CZ303693B6 - Glukuronyl-C5-epimeráza, DNA ji kódující a zpusob jejího pouzití - Google Patents

Abstract

Nová purifikovaná mysí C5-epimeráza, její fragmenty, nukleové kyseliny ji kódující a její rekombinantní príprava. Fragmenty takové epimerázy, zejména pak N-koncové fragmenty, které jsou pouzitelné v konstruktech fúzního proteinu ke zvýsení rekombinantne-produkovaných heterologních epimeráz.

Description

Předložený vynález se týká rekombinantních proteinů, zejména pak glukuronyl-C5-epimeráz a jejich použití pro modifikaci glukosaminglykanů.

Dosavadní stav techniky

Glukuronyl-C5 epimeráza (dále „C5-epimeráza“) katalyzuje přeměnu D-glukuronové kyseliny (GlcA) na L-iduronovou kyselinu (IdoA) v druhém kroku modifikace polymeru při heparinové/heparinsulfátové (HS) syntéze. Epimeráza podílející se na heparinové/HS syntéze bezpodmí15 nečně vyžaduje Λ'-sulíát na neredukující straně cílové HexA, jejíž tvorba je katalyzována Ndeacetylázou-jV-sulfotransferázou (NDST) v prvním (předcházejícím) kroku biosyntetické modifikace polymeru. Epimeráza je také inhibována O-sulfátovými skupinami blízko svého místa účinku, a to tak, že pozdější O-sulfatační kroky při biosyntetické dráze heparinu inhibují epimerizaci nebo zpětnou epimerizaci. Reakce zahrnuje reverzibilní odejmutí a readici protonu v poloze C5 cílové hexuronové kyseliny přes karbanionový meziprodukt a předpokládá se, že na tomto mechanizmu se podílejí dvě polyprotické základní aminokyseliny (zejména Lys).

C5-epimeráza, stejně tak jako další enzymy podílející se na heparinové/HS biosyntéze je vázána k membráně nebo asociována s Golgiho aparátem. Rozpuštěná epimeráza katalyzuje obě (rever25 zibilní) reakce, ale zpětná epimerizace nebyla u mikrosomálních frakcí delegována. Aktivní protein C5-epimerázy byl nejdříve purifikován a charakterizován z jater (Campbell et al., J. Biol. Chem. 269:26953 až 26958 (1994)).

Campbell, P. et al. publikovali purifikaci £>-glukuronyl-C5-epimerázy z hovězích jater (Camp30 bell et al., J. Biol. Chem. 269:26953 až 26958 (1994)) a dále bylo publikováno několik DNAsekvencí. I když předpokládaná velikost hovězí C5-epimerázy z genomové sekvence a cDNAsekvencí je 70,1 KD (618 aminokyselin) (viz níže), nejlépe purifikovaný nativní preparát extrahovaný shora uvedeným způsobem měl převážně 52 a 20 kDa, což znamená, že může docházet k proteolytickému štěpení (úpravě). Detegováním aktivity frakcí o větších mol. hmotnostech (200 kDa) při gelové chromatografií se ukázalo, že by mohlo docházet k agregaci nebo oligomerizaci. Enzym je aktivní v širokém rozmezí pH (6,5 až 7,5), přičemž optimum je 7,4. Enzym nevyžaduje ion kovu nebo jiný kofaktor. Podle kinetických studií se vzrůstající koncentrací enzymu vzrůstá hodnota K_m, což pravděpodobně souvisí s polymerním substrátem a prostorovou bariérou, a/nebo oligomerizaci molekul epimerázy.

Nedávno Lindahl U. a Li, J-P., W098/480006, purifikovali 52 kDa C5-epimerázu z hovězích jater a získali částečnou aminokyselinovou sekvenci. Primery byly připraveny oproti vnitřní sekvenci a používány k amplifikaci sekvence z cDNA-preparátu z hovězích jater. Sekvence z hovězích jater sloužila ke screeningu hovězí plicní knihovny cDNA. Byla nalezena sekvence mající otevřený čtecí rámec z 444 aminokyselin, která odpovídala polypeptidu o 49,9 kDa. Bylo konstatováno, že enzym dříve izolovaný z hovězích jater, byl zkrácenou verzí nativního proteinu. Byla analyzována celková RNA mastocytomu z hovězích jater a plic a myšího mastocytomu hybridizací s cDNA-klonem hovězí plicní epimerázy. S RNA z hovězích plic i jater bylo dosaženo stejných výsledků, přičemž dominantní transkript měl pás 9kb a slabý pás 6 kb. RNA z myšího mastocytomu měla pouze transkript při 5 kb.

V publikaci Li et al. J. Biol. Chem. 272: 28158 až 28163 (1997) bylo také zmíněno klonování cDNA kódující hovězí plicní C5-epimerázu. Li et al. klonovali a exprimovali hovězí plicní epimerázu v systému bakulovirus/hmyzí buňky, čímž se poprvé určila aktivita klonované (rekombi55 nantní) sekvence. Aktivní rekombinantní protein nebyl ke konečnému určení purifikován.

- 1 CZ 303693 B6

Byly publikovány cDNA- sekvence C5—epimerázy z Drosophila (GenBank Accession Number AAF57373), C. elegans (GenBank Accession Number P46555) a Methanococcus (GenBank Accession Number U67555).

Enzymatická aktivita rekombinantní hovězí epimerázy publikovaná Lindahlem et al. byla relativně nízká. Nicméně pokusy exprimovat hovězí plicní C5-epimerázu, což je jediná klonovaná savčí epimeráza, v systémech, ve kterých by byla možná lepší produkce, selhaly. Byly učiněny pokusy o expresi v savčích buňkách, Saccharomyces cerevisiae a E. coli. Do dneška nebyla pub10 li kována žádná úspěšná produkce rozpustné, aktivní C5-epÍmerázy. Tudíž nebylo možné rozšířit výsledky dosažené s prvotním systémem bakulovirus/hmyzí buňky na další rekombinantní systémy nebo nebylo možné použít standardní metody exprese, např. savčí, kvasinkové nebo bakteriální systémy, pro expresi tohoto enzymu.

Tudíž zde existuje potřeba pro vysoce aktivní C5-epimeráze a způsobech její přípravy ve větších množství.

Podstata vynálezu

Kvůli problémům při expresi rekombinantních epimeráz savčího původu a díky potřebě mít použitelný způsob exprese a produkce použitelných množství C5-epimerázy, zaměřili se vynálezci na výzkum způsobů produkce rekombinantní C5-epimerázy. Studie vyvrcholily objevem nového myšího genu a jím kódovaného myšího C5-epimerázového proteinu. C5—epimeráza podle před25 loženého vynálezu je kromě jiného unikátní tím, že v porovnání se sekvencí CS cpimerázového proteinu podle dosavadní techniky obsahuje další sekvence na svém N-konci. Bylo překvapivě zjištěno, že fúze N-koncového fragmentu z myší C5—epimerázy, nebo její zkrácené verze, sN— koncem jiných C5-epimeráz velmi zvyšuje aktivitu této vzniklé rekombinantní C5-epimerázy o několik řádů. Tudíž prodloužení o myší N-koncový fragment může být používáno k usnadnění exprese sekvencí, které jsou k němu proveditelně připojené, a zejména pak k expresi nativních (z myších jater) a heterologních (nemyších i myších nehepatických) forem C5-epimeráz v rekombinantních systémech.

V prvním provedení se předložený vynález týká puntíkovaných a/nebo izolovaných polynukleo35 tidů kódujících myší jatemí C5-epimerázu a rekombinantních vektorů a hostitelů pro jejich přechovávání a expresi.

V dalším provedení se předložený vynález týká purifíkovaného a/nebo izolovaného C5-epimerázového proteinu z myších jater kódovaného takovými polynukleotidy, nebo preparátů ho obsahu40 jících.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobů produkce myší C5-epímerázy pomocí polynukleotidů a rekombinantních vektorů a hostitelů podle předloženého vynálezu za účelem její exprese.

V dalším pí o vedení nc předložený vynález týká polynukleotidů, zejména purifí kovaných a/nebo izolovaných polynukleotidů, kódujících fúzní protein, kde takový fúzní protein obsahující Nkoncovou sekvenci myší C5—epimerázy je v rámci proveditelně připojen k aminokyselinové sekvenci požadovaného proteinu, a zejména pak sekvenci heterologní C5-epimerázy, a vektorů a hostitelů pro přechovávání a expresi takových polynukleotidů.

V dalším provedení se předložený vynález týká puntíkovaného a/nebo izolovaného C5-epimerázového fúzního proteinu kódovaného takovými polynukleotidy.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobů produkce požadovaného proteinu pomocí proveditelného připojení polynukleotidu, který kóduje myší C5-epimerázu, nebo její N-koncovou sekvenci, k polynukleotidu, který kóduje požadovaný protein, a jeho expresi v rekombinantním hostiteli podle předloženého vynálezu.

V dalším provedení se předložený vynález týká póly nukleotidových sekvencí a vektorů, které poskytují polynukleotidy kódující polynukleotidovou sekvenci N-koncového fragmentu myší C5 epimcrázy, např. polynukleotidy a vektory mající požadovaná restrikční místa na 3'-konci fragmentu pro inzerci (připojení) požadované sekvence do těchto míst, zejména pak sekvence, io která kóduje požadovaný protein, a nej výhodněji další epimerázovou sekvenci.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobů použití N-koncové sekvence z myší C5-epimerázy pro expresi nativních a heterologních sekvencí k ní připojených.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1. DNA-sekvence fúzního proteinu majícího sekvenci hovězí C5-epimerázy (netučně) a N-konce myší C5-epimerázy (tučně). Otevřený čtecí rámec (ORF) ukazující sekvenci, která kóduje polypeptid, je podtržen.

Obrázek 2. Kompletní DNA-sekvence myší C5-epimerázy.

Obrázek 3. Kompletní aminokyselinová sekvence myší C5-epimerázy.

Obrázek 4. Srovnávací analýza myší C5-epimerázy s dalšími sekvencemi ukazující oblasti homologie. Skóre jsou uvedena nahoře a ve sloupci následujícím po původu sekvence. Sekvence mají následující původ: řádek 2: myší játra; řádek 3: hovězí plíce; řádek 4: lidská EST; řádek 5: Drosvphikr, řádek 6: C. elegans; řádek 7: Methanococcus.

Obrázek 5. Grafické znázornění struktury domény myší C5-epimerázy. Plný obdélník na Nkonci: signální sekvence (vysoce hydrofobní transmembránová (TM) sekvence); šrafované obdélníky: hydrofobní transmembrána (TM) nebo skryté sekvence; plné obdélníky v peptidú: konzervované peptidové sekvence mající více než 50% podobnost s 71,9 KD hypotetickým pro35 teinem z C. elegans.

Obrázek 6A-6B. Obrázek 6A: Grafické znázornění produktů značených konstruktů rekombinantní (hovězích) C5-epimerázy. i: první aktivní značený rekombinantní (hovězí) konstrukt. Specifická aktivita byla 5 x 10⁵ cpm/mg/h). ii: nejaktivnější rekombinantní (kompletně myší) C5 konstrukt. Specifická aktivita byla 2x10⁹ cpm/mg/h. iii: chimérický konstrukt mající myší i hovězí sekvence. Aktivita byla 87 % aktivity kompletní myší sekvence, i v: zkrácený myší konstrukt. Aktivita je stejná jako hovězí konstrukt v bodě „i“. Obrázek 6B: Informace o sekvenci a doméně značky, která předchází každému z rekombinantních konstruktů na obrázku 6A.

Obrázek 7. Výsledky z testů aktivity mší C5-epirnerázy (mC5).

Obrázek 8. Western blotting s anti-FLAG. Řádek 1: standardy molekulových hmotností (New England Biolab's Broad Range, předem značené). Řádek 2: vzorek myší C5-epimerázy (mC5).

Obrázek 9. Western blotting s proteiny v médiu z klonů linií stálých hmyzích buněk obsahující různě značené rekombinantní C5-epimerázy odbarvené protilátkou proti anti-FLAG.

-3 CZ 303693 Β6

Podrobný popis výhodných provedení

Byl klonován gen z myších jater kódující C5-epimerázu. Nukleotidová sekvence je uvedena na obrázku 2. Bylo zjištěno, že aminokyselinová sekvence C5-epimerázového proteinu z myších jater má 618 aminokyselin (obrázek 3), molekulovou hmotnost 71180,1 daltonů (81,18 kDa), Myší C5-epimeráza má izoelektrický bod 8,25 a výsledný náboj při pH 7 +4,01.

Aminokyselinová sekvence z C5-epimerázové sekvence z myších jater je bez jakékoliv N-koncové extenze homologní (>96% shoda aminokyselin) se sekvencí z hovězí C5~epimerázy. Nicméně sekvenční analýza odhalila, že N-konec enzymu, který je kódován myší genomickou sekvencí obsahoval dalších 154 aminokyselin (aa), jenž scházeli u klonované hovězí sekvence.

Myší kódující sekvence vykazovala > 95 % shoda peptidů s odpovídajícími hovězími a lidskými (exprimovaná sekvenční značka z mozkové cDNA—knihovny) sekvencemi, >50% podobnost s hypotetickým 71,9 kDa proteinem zexprimované sekvence C.elegans a 38% podobnost s proteinem z exprimované sekvence z Methanococcus sp.

Předpokládaná transmembránová topologie (grafické znázornění hydrofobicity) myší C5-epimerázy se podobá NDST. Tato a další pozorování (např. rychlost syntézy heparinu) ukazovaly, že C5-epimeráza a další enzymy he pari nové biosyntézy jsou pravděpodobně spojeny v in vivo komplexu.

Rekombinantní myší C5-epimeráza, jak je exprimována a sekretována na signál z hmyzích buněk ze systému bakulovirus/hmyzí buňky, je nejstabilnější v médiu při teplotě 4 °C. Purifikace rekombinantní C5-epimerázy může zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, takové procesy jako katexovou a afinitní chromatografií. Rekombinantní protein může být zkonstruován např. takovým způsobem, aby obsahoval FLAG-značku nebo His-značku, jenž se vyskytuje také na konci rekombinantního proteinu. Jak jistě odborník v oboru v takových případech ocení, může být rekombinantní protein purifikován na komerčně dostupných pryskyřicích, které využívají například monoklonální protilátky anti-FLAG k zachycení rekombinantního proteinu obsahujícího FLAG-epitop.

Enzym se nejrychleji stanoví bifázickou extrakcí tritia uvolňovaného z C5-značeného substrátu do organického scintilačního koktajlu a změřením této aktivity, ačkoliv konečný výsledek, jak je popsáno v příkladech, je získán NMR analýzou konvertovaného produktu.

Nativní enzym z myších jater měl specifickou aktivitu 5 až 10 x 10⁹ cpm/mg/h, zatímco specifická aktivita rekombinantní formy myšího enzymu byla 2 x 10⁹ cpm/mg/h. Pro srovnání, rekombinantní hovězí enzym má specifickou aktivitu 0,5 až 1,0 x 10⁶ cpm/mg/h. Tudíž rekombinantní myší enzym je velmi aktivní C5-epimeráza.

Překvapivě bylo zjištěno, že 154 aminokyselinový N—konec myší C5-epimerázy, a zejména pak určité jeho fragmenty, má schopnost velmi ochotně zvyšovat enzymatickou aktivitu C5—epimerázy jiných C5- -epimeráz, pokud jsou kondenzovány v rámci s jejím N-koncem. Zdá se, že tento další 154 aminokyselinový fragment (aa) má alespoň tři charakteristické rysy, které jsou žádoucí pro rekombinantní expresi a sekrecí aktivní C5-epimerázy. První charakteristický rys zahrnuje sekvenci, která nejspíš funguje jako signální sekvence složená z prvních 33 až 34 zbytků (aminokyseliny 1 až 33 nebo 1 až 34 z obrázku 3). Druhý charakteristický rys spočívá v přítomnosti dalších cystěinových zbytků, které jsou odpovědné za tvorbu disulfidových můstků a stabilizaci sekundární struktury proteinu. Třetí charakteristický rys spočívá v místě amidace, které je shodné s místem použitelným k posttranslační proteolyrické úpravě.

Fragmenty z 154 aminokyselinové sekvence, které nemají signální sekvenci, si zachovávají schopnost zvyšovat aktivitu hetero logu ích epimeráz, zejména pak C5-epimeráz, ke kterým jsou proveditelně připojeny. Například, jak je uvedeno v příkladech, fúzní protein, který obsahoval

-4CZ 303693 B6 aminokyseliny 34 až 154 přímo připojené v rámci s N-koncem hovězí CS-epimerázy, zvyšoval aktivitu hovězí C5-epimerázy stonásobně.

Molekuly nukleové kyseliny

Předložený vynález se týká izolovaných molekul nukleové kyseliny sestávajících z:

(1) polynukleotidu kódujícího C5-epimerázový polypeptid z myších jater mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 3.

(2) polynukleotid kódující použitelné fragmenty C5-epimerázového polypeptidu z myších jater mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 3, kde tyto použitelné fragmenty, zahrnují, ale není to nikterak limitováno, (a) fragmenty, které poskytují signální sekvenci aminokyselin 1 až 33 nebo 1 až 34; (b) fragmenty, které poskytují mateřskou sekvenci C5-epimerázového proteinu z myších jater, a zejména pak aminokyseliny 33 až 618 nebo 34 až 618, a (c) fragmenty,které poskytují sekvenci N-koncového fragmentu stimulující aktivitu, která obsahuje aminokyseliny 1 až 154, a včetně jejich fragmentů např. aminokyseliny 33 až 154 nebo 34 až 154, které mají schopnost zvyšovat aktivitu jiných C5-epimeráz, ke kterým jsou proveditelně připojeny.

Není-ϋ uvedeno jinak, všechny uvedené nukleotidové sekvence stanovené sekvenováním molekuly DNA byly určeny podle způsobů popsaných v příkladech a dále všechny uvedené aminokyselinové sekvence polypeptidů kódovaných molekulami DNA byly predikovány translací shora určené DNA-sekvence. Kterákoliv nukleotidová sekvence může obsahovat chyby. Automaticky určené nukleotidové sekvence jsou typicky alespoň z 90 % shodné, typičtěji alespoň z 95 až 99,9 % shodné, se skutečnou nukleotidovou sekvenci sekvenované molekuly DNA. Skutečná sekvence může být určena přesněji jinými způsoby, včetně manuálních sekvenčních metod DNA, kteréjsou v oboru dobře známy. Dále se ví, že prostá inzerce nebo delece v určené nukleotidové sekvenci v porovnání se skutečnou sekvencí bude způsobovat posun čtecího rámce v translaci nukleotidové sekvence takovým způsobem, že předpokládaná aminokyselinová sekvence kódovaná určenou nukleotidovou sekvencí bude od místa této inzerce nebo delece zcela jiná než aminokyselinová sekvence skutečně kódovaná sekvenovanou molekulou DNA.

Termín „nukleotidová sekvence“ molekuly nukleové kyseliny nebo polynukleotidu zahrnuje molekulu DNA nebo polynukleotid, sekvenci deoxyribonukleotidů, molekulu RNA nebo polynukleotid, odpovídající sekvenci ribonukleotidů (A, G, C a U), kde každý thymidinový deoxyribonukleotid (T) ve specifikované deoxyribonukleotidové sekvenci je nahrazen uridinovým ribonukleotídem (U).

Podle informací uvedených v předloženém vynálezu, např. nukleotidová sekvence uvedená na obrázcích a dat ze sekvenční analýzy, může být molekula nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu kódující C5-epimerázový polypeptid, nebo jeho chimérický konstrukt získána standardními metodami klonování a screeningu, např. metodami pro klonování cDNA pomocí mRNA jako výchozího materiálu. Názorným příkladem předloženého vynálezu je molekula nukleové kyseliny C5-epimerázy popsaná na obrázcích 2 a 3, která byla objevena v cDNAknihovně získané z myší hepatické (jatemí) tkáně.

Určená nukleotidová sekvence DNA C5-epimerázy z obrázku 2 obsahuje otevřený čtecí rámec kódující protein o 618 aminokyselinových zbytcích, kde iniciační kodon v nukleotidové pozici 1 nukleotidových sekvencí je rovněž uveden na obrázku 2.

Jak jistě odborník v oboru ocení, díky možnosti sekvenčních chyb popisovaných výše, může být skutečný kompletní C5-epimerázový polypeptid kódovaný sekvencí z obrázku 2, který zahrnuje

618 aminokyselin uvedených na obrázku 3, někdy delší nebo kratší. Nicméně v každém případě, jak je uvedeno níže, poskytuje předložený vynález polypeptidy mající různé zbytky vynechané

-5CZ 303693 B6 zN-konce nebo C-konce kompletního polypeptidů, včetně polypeptidů postrádajících jednu nebo více aminokyselin zN-konce nebo C-konce zde popsané extracelulámí domény.

Molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu kódují signální sekvenci C5-epimerá5 zy uvedenou na obrázku 3, což jsou aminokyseliny 1 až 33 nebo aminokyseliny 1 až 34 z aminokyselinové sekvence uvedené na obrázku 3. Tyto molekuly mohou být proveditelně připojeny v rámci k jakékoliv požadované nukleotidová sekvenci, zejména pak molekuly, které kódují žádaný protein, jenž je třeba sekretovat z hostitele schopného sekrece takové signální sekvence C5-epimerázy.

Dále molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu kódují C5-epimerázovou sekvenci z myších jater „zvyšující heterologní aktivitu“, což jsou aminokyseliny 1 až 154, nebo alespoň 30 aminokyselin z nich, jenž jsou uvedeny na obrázku 3. Termín „heterologní“ nukleová kyselina, jak je známo odborníkům v oboru, znamená nukleovou kyselinou odvozenou od nukle15 ové kyseliny různých druhů. Výhodně takové molekuly nukleové kyseliny kódují aminokyseliny 1 až 154, 33 až 154 nebo 34 až 154 z obrázku 3, bez nebo s 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 aminokyselinami buď z jednoho, nebo obou konců. Nukleová kyselina kódující takový polypeptid může být proveditelně připojena v rámci ke kódující sekvenci pro další epimerázu, zejména pak další C5-epimerázy, s tím, že fúzní protein je kódován konstruktem nukleové kyseliny. Ve výhodném provedení jsou sekvence zvyšující heterologní aktivitu exprimovány na N-konci fúzního proteinu a jsou připojeny k N-konci dalšího proteinu, jehož aktivita je zvýšena přítomností myší sekvence, nejlépe nemyší C5~epimeráza nebo izozym myší C5-epimerázy.

Jak je uvedeno, mohou být molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu ve formě

RNA, např. mRNA, nebo ve formě DNA, včetně např. cDNA a genomické DNA získané klonováním nebo připravené synteticky. DNA může být dvouřetězcová nebo jednoretězcová. Jednořetězcová DNA nebo RNA může být kódující DNA-řetězec, také znám jako DNA-řetězec mající smysl, nebo může být nekódující DNA-řetězec, také označovaný jako kódující DNA-řetězec.

Termín „izolovaná“ molekula(y) nukleové kyseliny zahrnuje molekulu nukleové kyseliny, DNA nebo RNA, která byla odstraněna ze svého přirozeného prostředí. Pro účely předloženého vynálezu, jsou např. molekuly rekombinantní DNA obsažené ve vektoru izolovány. Další příklady izolovaných molekul DNA zahrnují molekuly rekombinantní DNA přechovávané v heterologních hostitelských buňkách nebo purifikované molekuly DNA (částečně nebo podstatně) v rozto35 ku. Izolované molekuly RNA zahrnují in vivo nebo in vitro RNA transkripty molekul DNA podle předloženého vynálezu. Izolované molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu dále zahrnují molekuly nukleové kyseliny připravené syntetickým způsobem.

Izolované molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu zahrnují molekuly DNA obsahující otevřený čtecí rámec (ORF), který kóduje C5-epimerázový protein nebo fúzní protein podle předloženého vynálezu. Molekuly DNA, které obsahují kódující sekvenci pro C5-epimerázový protein z obrázku 2, nebo její požadované fragmenty, a molekuly DNA, které v důsledku degenerace genetického kódu obsahují sekvence podstatně odlišné od sekvencí popsaných výše, stále kódují aminokyselinovou sekvenci C5-epimerázového proteinu z obrázku 3. Genetický kód jako takový je v oboru dobře znám. Tudíž by mělo být pro odborníka v oboru rutinou vytvořit takové degenerované varianty. V dalším provedení zahrnují molekuly nukleové kyseliny takové molekuly, které kódují shora popsaný C5-epimerázový polypeptid, ale postrádají N-koncový methionin, nebo signální sekvenci kódovanou aminokyselinami 1 až 33 nebo 1 až 34 z obrázku 3, nebo které mají kódující sekvence z různých (heterologních) signálních sekvencí na sebe prove50 ditelně připojené.

Předložený vynález dále poskytuje kromě shora popsaných molekul nukleové kyseliny, také molekuly nukleové kyseliny mající sekvence komplementární k výše uvedeným sekvencím. Tyto izolované molekuly, zejména molekuly DNA, jsou použitelné jako sondy pro genové mapování

-6CZ 303693 B6 in šitu hybridizaci s chromozomy a pro detekci exprese genu C5-epimerázy v různých species a tkáních, např. Northern blotting.

Předložený vynález se dále týká fragmentů izolovaných molekul zde popsané nukleové kyseliny, které si uchovávají požadované vlastnosti, nebo které kódují polypeptid, jenž si zachovává požadované vlastnosti nebo aktivitu. Termín „fragment“ izolované, shora popsané molekuly nukleové kyseliny zahrnuje fragmenty o délce alespoň 15 nukleotidů (nt), výhodněji alespoň 20 nt, ještě výhodněji alespoň 30 nt, a ještě výhodněji alespoň 40 nt, které jsou použitelné jako popsané diagnostické sondy a primery, nebo které poskytují požadovaný motiv nebo domény pro konstrukt fúzního proteinu. Samozřejmě, že větší fragmenty o velikosti 50 až 300 nt, nebo o 600 nt, jsou také podle předloženého vynálezu stejně tak použitelné jako fragmenty odpovídající většině fragmentům, pokud ne všem, z nukleotidové sekvence DNA uvedené na obrázku 2 nebo kódující aminokyselinové sekvence z obrázku 3. Termín fragment o velikosti alespoň 20 nt, pokud je srovnán např. s fragmentem z obrázku 2, zahrnuje fragmenty, které obsahují 20 nebo více za sebou jdoucích bází nukleotidové sekvence z nukleotidové sekvence uvedené na obrázku 2.

Zejména se předložený vynález týká polynukleotidů majících nukleotidovou sekvenci reprezentující část uvedenou na obrázku 2 nebo kódujících aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 3. Patří sem také polynukleotidy kódující C5-epimerázový polypeptid, postrádající amino-koncový meth ion in. Rovněž sem patří také polypeptidy kódované takovými polynukleotidy, např. polypeptidy, které obsahují aminokyselinovou sekvencí v polohách 2 až 618 aminokyselinové sekvence na obrázku 3, ale postrádají amino-koncový meth ion in.

V dalším aspektu poskytuje předložený vynález izolovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující polynukleotíd, který hybridizuje za striktních hybridizačních podmínek s částí poiynukleotidu nebo výhodně s celým polynukleotidem ve shora popsané molekule nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu. Částí se rozumí jakákoliv požadovaná část, např. polynukleotíd z obrázku 2, který kóduje aminokyseliny 1 až 154 nebo 33 až 154 nebo 34 až 154. Termín „striktní hybridizační podmínky zahrnuje inkubaci při teplotě 42 °C přes noc v roztoku obsahujícím 50% formamid, 5 x SSC (75é mM NaCl, 75 mM trojsodnou sůl citrátu), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtův roztok, 10% sulfát dextranu a 20 pg/ml denaturované, rozštěpené DNA lososího spermatu a následně promytí filtrů v 0,1 x SSC při teplotě 65 °C.

Termín polynukleotíd, který hybridizuje s „částí“ poiynukleotidu, zahrnuje polynukleotíd (buď DNA, nebo RNA), hybridizující alespoň s 15 nukleotidy (nt), výhodněji alespoň s 20 nt, ještě výhodněji s 30 nt, a ještě výhodněji s 30 až 70 (např. 50) nt referenčního poiynukleotidu. Tyto polynukleotidy jsou použitelné jako diagnostické sondy a primery, jak je uvedeno výše a v detailech i níže.

Termín část poiynukleotidu „o délce alespoň 20 nt“ zahrnuje např. 20 nebo více za sebou jdoucích nukleotidů z nukleotidové sekvence referenčního poiynukleotidu (např. nukleotidová sekvence z obrázku 2). Samozřejmě, že polynukleotíd, který hybridizuje pouze s poly(A)-sekvencí, nebo s komplementárním řetězcem T (nebo U) zbytků, by neměl být zahrnut do poiynukleotidu podle předloženého vynálezu používaného k hybridizaci s částí nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, poněvadž takový polynukleotíd by hybridizoval sjakoukoliv molekulou nukleové kyseliny obsahující poly(A)-řetězec nebo její kompiement (např. prakticky jakýkoliv klon dvouřetězcové cDNA).

Molekuly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, které kódují C5-epimerázový polypeptid, mohou zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, samotnou kódující sekvenci pro polypeptid (také označovanou jako mateřská C5—epimeráza, pokud postrádá sekreční signál); kódující sekvenci pro polypeptid a další sekvence, např. ty, které kódují vedoucí nebo sekreční sekvenci, např. preproteinová, proproteinová nebo preproproteinová sekvence; kódující sekvence polypeptidu, včetně nebo bez shora uvedených dalších kódujících sekvencí společně s dalšími nekódujícími sekvencemi, včetně například, ale není to nikterak limitováno, intronů a nekódujících 5'- a

-7CZ 303693 B6

3-sekvencí, např. transkribováné, nepřeložené sekvence, které mají určitou rolí při transkripci, posttranskripční úpravě - včetně sestřihu a polyadenylačních signálů, např. vazba na ribosomy a stabilita mRNA; další kódující sekvence, které kódují další aminokyseliny, např. ty, které poskytují další funkční možnosti. Například polypeptid může být tedy fúzován s markerovou sekvencí, např. peptidem, který usnadňuje purifikaci fúzovaného (markér obsahujícího) polypeptidu. V určitých výhodných provedeních tohoto aspektu předloženého vynálezu je markerovou sekvencí hexa-histidinový peptid, mimo jiné například značka v pQE vektoru (Qiagen, lne.), kde valná většina je komerčně dostupných. Například Gentz et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 821 až 824 (1989) popisuje hexa-histidiny jako vhodné pro purifikaci fúzního proteinu. Značka „HA“ je další peptid použitelný pro purifikaci, jenž odpovídá epitopu odvozenému od hemaglutininového proteinu chřipkového viru, který byl popsán Wilsonem et al., Cell 37: 767 až 778 (1984).

Varianty a mutantní polynukleotidy

Předložený vynález se dále týká jednotlivých variant molekul nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, které kódují, části analoga nebo deriváty C5-epimerázy. Jednotlivé varianty mohou být přirozené, např. přirozená alelická varianta. Termín „alelická varianta“ zahrnuje jednu z několika alternativních forem genu, který obsazuje daný lokus na chromozomu organizmu. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Přirozeně se nevyskytující varianty mohou být připraveny standardními technikami mutageneze.

Takové varianty vznikají substitucí, delecí nebo adicí nukleotidů. Substituce, delece nebo adice se mohou týkat jednoho nebo více nukleotidů. Varianty se mohou lišit v kódujících oblastech, nekódujících oblastech nebo v obou, Alterace v kódujících oblastech mohou vytvářet konzervované nebo nekonzervované aminokyselinové substituce, delece nebo adice. Z nich jsou zejména výhodné tiché substituce, adice a delece, které nemění vlastnosti a aktivitu C5 epimerázového polypeptidu a jeho části. Z tohoto pohledu jsou také velmi výhodné konzervované substituce.

Další provedení předloženého vynálezu zahrnují izolovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, kde jeho aminokyselinová sekvence je alespoň z 80 % shodná, výhodněji alespoň z 90, 95, 96, 97, 98 nebo 99 % shodná, s referenční aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající z: (a) aminokyselin 1 až 118 z obrázku 3; (b) aminokyselin 1 až 119 z obrázku 3; (c) aminokyselin 1 až 120 z obrázku 3; (d) aminokyselin 1 až 121 z obrázku 3; (e) aminokyselin 119 až 618 z obrázku 3; (f) aminokyselin 120 až 618 z obrázku 3; (g) aminokyselin 121 až 618 z obrázku 3; (h) aminokyselin 122 až 618 zobrázku 3; (i) aminokyselin 34 až 147 z obrázku 3; (j) aminokyselin 35 až 154 z obrázku 3; (k) aminokyselin 34 až 154 z obrázku 3; (1) aminokyselin 1 až 154 z obrázku 3; (m) kompletní aminokyselinové sekvence z obrázku 3.

Další provedení předloženého vynálezu zahrnují izolované molekuly nukleové kyseliny, které obsahují polynukleotid, který hybridizuje za přísných hybridizačních podmínek s polynukleotidem v bodě (a) (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1), (m), (n), výše. Tento hybridízující polynukleotid nehybridizuje za přísných hybridizačních podmínek s polynukleotidem majícím nukleotidovou sekvenci skládající se pouze z A-zbytků nebo pouze z T-zbytků.

Termín polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci např. alespoň z 95 % „shodnou“ s referenční nukleotidovou sekvencí kódující C5-epimerázový polypeptid zahrnuje nukleotidovou sekvenci polynukleotidu, která je shodná s referenční sekvencí s výjimkou toho, že polynukleotidová sekvence může zahrnovat až pět bodových mutací na každých 100 nukleotidů referenční nukleotidové sekvence kódující C5-epimerázový polypeptid. Jinými slovy získat polynukleotid mající nukleotidovou sekvenci alespoň z 95 % shodnou s referenční nukleotidovou sekvencí znamená, že až 5 % nukleotidů v referenční sekvenci může být deletováno nebo substituováno jiným nukleotidem, nebo že až 5 % nukleotidů z celkových nukleotidů v referenční sekvenci může být vpraveno do této referenční sekvence. Tyto mutace referenční sekvence se mohou

-8CZ 303693 Β6 vyskytovat na 5'- nebo 3'-koncových polohách referenční nukleotidové sekvence nebo kdekoliv mezi těmito koncovými polohami, rozptýlené buď individuálně mezi nukleotidy v referenční sekvenci, nebo v jedné nebo více za sebou jdoucích skupinách v referenční sekvenci.

Pokud kterákoliv konkrétní molekula nukleové kyseliny je alespoň z 90, 95, 96, 97, 98 nebo 99% shodná, může být např. nukleotidová sekvence uvedená na obrázku 2 standardně determinována pomocí známých počítačových programů, např. program Bestflt (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Program Bestfit využívá algoritmus lokální homologie podle Smithe a Watermana, Advances in Applied Mathematics 2: 482 až 489 (1981) k nalezení nejlepšího segmentu homologie mezi dvěma sekvencemi. Pokud se používá program Bestflt nebo jakýkoliv jiný program k určení např. 95% shody s referenční sekvencí podle předloženého vynálezu, jsou parametry samozřejmě nastaveny tak, aby procentuální shoda byla vypočtena z celkové délky referenční nukleotidové sekvence, a aby mezery v homologii byly přístupné až do 5 % z celkového počtu nukleotidů v referenční sekvenci.

Předložený vynález se týká molekul nukleové kyseliny, kteréjsou alespoň z 90, 95, 96, 97, 98 nebo 99 % shodné se sekvencí nukleové kyseliny uvedené na obrázku 2 bez ohledu na to, zda kódují polypeptid mající C5-epimerázovou aktivitu. To je proto, že pokud by konkrétní molekula nukleové kyseliny nekódovala polypeptid mající C5-epimerázovou aktivitu, odborník v oboru by měl vědět, jak ji využít, např. jako hybridizační sondu nebo jako primer pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Využití molekul nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, které nekódují polypeptid mající C5-epimerázovou aktivitu, zahrnuje mimo jiné: (i) izolaci genu C5epimerázy nebo jeho alelických variant v cDNA-knihovně; (2) in šitu hybridizace (např. „FISH“) k metafázi množení chromozomů za účelem získání přesné lokalizace genu C5-epimerázy, jak je popsáno v Verma et al., Human Chromozomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Presss, New York (1988); a Northern blotting za účelem detekce exprese mRNA C5-epímerázy ve specifických tkání.

Nicméně výhodné jsou molekuly nukleové kyseliny mající sekvence alespoň z 90, 95, 96, 97, 98 nebo 99 % shodné se sekvencí nukleové kyseliny na obrázku 2, která ve skutečnosti kóduje polypeptid mající C5-epimerázovou aktivitu. Termín „polypeptid mající C5-epimerázovou aktivitu“ zahrnuje polypeptidy vykazující aktivitu, která je podobná, ale ne nutně shodná, aktivitě C5 epimerázy podle předloženého vynálezu (buď celý protein, nebo výhodně identifikovaný aminokyselinový fragment obsahující aminokyseliny 33 až 618 nebo 34 až 618), změřenou v konkrétním biologickém testu.

V důsledku degenerace genetického kódu samozřejmě odborník v oboru okamžitě rozpozná, že větší počet molekul nukleové kyseliny majících sekvence alespoň z 80, 90, 95, 96, 97, 98 nebo 99 % shodné se sekvencí nukleové kyseliny vložené cDNA nebo sekvence nukleové kyseliny uvedené na obrázku 2 bude kódovat polypeptid „mající aktivitu C5-epimerázového proteinu“. Poněvadž ve skutečnosti všechny degenerované varianty těchto nukleotidových sekvencí kódují stejný polypeptid, cožje odborníkovi v oboru jasné i bez provedení výše popsaného srovnávacího testu. Dále je z dosavadních poznatků o molekulách nukleové kyseliny, které nejsou degenerovanými variantami, jasné, že přiměřené množství molekul bude kódovat polypeptid mající aktivitu C5-epimerázového proteinu. To je proto, že aminokyselinové substituce, které jsou buď málo pravděpodobné, nebo nepravděpodobné, výrazně neovlivňují funkci proteinu (např. nahrazení jedné alifatické aminokyseliny jinou alifatickou aminokyselinou), jakje dále vysvětleno.

Vektoiy a hostitelské buňky

Předložený vynález se také týká vektorů, které zahrnují izolované molekuly DNA podle předloženého vynálezu, hostitelských buněk, kteréjsou genově manipulovány s rekombinantními vektory podle předloženého vynálezu, a produkce C5-epimerázového polypeptidu nebo jeho fragmentů rekombinantními technikami.

-9CZ 303693 B6

Polynukleotidy mohou být spojeny s vektorem obsahujícím markér pro propagaci v hostiteli. Obecně plazmidový vektor je zaváděn v precípitátu, např. precipitát fosforečnanu vápenatého, nebo v komplexu s nabitým lipidem. Pokud je vektor virus, může být zapouzdřen in vitro pomocí vhodné zapouzdřovací buněčné linie a následně transdukován do hostitelských buněk.

DNA-inzert by měl být operativně připojen k vhodnému promotoru, např. fágový lambda PL promotor, E. coli lac, trp a tac promotory, SV40 časné a pozdní promotory a promotory retrovirové LTR. Další vhodné promotory jsou odborníkům v oboru jistě známy. Expresívní kon10 strukty budou dále obsahovat místa pro iniciaci transkripce, terminaci a v transkribované oblasti místo k navázání na ribosom pro translaci. Kódující část mateřských transkriptů exprimovaných konstrukty bude výhodně zahrnovat translaci iniciovanou na začátku a terminačním kodon (UAA, UGA nebo UAG) vhodně umístěný na konci polypeptidu, který má být přeložen.

Jak je uvedeno, expresívní vektory budou výhodně zahrnovat alespoň jeden volitelný markér. Tyto markéry zahrnují dihydrofolátreduktázu nebo nyomycin-rezistentní eukaryotické buněčné kultury a tetracyklin- a ampicilin- rezistentní geny nebo pro kultivaci v E. coli a dalších bakteriích. Reprezentativní příklady vhodných hostitelů zahrnují, ale není to nikterak limitováno, bakteriální buňky, např. E. coli, Corynebacterium, Streptomyces a Salmonella typhimurium; fungální buňky, např. Aspergillus, Aspergillus niger nebo Trichoderma, nebo kvasinkové buňky, např. Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae; hmyzí buňky, např. Drosophila S2 a Spodoptera sf9; zvířecí buňky, např. buňky CHO, COS a Bowesovy buňky melanomu; a rostlinné buňky. Preferovaní hostitelé zahrnují hmyzí buňky. Vhodná kultivační média a podmínky pro shora uvedené hostitelské buňky jsou v oboru známa.

Mezi výhodné vektory pro použití v bakteriích patří pQE70, pQE60 a pQE-9 ke koupi u Qiagen; pBS vektory, Phagescript vektory, Bluescript vektory, pNH8A, pNHlóa, pNH18A, pNH46A, ke koupi u Stratagene; a ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 ke koupi u Pharmacie. Mezi výhodné eukaryotické vektory patří pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl a pSG ke koupi u

Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG a pSVL ke koupi u Pharmacie. Virové vektory zahrnují, ale není to nikterak limitováno, retrovirové vektory, poxvirové vektory, včetně vakciniových a adenovirových vektorů. Další vhodné vektory budou odborníkovi v oboru jistě patrné.

Zavedení konstruktu do hostitelské buňky může být ovlivněno transfekcí fosforečnanem vápe35 natým, transfekcí zprostředkovanou DEAE-dextranem, transfekcí zprostředkovanou kationaktivním lipidem, elektroporací, transdukcí, infekcí nebo jinými metodami, které jsou popsány v mnoha standardních laboratorních manuálech, např. Davis et aí, Basic Methods In Molecular Biology (1986).

Polypeptídy a fragmenty

Předložený vynález dále poskytuje izolovaný nebo purifikovaný C5-epÍmerázový polypeptíd mající aminokyselinové sekvence kódované aminokyselinovými sekvencemi z obrázku 3 nebo peptid nebo polypeptíd obsahující část z polypeptidu výše, zejména pak shora popsaný a kódova45 ný shora popsanou molekulou nukleové kyseliny.

Předložený vynález dále poskytuje fúzní proteiny obsahující funkční část z N-konce myší C5epimerázy fúzovanou na svém C-konci s N-koncem požadovaného proteinu, např. signální sekvence aminokyselin 1 až 33 nebo 1 až 34 z obrázku 3 nebo sekvence aminokyselin 1 až 154, 33 až 154 nebo 34 až 154 z obrázku 3 zvyšující aktivitu. V rámci jednoho provedení je požadovaný protein fúzován s částí N-konce, která obsahuje 30 až 154 aminokyselin N-konce myší C5-epimerázy z obrázku 3, zejména pak aminokyselin 33 až 154 nebo 34 až 154. V rámci dalšího provedení je požadovaný protein fúzován s částí N-konce, který obsahuje zbytky 33 až 154 ze sekvence uvedené na obrázku 3. Ve velmi výhodném provedení je požadovaný protein fúzován

- 10 CZ 303693 B6 s funkční částí N-konce, která obsahuje sekreční signál aminokyselin 1 až 33 nebo 1 až 34 ze sekvence na obrázku 3.

Polypeptid může být exprimován v modifikované formě, např. fúzní protein, a může zahrnovat nejenom sekreční signály, ale také další heterologní funkční oblasti. Termín „heterologní^íl polypeptid, jak jistě odborník v oboru zná, zahrnuje polypeptid získaný z různých species. Například oblast s dodatečnými aminokyselinami, zejména nabité aminokyseliny, může být přidána k Nkonci polypeptidu za účelem zlepšení stability a perzistence v hostitelské buňce během purifikace nebo během následné manipulace a skladování. K usnadnění purifikace mohou být k polypeptidu io také přidány peptidové části. Před finální přípravou polypeptidu mohou být tyto oblasti odstraněny. Adice peptidových částí do polypeptidu k vyvolání sekrece nebo extrakce provedené mimo jiné kvůli zlepšení stability a usnadnění purifikace patří mezi známé a rutinní techniky v oboru.

C5-epimeráza nebo fúzní protein obsahující její fragment mohou být regenerovány a purifiko15 vány z rekombinantních buněčných kultur známými metodami, včetně precipitace síranem amonným nebo ethanolem, kyselou extrakcí, anexovou nebo katexovou chromatografíi, chromatografíi na fosfocelulóze, chromatografíi na reverzní fázy, afínitní chromatografíi, chromatografíi na hydroxyalapatitu a chromatografíi na lektinu.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu zahrnují přirozeně purifikované produkty, produkty chemické syntézy a produkty produkované rekombinantními technikami z prokaryotických nebo eukaryotických hostitelů, včetně např. bakteriálních, kvasinkových, hmyzích, savčích buněk a buněk vyšších rostlin. V závislosti na používaném hostiteli při rekombinantních technikách mohou být polypeptidy podle předloženého vynálezu glykosylované nebo neglykosylované.

Navíc mohou polypeptidy podle předloženého vynálezu také zahrnovat iniciální modifikovaný methioninový zbytek, v některých případech v důsledku procesů zprostředkovaných hostitelem. Polypeptid podle předloženého vynálezu může také zahrnovat modifikace histidinu nebo polyhistidinu přidaných ke konci kvůli procedurám při purifikaci proteinu.

3ϋ C5-epimerázové polynukleotidy a polypeptidy mohou být používány podle předloženého vynálezu k různým aplikacím, zejména k těm, které využívají chemických nebo biologických vlastností C5-epÍmerázy. Speciálně mohou být rekombinantní epímerázy podle předloženého vynálezu používány k produkci heparinu a/nebo heparin-sulfátu v průmyslovém měřítku, které mohou být účinné jako antikoagulans. Epímerázy podle předloženého vynálezu mohou být také použi35 telné při experimentální práci na studiu účinků molekul extracelulámí matrix, např. heparinu a heparin-sulfátu, na takových procesech jako je embryologie, angiogeneze a progrese nádoru. Enzym může například modulovat poměr zbytků D-glukuronové kyseliny/L-iduronové kyseliny v heparinu nebo heparin-sulfátu. Předpokládá se, že zbytky L-iduronové kyseliny díky svým výjimečným konformačním vlastnostem napomáhají interakcím polysacharidů s proteiny. Dále mohou být epímerázy podle předloženého vynálezu také používány k modifikaci cukrů využitelných v průmyslu, jenž mohou být používány jako stabilizátory nebo gelující aditiva v některých potravinách.

Varianty a mutantní polypeptidy

Genové inženýrství může být používáno ke zlepšení nebo změně charakteristických vlastností C5-epimerázového polypeptidu. Odborníkům v oboru jistě známá rekombinantní DNA-technologíe může být používána k vytvoření nových mutantních proteinů nebo „muteinů“, včetně jediné nebo mnohonásobné aminokyselinové substituce, delece, adice nebo fúzních proteinů. Takto modifikované polypeptidy mohou vykazovat např. zvýšenou aktivitu nebo zvýšenou stabilitu.

Navíc mohou být purifí kovány s vyššími výtěžky a vykazovat větší rozpustnost než odpovídající přirozený polypeptid alespoň za určitých purifikačních a skladovacích podmínek.

- 11 CZ 303693 B6

N-koncové a C-koncové deletované mutanty

U mnoha proteinů, včetně extracelulámí domény proteinu asociovaného s membránou nebo mateřské formy(em) sekretovaného proteinu, je z literatury známo, že jedna nebo více aminokyselin může být vynechána z N-konce nebo C-konce bez výrazné ztráty biologické funkce. Například Ron et al, J. Biol. Chem., 268: 2984 až 2988 (1993) publikoval modifikované KDF proteiny, které měly heparinovou vazebnou aktivitu jen za předpokladu, že chybělo 3, 8 nebo 27 amino-koncových aminokyselinových zbytků.

Nicméně, i kdyby delece jedné nebo více aminokyselin z N-konce proteinu vedla k modifikaci nebo ztrátě jedné nebo více biologických funkcí proteinu, další biologické aktivity proteinu budou zachovány. Tudíž schopnost zkráceného proteinu vyvolat a/nebo vázat se na protilátky, které rozpoznávají kompletní nebo část C5-epimerázového proteinu, bude obecně zachována za předpokladu, že menší než majoritní část zbytků kompletního proteinu nebo extracelulámí domény bude odstraněna z jeho(jejího) N-konce. Zdali si konkrétní polypeptid postrádající N-koncové zbytky kompletního proteinu udrží takové imunologické aktivity, lze stanovit rutinními metodami popsanými v předloženém vynálezu, které jsou jinak známy z literatury.

Předložený vynález dále poskytuje polypeptidy mající jeden nebo více zbytků vynechaných z amino-konce aminokyselinové sekvence uvedené na obrázku 3.

Nicméně, i kdyby delece jedné nebo více aminokyselin z C-konce proteinu vedla k modifikaci nebo ztrátě jedné nebo více biologických funkcí proteinu, další biologické aktivity proteinu budou zachovány. Tudíž schopnost zkráceného proteinu vyvolat a/nebo vázat se na protilátky, které rozpoznávají kompletní nebo mateřskou formu proteinu, bude obecně zachována za předpokladu, že menší než majoritní část zbytků kompletní nebo mateřské formy proteinu bude odstraněna z C-konce. Zdali si konkrétní polypeptid postrádající C-koncové zbytky kompletního proteinu udrží takové imunologické aktivity, lze stanovit rutinními metodami popsanými v předloženém vynálezu, které jsou jinak známy z literatury.

Předložený vynález také poskytuje polypeptidy mající jednu nebo více aminokyselin vynechaných z amino-konce i karboxy 1-konce.

Další mutanti

Kromě koncových delečních forem proteinu popsaného výše, jistě odborníci v oboru poznají, že některé aminokyselinové sekvence C5-epimerázového polypeptidu mohou být odlišné, aniž by došlo k signifikantnímu vlivu na strukturu nebo funkci proteinů. Pokud jsou takové rozdíly v sekvenci zamýšleny, mělo by být uvedeno, že existují kruciální oblasti proteinu, které determinují jeho aktivitu. Předložený vynález tudíž dále zahrnuje varianty C5-ep i me rázového polypeptidu, které vykazují podstatnou aktivitu C5-epimerázového polypeptidu, nebo které zahrnují oblasti C5-epimerázového proteinu, např. části proteinu uvedené níže. Takoví mutanti vznikají delecí, inzercí, inverzí, repeticí a substitucemi určitého typu. Podrobnosti o aminokyselinových změnách, které jsou pravděpodobně fenotypálně tiché, lze nalézt vBowie, J.U. et al., „Deciphereing the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions?‘ Science 247: 1306 až 13 10 (1990).

Tudíž fragment, derivát nebo analog polypeptidu z obrázku 3 nebo fúzní protein je obsahující může být: (i) ten, ve kterém jeden nebo více aminokyselinových zbytků je substituováno konzervovaným nebo nekonzervovaným aminokyselinovým zbytkem (výhodně konzervované aminokyselinové zbytky(tek), výhodněji alespoň jeden, ale méně než deset konzervovaných aminokyselinových zbytků) a tento substituovaný aminokyselinový zbytek(ky) může nebo nemusí být kódován genetickým kódem; nebo (ii) ten, ve kterém jeden nebo více aminokyselinových zbytků zahrnuje skupinu substituenta; nebo (iii) ten, ve kterém je mateřský nebo rozpustitelný extracelulární polypeptid fúzován s další sloučeninou, např. sloučenina, za účelem zvýšení poločasu

- 12CZ 303693 B6 polypeptidů (např. polyethylenglykol); nebo (iv) ten, ve kterém další aminokyseliny jsou fúzovány s vedoucí nebo sekreční sekvencí nebo sekvencí, která je používána k purifikaci mateřského polypeptidů, nebo s proproteinovou sekvencí. Určení takových fragmentů, derivátů a analog spadá do rozsahu odborných zkušeností vytvořených na základě tohoto textu.

Tudíž C5-epimeráza podle předloženého vynálezu může zahrnovat jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí, a to buď z přirozených mutací anebo lidskou manipulací. Jak je uvedeno, mají změny výhodně minoritní charakter, např. substituce konzervovaných aminokyselin, které výrazně neovlivňují funkčnost nebo aktivitu proteinu (viz tabulka 1).

io Tabulka 1

Substituce konzervovaných aminokyselin

Aromatické	Fenylalanin
	Tryptofan
	Tyrosin
Hydrofobní	Leucin
	Izoleucin
	Valin
Polární	Glutamin
	Asparagin
Bazické	Arginin
	Lysin
	Histidin
Kyselé	Aspartová kyselina
	Glutamové kyselina
Malé	Alanin
	Šeřin
	Threonin
	Methionin
	Glycin

Aminokyseliny v C5-epÍmerázovém proteinu podle předloženého vynálezu, kteréjsou esenciální pro funkci, mohou být identifikovány standardními metodami, např. místně cílená mutageneze nebo alanin-skenovací mutageneze (Cunningham and Wells, Science 244: 1081 až 1085 (1989)). Posledně zmíněný postup zavádí jednoduché alaninové mutace do každého zbytku v molekule.

Výsledné mutantní molekuly jsou pak testovány na biologickou aktivitu, např. vazba na receptor nebo in vitro proliferativní aktivita.

Mimořádný zájem je o substituce nabitých aminokyselin s dalšími nabitými aminokyselinami a s neutrálními nebo negativně nabitými aminokyselinami, což vede k proteinům s redukovaným

- 13 CZ 303693 B6 pozitivním nábojem, jenž mají zlepšené vlastnosti C5-epimerázového proteinu. Velmi žádoucí je prevence agregace. Agregace proteinů nevede jenom ke snížení aktivity, ale pokud se připravují farmaceutické formulace, může také být problematická v důsledku imunogenity. (Pinckard et al., Clin Exp. Immunol. 2: 331 až 340 (1967); Robbins et al, Diabetes 36: 838 až 845 (1987);

Cleland et al, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems IO: 307 až 377 (1993)).

Nahrazení aminokyselin může také změnit selektivitu vazby ligandu na receptory buněčného povrchu. Například Ostade et al, Nátuře 361: 266 až 268 (1993), popisuje určité mutace vyplývající ze selektivity vazby TNF-α na pouze jeden ze dvou známých typů TNF receptoru. Místa, io která jsou kruciální pro vazbu ligand-receptor mohou být také determinována strukturní analýzou, např. krystalizací, nukleární magnetickou rezonancí nebo fotoafínitním značením (Smith et al, J. Mol Biol 224: 899-904 (1992) a de Vos et al, Science 255: 306 až 312 (1992).

Polypeptidy podle předloženého vynálezu jsou výhodně v izolované formě. Termín „izolovaný polypeptid“ zahrnuje polypeptid odstraněný ze svého přirozeného prostředí. Pro účely předloženého vynálezu je polypeptid produkovaný a/nebo obsažený v rekombinantní hostitelské buňce izolován. Do termínu „izolovaný polypeptid“ rovněž patří polypeptidy, které byly purifíkovány, částečně nebo podstatně, z rekombinantních hostitelských buněk. Například rekombinantnč produkovaná verze C5-epimerázového polypeptidu může být podstatně purifikována jednokrokovou metodou popsanou v Smith and Johnson, Gene 67: 31 až 40 (1988). Výhodně je polypeptid podle předloženého vynálezu purifikován do takového stupně, který je dostatečný pro sekvenční analýzu, nebo který reprezentuje 99 % proteinového materiálu v preparátu.

Vynálezci objevili myší gen C5-epimerázy a C5-epimerázový protein a dále, že C5-epimerázo25 vý polypeptid je protein o 618 zbytcích vykazující N-koncovou 154 aminokyselinovou doménu, zejména pak 33 nebo 34 aminokyselinová doména obsahující aminokyseliny 1 až 33 nebo 1 až 34 podílející se na sekreci a stabilizaci aminokyselinových sekvencí, které jsou k ní připojené.

Tudíž tato doména nebo její funkční část je použitelná pro expresi a sekreci proteinů, např. C530 epimerázy, nebo kteréhokoliv jiného proteinu, zejména proteinu asociovaného s Golgiho aparátem, nebo jinak zapojeného do heparinové nebo heparin-sulfátové syntézy.

Vynálezci dále objevili, že N-konec myšího C5-epimerázového proteinu, zejména pak aminokyseliny 1 až 154, 33 až 154 nebo 34 až 154, jsou zejména použitelné ke zvýšení aktivity dalších enzymů, zvláště pak jiných C5-epimeráz. Tudíž tato doména nebo její funkční část je použitelná pro expresi a sekreci fúzních proteinů, které zahrnují C5-epimerázové sekvence, jenž jsou heterologní k sekvenci uvedené na obrázku 3, zejména pak k hovězí C5 -cpimcráze.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu zahrnují shora uvedený C5-epimerázový polypeptid a fragmenty, jejichž aminokyselinová sekvence je alespoň z 80 % shodná se sekvencí vybranou ze skupiny skládající z: (a) aminokyselin 1 až 118 z obrázku 3; (b) aminokyselin 1 až 119 z obrázku 3; (c) aminokyselin 1 až 120 z obrázku 3; (d) aminokyselin 1 až 121 z obrázku 3; (e) aminokyselin 119 až 618 z obrázku 3; (f) aminokyselin 120 až 618 z obrázku 3; (g) aminokyselin 121 až 618 zobrázku 3; (h) aminokyselin 122 až 618 z obrázku 3; (i) aminokyselin 34 až 147 zobrázku 3;

(j) aminokyselin 35 až 154 z obrázku 3; (k) aminokyselin 34 až 154 z obrázku 3; (1) aminokyselin i až i 54 z obrázku 3; (m) kompletní aminokyselinové sekvence z obrázku 3.

Předložený vynález zahrnuje polypeptidy, které jsou alespoň z 80 % shodné, výhodněji alespoň z 90 % nebo 95 %, ještě výhodněji z 96, 97, 98 nebo 99 %, shodné s výše popsaným polypeptidem, a také zahrnují části takového polypeptidu s alespoň 30 aminokyselinami, výhodněji s alespoň 50 aminokyselinami.

Polypeptidem majícím aminokyselinovou sekvenci např. alespoň z 95 % „shodnou“ s referenční aminokyselinovou sekvencí z C5--epimerázového polypeptidu je míněna aminokyselinová sek55 vence polypeptidu, která je shodná s referenční sekvencí s výjimkou toho, že polypeptidová sek-14 CZ 303693 B6 vence může zahrnovat až pět aminokyselinových alterací na každých 100 aminokyselin z referenční aminokyseliny C5-epimerázového polypeptidu. Jinými slovy získat polynukleotíd mající aminokyselinovou sekvenci alespoň z 95 % shodnou s referenční aminokyselinovou sekvencí znamená, že až 5 % aminokyselinových zbytků v referenční sekvenci může být deletováno nebo substituováno jinou aminokyselinou, nebo že až 5 % z celkových aminokyselinových zbytků v referenční sekvenci může být vpraveno do této referenční sekvence. Tyto a Iterace referenční sekvence se mohou vyskytovat na amino- nebo karboxy- koncových polohách referenční aminokyselinové sekvence nebo kdekoliv mezi těmito koncovými polohami, rozptýlené buď individuálně mezi zbytky v referenční sekvenci, nebo v jedné nebo více za sebou jdoucích skupinách ío v referenční sekvenci.

Pokud kterýkoliv konkrétní polypeptid je alespoň z 80, 90, 95, 96, 97, 98 nebo 99 % shodný, může být aminokyselinová sekvence uvedená na obrázku 3 standardně determinována pomocí známých počítačových programů, např. program Betsfit (Wisconsin Sequence analysis Package.

Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Pokud se používá program Bestfit nebo jakýkoliv jiný program k určení např. 95% shody s referenční sekvencí podle předloženého vynálezu, jsou parametry samozřejmě nastaveny tak, aby procentuální shoda byla vypočtena z celkové délky referenční aminokyselinové sekvence, a aby mezery v homologii byly přípustné až do 5 % z celkového počtu aminokyse20 línových zbytků v referenční sekvenci.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu, které mají C5-epimerázovou aktivitu, mohou být používány jako takové in vitro, např. při vyvíjení testů pro tyto polypeptidy nebo standardizačních testech pro použití s komplexnějšími systémy. Signální sekvence podle předloženého vyná25 lezu může být používána k sekreci homologního C5-epimerázového enzymu z eukaryotických rekombinantních hostitelů nebo k sekreci heterologních sekvencí, které jsou k ní proveditelně připojeny. Sekvence podle předloženého vynálezu zvyšující aktivitu může být používána ke zvýšení inherentní epimerázové aktivity rekombinantních preparátů z jiných C5-epimeráz a jako taková je nejlépe používána ve formě genu kódujícího fúzní protein pro tuto sekvenci.

Protilátky

Specifické protilátky proti C5-epimerázovému proteinu pro použití podle předloženého vynálezu mohou být získány expozicí vůči intaktním C5-epimerázovým proteinům nebo jejich antigenní35 mu peptidovému fragmentu, které mohou být přítomny společně s nosičovým proteinem, např. albumin, ve zvířecím systému (např. králík nebo myš), nebo pokud jsou dostatečně dlouhé (alespoň 25 aminokyselin) mohou být přítomny bez nosiče, nebo v lipozómech, nebo komplexovány s PEG ke zvýšení cirkulačního poločasu.

Termín „protilátka“ (Ab) nebo „monoklonální protilátka“ (Mab), jak je používán v předloženém vynálezu, zahrnuje intaktní molekuly i fragmenty protilátky (např. Fab a F(ab')₂ fragmenty), které jsou schopné specifické vazby na C5-epimerázový protein. Fab a F(ab')₂ fragmenty postrádají Fc fragment intaktní protilátky, odstupují rychleji z cirkulace a mohou mít menší nespecifickou tkáňovou vazbu intaktní protilátky (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316 až 325 (1983)). Tudíž prefe45 rovány jsou tyto fragmenty.

Protilátky podle předloženého vynálezu mohou být připraveny kterýmikoliv různými způsoby. Například buňky exprimující C5-epimerázový protein nebo jeho antigenní fragment mohou být podávány zvířecím subjektům za účelem vyvolání tvorby séra obsahujícího polyklonální proti lát50 ky. Ve výhodné způsobu je kvůli odstranění přirozených nečistot preparát C5-epimerázového proteinu purifikován. Takový preparát je pak zaveden do zvířete za účelem produkce polyklonálního anti séra s větší specifickou aktivitou.

V nej výhodnějším způsobu jsou protilátky podle předloženého vynálezu monoklonální protilátky.

Tyto monoklonální protilátky mohou být připraveny hybridomovou technologii (Kohler et al,

- 15CZ 303693 B6

Nátuře 256: 495 (1975); Kóhler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kóhler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., (1981) 563 až 681). Obecně tyto procedury zahrnují imunizaci zvířete (výhodně myši) antigenem C5-epimerázového proteinu, nebo výhodněji buňkami exprimující mi C5-epimerázový protein. Vhodné buňky mohou být rozpoznány podle své schopnosti vázat protilátku proti anti-C5-epimerázovému proteinu. Tyto buňky mohou být kultivovány v jakémkoliv vhodném tkáňovém kultivačním médiu, nicméně je výhodné kultivovat buňky v Earlem modifikovaném Eaglově médiu doplněném o 10% fetální hovězí sérum (ínaktivované při 56 °C) a doplněné 10 g/1 neesenciálních aminokyselin, 1000 U/ml penicilinu a 10 pg/ml streptomycinu. Splenocyty těchto myší jsou extrahovány a fúzovány s vhodnou myelomovou buněčnou linií. Podle předloženého vynálezu může být používána jakákoliv vhodná myelomová buněčná linie, nicméně je výhodné používat mateřskou myelomovou buněčnou linii (SP2O) dostupnou u American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Po fúzi jsou výsledné hybridní buňky selektivně udržovány v HAT médiu a následně klonovány limitovaným zředěním podle Wands et al., Gastroenterology 80: 225 až 232 (1981). Hybridní buňky připravené touto selekcí jsou pak testovány na identifikaci klonů, které secretují protilátky schopné vazby požadovaného C5-epimerázového antigenu.

Alternativně mohou být další protilátky schopné vazby na C5-epimerázový antigen produkovány dvoustupňovým procesem za použití anti-idiotypických protilátek. Tato metoda využívá faktu, že protilátky samotné jsou antigeny a tudíž je možné získat protilátku, která se váže na sekundární protilátku. Podle této metody jsou využívány specifické protilátky proti C5-epimerázovému proteinu k imunizaci zvířat, výhodně myší. Splenocyty těchto zvířat jsou pak používány k produkci hybridních buněk, u kterých je proveden sereening k identifikaci klonů, jenž produkují protilátku, jejíž schopnost vázat se na specifickou protilátku proti CS-epimerázovému proteinu může být blokována antigenem C5-epimerázového proteinu. Tyto protilátky obsahují antiidiotypické protilátky proti specifické protilátce proti C5-epimerázovému proteinu a mohou být používány k imunizaci zvířete za účelem vyvolání tvorby dalších specifických protilátek proti C5-epimerázovému proteinu.

Jistě bude oceněno, že Fab a F(ab^r)₂ a další fragmenty protilátek podle předloženého vynálezu mohou být používány podle metod v předloženém vynálezu. Tyto fragmenty jsou typicky produkovány proteolytickým štěpením enzymy, např. papain (produkuje Fag fragmenty) nebo pepsin (produkuje F(ab')₂ fragmenty). Jednořetězcové protilátky, např. lehký a těžký řetězec protilátky, jsou rovněž zahrnuty do předloženého vynálezu. Alternativně mohou být vazebné fragmenty C5epimerázového proteinu produkovány aplikací rekombinantní DNA-technologie nebo syntetickou chemií. Takové protilátky by měly zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, rekombinantní protilátky obsahující komplementaritu determinující oblasti (CDR), které mají rozdílné vazebné specificity nebo CDR, jenž byly modifikovány aplikací rekombinantní DNA-technologie nebo syntetickou chemií.

Pro in vivo použití anii-C5-epimerázy u lidí může být výhodné používat „humanizované“ chimérické monoklonální protilátky. Tyto protilátky mohou být produkovány genetickými konstrukty odvozenými od hybridních buněk produkujících monoklonální protilátky popsané výše. Metody produkce chimérických protilátek jsou dostupné z literatury. Viz například Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4; 214 (1986); Cabilly et al., Patent US 4 816 567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 870 2671; Boulianne et al., Nátuře 312: 643 (1984); Neuberger et al., Nátuře 314: 268(1985).

Bifunkční protilátky jsou protilátky, které mají antigen-vázající domény pro různé epitopy nebo odvozené od různých species, a spadají do předloženého vynálezu. Patří sem rovněž protilátky s Fc oblastmi odvozené od species lišících se od sebe Fab oblastmi. Tyto protilátky mohou být využívány při imunospecifických chromatografických technikách. Dále do předloženého vynálezu spadají protilátky s připojenou značkou, např. fluorescein, texaská červeň, rhodamin, peroxi- 16CZ 303693 B6 dáza, zlato, magnetické značky, alkalická fosfatáza, radioizotopy nebo chemiluminiscenční značky.

Nyní, když byl předložený vynález obecně popsán, bude dosavadní popis srozumitelnější díky 5 následujícím příkladům, které jsou pouze ilustrativní a nemají nikterak předložený vynález limitovat.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace a sekvenování myších genomických klonů

Byl proveden screening myší genomické knihovny (FIX II, Stratagene) pomocí DNA-sondy z hovězí sekvence kódující C5-epimerázu. Sonda byla značena [ct ]dCTP (NEN Life Science Products). Přibližně 2 x 10⁶ fágů bylo naneseno na destičku o rozměrech 20 x 20 cm a z každé destičky byly duplicitně připraveny nylonové filtry. Byl proveden velmi přísně řízený screening hybridizací v5x Denhardtech obsahujících 100 gg DNA lososího spermatu při teplotě 60 °C. Finální promývání bylo provedeno v 0,1 SSC (1 x SSC je 150 mM NaCl, 15 mM citrátu sodného, pH 7,0 obsahujícího 0,1% SDS). Plaky, které produkovaly pozitivní signály na obou replikacích byly vybrány pro druhý a třetí screening a nakonec bylo izolováno pět pozitivních klonů. Bylo zjištěno, že dva klony mají podobnou délku (asi 16 kb), zatímco ostatní tři byly relativně krátké, kolem 10 až 12 kb. Nejdelší klon (klon 64) byl štěpen Sací a restrikční fragmenty byly klonovány do pBlueScriptu. Druhý nejdelší klon (klon 5A) byl štěpen EcoRI a výsledné fragmenty byly klonovány do pUCl 19 pro další charakterizaci. Inzert obsahující plazmid byl purifikován pomocí plazmidového kitu QIAGEN a sekvenován. Nukleotidová sekvenční reakce byla provedena pomocí di-deoxy terminační metody a uskutečněna na sekvenceru ABI 310. Exony a introny byly stanoveny primerem postupujícím po obou řetězcích a velikost intronů byla stanovena sekvenování v kombinaci s elektroforézou na agarózovém gelu. Byly zjištěny pouze 3 exony kódující C5 -epirncrázu, kde nejdelší exon kódoval více než 50 % proteinu. Exon-intron spojení (místa sestřihu) přesně kopírují gt-ag konvenční pravidlo. Vynálezci věří, že na základě přítomnosti intronů a přesného párování mezi exony a cDNA—sekvencí reprezentuje identifikovaný genomic35 ký klon funkční gen C'5-cpimerázy.

Klonování myší C5-epimerázové cDNA

Byl určen jeden pár primerů a na základě nukleotidové sekvence získán sekvenováním exonů zgenomického klonu. Kódující primer odpovídal bp 1 až 26 z myší ORF, přičemž se vycházelo z iniciačního kodonu ATG. Nekódující primer odpovídal bp 1829 až 1854 bez terminaěního kodonu. PCR byla provedena pomocí QUICK-Clone™ cDNA (Clontech z myších jater jako templátu za následujících podmínek: 1 cyklus při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty, 30 cyklů každý při teplotě 94 °C po dobu 30 s, 60 °C po dobu 45 s a 72 °C po dobu 1 minuty a finální extenze při teplotě 72 °C po dobu 10 minut. Byl získán silný pás o přibližně 2 kb, který byl nakloňován do klonovacího vektoru TOPO™-TA (lnvitrogen) a amplifikován a následně sekvenován. Sekvenováním obou řetězců bylo zjištěno, že klon myší C5-epímerázy je 1875 bp dlouhý a má silně hydrofóbní doménu na N-konci odpovídajícího peptidů.

Northern blotting

Myší multítkáňový mRNA blot byl zakoupen u firmy Clontech. DNA-sonda z klonu hovězí cDNA byla značena [a³²P]dCTP pomocí Klenowova enzymu od firmy Boehringer Mannheim.

Hybridizace byla prováděna v ExpressHybu (Clontech) při teplotě 60 °C po dobu jedné hodiny a následně byla promývána za velmi přísných podmínek. Membrána byla vystavena Kodak filmu

- 17CZ 303693 B6 při teplotě -70 °C přes noc. Enzym C5-epimeráza byla exprimována ve všech zkoumaných tkáních a velikost transkriptů byla 5 kb. V játrech docházelo k nejvyšší expresi transkriptů, zatímco ve slezině byly pozorovány nižší hladiny vzhledem k β-aktinu ve stejném membráně.

Southern blotting

Southern blotting byl proveden podle Sambrooka et al. (Sambrook et al., 1989). Myší genomická DNA byla připravena pomocí kitu Easy Prep (Pharmacia Biotech). Genomická DNA (20 gg) byla štěpena restrikčním enzymem Sací a separována elektroforézou na 0,8% agarózovém gelu. io Po elektroforéze byl gel podroben 0,lN NaOH po dobu 30 minut a neutralizován Tris-HCl pufrem. DNA fragmenty byly převedeny do nylonové membrány. Fragment 837 bp z hovězí C5epimerázové cDNA byl značen [a³²P]dCTP pomocí Klenowa enzymu zakoupeného u Boehringer

Mannheim a používán jako sonda. Podmínky hybridizace byly stanoveny podle Northern blottingu. Doba expozice byla 3 dny.

K určení počtu genů, které mohou potenciálně kódovat C5-epimerázu, bylo 20 gg purifikované myší genomické DNA z myších jater štěpeno restrikčními enzymy Apal, resp. BamHI, EcoRI, EcoR, HindllI, Ncoll a Xbai, a separováno elektroforézou na 0,8% agarózovém gelu. DNA separovaná v gelu byla převedena na nylonovou membránu a následně hybridizována DNA-sondou z kódující hovězí sekvence (1407 bp). Restrikční mapa C5-epimerázové genomické DNA, ukazuje, že existuje pouze jeden gen kódující C5-epimerázu.

Analýza enzymové aktivity

Aktivita C5-epimerázy byla stanovena podle způsobu publikovaného Malmsromem et al., J. Biol. Chem. 255:3878 až 3883 (1980), zde je uveden jako odkaz. Myš s intramuskulámě transplantovanými buňkami mastocytomu byla usmrcena červikální dislokací a následně pitvána. Příslušné tkáně, včetně xenoimplantátu, byly odebrány a okamžitě homogenizovány v pufru 50 mM HEPES obsahujícího 100 mM KCl, 15 mM EDTA, 1% Triton X-10 a inhibitory proteázy.

Homogenáty byly třepány při teplotě 4 °C po dobu 30 minut a centrifugovány. Supematant byl odebrán. Celková koncentrace proteinu byla určena testem QuantiGold a specifická aktivita C5epimerázy byla analyzována na základě uvolňování ³H (regenerovaný jako ³H₂O) ze substrátového polysacharidů podle způsobu popsaného Li et al. (Li et al. 1997). C5-substrát používaný při stanovení specifické aktivity byl alespoň jednou měsíčně analyzován změřením pouze 50 μϊ C535 substrátového pracovního roztoku bez přítomnosti jakéhokoliv enzymu.

Pokud iniciální aktivita vzorku byla větší než 2000 cpm/50 μϊ, znamenalo to, že vzorek je nasycen a je třeba ho zředit. Faktory zředění závisely na použitých vzorcích, nasycení vzorků a na koncentraci soli. Vzorky nesmějí obsahovat více než 50 mM soli (NaCl nebo KCl), protože akti4o vita C5-epimerázy je částečně nebo zcela inhibována při vyšších koncentracích soli.

Pří stanovení aktivity C5-epimerázy byly používány pozitivní nebo negativní kontroly. Pozitivní kontrola by měla být standardizována každé dva měsíce kvůli udržení stability. Jako negativní kontrola může být používán pouze vektor produkovaný stejnými buňkami. Například byla jako negativní kontrola pro C5-vzorky produkované v expresí vním systému bakulo v irus/hmyzí buňky používána acetylcholinesteráza produkovaná stejným systémem.

Pokud bylo třeba, byly vzorky během temperace C5 substrátového roztoku zředěny. K temperovanému substrátu byl přidán 50μ! vzorek (enzym) a inkubován přesně po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Po inkubaci bylo ke směsi substrát-enzym přidáno 100 μΐ roztoku zastavujícího enzymovou reakci a tato reakční směs byla převedena do Wallaceho 20 ml scintilačních vialek.

Do vialek bylo přidáno 13 ml epimerázového testovacího scintilačního koktailu a vialky byly vortexovány po dobu 10 s. Po inkubaci přes noc byla radioaktivita měřena trojmo na přístroji

Wallac 1415 Liquid Scinti llatíon Counter každá po dobu 2 minut. Ze scintilačního počítače byly

- 18CZ 303693 B6 získány výsledky ve formě cpm/reakční objem (50 μΐ). Pokud byl vzorek zředěn měla by být aktivita ředicího pufru odečtena od aktivity vzorku. V každém případě byla před analýzou výsledků odečtena aktivita slepého pokusu od aktivity vzorku.

Specifická aktivita byla měřena dělením celkové aktivity (cpm/μΐ) celkovou koncentrací proteinu (mg/ml). Koncentrace celkového proteinu byla měřena testem QuantiGold podle Stoscheka, C. M., Anal. Biochem. 160: 301 až 305 (1987), zde je uvedeno jako odkaz. Jednotka specifické aktivity je cpm/mg/h, kde h (hodina) udává dobu enzymové reakce.

io

Příklad 2

Identifikace skutečného N-konce C5-epimerázy na základě analýzy kódující sekvence myšího genu a exprese klonované cDNA

Na základě klonování a předběžné sekvenční analýzy putativního myšího genu C5-epimerázy identifikovaného v příkladu 1 a podle již dříve publikované hovězí sekvence cDNA, byly izolovány další myší 5'-lemovací DNA-sekvence a cDNA byla klonována tak, aby obsahovala tuto 5'-lemovací DNA-sekvenci.

Kvůli stanovení, zda tato 5-lemovací DNA-sekvence může kódovat další N-koncové peptidové sekvence, které by mohly představovat skutečný N-konec C5-epimerázy kódované myším genem, byla myší sekvence (tučně v komprilované nukleotidové sekvenci uvedené na obrázku 1) přidána do hovězí cDNA-sekvence, která již byla v souboru, za použití hovězí sekvence a vychá25 zeje z bodu největší konzervace (>96% aminokyselinová shoda). K vyhledání otevřených čtecích rámců, což jsou potenciální sekvence kódující polypeptid v kompilované sekvenci, byl používán program Gene Inspector (Textco, USA). Výsledky ze sekvenční analýzy jsou uvedeny na obrázku 1 a výsledky z analýzy ORF jsou uvedeny na obrázku 2.

Na obrázku 1 je místo fúze mezi novou myší sekvencí a hovězí sekvencí označeno čtyřtečkou Sekvencí začínají po čtyřtečce je hovězí cDNA-sekvence. Sekvence (tučně) 5' k místu fúze je další shora popsaná, izolovaná myší 5'-lemovací DNA-sekvence izolovaná podle shora uvedeného způsobu. Podtržená sekvence je zjištěný otevřený čtecí rámec, ukazující polypeptidovou kódující sekvenci.

Je známo, že nativní C5-epimeráza je lokalizována v membránových Golgiho „kompartmentových“ (mikrozomální frakce“) buňkách (z jater). Proto by nativní myší sekvence měla obsahovat vhodný N-koncový signál pro translokaci do tohoto kompartmentu. Kjeho analýze byt používán algoritmus (program) Níelsena et al., Protein Engineering 10: 1 až 6 (1997). Algoritmus analy40 zuje „signální“ potenciál prvních 40 až 60 aminokyselin z každé z výše uvedených polypeptidových sekvencí. Stejný program byl používán k testování prvních 40 zbytků myší polypeptidové sekvence syndecan-1, o které se ví, že obsahuje sekreční signál, jako kontrolní skupina účinnosti programu, přičemž je program jasně identifikoval (data nejsou uvedena). Analýza ukazuje silný signální potenciál pro prvních 33 zbytků.

Kromě již zmíněné 33 aminokyselinové signální sekvence zahrnuje 154 další N-koncových zbytků další cysteinové zbytky, které mohou tvořit disulftdové můstky a stabilizovat konformací proteinu a predikovat místo amidace (zbytky 118 až 121), které se může týkat posttranslačního proteolytického zpracování. Další analýzy kompletní C5-epimerázové sekvence ukazují hydro50 fóbní úseky polypeptidu, jenž mohou být skryty nebo prostupovat skrz membrány.

Sekvenční analýza s dalšími sekvencemi nalezenými v databázích odhaluje horká místa homologie. Tyto výsledky jsou shrnuty na obrázcích 4 a 5.

- 19CZ 303693 B6

Na obrázku 5 je grafické znázornění polypeptidové sekvence myší C5-epimerázy. Jakje uvedeno na obrázku 5, největší evoluční konzervace („horká místa“ homologie) sekvence se vyskytla více u C-koncové části, v prostoru s velmi hydrofóbním úsekem mezi aminokyselinovými zbytky Trp497 a Leu523, což ukazuje na to, že má být skrytá ve struktuře podobné proteinu nebo probí5 há skrz membránu, možná do 1 uměnu golgiho aparatu, kde se ví, že enzym působí. Další nej důležitější a extendovaný konzervovaný úsek („horké místo“) se vyskytuje mezi zbytky Leu546 a His58O a může obsahovat nebo zahrnovat aktivní místo enzymu. Funkční signifikance konzervace polypeptidové sekvence (identita) > 22 % byla upravena podle publikovaných studií jiných proteinů se známou funkcí (Branděn, C. a Tooze, Introduction to Protein Structure, Garland io Publishing, NY and London, 100 až 101 (1991)), a Wilson, Kreychman a Gerstein a další autoři citovaní v „Quant ífý ing the relations between protein sequence, structure, and function through traditional and probabilistic scores“ dostupné na http://bioinfo.mbb.yale.edu/e~print/ann-xferjmb/preprint.html. Jakje vysvětleno v tomto článku, neukázalo se, že přesná funkce je konzervována méně než z 30 až 40% sekvenční shody, zatímco funkční třída je konzervována z hlediska sekvenční shody z 20 až 25 % (pod 20 % již není obecná podobnost konzervovaná). V současné době SWISS-MODEL vytváří modely pro sekvence, které odpovídají těmto kritériím: BLAST hledání hodnoty P: <0.00001; globální stupeň sekvenční shody (SIM): >25 % a minimální délka předpokládaného modelu — 25 aminokyselin.

Na základě těchto skutečností je vidět, že sekvence z Drosophila se více podobá sekvenci z myši (46,6 %) než sekvenci z C. elegans (39,6 %).

V jiném typu sekvenční analýzy byla předpokládaná trojrozměrná (3D) struktura sekvence myší C5—epimerázy porovnávána s 3D strukturami podle Kelleyho, L. A. et al., Mol. Biol. 299(2): 499 až 520 (2000). Z těchto srovnání se vychází, že sekvence C5-epimerázy má signifikantní vztah k doméně chondroitinázy (chondroitin AC/alginát lyáza), která je alfa/alfa toroidní. ChondroitinAC-lyáza představuje rodinu enzymů degradujících glykosaminglykany a souvislost mezi strukturou a funkcí byla objasněna díky krystalografickým studiím (Fethiere et al., J. Mol. Biol. 288: 635 až 647 (1999). Bylo zjištěno, že nejvýraznější podobnost 3D struktury se sekvencí chondroi30 tinázy je extendována z Ala408 blízko C—konce vnitřního hydrofóbního (transmembránového) useku do C-konce sekvence myší C5-epimerázy, a tak tento úsek obsahuje většinu konzervace konzervované sekvence, což pravděpodobně ukazuje na doménu obsahující aktivní místo.

Na základě veškerých výsledků ze sekvenčních analýz byly kromě prvního značeného konstruktu rekombinantní (hovězí) CS-epimerázy, který byl aktivní, připraveny nové konstrukty rekombinantní C5-epimerázy pro heterologní sekreci-expresi z bakulovirových expres ívních systémů InsectSelect (Invitrogen, USA). Charakterizované produkty z takto klonovaných hmyzích buněčných linií jsou shrnuty na obrázku 6A (uvedeny jsou čtyři konstrukty). První konstrukt je značená rekombinantní hovězí C5-epimeráza. Druhý konstrukt je značená kompletní myší C5—epimeráza.

Třetí konstrukt je značený chimérický konstrukt mezi myšími a hovězími C5-epimerázovými sekvencemi. Čtvrtý konstrukt je značená zkrácená myší sekvence.

V každém z rekombinantním konstruktů byla C5-epimeráza značena. Pokud byla značena, pak C5—epímerázové sekvenci předcházela sekvence uvedená na obrázku 6B, která obsahovala EGT signální peptid připojený k štěpícímu místu EGT signálu, enterokinázové štěpící místo, šest histidinů a nakonec rTEV proteázové místo. EGT signál je z proteinu bakuloviru (který infikuje hmyzí buňky). FLAG—sekvence je epitop-značka používaná pro detekci a purifikaci rekombinantního proteinu podle výrobcem doporučeného způsobu (Sigma) (Hopp, T. et al., Biotechnology 6; 1204 až 1210 (1988)). Enterokináza je enzym používaný k odštěpení sekvence předcházejí50 ct rozpoznávacímu místu enterokinázy. Další značkou je šest po sobě jdoucích histidinů. K odstranění předcházejících sekvencí bylo využito také rTEV („recombinant tobacco edge virus“) proteázové místo. EGT signál a FLAG™-značka (IBI) byly získány z konstruktů připravených v modifikovaném pFastBacTM (Life Technologies) vektoru získaném od Dr. Christiana Oker-Bloma, VTT Biotechnology, P. O. Box 1500, VTT, Finland. Purifikace všech rekombi55 nantních proteinů popsaných v této přihlášce byla provedena pomocí FLAG-značky.

-20 CZ 303693 B6

Reprezentativní data z testů aktivity a proteinové analýzy těchto značených rekombinantních C'5 epimeráz jsou uvedena na obrázku 7, v tabulce I a II. Na obrázku 7 jsou uvedeny výsledky z testů aktivity myší C5-epimerázy (mC5), která byla purifikována nad anti-FLAG Ml podle výrobcem doporučeného způsobu.

Test C5-epimerázové aktivity za účelem změření aktivity heterologního proteinu byly prováděny podle shora uvedeného příkladu 1. Celkový protein byl extrahován z kultur transformovaných s každým z konstruktů rekombinantní C5-epimerázy, které byly jednotlivě inokulovány do hmyío zích buněk pomocí expresívního systému InsectSelect. Poté, co buňky dosáhly konfluence, byly odebrány a lyžovány a celkový protein byl izolován a kvantifikován. Aktivita C5 epirnerázy byla měřena ve formě uvolňování ³H z epimerázového substrátu ve scintilačním počítači. Epimerázová aktivita byla změřena oproti celkovému proteinu. Na obrázku 7 je uvedena aktivita se zvyšujícím se objemem vzorku (zředění 1:2000). Celková aktivita byla 6360 cpm/μΙ. Proteinová analýza (provedená pomocí QuantiGold, Diversified Biotech) byla analyzována způsobem podle Stoscheka, C. M., Anal. Biochem, 160: 301 až 305 (1987) a indikovala 3,2 pg/ml koncentraci proteinu. Tudíž specifická aktivita byla 2,0 x 10⁹ cpm/mg/h.

Na obrázku 8 je uveden Western blotting s anti-FLAG. Sloupec 1 obsahuje standardy molekulo20 vých hmotností (New England Biolabs, Broad Range, značené předem). Sloupec 2 obsahuje celou myší C5-epimerázu. Značená celá myší C5-epimeráza (obsahující zjištěné N-koncové dodatečné sekvence) má délku 618 aminokyselin, molekulovou hmotnost (v daltonech) 71189,1, izoelektrický bod (pl) 8,25 a při pH 7 výsledný náboj +4,01.

Na obrázku 9 je uveden Western blotting kultivačního média odebraného ze stálých hmyzích buněčných linií z různých klonů pro čtyři značené rekombinantní C5-epimerázy popsané výše, které jsou značené protilátkou proti anti-FLAG (020300). Sloupec 1 obsahuje standardy molekulových hmotností jako na obrázku 8, kde molekulové hmotnosti jsou uvedeny ve svém sloupci. Sloupec 2 obsahuje zkrácenou myší C5—epimerázu. Sloupec 3 obsahuje původní hovězí C5—epi30 merázu. Sloupec 4 obsahuje myškhovězí chimérickou C5-epimerázu, ve které jsou N-koncové myší sekvence vpraveny do rámce hovězího sekvencí, jak je uvedeno na obrázcích 2 a 3. Sloupec 5 obsahuje celou myší C5-epimerázu. Chimérický myšhhovězí konstrukt má přibližně stejnou velikost jako konstrukt z celé myší C5-epímerázy.

Relativní aktivita různých rekombinantních konstruktů byla spočtena na základě testů aktivity a denzitometrického měření Western blottingu a je uvedena v tabulce 1 níže. „TruncCS“ je zkrácená aminokyselinová sekvence myší C5-epimerázy, kde prvních 154 aminokyselin bylo odstraněno takovým způsobem, že „TruncC5“ sekvence má stejný N-konec jako rekombinantní hovězí sekvence. „ExtCS“ je rekombinantní hovězí C5-epimerázový polypeptíd, zatímco „ehC5“ ozna40 čuje konstrukt myšhhovězí chimérické C5-epimerázy kódovaný sekvencí nukleové kyseliny, jak je uvedeno na obrázku 1. „mC5“ označuje sekvenci celkové myší C5-epimerázy.

-21 CZ 303693 B6

Tabulka I

Relativní aktivity různých rekombinantních C5-epimeráz

Vzorek	Hustota	Vzorek (μΐ)	Hustota/μΙ	Aktivita (cpm/μΐ)	Aktivita/hustota (Cpm/denzito- metrická jedn.)
truncCS	15984	12	1332,0	20	0,015
extCS	6451	12	537,6	7	0,013
chC5	14960	12	1246,7	3455	2,771
mC5	13804	12	1150,3	3681	3,200

Specifické aktivity různých částečně purifikovaných rekombinantních C5-epimeráz jsou uvedeny v tabulce II.

Tabulka II

Specifické aktivity částečně purifikovaných rekombinantních C5-epimeráz

Vzorek	Celková aktivita	Linearita (R2)	Protein (mg/ml)	Specifická aktivita (cpm/mg/h)
truncCS	39,5	0,9905	0,0129	3,06 x 10®
extC5	9,1	0,9978	0,0092	9,89 x 105
chC5	919,7	0,9964	0,0026	3,54 x 10“
mC5	2019	0,9969	0,0042	4,81 x 10“

Jak je uvedeno na obrázku 6B, připravený chimérický myšúhovězí konstrukt obsahoval aminokyselinové zbytky 34 až 154 N-koncové sekvence z myší polypeptidové sekvence, které bezprostředně navazovaly na EGT-FLAG-His-RTEV elementy z obrázku 6B. Nicméně bylo zjištěno, že je tento rekombinantní enzym převážně zadržován v cytosolu, pravděpodobně v důsledku signálního potenciálu myší sekvence.

Závěr

Přidání N-koncového fragmentu polypeptidu (Asp34 až Asp 154) z myší genové sekvence zvyšuje aktivitu rekombinantní C5-epimerázy o několik řádů, přestože tato část sekvence neobsahuje největší mczidruhový konzervovaný úsek. Byl ukázán možný účinek značek na aktivitu prvního rekombinantního hovězího konstruktu (odstraněním značky; data nejsou uvedena) a může zdůvodňovat malou míru rozdílu, ale ne rozdíly ve specifických aktivitách mezi delšími a kratšími formami rekombinantní C5-epimerázy o několik řádů. V současné době se provádějí studie na neznačených expresívních konstruktech a studie struktury a funkce k lepšímu definování základu a mechanizmu regulace aktivity tohoto velmi důležitého rekombinantního enzymu.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   5 1. Izolovaný polynukleotid, který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je alespoň z 95 % shodná s referenční aminokyselinovou sekvencí skládající se z aminokyselin 1 až 618 z obrázku 3.
2. 2. Polynukleotid podle nároku 1, který je DNA. io
3. 3. Polynukleotid podle nároku 1, který je RNA.
4. 4. Polynukleotid podle nároku 1, který dále obsahuje heterologní polynukleotid.

   15 5. Polynukleotid podle nároku 4, kde uvedený heterologní polynukleotid kóduje heterologní polypeptid.

   6. Polynukleotid podle nároku 5, kde heterologní polynukleotid je umístěn na 3'-konci nukleotidové sekvence.

   7. Vektor obsahující polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.

   8. Vektor podle nároku 7, kde uvedený polynukleotid je operabilně připojen k heterolognímu regulačnímu polynukleotidu.

   9. Hostitelská buňka obsahující polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.

   10. Hostitelská buňka podle nároku 9, kde izolovaný polynukleotid je operabilně připojen k heterolognímu regulačnímu polynukleotidu.

   11. Způsob produkce proteinu, vyznačující se tím, že se kultivují hostitelské buňky podle nároku 10 za takových podmínek, kdy je uvedený protein exprimován, a získá se uvedený protein.

   35 12. Izolovaný C5 cpirnerázový polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je alespoň z 95 % shodná se sekvencí skládající se z aminokyselin 1 až 618 z obrázku 3.

   13. Izolovaný polypeptid podle nároku 12, který je produkován nebo obsažen v rekombinantní hostitelské buňce.

   14. Izolovaný polypeptid podle nároku 13, kde rekombinantní hostitelská buňka je hmyzí buňka.

   15. Izolovaný polypeptid, který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je alespoň z 95 % shodná s referenční aminokyselinovou sekvencí

   45 vybranou ze skupiny skládající se z:

   (a) aminokyselin 1 až 154 z obrázku 3, (b) aminokyselin 35 až 154 z obrázku 3, (c) aminokyselin 34 až 154 z obrázku 3.

   50 16. Polynukleotid podle nároku 15, který je DNA.

   17. Polynukleotid podle nároku 15, který je RNA.

   18. Polynukleotid podle nároku 15, který dále obsahuje heterologní polynukleotid.

   -23CZ 303693 B6

   19. Polynukleotid podle nároku 18, kde uvedený heterologní polynukleotid kóduje heterologní polypeptid.

   20. Polynukleotid podle nároku 19, kde heterologní polynukleotid je umístněn na 3'-konci nukleotidové sekvence.
5. 5 21. Vektor obsahující polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 15 až 20.

   22. Vektor podle nároku 21, kde uvedený polynukleotid je operabilně připojen k heterolognímu regulačnímu polynukleotidu.

   23. Hostitelská buňka obsahující polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 15 až 20.

   24. Hostitelská buňka podle nároku 23, kde izolovaný polynukleotid je operabilně připojen k io heterolognímu regulačnímu polynukleotidu.

   25. Způsob produkce proteinu, vyznačující se tím, že se kultivují hostitelské buňky podle nároku 24 za takových podmínek, kdy je uvedený protein exprimován, a získá se uvedený protein.

   26. Izolovaný polypeptid C5-epimeráza obsahující N-koncový fragment, jehož aminokyselino15 vá sekvence je alespoň z 95 % shodná s referenční aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z:

   (d) aminokyselin 1 až 154 z obrázku 3, (e) aminokyselin 35 až 154 z obrázku 3, (f) aminokyselin 34 až 154 z obrázku 3.

   27. Izolovaný polypeptid podle nároku 26, který je produkován nebo obsažen v rekombinantní hostitelské buňce.

   28. Izolovaný polypeptid podle nároku 26, kde rekombinantní hostitelská buňka je hmyzí buňka.

   29. Způsob významného zvýšení aktivity C5-epimerázy, vyznačující se tím, že 25 zahrnuje:

   a) získání prvního polynukleotidu obsahujícího nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je alespoň z 90 % shodná s referenční aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny skládající se z aminokyselin 35 až 154 z obrázku 3 a aminokyselin 34 až 154 z obrázku 3;

   30 b) připojení uvedeného prvního polynukleotidu z bodu (a) na druhý polynukleotid kódující C5epimerázu; a

   c) expresi fúzovaného polynukleotidu.

   30. Způsob významného zvýšení aktivity C5—epimerázy podle nároku 29, vyznačující 35 se tím, že první polynukleotid obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jehož aminokyselinovou sekvencí jsou aminokyseliny 35 až 154 z obrázku 3.

   31. Způsob významného zvýšení aktivity C5-epimerázy podle nároku 29, vyznačuj ící se tím, že první polynukleotid obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, jehož aminokyselinovou sekvencí jsou aminokyseliny 34 až 154 z obrázku 3.

   40 32. Způsob významného zvýšení aktivity C5-epimerázy podle kteréhokoliv z nároků 15 až 17, vyznačující se tím, že C5-epímeráza je hovězí C5—epimeráza.