ES2245707T3

ES2245707T3 - Glucuronilo c5-epimerasa del raton, adn codante para esta y utilizacion asociada.

Info

Publication number: ES2245707T3
Application number: ES01999640T
Authority: ES
Inventors: Markku Jalkanen; Kamel El Darwish; Ulf Lindahl; Jin-Ping Li
Original assignee: Biotie Therapies Corp
Current assignee: Biotie Therapies Corp
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2006-01-16
Anticipated expiration: 2021-12-07
Also published as: WO2002046379A2; US7399626B2; HUP0500099A3; CA2436728A1; EP1379639A2; EE05296B1; CZ303693B6; AU2002217174B2; SK8592003A3; DK1379639T3; DE60112476T2; CZ20031809A3; AU1717402A; EP1379639B1; US20100261253A1; SK286819B6; HK1060147A1; WO2002046379A3; BG107975A; US20020127696A1

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia que consta de los aminoácidos 1-618.

Description

Glucuronilo C5-epimerasa del ratón, ADN codante para esta y utilización asociada.

La invención está dentro del campo de las proteínas recombinantes y, especialmente, de las glucuronil C5-epimerasas y de la utilización de las mismas para modificar glucosaminoglicanos.

Antecedentes de la invención

La glucuronil C5-epimerasa (en la presente, "C5-epimerasa") cataliza la conversión del ácido D-glucurónico
(GlcA) en ácido L-idurónico (IdoA) en la segunda etapa de modificación polimérica de la síntesis de heparina/heparán sulfato (HS). La epimerasa implicada en la síntesis de heparina/HS requiere de manera absoluta N-sulfato en el lado no reductor del HexA diana, la formación del cual está catalizada por una N-Desacetilasa-N-sulfotransferasa (NDST) en la primera etapa (precedente) de modificación biosintética del polímero. Además, la epimerasa es inhibida por grupos O-sulfato próximos a su lugar de acción, por lo que las etapas posteriores de O-sulfatación en la ruta biosintética de la heparina inhiben la epimerización o la retroepimerización. La reacción implica la sustracción reversible y la nueva adición de un protón en C5 del ácido hexurónico diana, a través de un carbanión intermedio, y se cree que implica a dos aminoácidos básicos polipróticos (esp. Lys).

La C5-epimerasa, igual que otros enzimas implicados en la biosíntesis de heparina/HS, parece estar unida o asociada a la membrana en el Golgi. Y lo que es más interesante, la epimerasa solubilizada cataliza ambas reacciones (reversibles), pero no es detectable ninguna retroepimerización en las fracciones microsomales. La proteína C5-epimerasa activa fue purificada y caracterizada por vez primera a partir del hígado (Campbell y col., J. Biol. Chem. 269:26953-26958 (1994)).

Campbell, P. y col. describieron la purificación de la D-glucuronil C5-epimerasa a partir de hígado bovino
(Campbell y col., J. Biol. Chem. 269:26953-26958 (1994)), y se han descrito también varias secuencias de ADN. Aunque el tamaño pronosticado de la C5-epimerasa bovina a partir de secuencias de ADN genómico y de ADNc es 70,1 kD (618 aminoácidos) (se discute más adelante), el preparado nativo más purificado extraído igual que anteriormente contenía especies predominantes de 52 y 20 kDa, indicando que podría haber tenido lugar un corte proteolítico (procesamiento). La detección de actividad en las fracciones de mayor PM (200 kDa) procedentes de cromatografía por exclusión de tamaños, indicaba que podría tener lugar una agregación o una oligomerización. El enzima tiene un amplio rango de pH de actividad (6,5-7,5), siendo el óptimo 7,4. El enzima no requiere un ión metálico ni otro cofactor. Los estudios cinéticos revelaron inesperadamente que la K_{m} aumentaba al incrementar la concentración del enzima, lo cual estaba relacionado probablemente con el sustrato polimérico y el impedimento estérico, y/o la oligomerización de las moléculas de epimerasa.

Recientemente, Lindahl, U. y Li, J-P., WO98/48006, purificaron la C5-epimerasa de 52 kDa a partir de hígado bovino y obtuvieron una secuencia de aminoácidos parcial. Se produjeron cebadores frente a una secuencia interna y se utilizaron para amplificar una secuencia de una preparación de ADNc de hígado bovino. La secuencia de hígado bovino fue utilizada para someter a selección una biblioteca de ADNc de pulmón bovino. Se encontró una secuencia que tenía un marco de lectura abierto de 444 aminoácidos, la cual correspondía a un polipéptido de 49,9 kDa. Se manifestó que el enzima previamente aislado de hígado bovino era una forma truncada de la proteína nativa. El ARN total de hígado bovino, pulmón y mastocitoma de ratón fue analizado mediante hibridación con el clon de ADNc de la epimerasa de pulmón bovino. El hígado bovino y el pulmón bovino dieron ambos resultados idénticos, con un transcrito dominante de 9 kb aproximadamente y una banda débil de 5 kb. El ARN de mastocitoma de ratón solamente mostraba el transcrito de 5 kb aproximadamente.

La descripción del clonaje de un ADNc que codificaba una C5-epimerasa de pulmón bovino aparecía también en Li y col., J. Biol. Chem. 272:28158-28163 (1997). Li y col. clonaron y expresaron la epimerasa de pulmón bovino en una sistema de baculovirus/células de insecto, que asignó actividad por primera vez a una secuencia clonada (recombinante). La proteína recombinante activa no fue purificada para una asignación definitiva.

Se han descrito secuencias de ADNc de C5-epimerasa de Drosophila (Número de Acceso del GenBank AAF
57373), C. elegans (Número de Acceso del GenBank P46555) y Methanococcus (Número de Acceso del GenBank U67555).

La actividad enzimática de la epimerasa bovina recombinante descrita por Lindahl y col. era relativamente baja. Sin embargo, los intentos para expresar la C5-epimerasa de pulmón bovino, la única epimerasa de mamífero clonada, en sistemas que podrían dar lugar a una mejor producción, fracasaron. Se ha intentado la expresión en células de mamífero, en Saccharomyces cerevisiae y en E. coli. Hasta la fecha, no ha habido informes de la producción con éxito de una C5-epimerasa activa soluble. Por tanto, no ha sido posible extender los primeros resultados del sistema celular de baculovirus a otros sistemas recombinantes, ni tampoco utilizar los métodos de expresión convencionales tales como sistemas de mamífero, levadura y bacterianos para la expresión de este enzima.

Por tanto, permanece la necesidad en la técnica de una C5-epimerasa altamente activa, y de métodos para la producción de mayores cantidades de la misma.

Resumen de la invención

Reconociendo la existencia de problemas de naturaleza indefinida en la expresión de epimerasas recombinantes de origen mamífero, y conociendo la necesidadde un método útil para expresar y producir cantidades útiles de la C5-epimerasa, los inventores investigaron métodos para la producción de C5-epimerasa recombinante. Los estudios culminaron con el descubrimiento de un nuevo gen de ratón, y de la proteína C5-epimerasa de ratón codificada por el mismo. La C5-epimerasa de la invención es única en cuanto a que, inter alia, contiene secuencias adicionales en su extremo N en comparación con las secuencias de la proteína C5-epimerasa conocida en la técnica. Se ha descubierto inesperadamente que la fusión del fragmento N-terminal de la C5-epimerasa de ratón, o versiones acortadas del mismo, al extremo N de otras C5-epimerasas incrementa enormemente la actividad de esas otras C5-epimerasas recombinantes en órdenes de magnitud. Por tanto, la extensión del extremo N de ratón puede ser utilizada para facilitar la expresión de secuencias que estén unidas operativamente a la misma y, especialmente, la expresión de formas nativas (hígado murino) y heterólogas (no murinas y murinas no hepáticas) de C5-epimerasas en sistemas recombinantes.

Por consiguiente, en una primera realización, la invención está dirigida a polinucleótidos purificados y/o aislados que codifican una C5-epimerasa de hígado de ratón (murina) y a vectores y huéspedes recombinantes para el mantenimiento y la expresión de los mismos.

En una realización más, la invención está dirigida a la proteína C5-epimerasa de hígado de ratón purificada y/o aislada codificada por tales polinucleótidos, o a preparaciones conteniendo la misma.

En una realización más, la invención está dirigida a métodos para producir la C5-epimerasa de ratón utilizando tales polinucleótidos y los vectores y huéspedes recombinantes de la invención para expresar la misma.

En una realización adicional, la invención está dirigida a polinucleótidos, especialmente polinucleótidos purificados y/o aislados, que codifican una proteína de fusión, conteniendo tal proteína de fusión la secuencia N-terminal de la C5-epimerasa de ratón, unida operativamente en marco a la secuencia de aminoácidos de una proteína deseada y, especialmente, a una secuencia de C5-epimerasa heteróloga, y a vectores y huéspedes para el mantenimiento y la expresión de tales polinucleótidos.

En una realización más, la invención está dirigida a la proteína de fusión de la C5-epimerasa purificada y/o aislada codificada por tales polinucleótidos.

En una realización más, la invención está dirigida a métodos para producir una proteína deseada, mediante la unión operativa de un polinucleótido que codifica la C5-epimerasa de ratón, o de su secuencia N-terminal, a un polinucleótido que codifica tal proteína de interés deseada, y la expresión de la misma en un huésped recombinante de la invención.

En una realización más, la invención está dirigida a secuencias de polinucleótidos y a vectores que proporcionan polinucleótidos que codifican la secuencia polinucleotídica del fragmento N-terminal de una C5-epimerasa de ratón, teniendo tales polinucleótidos y vectores sitios de restricción deseados en el extremo 3' del fragmento para la inserción (enlace) de una secuencia deseada a los mismos, especialmente de una secuencia que codifica una proteína de interés y, muy especialmente, de otra secuencia de epimerasa.

En una realización más, la invención está dirigida a métodos para utilizar la secuencia N-terminal de la C5-epimerasa de ratón para la expresión de secuencias nativas y heterólogas unidas a la misma.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Secuencia de ADN de una proteína de fusión que tiene la secuencia de la C5-epimerasa bovina (no negrita) y el extremo N de la C5-epimerasa de ratón (negrita). El marco de lectura abierto (ORF) que muestra la secuencia codificadora del polipéptido está subrayado.

Figura 2. Secuencia de ADN completa de la C5-epimerasa de ratón.

Figura 3. Secuencia de aminoácidos completa de la C5-epimerasa de ratón.

Figura 4. Análisis de alineación de la C5-epimerasa de ratón con otras secuencias que muestra las regiones de homología. Las puntuaciones están mostradas en la línea superior y están enumeradas en la columna después de la de la fuente de la secuencia. Las secuencias están tomadas de las fuentes siguientes: línea 2: hígado de ratón; línea 3: pulmón bovino; línea 4: EST humana; línea 5: Drosophila; línea 6: C. elegans; línea 7: Methanococcus.

Figura 5. Representación en forma de diagrama de la estructura de los dominios de la C5-epimerasa. Recuadro rectangular de relleno en el extremo N: secuencia señal (secuencia transmembranal (TM) altamente hidrofóbica); recuadros rectangulares rayados: secuencias transmembranales (TM) hidrofóbicas o secuencias enmascaradas); recuadros rectangulares rellenos dentro del péptido: secuencias peptídicas conservadas que tienen más de un 50% de similitud con la proteína hipotética de 71,9 kD de C. elegans.

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Figura 6A-6B. Figura 6A: Representaciones en forma de diagrama de los productos de las construcciones de C5-epimerasa (bovina) recombinante marcadas. i: Primera construcción de C5-epimerasa (bovina) recombinante marcada activa. La actividad específica era de 5 x 10^{5} cpm/mg/h. ii: La construcción de C5 recombinante más activa (completa de ratón). La actividad específica era de 2 x 10^{9} cpm/mg/h. iii: Construcción quimérica que tiene secuencias de ratón y bovinas. La actividad era un 87% de la actividad de la secuencia de ratón de longitud completa. iv: Construcción truncada de ratón. La actividad es la misma que la de la construcción bovina de "i". Figura 6B: información sobre la secuencia y los dominios de la marca que precedía a cada una de las construcciones recombinantes de la Figura 6A.

Figura 7. Resultados de los ensayos de actividad de la C5-epimerasa de ratón (mC5).

Figura 8. Transferencia Western teñida con anti-FLAG. Calle 1: estándares de peso molecular (New England Biolabs' Broad Range, preteñidos). Calle 2: muestra de C5-epimerasa de ratón (mC5).

Figura 9. Transferencia Western de las proteínas en el medio de líneas celulares de insecto estables de clones que contienen diferentes C5-epimerasas recombinantes marcadas teñidas con el anticuerpo anti-FLAG.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Se clonó un gen de hígado de ratón que codificaba la C5-epimerasa. La secuencia de nucleótidos está mostrada en la Figura 2. Se encontró que la secuencia de aminoácidos de la proteína C5-epimerasa de hígado de ratón tenía 618 aminoácidos de longitud (Figura 3), con un peso molecular de 71.180,1 daltons (71,18 kDa). La C5-epimerasa de ratón tiene un punto isoeléctrico de 8,25 y una carga neta a pH 7 de +4,01.

La secuencia de aminoácidos de la C5-epimerasa de hígado de ratón, sin ninguna extensión N-terminal, es homóloga (>96% de identidad de aminoácidos) a la secuencia de la C5-epimerasa bovina. Sin embargo, el análisis de la secuencia reveló que el extremo N del enzima que está codificado por la secuencia genómica de ratón contenía 154 aminoácidos (aa) adicionales que habían "desaparecido" de la secuencia bovina clonada.

La secuencia codificadora de ratón mostraba >95% de identidad peptídica con las secuencias bovina y humana correspondientes (marca de la secuencia expresada de la biblioteca de ADNc de cerebro), >50% de similitud con una proteína hipotética de 71,9 kDa procedente de la secuencia expresada de C. elegans y un 38% de similitud con una proteína procedente de una secuencia expresada de especies de Methanococcus.

La topología transmembranal pronosticada (representación gráfica de la hidrofobicidad) del enzima C5-epimerasa de ratón se asemeja a la de NDST. Estas y otras observaciones (por ejemplo, la velocidad de síntesis de heparina) indicaban que la C5-epimerasa y otros enzimas de la biosíntesis de heparina están probablemente asociados en un complejo in vivo.

La C5-epimerasa de ratón recombinante, según es expresada y secretada por una señal en una célula de insecto, del sistema de baculovirus/células de insecto, es muy estable en medio a 4ºC. La purificación de la C5-epimerasa recombinante puede incluir, pero no se limita a, procesos tales como cromatografía de intercambio catiónico o cromatografía de afinidad. Por ejemplo, la proteína recombinante puede ser manipulada de tal manera que la proteína contenga una marca FLAG o una marca His que esté en cualquiera de los extremos de la proteína recombinante. Como apreciará una persona con experiencia habitual en la técnica, en tales casos, la proteína recombinante puede ser purificada utilizando resinas disponibles comercialmente que utilizan, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-FLAG para capturar la proteína recombinante que contenga el epítopo FLAG.

El enzima es analizado muy rápidamente mediante extracción bifásica del tritio liberado de un sustrato marcado de C5 en un cóctel de centelleo orgánico y contaje, aunque la confirmación final de la actividad es mediante análisis de RMN del producto convertido según se describe en los ejemplos.

El enzima de hígado de ratón nativo tiene una actividad específica de 5-10 x 10^{9} cpm/mg/h, mientras que la de la forma recombinante del enzima de ratón era de 2 x 10^{9} cpm/mg/h aproximadamente. Por comparación, el enzima bovino recombinante tiene una actividad específica de 0,5-1,0 x 10^{6} cpm/mg/h aproximadamente. Por tanto, el enzima de ratón recombinante es una C5-epimerasa especialmente activa.

Inesperadamente, se encontró que el extremo N de 154 aminoácidos (aa) de la C5-epimerasa de ratón, y especialmente ciertos fragmentos del mismo, tiene la capacidad de poder incrementar enormemente la actividad enzimática C5-epimerasa de otras C5-epimerasas cuando se fusiona en marco al extremo N de las mismas. Este fragmento adicional de 154 aminoácidos (aa) parece tener al menos tres características que son deseables para la expresión recombinante y la secreción de una C5-epimerasa activa. En primer lugar, incluye una secuencia que se cree que funciona como una secuencia señal compuesta por los primeros 33-34 residuos (aminoácidos 1-33 ó 1-34 de la Figura 3). En segundo lugar, proporciona residuos de cisteína adicionales que son responsables de la formación de enlaces disulfuro y la estabilización de la estructura secundaria de la proteína. En tercer lugar, proporciona un sitio de amidación que es consistente con un sitio útil para el procesamiento proteolítico post-traduccional.

Fragmentos de la secuencia de 154 aminoácidos que carecen de la secuencia señal poseen todavía la capacidad de incrementar la actividad de epimerasas heterólogas, y especialmente de C5-epimerasas, a las que están unidos operativamente. Por ejemplo, según se muestra en los ejemplos, una proteína de fusión que contenía los aminoácidos 34-154 unidos directamente en marco al extremo N de la C5-epimerasa bovina, incrementaba la actividad de la C5-epimerasa bovina más de 100 veces.

Moléculas de ácido nucleico

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas, que comprenden:

(1) un polinucleótido que codifica el polipéptido C5-epimerasa de hígado de ratón que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3.

(2) un polinucleótido que codifica fragmentos útiles del polipéptido C5-epimerasa de hígado de ratón que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3, incluyendo tales fragmentos útiles, pero sin limitarse a, (a) fragmentos que proporcionan la secuencia señal de aminoácidos 1-33 ó 1-34; (b) fragmentos que proporcionan la secuencia de la proteína C5-epimerasa de hígado de ratón madura y, especialmente, los aminoácidos 33-618 ó 34-618, y (c) fragmentos que proporcionan la secuencia del fragmento del extremo N que estimula la actividad y que tiene los aminoácidos 1-154, incluyendo fragmentos del mismo tales como los aminoácidos 33-154 ó 34-154 que poseen la capacidad de incrementar la actividad de otras C5-epimerasas a las que están unidos operativamente.

A no ser que se indique de otro modo, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por la secuenciación de una molécula de ADN de la presente fueron determinadas según se describe en los ejemplos, y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de ADN determinadas en la presente fueron pronosticadas mediante la traducción de una secuencia de ADN determinada igual que anteriormente. Por tanto, como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada mediante este procedimiento, cualquiera de las secuencias de nucleótidos determinadas en la presente puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas de manera automatizada son típicamente al menos un 90% idénticas aproximadamente, más típicamente al menos un 95% idénticas aproximadamente, y al menos un 99,9% idénticas aproximadamente a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real puede ser determinada con más precisión mediante otros procedimientos, incluyendo los métodos manuales de secuenciación de ADN que son bien conocidos en la técnica. Como también es conocido en la técnica, una única inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada, comparada con la secuencia real, producirá un desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos, de tal manera que la secuencia de aminoácidos pronosticada codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de tal inserción o deleción.

Por "secuencia de nucleótidos" de una molécula de ácido nucleico o de un polinucleótido se quiere indicar, para una molécula o un polinucleótido de ADN, una secuencia de desoxirribonucleótidos, y para una molécula o polinucleótido de ARN, la secuencia correspondiente de ribonucleótidos (A, G, C y U), en la que cada desoxirribonucleótido de timidina (T) de la secuencia de desoxirribonucleótidos especificada está sustituida por el ribonucleótido uridina (U).

Utilizando la información proporcionada en la presente, tal como la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras y en el listado de secuencias, puede obtenerse una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido C5-epimerasa, o una construcción quimérica del mismo, utilizando procedimientos estándar de clonaje y selección, tales como los procedimientos para el clonaje de ADNcs utilizando ARNm como material de partida. Ilustrativa de la invención, la molécula de ácido nucleico de la C5-epimerasa descrita en las Figuras 2 y 3 fue descubierta en una biblioteca de ADNc derivada de tejido hepático (hígado) murino.

La secuencia de nucleótidos determinada del ADN de la C5-epimerasa de la Figura 2 contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 618 residuos de aminoácidos aproximadamente, con un codón de inicio en el nucleótido en posición 1 de las secuencias de nucleótidos de la Figura 2.

Como apreciaría una persona con experiencia habitual, debido a la posibilidad de errores de secuenciación según se discutió anteriormente, el polipéptido C5-epimerasa completo real codificado por la secuencia de la Figura 2, que comprende 618 aminoácidos aproximadamente según se muestra en la Figura 3, puede ser algo más largo o algo más corto. En cualquier caso, según se discute adicionalmente más adelante, la invención proporciona además polipéptidos que tienen varios residuos eliminados del extremo N o del extremo C del polipéptido completo, incluyendo polipéptidos que carecen de uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C del dominio extracelular descrito en la presente.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen aquéllas que codifican una secuencia señal de la C5-epimerasa, según se muestra en la Figura 3, la cual está formada por los aminoácidos 1-33 o los aminoácidos 1-34 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3. Tales moléculas pueden ser unidas operativamente en marco a cualquier secuencia de nucleótidos deseada, especialmente a una que codifique una proteína de interés que se desea que sea secretada por un huésped en el que la secuencia señal de la C5-epimerasa sea capaz de secreción.

Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen aquéllas que codifican la secuencia "intensificadora de la actividad heteróloga" de la C5-epimerasa de hígado de ratón que está formada por los aminoácidos 1-154, o al menos 30 aminoácidos de la misma, según se muestra en la Figura 3. Lo que se quiere indicar por el término ácido nucleico "heterólogo" es bien conocido por las personas con experiencia habitual en la técnica, y significa que deriva del ácido nucleico de una especie diferente. Preferiblemente, tales moléculas de ácido nucleico codifican los aminoácidos 1-154, 33-154 ó 34-154 según se muestra en la Figura 3, más o menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos de uno o ambos extremos. Un ácido nucleico que codifique tal polipéptido puede ser unido operativamente, en marco, a la secuencia codificadora de otra epimerasa, especialmente de otras C5-epimerasas, con el resultado de que una proteína de fusión es codificada por la construcción del ácido nucleico. En una realización preferida, las secuencias intensificadoras de la actividad heteróloga son expresadas en el extremo N de la proteína de fusión y están unidas al extremo N de otra proteína cuya actividad es incrementada por la presencia de la secuencia de ratón, muy especialmente una C5-epimerasa que no sea de ratón o un isozima de la C5-epimerasa de ratón.

Según se ha indicado, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc y ADN genómico obtenido mediante clonaje o producido de manera sintética. El ADN puede ser de doble hebra o de hebra sencilla. El ADN de hebra sencilla o el ARN puede ser la hebra codificadora, conocida también como hebra sentido, o puede ser la hebra no codificadora, referida también como hebra antisentido.

Por el término molécula(s) de ácido nucleico "aislada(s)" se quiere indicar una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido extraída de su entorno nativo. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran "aisladas" para los fines de la presente invención. Ejemplos adicionales de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en células huésped heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcialmente o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la presente invención incluyen además las moléculas producidas de manera sintética.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención incluyen moléculas de ADN que contienen un marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína C5-epimerasa o una proteína de fusión de la invención. Las moléculas de ADN que contienen la secuencia codificadora de la proteína C5-epimerasa según se muestra en la Figura 2, o de un fragmento deseado de la misma; y las moléculas de ADN que contienen una secuencia sustancialmente diferente de las descritas anteriormente, pero que, debido a la degeneración del código genético, codifican todavía la secuencia de aminoácidos de la proteína C5-epimerasa según se muestra en la Figura 3. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. Por tanto, sería cuestión de rutina para una persona experta en la técnica generar tales variantes degeneradas. En una realización adicional, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido C5-epimerasa igual que anteriormente, pero que carece de la metionina N-terminal, o la secuencia señal codificada por los aminoácidos 1-33 ó 1-34 según se muestra en la Figura 3, o que tienen la secuencia codificadora de una secuencia señal diferente (heteróloga) unida operativamente a los mismos.

La invención proporciona además no solamente las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas, sino también moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias complementarias a las secuencias anteriores. Tales moléculas aisladas, particularmente moléculas de ADN, son útiles como sondas para la generación de mapas génicos, mediante hibridación in situ con cromosomas, y para la detección de la expresión del gen de la C5-epimerasa en varias especies y tejidos mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern.

La presente invención está dirigida además a fragmentos de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente que conservan una propiedad deseada o que codifican un polipéptido que conserva una propiedad o una actividad deseadas. Por un fragmento de una molécula de ácido nucleico aislada, según se describe en la presente, se quiere indicar fragmentos de al menos 15 nucleótidos (nt) aproximadamente, y más preferiblemente de al menos 20 nt aproximadamente, todavía más preferiblemente de al menos 30 nt aproximadamente, e incluso más preferiblemente de al menos 40 nt aproximadamente de longitud que son útiles como sondas y cebadores para diagnóstico según se discute en la presente, o que proporcionan motivos o dominios deseados a una construcción de una proteína de fusión. Por supuesto, fragmentos mayores de 50-300 nt, o incluso de 600 nt de longitud son también útiles de acuerdo con la presente invención, igual que lo son los fragmentos correspondientes a la mayor parte, si no a toda, de la secuencia de nucleótidos del ADN mostrado en la Figura 2 o que codifiquen la secuencia de aminoácidos de la Figura 3. Por un fragmento de al menos 20 nt de longitud, cuando se compara con el de la Figura 2, se quiere indicar, por ejemplo, un fragmento que incluya 20 o más bases contiguas de la secuencia de nucleótidos según se muestra en la Figura 2.

En particular, la invención proporciona polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que representa la porción de la mostrada en la Figura 2 o que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3. Se contemplan también polinucleótidos que codifican polipéptidos C5-epimerasa que carecen de una metionina aminoterminal. Se proporcionan también polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, comprendiendo tales polipéptidos una secuencia de aminoácidos en las posiciones 2 a 618 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3, pero careciendo de una metionina aminoterminal.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con una porción de, o preferiblemente con todo, el polinucleótido de una molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente. Una porción, podría ser cualquier porción deseada, por ejemplo el polinucleótido de la Figura 2 que codifica los aminoácidos 1-154 ó 33-154 ó 34-154. Por el término "condiciones de hibridación rigurosas" se indica una incubación a 42ºC durante una noche en una solución que comprende: formamima 50%, SSC 5x (NaCl 750 mM, citrato trisódico 72 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5x, dextrán sulfato 10% y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, cortado, seguido por lavado de los filtros en SSC 0,1x a 65ºC aproximadamente.

Por el término polinucleótido que hibrida con una "porción" de un polinucleótido, se quiere indicar un polinucleótido (ADN o ARN) que hibrida con al menos 15 nucleótidos (nt) aproximadamente, y más preferiblemente con al menos 20 nt aproximadamente, todavía más preferiblemente con al menos 30 nt aproximadamente e incluso más preferiblemente con 30-70 (por ejemplo, 50) nt aproximadamente del polinucleótido de referencia. Éstos son útiles como sondas y cebadores para diagnóstico según se discutió anteriormente y según se discutirá con más detalle más adelante.

Por una porción de un polinucleótido de "al menos 20 nt de longitud", por ejemplo, se hace referencia a 20 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 2). Por supuesto, un polinucleótido que hibride solamente con una secuencia de poli A, o con un tramo complementario de residuos de T (o de U), no estaría incluido en un polinucleótido de la invención utilizado para hibridar con una porción de un ácido nucleico de la invención, ya que tal polinucleótido hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contuviera un tramo de poli (A) o con el complemento de la misma (por ejemplo, prácticamente con cualquier clon de ADNc de doble hebra).

Según se ha indicado, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican un polipéptido C5-epimerasa pueden incluir, pero no se limitan a, la secuencia codificadora del polipéptido, por sí misma (denominada también C5-epimerasa madura cuando carece de la señal de secreción); la secuencia codificadora del polipéptido y secuencias adicionales, tales como las que codifican una secuencia líder o de secreción, tal como una secuencia de pre-, o pro- o prepro-proteínas; la secuencia codificadora del polipéptido, con o sin las secuencias codificadoras adicionales anteriormente mencionadas, junto con secuencias no codificadoras adicionales, incluyendo por ejemplo, pero sin limitarse a, intrones y secuencias 5' y 3' no codificadoras, tales como las secuencias transcritas no traducidas que tienen una función en la transcripción, en el procesamiento del ARNm - incluyendo señales de ayuste y poliadenilación, por ejemplo - en la unión a ribosomas y en la estabilidad del ARNm; una secuencia codificadora adicional que codifique aminoácidos adicionales tales como los que proporcionan grupos funcionales adicionales. Así, por ejemplo, el polipéptido puede ser fusionado a una secuencia marcadora, tal como un péptido, que facilite la purificación del polipéptido fusionado (que contiene el marcador). En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido hexa-histidina, tal como la marca proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Según está descrito en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación idónea de la proteína de fusión. La marca "HA" es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza, que ha sido descrito por Wilson y col., Cell 37:767-778 (1984).

Polinucleótidos variantes y mutantes

La presente invención se refiere además a variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican porciones, análogos o derivados de la C5-epimerasa. Las variantes pueden acontecer de forma natural, tal como una variante alélica natural. Por una "variante alélica" se quiere indicar una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Las variantes que no se dan en la naturaleza pueden ser producidas utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en el oficio.

Tales variantes incluyen las producidas por sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas en las regiones codificadoras, en las regiones no codificadoras o en ambas. Las alteraciones en la regiones codificadoras pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Especialmente preferidas entre éstas son las sustituciones, adiciones y deleciones silentes, que no alteran las propiedades ni las actividades del polipéptido C5-epimerasa o de porciones del mismo. Son especialmente preferidas también a este respecto las sustituciones conservadoras.

Realizaciones adicionales de la invención incluyen una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 80% idéntica a, y más preferiblemente al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consta de: (a) aminoácidos 1 a 118 de la Figura 3; (b) aminoácidos 1 a 119 de la Figura 3; (c) aminoácidos 1 a 120 de la Figura 3; (d) aminoácidos 1 a 121 de la Figura 3; (e) aminoácidos 119 a 618 de la Figura 3; (f) aminoácidos 120 a 618 de la Figura 3; (g) aminoácidos 121 a 618 de la Figura 3; (h) aminoácidos 122 a 618 de la Figura 3; (i) aminoácidos 34 a 147 de la Figura 3; (j) aminoácidos 35 a 154 de la Figura 3; (k) aminoácidos 34 a 154 de la Figura 3 y (l) aminoácidos 1 a 154 de la Figura 3; (m) la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la Figura 3.

Realizaciones adicionales de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con un polinucleótido de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), anterior. Este polinucleótido que hibrida no hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos que conste de solamente residuos de A o de solamente residuos de T.

Por un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido C5-epimerasa, se quiere indicar que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido C5-epimerasa. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos un 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia pueden estar eliminados o sustituidos por otro nucleótido, o varios nucleótidos hasta un 5% de los nucleótidos totales de la secuencia de referencia pueden estar insertados en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden tener lugar en posición 5' terminal o en posición 3' terminal de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como cuestión práctica, puede determinarse de manera convencional si cualquier molécula de ácido nucleico particular es al menos un 90%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 2, mediante la utilización de programas de ordenador conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). El programa Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, un 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se establecen, por supuesto, de tal manera que el porcentaje de identidad sea calculado sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y se permitan huecos en la homología de hasta un 5% del número total de nucleótidos de la secuencia de referencia.

La presente solicitud está dirigida a moléculas de ácido nucleico al menos un 90%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% idénticas a una secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 2, independientemente de si codifican o no un polipéptido con actividad C5-epimerasa. Esto es debido a que, incluso cuando una molécula de ácido nucleico particular no codifica un polipéptido con actividad C5-epimerasa, una persona con experiencia en la técnica sabría aún así cómo utilizar la molécula de ácido nucleico como, por ejemplo, una sonda de hibridación o un cebador de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las utilizaciones de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido con actividad C5-epimerasa incluyen, inter alia: (1) el aislamiento de un gen de la C5-epimerasa o de variantes alélicas del mismo de una biblioteca de ADNc; (2) la hibridación in situ (por ejemplo, "FISH") con extensiones de cromosomas en metafase para proporcionar la posición cromosómica precisa del gen de la C5-epimerasa, según está descrito en Verma y col., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); y análisis de Transferencia Northern para detectar la expresión del ARNm de C5-epimerasa en tejidos específicos.

Se prefieren, sin embargo, moléculas de ácido nucleico que tengan secuencias al menos un 90%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% idénticas a una secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 2 que codifiquen, de hecho, un polipéptido con actividad C5-epimerasa. Por "un polipéptido con actividad C5-epimerasa" se hace referencia a polipéptidos que presenten una actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la C5-epimerasa de la invención (la proteína de longitud completa o preferiblemente el fragmento de aminoácidos identificado que contiene los aminoácidos 33-618 o 34-618), medida en un ensayo biológico particular.

Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, una persona con experiencia habitual en la técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de moléculas de ácido nucleico con una secuencia al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de un ADNc depositado o a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 2, codificarán un polipéptido "con actividad de la proteína C5-epimerasa". De hecho, como variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican todas el mismo polipéptido, esto será obvio para el técnico experto incluso sin realizar el ensayo de comparación anteriormente descrito. Se reconocerá además en la técnica que, para tales moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable codificará también un polipéptido con actividad de la proteína C5-epimerasa. Esto es debido a que el técnico experto es totalmente consciente de las sustituciones de aminoácidos que es menos probable que, o que no es probable que, afecten significativamente la función de la proteína (por ejemplo, la sustitución de un aminoácido alifático por un segundo aminoácido alifático), según se describe adicionalmente más adelante.

Vectores y células huésped

La presente invención se refiere también a vectores que incluyen las moléculas de ADN aisladas de la presente invención, a células huésped que son manipuladas genéticamente con los vectores recombinantes de la invención y a la producción de polipéptidos C5-epimerasa o de fragmentos de los mismos mediante técnicas recombinantes.

Los polinucleótidos pueden ser unidos a un vector que contenga un marcador seleccionable para su propagación en un huésped. Generalmente, un vector plasmídico es introducido en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, puede ser empaquetado in vitro utilizando una línea celular de enpaquetamiento apropiada y transducido posteriormente a células huésped.

El inserto de ADN debe ser unido operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los promotores tempranos y tardíos de SV40 y los promotores de las LTRs retrovirales, para enumerar unos cuantos. Otros promotores adecuados serán conocidos por el técnico experto. Las construcciones de expresión contendrán además sitios para el inicio de la transcripción, sitios de terminación de la transcripción y, en la región transcrita, un sitio de unión de ribosomas para la traducción. La porción codificadora de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirá preferiblemente un iniciador de la traducción en el comienzo y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) situado apropiadamente en el extremo del polipéptido que va a ser traducido.

Según se ha indicado, los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa o el gen de resistencia a neomicina para un cultivo de células eucarióticas y genes de resistencia a tetraciclina o a ampicilina para el cultivo en E. coli y en otras bacterias. Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas tales como E. coli, Corynebacterium, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como Aspergillus, Aspergillus niger o Trichoderma, o células de levadura tales como Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae; células de insecto tales como células S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; células animales tales como células CHO, COS y células de melanoma de Bowes; y células vegetales. Los huéspedes preferidos incluyen células de insecto. Los medios y las condiciones de cultivo apropiados para las células huésped anteriormente descritas son conocidos en la técnica.

Entre los vectores preferidos para ser utilizados en bacterias están incluidos pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles en Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles en Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, disponibles en Pharmacia. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles en Stratagene y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. Los vectores víricos incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovíricos, vectores poxvíricos, incluyendo virus vaccinia y vectores adenovíricos. Otros vectores adecuados serán fácilmente obvios para el técnico experto.

La introducción de la construcción en la célula huésped puede ser efectuada mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos están descritos en muchos manuales estándar de laboratorio, tales como Davis y col., Basic Methods In Molecular Biology (1986).

Polipéptidos y fragmentos

La invención proporciona además un polipéptido C5-epimerasa aislado o purificado que tiene las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de aminoácidos de la Figura 3, o un péptido o polipéptido que comprende una porción del polipéptido anterior, especialmente como el descrito anteriormente y codificado por una molécula de ácido nucleico descrita anteriormente.

La invención proporciona además proteínas de fusión que contienen una porción funcional del extremo N de la C5-epimerasa de ratón fusionada en su extremo C con el extremo N de una proteína de interés, tal como, por ejemplo, la secuencia señal de aminoácidos 1-33 o 1-34 según se muestra en la Figura 3, o la secuencia intensificadora de la actividad de aminoácidos 1-154, 33-154 ó 34-154 según se muestra en la Figura 3. En una realización, la proteína de interés es fusionada a una porción del extremo N que contiene desde el aminoácido 30 al 154 del extremo N de la C5-epimerasa de ratón de la Figura 3, y especialmente los aminoácidos 33-154 o 34-154. En otra realización preferida, la proteína de interés es fusionada a una porción funcional del extremo N que contiene los residuos 33-154 de la secuencia mostrada en la Figura 3. En una realización muy preferida, la proteína de interés es fusionada a una porción funcional del extremo N que contiene la señal de secreción de aminoácidos 1-33 ó 1-34 según se muestra en la secuencia de la Figura 3.

El polipéptido puede ser expresado en forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Lo que se quiere indicar por el término polipéptido "heterólogo" es bien conocido por las personas con experiencia habitual en la técnica como derivado de una especie diferente. Así, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente de aminoácidos cargados, puede ser añadida al extremo N del polipéptido con el fin de mejorar la estabilidad y la perseverancia en la célula huésped durante la purificación o durante el manejo y el almacenamiento posteriores. Pueden añadirse también al polipéptido restos peptídicos para facilitar la purificación. Tales regiones pueden ser eliminadas antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos peptídicos a los polipéptidos para producir la secreción o la excreción, para mejorar la estabilidad y facilitar la purificación, entre otras cosas, son técnicas familiares y rutinarias en el oficio.

La C5-epimerasa o la proteína de fusión que contiene un fragmento de la misma pueden ser recuperadas y purificadas a partir de los cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía con lectinas.

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Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos naturales purificados, productos de procedimientos de química sintética y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención pueden incluir también un residuo de metionina inicial modificado, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el huésped. El polipéptido de la presente invención puede incluir también una modificación de una histidina o de poli histidina añadida a los extremos para los procedimientos de purificación de la proteína.

Los polinucleótidos y polipéptidos C5-epimerasa pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención para una variedad de aplicaciones, particularmente para aquéllas que utilizan las propiedades químicas y biológicas de la C5-epimerasa. Específicamente, las epimerasas recombinantes de la presente invención pueden ser utilizadas para producir heparina y/o heparán sulfato, que pueden ser útiles como anticoagulantes, a mayor escala. Además, las epimerasas de la presente invención pueden ser útiles en un montaje experimental para estudiar los efectos de las moléculas de la matriz extracelular tales como heparina y heparán sulfato sobre procesos tales como la embriología, la angiogénesis y la progresión de tumores. Por ejemplo, el enzima puede modular la proporción de residuos de ácido D-glucurónico/ácido L-idurónico en la heparina o en el heparán sulfato. Se cree que los residuos de ácido L-idurónico, debido a sus propiedades conformacionales exclusivas, estimulan las interacciones de los polisacáridos con las proteínas. Adicionalmente, las epimerasas de la presente invención pueden ser utilizadas también para modificar azúcares industrialmente útiles que pueden ser utilizados como agentes estabilizantes o gelificantes en algunos alimentos.

Polipéptidos variantes y mutantes

Con el fin de mejorar o alterar las características de un polipéptido C-epimerasa, puede emplearse la manipulación de proteínas. Puede utilizarse la tecnología de ADN recombinante conocida por los expertos en la técnica para crear nuevas proteínas mutantes o "muteínas" que incluyan sustituciones, deleciones, adiciones de aminoácidos individuales o múltiples o proteínas de fusión. Tales polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, una actividad incrementada o una estabilidad intensificada. Además, pueden ser purificados con mayores rendimientos y mostrar una mejor solubilidad que el polipéptido natural correspondiente, al menos bajo ciertas condiciones de purificación y almacenamiento.

Mutantes por deleción N-terminal y C-terminal

Por ejemplo, para muchas proteínas, incluyendo el dominio extracelular de una proteína asociada a la membrana o la(s) forma(s) madura(s) de una proteína secretada, se conoce en la técnica que pueden eliminarse uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C sin una pérdida sustancial de la función biológica. Por ejemplo, Ron y col., J. Biol. Chem. 268:2984-2988 (1993), describieron proteínas KGF modificadas que tenían actividad de unión a heparina incluso si faltaban 3, 8 ó 27 residuos de aminoácidos aminoterminales.

Sin embargo, incluso si la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N de una proteína tuviera como resultado la modificación o la pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, podrían conservarse de todas formas otras actividades biológicas. Por tanto, la capacidad de la proteína acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan la proteína C5-epimerasa completa o la porción de la proteína C5-epimerasa, se conservará generalmente cuando se eliminen del extremo N menos de la mayoría de los residuos de la proteína completa o del dominio extracelular. El hecho de que un polipéptido particular que carezca de residuos N-terminales de la proteína completa conserve tales actividades inmunológicas, puede ser fácilmente determinado mediante métodos rutinarios descritos en la presente y por otra parte conocidos en la técnica.

Por consiguiente, la presente invención proporciona además polipéptidos que tienen uno o más residuos eliminados del extremo amino de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3.

Sin embargo, incluso si la deleción de uno o más aminoácidos del extremo C de una proteína tuviera como resultado la modificación o la pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, podrían conservarse de todas formas otras actividades biológicas. Por tanto, la capacidad de la proteína acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan la forma completa o madura de la proteína, se conservará generalmente cuando se eliminen del extremo C menos de la mayoría de los residuos de la forma completa o madura de la proteína. El hecho de que un polipéptido particular que carezca de residuos C-terminales de una proteína completa retenga tales actividades inmunológicas puede ser fácilmente determinado mediante métodos rutinarios descritos en la presente y por otra parte conocidos en la técnica.

La invención proporciona también polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos eliminados de los extremos amino y carboxilo.

Otros mutantes

Además de las formas de la proteína por deleción terminal discutidas anteriormente, una persona con experiencia habitual en la técnica reconocerá también que algunas secuencias de aminoácidos del polipéptido C5-epimerasa pueden ser variadas sin un efecto significativo sobre la estructura o la función de las proteínas. Si se contemplan tales diferencias en la secuencia, debe recordarse que habrá áreas críticas en la proteína que determinan la actividad. Por tanto, la invención además variaciones del polipéptido C5-epimerasa, que muestran la actividad sustancial del polipéptido C5-epimerasa o que incluyen regiones de la proteína C5-epimerasa tales como las porciones de la proteína discutidas más adelante. Tales mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo. Directrices referentes a qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silentes pueden encontrarse en Bowie, J.U. y col., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990).

De este modo, el fragmento, el derivado o el análogo del polipéptido de la Figura 3 o la proteína de fusión que contiene el mismo, puede ser: (i) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente residuo(s) de aminoácido(s) conservado(s), y más preferiblemente al menos uno pero menos de diez residuo(s) de aminoácido(s) conservado(s)), y tal(es) residuo(s) de aminoácido(s) sustituido(s) puede(n) estar o no codificado(s) por el código genético; o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente; o (iii) uno en el que el polipéptido extracelular maduro o soluble está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilén glicol); o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados a una secuencia líder o secretora o a una secuencia que es empleada para la purificación del polipéptido maduro o a una secuencia de proproteína. Se considera que tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las descripciones de la presente.

Por tanto, la C5-epimerasa de la presente invención puede incluir una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, procedentes de mutaciones naturales o de manipulación humana. Según se ha indicado, los cambios son preferiblemente de naturaleza menor, tales como sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento o a la actividad de la proteína (ver la Tabla 1).

TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos conservadoras

Aromáticos	Fenilalanina
	Triptófano
	Tirosina
Hidrofóbicos	Leucina
	Isoleucina
	Valina
Polares	Glutamina
	Asparragina
Básicos	Arginina
	Lisina
	Histidina
Ácidos	Ácido Aspártico
	Ácido Glutámico
Pequeños	Alanina
	Serina
	Treonina
	Metionina
	Glicina

Los aminoácidos de la proteína C5-epimerasa de la presente invención que son esenciales para la función pueden ser identificados mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a un sitio o mutagénesis por barrido de alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Este último procedimiento introduce mutaciones de alanina individuales en todos los residuos de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes son analizadas posteriormente para determinar su actividad biológica tal como la unión a receptores o la actividad proliferativa in vitro.

Son de particular interés las sustituciones de aminoácidos cargados por otros aminoácidos cargados y por aminoácidos neutros o cargados negativamente. Estas últimas tienen como resultado proteínas con carga positiva reducida para mejorar las características de la proteína C5-epimerasa. La prevención de la agregación es muy deseable. La agregación de proteínas tiene como resultado no solamente una pérdida de actividad sino que también puede ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas, ya que pueden ser inmunogénicas (Pinckard y col., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins y col., Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland y col., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)).

La sustitución de aminoácidos puede cambiar también la selectividad de la unión de un ligando a los receptores de la superficie celular. Por ejemplo, Ostade y col., Nature 361:266-268 (1993), describen ciertas mutaciones que tienen como resultado la unión selectiva de TNF-\alpha a solamente uno de los dos tipos conocidos de receptores de TNF. Los sitios que son críticos para la unión ligando-receptor pueden ser determinados también mediante análisis estructural tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcaje por fotoafinidad (Smith y col., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos y col., Science 255:306-312 (1992)).

Los polipéptidos de la presente invención son suministrados preferiblemente en forma aislada. Por "polipéptido aislado" se indica un polipéptido extraído de su entorno nativo. El polipéptido producido y/o contenido en una célula huésped recombinante es considerado aislado para los fines de la presente invención. Se consideran también "polipéptidos aislados" polipéptidos que han sido purificados, parcialmente o sustancialmente, a partir de una célula huésped recombinante. Por ejemplo, una versión producida recombinantemente del polipéptido C5-epimerasa puede ser purificada sustancialmente mediante el método de una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Preferiblemente, el polipéptido de la invención es purificado hasta un grado suficiente para el análisis de la secuencia, o de tal manera que represente el 99% del material proteináceo de la preparación.

Los presentes inventores han descubierto el gen y la proteína C5-epimerasa de ratón, y también que el polipéptido C5-epimerasa es una proteína de 618 residuos que presenta un dominio N-terminal de 154 aminoácidos y, especialmente, un dominio de 33 ó 34 aminoácidos que contiene los aminoácidos 1-33 ó 1-34 y que está implicado en la secreción y en la estabilización de secuencias de aminoácidos que estén unidas a él. Por consiguiente, este dominio, o una porción funcional del mismo, es útil para la expresión y la secreción de proteínas tales como la C5-epimerasa, o de cualquier otra proteína, especialmente de una proteína que se asocie con el aparato de Golgi o que esté asociada de otro modo con la síntesis de heparina o de heparán sulfato.

Los presentes inventores han descubierto también que el extremo N de la proteína C5-epimerasa de ratón y, especialmente, los aminoácidos 1-154, 33-154 ó 34-154, es especialmente útil para incrementar la actividad de otros enzimas, especialmente de otras C5-epimerasas. Por consiguiente, este dominio, o una porción funcional del mismo, es útil para la expresión y la secreción de proteínas de fusión que incluyan secuencias de C5-epimerasas heterólogas respecto a la mostrada en la Figura 3, especialmente de la C5-epimerasa bovina.

Los polipéptidos de la invención incluyen el polipéptido C5-epimerasa y los fragmentos discutidos anteriormente, cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 80% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consta de: (a) aminoácidos 1 a 118 de la Figura 3; (b) aminoácidos 1 a 119 de la Figura 3; (c) aminoácidos 1 a 120 de la Figura 3; (d) aminoácidos 1 a 121 de la Figura 3; (e) aminoácidos 119 a 618 de la Figura 3; (f) aminoácidos 120 a 618 de la Figura 3; (g) aminoácidos 121 a 618 de la Figura 3; (h) aminoácidos 122 a 618 de la Figura 3; (i) aminoácidos 34 a 147 de la Figura 3; (j) aminoácidos 35 a 154 de la Figura 3; (k) aminoácidos 34 a 154 de la Figura 3; (l) aminoácidos 1 a 154 de la Figura 3; y (m) la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la Figura 3.

La invención incluye polipéptidos que son al menos un 80% idénticos, más preferiblemente al menos un 90% o un 95% idénticos, todavía más preferiblemente al menos un 96%, un 97%, un 98% o un 99% idénticos a los polipéptidos descritos anteriormente, e incluye también porciones de tales polipéptidos con al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, un 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido C5-epimerasa, se quiere indicar que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia,excepto en que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia del polipéptido C5-epimerasa. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos un 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los residuos de aminoácidos de la secuencia de referencia puede ser eliminado o sustituido por otro aminoácido, o varios aminoácidos, hasta el 5% de los residuos de aminoácidos totales de la secuencia de referencia, pueden ser insertados en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden tener lugar en las posiciones aminoterminales o carboxiterminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como cuestión práctica, puede determinarse de manera convencional si cualquier polipéptido particular es al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3, utilizando programas de ordenador conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, un 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros son establecidos, por supuesto, de tal manera que el porcentaje de identidad sea calculado sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia y que se permitan huecos en la homología de hasta un 5% del número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia.

Los polipéptidos de la presente invención que poseen actividad C5-epimerasa pueden ser utilizados para proporcionar la misma in vitro a, por ejemplo, ensayos de desarrollo para determinar la misma o en ensayos de estandarización para ser utilizados con sistemas más complejos. La secuencia señal de la invención puede ser utilizada para secretar el enzima C5-epimerasa homólogo a partir de huéspedes recombinantes eucarióticos, o para secretar secuencias heterólogas que estén unidas operativamente a la misma. La secuencia intensificadora de la actividad de la invención puede ser utilizada para incrementar la actividad epimerasa inherente de preparaciones recombinantes de otras C5-epimerasas, y como tal lo mejor es proporcionarla en forma de un gen que codifica una proteína de fusión de las mismas.

Anticuerpos

Pueden producirse anticuerpos específicos hacia la proteína C5-epimerasa para ser utilizados en la presente invención contra las proteínas C5-epimerasas intactas o contra un fragmento polipeptídico antigénico de las mismas, que puede ser presentado junto con una proteína transportadora, tal como una albúmina, a un sistema animal (tal como un conejo o un ratón) o, si es suficientemente largo (al menos 25 aminoácidos aproximadamente), sin una proteína transportadora, o en liposomas, o acomplejado con PEG para incrementar su semivida en la circulación.

Según se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) tiene la intención de incluir moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpo (tales como, por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')_{2}) que sean capaces de unirse específicamente a una proteína C5-epimerasa. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener una menor unión no específica a los tejidos que un anticuerpo intacto (Wahl y col., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Por tanto, se prefieren estos fragmentos.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser preparados mediante cualquiera de una variedad de métodos. Por ejemplo, células que expresen la proteína C5-epimerasa o un fragmento antigénico de la misma pueden ser administradas a un animal con el fin de inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales. En un método preferido, se produce una preparación de proteína C5-epimerasa y se purifica para convertirla en sustancialmente libre de contaminantes naturales. Tal preparación es posteriormente introducida en un animal para producir antisuero policlonal de mayor actividad específica.

En el método más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales. Tales anticuerpos monoclonales pueden ser preparados utilizando la tecnología de hibridomas (Köhler y col., Nature 256:495 (1975); Köhler y col., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Köhler y col., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling y col., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. (1981) pp. 563-681). En general, tales procedimientos implican la inmunización de un animal (preferiblemente un ratón) con un antígeno proteico C5-epimerasa o, más preferiblemente, con una célula que exprese la proteína C5-epimerasa. Las células adecuadas pueden ser reconocidas por su capacidad para unirse a anticuerpos anti-proteína C5-epimerasa. Tales células pueden ser cultivadas en cualquier medio para cultivo de tejidos adecuado; sin embargo, es preferible cultivar las células en medio de Eagle modificado de Earle suplementado con un 10% de suero bovino fetal (inactivado a 56ºC aproximadamente) y suplementado con 10 g/l aproximadamente de aminoácidos no esenciales, 1.000 U/ml de penicilina aproximadamente y 100 \mug/ml de estreptomicina aproximadamente. Los esplenocitos de tales ratones son extraídos y fusionados con una línea celular de mieloma adecuada. Puede emplearse cualquier línea celular de mieloma adecuada de acuerdo con la invención; sin embargo, es preferible emplear la línea celular de mieloma parental (SP2O), disponible en la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Después de la fusión, las células hibridomas resultantes son mantenidas selectivamente en medio HAT, y clonadas posteriormente mediante dilución limitante según está descrito por Wands y col., Gastroenterology 80:225-232 (1981). Las células hibridomas obtenidas mediante tal selección son luego analizadas para identificar los clones que secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno C5-epimerasa deseado.

Alternativamente, pueden producirse anticuerpos adicionales capaces de unirse al antígeno C5-epimerasa en un procedimiento de dos etapas mediante la utilización de anticuerpos anti-idiotípicos. Tal método utiliza el hecho de que los anticuerpos son ellos mismos antígenos y que, por tanto, es posible obtener un anticuerpo que se una a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este método, se utilizan anticuerpos específicos de la proteína C5-epimerasa para inmunizar a un animal, preferiblemente un ratón. Los esplenocitos de tal animal son utilizados posteriormente para producir células hibridomas, y las células hibridomas son sometidas a selección para identificar clones que produzcan un anticuerpo cuya capacidad para unirse al anticuerpo específico de la proteína C5-epimerasa pueda ser bloqueada por el antígeno proteico C5-epimerasa. Tales anticuerpos comprenden anticuerpos anti-idiotípicos hacia el anticuerpo específico de la proteína C5-epimerasa y pueden ser utilizados para inmunizar a un animal con el fin de inducir la formación de más anticuerpos específicos de la proteína C5-epimerasa.

Se apreciará que Fab y F(ab')_{2} y otros fragmentos de los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Tales fragmentos son producidos típicamente mediante corte proteolítico utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}). Están abarcados también por esta invención anticuerpos de una sola cadena tales como anticuerpos de cadena ligera o pesada. Alternativamente, pueden producirse fragmentos que se unan a la proteína C5-epimerasa mediante la aplicación de la tecnología de ADN recombinante o a través de química sintética. Tales anticuerpos incluirían, pero sin limitarse a, anticuerpos recombinantes que comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que tienen diferentes especificidades de unión o CDRs que han sido modificadas mediante la aplicación de la tecnología de ADN recombinante o mediante química sintética para modificar la especificidad de unión de los anticuerpos.

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Para la utilización in vivo de anti-C5-epimerasa en humanos, puede ser preferible utilizar anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados". Tales anticuerpos pueden ser producidos utilizando construcciones genéticas derivadas de células hibridomas productoras de los anticuerpos monoclonales anteriormente descritos. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Ver, para una revisión, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y col., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly y col., Patente de EE.UU. Nº 4.816.567; Taniguchi y col., EP 171496; Morrison y col., EP 173494; Neuberger y col., WO 8601533; Robinson y col., WO 8702671; Boulianne y col., Nature 312:643 (1984); Neuberger y col., Nature 314:268 (1985).

Los anticuerpos bifuncionales son anticuerpos que tienen dominios de unión al antígeno para diferentes epítopos o derivados de especies diferentes, y están abarcados por la invención. Están previstos también anticuerpos con regiones Fc derivadas de especies que difieren de las regiones Fab y pueden ser utilizados en procedimientos cromatográficos inmunoespecíficos. Están abarcados también por esta invención anticuerpos con marcas unidas tales como fluoresceína, Rojo Texas, rodamina, peroxidasa, oro, marcas magnéticas, fosfatasa alcalina, radioisótopos o marcas quimioluminiscentes.

Habiendo descrito de manera general la invención, la misma será comprendida más fácilmente por referencia a los ejemplos siguientes, que se proporcionan a manera de ilustración y no deben ser considerados como limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento y secuenciación de clones genómicos de ratón

Una biblioteca genómica de ratón (FIX II, Stratagene) fue sometida a selección con una sonda de ADN procedente de una secuencia bovina que codificaba C5-epimerasa. La sonda estaba marcada con [\alpha^{32}P]dCTP (NEN Life Science Products). Aproximadamente 2 x 10^{6} fagos fueron sembrados en una placa de 20 x 20 cm y se prepararon filtros de nailon duplicados de cada placa. La selección bajo rigurosidad elevada fue realizada con hibridación en Denhardt 5x que contenía 100 \mug de ADN de esperma de salmón/ml a 60ºC. Los lavados finales fueron en SSC 0,1x (SSC 1x es NaCl 150 mM, citrato de sodio 15 mM, pH 7,0, conteniendo un 0,1% de SDS). Las placas que producían señales positivas en ambas réplicas fueron seleccionadas para una segunda y una tercera ronda de selección, y finalmente se aislaron cinco clones positivos. Se encontró que dos de los clones tenían una longitud similar de 16 kb aproximadamente, mientras que los otros tres eran relativamente más cortos, alrededor de 10-12 kb. El clon más largo (clon 64) fue digerido con SacI y los fragmentos de restricción fueron clonados en pBluescript. El segundo clon más largo (clon 5A) fue digerido con EcoRI y los fragmentos resultantes fueron clonados en pUC119 para su caracterización posterior.

El plásmido que contenía el inserto fue purificado utilizando el kit para plásmidos de QIAGEN y secuenciado. La reacción de secuenciación de nucleótidos fue realizada utilizando el método de terminación en didesoxi y se llevó a cabo con un secuenciador ABI 310. Los exones y los intrones fueron determinados mediante recorrido con cebadores sobre ambas hebras, y el tamaño de los intrones fue calculado mediante secuenciación en combinación con electroforesis en gel de agarosa. Parecía haber solamente tres exones que codificaban la C5-epimerasa, codificando el exón más largo más del 50% de la proteína. Las uniones exón-intrón (sitios de ayuste) siguen con precisión la regla de consenso gt-ag. Sobre la base de la presencia de intrones y del apareamiento preciso entre los exones y la secuencia de ADNc, nosotros creemos que el clon genómico identificado representa el gen funcional de la C5-epimerasa.

Clonaje del ADNc de la C5-epimerasa de ratón

Se diseñó un par de cebadores que estaban basados en la secuencia de nucleótidos obtenida por la secuenciación de los exones del clon genómico. El cebador sentido corresponde a los pb 1-26 del ORF de ratón, comenzando a partir del codón de inicio ATG. El cebador antisentido corresponde a los pb 1829-1854 sin incluir el codón de parada. Se llevó a cabo una PCR mediante la utilización de un ADNc de hígado de ratón QUICK-Clone™ (Clontech) como molde a las condiciones: 1 ciclo de 94ºC durante 1 minuto, 30 ciclos cada uno de 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 1 minuto, y una extensión final a 72ºC durante 10 minutos. Se obtuvo una potente banda de 2 kb aproximadamente, que fue clonada en un vector de clonaje TOPO™ -TA (Invitrogen) y amplificada y secuenciada posteriormente. Mediante la secuenciación de la doble hebra se encontró que el clon de la C5-epimerasa de ratón tenía 1875 pb de longitud, con un potente dominio hidrofóbico en el extremo N-terminal del péptido deducido.

Análisis de transferencia Northern

La transferencia de ARNm multitisular de ratón fue adquirida a Clontech. La sonda de ADN procedente del clon de ADNc bovino fue marcada con [\alpha^{32}P]dCTP mediante el enzima Klenow de Boehringer Mannheim. La hibridación se llevó a cabo en ExpressHyb (Clontech) a 60ºC durante una hora y se lavó bajo condiciones de rigurosidad elevada. La membrana fue expuesta a una película Kodak a -70ºC durante una noche. El enzima C5-epimerasa es expresado en todos los tejidos examinados y el transcrito tiene alrededor de 5 kb. Parece que el hígado tiene la expresión más elevada del transcrito, mientras que el bazo expresa un nivel relativamente más bajo con relación a la \beta-actina en la misma membrana.

Análisis de transferencia Southern

El análisis de transferencia Southern fue realizado de acuerdo con Sambrook y col. (Sambrook y col., 1989). Se preparó ADN genómico de ratón con un kit Easy Prep (Pharmacia Biotech). Se sometieron a digestión 20 \mug del ADN genómico con el enzima de restricción SacI, y se separaron en un gel de agarosa al 0,8% mediante electroforesis. Después de la electroforesis, el gel fue tratado con NaOH 0,1 N durante 30 minutos y neutralizado en tampón Tris-HCl. Los fragmentos de ADN fueron transferidos a una membrana de nailon. Un fragmento de 837 pb de ADNc de la C5-epimerasa bovina fue marcado con [\alpha^{32}P]dCTP mediante el enzima Klenow de Boehringer Mannheim y utilizado como sonda. Las condiciones de hibridación se llevaron a cabo según se describió para el análisis Northern. El tiempo de exposición fue de 3 días.

Con el fin de determinar cuántos genes podían codificar potencialmente la C5-epimerasa, veinte microgramos de ADN genómico de ratón purificado a partir de hígado de ratón fueron digeridos con los enzimas de restricción ApaI, BamHI, EcoRI, EcoRV, HindIII, NcoI y XbaI, respectivamente, y separados en un gel de agarosa al 0,8% mediante electroforesis. El ADN separado en el gel fue transferido a una membrana de nailon y fue hibridado posteriormente con una sonda de ADN procedente de la secuencia codificadora bovina (1407 pb). El mapa de restricción del ADN genómico de la C5-epimerasa sugiere que hay solamente un gen que codifica el enzima C5-epimerasa en ratón.

Análisis de la actividad enzimática

La actividad de la C5-epimerasa fue determinada de acuerdo con el protocolo descrito en Malmström y col., J. Biol. Chem. 255:3878-3883 (1980), que se incorpora a la presente por referencia. Brevemente, un ratón trasplantado con células de mastocitoma intramuscularmente fue sometido a eutanasia por dislocación cervical y posteriormente diseccionado. Se recogieron los tejidos respectivos, incluyendo el xenoinjerto, y se homogeneizaron inmediatamente en un tampón HEPES 50 mM que contenía KCl 100 mM, EDTA 15 mM, Triton X-100 1% e inhibidores de proteasas. Los homogenados fueron agitados a 4ºC durante 30 minutos y centrifugados. Se recogió el sobrenadante. La concentración de proteínas totales fue determinada mediante un ensayo QuantiGold y se analizó la actividad específica de la C5-epimerasa sobre la base de la liberación de ^{3}H (recuperado como ^{3}H_{2}O) a partir de un polisacárido sustrato de acuerdo con el procedimiento descrito por Li y col. (Li y col., 1997). El sustrato de C5 utilizado en el ensayo de la actividad específica es analizado al menos una vez al mes midiendo solamente 50 \mul de solución de trabajo del sustrato de C5 sin ningún enzima.

Si la actividad inicial de la muestra fuera >2000 cpm/50 \mul, sería una indicación de que la muestra está saturada y necesita ser diluida. Los factores de dilución dependen de las muestra utilizadas, de la saturación de la muestras y de la concentración de sales. La muestra no debe contener más de 50 mM de sales (NaCl o KCl), ya que la actividad C5-epimerasa es inhibida parcialmente o completamente a concentraciones de sales mayores.

En el ensayo de la actividad C5-epimerasa se utilizan controles positivos y negativos. El control positivo tiene que ser estandarizado cada dos meses con el fin de asegurar que se ha conservado la estabilidad. Solamente un vector producido en las mismas células que la muestra puede ser utilizado como control negativo. Por ejemplo, para las muestras de C5 producidas por el sistema de expresión de baculovirus/células de insecto, se ha utilizado como control negativo la acetilcolinesterasa producida con el mismo sistema.

Durante el precalentamiento de la solución del sustrato de C5, se diluyeron las muestras si era necesario. Se añadieron 50 \mul de muestra (enzima) al sustrato precalentado y se incubaron exactamente durante 1 hora a +37ºC. Después de la incubación, se añadieron a la mezcla sustrato-enzima 100 \mul de una solución de parada de la reacción enzimática, y esta mezcla de reacción fue transferida a un vial de centelleo de 20 ml de Wallac. Se añadieron a los viales 13 ml de cóctel de centelleo para el ensayo de epimerasa y se agitó en vórtex durante 10 segundos. La radiactividad fue medida por triplicado en un Contador de Centelleo Líquido Wallac 1415 durante 2 minutos cada una, después de incubación durante una noche. El contador de centelleo proporciona los resultados como cpm/volumen de reacción (50 \mul). Si una muestra ha sido diluida, debe restarse la actividad del tampón de dilución de la actividad de la muestra. En cualquier caso, la actividad del blanco fue restada de la actividad de la muestra antes de analizar los resultados.

La actividad específica fue medida dividiendo la actividad total (cpm/\mul) entre la concentración de proteínas totales (mg/ml). La concentración de proteínas totales fue medida mediante un ensayo QuantiGold de acuerdo con Stoschek, C.M., Anal. Biochem. 160:301-305 (1987), que se incorpora a la presente por referencia. La unidad de la actividad específica es cpm/mg/h, donde h (hora) describe el tiempo de la reacción enzimática.

Ejemplo 2 Identificación del verdadero extremo N de la C5-epimerasa a partir del análisis de la secuencia codificadora del gen de ratón, y expresión del ADNc clonado

Sobre la base del clonaje y el análisis preliminar de la secuencia del supuesto gen de la C5-epimerasa de ratón identificado en el Ejemplo 1, y sobre la base de la alineación con la secuencia del ADNc bovino previamente publicada, se aisló una secuencia de ADN flanqueante 5' murina adicional, y se clonó un ADNc que contenía esta secuencia de ADN flanqueante 5'.

Con el fin de determinar si esta secuencia de ADN flanqueante 5' podría codificar secuencias peptídicas N-terminales adicionales que representarían el verdadero extremo N de la C5-epimerasa codificada por el gen de ratón, la secuencia de ratón (texto en negrita en la secuencia de nucleótidos compilada mostrada en la Figura 1) fue añadida a la secuencia de ADNc bovina, que estaba ya en un archivo del ordenador, utilizando la secuencia bovina y partiendo desde el punto de mayor conservación (>96% de identidad de aminoácidos). Posteriormente, se utilizó el programa Gene Inspector (Textco, EE.UU.) para buscar en la secuencia compilada marcos de lectura abiertos (ORFs) que fueran secuencias codificadoras del polipéptido potenciales. El resultado de la alineación de secuencias está mostrado en la Figura 1 y el análisis de los ORFs produjo los resultados mostrados en la Figura 2.

En la Figura 1, el sitio de fusión entre la nueva secuencia de ratón y la secuencia bovina está indicado por dos puntos dobles "::". La secuencia que comienza después de los dos puntos dobles es la secuencia del ADNc bovino. La secuencia (en negrita) 5' respecto al sitio de fusión es la secuencia de ADN flanqueante 5' murina adicional aislada según se describió anteriormente. La secuencia subrayada es el marco de lectura abierto que se encontró, mostrando la secuencia codificadora del polipéptido.

Se sabe que el enzima C5-epimerasa nativo está localizado en el "compartimento" Golgi membranoso (fracción microsomal) de las células (del hígado). Por tanto, la secuencia de ratón nativa debería contener una señal N-terminal adecuada para la translocación a este compartimento. Para analizar esto se utilizó el algoritmo (programa) de Nielsen y col., Protein Engineering 10:1-6 (1997). El algoritmo analizó el potencial de "señal" de los primeros 40-60 aminoácidos de cada una de las secuencias polipeptídicas anteriores. Se utilizó el mismo programa para analizar los primeros 40 residuos de la secuencia del polipéptido syndecan-1 de ratón, ya que se sabe que ésta contiene una señal de secreción, como un tipo de control de la eficacia del programa, y el programa identificó ésta positivamente (datos no mostrados). El análisis demostró un potente potencial de señal para los primeros 33 residuos.

Además de la secuencia señal de 33 aminoácidos ya mencionada, los 154 residuos N-terminales adicionales incluyen residuos de cisteína adicionales que podrían formar enlaces disulfuro y estabilizar el plegamiento de la proteína, y un sitio de amidación pronosticado (residuos 118-121) que podría ser relevante para el procesamiento proteolítico post-traduccional. Análisis posteriores de la secuencia completa de la C5-epimerasa pronosticaron tramos hidrofóbicos del polipéptido que podrían estar enterrados o atravesar membrana(s).

El análisis de alineación con otras secuencias encontradas en bases de datos revela puntos calientes de homología. Estos resultados están resumidos en las Figuras 4 y 5.

La Figura 5 es una representación en forma de diagrama de la secuencia polipeptídica de la C5-epimerasa de ratón. Según se muestra en la Figura 5, la mayor conservación evolutiva de la secuencia ("puntos calientes" de homología) ha tenido lugar en la porción más C-terminal, en un tramo altamente hidrofóbico entre los residuos de aminoácidos Trp497 y Leu523, que se había pronosticado que estaría enmascarado en la estructura plegada de la proteína o que estaría atravesando una membrana, posiblemente hacia la luz del Golgi, donde se sabe que actúa el enzima. El otro tramo más significativo y extendido de conservación ("punto caliente") está entre los residuos Leu546 y His580, y podría contener o comprender el sitio activo del enzima. El significado funcional de la conservación de secuencias polipeptídicas (identidad) \geq 22% ha sido establecido por estudios publicados de otras proteínas de función conocida (Branden, C. y Tooze, J., Introduction to Protein Structure, Garland Publishing, NY y London, pp. 100-101 (1991) y Wilson, Kreychman y Gerstein y los demás autores citados en la misma, en "Quantifying the relations between protein sequence, structure, and function through traditional and probabilistic scores", disponible en http://bioinfo.mbb.yale.edu/e-print/ann-xfer-jmb/preprint.htlm. Según se explica en este artículo, la función precisa no parece conservarse por debajo del 30-40% de identidad de secuencias, mientras que la clase funcional se conserva para identidades de secuencias tan bajas como del 20-25%. Por debajo del 20%, ya no se conserva una similitud general). Actualmente, SWISS-MODEL generará modelos de secuencias que respondan a estos criterios: Valor de P en la búsqueda BLAST: <0,00001; Grado global de identidad de secuencias (SIM): >25% y Longitud mínima del modelo proyectado - 25
aminoácidos.

Sobre la base de todo esto, se observa que la secuencia de Drosophila está relacionada más estrechamente con la secuencia de ratón (46,6%) que la secuencia de C. elegans (39,6%).

En otro tipo de análisis de secuencias, la estructura tridimensional (3D) pronosticada de la secuencia de la C5-epimerasa de ratón fue "ensartada" frente a las estructuras 3D de Kelley, L.A. y col., Mol. Biol. 299(2):499-520 (2000). Esta comparación indicaba que la secuencia de la C5-epimerasa tiene una relación significativa con un dominio de la condroitinasa (condroitín AC/alginato liasa), que es un toroide alfa/alfa. La condroitín AC liasa es representativa de una familia de enzimas que degradan glucosaminoglicanos, y las relaciones estructura/función han sido elucidadas a partir de la cristalografía (Fethiere y col., J. Mol. Biol. 288:635-647 (1999)). Increíblemente, se encontró que la similitud 3D más significativa con la secuencia de la condroitinasa se extendía desde Ala408, cerca del extremo C terminal de un tramo hidrofóbico interno (transmembranal), hasta el extremo C de la secuencia de la C5-epimerasa de ratón, y que este tramo contenía la mayoría de la secuencia conservada, indicando probablemente la conservación que es un dominio que contiene el sitio activo.

Sobre la base de todos los resultados de los análisis de secuencias anteriores, se produjeron nuevas construcciones de C5-epimerasa recombinante, además de la primera construcción de C5-epimerasa recombinante (bovina) marcada activa, para la secreción-expresión heteróloga a partir de sistemas de expresión de baculovirus e InsectSelect (Invitrogen, EE.UU.). Los productos procedentes de las líneas de células de insecto clonadas caracterizados hasta ahora están resumidos en la Figura 6A. Se muestran cuatro construcciones. La primera construcción es la C5-epimerasa bovina recombinante marcada. La segunda construcción es la C5-epimerasa de ratón de longitud completa marcada. La tercera construcción es una construcción quimérica marcada entre las secuencias de las C5-epimerasas de ratón y bovina. La cuarta construcción es una secuencia de ratón truncada, marcada.

En cada una de las construcciones recombinantes, la C5-epimerasa estaba marcada. Cuando estaba marcada, la secuencia de la C5-epimerasa estaba precedida por una secuencia según se muestra en la Figura 6B, que contiene el péptido señal EGT ligado al corte de la señal EGT, un sitio de corte de enteroquinasa, seis histidinas y, finalmente, el sitio de la proteasa rTEV. La señal EGT procede de una proteína de baculovirus (que infecta células de insecto). La secuencia FLAG es una marca epitópica utilizada para la detección y purificación de proteínas recombinantes de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante (Sigma) (Hopp, T. y col., Biotechnology 6:1204-1210 (1988)). La enteroquinasa es un enzima utilizado para cortar la secuencia que precede a su sitio de reconocimiento. Las seis histidinas consecutivas son otra marca. El sitio de la proteasa rTEV (Virus del Grabado del Tabaco Recombinante) fue utilizado también para eliminar las secuencias precedentes. La señal EGT y la marca FLAG™ (IBI) fueron obtenidas de construcciones producidas en un vector pFastBacTM (Life Technologies) modificado proporcionado por el Dr. Christian Oker-Blom, VTT Biotechnology, P.O. Box 1500, FIN-02044, VTT, FINLANDIA. La purificación de todas las proteínas recombinantes descritas en esta solicitud estaba basada en la marca FLAG.

Los datos representativos de los ensayos de actividad y de los análisis de proteínas de estas C5-epimerasas recombinantes marcadas están mostrados en la Figura 7 y en la Tabla I y en la Tabla II. La Figura 7 muestra los resultados de los ensayos de actividad de la C5-epimerasa de ratón (mC5) que había sido purificada sobre anti-FLAG M1 de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante.

El ensayo de actividad C5-epimerasa para medir la actividad de la proteína heteróloga fue realizado igual que en el Ejemplo 1 anterior. Brevemente, se extrajo la proteína total de cultivos transformados con cada una de las construcciones de C5-epimerasa recombinante que fueron inoculadas individualmente en células de insecto utilizando los sistemas de expresión InsectSelect. Una vez que las células alcanzaron la confluencia, fueron recogidas y lisadas y se aisló y cuantificó la proteína total. La actividad C5-epimerasa fue medida como liberación de ^{3}H a partir del sustrato de la epimerasa en un contador de centelleo. La actividad epimerasa fue medida frente a la proteína total. La Figura 7 muestra la actividad con volúmenes crecientes de muestra (diluida 1:2000). La actividad total fue de 6360 cpm/\mul. El análisis de proteínas (utilizando QuantiGold, Diversified Biotech) fue realizado de acuerdo con Stoschek, C.M., Anal. Biochem. 160:301-305 (1987) e indicó que la concentración de proteína era de 3,2 \mug/ml. Por tanto, la actividad específica era de 2,0 x 10^{9} cpm/mg/h.

La Figura 8 muestra una Transferencia Western teñida con anti-FLAG. La Calle 1 contiene estándares de peso molecular (New England Biolabs, Broad Range, preteñidos). La Calle 2 contiene la C5-epimerasa de ratón de longitud completa. La C5-epimerasa de ratón de longitud completa marcada (que contiene las secuencias adicionales N-terminales encontradas en la presente), tiene una longitud de 618 aminoácidos, un peso molecular (daltons) de 71189,1, un punto isoeléctrico (pI) de 8,25 y una carga neta a pH 7 de +4,01.

La Figura 9 es una Transferencia Western del medio de cultivo recogido de líneas celulares de insecto estables de los diferentes clones para las cuatro C5-epimerasas recombinantes marcadas descritas anteriormente, teñida con un anticuerpo anti-FLAG (020300). La Calle 1 contiene estándares de peso molecular igual que en la Figura 8, estando anotados los pesos moleculares al lado del gel. La Calle 2 contiene la C5-epimerasa de ratón truncada. La Calle 3 contiene la C5-epimerasa bovina original. La Calle 4 contiene la C5-epimerasa quimérica ratón:bovina en la que las secuencias N-terminales de ratón están fusionadas en marco a las secuencias bovinas, según se muestra en las Figuras 2 y 3. La Calle 5 contiene la C5-epimerasa de ratón de longitud completa. Puede observarse que la construcción quimérica ratón:bovina tiene aproximadamente el mismo tamaño que la construcción de ratón de longitud
completa.

La actividad relativa de las diferentes construcciones recombinantes fue calculada sobre la base de los ensayos de actividad y del análisis densitométrico de la Transferencia Western y está mostrada en la Tabla I siguiente. "TruncC5" es la secuencia de aminoácidos de la C5-epimerasa de ratón acortada en la que se han eliminado los 154 primeros aminoácidos, de tal manera que la secuencia "TruncC5" tiene el mismo extremo N que la secuencia bovina recombinante. "ExtC5" es el polipéptido C5-epimerasa bovina recombinante, mientras que "chC5" se refiere a la construcción de la C5 epimerasa quimérica ratón:bovina codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1. "mC5" se refiere a la secuencia de la C5-epimerasa de ratón de longitud completa.

TABLA I Actividades relativas de las diferentes C5-epimerasas recombinantes

Muestra	Densidad	Muestra (\mul)	Densidad/\mul	Actividad	Actividad/Densidad
				(cpm/\mul)	(cpm/unidad densitométrica)
truncC5	15984	12	1332,0	20	0,015
extC5	6451	12	537,6	7	0,013
chC5	14960	12	1246,7	3455	2,771
mC5	13804	12	1150,3	3681	3,200

Las actividades específicas de las diferentes C5-epimerasas recombinantes parcialmente purificadas están mostradas en la Tabla II.

TABLA II Actividades específicas de las C5-epimerasas recombinantes parcialmente purificadas

Muestra	Actividad Total (cpm/\mul)	Linealidad (R^{2})	Proteína (mg/ml)	Actividad Específica (cpm/mg/h)
truncC5	39,5	0,9905	0,0129	3,06 x 10^{6}
extC5	9,1	0,9978	0,0092	9,89 x 10^{5}
chC5	919,7	0,9964	0,0026	3,54 x 10^{8}
mC5	2019	0,9969	0,0042	4,81 x 10^{8}

La construcción quimérica ratón:bovina que fue producida contiene los residuos de aminoácidos 34-154 de la secuencia N-terminal de la secuencia del polipéptido de ratón, inmediatamente después de los elementos EGT-FLAG-His-rTEV, según se muestra en la Figura 6B. Sin embargo, ese enzima recombinante parecía estar retenido predominantemente en el citosol, debido probablemente al potencial de señalización de la secuencia de ratón.

Conclusión

La adición de un fragmento N-terminal del polipéptido (Asp34 a Asp154) procedente de la secuencia del gen de ratón incrementa la actividad del enzima C5-epimerasa recombinante en órdenes de magnitud, aunque esta porción de secuencia no contenga la mayor conservación entre especies. Se ha abordado el posible efecto de las marcas sobre la actividad de la primera construcción bovina recombinante (mediante eliminación de las marcas; datos no mostrados) y podrían representar un pequeño factor de la diferencia, pero no hasta el grado de las diferencias de órdenes de magnitud en las actividades específicas entre las formas más largas y más cortas de la C5-epimerasa recombinante. Estudios con construcciones de expresión no marcadas y estudios de estructura-función están actualmente en marcha para definir mejor la base y el mecanismo para controlar la actividad de este muy importante enzima recombinante.

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<110> Biotie Therapies Corp.

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<120> Glucuronil C5-Epimerasa, ADN que Codifica la Misma y Utilizaciones del Mismo

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<130> 37186

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<140> US 60/304.180

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<141> 12-08-2000

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<150> US 09/732.026

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<151> 12-08-2000

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<160> 2

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<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 1854

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1854)

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<400> 1

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1

2

3

4

40

\newpage

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<210> 2

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<211> 618

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

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5

6

7

Claims

1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia que consta de los aminoácidos 1-618 de la Figura 3.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es ADN.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es ARN.

4. El polinucleótido de la reivindicación 1, que comprende además un polinucleótido heterólogo.

5. El polinucleótido de la reivindicación 4, donde dicho polinucleótido heterólogo codifica un polipéptido heterólogo.

6. El polinucleótido de la reivindicación 5, donde dicho polinucleótido heterólogo está situado en el 3' de dicha secuencia de nucleótidos.

7. Un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. El vector de la reivindicación 7, en el que dicho polinucleótido está unido operativamente a un polinucleótido regulador heterólogo.

9. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

10. La célula huésped de la reivindicación 9, en la que dicho polinucleótido aislado está unido operativamente a un polinucleótido regulador heterólogo.

11. Un método para producir una proteína que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 10 bajo condiciones tales que dicha proteína sea expresada, y la recuperación de dicha proteína.

12. Un polipéptido C5-epimerasa aislado cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 95% idéntica a una secuencia que consta de los aminoácidos 1-618 de la Figura 3.

13. El polipéptido aislado de la reivindicación 12, que es producido o está contenido en una célula huésped recombinante.

14. El polipéptido aislado de la reivindicación 13, donde dicha célula huésped recombinante es una célula de insecto.

15. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consta de:

(a): aminoácidos 1 a 154 de la Figura 3;

(b): aminoácidos 35 a 154 de la Figura 3;

(c): aminoácidos 34 a 154 de la Figura 3.

16. El polinucleótido de la reivindicación 15 que es ADN.

17. El polinucleótido de la reivindicación 15 que es ARN.

18. El polinucleótido de la reivindicación 15, que comprende además un polinucleótido heterólogo.

19. El polinucleótido de la reivindicación 18, donde dicho polinucleótido heterólogo codifica un polipéptido heterólogo.

20. El polinucleótido de la reivindicación 19, donde dicho polinucleótido heterólogo está situado en el 3' de dicha secuencia de nucleótidos.

21. Un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 15-20.

22. El vector de la reivindicación 21, en el que dicho polinucleótido está unido operativamente a un polinucleótido regulador heterólogo.

23. Una célula huésped que contiene el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 15-20.

24. La célula huésped de la reivindicación 23, en la que dicho polinucleótido aislado está unido operativamente a un polinucleótido regulador heterólogo.

25. Un método para producir una proteína que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 24 bajo condiciones tales que se exprese dicha proteína, y la recuperación de dicha proteína.

26. Un polipéptido C5-epimerasa aislado que contiene un fragmento N-terminal cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consta de:

(a): aminoácidos 1 a 154 de la Figura 3;

(b): aminoácidos 35 a 154 de la Figura 3;

(c): aminoácidos 34 a 154 de la Figura 3.

27. El polipéptido aislado de la reivindicación 26, que es producido o está contenido en una célula huésped recombinante.

28. El polipéptido aislado de la reivindicación 26, donde dicha célula huésped recombinante es una célula de insecto.

29. Un método para incrementar significativamente la actividad de una C5-epimerasa, comprendiendo dicho método:

(a) la provisión de un primer polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consta de los aminoácidos 35 a 154 de la Figura 3 y los aminoácidos 34 a 154 de la Figura 3;

(b) la unión de dicho primer polinucleótido de (a) a un segundo polinucleótido que codifica una C5-epimerasa; y

(c) la expresión del polinucleótido de fusión.

30. El método de la reivindicación 29, en el que dicho primer polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos son los aminoácidos 35 a 154 de la Figura 3.

31. El método de la reivindicación 29, en el que dicho primer polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos son los aminoácidos 34 a 154 de la Figura 3.

32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 29-31, en el que dicha C5-epimerasa es C5-epimerasa bovina.