JPH02504463A - ウシのインターロイキン‐1α - Google Patents
ウシのインターロイキン‐1αInfo
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- JPH02504463A JPH02504463A JP63505132A JP50513288A JPH02504463A JP H02504463 A JPH02504463 A JP H02504463A JP 63505132 A JP63505132 A JP 63505132A JP 50513288 A JP50513288 A JP 50513288A JP H02504463 A JPH02504463 A JP H02504463A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ウシのインターロイキン−1α
主皿皇!景
本発明は、一般的には哺乳動物のサイト力イン、特に哺乳動物におけるヒトルー
1αの生物活性同族体、例えばウシのインターロイキン−1αのクローニングお
よび発現に関する。インターロイキン−1(IL−1)は免疫原および外傷性の
刺激に応答してマクロファージおよびその他のある種の細胞によって放出される
ポリペプチド類に与えられる名称であって、損傷および怒染に対して宿主応答を
開始させることを主要な役割とする。
これらのサイト力インは生物活性の複雑なスペクトルと関連している。IL−1
インターロイキン−2の放出の誘導を通して胸腺細胞の増殖を誘導する能力なら
びにBリンパ球の増殖および成熟を刺激する能力をもつ一次免疫刺激性信号であ
る。さらに、IL−1は発熱およびプラスタグランジンの生産、ならびに傷癒合
の促進と関連している。IL−1に関係する文献のレビューにはオッヘンハイム
(Oppenheim) ら、Immunol T9i?LLL7.45(
1986)、およびデュラム(Durum) ら、Ann、Rrv、Immu
nol + 3゜263 (1985)がある。
ヒトルー1の活性は2つの少し関連している蛋白質に備っており、IL−1αお
よびルー1βと名付けられている。〔マーチ(March)ら、Nature、
、115.6401985)) 、両分子は通常的31.000ダルトンの分
子量をもつより大きい前駆体として合成され、その後蛋白室分解による切断によ
ってプロセッシングされおよそ17.500ダルトンの分子量をもつ成熟型にな
る。ヒトIL−1α前駆体はIL−1の生物活性を発現するが、ヒトルー1βの
前駆体は生物学的に不活性であり、IL−1活性をもつ成熟型を提供するために
は切断される必要がある。
最近、ヒトIL−1種の両方をコードするcDNAがクローン化され、微生物で
発現され、前臨床研究および治療に使用するのに充分な量のIL−1αおよびI
L−1βの生産が可能になった。
ワクチンアジュバントおよび傷治療用組成物の構成成分として可能な治療法に利
用するという観点において、獣医学分野においてウシのIL−1蛋白質を使用す
ることは興味深い。生物学的活性量のウシIL−1蛋白質または活性同族体から
なる治療用組成物はワクチン抗原に応答して抗体の生産を増強するために、さら
に傷表皮のすみやかな癒合を促進するためにも使用することができるであろう。
光里皇塁!
本発明は組換え型ウシ比−1α蛋白質、および本質的にはウシのインターロイキ
ン1α(blL−1α)をコードする単一のオープンリーディングフレーム(o
pen reading frame)ヌクレオチド配列からなるDNAセグメ
ントを提供する。好適には、そのようなセグメントは微生物またはウィルスのオ
ペロンに起源を有する誘導可能な調節エレメントからなる組換え型転写ユニット
中で発現可能である合成遺伝子のかたちで提供される。また、本発明は前記DN
Aセグメントからなる組換え発現ベクター、組換え発現ベクターを含む微生物発
現システム、および微生物発現システムを用いた前記蛋白質調製のための方法を
も提供する。
辺二旦員星に里
第1図はウシIL−1αをコードする配列を含むcDNAクローンのヌクレオチ
ド配列を示す。
第2図は第1図に示したクローンのコード領域のヌクレオチド配列およびそれよ
り導かれるアミノ酸配列を示す。
1班皇昆豊星■皿
ウシIL−1αをコードするDNAセグメントはウシの肺胞マクロファージより
単離されたポリアデニル化RN^の逆転写によって調製されたcDNAライブラ
リーより単離された。ヒトTL−1αのコード配列の一部に相当するcDNAフ
ラグメントが慣用的なりNAパイプリダイゼーション技術によってライブラリー
をスクリーニングするために用いられた。プローブとハイブリダイゼーションす
るクローンは制限エンドヌクレアーゼ分解、アガロースゲル電気泳動、および電
気泳動したフラグメントからなるさらなるハイブリダイゼーション実験〔“サザ
ンプロット(Southernblot)”〕によって分析した。ヒトcDNA
プローブとハイブリダイゼーシヨンした数種のクローンを単離した後、1個のb
lL−1αクローンのハイブリダイゼーシッンセグメントをサブクローン化し、
慣用的技術を用いてその配列を決定した。
組換え型蛋白質を得るために、成熟型blL−1αのポリペプチド配列をコード
するcDNA配列を適切な発現ベクター内に挿入し、さらにこれを用いて大腸W
(E、coli)の適切な株を形質転換し、次いで形質転換株を組換え型転写ユ
ニットの抑制解除に好都合な条件下、培養液中で増殖させた。培養細胞を収集し
、細胞質ゾル蛋白質を抽出し、さらにウシの胸腺細胞増殖アンセイおよびネズミ
のリンパ球IL−2生産アッセイによってウシ・インターロイキン−1活性の発
現について試験した。
また、発現ベクターは他の細菌、酵母、バクテリオファージ、またはウィルスの
遺伝子に起源を含する誘導性エレメントとこれに機能しうるように連結したbl
L−1αまたは生物学的に同等な同族体をコードする合成またはcDNA由来の
DNAフラグメントから組み立てられる。適切な細胞系の形質転換またはトラン
スフェクションに次いで、そのようなベクターは組換え型蛋白質を発現させるた
めに誘導されうる。
核酸に関する態様において、本発明は本質的にウシのインターロイキン−1α(
blL−1α)をコードする単一オープンリーディングフレームのヌクレオチド
配列からなるDNAセグメントを提供する。前述のように、そのようなりNA上
セグメント、好適には、本質的に微生物またはウィルスオペロンに起源を有する
誘導性調節エレメントからなる組換え型転写ユニット中で発現する能力をもつb
IL−1αをコードする合成遺伝子からなる。
好適な態様において、DNAセグメントはcDNA配列またはそのコピーに起源
を有する少な(とも1個、任意には1個以上の配列成分からなる。そのような配
列は合成オリゴヌクレオチドの組み合わせによって調製したDNA配列によって
連結または結合される場合もある。例示的配列には第2図に示したポリペプチド
配列のアミノ酸120−268をコードするヌクレオチド配列と実質的に相同な
配列が含まれる。任意には、コード配列は120番目のセリンのすぐ前に1個以
上のさらなるアミノ酸をコードするコドン、例えばリーディングフレーム中でヌ
クレオチド配列と連結されたグルタミン残基を指定するコドンまたはメチオニン
を指定するN末端ATGコドン、を含む場合もある。コードの縮重のため、同一
のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にはいろいろの異なる配列が存在
しうる;例示的なりNAの実施!!様の1つに第2図のヌクレオチド配列360
−804に相当するそれがある。また、本発明は任意の前述のDNAセグメント
からなる組換え型発現ベクターを提供する。ベクターは以下により詳細に記載す
るような調節領域を含む。
方法に関する観点において、本発明は組換え蛋白質の発現を可能にする条件下で
適切な宿主/ベクター発現システムを培養することからなる精製rblL 1
αおよびその同族体の調製方法を提供する。
蛋白質に関する実施態様において、本発明は内因性物質の混入ガくなくかつ任意
には結合された天然型のグリコジル化を伴わない実質的に均質なりIL−1αに
相当するポリペプチドを提供する。そのような蛋白質は本発明のDNAによって
コードされた蛋白質に相当し、その1つの実施態様としてN末端メチオニル化b
IL−1αが含まれる0組成物および使用方法に関する観点において、本発明は
、有効量の本発明のいずれかのblL−α蛋白質および適切な希釈剤またはキャ
リアーからなるワクチンアジュバント組成物、ならびに有効量の前述のいずれか
の組成物を投与することからなるウシ哺乳動物において抗原に対する免疫応答を
増強するための方法を提供する。さらには、治療上有効な量の本発明のいずれか
のblL−α蛋白質および適切な希釈剤またはベヒクルからなる創傷治療用組成
物、ならびに治療上有効な量のそのような組成物を投与することからなるウシ哺
乳動物における創傷癒合を促進するための方法が提供される。その他に免疫を刺
激するような使用法および組成物もまた考えら“ウシのインターロイキン−1α
”および’blL−1α”とは、IL−2の放出を誘導することを通してウシの
胸腺細胞の増殖を誘導すること、ならびにウシのBリンパ球の増殖および成熟を
刺激することを含む生物学的特徴をもつウシの内因性分泌蛋白質を指す、ウシI
L−1αのヒト同族体に観察される生物学的特徴にもまたプロスタグランジン生
産を誘導することおよび繊維芽細胞に対して走化性信号を与えることが含まれる
。明細書を通じて用いられる“成熟型bIL−1α”という言葉はblL−1の
生物学的活性およびアミノ酸120で始まりアミノ酸268で終わる第2図に示
したポリペプチド配列と実質的に相同なアミノ酸配列をもつblL−1α蛋白質
を意味する。
核酸およびアミノ酸配列の両方について用いる“実質的に相同な”とは、個々の
従属配列、例えは突然変異体の配列が基準配列から1個以上の置換、欠落、また
は挿入によって、その正味の影響によって基準配列と従属配列との間に悪い機能
的相違点を生じないような、変化をすることを意味する0本発明の目的のために
は、90%以上の相同性、同等の生物活性、および等しい発現特徴を有する配列
は実質的に相同であると考えられる。
相同性を測定する目的のためには、成熟型配列の切り出しは無視されねばならな
い。より低い程度の相同性、比較しうる程度の生物活性、および同等の発現特徴
を有する配列が同等物であると考えられる。一般的に、相同なりNA配列は中程
度にストリンシェドな標準的ハイブリダイゼーション条件下のクロスフ1イブリ
ダイゼーシヨンによって同定されうる。
本明細書中に用いられる“組換え(型)”とは、蛋白質が組換え型(例えば微生
物または哺乳動物)発現システムに起源を有することを意味する@ ”rbl
L lz’は組換え型′″bIL−1α”を意味する。“微生物(の)”とは
、細菌または真菌(例えば酵母)発現システム中で作られた組換え(型)蛋白質
を指す、生成物としての”組換え(型)微生物(の)”は、本質的に天然の内因
性物質を含まず、かつ結合した天然型のグリコジル化を伴わないウシの蛋白質を
意味する。m菌培養液中で発現した蛋白質はポリ多糖を含まないであろう;酵母
で発現した蛋白質は哺乳動物細菌で発現したのとは異なるグリコジル化パターン
を有するであろう。
“実質的に均質なり1L−1α”とは、例えばポリアクリルアミドゲル染色のよ
うな慣用的な手段によって検出可能な量の夾雑蛋白質を含まない精製されたb
IL−1αからなる蛋白質組成物を意味する0本明細書に開示した微生物発現シ
ステムの能力によって治療上有効な量の実質的に均質な物質を提供するために十
分な量のウシIL−1αの生産が可能になる。
” DNAセグメント”は、分離したフラグメントの形のまたはより大きなりN
A構築物の構成成分としてのDNAポリマーであって、少なくとも一度は実質的
に純粋な形で単離されたDNA、即ち内因性物質の夾雑がなく、かつ例えばクロ
ーニングベクターを使用するといったような標準的な生化学的方法によるセグメ
ントおよびその構成成分であるヌクレオチドの配列の同定、操作、および回収を
可能にする量または濃度の上記DNAに起源を有する上記DNAポリマーを指す
。そのようなセグメントは、典型的には哺乳動物に存在する翻訳されない内部配
列またはイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形で
提供される。翻訳されないDNA配列は、同DNA配列がコード領域の操作また
は発現を妨害しないオーブンリーディングフレームの下流に存在する場合がある
。“ヌクレオチド配列”とはデオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを指す
、一般的に本発明によって提供される蛋白質をコードするDNAセグメントは
cDNAフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカー、または一連のオ
リゴヌクレオチドから組み立てられ、微生物またはウィルスのオペロンに起源を
有する誘導性調節エレメントからなる組換え型転写ユニット中で発現する能力を
もつ合成遺伝子を提供する。
“組換え型発現ベクター”とは、(1)遺伝子の発現を調節する役割をもつ遺伝
子エレメントまたはエレメント類、例えばプロモーターまたはエンハンサ−1(
2)m RN Aに転写され蛋白質に翻訳される構造配列またはコード配列、お
よび(3)適切な転写開始配列および転写終止配列:の組み合わせからなる転写
ユニットを含むプラスミドを指す、好適には、酵母発現システムで使用を予定し
ている転写ユニットは宿主細胞によって翻訳された蛋白質の細胞外分泌を可能に
するリーダー配列を含む、また、リーダー配列または輸送配列なしで発現した組
換え型蛋白質はN末端にメチオニン残基を含む場合がある。その後、この残基は
発現した組換え型蛋白質から切断されてもしくは切断されないままで最終生成物
が提供される。
“組換え型発現システム”は、組換え型転写ユニットが安定に組み込まれた染色
体DNAを有しているか、または常在性プラスミドの構成成分として組換え型転
写ユニットを保持している適切な宿主微生物、例えば太盪回(E、 coli
)のような微生物または土ユ左旦l立ス セレビシアエ(S、 cerevi
siae)のような酵母、の実質的に均質な単一培養を意味する。一般的に、シ
ステムを構成する細胞は単一の先祖をもつ形質転換体の子孫である0本明細書で
定義した組換え型発現システムは発現されるべきDNAセグメントまたは合成遺
伝子に連結した調節エレメントの誘導時に異種蛋白質を発現するであろう。
blL−1αの ・ゝ のア・・セー瓜a シの の 、 迭 ア
ーセイウシのIL−1α活性は、殺したばかりの子牛の胸腺細胞の増殖を誘導す
るサンプルの能力を確認することを含む胸腺細胞の有糸分裂誘発アッセイによっ
てモニターされうる。このアッセイにおいては、およそ1.5 X 10b個の
フィコニル−ハイバック(Ficol ]−Hypaque)で精製したウシの
胸腺細胞を、サブマイトゲン(submi togen)濃度のフォトへマグル
チニン−M(PHA−M)およびbIL−1の活性について試験されるサンプル
の一連の二倍希釈物を入れた平底のミクロタイタープレート〔コーニング プラ
スチックス(Corning Plastics)、コーニング、ニューヨーク
、米国〕のウェル(Well)の中に分注する。
ウェル当りの総培養液容量は200μ!である。胸腺細胞を500/dペニシリ
ン、504/dストレプトマイシン、211Mグルタミン、0.2.Mゲンタマ
イシン、1請1’1−HEPES(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’
−2−エタンスルホン酸)バッファー、pH7,4,10−5M 2−メルカプ
トエタノール、および10%(v/v)ウシ胎児血清を含むRPM11640培
地中で培養する。サンプルは空気中に5%CO2を含む加温雰囲気中で68時間
37°Cにインキュベーションする。そうした後、培養液をおよそ4時間の間0
.5μCiのトリチウム化されたチミジン(’)l−Td、)でパルス標識し、
さらに4時間インキュベーションし、次いでマルチプルーオートメイティッド
サンプル ハーベスタ−(multiple−automated sampl
eharves ter)を用いてガラス ファイバー フィルター ストリッ
プ(glass fiber filter 5trip)上に収集した。この
方法の詳細は米国特許第4,411.992号に提供されている。
このアッセイにおいては、IL−1の存在下で培養した細胞のみが投与量に依存
した方式で38−Td、を取り込む。IL−1不在下で培養したウシの胸腺細胞
はバックグラウンドレベルの放射能標識を取り込んでいるのみである。IL−1
活性は3H−Td、取り込みデータの直線部分より計算される。IL−1活性の
単位は与えられたアッセイにおいて胸腺細胞の”H−Td、の最火取り込みの5
0%を生ずるサンプルの希釈倍率の逆数として決定される。所望するならば、あ
る濃度の精製した組換え型のヒトIL−1βの標準溶液を対照の目的で使用しう
る。
b TL−六 アーセイ
またIL−1活性はIL−1交換アツセイによってもアッセイすることができ、
このIL−1変換アツセイはbIL−1蛋白質がある種のIL−1依存性IL−
2生産細胞系、例えばマウスのT細胞系LBRM−33−IA5(ATCCCR
L−8079)を誘導してIL−2を生産するという所見に基づいている。IL
−1変換アツセイはコロン(Conlon) +j、 Immunol 、L
Ll、 1280(1983)およびロウエンタル(lowen t−hal)
ら、ム I+u+uno1.、 Lυ工1226(1986)に記載されている
。
これらのアッセイにおいては、誘導された細胞を50.7dのマイトマイシンC
で処理することによって最初に不活性化し、次いで亜最適マイトジェニック濃度
のPHA−M 、いろいろな希釈倍率のサンプル希釈物、およびIL−2依存性
細胞、例えばマウスのT細胞系CTLL−2(ATCCTlB214) 、の存
在下でインキュベーションする。前もってルー1と接触させたウェル(それによ
って、不活性化細胞によるIL−2生産が誘導される)に添加したIL−2依存
性細胞のみが増殖し、放射能標識を取り込むであろう。
こういった形の変換アッセイは胸腺細胞を糸分裂誘発(mitoge−nesi
s)アッセイよりも迅速でありかつ高怒度である。
好適な変換アッセイにおいては、およそ5X10’個の不活性化EL4−6.1
細胞(マウスのEL4細胞系に起源を有するクローン、ATCCTlB59)が
活性について試験されるサンプルの一連の3倍希釈物を含む平底ミクロタイター
プレートのウェル内に分注される。m胞は50υ/dペニシリン、50■/iス
トレプトマイシン、2mMグルタミン、0.’2mMゲンタマイシン、10mM
HEPESバッファーpH7,4,10−’M 2−メルカプトエタノールお
よび10%(v/v)ウシ胎児血清を含む総容量100pZの完全クリックス(
C11cks)培地中で培養する。
サンプルは空気中に5%のCOtを含む加湿雰囲気中で24時間、37°Cでイ
ンキュベーションする。この時点で、およそ4X10”個の洗浄CTLL−2T
lB214インキュベーションをさらに20時間続ける。最終的に、培養液はお
よそ4時間の間、0.5μCiのトリチウム化チミジン(3)1−Td、)でパ
ルス標識し、さらに4時間インキュベーションし、その結果得られたパルス標識
した培養液を上述の方法に従ってチミジンの取り込みについてアラ蛋白質の濃度
は任意の適切な方法によって定量されうる。しかしながらバイオ・ラド トータ
ル プロティン アッセイ(Bio−rad total protein a
ssay) (バイオ・ラド ラボラドリース(Bio−rad Labor
atories)、リッチモンド(Richmond)、カリフォルニア、米国
〕が望ましい、実質的にはクロンヘイム(Kronheim)ら2.シb且J到
ヨ、 1fi1.490(1985)に記載の方法またはその他の適切な技術に
よる5DS−PAGEもまた精製過程をモニターするために用いられる。上記の
さまざまなIL−1アツセイの利用に関するさらなる詳細はコンロン(Conl
on)、ム lm5un、+1iLL1280(1983)およびクロンヘイム
ら、↓記、に開示されている。
蛋白質組成物中の内毒素の濃度はライツタケル バイオプロダクツ(Whitt
aker Bioproducts) (ワーカ−スピル(Walkersv−
ille) 、マリ−ランド、米国〕から入手可能な商品キット〔クウォンティ
テイティプ クロモゲニック(Quantitative Chrom−oge
nic)LAL QCL−1000)) 、またはこれと同等の物を用いて慣用
的にアッセイされる。この方法では修飾したカブトガニのアメ−バ一様細胞溶解
液および合成色素生成基質を使用し、発色によって内毒素を検出する。精製した
組換え型bIL−1αは複数の希釈物を用いて内毒素の存在について試験する。
好適には、アッセイは精製完了直後、−70°Cで保存する前に行なわれる。
精製過程の間の細菌汚染の可能性を最少限にするためには無菌バッファー・を用
いるべきである。
鋏のblL−1α 1
ウシ肺胞細胞マクロファージライブラリーより単離したcDNAクローンのヌク
レオチド配列を第1図に示す。イニシェークーのメチオニン(ヌクレオチド55
)、成熟型bIL−1αの第一コドン(ヌクレオチド412)および終止コドン
(ヌクレオチド859)に下線を付けた。
第2図に、cDNAおよび第1図にそのすべてを示したblL−1αクローンの
コード領域の推定アミノ酸配列を示す、ヒトIL−1αの場合と同様に、bIL
−1αはインビボ(in vivo)ではおよそ31.000ダルトンの分子量
の前駆体蛋白質として翻訳され、後に内因性プロテアーゼまたはプロテアーゼ類
によってプロセッシングされて、推定分子量約17,500ダルトンの成熟型蛋
白質になる。第2図において、ヌクレオチドおよびアミノ酸は前駆体のイニシエ
ーターのメチオニンからの番号を付けた。下線を付けた成熟型配列変異体の1つ
は残基120の矢印によって示されたセリン残基を特定するAGTコドンから始
まる。blL−1αの推定アミノ酸配列は第2図の残基番号141−143にA
sn−Gln−5er配列を含み、この配列はN−結合グリコシル化部位として
の可能性がある。
bIL−1αのアミノ酸配列をコードする組換え型DNAセグメントは適切なプ
ローブを使用して適切なCDNAライブラリーを選択することによって、または
人工合成オリゴヌクレオチドの組み立てによって得られうる。
ベ −の
成熟型blL−1αは適切な誘導性プロモーターの調節下、細菌、酵母、哺乳動
物、およびその他の細胞内で発現しうる。
細−での使用に適切な発現ベクターは機能的プロモーターで機能、しうる読み枠
(reading phase)内に翻訳開始および終止コドンを伴うblL−
1αをコードする異種のDNA構造遺伝子を挿入することによって構築される。
ベクターは1個以上の表現型選択可能マーカーおよび宿主内での増幅を確実なも
のにする複製開始点からなるであろう、任意には、異種配列は同定用配列(例え
ばDYKDDDDK)まはた発現蛋白質の安定性あるいは精製に関連した望まし
い特徴を付加する他の配列と結合している融合蛋白質として翻訳されるようにベ
クター内に組み込まれうる。
形質転換に適切な原核生物宿主には、Vll(E、 coli) 、 l!E
!ヱユ球回(鉦鉦り圏匹匹■)属内のその他の種が含まれるが、その他の細胞を
必要に応じて使用する場合もある。
数多くの細菌、真菌、および酵母宿主での使用にあたって、適切なりローニング
、及び発現ベクターはホウウェルズ(Pou−wels) ら、C1onin
Vector : A Laborator Manual (エルセピ
ア(Elsevier) 、 ニューヨーク、1985)に記載されており、こ
の単行本に関連した開示をニーに参照として合体させる。
制限的なものではなく代表的な例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは
よく知られているクローニングベクターpBR322(ATCC37017)に
起源を有する商品として入手可能なプラスミドに由来する選択可能マーカーおよ
び細菌複製開始点を含みうる。そのような商品として入手可能なベクターには、
例えばI)KK223−3 (ファルマシア ファイン ケミカルズ(Phar
mas−ia Fine Chemicals)、ラップサラ(Uppsala
) 、スウェーデン〕およびpGEMI (プロメガ バイオチック(Prom
ega Biotec)、メディソン(Medison) 、ライスコンシン、
米国〕が含まれる。
これらの”バックボーン(backbone) ”部分は適切なプロモーターお
よび発現されるべき構造遺伝子と結合される。
特に有用な細菌発現システムは、ファージλPLプロモーターおよびCl857
ts熱怒受性リプレツサーを使用している。アメリカンタイプカルチャーコレク
ション(American Type Cu1tureCollection)
から入手可能でλPLプロモーターの誘導体を取り込むプラスミドベクターには
、太■皿JMB9株(ATCC37092)内に保持されるプラスミドpHUB
2およびJR1?1 (ATCC53082)内に保持されpPLc28が含ま
れる。1lIILi内での発現に有用な他のプロモーターには、スツジェル(S
tudier) ら、J、Mo1.Biol、+1f19゜113(1986)
記載のT7RNAポリメラーゼプロモーター、ラウェル(Lauer)、J、M
o1.A 1.Genet、、l 139−147(1981)記載のATC
C37121として入手可能な1acZプロモーター、およびマニアチス(Ma
ni−atis)+Mo土ecular C1onin : A Ll山or
ator Manual (コールドスプリング ハーバ−ラボラトリ−(
Cold Spring HarborLaboratory) 、 1982
.412頁〕に記載されておりかつATCC37138として入手可能なtac
プロモーターが含まれる。
適切な宿主株へ形質転換し、さらに適切な細胞密度に迄宿主株を増殖させた後、
選択プロモーターを適切な手段(例えば温度シフトまたは化学誘導)によって抑
制解除し、細胞をさらなる期間培養する。細胞は典型的には遠心分離によって収
集し、物理的または化学的手段によって破砕し、得られた粗抽出物はさらに精製
するために取ってお(。
好適には、ヱユ左二ヱ不立ス セレビシアエ(シ匹旦−工」す!じ一≧evis
iae)を用いる酵母システムもまた本発明の組換え型蛋白質を発現するために
使用される場合がある。その他の種、例一般的に、有用な酵母ベクターには酵母
および大腸菌の両方の形質転換を可能にする複製開始点および選択可能マーカー
、例えば大11iのアンピシリン耐性遺伝子および酵母のTRPI遺伝子、なら
びに下流の構造遺伝子の転写を誘導する高発現酵母遺伝子に起源を有するプロモ
ーターが含まれる。そのようなプロモーターは3−ホスホグリセリン酸キナーゼ
(PGM)のような解糖系酵素、α−ファクター、酸性ホスファターゼ、または
熱ショック蛋白質性をコードする酵母オペロンから誘導されうる。
異種の構造配列は転写開始および終止配列、ならびに好適には翻訳蛋白質の細胞
外培地への分泌を命令する能力をもつリーダー配列の適切なフェーズ内に組み立
てられうる。
有用な酵母ベクターは大腸菌内で選択および複製するためのpBR322からの
DNA配列(Ap’遺伝子および複製開始点)ならびにグルコース−抑制性アル
コールデヒドロゲナーゼ1または2(ADHIまたは2)プロモーターを含む酵
母のDNA配列を用いて組み立てられうる。ADH2プロモーターはルッセル(
Russell)ら、J、Biol、Ches、、 ■紅2674(1982)
およびベイエル(Beier) ら、Nature+皿724 (1982)に
記載されている。また、そのようなベクターには選択可能なマーカーとしての酵
母TRPI遺伝子および酵母2μ複製開始点が含まれる場合もある。酵母宿主か
らの異種蛋白質の分泌を可能にする酵母のリーダー配列、例えばα−ファクター
のリーダー配列はプロモーターおよび転写開始配列に隣接し、かつ発現される構
造遺伝子のフェーズ内に挿入されうる。リーダー配列はその3′末端付近に外来
遺伝子へのリーダー配列の融合を容易にする1個以上の有用な制限サイトを含む
ように修飾される場合もある。
適切な酵母の形質転換の処方せんは当業者らに知られている。
典型的な技術はヒンメン(Hinnen)ら、Proc、Natl、Acad、
SciH,1929(1978)に記載されており;この文献では0.67%酵
母窒素塩基、0.5%カザミン酸、2%グルコース、10M/dアテニンおよび
20■/dウラシルを含む選択培地中でTrp’形質転換体を選択している。
ADHIまたはADH2プロモーターからなるベクターによって形質転換した宿
主株は80!!g/j!1!アデニンおよび80g/dウラシルを補足した1%
酵母エキス、2%ペプトンおよび1%グルコースからなる冨栄養培地中で発現さ
せるために増殖させた。 AD)IIおよびADH2プロモーターの抑制解除は
培地グルコースの枯渇によって起こる。酵母の組上澄液は濾過によって収集し、
凍結させるかまたはさらなる精製迄4°Cに保った。
いろいろな哺乳動物細胞の培養システムもまた組換え蛋白質を発現させるために
使用されうる。@乳動物発現システムの例としてグルズマン(Gluzwan)
、皿、 u、175(1981)に記載のサル腎臓繊維芽細胞のCO5−7系な
らびに適合性ベクターを発現させる能力をもつ他の細胞系、例えばCl27.3
T3 、CIO、HeLaおよびBHK細胞系、が挙げられる。@乳動物の発現
ベクターは複製開始点、適切なプロモーターおよびエンハンサ−を含ム場合があ
り、さらに任意の必要なリポソーム結合サイト、ポリアデニル化サイト、スプラ
イシング供与体および受容体サイト、転写終止配列、ならびに5′−フランキン
グ非転写配列をも含む場合がある。 SV40ウィルスゲノムに起源を有するD
NA配列、例えばSV40の複製開始点、初期プロモーター、エンハンサ−、ス
プライシング、およびポリアデニル化サイトは必要な非転写遺伝子エレメントを
提供するために使われる。
゛ の お び の 11本明細書に記載した一般的精
製計画には最初に行なう細胞ペレットの酸抽出、これに続く水性媒体中でのイオ
ン交換クロマトグラフィーが含まれる。イオン交換クロマトグラフィーは陽イオ
ン交換クロマトグラフィーとこれに続いて行なわれる陰イオン交換クロマトグラ
フィーからなる場合がある。
rblL−1αの発現に用いた微生物細胞は凍結−解凍のくり返し、超音波処理
、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を含む任意の都合の良い方法によって破
砕されうる。好適には、rbIL−1αの酸媒介抽出段階はpH約2.0〜4.
01最適にはpH約2.5〜3.5の水性の緩衝化媒体中で行なわれる。一般的
に、最初の酸抽出段階は次の水性媒体中でのクロマトグラフィーと組み合わせて
行なわれる。好適には、この部分の精製過程は最初に行なうイオン交換クロマト
グラフィー、任意にこれに次いで行なわれる1種類以上のサイズ排除クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはI(PLC段階を含む、
イオン交換段階は、好適な態様においては、陽イオン交換クロマトグラフィーと
これに続く陰イオン交換クロマトグラフィーからなる。
適切な陽イオン交換クロマトグラフィー媒体は、スルホプロピルまたはカルボキ
シメチル基からなるさまざまな不溶性マトリックスを含む、スルホプロピル基が
望ましい、マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロ
ースまたは蛋白質精製に共通して用いられるその他のイオン交換樹脂あるいは基
質である。rbIL−3αの陽イオン交換クロマトグラフィーは特に有用な物質
はスルホプロピルセファデックスC−25〔ファルマシア ファインケミカルズ
(Pharvacia Fine Ch−emicals)、ラップサラ(Up
psala) 、スウェーデン〕である。スルホプロピル基を含む媒体を用いる
場合、rbIL−1αを含む抽出物はクエン酸ナトリウムのような適切なバッフ
ァーを用い、pH約2.5〜5.0、好適にはpH約4.0で負荷する。rlL
−1a種はイオン交換体に結合し、pH約7.5〜9.0の弱塩基性溶出側、例
えば10mM )リス(Tris)−H(J、p)18.1を流すことによって
さらに精製された形で溶出されうる。
適切な陰イオン交換クロマトグラフィー媒体には、ジエチルアミノエチル(DE
AE)またはジエチル(2−ヒドロキシプロピル)アミノエチル(QAE)基か
らなるさまざまな不溶性マトリックスが含まれる。 DEAE基が望ましい、マ
トリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋
白質の精製に共通して用いられるその他の型である。 rbIL −1αの陰イ
オン交換クロマトグラフィーに特に有用な物質はDEAE−セファセル(Sep
hac、el) (ファルマシア)である、 DEAE基を含む媒体を用いる場
合、rblL 1α含有抽出物は弱塩基性のp)lで負荷する。
例えば前の陽イオン交換クロマトグラフィ一段階(p)l約8.1)から得られ
たプールしたrblL−1α含有フラクシヨンはトリス−HClのような適切な
バッファー中で直接負荷することができる。
rblL 1α種は陰イオン交換媒体に結合し、同一バッファーの塩濃度勾配
を流すことによってより精製された形で溶出されうる。一般的に濃度勾配の指標
は少量の組換え蛋白質を用いた溶出の予備実験によって決定されうる。比較する
と、組換え型ヒ)IL−1aはDEAE−セファアセルから0.17〜0.22
+1NaCZで溶出することが知られている。
最初の抽出バフファーのpHを変化させる実験によって、大腸菌からの組換え型
ヒ)IL−1αの抽出は非所望蛋白質を沈殿させるがrhIL 1αを可溶化
するために例えばpH2,5〜3.5の酸性条件下で任意に成し遂げられること
が分かっている。 rblL−1αの最初の抽出段階の最適pHはヒト蛋白質と
は異なる場合もあり、醗酵槽バラ千間で異なる場合もある。このような理由から
特に大量の物質を含む小ML模のパイロット運転を最適pHの決定のために用い
る場合もある。
前述のように、rbIL 1αは熱誘導性の高頻度発現プラスミドをもつ適切
な大腸菌細胞の増殖および抑制解除によって効率良く生産されうる。細胞は、例
えば、最大限に通気しかつ激しく攪拌する条件を用いて101発酵槽中で増殖さ
せる。好適には消泡剤〔アンチフオーム(Antifoam) A )を使用す
る。細胞は、任意には抗生物質を含むセント(Mott)ら、Proc、Nat
l、Acad、Sci。
用紅 82.88(1985)に開示の超誘導培地中30″Cで増殖させ、細胞
密度A、。。=0.4〜0.5になった時点で温度を42°Cに上昇させること
によって抑制を解除し、さらに温度上昇させた後2〜20時間、好適には3〜6
時間後に収面する。細胞は最初に濾過または他の手段によって濃縮され、その後
10.000gで10分間4°Cで遠心分離を行ない、次いで細胞ベレットを急
速凍結させる。
最初の酸抽出を行なうために、細胞ベレットは5 mMEDTAおよび1mMフ
ェニル−メチルスルホニル フルオリド(PMSF)を含む30n+M )リス
−HClバッファー、pH8中に懸濁する。得られた懸濁液はドライアイス/メ
タノール浴中でゑ、速凍結させ、その後解凍する0次に5 mMEDTAを含む
3001Mクエン酸ナトリウムバッファーpn3.oを懸濁液に添加し、細胞ホ
モジナイザーを用いて細胞を破砕する。得られた酸性懸濁液は60分間、37°
Cの水浴中でインキュベーションする。インキュベーションに次いで、抽出物と
ドライアイス/メタノール浴中で急速凍結させ、解凍し、その後4°Cで45分
間38.000 gで遠心分離を行なう、そうした後、上澄液は次の精製段階で
用いるためにデカントされる。
p)13.0で大腸菌の細胞懸濁液からrblL 1αの抽出を行なうと、そ
の結果大部分の混入蛋白質が沈殿し、rbIL −1α活性ははヌ“回収される
。rbIL 1αを含む抽出物は適切なバッファーヲ用イテpH4,0ニ調整
し、0.1χトリドア (Triton) X−100(ポリオキシエチレンエ
ーテル:シグマケミカルカンパニー(SigmaChemical Compn
y)、セントルイス、ミズーリー、米国〕および10%ウシ胎児血清で前処理し
たSPS C−25カラムに負荷する1次いでカラムはカラムの3倍容量の10
mM 2 (N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)バッファーpH5
,0で洗條し、蛋白質は10s+M )リス−HC!p)18.1でカラムから
溶出させる。
次いでSPS段階で得られたblL−1活性含有フラクシヨンを集め、前もって
11011Iトリス−HCl、’ pH8,1で平衡化したDEAE−セファア
セルを詰めたカラムに負荷する。DEAEカラムはさらに初発バッファーで洗條
してblL−1αを溶出させる。得られたbIL−1αは5DS−PAGEでは
N゛純粋ある。
前述のイオン交換クロマトグラフィー法はさらなる精製を達成するために繰り返
したり、または比較的高純度の最終生成物を得るためにさらにサイズ排除クロマ
トグラフィーあるいは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)段階と組み合わ
せたりすることが可能である。
几二上Q役並
使用において、精製したウシIL−1αは治療のために症状に適した方式で哺乳
動物に投与される。このように、例えばワクチンアジュバントとして投与される
blL−1αは適切なワクチン抗原の投与と共に、または抗原投与後すぐに投与
されるであろう、投与は注射、連続注入、挿入物からの持続的放出、またはその
他の適切な技術による場合がある。 bIL−1αを傷治療の補助剤として投与
する場合、典型的には例えば外傷用医薬材料と共に損傷部位に局所塗布するであ
ろう、典型的には、bIL−1αは生理学的に受容しうる担体、賦形剤、または
希釈剤を伴なう精製した蛋白質からなる組成物の形で投与されるであろう。中性
にバッファー化した生理食塩水または同一種の血清アルブミンを混合した生理食
塩水が適切な希釈剤として代表的である。
1:bTL−1tx コー゛ るcDNAの および゛m建λ九現
cDNAポリヌクレオチドプローブはヒトIL−1αcDNAの構造遺伝子の8
47塩基対(bp)のPst I /Hinc I[フラグメントからDNAポ
リメラーゼ■を用いたニックトランスレーションによって調製した。使用した方
法は本質的にはマニアチス(Maniatis)ら、US109頁に開示された
方法と同様である。
cDNAライブラリーはウシの肺胞マクロファージ(RAM)から抽出した全R
NAから単離したポリアデニル化mRNAの逆転写によって構築した。 RAM
は最大のIL−1特異的メツセンジヤーRNA生産を引き出すためにRPM11
640培地+10%ウ培地+1情10JZg/ ld− 土土天生立±工土ムユ
立L (Smalmonella 皿−7−リボ多糖(LPS)と共に培養し
た, cDNAはDNAポリメラーゼ■を用いて二本鎖にし、T4 DNAポリ
メラーゼでプラントエンドにし、EcoRIメチラーゼでメチル化してcDNA
内のEcoRI切断サイトを保護し、EcoRIリンカ−に結合させた.得られ
た構築物はll:coRIで消化してcDNAの各々の末端に位置するすべての
リンカ−(この場合はcDNA各末端の1コピーのリンカ−)を取り除き、Ec
oRI−カット部位とバクテリオファージλgtlO Cフィコ4 − (Hu
ynh) ら、DNA CIonin :A Practical A r
oach, グローベル(Glover)縄、IRL Press+ 49−
78頁)〕の脱リン酸化アーム(ar■)に結合させた.結合させたDNAは組
換え体のライブラリーを作製するための商品として入手可能なキット〔ストラタ
ジーン クローニング システム(Stratagene C1or+ing
Systetm) 。
サンジエゴ、カルフォルニア、米国92121 )を用いてファージ粒子内にパ
ックした。組換え体を天[1C600 (hfl−)採土で平板培養し、中程度
にストリンシェドな条件(60″C16xSSC)下標準的なプラーク ハイブ
リダイゼーション技術を行なうことによって選択した.数回の選択をくり返した
結果、4個のクローンがcDNAプローブとハイブリダイゼーションしたライブ
ラリーから単離された.クローンをプラーク精製し、これを用いてEcoR I
消化のバクテリオファージDNAを調製した.消化物はアガロースゲル上を電気
泳動させ、ナイロンフィルター上にプロットし、ハイブリダイゼーションの再試
験を行なった.クローンをEcoRIで消化し、次に調製用アガロースゲル電気
泳動を行い、その後唯−のEcoRIサイト、BamF11サイトおよびその他
の唯一の制限サイトを多数含むポリリンカーを含む標準的クローニングベクター
pBR322のEcoR I切断誘導体(pGEMBL)内にサブクローニング
した.この種のベクターの代表例はアンチ(Dent6)ら、Nucleic
Ac1ds Re5earch+ 、ll+1645 (1983)に記載され
ている。
制限地図の作成から、1個のクローン内におよそ2.1キロベース(Kb)の挿
入物が存在していることがわかった.この挿入物をサブクローン化し、その配列
を決定した。クローンbovlL−1α7゜4は31キロダルトン(Kd)の推
定分子量をもち、且つヒトIL−1αとおよそ72%の相同性を有する268個
のアミノ酸からなる蛋白質をコードするDNAセグメントを含んでいる。
細菌発現ベクターはbIL−1α配列を含むクローニングベクターをBsmIお
よびPstlで消化し、その結果生じた成熟型blL−1αをコードする108
0bpのフラグメントを単離することによって構築されうる0次いでこのフラグ
メントは次のオリゴヌクレオチドリンガ−と結合させる:
得られた構築物は適切な宿主株、例えば大腸菌に802 (pRK248cI
ts ;ATCC33526)内で熱誘導によって発現させるためにC1al−
切断およびPstI−切断のpPL3に結合させる。 pPL3は前述のように
ファージλPLプロモーターの誘導体を含むpBR322の誘導体である。
発現後、blL−1α発現ベクターを含む細胞のSDS粗抽出物はウシ胸腺細胞
増殖アッセイによってアッセイを行ないその生物学的活性を確認することができ
る。さらなる量の精製組換え型蛋白質は前述のような酸抽出から得ることができ
る。
2:″ シスーム でのblL−αの
blL−1α遺伝子のコード領域は適切なcDNAクローンから取得するかまた
は合成オリゴヌクレオチドから組み立てるかじて以下にその詳細を記載する細菌
/酵母シャトルベクターpYADH(ATCC39967)内に挿入する。得ら
れた発現ベクターはfJJa宿主細胞内で増幅させ、次いで酵母ADHIプロモ
ーター制御下で組換え型蛋白質を発現させるために、このベクターを用いて酵母
宿主細胞を形質転換する。
bIL−1α遺伝子のコード領域を含むプラスミドを遺伝子の3′フランキング
領域内に位置するPstlサイトで最初に消化する。
S1ヌクレアーゼを用いて、PstIサイトをプラントエンドにして、プラスミ
ドpYADHの5tuIサイトに結合するための適切な末端を提供する。次いで
得られたプラントエンドの線状フラグメントを制限エンドヌクレアーゼBs++
Iで切断してblL−1α遺伝子のコード領域の主要部分を含むフラグメントを
提供する。
合成オリゴヌクレオチドを化学合成してblL−1α遺伝子のコード領域の5′
末端部分に添加し、さらにコード領域の5′末端に翻訳開始コドンを作り出す。
合成オリゴヌクレオチド組成を以下に示すが、このオリゴヌクレオチドはEco
RI付着5′末端、それに続< ATG開始コドン、およびこれに続<Bs蒙I
サイト迄を含むIL−1遺伝子コード領域の5′末端を含む。
Met Arg Val Ile His Gin Glu CyspYADH
発現ベクターは、成分ヌクレオチドおよび削出したbIL−1α遺伝子コード領
域の主要部分と結合させるために、マニアチスら、圧、104頁に示す標準的技
術に従って制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよび5tulを用いて完全にベ
クターを消化することによって調製される。所望の大きい方のフラグメントは0
.7%アガロースゲルを用いて100ボルト、22℃で2時間電気泳動を行なう
ことによって消化物より単離する。
合成りNAオリゴマー、削り出したblL−1α遺伝子コード領域の主要部分、
および所望の線状化pYAD)lフラグメントは、1trg/rdのpYADH
ベクターフラグメント(EcoRI−Stul) 、0.4 trg/1lBt
の主要blL−1aDNAフラグメント(Bsa+I、 PstI (プラント
エンド) ) 、0.00511g/dの合成オリゴヌクレオチド(EcoRI
−Bs+sl) 、および十分量のT4DNAリガーゼ用バッファー(10x
T4DNAリガーゼ用バッファーは0.4111)リス(pH7,4)、O,I
M−MgC7z。
0.1Mジチオスレイトール、10mMスペルミジン、10IaM・ATPおよ
び/lIg/d BS^〕に溶解したSOU/dの74[IWAリガーゼからな
る反応容量20plの反応混合液中で一緒に結合させる0反応は15°Cで15
時間インキュベーションすることによって行なわれる。
次いで、得られた組換え型プラスミドは標準的技術を用いて1llilRR1株
を形質転換するために用いられる。宿主細胞を培養液中で増殖させてプラスミド
DNAを増幅させ、このプラスミドを例えばマニアチスら、圧368真に記載の
標準法に従って単離する。プラスミドDNAは塩化セシウム−臭化エチジウム密
度勾配中での平衡遠心分離によって精製し、次いで欧州特許明細書EPAO16
5654に開示されているようなトリプトファン原栄養体を選択する標準的な方
法に従って並ユ互旦ヱヱ丈ス セレビ之ヱx (S、 cerevisiae)
のプロアーゼ欠!i酵母株〔例えば20B−12(α、PEP4.3. TRP
I) )を形質転換するために使用した。
組換え型蛋白質を発現させるために、酵母形質転換体は最少培地から富栄養培地
(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコース)内に植菌し、対数増殖末期
上30°Cで15〜20時間増殖させた。収面時、プロテアーゼ阻害剤であるフ
ェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を濃度が1mMになるように添
加する。
次いで培養液は400xgで遠心分離して細胞をペレット状にし、その細胞を0
.1倍容量の冷H20で1回洗條し、l mM−PMSFを含む0.01倍容量
の冷H,0に再懸濁し、さらにガラスピーズ(重へ倍容量)と共に2分間渦巻撹
拌を行なう、細胞破片およびガラスピーズは遠心分離によってペレット状にする
。その後、得られた上澄液はウシ胸腺細胞の増殖アッセイおよびルー1変換アツ
セイを行なうことによって組換え型蛋白質の存在について試験する。
FIGURE 1
厄虹ユ
GAA AAT GAA GACTACAGT TCT GAA ATT GA
CCACCTCTCT CTCAAT CAG 96Glu Asn G
lu Asp Tyr S@r Ser Glu工1e Asp Hls Le
u Ser Leu Asn Gin @32
CIT AGCTTCAAG GAG AAT GTG GTG ATG GT
G にCA GCCAGT GGG AAG ATT 2S0
Leu Ser Phe Lyg Glu Asn Val Val M@t
Val Ala Ala Ser Val Lys工le @80
国際調査報告
に%alleeal Aaphca111IspCT/ p CF B p l
Q 1441
Claims (19)
- 1.ウシのインターロイキン−1α(bIL−1α)をコードするDNAセグメ ント。
- 2.第2図に示すポリペプチド配列のアミノ酸120〜268をコードするヌク レオチド配列と実質的に相同であるDNAセグメント。
- 3.第2図に示すヌクレオチド360〜804の配列を有するDNAセグメント 。
- 4.請求項1記載のDNAセグメントを含む組換え型発現ベクター。
- 5.請求項2記載のDNAセグメントを含む組換え型発現ベクター。
- 6.請求項3記載のDNAセグメントを含む組換え型発現ベクター。
- 7.請求項4記載のベクターを含む組換え型発現システム。
- 8.請求項5記載のベクターを含む組換え型発現システム。
- 9.請求項6記載のベクターを含む組換え型発現システム。
- 10.請求項7記載のシステムを発現促進条件下で培養することからなる、精製 rbIL−1αまたはその同族体の調製方法。
- 11.請求項8記載のシステムを発現促進条件下で培養することからなる、精製 rbIL−1αまたはその同族体の調製方法。
- 12.請求項9記載のシステムを発現促進条件下で培養することからなる、精製 rbIL−1αまたはその同族体の調製方法。
- 13.実質的に均質なbIL−1α。
- 14.請求項2記載のDNAセグメントによってコードされる蛋白質。
- 15.請求項3記載のDNAセグメントによってコードされる蛋白質。
- 16.有効量の請求項13記載のbIL−1αおよび適切な希釈剤または担体か らなるワクチンアジュバント組成物。
- 17.請求項16記載の組成物の有効量を投与することからなる、ウシ哺乳類の 抗原に対する免疫応答増強方法。
- 18.治療上有効な量の請求項13記載のbIL−1αおよび適切な担体または ベヒクルからなる創傷治療用組成物。
- 19.請求項18記載の組成物の治療上有効な量を投与することからなる、ウシ 哺乳類の創傷癒合を促進するための方法。
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