JPH1189582A - 炎症性サイトカイン誘導因子の遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 炎症性サイトカイン誘導因子をコードする新
規遺伝子等を提供する。 【解決手段】 本発明は、配列表の配列番号６のアミノ
酸配列を有し、かつ炎症性サイトカインを誘導する機能
を有するポリペプチドをコードする遺伝子、炎症性サイ
トカインを誘導する機能を有するポリペプチドが、その
分子中に配列表の配列番号２−５の少なくとも一つのア
ミノ酸配列を有することを特徴とする前記の遺伝子、当
該遺伝子の組換え体により発現された炎症性サイトカイ
ン誘導因子ポリペプチドの製造方法、天然由来の他の蛋
白質を含有しない炎症性サイトカイン誘導因子、上記遺
伝子組換え体の発現ポリペプチドからなる炎症性サイト
カイン誘導因子を有効成分として含有する医薬組成物、
上記ポリペプチドの炎症性サイトカイン誘導因子として
の機能を阻害する化合物のスクリーニング方法およびそ
の化合物等に係る。 【効果】 本発明の生理活性物質は、マイコプラズマ感
染による過剰な免疫応答の抑制、各種の血小板減少症の
治療等に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は炎症性サイトカイン
を誘導する活性を有する生理活性物質のポリペプチドを
コードする遺伝子、この遺伝子の組換え体による発現ポ
リペプチドの製造法、発現ポリペプチド、発現ポリペプ
チドに対する抗体、その炎症性サイトカイン誘導因子と
しての活性／機能を阻害する化合物のスクリーニング方
法およびその化合物等に関するものである。本発明の遺
伝子が発現する生理活性物質は血球細胞、骨髄ストロー
マ細胞などに作用してインターロイキン６などの炎症性
サイトカインを誘導する活性を有する。本発明の生理活
性物質はマイコプラズマ感染に伴う炎症性サイトカイン
誘導の原因物質であることから、その機能を抑制するこ
とでマイコプラズマ感染による過剰な免疫応答を抑制で
きるなど、特に医療の分野において有用なものである。
一方、インターロイキン６は巨核球系細胞に作用し、増
殖・分化を促進する活性を有し、各種の血小板減少症の
治療剤としての有用性が示唆されている。本発明の生理
活性物質はインターロイキン６の誘導活性を有すること
から、これら各種の血小板減少症の治療剤としても有効
と考えられる。

【０００２】

【従来の技術】マイコプラズマには、異型肺炎や気管支
炎の起炎病原菌であるMycoplasma pneumoniae や、尿道
炎、卵管炎などの泌尿生殖器・産婦人科系疾患の病原マ
イコプラズマとしてのMycoplasma hominis、Mycoplasma
genitalium やUreaplasma urealyticumなどが知られて
いる。さらに、最近、リューマチ、癌化やHIV 感染によ
るAIDSの発症とMycoplasma fermentans などの感染との
因果関係が注目されている。これらマイコプラズマ感染
による疾患では感染に伴う免疫反応を介した間接的な障
害が疾患の成立に深く関与していると考えられている。
すなわち、マイコプラズマの分泌する液性因子や菌体成
分が炎症性サイトカインを過剰に誘導し、免疫反応の異
常を惹起していると考えられる。一方、マイコプラズマ
感染の確定診断には分離菌の同定が必要であるが、マイ
コプラズマが通常の人工培地では生育しないことに加え
て、生育速度が遅いなど問題点も多い。

【０００３】２０年以上前に、リウマチ患者の滑膜液か
らMycoplasm fermentansが分離された（Ciba Foundatio
n symposium.Amsterdam:Associated Scientic Publishe
rs,1972:251-262 ）。最近、炎症性関節炎、例えば、rh
eumatoid arthritis、spondyloarthropathy with perip
heral arthritis 、psoriatic arthritis 、unclassifi
ed inflamatory arthritisなどの滑膜液などにMycoplas
ma fermantans をPCRで検出できる場合があることが報
告された（Lancent.347:1418,1996 ）。このように、My
coplasma感染が炎症性関節炎における異常な免疫反応と
密接に関連していることが示唆されている。

【０００４】一方、Mycoplasma産物が炎症性サイトカイ
ンを誘導することが知られている。HallらはヒトPre-B
細胞白血病細胞株Reh の培養上清から、ヒトPromyelocy
tic白血病細胞株HL-60 を増殖抑制および分化誘導する
因子としてp48 を同定した。その後、この因子がMycopl
asma産物であり、単球および単球系の細胞株に作用して
Interleukin 1 、Tumour necrosis factor-alpha、Inte
rleukin-6 などの炎症性サイトカインを誘導することを
報告した（Biochemical Journal. 319:919-927, 1996)
。この因子は18kdの蛋白質にpost-translational modi
fication を受けたものであると考えられる。

【０００５】このように、Mycoplasma産物による炎症性
サイトカインの誘導が炎症性関節炎の発症と密接に関連
していることから、炎症性サイトカインの誘導活性を抑
制する抗体あるいは化合物はこれら疾患に対する治療剤
として有効であると考えられる。

【０００６】また、Mycoplasma感染によって誘導される
実験動物の関節炎モデルでは関節炎発症の初期の段階で
はMycoplasmaを検出できるが、後期には検出できないこ
とが報告されている（Arthritis Rheum. 23:825-36, 19
80）。この原因としてはMycoplasmaの炎症性サイトカイ
ンを誘導する産物が関節内に蓄積して持続的に作用して
いる可能性が考えられる。この際、PCR などの検出方法
ではMycoplasma感染が原因となっているかどうかを診断
することは困難であり、その原因物質を検出する方法が
有効である。

【０００７】このように、炎症性関節炎の診断において
も炎症性サイトカインを誘導する因子本体を検出する診
断方法が有効であると考えられる。

【０００８】癌化とMycoplasma感染との関係も注目され
ている。これまでのMycoplasma感染によって染色体異常
が誘導されることが報告されていた。しかし、使用した
細胞がBaby Hamster Kidney (BHK）であることから、sp
ontaneous な変異との異同が問題視されていた。Tsaiら
はマウス胎児細胞C3H/10T1/2を用いてMycoplasma ferme
ntans 感染による癌化との関係について調べた。その結
果、Mycoplasmaの持続感染でC3H/10T1/2が形質転換し、
腫瘍化することを報告した（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA. 92:10197-10201, 1995）。この腫瘍化とMycoplasma
由来の炎症性サイトカイン誘導因子との関連については
明確ではないが、異常なサイトカイン誘導が関与してい
る可能性は充分に考えられる。

【０００９】本発明者らはMycoplasmaに感染した未分化
甲状腺患者由来細胞株KHM-5Mの培養上清から、マウス骨
髄細胞に作用して巨核球系細胞の増殖・分化を促進する
生理活性物質を単離し、その性状を明らかにすることに
成功して先に出願した（特願平７ー３３４３２７（特開
平９−１８８６９７））。この生理活性物質の作用機序
としては直接巨核球系細胞に作用する可能性とインター
ロイキン６などの炎症性サイトカインの誘導を介する可
能性が考えられる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】このような状況を踏ま
えて、本発明者等はこの生理活性物質の作用機序を詳細
に解析し、マウス骨髄細胞に作用して巨核球系細胞の増
殖・分化を促進する作用が抗インターロイキン６レセプ
ター抗体で中和されることを明らかにした。さらに、本
発明者等はマイコプラズマ由来（Mycoplasma fermentan
s あるいは類似菌）の炎症性サイトカイン誘導に関与す
る新しい生理活性物質として、この生理活性物質をコー
ドする遺伝子を解明するとともに、遺伝子組換え体によ
るこの遺伝子の発現ポリペプチドの製造、などに成功し
て、本発明を完成するに至った。この生理活性物質はマ
イコプラズマ感染に伴う免疫反応の異常を惹起する本体
と考えられ、この機能を抑制する抗体あるいは化合物は
これらの異常を改善する医薬品として有効と考えられ
る。また、この生理活性物質に対する抗体はマイコプラ
ズマ感染による疾患の確定診断も有用なものと考えられ
る。

【００１１】本発明は血球細胞、骨髄ストローマ細胞な
どに作用し、インターロイキン６などの炎症性サイトカ
インを誘導する生理活性物質のポリペプチドをコードす
る新規な遺伝子を提供することを目的とするものであ
る。また、本発明は血球細胞、骨髄ストローマ細胞など
に作用し、インターロイキン６などの炎症性サイトカイ
ンを誘導する生理活性物質を遺伝子組換え体により製造
する方法を提供することを目的とするものである。

【００１２】また、本発明はこの炎症性サイトカイン誘
導活性を有する遺伝子組換え体の発現ポリペプチド、こ
の発現ポリペプチドを有効成分として含有することを特
徴とする医薬組成物を提供することを目的とするもので
ある。さらに、本発明は上記の遺伝子を含有する組換え
DNA 、この組換えDNA を含有するベクター、このベクタ
ーで形質転換されている細胞、上記発現ポリペプチドに
特異的に結合する抗体やその炎症性サイトカイン誘導因
子としての機能を阻害する化合物のスクリーニング方法
およびその化合物等を提供することを目的とするもので
ある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】このような課題を解決す
る本発明は以下の技術的手段からなる。 （１）配列表の配列番号２−５の少なくとも一つのアミ
ノ酸配列を有し、炎症性サイトカインを誘導する機能を
有するポリペプチドをコードする遺伝子。 （２）配列表の配列番号６のアミノ酸配列を有し、かつ
炎症性サイトカインを誘導する機能を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子。 （３）配列表の配列番号１に記載した塩基配列、または
その一部からなる塩基配列を有し、その塩基配列の１個
または複数個の残基が置換、欠失、挿入または付加の少
なくとも一つがなされており、かつ、炎症性サイトカイ
ンを誘導する機能またはそれと同等の機能を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子。 （４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子を
含有する組換えDNA 。 （５）前記（４）に記載の組換えDNA を含有するベクタ
ー。 （６）前記（５）に記載のベクターで形質転換されてい
る細胞。

【００１４】（７）前記（６）に記載の細胞を培養し、
この培養物から炎症性サイトカインを誘導する機能を有
するポリペプチドを採取することを特徴とする、遺伝子
組換え体により発現された炎症性サイトカイン誘導因子
の製造法。 （８）前記（７）に記載の方法により製造された遺伝子
組換え体の発現ポリペプチドからなる炎症性サイトカイ
ン誘導因子。 （９）前記（１）〜（３）に記載の遺伝子にハイブリダ
イズする合成オリゴヌクレオチドまたはプライマー。 （１０）前記（８）に記載のポリペプチドに特異的に結
合する抗体またはその断片。 （１１）前記（８）に記載のポリペプチドの活性／機能
の抑制を指標とすることを特徴とする、当該ポリペプチ
ドの炎症性サイトカイン誘導因子としての機能を阻害す
る化合物のスクリーニング方法。 （１２）前記（１１）に記載のスクリーニング方法によ
り得られた、前記ポリペプチドの炎症性サイトカイン誘
導因子としての機能を阻害する化合物。 （１３）前記（７）に記載の遺伝子組換え体の発現ポリ
ペプチドからなる炎症性サイトカイン誘導因子を有効成
分として含有することを特徴とする医薬組成物。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下に本発明の内容を詳細に説明
する。本発明の遺伝子により発現される生理活性物質
は、血球細胞、骨髄ストローマ細胞等に作用し、インタ
ーロイキン６などの炎症性サイトカインを誘導する活性
／機能を有することを特徴とする。この生理活性物質は
マイコプラズマ感染に伴う炎症性サイトカイン誘導の本
体と考えられ、この生理活性物質の機能を阻害すること
でマイコプラズマ感染による炎症反応を抑制できるもの
と考えられる。また、マイコプラズマ感染を診断する上
で有効な分子でもある。次に、本発明の生理活性物質の
活性を測定するには、例えば、骨髄細胞、末梢血単核
球、各種の細胞株を使用し、被実験物質をこれら細胞に
作用させて、その培養上清中のインターロイキン６など
の炎症性サイトカインの濃度を測定する方法が好適なも
のとして使用される。

【００１６】次に、本発明の生理活性物質はSDS-PAGEで
測定される分子量が約４２kdであることを特徴とする。
一般的に、生理活性物質の分子量はゲル濾過やSDS-PAGE
などの分子量測定法により測定され、その測定値は測定
方法の種類や、測定に用いる担体や分子量マーカーの種
類、測定条件等によって微妙に変動する。本生理活性物
質は前述したようにSDS-PAGEで測定した場合の分子量が
約４２kdである。

【００１７】次に、本発明の生理活性物質はN 末端に以
下のアミノ酸配列を有することを特徴とする。このアミ
ノ酸配列は後述するようにプロテインシーケンサーによ
って実験的に同定したものである。 （配列） Xaa Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Tyr Thr Thr Thr Asn Ala 20 （Xaa はアミノ酸が特定されていないことを示す）

【００１８】次に、本発明の生理活性物質はその由来と
してマイコプラズマに感染している赤白血病細胞株K56
2、未分化甲状腺癌患者由来KHM-5M細胞株、シーゼリィT
細胞白血病患者由来HUT78 細胞株が好適なものとして
あげられる。しかし、その由来はこれらに限定されるも
のではなく、例えば、このマイコプラズマに感染したヒ
トあるいは動物由来細胞株、マイコプラズマの培養菌体
あるいは培養液、本発明の生理活性物質に対する遺伝子
を利用して遺伝子工学的に産生させたものなどであって
もよい。

【００１９】次に、本発明の生理活性物質の製法につい
て説明すると、本発明の生理活性物質は、例えば、下記
の工程により効率的に製造することができる。 （１）マイコプラズマに感染しているK562細胞株を培養
する。 （２）その培養上清を回収する。 （３）培養上清を限外濾過膜により濃縮する。 （４）下記のa 〜e により精製を行う。 a. DEAE-Sepharose FF イオン交換クロマトグラフィー b. 第一回目逆相系高速液体クロマトグラフィー c. 第二回目逆相系高速液体クロマトグラフィー d. ゲル濾過 e. SDS-PAGE 本発明ではこの工程による製法が好適なものとしてあげ
られるが、これに限定されるものではなく、これらの工
程に必要に応じて他の工程を付加した製法やこれらの工
程の一部を省略した製法も適宜使用される。

【００２０】次に、前記の各工程について説明する。前
記（１）のマイコプラズマに感染したK562細胞等の培養
工程はこの細胞が増殖し得る培養条件により適宜実施さ
れる。すなわち、K562細胞株等を増殖させるのに好適な
濃度の血清や増殖因子、例えば、ウシ胎児血清やインス
リンなどを含む培地を用いて、３７℃で培養する。培地
としては、一般的に使用されているDMEM ( Dulbecco's
Modified Eagle's Medium)、IMDM ( Iscove's Modified
Dulbecco's Medium) およびRPMI1640などの培地が好適
なものとしてあげられる。

【００２１】次に、前記（２）のK562細胞株等の培養上
清の回収工程は、例えば、前記（１）によりK562細胞株
等を培養した培地から、適宜の手段でその培養上清を回
収すればよく、K562細胞株等を培養後、培養容器から培
地を取り出し、必要があれば、遠心分離、濾過等の手段
により、培地中の細胞と培養上清とを分離し、培養上清
を回収する。

【００２２】次に、前記（３）の限外濾過膜による培養
上清の濃縮は常法により市販の限外濾過膜を利用して実
施することにより、適宜、濃縮して液体濃縮物を調製す
ればよく、その手段は特に限定されるものではない。
尚、本発明の生理活性物質を含有する液体濃縮物は前記
K562細胞株等が好適なものとして使用されるが、その
他、本生理活性物質を産生し得る細胞や微生物を培養し
た培地、細胞、微生物等を適宜使用することができる。

【００２３】次に、このようにして得られた培養上清の
濃縮物から本発明の生理活性物質を精製する方法は特に
限定されるものではなく、塩析、限外濾過、等電点沈
殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性
クロマトグラフィー、抗体アフィニティークロマトグラ
フィー、クロマトフォーカシング、吸着クロマトグラフ
ィー、逆相系クロマトグラフィー等、多くの成書等に記
載されている方法の中から、適宜の方法を選択して実施
すればよい。次に、前記（４）は、a. DEAE-Sepharose
FFイオン交換クロマトグラフィー、b. 第一回目逆相系
高速液体クロマトグラフィー、c. 第二回目逆相系高速
液体クロマトグラフィー、d. ゲル濾過およびe. SDS-P
AGE を組み合わせてなる好適な精製ステップであり、こ
の精製ステップを利用することにより、本発明の生理活
性物質を効率よく精製することができる。

【００２４】前記工程（４）において、イオン交換クロ
マトグラフィーとしてはDEAE-Sepharose FF が、逆相系
高速液体クロマトグラフィーとしてはVydac Protein C4
が、また、ゲル濾過としてはTSK G3000SWXL が好適なも
のとしてあげられる。尚、本発明の生理活性物質はこの
ようにして精製されるが、一旦採取、精製され、その性
質が解明された後はそれらの性質を指標として蛋白質の
単離、精製に用いられる適当な方法を利用することが可
能である。

【００２５】さらに、本発明の生理活性物質を遺伝子工
学的手段により製造することも可能である。例えば、上
記のHUT78 細胞株から常法に従ってmRNAを単離し、この
mRNAを用いて常法によりcDNAライブラリーを作製するこ
とができるし、genomic DNAを酵素的に切断したDNA 部
分分解物を用いることができる。このcDNAライブラリー
またはDNA 部分分解物をスクリーニングするためのDNA
プローブは、例えば、本発明で明らかにされた部分アミ
ノ酸配列に基づいて設計することができる。あるいは、
本発明の生理活性物質を酵素的に、または、化学的に切
断し、その断片のアミノ酸配列を決定した後、そのアミ
ノ酸配列に基づいてDNA プローブを設計することもでき
る。

【００２６】次に、こうして得られた生理活性物質をコ
ードするcDNAを適宜の発現ベクターに挿入し、上記遺伝
子を含有するベクターを作製した後、この発現ベクター
により宿主を形質転換し、この形質転換体を培養するこ
とにより本発明の生理活性物質を製造することができ
る。宿主としては、大腸菌の如き原核細胞、酵母の如き
下等真核細胞、哺乳類の如き高等真核細胞等、常用の宿
主を用いればよい。

【００２７】前記工程により製造された本発明の生理活
性物質はJ774.1細胞株、ST-2細胞株等に作用して培養上
清中へのインターロイキン６産生を促進する活性を有す
る。

【００２８】尚、本発明者等がスクリーニングし、細胞
株として樹立した前記未分化甲状腺癌患者由来のKHM-5M
細胞株は1994年11月29日付で公的微生物寄託機関である
工業技術院生命工学工業技術研究所にKHM-5M、受託番
号：FERM BP-4901として寄託（ブタペスト条約に基ずく
国際寄託）されている。尚、上記のKHM-5Mは微生物寄託
機関の通告に従って、マイコプラズマを除染したKHM-5M
細胞株として寄託されている。

【００２９】次に、本発明の生理活性物質に特異的に結
合する抗体について説明する。本発明の生理活性物質あ
るいはその部分ペプチドを抗原として、ウサギ、モルモ
ット、マウス等に免疫して抗血清を作製することができ
る。また、免疫したマウスの脾細胞とミエローマをフュ
ージョンさせて得られた細胞から、本生理活性物質と特
異的に結合するモノクローナル抗体を作製することがで
きる。

【００３０】次に、本生理活性物質による炎症性サイト
カイン誘導活性を阻害する物質のスクリーニング方法を
説明する。ヒト末梢血単核球あるいはJ774.1細胞株やST
-2細胞株に、本生理活性物質と化合物を添加して、一定
時間培養した後に、その培養上清を回収する。この培養
上清中のインターロイキン６等の炎症性サイトカインの
濃度を測定して、インターロイキン６等の炎症性サイト
カインの産生抑制、すなわち、本ポリペプチドの活性／
機能の抑制を指標としたスクリーニング方法が考えられ
る。

【００３１】次に、本発明の医薬組成物について説明す
る。本発明の医薬組成物は、本発明の生理活性物質を有
効成分として含有することを特徴とするものである。こ
の生理活性物質としては前記のアミノ酸配列をその分子
中のN 末端もしくは適宜の部位に有するものを使用でき
る。本発明の医薬組成物はこの生理活性物質を凍結乾
燥、除菌濾過などの製剤学的に必要な工程で処理しただ
けのもので充分にその効果を奏することができるもので
あるが、この生理活性物質に製剤学的に許容されうる補
助成分を適宜添加し、常法により製剤化し得ることはい
うまでもない。

【００３２】

【実施例】次に、本発明を実施例に基づいてさらに具体
的に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１ 本生理活性物質の巨核球系細胞増殖・分化促進活性に対
する抗インターロイキン６レセプター抗体の作用 １）ＡｃｈＥ ａｓｓａｙ（アセチルコリンエステラー
ゼ アッセイ） マウス巨核球系細胞の増殖・分化をBursteinらの方法に
準じたＡｃｈＥ ａｓｓａｙで測定した。（Burstein
S. A., Boyd C. N., Dale G. E., Quantitationof mega
karyocytopoiesis in liquid culture by enzymatic de
termination ofacetylcholinesterase, Journal of Cel
lular Physiology, 122:159-165, 1985） Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６〜１０週齢）（日本チャー
ルスリバー）の大腿骨および脛骨より骨髄細胞を採取
し、これを1%ニュートリドーマSP（ベーリンガーマンハ
イム）を含むRPMI1640培地（GIBCO ）に懸濁し、メッシ
ュ径１００μｍのフィルター濾過して、骨片などを除去
した。本生理活性物質、マウスインターロイキン３（Ge
nzyme ）およびラット抗マウスインターロイキン６レセ
プターモノクローナル抗体（Ｔａｍｕｒａ Ｔ．，Ｕｄ
ａｇａｗａ Ｎ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ．，Ｍｉｙ
ａｕｒａ Ｃ．，Ｔａｎａｋａ Ｓ．，Ｙａｍａｄａ
Ｙ．，Ｋｏｉｓｈｉｈａｒａ Ｙ．，Ｏｈｓｕｇｉ
Ｙ．，Ｋｕｍａｋｉ Ｋ．，Ｔａｇａ Ｔ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｏｌｕｂｌｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６
ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｏｓｔｅｏｃｌ
ａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕ
ｋｉｎ ６．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．，９０（２４）：１１９２４
−８、１９９３）を1%ニュートリドーマSP/RPMI1640 培
地で希釈し、骨髄細胞と混和して３７℃にて６日間培養
した。尚、マウスインターロイキン３の添加量は最終濃
度10u/ml、ラット抗マウスインターロイキン６レセプタ
ーモノクローナル抗体の添加量は最終濃度５マイクログ
ラム/ml 、骨髄細胞の最終濃度は0.7 ×10⁵/mlとした。

【００３３】培養終了後、３．１５ｍｇ／ｍｌ ＤＴＮ
Ｂ／１％クエン酸Ｎａ溶液を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００溶液で１０倍稀釈し、これを５０μｌ／ウェルずつ
添加してプレートミキサーで攪拌し、波長４１５ｎｍと
６２０ｎｍの吸光度差を測定して０ｍｉｎにおける吸光
度とした。

【００３４】次に、２．１７ｍｇ／ｍｌヨー化アセチル
チオコリン溶液を２０μｌ／ウェルずつ添加し、室温に
て６０分間反応させた後、波長４１５ｎｍと６２０ｎｍ
の吸光度差を測定し、△ＯＤ（６０ｍｉｎの吸光度と０
ｍｉｎの吸光度の差）を求めた。尚、ＤＴＮＢは、５，
５′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ
ｏｉｃ ａｃｉｄ）の略称である。

【００３５】２）測定結果 AchE活性（△ＯＤ）は抗インターロイキン６レセプター
モノクローナル抗体 非添加時 0.6 添加時 0.2 以上の結果から、本生理活性物質の巨核球系細胞増殖・
分化促進活性は抗インターロイキン６レセプター抗体に
より抑制されることが明らかとなった。インターロイキ
ン６は巨核球系前駆細胞の成熟を促進することが知られ
ている（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ Ｔ．，Ｓｈｉｋａｍａ
Ｙ．，Ｋｉｍｕｒａ Ｈ．，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ
Ｍ．，Ｕｃｈｉｄａ Ｔ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ．，
Ｏｋａｎｏ Ａ．，Ａｋｉｙａｍａ Ｙ．，Ｈｉｒａｎ
ｏ Ｔ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｉ
ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ
ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２１
（５）：６４０−６、１９９３）。よって、本生理活性
物質の巨核球系細胞増殖・分化促進活性は、本生理活性
物質によって誘導されたインターロイキン６による間接
的な作用であり、本生理活性物質はインターロイキン６
等の炎症性サイトカイン誘導活性を有することが予想さ
れた。

【００３６】実施例２ 各種細胞株での本生理活性因子の産生 ＫＨＭ−５Ｍ以外の細胞株での本生理活性物質の産生を
ウエスタンブロットで確認した。 （１）本生理活性物質のＮ末端部分のアミノ酸配列を含
む抗ペプチド抗体の作製 本生理活性物質のＮ末端部分のアミノ酸配列を含む１９
アミノ酸からなるペプチドをＭＡＰ法で合成（（株）サ
ワディー・テクノロジー）して抗原とした。このＭＡＰ
ペプチドをフレンドの完全アジュバントでエマルジョン
とし、ウサギの皮内に免疫して抗ペプチド抗体を作製し
た。

【００３７】（２）本生理活性物質の検出法 本生理活性物質は抗ペプチド抗体を使用したウエスタン
ブロットで検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌ
ｉらの方法を部分的に改変して行った。試料は適切な濃
度に希釈してサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、１０％
２−メルカプトルエタノール、２０％グリセロール、
０．１２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８））と１：
１で混合し、１００℃で３分間処理した。分子量の推定
はＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＧＩＢ
ＣＯ）を分子量マーカーとして用いた。泳動はＳＤＳ−
ＰＡＧＥ ｍｉｎｉゲル（ＴＥＦＣＯ社製、１０Ｔ％、
１ｍｍ）を用いて定電流（濃縮ゲル：２５ｍＡ、分離ゲ
ル：３５ｍＡ）で泳動した。泳動終了後、ゲル中の蛋白
質をセミドライブロッティング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、
ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴＳＤ ＳＥＭＩ−ＤＲＹ ＴＲＡ
ＮＳＦＥＲ ＣＥＬＬ）を用いてＰＶＤＦ膜に１４０ｍ
Ａ、４時間転写した。各レーンは一次抗体として抗ペプ
チド抗体、二次抗体としてアルカリフォスファターゼを
コンジュゲートさせた抗ウサギＩｇＧ抗体を使用し、免
疫酵素染色した。

【００３８】（３）各種細胞株での本生理活性物質の産
生確認 抗ペプチド抗体を使用したウエスタンブロットで各種細
胞株ＣＥＭ、ＳＫＴ−１Ｂ、Ｂａ／Ｆ３、ＨＬ−６０、
ＭＯＬＴ−４、ＨＥＬ、ＨＵＴ−７８、Ｊｕｒｋａｔ、
Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｏｍａ ＰＭＡ（−）、Ｐｒｉ
ｍａｒｙ Ｓｔｒｏｍａ ＰＭＡ（＋）、ＵＴ−７、Ｍ
Ｅ−１、Ｋａｓｕｍｉ−１、Ｍ−ＭＯＫ、ＴＨＰ−１、
Ｕ９３７、Ｋ３Ｔ、ＭＴ２、Ｋ５６２の細胞培養上清中
の本生理活性物質を調べた。

【００３９】（４）結果 その結果を表１に示す。本生理活性物質の陽性染色バン
ドの濃さを強い順にＡ、Ｂ、Ｃまた陰性をＤで表示す
る。

【００４０】

【表１】

【００４１】実施例３ Ｋ５６２細胞株の培養 実施例１より、本生理活性物質の産生量が高く、浮遊性
細胞であるため培養が容易なK562細胞株を選択し、培養
を実施した。 １）赤白血病細胞株Ｋ５６２の継代培養 継代用培地には５７℃で３０分間非動化した１０％ＦＣ
Ｓを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いた。培養初期濃
度は１×１０⁵ 細胞／ｍｌとし、３７℃、５％ＣＯ₂ 、
湿度１００％の条件下で３日間培養し、継代培養を行っ
た。継代は、遠心分離で細胞を集め、継代用培地に細胞
を１×１０⁵ 細胞／ｍｌの濃度で浮遊させ上記条件で培
養した。底面積２５ｃｍ² のカルチャーフラスコは１０
ｍｌ、１７５ｃｍ² のカルチャーフラスコでは１００ｍ
ｌのスケールで培養した（ファルコン社製）。また、１
０００ｍｌスケールではスピナーフラスコ（テクネ社
製）を使用し、攪拌速度は２０ｒｐｍとした。

【００４２】２）培養上清の調製 上記の継代用培地で３日間培養した細胞は、遠心分離で
回収し、５０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄後、
１ＬのＩＭＤＭ培地に浮遊させ同スピナーフラスコで２
日間培養した。本培養液を４５００ｒｐｍ、２０分間の
遠心分離により細胞を沈澱させ、０．４５μｍフィルタ
ー濾過で浮遊物を取り除いた上清を、Ｋ５６２の培養上
清として−２０℃で凍結保存した。

【００４３】実施例４ 本発明の生理活性物質の精製 １）限外濾過膜による脱塩・濃縮 上記の培養上清約１２Ｌを室温にて融解後、限外濾過膜
ＰＭ１０（アミコン社製）で濃縮し、０．０１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０
で電気伝導率３ｍＳ／ｃｍ² になるまで脱塩・濃縮を繰
り返し１．４Ｌにした。

【００４４】２）ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ
イオン交換クロマトグラフィー 上記の濃縮した培養上清１．４Ｌを０．０１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０で
平衡化してあるＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（フ
ァルマシア社製）のカラムに吸着させ、３００ｍＭＮａ
Ｃｌを含む０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０で溶出させ、溶出画分１４
０ｍｌを得た。流速は６ｍｌ／ｍｉｎ（Ｐ１ポンプ：フ
ァルマシア社製）、蛋白質の検出はＡｂｓ．２８０ｎｍ
（ＵＶ１：ファルマシア社製）で測定した。

【００４５】３）Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４
ＲＰ−ＨＰＬＣ 次に上記の３００ｍＭＮａＣｌで溶出される画分を、Ｖ
ｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４（バイダック社製）の
カラムを用いた逆相系の高速液体クロマトグラフィーで
分画した。すなわち、流速１ｍｌ／ｍｉｎで４０％アセ
トニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化し
てあるカラム吸着させ、４０分間でアセトニトリルの濃
度を８０％まで直線的に増加させて溶出した。アセトニ
トリル４８％〜５５％付近に溶出される画分を合わせ、
２ｎｄ Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４ ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣに供した。

【００４６】４）２ｎｄ Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ 上記のアセトニトリル４８％〜５５％付近に溶出される
画分を合わせ、２０％アセトニトリルを含む０．１％ト
リフルオロ酢酸を等量加えて希釈した。本サンプルは流
速１ｍｌ／ｍｉｎで４０％アセトニトリルを含む０．１
％トリフルオロ酢酸で平衡化してあるカラムに吸着させ
４０分間でアセトニトリルの濃度を８０％まで直線的に
増加させ溶出させた。アセトニトリル４８％〜５５％付
近に溶出される画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料とした。

【００４７】５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥとエレクトロブロッ
ティング ａ）蛋白試料の調製とＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉらの方法を部分的に
改変して行った。すなわち、上記のアセトニトリルの濃
度４８〜５５％付近に溶出された画分各１ｍｌに０．６
２５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）３．７５μ
ｌ、１０％ＳＤＳ６μｌ、飽和ブロモフェノールブル−
水１μｌを添加し、減圧式遠心濃縮機で濃縮した。濃縮
液は１ＮＮａＯＨでｐＨ６．８に調製し、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ ｍｉｎｉゲル（ＴＥＦＣＯ社製、１０Ｔ％、１ｍ
ｍ）を用いて定電流（濃縮ゲル：１０ｍＡ、分離ゲル：
１５ｍＡ）で泳動した。

【００４８】ｂ）エレクトロブロッティング ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、ゲル中の蛋白質をセミドライ
ブロッティング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＴＲＡＮＳ−Ｂ
ＬＯＴ ＳＤ ＳＥＭＩ−ＤＲＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ
ＣＥＬＬ）を用いてＰＶＤＦ膜に５０ｍＡ、４時間転写
した。ブロッティングしたＰＶＤＦ膜はＤＤＷで１０分
間洗浄し、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＰｏｎｓｏＳを含む２％
（Ｖ／Ｖ）酢酸溶液で５分間染色した。またバックグラ
ンドの脱色は１％（Ｖ／Ｖ）酢酸溶液で約１０分間行っ
た。脱色後ＰＶＤＦ膜はＤＤＷで洗浄し風乾した。

【００４９】実施例５ 部分アミノ酸配列の決定 １）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 実施例４で得られたＰＶＤＦ膜転写サンプルから分子量
４２ｋＤのバンドを切り出し、モデル４７６Ａプロテイ
ンシークエンサー（アプライドバイオシステム社製）に
より分子中のＮ末端アミノ酸配列を決定した。すなわ
ち、エドマン分解によって遊離したＰＴＨ−アミノ酸を
紫外部吸収にて検出し、予め分離した標準ＰＴＨ−アミ
ノ酸（アプライドバイオシステム社製）の保持時間を基
準にしてアミノ酸を同定した。その結果、Ｋ５６２細胞
株由来の当該生理活性物質のＮ末端アミノ酸配列（配列
表の配列番号２のアミノ酸配列）は、前出願のＫＨＭ−
５Ｍ細胞株由来と同じ以下の配列を有していることが確
認された。 ＸＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦ ＫＥＫＤＩＳＫＹＴＴ ＴＮＡ

【００５０】２）内部アミノ酸配列の決定 実施例４で得られたＰＶＤＦ膜転写サンプルから分子量
４２ｋＤバンドを切り出し、「遺伝子クローニングのた
めのタンパク質構造解析」（平野 久著、東京化学同
人）８７頁記載の方法により、臭化シアン分解を行っ
た。臭化シアン分解後、反応液を逆相系高速液体クロマ
トグラフィー（ＰＲＯＴＥＩＮ ＆ ＰＥＰＴＩＤＥ
Ｃ１８、ＶＹＤＡＣ社）で分画し、得られたピークをモ
デル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライドバ
イオシステム社製）で分析した。 その結果、以下の三
つのアミノ酸配列（配列表の配列番号３〜５のアミノ酸
配列）の存在が明らかとなった。 ＣＮ−１（ＩＱＤＫＤＲＩＬＴＳ ＶＬＫＨＩＫＱＡＶ
ＹＥＴＬＬＤＬＩＬＥＫＸＸＧＹＫＰＹＶＶＫ） ＣＮ−２（ＦＫＥＬＰＥＤＦＶＫ ＹＩＮＳＤＫＡＬＫ
Ｄ ＧＮＫＩＤＮＶＳＥＲ ＬＥＡＩＩ） ＣＮ−３（ＮＴＶＩＮＮＶＬＳＸ ＴＰＡＤＶＫＹＮＰ
Ｈ ＶＩＬＸＶＡＧＰ）

【００５１】実施例６ in vitroにおけるＩＬ−６産生誘導活性の測定 １）活性測定用細胞の調製 ヒト末梢血単核球は、ヘパリン加採血したヒト末梢血を
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液（ファルマシア社製）に
重層し、遠心分離機を用いて２５℃にて４００ｇで３０
分間遠心することにより分離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａ
ｑｕｅ溶液と血漿の界面に存在する単核球を集め、１０
％ＦＣＳ／ＩＭＤＭ培地で２回洗浄した。マウスマクロ
ファージ由来細胞株Ｊ７７４．１、マウス骨髄間質細胞
由来細胞株ＳＴ２、マウス線維芽細胞由来細胞株ＮＩＨ
３Ｔ３は理化学研究所細胞開発銀行より入手した。

【００５２】２）活性の測定 被検サンプルとして実施例４の４）２ｎｄ Ｖｙｄａｃ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣにおいてアセ
トニトリル４８％〜５５％付近に溶出される画分を用い
た。ヒト末梢血単核球は２×１０⁶ 細胞／ｍｌになるよ
うに１０％ＦＣＳ／ＩＭＤＭ培地に懸濁し、同液量の被
検サンプル（１０％ＦＣＳ／ＩＭＤＭ培地で希釈）と混
合した。３７℃にて２４時間培養し、培養上清中のＩＬ
−６濃度をＥＬＩＳＡ法（ＥＮＤＯＧＥＮ社製）で測定
した。マウスマクロファージ由来細胞株J ７７４．１は
１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、被検サ
ンプル（１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈）
と混合し（最終細胞濃度２×１０⁶ 細胞／ｍｌ）、３７
℃にて２４時間培養し、培養上清中のＩＬ−６濃度をＥ
ＬＩＳＡ法（ＥＮＤＯＧＥＮ社製）で測定した。マウス
骨髄間質細胞由来細胞株ＳＴ２、マウス線維芽細胞由来
細胞株ＮＩＨ３Ｔ３は１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０
培地中で２４ウェルプレート（ベクトンデッキンソン社
製）で培養し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになった時点で被検
サンプル（１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で希
釈）を添加した。３７℃にて２４時間培養し、培養上清
中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡ法（ＥＮＤＯＧＥＮ社
製）で測定した。

【００５３】 ３）結果 ・ヒト末梢血単核球からのＩＬ−６産生誘導 被検サンプル添加時 １５７５ｐｇ／ｍｌ 陽性コントロール（ＩＬ−１ーβ、ベーリンガーマンハイム社製）１０ｎｇ／ｍ ｌ添加 １３２８ｐｇ／ｍｌ 陰性コントロール（無刺激） ４１ｐｇ／ｍｌ ・マウス細胞株からのＩＬ−６産生誘導 被検サンプル添加時 Ｊ７７４．１ １２４１ｐｇ／ｍｌ ＳＴ２ ５１．７ｐｇ／ｍｌ ＮＩＨ３ ０ｐｇ／ｍｌ（検出限界以下） 陰性コントロール（無刺激） Ｊ７７４．１ ０ｐｇ／ｍｌ（検出限界以下） ＳＴ２ ０ｐｇ／ｍｌ（検出限界以下） ＮＩＨ３Ｔ３ ０ｐｇ／ｍｌ（検出限界以下） 上記の結果から、本生理活性物質は血球細胞、マクロフ
ァージ系細胞株Ｊ７７４．１および骨髄間質細胞系細胞
株ＳＴ２に作用し、ＩＬ−６産生を誘導することが明ら
かとなった。

【００５４】実施例７ ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩＬ−６産生誘導活性の測定 １）活性の測定 動物：Ｃ５７ＢＬ／６Ｎｃｒｊ（雄、７週齢）マウスを
使用した。Ｋ５６２細胞株培養上清から実施例３と同様
な方法でＶｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４ HPLC で精
製し、凍結乾燥して冷蔵保存したものを４０％アセトニ
トリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸溶液１ｍｌで溶
解した。この溶液５０μｌに０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶
液２５０μｌを加えて投与試料とした。尚、コントロー
ル投与試料としては０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を用い
た。コントロール投与群およびサンプル投与群は各群２
匹のマウスを用いた。各投与試料０．１ｍｌをマウス尾
静脈から投与し、投与２時間後にエーテル麻酔下で下行
大静脈から採血し、血清を調製した。血清中のＩＬ−６
濃度はＥＬＩＳＡ法（ＥＮＤＯＧＥＮ社製）で測定し
た。

【００５５】２）結果 血清中のＩＬ−６濃度は以下の通りであった。 コントロール投与群 二匹とも０ｐｇ／ｍｌ（検出限界以下） 被検サンプル投与群 ３２４ｐｇ／ｍｌ、３６０ｐｇ／ｍｌ 上記の結果、本生理活性物質はin vivo においてもＩＬ
−６産生を誘導することが明らかとなった。

【００５６】実施例８ 当該生理活性物質をコードするｃＤＮＡのクローニング （１）ＰＣＲプライマーの作製 実施例５の部分アミノ酸配列の中から、Ｎ末端アミノ酸
配列よりＮＨ2 −Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｕをコードし得るヌクレオチド配列に基づき次のミッ
クスオリゴヌクレオチドを作製した（（株）サワディー
・テクノロジー社に依頼）。 ＳＢ Ｓ２ ５′ＧＣ（ＡＧＴＣ）ＡＡ（ＡＧ）ＧＧ
（ＡＧＴＣ）ＡＡ（ＴＣ）ＡＡ（ＴＣ）ＧＡ（ＴＣ）Ｇ
Ａ３′ また、内部アミノ酸配列ＣＮ−１よりＮＨ2 −Ｌｙｓ−
Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌをコ
ードし得るヌクレオチド配列の相補鎖に相当する次のミ
ックスオリゴヌクレオチドを作製した（（株）サワディ
ー・テクノロジー社に依頼）。 ＳＢ Ａ２１ ５′ＡＣ（ＡＧＴＣ）ＧＣ（ＴＣ）ＴＧ
（ＴＣ）ＴＴ（ＡＧＴ）ＡＴ（ＡＧ）ＴＧ（ＴＣ）ＴＴ
３′

【００５７】（２）ＰＣＲ 実施例２より本生理活性物質の産生が検出されたマイコ
プラズマ感染ＨＵＴ７８細胞ｐｏｌｙＡ+ ＲＮＡより、
ＴｉｍｅＳａｖｅｒ^TMｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｋｉｔ（ファルマシア社製）を使用し、添付の説明書に
従った方法によって二本鎖ｃＤＮＡを合成した。フェノ
ール／クロロホルム抽出による除蛋白後、エタノール沈
澱によってｃＤＮＡを回収し、５０マイクロリットルの
ＴＥ緩衝液（トリス塩酸１０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、
ｐＨ８．０）に溶解してＰＣＲの鋳型として用いた。
（１）で述べたミックスオリゴヌクレオチドと鋳型を用
いて、以下の組成の反応混合液でＲＣＲを行った。 鋳型ｃＤＮＡ １マイクロリットル ＳＢ Ｓ２オリゴヌクレオチド １００ｐｍｏｌ ＳＢ Ａ２１オリゴヌクレオチド １００ｐｍｏｌ ｄＮＴＰS 各々の最終濃度 ０．２ｍＭ Ｔａｑポリメラーゼ １．２５Ｕ １０×緩衝液 ５マイクロリットル 滅菌水にて全量を５０マイクロリットルにした。 ＰＣＲは９４℃で２分変性させた後、９４℃で１分（変
性）、４８℃で１分（アニーリング）、７２℃で１分
（伸長）というサイクルを３２回行い、さらに７２℃で
７分伸長反応を行った。

【００５８】（３）ＰＣＲ産物の解析 ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動し、約９００ｂａｓｅ
ｐａｉｒのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。
このＤＮＡ断片をｐＣＲＴＭＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社製）にＴＡクローニング法（Ｍａｒｃｈｕ
ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１
９，１１５４．１９９０）によってサブクローニングし
た。この断片が組み込まれたプラスミドをアルカリ−Ｓ
ＤＳ法（Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉ
ｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によって調製し、これを
鋳型としてＰＲＩＳＭ^TMＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｍｉｘ
（パーキンエルマー社製）を使用した。サイクル塩基配
列決定法（Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によっ
て塩基配列を決定した。その結果、この断片が当該生理
活性物質をコードするｃＤＮＡの部分断片であることを
確認した。

【００５９】（４）プラークハイブリダイゼーション a) マイコプラズマｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡの調製 マイコプラズマ感染ＨＵＴ７８細胞培養液を７６０ｇで
１０分間遠心し、上清を１００００ｇ、２０分間遠心し
て沈澱にマイコプラズマ菌体を回収した。これに２．７
ｍｌのｓａｌｉｎｅ ＥＤＴＡ溶液（ＮａＣｌ １００
ｍＭ，ＥＤＴＡ２５ｍＭ、トリス塩酸 ５０ｍＭ ｐＨ
８．０）、０．３ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液、１５マイク
ロリットルのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２０ｍｇ／ｍ
ｌ）溶液を加え、攪拌しながら５５℃で一晩インキュベ
ートした。フェノール／クロロホルム抽出による除蛋白
を２回行った後、エタノール沈澱によってｇｅｎｏｍｉ
ｃ ＤＮＡを回収した。

【００６０】b) ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡの部分分解 １００マイクログラムのｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを８０
０ｕｎｉｔのＸｂａＩ（宝酒造社製）とともに３７℃で
３時間インキュベートし、フェノール／クロロホルム抽
出、エタノール沈澱を行って２００マイクロリットルの
ＴＥ緩衝液に溶解した。新細胞工学実験プロトコール
（秀潤社、ｐ３０−）に従って作製した１０％〜４０％
ショ糖密度勾配にｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ部分分解物を
重層し、２８０００ｒｐｍで２０時間、２０℃で遠心し
た。得られた画分を鋳型として、前記（２）と同様のＰ
ＣＲを行い、ＰＣＲ産物が７ｋ〜２０ｋｂｐの画分に認
められることを確認した上で、約１２ｋｂｐの画分をラ
イゲーションに使用した。

【００６１】c) ライゲーションとｉｎ ｖｉｖｏパッ
ケージング １．５マイクログラムのλＤＡＳＨ ＩＩ ＤＮＡを３
０ｕｎｉｔのＸｂａＩ（宝酒造（株）社製）で３７℃で
３時間消化し、λＤＡＳＨ ＩＩ／Ｘｂａｌａｒｍを調
製した。ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）社
製）を用いて、約３００ｎｇのλＤＡＳＨ ＩＩ／Ｘｂ
ａ Ｉ ａｒｍ ＤＮＡと前記（４）のb) で得られた
１２ｋｂｐ ＤＮＡ画分をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ
によって連結した。ｉｎ ｖｉｖｏパッケージングはＧ
ｉｇａｐａｃｋ^TM Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
製）を用いて行い、Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌにはＰ２ＰＬＫ
１７を使用した。

【００６２】(4) プラークハイブリダイゼーションによ
るスクリーニング ＣｈｕｒｃｈとＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１９９１−１
９９５，１９８４）に従って行った。前記（４）のc)で
作製した遺伝子ライブラリーをＬＢ寒天培地上に蒔き、
生じたプラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋フィルター（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ社製）に移した。フィルターを０．２Ｍ
ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌをしみこませた３ＭＭ濾
紙の上に５分間放置し、アルカリ変性を施した。前記
（３）で得られた約９００ｂｐのｃＤＮＡ断片をランダ
ムプライマー法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１３７，２６６，１９８４）により³²Ｐ−ＣＴＰで
標識し、これをプローブとしてハイブリダイゼーション
溶液（５０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、５×
ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ，１０％デキストラン硫酸、
１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ）中４２℃で一
晩インキュベートすることによりハイブリダイゼーショ
ンを行った。陽性クローンのファージ懸濁液からファー
ジＤＮＡを回収し、ＥｃｏＲＩ消化し、得られた断片を
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲ Ｉ
ｓｉｔｅに連結した。

【００６３】(5) シークエンス ＡＢＩＰＲＩＳＭ ^TMＤｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ Ｋｉｔを用いて全塩基配列（配列表の配列番号１
の塩基配列）を決定した。

【００６４】実施例９ 遺伝子組換え体の発現系構築 マイコプラズマでは一般的な遺伝子コドンと異なる。例
えば、TGA の配列は一般的にはストップコドンである
が、マイコプラズマではTrp と翻訳される。そのため、
本生理活性物質の遺伝子をそのままで大腸菌細胞や哺乳
類細胞に発現させることはできない。そこで、本生理活
性物質のN 末端アミノ酸配列から３ヵ所のトリプトファ
ンをコードしている塩基配列のTGA をTGG の一般的なコ
ドンに変えて、本生理活性物質の部分蛋白質を発現させ
た。

【００６５】（１）DNA 断片の作製 この生理活性物質のN 末端アミノ酸から３ヵ所のトリプ
トファンをコードしているTGA の塩基配列をTGG に変更
するために、TGG の配列を含むプライマーを合成してPC
R でTGG に塩基置換したDNA 断片を調製した。 a) PCRプライマーの作製 PCR プライマーはトリプトファンをコードしているTGA
のコードをTGG に変更した配列を含む、以下の４種類を
用いた。なお、プライマーの合成はサワディー・テクノ
ロジー社で行った。 Sb PCR1S： 5>ACA GTG CAC TTT CAG CCG GAC ACA AAA TTT GGG TAC TTA<3 Sb PCR1A： 5>TTA ATA TTG AAT TGT AAT GAG TAG AAC CAC TTG TAC<3 Sb PCR2S： 5>TCA ATA TTA AAG AAT CTG CAT TTA CAA CAG GCT ATG CAA<3 Sb PCR2AB ： 5>TAA GAT CTA ATA ATG TTT CAT AAA CAG C<3

【００６６】b) PCR pBluescript にこの生理活性物質の部分DNA を組み込ん
だpBlueTIO1 を鋳型とし、Sb PCR1SとSb PCR1Aのプライ
マーの組み合わせとSb PCR2SとSb PCR2AB のプライマー
の組み合わせでそれぞれPCR を行った。PCR の反応は以
下の組成の混合液で行った。 pBlueTI01 1 μl (100ng) X10 PCR Buffer 5 μl dNTP 4 μl primer (20μM) 5 μl primer (20μM) 5 μl Taq Polymerase 0.25 μl 蒸留水 30 μl PCR 反応は９４℃１分間、６０度１分間、７２℃３分間
の順序に加熱し、このサイクルを３５回反復したのち、
７２℃８分間加熱した。

【００６７】c)アガロース電気泳動によるDNA 断片の分
析 PCR で増幅したDNA 断片をアガロース電気泳動で分析し
たところ、Sb PCR1SとSb PCR1Aのプライマーの組み合わ
せでは約１８０bp、 Sb PCR2S とSb PCR2AB のプライマ
ーの組み合わせでは約４７０bpのDNA 断片が得られた。
これらのバンドを切り出して、QIAEX II gel extractio
n Kit でDNA を回収し、４０μl のTEに溶解した。

【００６８】d) 制限酵素による切断 PCR1S とSb PCR1Aのプライマーの組み合わせで得られた
約１８０bpのDNA 断片はApaLI とSspIで切断し、Sb PCR
2SとSb PCR2AB のプライマーの組み合わせで得られた約
４７０bpのDNA 断片はBgl IIとSspIで切断し、それぞれ
のDNA 断片をアガロース電気泳動して上記と同様の方法
でDNA 断片を回収した。また、pBlueITO1 はBgl IIとBa
m HIで切断し、アガロース電気泳動でBgl IIとBam HIで
切断されたPlasmid を回収した。このPlasmid はBAP 処
理して、pBlueITO1(Bgl II /Bam HI) とした。一方、 p
BlueITO1をBgl IIとBam HIで切断して得られた約1.2kbp
のDNA 断片はさらにApa LIで切断して３５０bpのDNA 断
片を回収して、BamHI/Apa LIフラグメントとした。

【００６９】e) Ligation d)で得られた180 bpの制限酵素切断DNA 断片、470 bpの
制限酵素切断DNA 断片、pBlueITO1(Bgl II / Bam HI)お
よびBamHI / Apa LIフラグメントをTaKaRa ligation ki
t ver.1 でligationした。得られたligation溶液でJM10
9 株をtransformationし、subcloningしてPlasmid を回
収した。これらPlasmid で目的とするLigationができて
いるかどうかをBam HIの制限酵素で消化して確認した。

【００７０】f) 塩基配列の確認 得られたPlasmid に目的とするTGA をTGG に置換した本
生理活性物質のDNA 断片が挿入されているかどうかを37
3A DNA Sequencerで解析した。その結果、目的とする塩
基置換が挿入されたDNA 断片が得られた。しかし、２つ
の塩基の欠失が認められたことから、PCR を用いてこれ
ら欠失を直して得られたPlasmid をpBlueITO3Gとした。

【００７１】（２） 遺伝子組み換え体の発現系構築 遺伝子組換え技術による当該生理活性物質の発現を次の
ようにして行った。 a) ＰＣＲによるＤＮＡ断片の作製 （１）によって得られた、本生理活性物質遺伝子は翻訳
開始ｃｏｄｏｎを含まず、また、哺乳動物細胞での分泌
に必須なシグナル配列を有しない。そこで、当該生理活
性物質の翻訳と分泌を目的にｃ−ｋｉｔ ｌｉｇａｎｄ
遺伝子のシグナル配列と当該生理活性物質の融合遺伝子
をＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲに用いたプライマー
を以下に示す。 ＫＬＵ１ ５′−ＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣ ＡＣＡＡＡＣＴＴＧ−３′ ＫＬｘＳＢＬ１ ５′−ＴＧＴＴＴＣＣＡＣＡＧＧＴＴＴＴＧＡＣＡＡＧＡＧＧ ＡＴＴＡＡ−３′ ＫＬｘＳＢＵ１ ５′−ＴＧＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＡＡＣＡＡＣＧＡＴ ＧＡＡＴＣ−３′ ＳｂＰＣＲ１Ａ ５′−ＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＧＡＧＴＡＧＡ ＡＣＣＡＣＴＴＧＴＡＣ−３′

【００７２】これらのプライマーを３９４型ＤＮＡシン
セサイザー（パーキンエルマー）にて合成し、Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｃａｒｔｒｉｄｇｅにて精製した。１回目のＰＣＲ反応
液Ａ．５０μｌの組成は、２００ｎｇ ｐＢｌｕｅＴＩ
Ｏ３Ｇ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、
０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、そ
れぞれ２００ｎＭのＫＬｘＳｂＵ１およびＳｂＰＣＲ１
Ａを含む。１回目のＰＣＲ反応液Ｂ．５０μｌの組成
は、３００ｎｇｐＣＨＯ２／ｓｍＫＬ、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．２５ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｕ Ｅｘ．Ｔａｑ
（宝酒造）、それぞれ２００ｎＭのＫＬＵ１およびＫＬ
ｘＳｂＬ１を含む。これを５０μｌの鉱油で覆った後、
８５℃で１分間保温した後２．５ｕ Ｅｘ．Ｔａｑ（宝
酒造）を添加し、９６℃１分間、６０℃１分間、７２℃
２分間の順序で加熱し、このサイクルを３０回反復した
のち、さらに７２℃で１０分間加温した。２回目のＰＣ
Ｒ反応液５０μｌの組成は、１回目のＰＣＲ反応液Ａ．
およびＢ．をそれぞれ１μｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．３）、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、１．５
ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｕ Ｅｘ．Ｔａｑ（宝酒
造）、それぞれ２００ｎＭのＫＬＵ１およびＳｂＰＣＲ
１Ａを含む。これを５０μｌの鉱油で覆った後、８５℃
で１分間保温した後２．５ｕ Ｅｘ．Ｔａｑ（宝酒造）
を添加し、９６℃１分間、５４℃１分間、７２℃２分間
の順序で加熱し、このサイクルを３０回反復したのち、
さらに７２℃で１０分間加温した。

【００７３】（２）アガロース電気泳動によるＤＮＡ断
片の分析 ＰＣＲにて増幅したＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気
泳動にて分析し、目的のサイズのＤＮＡ断片を確認し
た。ＰＣＲ反応液をＱＩＡｐｒｅｐ−ｓｐｉｎ ＰＣＲ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）
にて精製し、エタノール沈澱を行った後１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し
たものおよび６４０ｎｇのｐＵＣ１９（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（宝酒造）を含む溶液中で３７℃２時間消化した。一
方、３２０ｎｇのｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
および２４００ｎｇのｐＢｌｕｅＴＩＯ３Ｇを１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）を含
む溶液中で３７℃２時間消化した。得られた消化物をア
ガロースゲル電気泳動にて分析した。目的のサイズのＤ
ＮＡ断片を確認し、ゲルより切り出してＱＩＡＥＸ Ｇ
ｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）に
て精製した（それぞれＫＬＳｂｄＣ ＨｉｎｄＩＩＩ／
ＢａｍＨＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｐＵＣ１９ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ／ＢａｍＨＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｐＣＥＰ４
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＳＢｄ
Ｎ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ）。

【００７４】（３）クローンの作製 ＫＬＳｂｄＣ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔおよびｐＵＣ１９ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨ
Ｉ ｆｒａｇｍｅｎｔとｐＣＥＰ４ ＨｉｎｄＩＩＩ／
ＸｈｏＩ ｆｒａｇｍｅｎｔおよびＳＢｄＮ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ／ＸｈｏＩ ｆｒａｇｍｅｎｔをそれぞれＴ４Ｄ
ＮＡ ｌｉｇａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ）により連結し、大腸
菌ＪＭ１０９（宝酒造、コンピテントセル）を形質転換
し、ＬＢＡ−Ａｍｐプレートに播種し、３７℃にて終夜
培養した。各々８個のコロニーをつり上げ、５ｍｌのＬ
Ｂにて３７℃にて終夜培養した。培養液からプラスミド
をＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｋｉｔ
にて調製し、一部をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩに
て消化してアガロースゲル電気泳動にて分析し、目的の
サイズのＤＮＡ断片が挿入されたクローンを確認した
（それぞれｐＵＣ／ＫＬＳｂｄＣ、ｐＣＥＰ４／Ｓｂｄ
Ｎ）。ｐＵＣ／ＫＬＳｂｄＣの挿入配列をＤＮＡ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔおよび３７３Ａ型ＤＮＡシー
ケンサー（パーキンエルマー）を用いたサイクルシーク
エンス法にて決定し、クローン８が目的の配列を有する
ことを確認した。ｐＵＣ／ＫＬＳｂｄＣクローン８およ
びｐＣＥＰ４／ＳｂｄＮクローン２を１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１
ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭ ＮａＣｌ、制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩで消化した後１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１ｍＭジチオスレイトールにて２倍希釈して制限
酵素ＫｐｎＩで消化した。得られた消化物をアガロース
ゲル電気泳動にて分析した。目的のサイズのＤＮＡ断片
を確認し、ゲルより切り出してＱＩＡＥＸ Ｇｅｌ Ｅ
ｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製し
た（それぞれＫＬＳｂｄＣ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ
ｆｒａｇｍｅｎｔおよびｐＣＥＰ４／ＳｂｄＮ Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ）。ＫＬＳｂ
ｄＣ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ ｆｒａｇｍｅｎｔお
よびｐＣＥＰ４／ＳｂｄＮ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ
ｆｒａｇｍｅｎｔをＴ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（Ｇｉ
ｂｃｏ）により連結し、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造、コ
ンピテントセル）を形質転換し、ＬＢＡ−Ａｍｐプレー
トに播種し、３７℃にて終夜培養した。各々８個のコロ
ニーをつり上げ、５ｍｌのＬＢにて３７℃にて終夜培養
した。一方、ＬＢ懸濁液を蒸留水にて希釈し、ＳｂＰＣ
Ｒ１ＡおよびＫＬＵ１ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行
い、アガロースゲル電気泳動にて分析し、クローン１、
２、３、４、６および７に目的のサイズのＤＮＡ断片が
挿入されたことを確認した（ｐＣＥＰ４／ＫＬＳｂ）。

【００７５】（４）発現ベクターと融合遺伝子の連結 クローン１の培養液からプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ
ｓｐｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｋｉｔにて調製し、Ｂａｍ
ＨＩにて消化してアガロースゲル電気泳動にて分析し、
ＫＬＳｂ融合遺伝子を切り出し、ＱＩＡＥＸ Ｇｅｌ
Ｅｘｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製
した。一方、同様に調製したｐＣＯＳ１ＢａｍＨＩ ｆ
ｒａｇｍｅｎｔをアルカリフォスファターゼ（宝酒造）
処理し、ＫＬＳｂ融合遺伝子とＴ４ＤＮＡ ｌｉｇａｓ
ｅ（Ｇｉｂｃｏ）により連結し、大腸菌ＪＭ１０９（宝
酒造、コンピテントセル）を形質転換し、ＬＢＡ−Ａｍ
ｐプレートに播種し、３７℃にて終夜培養した。各々８
個のコロニーをつり上げ、５ｍｌのＬＢにて３７℃にて
終夜培養した。培養液からプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ
ｓｐｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｋｉｔにて調製し、Ｘｈｏ
Ｉで消化して目的のサイズのＤＮＡ断片が挿入されたク
ローンをアガロースゲル電気泳動にて確認した（ｐＣＯ
Ｓ／ＫＬＳｂ）。

【００７６】（５）融合遺伝子のＣＯＳ−７細胞への導
入および発現 以上のようにして得られたＫＬ−Ｓｂ融合遺伝子発現プ
ラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ法によりＣＯＳ
−７に導入した。すなわち、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ
Ｅ試薬１０ｍｌとｐＣＯＳ１またはｐＣＯＳ／ＫＬＳｂ
３ｍｇを０．６ｍｌのＤ−ＭＥＭ中で室温４５分間混
合して複合体を形成させた。一方、４枚の２５Ｔフラス
コに７０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ程度に培養したＣＯＳ−
７細胞をＤ−ＭＥＭで洗浄後、２．４ｍｌのＤ−ＭＥＭ
を添加し、複合体０．６ｍｌを添加して３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂ 下８時間培養した後、２ｍｌの５％または２５％Ｄ
−ＭＥＭを添加してさらに３日間培養した。

【００７７】実施例１０ 遺伝子組み換え体のＩＬ−６誘導活性 （１）活性の測定 実施例９でｃ−ｋｉｔ ｌｉｇａｎｄ遺伝子のシグナル
配列と当該生理活性物質の融合遺伝子を組み込んだＣＯ
Ｓ−７細胞をＳＤＳで可溶化し、遠心後の上清を被検サ
ンプルとしてＩＬ−６誘導活性を測定した。マウスマク
ロファージ系細胞株Ｊ７７４．１細胞を１０％ウシ胎児
血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁
し、２４ｗｅｌｌ細胞培養用プレート（ファルコン）に
ｗｅｌｌあたり１×１０⁵ 個蒔き、被検サンプルを添加
して２０時間ＣＯ₂ インキュベーター内で培養した。培
養終了後、培養上清を分取し、含有するＩＬ−６濃度を
ＥＬＩＳＡ（ｍｕｒｉｎｅ ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡＫｉ
ｔ，ＥＮＤＯＧＥＮ社）で測定した。

【００７８】（２）結果 図１に示すように、ベクターのみを導入したｍｏｃｋ
ｃｏｎｔｒｏｌに比べて、本生理活性物質をコードする
遺伝子を導入した細胞の可溶化物には、顕著なＩＬ−６
誘導活性を認めた。

【００７９】上記したように、本発明の遺伝子は、配列
表の配列番号６のアミノ酸配列を有し、かつ炎症性サイ
トカイン誘導因子の機能を有するポリペプチドをコード
する遺伝子であるが、本発明は、配列表の配列番号１に
記載した塩基配列、またはその一部からなる塩基配列を
有し、その塩基配列の１個または複数個の残基が置換、
欠失、挿入又は付加の少なくとも一つがなされており、
かつ、炎症性サイトカイン誘導因子の機能またはそれと
同等の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を
含むものである。すなわち、本発明の遺伝子は、炎症性
サイトカイン誘導因子の活性／機能またはそれと同等の
活性／機能を有するポリペプチドをコードするものであ
れば、上記塩基配列の１部の残基が置換、欠失、挿入ま
たは付加の少なくとも一つがなされていてもよく、当該
塩基配列の改変は、適宜の方法ですることが可能であ
り、その方法は特に限定されない。また、本発明の方法
により製造される上記遺伝子組換え体により発現された
炎症性サイトカイン誘導ポリペプチドは、天然由来の他
の蛋白質を含有しない遺伝子組換え体の発現蛋白として
の特性を有するものであり、医薬品の有効成分として有
用である。

【００８０】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明は、配列表
の配列番号２−５の少なくとも一つのアミノ酸配列を有
し、炎症性サイトカインを誘導する機能を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子、当該遺伝子の組換え体によ
り発現された炎症性サイトカイン誘導因子ポリペプチド
の製造方法等に係り、本発明によれば、以下の効果が得
られる。 （１）炎症性サイトカイン誘導因子の活性／機能を有す
るポリペプチドをコードする全長遺伝子およびその改変
遺伝子を提供することができる。 （２）上記遺伝子を含有する組換えＤＮＡ、当該組換え
ＤＮＡを含有するベクター、当該ベクターで形質転換さ
れてなる細胞を提供することができる。 （３）上記遺伝子の組換え体により発現された炎症性サ
イトカイン誘導因子ポリペプチドの製造方法、および当
該遺伝子組換え体の発現ポリペプチドからなり、天然由
来の他の蛋白質を含有しない炎症性サイトカイン誘導因
子を提供することができる。 （４）上記遺伝子にハイブリダイズする合成オリゴヌク
レオチドまたはプライマー、上記ポリペプチドに特異的
に結合する抗体またはその断片、上記遺伝子組換え体の
発現ポリペプチドからなる炎症性サイトカイン誘導因子
を有効成分として含有する医薬組成物を提供することが
できる。 （５）上記発現ポリペプチドの炎症性サイトカイン誘導
因子としての機能を阻害する化合物のスクリーニング方
法およびその化合物を提供することができる。 （６）マイコプラズマ感染による過剰な免疫応答の抑
制、各種の血小板減少症の治療等に有用である。

【００８１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１６９０ 配列の型：核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 鎖の数：二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ） トポロジー：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ） 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：２８６ ．．１５６９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTTATCTTTT TAGTTGTTAA TTCAGTTAAA AATGTGACGC AATTTTCAAT TTTAATATAA 60 AAATTAGTAA AAAATTTTAA TTTTTTTTAA TCTCATATTA TTAATAACAA ATTTAATATT 120 GCCACATTAT AATTTTGCAC ATTATAAACT AAAAAATGAA ATCACAAAAC AAATTGCAAT 180 TTTTTCTTAT TTTTTGCAAA ATTTGCCAAT AAAAACCAAT TTTTGAGATA TTTAAGCAAA 240 ATATCTATAT AATGTTCAAT ATACAATTAA AAATAAGGAG ATTATATGAA AAAGTCAAAA 300 AAAATTTTAT TAGGATTGAG TCCTATTGCT GCTATTCTTC CTGCAGTAGC TGTTTCTTGT 360 GGAAACAACG ATGAATCCAA TATTTCATTC AAAGAGAAAG ATATTAGTAA ATATACCACA 420 ACAAATGCTA ATGGAAAACA AGTTGTTAAA AACGCTGAAT TGTTAAAATT GAAACCAGTT 480 CTTATTACAG ATGAAGGTAA AATTGATGAT AAATCATTTA ACCAATCAGC TTTTGAAGCT 540 TTAAAAGCTA TAAATAAACA AACTGGTATT GAAATTAACA ATGTTGAACC TAGCTCAAAC 600 TTTGAAAGTG CTTACAACAG TGCACTTTCA GCCGGACACA AAATTTGAGT ACTTAATGGC 660 TTCAAACACC AACAATCTAT TAAACAATAC ATTGATGCTC ACAGAGAAGA ACTTGAAAGA 720 AATCAAATCA AAATCATTGG TATCGACTTT GATATTGAAA CAGAGTACAA GTGATTCTAC 780 TCATTACAAT TCAATATTAA AGAATCTGCA TTTACAACAG GCTATGCAAT TGCAAGTTGA 840 TTAAGTGAAC AAGATGAAAG TAAAAGAGTT GTTGCATCAT TTGGTGGAGG TGCATTCCCA 900 GGTGTTACAA CATTTAACGA AGGTTTTGCA AAAGGTATTC TATACTACAA CCAAAAACAT 960 AAATCAAGTA AAATTTACCA CACATCACCT GTTAAATTAG ACTCAGGTTT TACTGCTGGT 1020 GAAAAAATGA ACACTGTTAT TAATAATGTT TTATCTTCAA CACCAGCTGA TGTTAAATAC 1080 AACCCACATG TTATCTTATC TGTTGCTGGA CCTGCTACAT TTGAAACTGT AAGATTAGCA 1140 AACAAAGGTC AATATGTAAT TGGTGTTGAC TCAGACCAAG GCATGATTCA AGACAAAGAC 1200 AGAATTCTTA CATCAGTTCT AAAACACATT AAACAAGCTG TTTATGAAAC ATTATTAGAT 1260 CTTATTCTTG AAAAAGAAGA AGGATATAAA CCATATGTAG TTAAAGACAA AAAAGCAGAC 1320 AAAAAATGAA GCCACTTTGG AACTCAAAAA GAAAAATGAA TCGGTGTCGC AGAAAACCAC 1380 TTCTCAAATA CAGAAGAACA AGCAAAAATT AATAACAAAA TTAAAGAAGC AATTAAAATG 1440 TTTAAAGAAT TACCAGAAGA TTTCGTTAAA TATATTAATA GTGACAAAGC TTTAAAAGAT 1500 GGTAATAAAA TTGACAATGT TAGTGAAAGA TTAGAAGCAA TTATTTCTGC TATTAACAAG 1560 GCAGCAAAAT AATTAATCAA AAAAATGCTG GAAAATATCC AGCATTTTTT ATTTTAAATA 1620 TGAAAAAAGT ATATTTTTTT GTTAATTTTT GAAGAAATTA GATAAAACAG TTTTTCCGTT 1680 TTTGTCTTCA 1690 配列番号：２ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ） トポロジー：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ） 配列の種類：ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：１ ．．２４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Xaa Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Tyr Thr Thr Thr Asn Ala 20 配列番号：３ 配列の長さ：４０ 配列の型：アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ） トポロジー：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ） 配列の種類：ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：１ ．．４０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Ile Gln Asp Lys Asp Arg Ile Leu Thr Ser Val Leu Lys His Ile Lys 1 5 10 15 Gln Ala Val Tyr Glu Thr Leu Leu Asp Leu Ile Leu Glu Lys Xaa Xaa 20 25 30 Gly Tyr Lys Pro Tyr Val Val Lys 35 40 配列番号：４ 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ） トポロジー：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ） 配列の種類：ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：１ ．．３５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Phe Lys Glu Leu Pro Glu Asp Phe Val Lys Tyr Ile Asn Ser Asp Lys 1 5 10 15 Ala Leu Lys Asp Gly Asn Lys Ile Asp Asn Val Ser Glu Arg Leu Glu 20 25 30 Ala Ile Ile 35 配列番号：５ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ） トポロジー：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ） 配列の種類：ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：１ ．．２８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Asn Thr Val Ile Asn Asn Val Leu Ser Xaa Thr Pro Ala Asp Val Lys 1 5 10 15 Tyr Asn Pro His Val Ile Leu Xaa Val Ala Gly Pro 20 25 配列番号：６ 配列の長さ：４２８ 配列の型：アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ） トポロジー：直鎖状（ｌｉｎｅａｒ） 配列の種類：ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：１ ．．４２８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Met Lys Lys Ser Lys Lys Ile Leu Leu Gly Leu Ser Pro Ile Ala Ala 1 5 10 15 Ile Leu Pro Ala Val Ala Val Ser Cys Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn 20 25 30 Ile Ser Phe Lys Glu Lys Asp Ile Ser Lys Tyr Thr Thr Thr Asn Ala 35 40 45 Asn Gly Lys Gln Val Val Lys Asn Ala Glu Leu Leu Lys Leu Lys Pro 50 55 60 Val Leu Ile Thr Asp Glu Gly Lys Ile Asp Asp Lys Ser Phe Asn Gln 65 70 75 80 Ser Ala Phe Glu Ala Leu Lys Ala Ile Asn Lys Gln Thr Gly Ile Glu 85 90 95 Ile Asn Asn Val Glu Pro Ser Ser Asn Phe Glu Ser Ala Tyr Asn Ser 100 105 110 Ala Leu Ser Ala Gly His Lys Ile Trp Val Leu Asn Gly Phe Lys His 115 120 125 Gln Gln Ser Ile Lys Gln Tyr Ile Asp Ala His Arg Glu Glu Leu Glu 130 135 140 Arg Asn Gln Ile Lys Ile Ile Gly Ile Asp Phe Asp Ile Glu Thr Glu 145 150 155 160 Tyr Lys Trp Phe Tyr Ser Leu Gln Phe Asn Ile Lys Glu Ser Ala Phe 165 170 175 Thr Thr Gly Tyr Ala Ile Ala Ser Trp Leu Ser Glu Gln Asp Glu Ser 180 185 190 Lys Arg Val Val Ala Ser Phe Gly Gly Gly Ala Phe Pro Gly Val Thr 195 200 205 Thr Phe Asn Glu Gly Phe Ala Lys Gly Ile Leu Tyr Tyr Asn Gln Lys 210 215 220 His Lys Ser Ser Lys Ile Tyr His Thr Ser Pro Val Lys Leu Asp Ser 225 230 235 240 Gly Phe Thr Ala Gly Glu Lys Met Asn Thr Val Ile Asn Asn Val Leu 245 250 255 Ser Ser Thr Pro Ala Asp Val Lys Tyr Asn Pro His Val Ile Leu Ser 260 265 270 Val Ala Gly Pro Ala Thr Phe Glu Thr Val Arg Leu Ala Asn Lys Gly 275 280 285 Gln Tyr Val Ile Gly Val Asp Ser Asp Gln Gly Met Ile Gln Asp Lys 290 295 300 Asp Arg Ile Leu Thr Ser Val Leu Lys His Ile Lys Gln Ala Val Tyr 305 310 315 320 Glu Thr Leu Leu Asp Leu Ile Leu Glu Lys Glu Glu Gly Tyr Lys Pro 325 330 335 Tyr Val Val Lys Asp Lys Lys Ala Asp Lys Lys Trp Ser His Phe Gly 340 345 350 Thr Gln Lys Glu Lys Trp Ile Gly Val Ala Glu Asn His Phe Ser Asn 355 360 365 Thr Glu Glu Gln Ala Lys Ile Asn Asn Lys Ile Lys Glu Ala Ile Lys 370 375 380 Met Phe Lys Glu Leu Pro Glu Asp Phe Val Lys Tyr Ile Asn Ser Asp 385 390 395 400 Lys Ala Leu Lys Asp Gly Asn Lys Ile Asp Asn Val Ser Glu Arg Leu 405 410 415 Glu Ala Ile Ile Ser Ala Ile Asn Lys Ala Ala Lys 420 425

【図面の簡単な説明】

【図１】遺伝子組換え技術により得られた本生理活性物
質のＩＬ−６誘導活性を示す。

【図２】本発明の炎症性サイトカイン誘導因子の機能を
有するポリペプチドをコードする遺伝子の配列（ａ：ア
デニン、ｃ：シトシン、ｇ：グアニン、ｔ：ケミン）を
示す。

【図３】本発明の炎症性サイトカイン誘導因子の機能を
有するポリペプチドをコードする第１番目から第９００
番目の遺伝子の配列（ａ：アデニン、ｃ：シトシン、
ｇ：グアニン、ｔ：ケミン）および推定アミノ酸配列
（慣用の１文字記号で表す）を示す。

【図４】本発明の炎症性サイトカイン誘導因子の機能を
有するポリペプチドをコードする第９０１番目から第１
６９０番目の遺伝子の配列（ａ：アデニン、ｃ：シトシ
ン、ｇ：グアニン、ｔ：ケミン）および推定アミノ酸配
列（慣用の１文字記号で表す）を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年１０月２４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６５】（１）ＤＮＡ断片の作製 この生理活性物質のＮ末端アミノ酸から３ヵ所のトリプ
トファンをコードしているＴＧＡの塩基配列をＴＧＧに
変更するために、ＴＧＧの配列を含むプライマーを合成
してＰＣＲでＴＧＧに塩基置換したＤＮＡ断片を調製し
た。 ａ）ＰＣＲプライマーの作製 ＰＣＲプライマーはトリプトファンをコードしているＴ
ＧＡのコードをＴＧＧに変更した配列を含む、以下の４
種類を用いた。なお、プライマーの合成はサワディー・
テクノロジー社で行った。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年９月１１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６５】（１）DNA 断片の作製 この生理活性物質のN 末端アミノ酸から３ヵ所のトリプ
トファンをコードしているTGA の塩基配列をTGG に変更
するために、TGG の配列を含むプライマーを合成してPC
R でTGG に塩基置換したDNA 断片を調製した。 a) PCRプライマーの作製 PCR プライマーはトリプトファンをコードしているTGA
のコードをTGG に変更した配列を含む、以下の４種類を
用いた。なお、プライマーの合成はサワディー・テクノ
ロジー社で行った。 Sb PCR1S： 5>ACA GTG CAC TTT CAG CCG GAC ACA AAA TTT GGG TAC TTA<3 Sb PCR1A： 5>TTA ATA TTG AAT TGT AAT GAG TAG AAC CAC TTG TAC<3 Sb PCR2S： 5>TCA ATA TTA AAG AAT CTG CAT TTA CAA CAG GCT ATG CAA TTG CAA GTT GGT TAA GTG<3 Sb PCR2AB ： 5>TAA GAT CTA ATA ATG TTT CAT AAA CAG C<3

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＢＹ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 平田 芳子 茨城県つくば市吾妻３−８−３ パレドー ル吾妻203号 (72)発明者 下中 靖 静岡県御殿場市駒門１−135 中外製薬株 式会社内 (72)発明者 樋口 正人 静岡県御殿場市駒門１−135 中外製薬株 式会社内 (72)発明者 松下 淳一 静岡県御殿場市駒門１−135 中外製薬株 式会社内

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２−５の少なくとも一
   つのアミノ酸配列を有し、炎症性サイトカインを誘導す
   る機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号６のアミノ酸配列を有
   し、かつ炎症性サイトカインを誘導する機能を有するポ
   リペプチドをコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に記載した塩基配
   列、またはその一部からなる塩基配列を有し、その塩基
   配列の１個または複数個の残基が置換、欠失、挿入又は
   付加の少なくとも一つがなされており、かつ、炎症性サ
   イトカインを誘導する機能またはそれと同等の機能を有
   するポリペプチドをコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項１−３のいずれかに記載の遺伝子
   を含有する組換えＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えDNA を含有するベ
   クター。
6. 【請求項６】 請求項５記載のベクターで形質転換され
   ている細胞。
7. 【請求項７】 請求項６記載の細胞を培養し、当該培養
   物から炎症性サイトカインを誘導する機能を有するポリ
   ペプチドを採取することを特徴とする、遺伝子組換え体
   により発現された炎症性サイトカイン誘導因子の製造方
   法。
8. 【請求項８】 請求項７記載の方法により製造された、
   遺伝子組換え体の発現ポリペプチドからなる炎症性サイ
   トカイン誘導因子。
9. 【請求項９】 請求項１−３記載の遺伝子にハイブリダ
   イズする合成オリゴヌクレオチドまたはプライマー。
10. 【請求項１０】 請求項８記載のポリペプチドに特異的
    に結合する抗体またはその断片。
11. 【請求項１１】 請求項８記載のポリペプチドの活性／
    機能の抑制を指標とすることを特徴とする、当該ポリペ
    プチドの炎症性サイトカイン誘導因子としての機能を阻
    害する化合物のスクリーニング方法。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のスクリーニング方
    法により得られた、前記ポリペプチドの炎症性サイトカ
    イン誘導因子としての機能を阻害する化合物。
13. 【請求項１３】 請求項７に記載の遺伝子組換え体の発
    現ポリペプチドからなる炎症性サイトカイン誘導因子を
    有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。