstraněna z jeho(jejího) N-konce. Zdali si konkrétní polypeptid postrádající N-koncové zbytky kompletního proteinu udrží takové imunologické aktivity, lze stanovit rutinními metodami popsanými v předloženém vynálezu, které jsou jinak známy z literatury.
• · · · · « · · « • · · · · · · 4 • · · · « 44 4 ·
444 *44444 • * 44 44444 ······ <4 «4 44 44
-22Předložený vynález dále poskytuje polypeptidy mající jeden nebo více zbytků vynechaných z amino-konce aminokyselinové sekvence uvedené na obrázku 3.
Nicméně, i kdyby delece jedné nebo více aminokyselin z C-konce proteinu vedla k modifikaci nebo ztrátě jedné nebo více biologických funkcí proteinu, další biologické aktivity proteinu budou zachovány. Tudíž schopnost zkráceného proteinu vyvolat a/nebo vázat se na protilátky, které rozpoznávají kompletní nebo mateřskou formu proteinu, bude obecně zachována za předpokladu, že menší než majoritní část zbytků kompletní nebo mateřské formy proteinu bude odstraněna z C-konce. Zdali si konkrétní polypeptid postrádající C-koncové zbytky kompletního proteinu udrží takové imunologické aktivity, lze stanovit rutinními metodami popsanými v předloženém vynálezu, které jsou jinak známy z literatury.
Předložený vynález také poskytuje polypeptidy mající jednu nebo více aminokyselin vynechaných z amino-konce i karboxyl-konce.
44 4
Další mutanti
Kromě koncových delečních forem proteinu popsaného výše, jistě odborníci v oboru poznají, že některé aminokyselinové sekvence C5-epimerázového polypeptidu mohou být odlišné, aniž by došlo k signifikantnímu vlivu na strukturu nebo funkci proteinů. Pokud jsou takové rozdíly v sekvenci zamýšleny, mělo by být uvedeno, že existují kruciální oblasti proteinu, které determinují jeho aktivitu. Předložený vynález tudíž dále zahrnuje varianty C5-epimerázového polypeptidu, které vykazují podstatnou aktivitou C5-epimerázového polypeptidu, nebo které zahrnují oblasti C5-epimerázového proteinu, např. části proteinu uvedené níže. Takoví mutanti vznikají delecí, inzercí, inverzí, repeticí a substitucemi určitého typu. Podrobnosti o aminokyselinových změnách, které jsou pravděpodobně fenotypálně tiché, lze nalézt v Bowie, J. U. et al., „Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,“ Science 247: 13061310 (1990).
Tudíž fragment, derivát nebo analog polypeptidu z obrázku 3 nebo fúzní protein je obsahující může být: (i) ten, ve kterém jeden nebo více • · • · • · · ·
-23• « · · • « • 44 4 • 99 • · • ♦ · 9
9 9 9 * 444«·
4 · aminokyselinových zbytků je substituováno konzervovaným nebo nekonzervovaným aminokyselinovým zbytkem (výhodně konzervované aminokyselinové zbytky(tek), výhodněji alespoň jeden, ale méně něž deset konzervovaných aminokyselinových zbytků) a tento substituovaný aminokyselinový zbytek(ky) může nebo nemusí být kódován genetickým kódem; nebo (ii) ten, ve kterém jeden nebo více aminokyselinových zbytků zahrnuje skupinu substituenta; nebo (iii) ten, ve kterém je mateřský nebo rozpustitelný extracelulární polypeptid fúzován s další sloučeninou, např. sloučenina, za účelem zvýšení poločasu polypeptidu (např. polyethylenglykol); nebo (iv) ten, ve kterém další aminokyseliny jsou fúzovány s vedoucí nebo sekreční sekvencí nebo sekvencí, která je používána k purifikaci mateřského polypeptidu, nebo s proproteinovou sekvencí. Určení takových fragmentů, derivátů a analog spadá do rozsahu odborných zkušeností vytvořených na základě tohoto textu.
Tudíž C5-epímeráza podle předloženého vynálezu může zahrnovat jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí, a to buď z přirozených mutací anebo lidskou manipulací. Jak je uvedeno, mají změny výhodně minoritní charakter, např. substituce konzervovaných aminokyselin, které výrazně neovlivňují funkčnost nebo aktivitu proteinu (viz tabulka 1).
• ·
Tabulka 1
Substituce konzervovaných aminokyselin
| Aromatické | Fenylalanin |
| Tryptofan | |
| Tyrosin | |
| Hydrofóbní | Leucin |
| Izoleucin | |
| Valin | |
| Polární | Glutamin |
| Asparagin | |
| Bazické | Arginin |
| Lysin | |
| Histidin | |
| Kyselé | Aspartová kyselina |
| Glutamová kyselina | |
| Malé | Alanin |
| Serin | |
| Threonin | |
| Methionin | |
| Glycin |
Aminokyseliny v C5-epimerázovém proteinu podle předloženého vynálezu, které jsou esenciální pro funkci, mohou být identifikovány standardními metodami, např. místně cílená mutageneze nebo alanin-skenovací mutageneze (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). Posledně zmíněný postup zavádí jednoduché alaninové mutace do každého zbytku v molekule. Výsledné mutantní molekuly jsou pak testovány na biologickou aktivitu, např. vazba na receptor nebo in vitro proliferativní aktivita.
• 9
-259 9 9 99 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 •999 9 99 9 • 9 9 9 9 9 9 9 • · « « · ······ ·· · 9
Mimořádný zájem je o substituce nabitých aminokyselin s dalšími nabitými aminokyselinami a s neutrálními nebo negativně nabitými aminokyselinami, což vede k proteinům s redukovaným pozitivním nábojem, jenž mají zlepšené vlastnosti C5-epimerázového proteinu. Velmi žádoucí je prevence agregace. Agregace proteinů nevede jenom ke snížení aktivity, ale pokud se připravují farmaceutické formulace, může také být problematická v důsledku imunogenity. (Pinckard et al., Clin Exp. Immunol. 2: 331 až 340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crít. Rev. Therapeutic Drug Carríer Systems 10: 307-377(1993)).
Nahrazení aminokyselin může také změnit selektivitu vazby ligandu na receptory buněčného povrchu. Například Ostade et al., Nátuře 361: 266-268 (1993), popisuje určité mutace vyplývající ze selektivity vazby TNF-α na pouze jeden ze dvou známých typů TNF receptorů. Místa, která jsou kruciální pro vazbu ligand-receptor mohou být také determinována strukturní analýzou, např. krystalizací, nukleární magnetickou rezonancí nebo fotoafinitním značením (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) a de Vos et al., Science 255: 306-312 (1992).
Polypeptidy podle předloženého vynálezu jsou výhodně v izolované formě. Termín „izolovaný polypeptid“ zahrnuje polypeptid odstraněný ze svého přirozeného prostředí. Pro účely předloženého vynálezu je polypeptid produkovaný a/nebo obsažený v rekombinantní hostitelské buňce izolován. Do termínu „izolovaný polypeptid“ rovněž patří polypeptidy, které byly purifikovány, částečně nebo podstatně, z rekombinantních hostitelských buněk. Například rekombinantně produkovaná verze C5-epimerázového polypeptidu může být podstatně purifikována jednokrokovou metodou popsanou v Smith and Johnson, Gene 61: 31-40 (1988). Výhodně je polypeptid podle předloženého vynálezu purifikován do takového stupně, který je dostatečný pro sekvenční analýzu, nebo který reprezentuje 99% proteinového materiálu v preparátu.
Vynálezci objevili myší gen C5-epimerázy a C5-epimerázový protein a dále, že C5-epimerázový polypeptid je protein o 618 zbytcích vykazující N-koncovou 154 aminokyselinovou doménu, zejména pak 33 nebo 34 aminokyselinová • * · · • ·· ·
-26doména obsahující aminokyseliny 1 až 33 nebo 1 až 34 podílející se na sekreci a stabilizaci aminokyselinových sekvencí, které jsou kní připojené.
Tudíž tato doména nebo její funkční část je použitelná pro expresi a sekreci proteinů, např. C5-epimerázy, nebo kteréhokoliv jiného proteinu, zejména proteinu asociovaného s Golgiho aparátem, nebo jinak zapojeného do heparinové nebo heparin-sulfátové syntézy.
Vynálezci dále objevili, že N-konec myšího C5-epimerázového proteinu, zejména pak aminokyseliny 1 až 154, 33 až 154 nebo 34 až 154, jsou zejména použitelné ke zvýšení aktivity dalších enzymů, zvláště pak jiných C5-epimeráz. Tudíž tato doména nebo její funkční část je použitelná pro expresi a sekreci fúzních proteinů, které zahrnují C5-epimerázové sekvence, jenž jsou heterologní k sekvenci uvedené na obrázku 3, zejména pak k hovězí C5-epimeráze.
Polypeptidy podle předloženého vynálezu zahrnují shora uvedený C5-epimerázový polypeptid a fragmenty, jejichž aminokyselinová sekvence je alespoň z 80% shodná se sekvencí vybranou ze skupiny skládající z: (a) aminokyselin 1 až 118 z obrázku 3; (b) aminokyselin 1 až 119 z obrázku 3; (c) aminokyselin 1 až 120 z obrázku 3; (d) aminokyselin 1 až 121 z obrázku 3; (e) aminokyselin 119 až 618 z obrázku 3; (f) aminokyselin 120 až 618 z obrázku 3; (g) aminokyselin 121 až 618 z obrázku 3; (h) aminokyselin 122 až 618 z obrázku 3; (i) aminokyselin 34 až 147 z obrázku 3; (j) aminokyselin 35 až 154 z obrázku 3; (k) aminokyselin 34 až 154 z obrázku 3; (I) aminokyselin 1 až 154 z obrázku 3; (m) kompletní aminokyselinové sekvence z obrázku 3.
Předložený vynález zahrnuje polypeptidy, které jsou alespoň z 80% shodné, výhodněji alespoň z 90% nebo 95%, ještě výhodněji z 96%, 97%, 98% nebo 99%, shodné s výše popsaným polypeptidem, a také zahrnují části takového polypeptidu s alespoň 30 aminokyselinami, výhodněji s alespoň 50 aminokyselinami.
Polypeptidem majícím aminokyselinovou sekvenci např. alespoň z 95% „shodnou“ s referenční aminokyselinovou sekvencí z C5-epimerázového polypeptidu je míněna aminokyselinová sekvence polypeptidu, která je shodná s referenční sekvencí s výjimkou toho, že polypeptidová sekvence může • · » · · · · ·
-27zahrnovat až pět aminokyselinových alterací na každých 100 aminokyselin z referenční aminokyseliny C5-epimerázového polypeptidu. Jinými slovy získat polynukleotid mající aminokyselinovou sekvenci alespoň z 95% shodnou s referenční aminokyselinovou sekvencí znamená, že až 5% aminokyselinových zbytků v referenční sekvenci může být deletováno nebo substituováno jinou aminokyselinou, nebo že až 5% z celkových aminokyselinových zbytků v referenční sekvenci může být vpraveno do této referenční sekvence. Tyto alterace referenční sekvence se mohou vyskytovat na amino- nebo karboxykoncových polohách referenční aminokyselinové sekvence nebo kdekoliv mezi těmito koncovými polohami, rozptýlené buď individuálně mezi zbytky v referenční sekvenci nebo v jedné nebo více za sebou jdoucích skupinách v referenční sekvenci.
Pokud kterýkoliv konkrétní polypeptid je alespoň z 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99% shodný, může být aminokyselinová sekvence uvedená na obrázku 3 standardně determinována pomocí známých počítačových programů, např. program Bestfit (Wisconsin Sequence analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). Pokud se používá program Bestfit nebo jakýkoliv jiný program k určení např. 95% shody s referenční sekvencí podle předloženého vynálezu, jsou parametry samozřejmě nastaveny tak, aby procentuální shoda byla vypočtena z celkové délky referenční aminokyselinové sekvence, a aby mezery v homologii byly přípustné až do 5% z celkového počtu aminokyselinových zbytků v referenční sekvenci.
Polypeptidy podle předloženého vynálezu, které mají C5-epimerázovou aktivitu, mohou být používány jako takové in vitro, např. při vyvíjení testů pro tyto polypeptidy nebo standardizačních testech pro použití s komplexnějšími systémy. Signální sekvence podle předloženého vynálezu může být používána k sekreci homologního C5-epimerázového enzymu z eukaryotických rekombinantních hostitelů nebo k sekreci heterologních sekvencí, které jsou k ní proveditelně připojeny. Sekvence podle předloženého vynálezu zvyšující aktivitu může být používána ke zvýšení inherentní epimerázové aktivity rekombinantních preparátů • 9 99 9 • 9 9 • · 9 9 « · • 9
9» • · · 9 • * · · « 9 9 9 9 « • * 9 • 9 «9
99 ·
-28z jiných C5-epimeráz a jako taková je nejlépe používána ve formě genu kódujícího fúzní protein pro tuto sekvenci.
Protilátky
Specifické protilátky proti C5-epimerázovému proteinu pro použití podle předloženého vynálezu mohou být získány expozicí vůči intaktním C5epimerázovým proteinům nebo jejich antigennímu peptidovému fragmentu, které mohou být přítomny společně s nosičovým proteinem, např. albumin, ve zvířecím systému (např. králík nebo myš), nebo pokud jsou dostatečně dlouhé (alespoň 25 aminokyselin) mohou být přítomny bez nosiče, nebo v lipozómech, nebo komplexovány s PEG ke zvýšení cirkulačního poločasu.
Termín „protilátka“ (Ab) nebo „monoklonální protilátka“ (Mab), jak je používán v předloženém vynálezu, zahrnuje intaktní molekuly i fragmenty protilátky (např. Fab a F(ab')2 fragmenty), které jsou schopné specifické vazby na C5-epimerázový protein. Fab a F(ab')2 fragmenty postrádají Fc fragment intaktní protiláky, odstupují rychleji z cirkulace a mohou mít menší nespecifickou tkáňovou vazbu intaktní protilátky (Wahl et al., J. Nud. Med. 24: 316-325 (1983)). Tudíž preferovány jsou tyto fragmenty.
Protilátky podle předloženého vynálezu mohou být připraveny kterýmikoliv různými způsoby. Například buňky exprimující C5-epimerázový protein nebo jeho antigenní fragment mohou být podávány zvířecím subjektům za účelem vyvolání tvorby séra obsahujícího polyklonální protilátky. Ve výhodném způsobu je kvůli odstranění přirozených nečistot preparát C5-epimerázového proteinu purifikován. Takový preparát je pak zaveden do zvířete za účelem produkce polyklonálního antiséra s větší specifickou aktivitou.
V nejvýhodnějším způsobu jsou protilátky podle předloženého vynálezu monoklonální protilátky. Tyto monoklonální protilátky mohou být připraveny hybridomovou technologií (Kóhler et al., Nátuře 256: 495 (1975); Kóhler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kóhler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al., in: Monodonal Antibodies and T-cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., (1981) 563-681). Obecně tyto procedury zahrnují imunizaci zvířete (výhodně ·« ····
-29myši) antigenem C5-epimerázového proteinu, nebo výhodněji buňkami exprimujícími C5-epimerázový protein. Vhodné buňky mohou být rozpoznány podle své schopnosti vázat protilátku proti anti-C5-epimerázovému proteinu. Tyto buňky mohou být kultivovány v jakémkoliv vhodném tkáňovém kultivačním médiu, nicméně je výhodné kultivovat buňky v Earlem modifikovaném Eaglově médiu doplněném o 10% fetální hovězí sérum (inaktivované při 56°C) a doplněné 10 g/l neesenciálních aminokyselin, 1000 U/ml penicilinu a 10 pg/ml streptomycinu. Splenocyty těchto myší jsou extrahovány a fúzovány s vhodnou myelomovou buněčnou linií. Podle předloženého vynálezu může být používána jakákoliv vhodná myelomová buněčná linie, nicméně je výhodné používat mateřskou myelomovou buněčnou linii (SP2O) dostupnou u American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Po fúzi jsou výsledné hybridní buňky selektivně udržovány v HAT médiu a následně klonovány limitovaným zředěním podle Wands et al., Gastroenterology 80: 225-232 (1981). Hybridní buňky připravené touto selekcí jsou pak testovány na identifikaci klonů, které secretují protilátky schopné vazby požadovaného C5-epimerázového antigenu.
Alternativně mohou být další protilátky schopné vazby na C5-epimerázový antigen produkovány dvoustupňovým procesem za použití anti-idiotypických protilátek. Tato metoda využívá faktu, že protilátky samotné jsou antigeny a tudíž je možné získat protilátku, která se váže na sekundární protilátku. Podle této metody jsou využívány specifické protilátky proti C5-epimerázovému proteinu k imunizaci zvířat, výhodně myší. Splenocyty těchto zvířat jsou pak používány k produkci hybridních buněk, u kterých je proveden screening k identifikaci klonů, jenž produkují protilátku, jejíž schopnost vázat se na specifickou protilátku proti C5-epimerázovému proteinu může být blokována antigenem C5-epimerázového proteinu. Tyto protilátky obsahují anti-idiotypické protilátky proti specifické protilátce proti C5-epimerázovému proteinu a mohou být používány k imunizaci zvířete za účelem vyvolání tvorby dalších specifických protilátek proti C5-epimerázovému proteinu.
Jistě bude oceněno, že Fab a F(ab')2 a další fragmenty protilátek podle předloženého vynálezu mohou být používány podle metod v předloženém
4 • 44 4
-30♦ 4 · · · «φ « » ·· · 4*44 ···· 4 44 4 ♦ 4 9 4 4 444 ♦ · 4 4 4 vynálezu. Tyto fragmenty jsou typicky produkovány proteolytickým štěpením enzymy, např. papain (produkuje Fag fragmenty) nebo pepsin (produkuje F(ab')2 fragmenty). Jednořetězcové protilátky, např. lehký a těžký řetězec protilátky, jsou rovněž zahrnuty do předloženého vynálezu. Alternativně mohou být vazebné fragmenty C5-epimerázového proteinu produkovány aplikací rekombinantní DNAtechnologie nebo syntetickou chemií. Takové protilátky by měly zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, rekombinantní protilátky obsahující komplementaritu determinující oblasti (CDR), které mají rozdílné vazebné specificity nebo CDR, jenž byly modifikovány aplikací rekombinantní DNA-technologie nebo syntetickou chemií.
Pro in vivo použití anti-C5-epimerázy u lidí může být výhodné používat „humanizované“ chimérické monoklonální protilátky. Tyto protilátky mohou být produkovány genetickými konstrukty odvozenými od hybridních buněk produkujících monoklonální protilátky popsané výše. Metody produkce chimérických protilátek jsou dostupné z literatury. Viz například Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Cabilly et al., U. S. Patent No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., \NO 870 2671; Boulianne et al., Nátuře 312:643 (1984); Neuberger et al., Nátuře 314:268 (1985).
Bifunkční protilátky jsou protilátky, které mají antigen-vázající domény pro různé epitopy nebo odvozené od různých species, a spadají do předloženého vynálezu. Patří sem rovněž protilátky s Fc oblastmi odvozené od species lišících se od sebe Fab oblastmi. Tyto protilátky mohou být využívány při imunospecifických chromatografických technikách. Dále do předloženého vynálezu spadají protilátky s připojenou značkou, např. fluorescein, texaská červeň, rhodamin, peroxidáza, zlato, magnetické značky, alkalická fosfatáza, radioizotopy nebo chemiluminiscenční značky.
Nyní, když byl předložený vynález obecně popsán, bude dosavadní popis srozumitelnější díky následujícím příkladům, které jsou pouze ilustrativní a nemají nikterak předložený vynález limitovat.
• 4 • · 444 4 • ·««· 4 4 ♦ · · 4 4 4 « 4 « « • *·· 4 4 4 4 4 4 4
4444 444 444 4 • 4 44 4 4444 •·4 4·4 44 44 44 44
-31 Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace a sekvenování myších genomických klonů
Byl proveden screening myší genomické knihovny (FIX II, Stratagene) pomocí DNA-sondy z hovězí sekvence kódující C5-epimerázu. Sonda byla značena [a32P]dCTP (NEN Life Science Products). Přibližně 2 x 106 fágů bylo naneseno na destičku o rozměrech 20 x 20 cm a z každé destičky byly duplicitně připraveny nylonové filtry. Byl proveden velmi přísně řízený screening hybridizací v 5 x Denhardtech obsahujících 100 pg DNA lososího spermatu při teplotě 60°C. Finální promývání bylo provedeno v 0,1 SSC (1 x SSC je 150 mM NaCI, 15 mM citrátu sodného, pH 7,0 obsahujícího 0,1% SDS). Plaky, které produkovaly pozitivní signály na obou replikacích byly vybrány pro druhý a třetí screening a nakonec bylo izolováno pět pozitivních klonů. Bylo zjištěno, že dva klony mají podobnou délku (asi 16 kb), zatímco ostatní tři byly relativně krátké, kolem 10-12 kb. Nejdelší klon (klon 64) byl štěpen Sací a restrikční fragmenty byly klonovány do pBlueScriptu. Druhý nejdelší klon (klon 5A) byl štěpen EcoRI a výsledné fragmenty byly klonovány do pUC119 pro další charakterizaci. Inzert obsahující plazmid byl purifikován pomocí plazmidového kitu QIAGEN a sekvenován. Nukleotidová sekvenční reakce byla provedena pomocí di-deoxy terminační metody a uskutečněna na sekvenceru ABI 310. Exony a introny byly stanoveny primerem postupujícím po obou řetězcích a velikost intronů byla stanovena sekvenování v kombinaci s elektroforézou na agarózovém gelu. Byly zjištěny pouze 3 exony kódující C5-epimerázu, kde nejdelší exon kódoval více než 50% proteinu. Exon-intron spojení (místa sestřihu) přesně kopírují gt-ag konvenční pravidlo. Vynálezci věří, že na základě přítomnosti intronů a přesného párování mezi exony a cDNA-sekvencí reprezentuje identifikovaný genomický klon funkční gen C5-epimerázy.
Klonování myší C5-epimerázové cDNA
4 4 4
4
-32• 44
4 4 4 » · · • 44
4 4 • · 4 » • 4 4 4
Byl určen jeden pár primerů a na základě nukleotidové sekvence získán sekvenováním exonů z genomického klonu. Kódující primer odpovídal bp 1 až 26 z myší ORF, přičemž se vycházelo z iniciačního kodonu ATG. Nekódující primer odpovídal bp 1829 až 1854 bez terminačního kodonu. PCR byla provedena pomocí QUICK-Clone™ cDNA (Clontech) z myších jater jako templátu za následujících podmínek: 1 cyklus při teplotě 94°C po dobu 1 minuty, 30 cyklů každý při teplotě 94°C po dobu 30 s, 60°C po dobu 45 s a 72°C po dobu 1 minuty a finální extenze při teplotě 72°C po dobu 10 minut. Byl získán silný pás o přibližně 2 kb, který byl nakloňován do klonovacího vektoru TOPO™-TA (Invitrogen) a amplifikován a následně sekvenován. Sekvenováním obouřetězců bylo zjištěno, že klon myší C5-epimerázy je 1875 bp dlouhý a má silně hydrofóbní doménu na N-konci odpovídajícího peptidu.
Northern blotting
Myší multitkáňový mRNA blot byl zakoupen u firmy Clontech. DNA-sonda z klonu hovězí cDNA byla značena [a32P]dCTP pomocí Klenowova enzymu od firmy Boehringer Mannheim. Hybridizace byla prováděna v ExpressHybu (Clontech) při teplotě 60°C po dobu jedné hodiny a následně byla promývána za velmi přísných podmínek. Membrána byla vystavena Kodak filmu při teplotě -70°C přes noc. Enzym C5-epimeráza byla exprimována ve všech zkoumaných tkáních a velikost transkriptu byla 5 kb. V játrech docházelo k nejvyšší expresi transkriptu, zatímco ve slezině byly pozorovány nižší hladiny vzhledem k β-aktinu ve stejném membráně.
Southern blotting
Southern blotting byl proveden podle Sambrooka et al. (Sambrook et al., 1989). Myší genomická DNA byla připravena pomocí kitu Easy Prep (Pharmacia Biotech). Genomická DNA (20 pg) byla štěpena restrikčním enzymem Sací a separována elektroforézou na 0,8% agarózovém gelu. Po elektroforéze byl gel podroben 0,1 N NaOH po dobu 30 minut a neutralizován Tris-HCI pufrem. DNA fragmenty byly převedeny do nylonové membrány. Fragment 837 bp z hovězí C5-33epimerázové cDNA byl značen [a32P]dCTP pomocí Klenowa enzymu zakoupeného u Boehringer Mannheim a používán jako sonda. Podmínky hybridizace byly stanoveny podle Northern blottingu. Doba expozice byla 3 dny.
K určení počtu genů, které mohou potenciálně kódovat C5-epimerázu, bylo 20 qg purifikované myší genomické DNA z myších jater štěpeno restrikčními enzymy Apal, resp. BamHI, EcoRI, EcoRV, Hindlll, Ncol a Xbai, a separováno elektroforézou na 0,8% agarórovém gelu. DNA separovaná v gelu byla převedena na nylonovou membránu a následně hybridizována DNA-sondou z kódující hovězí sekvence (1407 bp). Restrikční mapa C5-epimerázové genomické DNA, ukazuje, že existuje pouze jeden gen kódující C5-epimerázu.
Analýza enzymové aktivity
Aktivita C5-epimerázy byla stanovena podle způsobu publikovaného Malmstrómem et a/., J. Biol. Chem. 255:3878-3883 (1980), zde je uveden jako odkaz. Myš s intramuskulárně transplantovanými buňkami mastocytomu byla usmrcena cervikální dislokací a následně pitvána. Příslušné tkáně, včetně xenoimplantátu, byly odebrány a okamžitě homogenizovány v pufru 50 mM HEPES obsahujícího 100 mM KCI, 15 mM EDTA, 1% Triton X-100 a inhibitory proteázy. Homogenáty byly třepány při teplotě 4°C po dobu 30 minut a centrifugovány. Supernatant byl odebrán. Celková koncentrace proteinu byla určena testem QuantiGold a specifická aktivita C5-epimerázy byla analyzována na základě uvolňování 3H (regenerovaný jako 3H2O) ze substrátového polysacharidu podle způsobu popsaného Li et al. (Li et al. 1997). C5-substrát používaný při stanovení specifické aktivity byl alespoň jednou měsíčně analyzován změřením pouze 50 μΙ C5-substrátového pracovního roztoku bez přítomnosti jakéhokoliv enzymu.
Pokud iniciální aktivita vzorku byla větší než 2000 cpm/50 μΙ, znamenalo to, že vzorek je nasycen a je třeba ho zředit. Faktory zředění závisely na použitých vzorcích, nasycení vzorků a na koncentraci soli. Vzorky nesmějí obsahovat více než 50 mM soli (NaCI nebo KCI), protože aktivita C5-epimerázy je částečně nebo zcela inhibována při vyšších koncentracích soli.
• rf rfrf rfrf rfrf rfrfrf rfrfrf ····· rfrfrf · • · ······ rfrfrf rf rf rfrf rfrfrfrf rfrf·· rfrf rfrfrfrf rfrfrf ♦ rf rfrfrf · rf • rfrfrf • rf
-34Při stanovení aktivity C5-epimerázy byly používány pozitivní nebo negativní kontroly. Pozitivní kontrola by měla být standardizována každé dva měsíce kvůli udržení stability. Jako negativní kontrola může být používán pouze vektor produkovaný stejnými buňkami. Například byla jako negativní kontrola pro C5-vzorky produkované v expresívním systému bakulovirus/hmyzí buňky používána acetylcholinesteráza produkovaná stejným systémem.
Pokud bylo třeba, byly vzorky během temperace C5 substrátového roztoku zředěny. K temperovanému substrátu byl přidán 50 μΙ vzorek (enzym) a inkubován přesně po dobu 1 hodiny při teplotě 37°C. Po inkubaci bylo ke směsi substrát-enzym přidáno 100 μΙ roztoku zastavujícího enzymovou reakci a tato reakční směs byla převedena do Wallaceho 20 ml scintilačních vialek. Do vialek bylo přidáno 13 ml epimerázového testovacího scintilačního koktailu a vialky byly vortexovány po dobu 10 s. Po inkubaci přes noc byla radioaktivita měřena trojmo na přístroji Wallac 1415 Liquid Scintillation Counter každá po dobu 2 minut. Ze scintilačního počítače byly získány výsledky ve formě cpm/reakční objem (50 μΙ). Pokud byl vzorek zředěn měla by být aktivita ředícího pufru odečtena od aktivity vzorku. V každém případě byla před analýzou výsledků odečtena aktivita slepého pokusu od aktivity vzorku.
Specifická aktivita byla měřena dělením celkové aktivity (cpm/μΙ) celkovou koncentrací proteinu (mg/ml). Koncentrace celkového proteinu byla měřena testem QuantiGold podle Stoscheka, C. M., Anal. Biochem. 160: 301-305 (1987), zde je uvedeno jako odkaz. Jednotka specifické aktivity je cpm/mg/h, kde h (hodina) udává dobu enzymové reakce.
Příklad 2
Identifikace skutečného N-konce C5-epimerázy na základě analýzy kódující sekvence myšího genu a exprese klonované cDNA
Na základě klonování a předběžné sekvenční analýzy putativního myšího genu C5-epimerázy identifikovaného v příkladu 1 a podle již dříve publikované
444444 • · · 4 • · * · « • · ♦ 444 4 * 4 * t>4 ·♦«· 4«
44« • 0
-35hovězí sekvence cDNA, byly izolovány další myší 5’-lemovací DNA-sekvence a cDNA byla klonována tak, aby obsahovala tuto 5'-lemovací DNA-sekvenci.
Kvůli stanovení, zda tato 5'-lemovací DNA-sekvence může kódovat další N-koncové peptidové sekvence, které by mohly představovat skutečný N-konec C5-epimerázy kódované myším genem, byla myší sekvence (tučně v kompilované nukleotidové sekvenci uvedené na obrázku 1) přidána do hovězí cDNA-sekvence, která již byla v souboru, za použití hovězí sekvence a vycházeje z bodu největší konzervace (>96% aminokyselinová shoda). K vyhledání otevřených čtecích rámců, což jsou potenciální sekvence kódující polypeptid v kompilované sekvenci, byl používán program Gene Inspector (Textco, USA). Výsledky ze sekvenční analýzy jsou uvedeny na obrázku 1 a výsledky z analýzy ORF jsou uvedeny na obrázku 2.
Na obrázku 1 je místo fúze mezi novou myší sekvencí a hovězí sekvencí označeno čtyřtečkou Sekvencí začínající po čtyřtečce je hovězí cDNA-sekvence. Sekvence (tučně) 5' k místu fúze je další shora popsaná, izolovaná myší 5'-lemovací DNA-sekvence izolovaná podle shora uvedeného způsobu. Podtržená sekvence je zjištěný otevřený čtecí rámec, ukazující polypeptidovou kódující sekvenci.
Je známo, že nativní C5-epimeráza je lokalizována v membránovitých Golgiho „kompartmentových“ (mikrozomální frakce“) buňkách (z jater). Proto by nativní myší sekvence měla obsahovat vhodný N-koncový signál pro translokaci do tohoto kompartmentu. Kjeho analýze byl používán algoritmus (program) Nielsena et al., Protein Engineering 10A-6 (1997). Algoritmus analyzuje „signální“ potenciál prvních 40-60 aminokyselin z každé z výše uvedených polypeptidových sekvencí. Stejný program byl používán k testování prvních 40 zbytků myší polypeptidové sekvence syndecan-1, o které se ví, že obsahuje sekreční signál, jako kontrolní skupina účinnosti programu, přičemž je program jasně identifikoval (data nejsou uvedena). Analýza ukazuje silný signální potenciál pro prvních 33 zbytků.
Kromě již zmíněné 33 aminokyselinové signální sekvence zahrnuje 154 další N-koncových zbytků další cysteinové zbytky, které mohou tvořit disulfidové
99 ·* 99 • 9 · 9 9 9 » • 9 999999 · • 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9999 9* 99 99
999
9999
-36můstky a stabilizovat konformaci proteinu a predikovat místo amidace (zbytky 118121), které se může týkat posttranslačního proteolytického zpracování. Další analýzy kompletní C5-epimerázové sekvence ukazují hydrofóbní úseky polypeptidu, jenž mohou být skryty nebo prostupovat skrz membrány.
Sekvenční analýza s dalším sekvencemi nalezenými v databázích odhaluje horká místa homologie. Tyto výsledky jsou shrnuty na obrázcích 4 a 5.
Na obrázku 5 je grafické znázornění polypeptidové sekvence myší C5-epimerázy. Jak je uvedeno na obrázku 5, největší evoluční konzervace („horká místa“ homologie) sekvence se vyskytla více u C-koncové části, v prostoru s velmi hydrofóbním úsekem mezi aminokyselinovým zbytky Trp497 a Leu523, což ukazuje na to, že má být skrytá ve struktuře podobné proteinu nebo probíhá skrz membránu, možná do lumenu golgiho aparatu, kde se ví, že enzym působí. Další nejdůležitější a extendovaný konzervovaný úsek („horké místo“) se vyskytuje mezi zbytky Leu546 a His580 a může obsahovat nebo zahrnovat aktivní místo enzymu. Funkční signifikance konzervace polypeptidové sekvence (identita) > 22% byla upravena podle publikovaných studií jiných proteinů se známou funkcí (Branden, C. a Tooze, J., Introduction to Protein Structure, Garland Publishing, NY and London, 100-101 (1991)), a Wilson, Kreychman a Gerstein a další autoři citovaní v „Quantifying the reiations between protein sequence, structure, and function through traditional and probabilistic scores“ dostupné na htttp://bioinfo.mbb.yale.edu/e-print/ann-xfer-jmb/preprinthtml. Jak je vysvětleno v tomto článku, neukázalo se, že přesná funkce je konzervována méně než z 30 až 40% sekvenční shody, kdežto funkční třída je konzervována z hlediska sekvenční shody z 20-25% (pod 20% již není obecná podobnost konzervovaná). V současné době SWISS-MODEL vytváří modely pro sekvence, které odpovídají těmto kritériím: BLAST hledání hodnoty P: <0.00001; globální stupeň sekvenční shody (SIM): >25% a minimální délka předpokládaného modelu - 25 aminokyselin.
Na základě těchto skutečností je vidět, že sekvence z Drosophila se více podobá sekvenci z myši (46,6%) než sekvenci z C. elegans (39,6%).
·· ·· ♦· *«.« · · · « • » ·«*··* * · ♦ » · * · ··· • »<··««» · » »« · »·
-37V jiném typu sekvenční analýzy byla předpokládaná trojrozměrná (3D) struktura sekvence myší C5-epimerázy porovnávána s 3D strukturami podle Kelleyho, L. A. et al., Mol. Biol. 299(2): 499-520 (2000). Z těchto srovnání se vychází, že sekvence C5-epimerázy má signifikantní vztah k doméně chondroitinázy (chondroitin AC/alginát lyáza), která je alfa/alfa toroidní. Chondroitin-AC-lyáza představuje rodinu enzymů degradujících glykosaminglykany a souvislost mezi strukturou a funkcí byla objasněna díky krystalografickým studiím (Fethiere et al., J. Mol. Biol. 288: 635-647 (1999). Bylo zjištěno, že nejvýraznější podobnost 3D struktury se sekvencí chondroitinázy je extendována z Ala408 blízko C-konce vnitřního hydrofóbního (transmembránového) úseku do C-konce sekvence myší C5-epimerázy, a tak tento úsek obsahuje většinu konzervace konzervované sekvence, což pravděpodobně ukazuje na doménu obsahující aktivní místo.
Na základě veškerých výsledků ze sekvenčních analýz byly kromě prvního značeného konstruktu rekombinantní (hovězí) C5-epimerázy, který byl aktivní, připraveny nové konstrukty rekombinantní C5-epimerázy pro heterologní sekreciexpresi z bakulovirových expresívních systémů InsectSelect (Invitrogen, USA). Charakterizované produkty z takto klonovaných hmyzích buněčných linií jsou shrnuty na obrázku 6A (uvedeny jsou čtyři konstrukty). První konstrukt je značená rekombinantní hovězí C5-epimeráza. Druhý konstrukt je značená kompletní myší C5-epimeráza. Třetí konstrukt je značený chimérický konstrukt mezi myšími a hovězími C5-epimerázovými sekvencemi. Čtvrtý konstrukt je značená zkrácená myší sekvence.
V každém z rekombinantním konstruktů byla C5-epimeráza značena. Pokud byla značena, pak C5-epimerázové sekvenci předcházela sekvence uvedená na obrázku 6B, která obsahovala EGT signální peptíd připojený k štěpícímu místu EGT signálu, enterokinázové štěpící místo, šest histidinů a nakonec rTEV proteázové místo. EGT signál je z proteinu bakuloviru (který infikuje hmyzí buňky). FLAG-sekvence je epitop-značka používaná pro detekci a purifikací rekombinantního proteinu podle výrobcem doporučeného způsobu (Sigma) (Hopp, T. et al., Biotechnology 6:1204-1210 (1988)). Enterokináza je enzym používaný k ·· *· ·· ·· ·**··· • · ·««(»·· · · · « • « Λ · · · · ·« « <
• ···♦·» ··« ·· ·« »«*· 9
9999 99
-38odštěpení sekvence předcházející rozpoznávacímu místu enterokinázy. Další značkou je šest po sobě jdoucích histidinů. K odstranění předcházejících sekvencí bylo využito také rTEV („recombinant tobacco edge virus“) proteázové místo. EGT signál a FLAG™-značka (IBI) byly získány z konstruktů připravených v modifikovaném pFastBacTM (Life Technologies) vektoru získaném od Dr. Christiana Oker-Bloma, VTT Biotechnology, P. O. Box 1500, VTT, Finland. Purifíkace všech rekombinantních proteinů popsaných v této přihlášce byla provedena pomocí FLAG-značky.
Reprezentativní data z testů aktivity a proteinové analýzy těchto značených rekombinantních C5-epimeráz jsou uvedena na obrázku 7, v tabulce I a II. Na obrázku 7 jsou uvedeny výsledky z testů aktivity myší C5-epimerázy (mC5), která byla purifikována nad anti-FLAG M1 podle výrobcem doporučeného způsobu.
Test C5-epimerázové aktivity za účelem změření aktivity heterologního proteinu byl prováděny podle shora uvedeného příkladu 1. Celkový protein byl extrahován z kultur transformovaných s každým z konstruktů rekombinantní C5-epimerázy, které byly jednotlivě inokulovány do hmyzích buněk pomocí expresívního systému InsectSelect. Poté, co buňky dosáhly konfluence, byly odebrány a lyžovány a celkový protein byl izolován a kvantifikován. Aktivita C5-epimerázy byla měřena ve formě uvolňování 3H z epimerázového substrátu ve scintilačním počítači. Epimerázová aktivita byla změřena oproti celkovému proteinu. Na obrázku 7 je uvedena aktivita se zvyšujícím se objemem vzorku (zředění 1:2000). Celková aktivita byla 6360 cpm/μΙ. Proteinová analýza (provedená pomocí QuantiGold, Diversified Biotech) byla analyzována způsobem podle Stoscheka, C. M., Anal. Biochem. /60:301-305 (1987) a indikovala 3,2 pg/ml koncentraci proteinu. Tudíž specifická aktivita byla 2,0 x 109 cpm/mg/h.
Na obrázku 8 je uveden Western blotting s anti-FLAG. Sloupec 1 obsahuje standardy molekulových hmotností (New England Biolabs, Broad Range, značené předem). Sloupec 2 obsahuje celou myší C5-epimerázu. Značená celá myší C5-epimeráza (obsahující zjištěné N-koncové dodatečné sekvence) má délku 618 aminokyselin, molekulovou hmotnost (v daltonech) 71189,1, izoelektrický bod (pl) 8,25 a při pH 7 výsledný náboj +4,01.
• 4 44 • 4 4 4 • 9 · ·
9 · • * · •k«t 99 «· • 4 * •k4 4 4 · · « 4 · ·· »4 •
•
| 4 · | |
| 4 | 9 |
| 444 | 9 |
| • | 99 |
| 9999 | 9 |
-39Na obrázku 9 je uveden Western blotting kultivačního média odebraného ze stálých hmyzích buněčných linií z různých klonů pro čtyři značené rekombinantní C5-epimerázy popsané výše, které jsou značené protilátkou proti anti-FLAG (020300). Sloupec 1 obsahuje standardy molekulových hmotností jako na obrázku 8, kde molekulové hmotnosti jsou uvedeny v levém sloupci. Sloupec 2 obsahuje zkrácenou myší C5-epimerázu. Sloupec 3 obsahuje původní hovězí C5-epimerázu. Sloupec 4 obsahuje myší:hovězí chimérickou C5-epimerázu, ve které jsou N-koncové myší sekvence vpraveny do rámce hovězích sekvencí, jak je uvedeno na obrázcích 2 a 3. Sloupec 5 obsahuje celou myší C5-epimerázu. Chimérický myší :hovězí konstrukt má přibližně stejnou velikost jako konstrukt z celé myší C5-epimerázy.
Relativní aktivita různých rekombinantních konstruktů byla spočtena na základě testů aktivity a denzitometrického měření Western blottingu a je uvedena v tabulce I níže. „TruncC5“ je zkrácená aminokyselinová sekvence myší C5-epimerázy, kde prvních 154 aminokyselin bylo odstraněno takovým způsobem, že „TruncC5“ sekvence má stejný N-konec jako rekombinantní hovězí sekvence. „ExtC5“ je rekombinantní hovězí C5-epimerázový polypeptid, kdežto „chC5“ označuje konstrukt myší:hovězí chimérické C5-epimerázy kódovaný sekvencí nukleové kyseliny, jak je uvedeno na obrázku 1. „mC5“ označuje sekvenci celkové myší C5-epimerázy.
Tabulka I
Relativní aktivity různých rekombinantních C5-epimeráz
| Vzorek | Hustota | Vzorek (μΙ) | Hustota/μΙ | Aktivita (cpm/μΙ) | Aktivita/hustota (Cpm/denzito- metrická jedn.) |
| truncC5 | 15984 | 12 | 1332,0 | 20 | 0,015 |
| extC5 | 6451 | 12 | 537,6 | 7 | 0,013 |
| chC5 | 14960 | 12 | 1246,7 | 3455 | 2,771 |
| mC5 | 13804 | 12 | 1150,3 | 3681 | 3,200 |
• 4 44 • · * · * 4 · ·
4 4 • 4 4
4444 44
444
4
4
4 4
4 4 • 44 444 • 44 4 • 444
-40Specifické aktivity různých částečně purifikovaných rekombinantních C5-epimeráz jsou uvedeny v tabulce II.
Tabulka II
Specifické aktivity částečně purifikovaných rekombinantních C5-epimeráz
| Vzorek | Celková aktivita | Linearita (R2) | Protein (mg/ml) | Specifická aktivita (cpm/mg/h) |
| truncC5 | 39,5 | 0,9905 | 0,0129 | 3,06 x 106 |
| extC5 | 9,1 | 0,9978 | 0,0092 | 9,89 x 105 |
| chC5 | 919,7 | 0,9964 | 0,0026 | 3,54 x 108 |
| mC5 | 2019 | 0,9969 | 0,0042 | 4,81 x 108 |
Jak je uvedeno na obrázku 6B, připravený chimérický myší:hovězí konstrukt obsahoval aminokyselinové zbytky 34 až 154 N-koncové sekvence z myší polypeptidové sekvence, které bezprostředně navazovaly na EGT-FLAG-HisRTEV elementy z obrázku 6B. Nicméně bylo zjištěno, že je tento rekombinantní enzym převážně zadržován v cytosolu, pravděpodobně v důsledku signálního potenciálu myší sekvence.
Závěr
Přidání N-koncového fragmentu polypeptidu (Asp34 až Asp154) z myší genové sekvence zvyšuje aktivitu rekombinantní C5-epimerázy o několik řádů, přestože tato část sekvence neobsahuje největší mezidruhový konzervovaný úsek. Byl ukázán možný účinek značek na aktivitu prvního rekombinantního hovězího konstruktu (odstraněním značky; data nejsou uvedena) a může zdůvodňovat malou míru rozdílu, ale ne rozdíly ve specifických aktivitách mezi delšími a kratšími formami rekombinantní C5-epimerázy o několik řádů. V současné době se provádějí studie na neznačených expresívních konstruktech a
-41 studie struktury a funkce k lepšímu definování základu a mechanizmu regulace aktivity tohoto velmi důležitého rekombinantního enzymu.
Claims (29)
1. Izolovaný polynukleotid, který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je alespoň z 95% shodná s referenční aminokyselinovou sekvencí skládající se z aminokyselin 1 až 618 z obrázku 3.
2. Polynukleotid podle nároku 1, který je DNA.
3. Polynukleotid podle nároku 1, který je RNA.
4. Polynukleotid podle nároku 1, který dále obsahuje heterologní polynukleotid.
5. Polynukleotid podle nároku 4, kde uvedený heterologní polynukleotid kóduje heterologní polypeptid.
6. Polynukleotid podle nároku 5, kde heterologní polynukleotid je umístněn na 3'konci nukleotidové sekvence.
7. Vektor obsahující polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
8. Vektor podle nároku 7, kde uvedený polynukleotid je proveditelně připojen k heterolognímu regulačnímu polynukleotidu.
9. Hostitelská buňka obsahující polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
10. Hostitelská buňka podle nároku 9, kde izolovaný polynukleotid je proveditelně připojen k heterolognímu regulačnímu polynukleotidu.
• · ·· *····· • · · » · • · · · ··· | • · · · ·· · * • · · · · · · • · · · · · · · «
-4311. Způsob produkce proteinu, vyznačující se tím, že se kultivují hostitelské buňky podle nároku 10 za takových podmínek, kdy je uvedený protein exprimován, a získá se uvedený protein.
12. Izolovaný C5-epimerázový polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je alespoň z 95% shodná se sekvencí skládající se z aminokyselin 1 až 618 z obrázku 3.
13. Izolovaný polypeptid podle nároku 12, který je produkován nebo obsažen v rekombinantní hostitelské buňce.
14. Izolovaný polypeptid podle nároku 13, kde rekombinantní hostitelská buňka je hmyzí buňka.
15. Izolovaný polynukleotid, který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je alespoň z 95% shodná s referenční aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z:
(a) aminokyselin 1 až 154 z obrázku 3, (b) aminokyselin 35 až 154 z obrázku 3, (c) aminokyselin 34 až 154 z obrázku 3.
16. Polynukleotid podle nároku 15, který je DNA.
17. Polynukleotid podle nároku 15, který je RNA.
18. Polynukleotid podle nároku 15, který dále obsahuje heterologní polynukleotid.
19. Polynukleotid podle nároku 18, kde uvedený heterologní polynukleotid kóduje heterologní polypeptid.
44 ·· >44
4 4 4·
444 4 4 4 4 • 44 4 ·4· • •44 · ·· 4 · ···· • 4 44 • 4 4 4
-4420. Polýnukleotid podle nároku 19, kde heterologní polýnukleotid je umístněn na 3'-konci nukleotidové sekvence.
21. Vektor obsahující polýnukleotid podle kteréhokoliv z nároků 15 až 20.
22. Vektor podle nároku 21, kde uvedený polýnukleotid je proveditelně připojen k heterolognímu regulačnímu polynukleotidu.
23. Hostitelská buňka obsahující polýnukleotid podle kteréhokoliv z nároků 15 až 20.
24. Hostitelská buňka podle nároku 23, kde izolovaný polýnukleotid je proveditelně připojen k heterolognímu regulačnímu polynukleotidu.
25. Způsob produkce proteinu, vyznačující se tím, že se kultivují hostitelské buňky podle nároku 24 za takových podmínek, kdy je uvedený protein exprimován, a získá se uvedený protein.
26. Izolovaný polypeptid C5-epimeráza obsahující N-koncový fragment, jehož aminokyselinová sekvence je alespoň z 95% shodná s referenční aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z:
(d) aminokyselin 1 až 154 z obrázku 3, (e) aminokyselin 35 až 154 z obrázku 3, (f) aminokyselin 34 až 154 z obrázku 3.
27. Izolovaný polypeptid podle nároku 26, který je produkován nebo obsažen v rekombinantní hostitelské buňce.
28. Izolovaný polypeptid podle nároku 26, kde rekombinantní hostitelská buňka je hmyzí buňka.
4 4 ·» ♦ · · • 9 4 4 •99 9 999
9 · · * ···
9 9 9 9 9
94 94 4 4 4 4
4 4 4 4
-4529. Způsob významného zvýšení aktivity C5-epimerázy, vyznačující se tím že zahrnuje:
a) získání prvního polynukleotidu obsahujícího nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je alespoň z 90% shodná s referenční aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z aminokyselin 35 až 154 z obrázku 3 a aminokyselin 34 až 154 z obrázku 3;
b) připojení uvedeného prvního polynukleotidu z bodu (a) na druhý polynukleotid kódující C5-epimerázu; a
c) expresi fúzovaného polynukleotidu.
30. Způsob významného zvýšení aktivity C5-epimerázy podle nároku 29, vyznačující se tím, že první polynukleotid obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence obsahuje aminokyseliny 35 až 154 z obrázku 3.
31. Způsob významného zvýšení aktivity C5-epimerázy podle nároku 29, vyznačující se tím, že první polynukleotid obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence obsahuje aminokyseliny 34 až 154 z obrázku 3.
32. Způsob významného zvýšení aktivity C5-epimerázy podle kteréhokoliv z nároků 15 až 17, vyznačující se tím, že C5-epimeráza je hovězí
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30418000P | 2000-12-08 | 2000-12-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20031809A3 true CZ20031809A3 (cs) | 2004-01-14 |
| CZ303693B6 CZ303693B6 (cs) | 2013-03-20 |
Family
ID=23175421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20031809A CZ303693B6 (cs) | 2000-12-08 | 2001-12-07 | Glukuronyl-C5-epimeráza, DNA ji kódující a zpusob jejího pouzití |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6887698B2 (cs) |
| EP (1) | EP1379639B1 (cs) |
| JP (1) | JP2004515239A (cs) |
| AT (1) | ATE301185T1 (cs) |
| AU (2) | AU2002217174B2 (cs) |
| BG (1) | BG107975A (cs) |
| CA (1) | CA2436728A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ303693B6 (cs) |
| DE (1) | DE60112476T2 (cs) |
| DK (1) | DK1379639T3 (cs) |
| EE (1) | EE05296B1 (cs) |
| ES (1) | ES2245707T3 (cs) |
| HK (1) | HK1060147A1 (cs) |
| HU (1) | HUP0500099A3 (cs) |
| PT (1) | PT1379639E (cs) |
| SK (1) | SK286819B6 (cs) |
| WO (1) | WO2002046379A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200304136B (cs) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7120162B1 (en) * | 2000-08-03 | 2006-10-10 | Skyworks Solutions, Inc. | System and method for processing audio and video data in a wireless handset |
| US6887698B2 (en) * | 2000-12-08 | 2005-05-03 | Biotie Therapies Corp. | Glucuronyl C5-epimerase, DNA encoding the same and uses thereof |
| WO2011110683A2 (en) * | 2010-03-12 | 2011-09-15 | Glyconova Srl | Glce as a target for anti-tumour therapy |
| DE202012012998U1 (de) | 2011-08-31 | 2014-06-13 | Daniel Elias | Bioaktive, regenerative Mischung zur Herstellung eines Ergänzungsnahrungsmittels |
| JP6478190B2 (ja) | 2013-06-12 | 2019-03-06 | 生化学工業株式会社 | ヘパロサン−グルクロン酸−５−エピメラーゼ、およびそれを用いた多糖の製造方法 |
| JP7088026B2 (ja) | 2017-01-19 | 2022-06-21 | 味の素株式会社 | ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法 |
| EP4050036A1 (en) | 2017-09-05 | 2022-08-31 | Ajinomoto Co., Inc. | 3-o-sulfation enzyme mutant, and method for using same |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9221163D0 (en) * | 1992-10-08 | 1992-11-25 | Nobipol And Protan Biopolymer | Dna compounds |
| IT1271057B (it) | 1994-11-04 | 1997-05-26 | Inalco Spa | Polisaccaridi aventi un elevato contenuto di acido iduronico |
| SE9701454D0 (sv) * | 1997-04-18 | 1997-04-18 | Ulf Lindahl | new DNA sequences and a process for enzyme manufacture |
| GB9710991D0 (en) * | 1997-05-28 | 1997-07-23 | Danisco | Enzyme |
| US7244601B2 (en) * | 1997-12-15 | 2007-07-17 | National Research Council Of Canada | Fusion proteins for use in enzymatic synthesis of oligosaccharides |
| JP2001145488A (ja) * | 1999-11-19 | 2001-05-29 | Natl Inst Of Advanced Industrial Science & Technology Meti | シロイヌナズナ由来のｇｄｐ−４−ケト−６−デオキシ−ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ遺伝子 |
| US6887698B2 (en) * | 2000-12-08 | 2005-05-03 | Biotie Therapies Corp. | Glucuronyl C5-epimerase, DNA encoding the same and uses thereof |
-
2001
- 2001-12-07 US US10/005,647 patent/US6887698B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-07 AU AU2002217174A patent/AU2002217174B2/en not_active Ceased
- 2001-12-07 PT PT01999640T patent/PT1379639E/pt unknown
- 2001-12-07 SK SK859-2003A patent/SK286819B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-12-07 AU AU1717402A patent/AU1717402A/xx active Pending
- 2001-12-07 AT AT01999640T patent/ATE301185T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-12-07 HU HU0500099A patent/HUP0500099A3/hu unknown
- 2001-12-07 CA CA002436728A patent/CA2436728A1/en not_active Abandoned
- 2001-12-07 CZ CZ20031809A patent/CZ303693B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-12-07 DE DE60112476T patent/DE60112476T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-07 DK DK01999640T patent/DK1379639T3/da active
- 2001-12-07 JP JP2002548097A patent/JP2004515239A/ja active Pending
- 2001-12-07 EP EP01999640A patent/EP1379639B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-07 ES ES01999640T patent/ES2245707T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-07 EE EEP200300265A patent/EE05296B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-12-07 WO PCT/FI2001/001068 patent/WO2002046379A2/en active IP Right Grant
-
2003
- 2003-05-28 ZA ZA200304136A patent/ZA200304136B/en unknown
- 2003-07-07 BG BG107975A patent/BG107975A/bg unknown
-
2004
- 2004-04-22 HK HK04102864A patent/HK1060147A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-04-11 US US11/102,643 patent/US7399626B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-07-08 US US12/216,602 patent/US20100261253A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20050181434A1 (en) | 2005-08-18 |
| JP2004515239A (ja) | 2004-05-27 |
| CZ303693B6 (cs) | 2013-03-20 |
| WO2002046379A2 (en) | 2002-06-13 |
| ATE301185T1 (de) | 2005-08-15 |
| AU2002217174B2 (en) | 2006-06-22 |
| EP1379639A2 (en) | 2004-01-14 |
| WO2002046379A3 (en) | 2003-11-06 |
| SK286819B6 (sk) | 2009-06-05 |
| EE200300265A (et) | 2003-10-15 |
| CA2436728A1 (en) | 2002-06-13 |
| EE05296B1 (et) | 2010-04-15 |
| US6887698B2 (en) | 2005-05-03 |
| HUP0500099A2 (hu) | 2005-05-30 |
| DK1379639T3 (da) | 2005-11-28 |
| SK8592003A3 (en) | 2004-03-02 |
| US20020127696A1 (en) | 2002-09-12 |
| US20100261253A1 (en) | 2010-10-14 |
| ZA200304136B (en) | 2004-05-04 |
| ES2245707T3 (es) | 2006-01-16 |
| PT1379639E (pt) | 2005-10-31 |
| EP1379639B1 (en) | 2005-08-03 |
| DE60112476T2 (de) | 2006-06-29 |
| HUP0500099A3 (en) | 2010-03-29 |
| HK1060147A1 (en) | 2004-07-30 |
| DE60112476D1 (de) | 2005-09-08 |
| US7399626B2 (en) | 2008-07-15 |
| BG107975A (bg) | 2004-11-30 |
| AU1717402A (en) | 2002-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100261253A1 (en) | Glucuronyl C5-Epimerase, DNA encoding the same and uses thereof | |
| US5965711A (en) | Antibody to serine protease precursor | |
| US6033893A (en) | Human cathepsin | |
| US6043033A (en) | Human prostate-associated protease | |
| US5837841A (en) | Human Reg protein | |
| US5972684A (en) | Carbonic anhydrase VIII | |
| US5925521A (en) | Human serine carboxypeptidase | |
| US6268164B1 (en) | Human goose-type lysozyme | |
| WO1998041633A1 (en) | Human pancreatitis-associated protein, pap-2 | |
| AU2002217174A1 (en) | Glucuronyl C5-epimerase, DNA encoding the same and uses thereof | |
| US20020068816A1 (en) | Novel human phoshatase inhibitor protein | |
| US5962226A (en) | Human RNA-binding protein | |
| US20030166136A1 (en) | Human C-type lectin | |
| JPH10500019A (ja) | ヒトのオキサリル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ | |
| US5858750A (en) | Human retinol dehydrogenase type II homolog | |
| US6010879A (en) | Polynucleotides encoding human mitochondrial chaperone proteins | |
| US6130077A (en) | Human cytochrome P450 | |
| WO2000011164A1 (en) | Human angiopoietin-3 | |
| US5972654A (en) | Human microfibril-associated glycoprotein 4 splice variant | |
| US5834241A (en) | Vesicle trafficking protein | |
| JP2001500007A (ja) | ヒト誘発性腫瘍タンパク質 | |
| US7273724B1 (en) | Polypeptide-human actin-binding protein 54 and a polynucleotide encoding the same | |
| WO2001038543A1 (fr) | NOUVEAU POLYPEPTIDE, ACYL-CoA REDUCTASE HUMAINE 55, ET POLYNUCLEOTIDE CODANT POUR CE POLYPEPTIDE | |
| JPH06121673A (ja) | Δ４−３−ケトステロイド−５β−還元酵素を生産する実質上純粋な細胞 | |
| WO2001040286A1 (fr) | Proteine humaine du cerveau associee au chromosome x et polynucleotide codant pour ce polypeptide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130607 |