JP2002193840A - ヒトのイノシトールモノホスファターゼｈ１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規に確認されたポリヌクレオチド、ヒトイ
ノシトールモノホスファターゼＨ１およびこれらのポリ
ヌクレオチドがコードするポリペプチドを提供する。 【解決手段】 ヒトのイノシトールモノホスファターゼ
Ｈ１ポリヌクレオチドおよびこのポリペプチドをコード
するＤＮＡ（ＲＮＡ）および組換え技術によってこのポ
リペプチドを製造する方法、およびこのポリペプチド
を、例えばｈＩＭＰ−Ｈ１を阻害することのできる化合
物を設計し、検索するようなおよび遺伝子疾病の地図作
成するような治療的目的のために使用する方法を開示す
る。またこのポリペプチドに対する拮抗物質を、例えば
精神病および抑欝性障害の処置などの治療的目的のため
にこの拮抗物質を使用する方法とともに開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は新規に確認された
ポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドがコード
するポリペプチド、これらのポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用法、ならびにこれらのポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの生産法に関する。特に、本発明
のポリペプチドはヒトのイノシトールモノホスファター
ゼＨ１であって、以下、時には「ｈＩＭＰ−Ｈ１」と記
載する。本発明はこれらのポリペプチドの作用の阻害法
にも関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞は複雑な応答のネットワークを通し
て細胞外の刺激に応答する。イノシトール脂質代謝は細
胞内シグナル伝達において鍵となる役割を演じている。
作動剤が誘導する細胞の刺激は、ホスホイノシチドのホ
スホリパーゼＣによる加水分解によって、シグナル伝達
分子であるジアシルグリセロールおよびイノシトールホ
スフェートを放出させる。ジアシルグリセロールはプロ
テインキナーゼＣを刺激する機能を果たし（Ｎｉｓｈｉ
ｚｕｋａ，Ｙ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３巻：３０５〜
３１２頁（１９８６年））、数種のイノシトールモノホ
スフェート、特に注目すべきはイノシトール−１，４，
５−トリホスフェート、は細胞内および細胞間でカルシ
ウム放出を起こす（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｊ．とＩｒ
ｖｉｎｅ，Ｒ．Ｆ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、
３１２巻：３１５〜３２１頁（１９８４年））。イノシ
トールホスファターゼおよびキナーゼの作用でサイトソ
ル中にシグナル伝達分子または調節分子の役目を果たす
過剰のイノシトールホスフェートが生じる（Ｍａｊｅｒ
ｕｓ，Ｐ．Ｗ．など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６
３巻：３０５１〜３０５４頁（１９８８年））。

【０００３】イノシトールモノホスファターゼ（ＩＭ
Ｐ）はホスファチジルイノシトール・シグナル伝達経路
においてイノシトールモノホスフェートの加水分解を触
媒することによって重要な役割を果たしている。ＩＭＰ
類は躁鬱病の治療のためのリチウム療法における作用の
分子的側面であると信じられている。リチウムはイノシ
トールモノホスファターゼを阻害し、イノシトール−１
−ホスフェートからの遊離イノシトール蓄積を予防す
る。

【０００４】炭酸リチウムは１９４９年に有効な抗躁病
化合物であることがＪｏｈｎ・Ｃａｄｅによって証明さ
れ、この化合物は１９６９年には広範な使用を承認され
た。しかしながら、躁鬱病患者のリチウム療法はある種
の有害な副作用を伴う。これらには震え、体重増加、下
痢、肌荒れ、一過性白血球増加症、甲状腺機能低下、お
よび多尿−煩渇多飲症を含む。長期リチウム療法に伴う
その他の臨床的疾患には腎臓の構造的損傷（細管萎縮
症、糸球体硬化症および間質性繊維症を含む）がある。
これらの副作用は直接的にリチウムの毒性に由来する。

【０００５】ホスホイノシチド（ＰＩ）のサイクルはリ
チウムの作用の推測上の標的であるため、リチウムで全
身的に処置した時にはラットの脳中でイノシトール−１
−ホスフェートの顕著な増加および遊離イノシトールの
対応する減少が起きることが証明されている。これはイ
ノシトール−１−ホスフェートホスファターゼの阻害に
起因するとされ、リチウムは過剰に刺激された細胞中で
ＰＩサイクルの活性を弱めることができ、それで躁病を
制御する有効性を説明する仮説が導かれた。ＰＩサイク
ルに対するイノシトールの供給はグルコースからまたは
食事からの新たな合成によるイノシトールホスフェート
の加水分解から由来するとすることができる。前者の過
程はイノシトール−１−ホスフェートホスファターゼの
操作に依存し、それ故、リチウムによって阻害される。
末梢性組織中では食事からのイノシトールはリチウムに
よる遮断を迂回できるが、イノシトールは血液脳関門を
通過しないのでＣＮＳではできない。そこで、脳中での
イノシトール−１−ホスフェート増加は遊離イノシトー
ルの等価な減少を伴う。

【０００６】マンガンはイノシトールモノホスファター
ゼによる触媒作用をサポートする。一方では、二価イオ
ン、すなわちカルシウムおよびマンガンは競合的阻害剤
である（Ｈａｌｌｃｈｅｒ，Ｌ．Ｍ．とＳｈｅｒｍａ
ｎ，Ｗ．Ｒ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻：
１０８９６〜９０１頁（１９８０年））。リチウムはイ
ノシトールモノホスファターゼを非競合的に阻害する。

【０００７】ＩＭＰは基質ＩＮＳ（１）Ｐ、ＩＮＳ
（３）Ｐ、およびＩＮＳ（４）Ｐからイノシトールを遊
離させる。ＩＭＰはこれに限定するものではないが、Ｓ
ｈｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２４巻：
１０８９６〜１０９０１頁（１９８０年）、Ｔａｋｉｍ
ｏｔｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）、９
８巻：３６３〜３７０頁（１９８５年）およびＧｅｅ、
Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．Ｊ．、２４９巻：８８３〜８８９頁
（１９８８年）によって開示されたものを含む多様な非
イノシトール含有基質を加水分解することができる。最
初のヒトのＩＭＰ・ｃＤＮＡはＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒな
ど（ＷＯ９３／２５６９２（１９３３年））によって分
離され、開示された。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明のポリペプチドは
ヒトのイノシトールモノホスファターゼポリペプチドと
して推定的に確認された。この確認はアミノ酸配列相同
性の結果で得られた。本発明の一側面は、ｈＩＭＰ−Ｈ
１である新規な推定的な成熟ポリペプチドならびにその
断片、類縁体および誘導体を提供する。本発明のポリペ
プチドはヒト起源のものである。本発明の別の側面で
は、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。本発明のさらに
別の側面は、組換え技術によってこれらのポリペプチド
を製造する方法を提供する。本発明のさらに別の側面
は、これらのポリペプチドまたはこれらポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを、例えばこのクラスの酵
素を阻害することのできる化合物を検索し、設計するた
めおよび精神医学的な障害の処置のためなど、治療目的
のために使用する方法を提供する。本発明のさらに別の
側面は、これらのポリペプチドに対する抗体を提供す
る。本発明のさらに別の側面は、例えば精神疾患および
鬱病（両極性および非両極性）の処置においてこれらの
ポリペプチドの作用を阻害するために使用しうる、これ
らのポリペプチドに対する拮抗物質を提供する。本発明
のこれらおよびその他の側面は本明細書中の開示によっ
て当技術分野における熟練者には明白となる筈である。

【０００９】本発明は以下のものに関する： １）（ａ）図１に示す演繹したアミノ酸配列を持つｈＩ
ＭＰ−Ｈ１ポリペプチドまたはこのポリペプチドの断
片、類縁体または誘導体をコードするポリヌクレオチ
ド、（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号７５７５３に含まれるｃＤ
ＮＡがコードするアミノ酸配列を持つｈＩＭＰ−Ｈ１ポ
リペプチドまたはこのポリペプチドの断片、類縁体また
は誘導体をコードするポリヌクレオチド、から構成され
る群から選択した分離されたポリヌクレオチド。 ２）ポリヌクレオチドがＤＮＡである１）のポリヌクレ
オチド。 ３）ポリヌクレオチドがＲＮＡである１）のポリヌクレ
オチド。 ４）ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである１）のポリ
ヌクレオチド。 ５）ポリヌクレオチドが図１に示す演繹したアミノ酸配
列を持つｈＩＭＰ−Ｈ１をコードする２）のポリヌクレ
オチド。 ６）ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番号７５７５３の
ｃＤＮＡがコードするｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペプチドをコ
ードする２）のポリヌクレオチド。 ７）図１に示すｈＩＭＰ−Ｈ１のコード配列を持つ１）
のポリヌクレオチド。 ８）ＡＴＣＣ寄託番号７５７５３として寄託したｈＩＭ
Ｐ−Ｈ１のコード配列を持つ２）のポリヌクレオチド。 ９）異種ポリヌクレオチドと融合された１）〜８）のい
ずれかに記載のポリヌクレオチド。 １０）異種ポリヌクレオチドが異種ポリペプチドをコー
ドする、９）に記載のポリヌクレオチド。 １１）該異種ポリペプチドが、該ポリヌクレオチドによ
ってコードされるポリペプチドと融合されている、１
０）に記載のポリヌクレオチド。 １２）２）のＤＮＡを含むベクター。 １３）ポリヌクレオチドが調節制御配列に作動可能に連
結されている、１２）に記載のベクター。 １４）１２）のベクターで遺伝子工学的に処理した宿主
細胞。 １５）該宿主細胞が原核生物細胞、真核生物細胞、動物
細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、Ｃ
ＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または大腸菌細胞である、１４）
に記載の宿主細胞。 １６）１４）の宿主細胞からそのＤＮＡがコードするポ
リペプチドを発現させることを含むポリペプチドの製造
法。 １７）１２）のベクターで細胞を遺伝子工学的に処理す
ることを含むポリペプチドを発現することのできる細胞
の製造法。 １８）２）のＤＮＡにハイブリッドを形成でき、ｈＩＭ
Ｐ−Ｈ１活性を持つポリペプチドをコードする分離され
たＤＮＡ。 １９）（ｉ）図１に示す演繹されたアミノ酸配列を持つ
ｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペプチドおよびその断片、類縁体お
よび誘導体および（ｉｉ）ＡＴＣＣ寄託番号７５７５３
のｃＤＮＡがコードするｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペプチドお
よびそのポリペプチドの断片、類縁体および誘導体から
構成される群から選択したポリペプチド。 ２０）ポリペプチドが図１に示す演繹したアミノ酸配列
を持つｈＩＭＰ−Ｈ１である１９）のポリペプチド。 ２１）該ポリペプチドがラベルされているか、修飾され
ているか、あるいはポリエチレングリコールと融合され
ている、１９）または２０）に記載のポリペプチド。 ２２）該ポリペプチドが異種ポリペプチドと融合されて
いる、１９）または２０）に記載のポリペプチド。 ２３）該ポリペプチドがＮ末端メチオニンを欠いてい
る、１９）または２０）に記載のポリペプチド。 ２４）該ポリペプチドがＮ末端メチオニンを有してい
る、１９）または２０）に記載のポリペプチド。 ２５）１９）のポリペプチドに対する抗体。 ２６）該抗体が１９）〜２４）のいずれかに記載のポリ
ペプチドと特異的に結合する、２５）に記載の抗体。 ２７）ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一
鎖、単一鎖、ヒト抗体、ヒト化抗体またはＦａｂ断片で
ある、２５）または２６）に記載の抗体。 ２８）１９）のポリペプチドに対する拮抗物質。 ２９）２８）の拮抗物質の治療的有効量を含む、ｈＩＭ
Ｐ−Ｈ１を阻害する必要がある患者を処置するための医
薬組成物。 ３０）２８）の拮抗物質であるポリペプチドをコード
し、生体内で治療的有効量の該ポリペプチドを発現する
ＤＮＡを含む、ｈＩＭＰ−Ｈ１を阻害する必要がある患
者を処置するための医薬組成物。 ３１）１）〜１１）のいずれかに記載のポリヌクレオチ
ドおよび製薬的に許容される担体を含む医薬組成物。 ３２）１９）〜２４）のいずれかに記載のポリペプチド
および製薬的に許容される担体を含む医薬組成物。 ３３）２５）〜２７）のいずれかに記載の抗体および製
薬的に許容される担体を含む医薬組成物。 ３４）ｈＩＭＰ−Ｈ１とイノシトールモノホスフェート
との相互作用を阻害する化合物を検出する方法であっ
て、その化合物をイノシトールモノホスフェートの存在
下にｈＩＭＰ−Ｈ１を発現する細胞系列と接触させるこ
と、およびイノシトールモノホスフェートのｈＩＭＰ−
Ｈ１による加水分解を測定することを含む方法。 ３５）該化合物がｈＩＭＰ−Ｈ１の類似物である、３
４）に記載の方法。 ３６）該化合物が１）〜１１）のいずれかに記載のポリ
ヌクレオチドに対するアンチセンス分子である、３４）
に記載の方法。 ３７）該化合物が低分子である、３４）に記載の方法。 ３８）薬物の製造における、１）〜１１）のいずれかに
記載のポリヌクレオチドの使用。 ３９）薬物の製造における、１９）〜２４）のいずれか
に記載のポリペプチドの使用。 ４０）薬物の製造における、２５）〜２７）のいずれか
に記載の抗体の使用。

【００１０】配列決定の不正確さはポリヌクレオチド配
列の決定を試みる時には、日常的な難題である。従っ
て、図１の配列は数回行った配列決定実験に基づくもの
だが、その配列決定の正確度は少なくとも９７％である
と考えられる。本発明の一側面は図１に示す演繹された
アミノ酸配列を持つ成熟ポリペプチドまたはＡＴＣＣ寄
託番号７５７５３として１９９４年４月２５日に寄託し
たクローンのｃＤＮＡがコードする成熟ポリペプチドを
コードする分離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供
する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドはヒトの脳、リンパ球、および胎盤
から取得しうる。この発明のポリヌクレオチドはヒトの
脳組織から誘導したｃＤＮＡライブラリー中に発見され
た。これは構造的にイノシトールモノホスファターゼ族
に関連付けられる。これは約２６５アミノ酸残基の蛋白
質をコードする読取り枠を含む。この蛋白質はヒトのイ
ノシトールモノホスファターゼに対して２６５アミノ酸
の長さにわたって同一性５５％および類似性６５％に達
する最高度の相同性を示す。アミノ酸配列ＤＰＩＤＧＴ
が本発明のポリペプチドに保存されていることも、この
領域がＩＭＰ酵素の活性部位において必須であることが
証明されているので、重要なことである。

【００１２】本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの型で
もＤＮＡの型であってもよく、そのＤＮＡにはｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包含する。この
ＤＮＡは二重鎖または単一鎖であってもよく、もしも単
一鎖ならばコード鎖であっても非コード鎖（アンチセン
ス鎖）であってもよい。成熟ポリペプチドをコードする
コード配列は図１に示すコード配列または寄託したクロ
ーンのものと同一であってもよく、また遺伝子コードの
重複性または縮退性の結果として、コード配列が同じ成
熟ポリペプチドをコードする図１のＤＮＡとも寄託した
ｃＤＮＡとも異なるコード配列であってもよい。

【００１３】図１に示す成熟ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドまたは寄託したｃＤＮＡがコードする
成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは：成
熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドの
コード配列および、たとえばリーダーまたは分泌配列ま
たはプロ蛋白質配列のような付加的コード配列；成熟ポ
リペプチドのコード配列（および要すれば付加的コード
配列）および、たとえばイントロンまたは成熟ポリペプ
チドのコード配列の５’−および／または３’−の非コ
ード配列のような非コード配列；を包含することもあ
る。そこで、用語「ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド」はコード配列のみを含むポリヌクレオチドな
らびに付加的配列および／または非コード配列を含むポ
リヌクレオチドを包含する。

【００１４】本発明はさらに、図１に示す演繹したアミ
ノ酸配列を持つポリペプチドまたは寄託したクローンの
ｃＤＮＡがコードするポリペプチドの、断片、類縁体お
よび誘導体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体
に関する。このポリヌクレオチドの変異体は本ポリヌク
レオチドの天然起源対立遺伝子変異体であるかまたは本
ポリヌクレオチドの非天然起源変異体であってもよい。
こうして、本発明は図１に示すものと同じ成熟ポリペプ
チドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡがコードする同
じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなら
びにこれらポリヌクレオチドの変異体であって、これら
の変異体は図１に示すポリペプチドまたは寄託したクロ
ーンのｃＤＮＡがコードするポリペプチドの断片、誘導
体または類縁体をコードするものを包含する。このよう
なヌクレオチド変異体には欠失変異体、置換変異体およ
び付加変異体または挿入変異体を包含する。

【００１５】前記に指摘した通り、本ポリヌクレオチド
は図１に示すコード配列または寄託したクローンのコー
ド配列の天然起源アレル変異体であるコード配列を持つ
ことがある。当技術分野で知られている通り、アレル変
異体はポリヌクレオチド配列の別型であって、コードす
るポリペプチドの機能を実質的に変化させずにヌクレオ
チドに１個またはそれ以上の、置換、欠失または付加が
あるかもしれないものである。

【００１６】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
の精製を可能にするマーカー配列が融合したコード配列
を枠内に持ちうる。このマーカー配列は細菌性宿主の場
合にｐＱＥ−９ベクターによって供給されるこのマーカ
ーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するヘキサ
ヒスチジンタグでありうるし、または哺乳類宿主、たと
えばＣＯＳ−７細胞を使用する時は、例えばこのマーカ
ー配列は赤血球凝集素（ＨＡ）タグでもよい。このＨＡ
タグはインフルエンザの赤血球凝集素蛋白質から誘導し
たエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．など、Ｃ
ｅｌｌ、３７巻：７６７頁（１９８４年））。

【００１７】本発明はさらにもし両配列間に少なくとも
５０％、好ましくは７０％の同一性があれば前記配列に
ハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。本発
明は殊に前記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条
件下にハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中に使用する用語「ストリンジェントな条
件」とは両配列間に少なくとも９５％、好ましくは９７
％の同一性がある時にのみハイブリッド形成が起きるこ
とになることを意味する。好適な態様において前記ポリ
ヌクレオチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチド
は図１のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡがコードする
成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活
性を保持するポリペプチドをコードする。

【００１８】本明細書に示した寄託は特許手続上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の条項の
もとに維持されることになっている。これらの寄託物は
当技術分野における熟練者の便宜のためにのみ提供する
ものであって、この寄託物が米国特許法第１１２条の要
件を満たすことを承認するものではない。寄託物に含ま
れるポリヌクレオチドの配列ならびにこれがコードする
ポリペプチドのアミノ酸配列はここに参考のために引用
するものであって、本明細書の配列の記載に関して争い
がある場合に調整するものである。寄託物を製造し、使
用し、または販売するためには許諾が必要であって、そ
の許諾をここで授与するものではない。

【００１９】本発明はさらに図１に示す演繹されたアミ
ノ酸配列または寄託したｃＤＮＡがコードするするアミ
ノ酸配列を持つｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペプチドならびにそ
のポリペプチドの断片、類縁体および誘導体に関する。
用語「断片」、「誘導体」および「類縁体」は図１に示
すポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡに関連して言及
する時には、そのポリペプチドと本質的に同じ生物学的
機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。そ
こで、類縁体はプロプロテイン部分の切断によって活性
化されて活性な成熟ポリペプチドを生産するプロプロテ
インを包含する。本発明のポリペプチドは組換えポリペ
プチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
ってもよく、好ましくは組換えポリペプチドである。

【００２０】図１に示すポリペプチドまたは寄託したｃ
ＤＮＡがコードするポリペプチドの断片、誘導体または
類縁体は（ｉ）アミノ酸残基の１個またはそれ以上が保
存性または非保存性アミノ酸残基（好ましくは保存性ア
ミノ酸残基）で置換されているものであって、この置換
アミノ酸残基は遺伝子コードがコードするものであって
もなくてもよく、または（ｉｉ）アミノ酸残基１個また
はそれ以上が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟
ポリペプチドが他の化合物、たとえばポリペプチドの半
減期を増加する化合物（例えばポリエチレングリコー
ル）のようなものに融合しているもの、または（ｉｖ）
成熟ポリペプチドに、たとえばリーダーまたは分泌配列
または成熟ポリペプチドの精製のために採用する配列ま
たはプロプロテイン配列のような付加的なアミノ酸が融
合しているものでありうる。これら断片、誘導体および
類縁体は本明細書の教示からはこの技術分野の熟練の範
囲内にあると見做される。

【００２１】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは分離された型で供給され、好ましく
は均一になるまで精製される。用語「分離された」はそ
の材料がその起源である環境（たとえば、天然起源のも
のであれば天然の環境）から移動したことを意味する。
例えば、生きている動物の中に存在する天然起源ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは分離されていないが、
天然系における共存物質の一部または全部から分けられ
た同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離され
ている。これらのポリヌクレオチドはベクターの一部で
あることができ、および／またはこれらのポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドは構成の一部であることがで
き、そのベクターまたは構成が天然環境の一部でないと
いう点でなお分離されている。

【００２２】本発明はまた本発明のポリヌクレオチドを
含むベクター、本発明のベクターで遺伝子工学的に処理
された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの生産に関する。宿主細胞を、例えばクローニ
ングベクターまたは発現ベクターであってもよい本発明
のベクターで遺伝子工学的に処理（形質導入または形質
転換または遺伝子移入）する。このベクターは、例えば
プラスミド、ウイルス粒子、ファージその他の型であり
うる。遺伝子工学的に処理した宿主細胞はプロモーター
の活性化、形質転換体の選択またはｈＩＭＰ−Ｈ１遺伝
子の増幅のために適当なように修正した通常の栄養培地
中で培養できる。培養条件、たとえば温度、ｐＨその他
のようなものは発現のために選択した宿主細胞について
以前に使用されたものであって通常の当業者には明白と
なるものである。

【００２３】本発明のポリヌクレオチドを組換え技術に
よってポリペプチドを製造するために採用することもあ
る。そこで、例えばこのポリヌクレオチドはポリペプチ
ドの発現のために多種の発現ベクターの中のいずれか一
つを含めることもある。これらのベクターには染色体、
非染色体および合成ＤＮＡ配列、たとえばＳＶ４０の誘
導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイ
ルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡ、
ワクチニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよびシュ
ードラビエスのようなウイルスのウイルスＤＮＡとの組
合せから誘導したベクターを含む。しかしながら、他の
いずれのベクターもそれが宿主内で複製可能で生存可能
であれば使用しうる。

【００２４】適当なＤＮＡ配列は種々の操作法によって
ベクターに挿入しうる。一般的に、ＤＮＡ配列は適当な
制限エンドヌクレアーゼ部位に当技術分野で知られてい
る操作法によって挿入する。そのような操作法その他は
当技術の範囲内にあると見做される。発現ベクターにあ
るＤＮＡ配列はｍＲＮＡ合成を指示する適当な発現制御
配列（プロモーター）と作動可能に結合している。その
プロモーターの代表例としてはＬＴＲまたはＳＶ４０プ
ロモーター、大腸菌のｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラ
ムダＰＬプロモーターおよび原核生物または真核生物細
胞またはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御する
ことが知られているその他のプロモーターを指摘しう
る。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム
結合部位および転写終結部位を含む。ベクターはまた増
幅発現のために適当な配列を含みうる。これに加えて、
発現ベクターは、たとえば真核生物細胞培養のためのジ
ヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性または、た
とえば大腸菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシ
リン耐性のような好ましくは形質転換した宿主細胞の選
択用に表現型特性を提供するために選択可能なマーカー
遺伝子を１個またはそれ以上含む。

【００２５】前記のような適当なＤＮＡ配列ならびに適
当なプロモーターまたは制御配列をを含むベクターを採
用してそのプロテインを発現させるために適当な宿主を
形質転換しうる。適当な宿主の代表例として、たとえば
大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィム
リウムのような細菌細胞、酵母のような菌細胞、ドロソ
フィラおよびＳｆ９のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ
またはＢｏｗｅｓメラノーマのような動物細胞、植物細
胞などを指摘しうる。適当な宿主の選択は本明細書の教
示から当技術分野の熟練の範囲内にあると見做される。

【００２６】さらに特異的には、本発明は広義に前記し
たような配列１個またはそれ以上をを含む組換え構築物
も包含する。これらの構築物は正方向または逆方向に本
発明の配列を挿入したプラスミドまたはウイルスベクタ
ーのようなベクターを含む。この態様の好適な側面にお
いて、この構築物はさらに、例えば配列に作動可能に結
合しているプロモーターなどを含む制御配列を包含す
る。多数の適当なベクターとプロモーターが当技術分野
の熟練者に知られており、商業的に入手可能である。以
下のベクターを例示の目的で提示する：細菌：ｐＱＥ７
０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ社）、ｐｂ
ｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７
４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ
８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２
３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）。真核生物用：ｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、
ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）。しかし
ながら、宿主内で複製可能で存続可能である限り、その
他のプラスミドまたはベクターも使用しうる。

【００２７】プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェ
ニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたはその他の
選択マーカーを持つベクターを用いて所望のいずれの遺
伝子からでも選択できる。適当なベクターの二種はＰＫ
Ｋ２３２−８およびＰＣＭ７である。特に指定する細菌
プロモーターにはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇ
ｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。真核
生物プロモーターはＣＭＶ即時早期、ＨＳＶチミジンキ
ナーゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスから
のＬＴＲおよびマウスのメタロチオネイン−Ｉを包含す
る。適当なベクターおよびプロモーターの選択は当技術
分野における通常の熟練水準内にある。さらに別の態様
では、本発明は前記構築物を含む宿主細胞にに関する。
宿主細胞は哺乳類細胞のような高等真核生物細胞、酵母
細胞のような下等真核生物細胞またはこの宿主細胞は細
菌細胞のような原核生物細胞であることができる。宿主
細胞への構築物の導入は燐酸カルシウム遺伝子移入、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン媒介遺伝子移入または電気穿孔法
で行うことができる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ、Ｄｉｂｎｅｒ，
Ｍ．、Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．、「分子生物学における基礎
的方法（Ｂａｓｉｃ・Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９８６年））。

【００２８】宿主細胞中の構築物は通常の方法で使用で
き、組換え配列がコードする遺伝子生成物を生産する。
あるいは、本発明のポリペプチドは通常のペプチド合成
器によっても合成的に生産できる。

【００２９】成熟蛋白質は哺乳類細胞、酵母、細菌また
はその他の細胞中で適当なプロモーターの制御下に発現
できる。細胞不含翻訳系を本発明のＤＮＡ構築物から誘
導したＲＮＡを使用してこれらの蛋白質を生産するため
に採用できる。原核生物宿主および真核生物宿主で使用
するために適当なクローニングおよび発現ベクターはＳ
ａｍｂｒｏｏｋなど、「分子クローニング：実験室便覧
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ・
Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ社、Ｎ．Ｙ．（１９８９
年）に記載されており、ここに参考のために引用する。

【００３０】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写はベクターにエンハンサー配
列を挿入することによって増加できる。エンハンサーは
ＤＮＡのシス−作用エレメントであって、通常約１０か
ら３００ｂｐであって、プロモーターに作用してその転
写を増加する。これらの例には複製開始点の後期側にあ
るｂｐ１００から２７０のＳＶ４０エンハンサー、サイ
トメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複
製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およ
びアデノウイルスエンハンサーを包含する。

【００３１】一般に、組換え発現ベクターに複製開始点
および、たとえば大腸菌およびパン酵母のアンピシリン
耐性遺伝子であるＴＲＰ１遺伝子など宿主細胞の形質転
換を選択できるマーカーおよび高度に発現された遺伝子
から誘導した下流の構造配列の転写を指示するプロモー
ターを含む。このようなプロモーターは、中でも３−ホ
スホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸性
ホスファターゼまたは熱ショックプロテインのような解
糖酵素をコードするオペロンから誘導できる。異種構造
配列は翻訳の開始および終結配列、および好ましくは翻
訳した蛋白質の細胞縁辺腔または細胞外の培地への分泌
を指示することができるリーダー配列とともに適当な相
に集合させる。要すれば、この異種配列は、たとえば発
現した組換え生成物の安定化または精製単純化など所望
の特性を与えるＮ−末端同定ペプチドを含む融合蛋白質
をコードできる。

【００３２】細菌に使用する有用な発現ベクターは所望
の蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列を機能的プロモー
ターとともに作動可能な読取り枠内にある適当な翻訳開
始および終結シグナルとともに挿入することによって構
築する。このベクターにはベクターの持続を確保し、も
し所望なら宿主内での増幅を提供するために表現型選択
マーカーを一つまたはそれ以上および複製開始点を含ま
せる。形質転換のために適当な原核生物宿主には、大腸
菌、枯草菌、サルモネラ・ティフィムリウムおよび緑膿
菌属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッカ
ス属の中の数々の種を包含するが、選択の問題として
は、その他を採用することもありうる。代表的であるが
非限定的例示として、細菌を使用するのに有用な発現ベ
クターはよく知られているクローニングベクターｐＢＲ
３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子エレメントを含
む商業的に入手可能なプラスミドから誘導した選択マー
カーおよび細菌複製開始点を含むことができる。これら
の商業的ベクターには、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ウ
プサラ、スウェーデン）とＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ・
Ｂｉｏｔｅｃ社、マジソン、ＷＩ、米国）とを包含す
る。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」部分を適当
なプロモーターおよび発現すべき構造配列と結合する。

【００３３】適当な宿主株を形質転換し、宿主株を適当
な細胞濃度まで生育させ、それに続いて選択したプロモ
ーターを適当な手段（たとえば温度変化または化学的誘
導）で誘導して、細胞をさらに一定期間培養する。典型
的には細胞を遠心分離によって収集し、物理的または化
学的方法によって崩壊させ、得られる粗製抽出物をその
後の精製のために保持する。蛋白質の発現に採用する微
生物細胞は、凍結−解凍反復、超音波処理、機械的崩
壊、または細胞溶解剤の使用を含む通常の方法のいずれ
によっても崩壊でき、このような方法は当技術分野の熟
練者にはよく知られている。

【００３４】種々の哺乳類細胞培養系を組換え蛋白質を
発現するために採用できる。哺乳類発現系の例にはＧｌ
ｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ、２３巻：１７５頁（１９８１
年）が記載したサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系
列、および、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬ
ａおよびＢＨＫ細胞系列などの適合するベクターを発現
することができる他種の細胞系列を包含する。哺乳類発
現ベクターには複製開始点、適当なプロモーターおよび
エンハンサー、およびまた必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライシング供与体およびスプ
ライシング受容体部位、転写終結配列、および５’−隣
接非転写配列を含ませる。ＳＶ４０スプライシングから
誘導したＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位を必要な
非転写遺伝子エレメントを提供するために使用すること
もありうる。

【００３５】ｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペプチドは組換え細胞
培養物から硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸
性抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、
ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレ
クチンクロマトグラフィーを包含する方法によって回収
し、精製できる。精製の間に低濃度のカルシウムイオン
（約０．１５〜５ｍＭ）を存在させるのは好適である
（Ｐｒｉｃｅなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４４
巻：９１７頁（１９６９年））。蛋白質再折り畳みの段
階を成熟蛋白質の配置を完成するため必要ならば使用で
きる。最後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を最終的な精製段階のために採用できる。

【００３６】本発明のポリペプチドは、精製天然産生成
物、または化学合成操作の生成物、または原核生物また
は真核生物宿主（例えば培養物中の細菌、酵母、高等植
物、昆虫および哺乳類細胞によって）から組換え技術に
よって生産したものでありうる。組換え生産操作に採用
する宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシ
ル化されることも、グリコシル化されないこともある。
本発明のポリペプチドは開始メチオニンアミノ酸残基を
包含することもある。

【００３７】ｈＩＭＰ−Ｈ１をリチウム以外の異なる躁
鬱病治療用化合物を設計するために採用することもあり
うる。ｈＩＭＰ−Ｈ１はそれ故、ｈＩＭＰ−Ｈ１を阻害
することのできる化合物を検索し、設計するために有用
である。ｈＩＭＰ−Ｈ１の別の用途は遺伝子病の地図作
成である。例えばある種の型の遺伝性躁鬱病の原因であ
る正確な遺伝子座はなお知られておらず、十分な研究の
対象である（Ｙｏｒｋなど、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、９０
巻：５８３３〜５８３７頁（１９９３年））。この研究
の標的の一つはＩＭＰ遺伝子である。ｈＩＭＰ−Ｈ１ｃ
ＤＮＡを使用して完全遺伝子の染色体座を分離できる。
この染色体領域を、次に、躁鬱病またはおそらく他の精
神疾患に罹患した族における突然変異のいずれかがこの
領域に局在するかどうかを研究して決定する。

【００３８】本発明のポリヌクレオチドは同様な生物学
的活性を持つ別個の分子を確認するためにも有用であ
る。例えばｈＩＭＰ−Ｈ１遺伝子のコード領域の一部を
オリゴヌクレオチドプローブとして採用しうる。本発明
の遺伝子の配列と相補的な配列を持つ標識オリゴヌクレ
オチドは、ライブラリーのどの構成員とこのプローブと
がハイブリッド形成するか決定するためにヒトのｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーを検索
するために使用される。

【００３９】本発明はｈＩＭＰ−Ｈ１をその機能から遮
断する化合物（拮抗物質）を確認する検定法に関する。
ｈＩＭＰ−Ｈ１を阻害する別個の治療用化合物を設計す
るための構造的基礎を提供するため、ｈＩＭＰ−Ｈ１の
精製、クローニングおよびＸ線結晶学研究を行う。クロ
ーニングした酵素から構造データを作成し、中でもＸ線
結晶学的および構造データを得て、ｈＩＭＰ−Ｈ１に対
する拮抗物質を検索し、設計するために使用する。この
検索の一例にはＬ−［Ｕ−^１４Ｃ］Ｉｎｓ（１）Ｐを標
識として含有するＤＬ−Ｉｎｓ（１）Ｐからの
［^１４Ｃ］−イノシトールの放出測定（Ｇｕｍｂｅｒな
ど、Ｐｌａｎｔ・Ｐｈｙｓｉｏｌ．、７６巻：４０〜４
４頁（１９８９年）に記載）を包含する。酵素活性１単
位は３７℃で毎分基質１μモルを加水分解する活性を示
す。蛋白質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆ
ｏｒｄ，Ｍ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２巻：
２４８〜２５２頁（１９７６年））によって決定しう
る。

【００４０】前記検定法はＰＩサイクルに決定的な別種
の酵素を遮断するためにも使用しうるものであって、例
えばホスファチジルイノシトールシグナル伝達経路に関
与する酵素であるホスホイノシトールキナーゼは、すな
わちイノシトール−１，３，４−トリホスフェートおよ
びイノシトール−１，４−ジホスフェートから１位のホ
スフェートの加水分解を触媒する。

【００４１】拮抗物質候補にはｈＩＭＰ−Ｈ１に結合し
て基質に結合できないｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペプチドを作
る、ｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペプチドに対する抗体を包含す
る。拮抗物質候補にはｈＩＭＰ−Ｈ１に類似し（ｈＩＭ
Ｐ−Ｈ１機能を保持していない近縁蛋白質）、正常には
ｈＩＭＰ−Ｈ１が結合するサブタイプの受容体を認識
し、結合する蛋白質も包含する。しかしながら、第二メ
ッセンジャー応答は存在しない。このようにして、ｈＩ
ＭＰ−Ｈ１酵素の機能を妨害し、ｈＩＭＰ−Ｈ１阻害の
有益な治療的効果を達成する。これら蛋白質の数例に
は、これに限定するものではないが、オリゴヌクレオチ
ドおよびペプチド低分子を包含する。

【００４２】アンチセンス技術をＤＮＡまたはＲＮＡへ
のポリヌクレオチドの結合に基づく方法である三重ラセ
ン形成またはアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲ
ＮＡの両方法によって遺伝子発現を制御するために使用
することもある。例えば本発明の成熟ポリペプチドをコ
ードするこのポリヌクレオチド配列の５’−コード部分
を使用して長さ約１０塩基対から約４０塩基対までのア
ンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドを転写に関与する遺伝子領域と相
補的に設計し（三重ラセン−Ｌｅｅなど、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、６巻：３０７３頁（１９７９
年）；Ｃｏｏｎｅｙなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：
４５６頁（１９８８年）；Ｄｅｒｖａｎなど、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２５１巻：１３６０頁（１９９１年））、そこ
で転写およびｈＩＭＰ−Ｈ１の生産を妨害する。アンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドは生体内でｍＲＮＡと
ハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のｈＩＭＰ−Ｈ１へ
の翻訳を遮断する（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ、５６巻：５６０頁（１９９１年）；
「遺伝子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオ
キシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄ・ａｓ・Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ・Ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒｓ・ｏｆ・Ｇｅｎｅ・Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、Ｃ
ＲＣ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｂｏｃａ・Ｒａｎｔｏｎ、ＦＬ
（１９８８年））。前記オリゴヌクレオチドはアンチセ
ンスＲＮＡまたはＤＮＡが生体内で発現してｈＩＭＰ−
Ｈ１の生産を阻害しうるように細胞に送達できる。

【００４３】その他の拮抗物質候補はｈＩＭＰ−Ｈ１酵
素の触媒部位に結合し、占拠してその触媒部位に基質が
近付けなくして正常な生物学的活性を予防する低分子で
ある。低分子の例には、これに限定するものではない
が、低分子量ペプチドまたは低分子量のペプチド様分子
を包含する。これらの拮抗物質を躁病以外の精神病およ
び鬱病（両極性または非両極性の）を処置するために使
用しうる。拮抗物質はたとえば下記の医薬的に許容され
る担体とともに組成物中で採用することもある。

【００４４】ｈＩＭＰ−Ｈ１の作用を阻害する化合物を
適当な医薬的担体とともに組成物中で採用することもあ
る。これら組成物は治療的有効量のペプチドおよび医薬
的に許容される担体または添加剤を含む。この担体は、
これに限定するものではないが、食塩水、緩衝食塩水、
デキストロース、水、グリセリン、エタノールおよびこ
れらの組合せを包含する。製剤は投与の態様に適合させ
るべきである。

【００４５】これら医薬組成物は、たとえば経口、局
所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内または皮内の
ような経路の好都合な様式で投与しうる。これら医薬的
組成物は特定の徴候の処置および／または予防のために
有効な量を投与する。一般に、投与量は少なくとも約１
０μｇ／ｋｇ体重の量であって、ほとんどの場合に一日
当り約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない量で投与こととなろ
う。多くの場合、この日用量は投与経路、症状などを考
慮に入れて約１０μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ体重ま
でである。

【００４６】ｈＩＭＰ−Ｈ１を阻害することが確認され
たポリペプチドであるこれら化合物はしばしば「遺伝子
治療」と呼ばれているそのポリペプチドの生体内での発
現によって本発明に従って採用しうる。そこで、例えば
患者からの細胞を生体外でポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で遺伝子処理し
て、それら処理した細胞を次にそのポリペプチドで処置
すべき患者に供給する。このような方法は当技術分野で
良く知られている。例えば、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用するこ
とによって当技術分野で知られている操作法によって細
胞を処理する。

【００４７】同様にして、例えば当技術分野で知られて
いる操作法によって細胞を生体内で処理してポリペプチ
ドを生体内で発現することもある。当分野で知られてい
るように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを
含むレトロウイルス粒子を生産するための生産用細胞を
患者に投与して生体内で細胞に遺伝子工学的処理をして
このポリペプチドを生体内で発現する。本発明のポリペ
プチドを投与するためのこれらおよびその他の方法は当
技術分野における熟練者には本発明の教示から明白とな
ろう。例えば細胞に遺伝子工学的処理をするための発現
伝達体は、例えば適当な送達伝達体と結合した後に生体
内で細胞に遺伝子工学的処理をするために使用しうるア
デノウイルスのようにレトロウイルス以外のものであり
うる。

【００４８】本発明の配列はまた染色体確認のためにも
価値がある。この配列はヒトの各染色体上の特定の位置
を特異的標的とし、そこにハイブリッド形成できる。さ
らにその上、染色体上の特定の部位を確認する必要性が
現存する。染色体上の位置に目印するための実際の配列
データ（反復多型）に基づく染色体目印試薬は極めて少
数が入手できるにすぎない。本発明に従って染色体にＤ
ＮＡを地図作成することはこれら配列を疾病に関連する
遺伝子と相関付ける重要な第一段階である。

【００４９】略述すれば、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマ
ー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによっ
て配列を染色体に地図作成できる。ｃＤＮＡのコンピュ
ータ解析を使用して迅速にゲノムＤＮＡ中のエクソン１
個以上にわたらないので増幅工程を複雑化することのな
いプライマーを選択する。これらプライマーを次にヒト
の各染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲ検索に使
用する。このプライマーに対応するヒトの遺伝子を含む
ハイブリッドのみが増幅した断片を与えることとなる。

【００５０】体細胞ハイブリッドのＰＣＲ地図作成は特
定のＤＮＡを特定の染色体に割付けるための迅速な操作
である。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を
使用することで、特定の染色体からの一連の断片を用い
てまたは類似の様式における大きなゲノムクローンの集
積を用いて副局在化を達成できる。同様にして染色体に
地図作成するために使用できるその他の地図作成方策に
は現位置ハイブリッド形成、標識フロー分類染色体によ
る前検索、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを
構築するためのハイブリッド形成による前選択を包含す
る。

【００５１】分裂中期染色体展開へのｃＤＮＡクローン
による螢光現位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）は一段
階で正確な染色体位置を提供するために使用できる。こ
の技術は長さ５００塩基または６００塩基のｃＤＮＡで
使用できるが、しかしながら２０００ｂｐ以上の大きさ
のクローンは独特な染色体位置へのさらに高度な結合可
能性を持ち、単純な検出のために十分なシグナル強度を
有する。ＦＩＳＨにはＥＳＴを誘導した元のクローンの
使用が必要で、長いほどよい。例えば、２０００ｂｐは
良好で、４０００はさらに良く、時間の合理的な割合で
良好な結果を得るためには４０００以上はおそらく不要
であろう。この技術の綜説については、Ｖｅｒｍａな
ど、「ヒトの染色体：基礎技術便覧（Ｈｕｍａｎ・Ｃｈ
ｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ・Ｍａｎｕａｌ・ｏｆ・Ｂａｓ
ｉｃ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ｐｅｒｇａｍｏｎ・
Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク（１９８８年）を参照。

【００５２】一旦配列が正確な染色体の位置に地図作成
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝子地図デ
ータと関連付けできる。このデータは、例えばＶ．Ｍｃ
Ｋｕｓｉｃｋ、「ヒトのメンデル遺伝（Ｍｅｎｄｅｌｉ
ａｎ・Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ・ｉｎ・Ｍａｎ）」に見
出される（Ｊｏｈｎｓ・Ｈｏｐｋｉｎｓ大学Ｗｅｌｃｈ
医学図書館を経由してオンラインで入手できる）。同じ
染色体領域に割付けられた遺伝子と疾病との間の関係を
次にリンケージ分析によって確認する（物理的に隣接す
る遺伝子の共遺伝）。

【００５３】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。も
しも、ある突然変異が罹患個体のいくつかまたは全部に
観察されるが、正常な個体にはだれにも観察されなけれ
ば、その突然変異はその疾患の原因であるらしく思われ
る。

【００５４】物理的地図作成と遺伝子的地図作成技術と
の現技術で疾病に関連付けられた染色体領域に正確に割
付けられるＤＮＡは原因遺伝子５０個と５００個との間
の１個である（１メガ塩基の地図作成技術と２０ｋｂに
ついて１遺伝子を仮定）。これらポリペプチド、その断
片またはその他の誘導体またはその類縁体、またはそれ
らを発現する細胞はそれに対する抗体を生産するための
免疫原として使用できる。例えばこれら抗体は、ポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体であることがで
きる。本発明はキメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体
ならびにＦａｂ抗体またはＦａｂ発現ライブラリーの生
成物を包含する。当技術分野で知られている様々な操作
法を抗体およびその断片の生産に使用してもよい。

【００５５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して作成される抗体は、このポリペプチドを動物に直接
的に注射することによってまたはこのポリペプチドを動
物、好ましくは非ヒトに投与することによって取得でき
る。こうして得られる抗体はそこでこのポリペプチド自
体に結合することとなろう。こうして、これらポリペプ
チドの断片のみをコードする配列でさえ在来ポリペプチ
ド全体を結合する抗体を作成するために使用できる。次
にこのような抗体を使用してこのポリペプチドを発現す
る組織からポリペプチドを分離できる。

【００５６】モノクローナル抗体の調製のためには、連
続的細胞系列培養で生産される抗体を提供するいかなる
技術も使用できる。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２
５６巻：４９５〜４９７頁（１９７５年））、トリオー
マ技術、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏ
ｒなど、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・Ｔｏｄａｙ、４巻：７
２頁（１９８３年））、およびヒトのモノクローナル抗
体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏ
ｌｅなど、「モノクローナル抗体と癌治療法（Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ・ａｎｄ・Ｃａｎ
ｃｅｒ・Ｔｈｅｒａｐｙ）」、Ａｌａｎ・Ｒ．Ｌｉｓｓ
社、７７〜９６頁（１９８５年））を包含する。

【００５７】単鎖抗体の生産用に記載された技術（米国
特許第４９４６７７８号）はこの発明の免疫原ポリペプ
チド生成物に対する単鎖抗体を生産するために適用でき
る。ｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペプチドに特異的な抗体は診断
用検定法の一部として対象から由来する試料中のｈＩＭ
Ｐ−Ｈ１濃度を検出するために使用できるはずである。
もし検出されればｈＩＭＰ−Ｈ１濃度の異常は対象の脳
中遊離イノシトールの増加および対応する精神病的およ
び／またはその他の生理学的な障害の指標でありうる。

【００５８】本発明を以下の実施例を参照してさらに記
載することとする。しかしながら、これらの実施例に限
定するものではないと理解すべきである。特段の指摘が
なければ、部または量はすべてが重量によるものであ
る。

【００５９】以下の実施例の理解を促進するために、頻
繁に使用する方法および／または用語をいくつか記載す
ることとする。「プラスミド」は先行する小文字ｐおよ
び／または後続する大文字および数字で命名する。本明
細書の出発プラスミドは商業的に入手できるか、非制限
的条件で公共的に入手できるか、または公表された操作
に従って入手できるプラスミドから構築できる。これに
加えて、記載されたものと等価なプラスミドは当技術分
野で知られており、通常の技術熟練者には明白となろ
う。

【００６０】ＤＮＡの「消化」はＤＮＡ中にある一定の
配列のみに作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的切断
を示す。本明細書で使用する種々の制限酵素は商業的に
入手可能であり、それらの反応条件、共働因子、および
その他の必要条件は通常の熟練者には知られるようにし
て使用する。分析目的のためには、典型的にはプラスミ
ドまたはＤＮＡ断片１μｇを酵素約２単位とともに緩衝
液約２０μＬ中で使用する。プラスミド構築のためのＤ
ＮＡ断片の分離の目的のためには、典型的にはＤＮＡ５
から５０μｇを酵素２０から２５０単位で多量の容積中
で消化する。特定の制限酵素のために適当な緩衝液およ
び基質量は製造社が指定している。インキュベーション
時間約１時間を通常３７℃で使用するが、しかし供給社
の指示に従って変化することもある。消化後、反応物を
ポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望の断
片を分離する。

【００６１】切断断片のサイズ分割はＧｏｅｄｄｅｌ，
Ｄ．など、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、８
巻：４０５７頁（１９８０年）が記載した８％ポリアク
リルアミドゲルを使用して実施する。「オリゴヌクレオ
チド」は化学合成したものでもよい単鎖ポリデオキシヌ
クレオチドまたは相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖２
個を示す。このような合成オリゴヌクレオチドは５’−
ホスフェートを持たず、そのため、キナーゼの存在下に
ＡＴＰとともにホスフェートを添加しなければ、他のオ
リゴヌクレオチドとは連結しない。合成オリゴヌクレオ
チドは脱燐酸化されていない断片と連結することもあ
る。

【００６２】「連結」は二重鎖核酸断片２個の間にホス
ホジエステル結合を形成する工程を示す（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．など、前出、１４６頁）。特段の指摘がなけ
ればほぼ等モル量の連結すべき両ＤＮＡ断片０．５μｇ
についてＴ４−ＤＮＡ連結酵素（「リガーゼ」）１０単
位を既知緩衝液および条件を使用して連結を達成しう
る。特段の記述がなければ、形質転換はＧｒａｈａｍ，
Ｆ．およびＶａｎ・ｄｅｒ・Ｅｂの方法、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ、５２巻：４５６〜４５７頁（１９７３年）に記載
されたようにして実行した。

【００６３】

【実施例】実施例１ 細菌によるｈＩＭＰ−Ｈ１の発現および精製 最初にｈＩＭＰ−Ｈ１、ＡＴＣＣ７５７５３をコードす
るＤＮＡ配列をプロセッシングされたｈＩＭＰ−Ｈ１蛋
白質（マイナスシグナルペプチド配列）の５’−末端配
列およびｈＩＭＰ−Ｈ１遺伝子の３’へのベクター配列
に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用
して増幅した。ｈＩＭＰ−Ｈ１に対応する付加的なヌク
レオチドを５’−および３’−両配列に追加した。この
５’−オリゴヌクレオチドプライマーは配列：５’−Ａ
ＣＴＴＧＣＴＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＡＣ
ＡＧＧＧＧＣＧ−３’を持ちＢａｍＨ１制限酵素部位に
続いてプロセッシングされた蛋白質コドンの推測上の末
端アミノ酸から出発する１８ヌクレオチドのｈＩＭＰ−
Ｈ１コード配列を含む。３’−配列：５’−ＡＣＴＴＧ
ＣＴＡＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ
ＣＣＧ−３’はＨｉｎｄＩＩＩ部位を含み、最終終結コ
ドンを含むｈＩＭＰ−Ｈ１の１８ヌクレオチドが後続す
る。制限酵素部位は細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉ
ａｇｅｎ社、９２５９、Ｅｔｏｎ・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈ
ａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）上の制限酵素部
位に対応する。

【００６４】ｐＱＥ−９は抗生物質耐性（Ａｍｐ^ｒ）、
細菌の複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ−調節可能なプ
ロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部
位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓ−タグおよび制限酵素部位を
コードする。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨ１およびＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化した。増幅した配列をｐＱＥ−９内に連
結し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列と
共に枠内に挿入した。次に連結混合物を使用してＱｉａ
ｇｅｎ社から商標Ｍ１５／ｒｅｐ４の下に入手できる大
腸菌株をＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．など、「分子クローニ
ング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃ
ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅ
ｓｓ社（１９８９年）に記載の操作によって形質転換し
た。Ｍ１５／ｒｅｐ４株はプラスミドｐＲＥＰ４を多重
コピー含み、ｌａｃＩレプレッサーを発現し、またカナ
マイシン耐性（Ｋａｎ^ｒ）を与える。形質転換体をＬＢ
プレート上で生育する性能によって確認し、アンピシリ
ン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミド
ＤＮＡを単離し、制限分析によって確認した。所望の構
築物を含むクローンをＡｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およ
びＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）の両方を添加したＬＢ培地
で液体培養して一夜（Ｏ／Ｎ）生育させた。Ｏ／Ｎ培養
物を用いて大量培養基に１：１００から１：２５０まで
の比率で接種した。細胞を最適密度６００（Ｏ．Ｄ．
^６００）が０．４と０．６との間になるまで生育させ
た。次にＩＰＴＧ（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭまで添加した。Ｉ
ＰＴＧはｌａｃＩレプレッサーを不活化してＰ／Ｏをク
リアーして遺伝子発現の増加を誘導する。細胞をなお３
時間から４時間生育した。次に遠心分離によって細胞を
収集した。細胞ペレットをカオトロープ剤６Ｍ−塩酸グ
アニジン中で溶解した。澄明化の後、溶解したｈＩＭＰ
−Ｈ１をこの溶液からニッケル−キレートカラム上で６
−Ｈｉｓタグを含む蛋白質が強固に結合する条件（Ｈｏ
ｃｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｐｈ
ｙ、４１１巻：１７７〜１８４頁（１９８４年））でク
ロマトグラフィーを行って精製した。ｈＩＭＰ−Ｈ１
（純度９５％）を６Ｍ−塩酸グアニジン、ｐＨ５．０で
カラムから溶離し、再生の目的で３Ｍ−グアニジン塩
酸、１００ｍＭ−燐酸ナトリウム、１０ｍＭ−グルタチ
オン（還元型）、および２ｍＭ−グルタチオン（酸化
型）に調整した。この溶液中で１２時間インキュベーシ
ョンした後、蛋白質を１０ｍＭ−燐酸ナトリウムに対し
て透析した。

【００６５】実施例２ バキュロウイルス発現系を使用するｈＩＭＰ−Ｈ１のク
ローニングおよび発現 全長ｈＩＭＰ−Ｈ１蛋白質をコードするＤＮＡ配列、Ａ
ＴＣＣ７５７５３、を遺伝子の５’−および３’−配列
に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用
して増幅した。 ５’−プライマーは配列：５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣ
ＣＡＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＡＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧ
−３’を持ち、ＢａｍＨ１制限酵素部位（第一の下線）
とそれに続く真核生物細胞中での翻訳開始の効率的シグ
ナルに類似した６ヌクレオチド（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９４７〜９５０頁
（１９８７年））をｈＩＭＰ−Ｈ１遺伝子の最初の２１
ヌクレオチド（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に第二の下
線）の直後に含む。 ３’−プライマーは配列：５’−ＣＡＣＡＧＧＴＡＣＣ
ＣＡＧＣＴＴＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＡＧ−３’を持
ち、制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１８のための切断
部位およびｈＩＭＰ−Ｈ１遺伝子の３’−非翻訳配列に
相補的な２０ヌクレオチドを含む。増幅した配列は１％
アガロースゲルから商業的に入手できるキット（「Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ１０１社、ラホヤ、ＣＡ）を
使用して分離した。次に断片をエンドヌクレアーゼＢａ
ｍＨ１およびＡｓｐ７１８で消化し、次に再び１％アガ
ロースゲル上で精製した。この断片をＦ２と命名する。

【００６６】ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクター
の下記変換体）を使用してバキュロウイルス発現系（綜
説についてはＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．とＳｍｉｔｈ，
Ｇ．Ｅ．、「バキュロウイルスベクターおよび昆虫細胞
培養操作法の方法便覧（Ａ・ｍａｎｕａｌ・ｏｆ・ｍｅ
ｔｈｏｄｓ・ｆｏｒ・ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ・ｖｅｃ
ｔｏｒｓ・ａｎｄ・ｉｎｓｅｃｔ・ｃｅｌｌ・ｃｕｌｔ
ｕｒｅ・ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）」、Ｔｅｘａｓ・Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ・Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ・Ｓ
ｔａｔｉｏｎ・Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、１５５５号を参照
（１９８７年））によってｈＩＭＰ−Ｈ１蛋白質を発現
する。この発現ベクターはオートグラファ・カリフォル
ニカの核ポリヘドロージスウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の
強力なポリヘドリンプロモーターおよびそれに続いて制
限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１およびＡｓｐ７１８の
ための認識部位を含む。サルのウイルス（ＳＶ）４０の
ポリアデニル化部位を効率的なポリアデニル化のために
使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、大腸
菌からのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプ
ロモーターと同じ方向に挿入し、続いてポリヘドリン遺
伝子のポリアデニル化シグナルを挿入する。共遺伝子移
入した野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介相同的再結合の
ためのウイルス配列によってポリヘドリン配列を両端に
隣接させる。たとえばｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およ
びｐＡｃＩＭ１のような他種のバキュロウイルスベクタ
ー（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．とＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．
Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０巻：３１〜３９頁）も
多数がｐＲＧ１の代わりに使用できるはずである。

【００６７】このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨ１およ
びＡｓｐ７１８で消化し、次に当技術分野で知られてい
る操作によってウシ小腸ホスファターゼを使用して脱燐
酸化した。次にＤＮＡを１％アガロースゲルから商業的
に入手できるキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１社、ラホヤ、ＣＡ）を使用して分離した。このベ
クターＤＮＡをＶ２と命名する。断片Ｆ２および脱燐酸
化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。大
腸菌ＨＢ１０１細胞を次に形質転換し、ｈＩＭＰ−Ｈ１
遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃｈＩＭＰ−Ｈ１）
を含む細菌を酵素ＢａｍＨ１およびＡｓｐ７１８を使用
して確認した。クローニングした断片の配列はＤＮＡ配
列決定によって確認した。

【００６８】５μｇのプラスミドｐＢａｃｈＩＭＰ−Ｈ
１を商業的に入手できる線形化バキュロウイルス１．０
μｇ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）バキュロウイル
スＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンジェゴ、Ｃ
Ａ）とともにリポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒな
ど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
８４巻：７４１３〜７４１７頁（１９８７年））を使用
して共遺伝子移入した。ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）
ウイルスＤＮＡ１μｇとプラスミドｐＢａｃｈＩＭＰ−
Ｈ１とを血清不含Ｇｒａｃｅ培地５０μＬ（Ｌｉｆｅ・
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ、ＭＤ）を入れたマイクロタイタープレートの無菌ウ
ェル中で混合した。その後、リポフェクチン１０μＬお
よびＧｒａｃｅ培地９０μＬを添加し、混合し、および
室温で１５分間インキュベーションした。次に遺伝子移
入混合物を血清不含Ｇｒａｃｅ培地１ｍＬとともに３５
ｍｍ組織培養プレート中に接種したＳｆ９昆虫細胞（Ａ
ＴＣＣ・ＣＲＬ１７１１）に滴加した。このプレートを
前後にゆすって新たに加えた溶液と混合した。プレート
を次に２７℃で５時間インキュベーションした。５時間
後、遺伝子移入溶液をプレートから去り、１０％ウシ胎
児血清添加Ｇｒａｃｅ昆虫培地１ｍＬを添加した。プレ
ートをインキュベーターに戻し、培養を４日間２７℃で
継続した。

【００６９】４日後、上清液を集めて、Ｓｕｍｍｅｒｓ
とＳｍｉｔｈ（前出）が記載したものと同様なプラーク
検定を行った。修正部分として青色に染色されたプラー
クを容易に分離できる「Ｂｌｕｅ・Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ
・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ）を加えたアガロースゲルを使用した。（「プラー
ク検定」の詳細な記述はＬｉｆｅ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇが頒布している昆
虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための利用者用
案内書の９〜１０頁に見出すことができる）。

【００７０】ウイルスの系統的希釈物を細胞に添加して
４日後、青色に染まったプラークをエッペンドルフピペ
ットのチップで釣上げた。組換えウイルスを含む寒天を
次にＧｒａｃｅ培地２００μＬを入れたエッペンドルフ
管中に再懸濁した。簡単に遠心分離して寒天を除き、組
換えバキュロウイルスを含む上清液を用いて３５ｍｍ皿
に塗布したＳｆ９細胞に感染させた。４日後にこれらの
培養皿の上清液を収集し、次に４℃で貯蔵した。

【００７１】Ｓｆ９細胞を１０％熱不活化ＦＢＳ添加Ｇ
ｒａｃｅ培地中に生育させた。細胞を組換えバキュロウ
イルスＶ−ＤＲ３−Ｖ１に感染多重度（「ＭＯＩ」）２
で感染させた。６時間後、培地を除き、メチオニンおよ
びシステイン不含のＳＦ９００ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ・Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）に交換した。４２時間後、^３５Ｓ−メチオニン５μ
Ｃｉおよび^３５Ｓ−システイン５μＣｉ（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ社）を添加した。細胞をさらに１６時間インキュベ
ーションした後、遠心分離して収集し、標識した蛋白質
をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによ
って可視化した。

【００７２】実施例３ ＣＯＳ細胞中での組換えｈＩＭＰ−Ｈ１の発現 プラスミドｈＩＭＰ−Ｈ１の発現を１）ＳＶ４０複製開
始点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸菌複製開
始点、４）ＣＭＶプロモーターに続いてポリリンカー領
域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を含
むベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ社）から誘導した。完全ｈＩＭＰ−Ｈ１前駆体をコー
ドするＤＮＡ断片および枠内でその３’−末端に融合さ
せたＨＡタグをベクターのポリリンカー領域にクローニ
ングしたので、組換え蛋白質の発現はＣＭＶプロモータ
ーの支配下にある。ＨＡタグは既報（Ｉ．Ｗｉｌｓｏ
ｎ，Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈ
ｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．ＣｏｎｎｏｌｌｙおよびＲ．Ｌｅ
ｒｎｅｒ、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁（１９８４
年））のようにインフルエンザ赤血球凝集素から誘導し
たエピトープに対応する。標的蛋白質へのＨＡタグの注
入でＨＡエピトープを認識する抗体で組換え蛋白質が容
易に検出できる。

【００７３】プラスミドの構築方針は次の通り：ｈＩＭ
Ｐ−Ｈ１、ＡＴＣＣ７５７５３をコードするＤＮＡ配列
はプライマー２個を使用してクローニングした原ＥＳＴ
にＰＣＲによって構築した。５’−プライマー：５’−
ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＡＣ
ＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧ−３’はＢａｍＨ１制限酵素部位
（第一の下線）および開始コドン（第二の下線）から始
まるｈＩＭＰ−Ｈ１の１８ヌクレオチドを含む。３’−
配列：ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴ
ＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＴＣＴＣＡＴ
ＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣはＸｂａＩ制限部位、翻訳終結コ
ドン、ＨＡタグおよびｈＩＭＰ−Ｈ１コード配列の最後
の１８ヌクレオチド（終結コドン不含）に対応する相補
的配列を含む。それ故、このＰＣＲ生成物はｈＩＭＰ−
Ｈ１コード配列に続いて枠内に融合するＨＡタグ、ＨＡ
タグに隣接する翻訳終結コドン、およびＢａｍＨ１およ
びＸｂａＩ部位を含む。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片お
よびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＢａｍＨ１および
ＸｂａＩ制限酵素で消化して連結した。連結混合物で大
腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ・Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔｈ・Ｔｏ
ｒｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、ラホヤ、ＣＡ、９２
０３７から入手できる）を形質転換した。形質転換した
培養物をアンピシリン培地プレート上に塗布し、耐性コ
ロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から
分離し、正しい断片の存在を制限分析によって検査し
た。組換えｈＩＭＰ−Ｈ１の発現のためにＤＥＡＥ−Ｄ
ＥＸＴＲＡＮ法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：
実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ
・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社
（１９８９年））によってＣＯＳ細胞に発現ベクターを
遺伝子移入した。ｈＩＭＰ−Ｈ１・ＨＡ蛋白質の発現は
放射能標識および免疫沈降法（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．
Ｌａｎｅ、「抗体：実験室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃ
ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社（１９８８年））によって検出し
た。遺伝子移入の２日後に細胞を^３５Ｓ−システインで
８時間標識した。次に培養培地を集め、細胞を界面活性
剤（ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ
−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％Ｄ
ＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）（Ｗｉｌｓｏ
ｎ，Ｉ．など、前出、３７巻：７６７頁、１９８４年）
で溶解した。菌溶解物および培養培地をＨＡ特異的モノ
クローナル抗体で沈降した。沈殿した蛋白質を１５％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。

【００７４】実施例４ ヒトの組織中でのｈＩＭＰ−Ｈ１の発現パターン ノーザンブロット分析を実施してヒトの組織中における
ｈＩＭＰ−Ｈ１の発現レベルを検査した。細胞の全ＲＮ
Ａ試料をＲＮＡｚｏｌ（商標）システム（Ｂｉｏｔｅｃ
ｘ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔ
ｈ・Ｌｏｏｐ・Ｅａｓｔ、ヒューストン、ＴＸ、７７０
３３）で分離した。特定のヒトの組織から分離した全Ｒ
ＮＡ約１０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイ
ロンフィルター上に吸収転移した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、
Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒ
ｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｐｒｅｓｓ社（１９８９
年））。標識反応はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ・Ｐｒｉｍｅ
−Ｉｔキットに従ってＤＮＡ断片５０ｎｇで行った。標
識されたＤＮＡをＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラム（５Ｐ
ｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ社、５６０３、Ａｒａｐａｈｏ
ｅ・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）で
精製した。次にフィルターを１，０００，０００ｃｐｍ
／ｍＬの放射能標識全長ｈＩＭＰ−Ｈ１遺伝子と０．５
Ｍ−ＮａＰＯ４、ｐＨ７．４および７％ＳＤＳ中、一夜
６５℃でハイブリッド形成させた。室温で２回洗浄し、
２回０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと６０℃で洗浄し
た後、−７０℃で一夜フィルターを補力焦点板で露出し
た。ｈＩＭＰ−Ｈ１のメッセージＲＮＡは数種の組織中
で豊富であった（図４）。前記教示に照らして本発明に
は多数の修飾および変化が可能であり、それ故、添付す
る請求項の範囲内にある。本発明では特定的に記載した
ものと異なる実施をすることもある。

【００７５】

【配列表】配 列 表 (１) 一般的情報： (i) 出願人：マイスナー等 (ii) 発明の名称： ヒトのイノシトールモノホスファ
ターゼＨ１ (iii) 配列の数： ３ (iv) 連絡先： (Ａ) 宛名：カレーラ，バーン，ベイン，ギルフィラ
ン，セッチ，スチュワート・アンド・オルステイン (Ｂ) 通り：ベッカー・ファーム・ロード６番 (Ｃ) 市：ローズランド (Ｄ) 州：ニュー・ジャージー (Ｅ) 国：アメリカ合衆国 (Ｆ) ＺＩＰ：０７０６８ (v) コンピューター解読書式： (Ａ) 媒体型：３．５インチ ディスケット (Ｂ) コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ／２適合 (Ｃ) オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ (Ｄ) ソフトウエア：ワード・パーフェクト５．１ (vi) 本出願のデータ： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日：同日 (Ｃ) 分類： (vii) 優先権主張出願のデータ： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日： (viii) 弁理士／代理人 情報： (Ａ) 氏名：フェラーロ，グレゴリー・ディー (Ｂ) 登録番号：３６，１３４ (Ｃ) 参照／整理番号：３２５８００−１２７ (ix) 電話連絡先情報： (Ａ) 電話番号：２０２−９９４−１７００ (Ｂ) ファックス番号：２０２−９９４−１７４４ (２) 配列番号１の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１３１３塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：cＤＮＡ (xi) 配列：配列番号１：

【表１】 (２) 配列番号２の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：７９８塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：cＤＮＡ (xi) 配列：配列番号２：

【表２】 (２) 配列番号３の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２６５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｃ) 鎖の数： (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列：配列番号３：

【表３】

【００７６】下記の図面は本発明の態様を例示するもの
であって、請求項が描出するような本発明の範囲を限定
することを意図しているものではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａである。図１はｃＤＮＡ配列および成
熟型ｈＩＭＰ−Ｈ１の演繹した対応アミノ酸配列を開示
する。アミノ酸ＤＰＩＤＧＴはＩＭＰ酵素の活性部位に
おいて必須であることが証明されており、太字および下
線で示してある。

【図２】 図１Ｂである。図１Aの続きである。

【図３】 図１Ｃである。図１Ｂの続きである。

【図４】 図２Ａである。図２はｈＩＭＰ−Ｈ１ｃＤＮ
Ａの完全ヌクレオチド配列を示す。ｃＤＮＡをクローニ
ングするために使用した合成ＢａｍＨ１（位置１）およ
びＸｈｏＩリンカー（位置１３０８）は下線で示す。

【図５】 図２Ｂである。図２Ａの続きである。

【図６】 図３はｈＩＭＰ−Ｈ１とｈＩＭＰとの間のア
ミノ酸の比較である。四角の枠で囲んだ領域は同一なア
ミノ酸を示す。

【図７】 図４はｈＩＭＰ−Ｈ１のノーザンブロット分
析である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 25/24 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 25/24 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ０７Ｋ 16/40 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ０７Ｋ 16/40 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ポール・エス・マイスナー アメリカ合衆国20838メリーランド州バー ンズビル、ピー・オー・ボックス306、バ ーンスビル・ロード18040番 (72)発明者 ジーニー・ディ・ゴカイン アメリカ合衆国20902メリーランド州シル バー・スプリング、ハーモン・ロード2715 番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA11 CA04 4B050 CC03 DD11 LL01 4C084 AA02 AA03 AA13 BA01 BA02 BA22 CA53 DC22 NA14 ZA122 4C085 AA13 AA14 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA12 4C087 AA01 AA02 BC83 NA14 ZA12 4H045 AA11 BA10 DA75

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）図１に示す演繹したアミノ酸配列
   を持つｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペプチドまたはこのポリペプ
   チドの断片、類縁体または誘導体をコードするポリヌク
   レオチド、 （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号７５７５３に含まれるｃＤＮＡ
   がコードするアミノ酸配列を持つｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペ
   プチドまたはこのポリペプチドの断片、類縁体または誘
   導体をコードするポリヌクレオチド、から構成される群
   から選択した分離されたポリヌクレオチドの、薬物の製
   造における使用。
2. 【請求項２】 （ｉ）図１に示す演繹されたアミノ酸配
   列を持つｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペプチドおよびその断片、
   類縁体および誘導体および（ｉｉ）ＡＴＣＣ寄託番号７
   ５７５３のｃＤＮＡがコードするｈＩＭＰ−Ｈ１ポリペ
   プチドおよびそのポリペプチドの断片、類縁体および誘
   導体から構成される群から選択したポリペプチドの、薬
   物の製造における使用。
3. 【請求項３】 薬物の製造における、請求項２に記載の
   ポリペプチドに対する抗体の使用。