JPH02504463A

JPH02504463A - ウシのインターロイキン‐１α

Info

Publication number: JPH02504463A
Application number: JP63505132A
Authority: JP
Inventors: セレッティ，ダグラス・ピー; ショーンボーン，マイケル・エイ; マリスジュースキ，チャールズ・アール
Original assignee: イミュネックス・コーポレーション
Priority date: 1987-05-28
Filing date: 1988-05-09
Publication date: 1990-12-20
Also published as: EP0362283A1; WO1988009382A1; AU613930B2; US4894333A; ATE108831T1; EP0362283A4; CA1340082C; AU1947688A; EP0362283B1; DE3850774D1; DE3850774T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ウシのインターロイキン−１α 主皿皇！景本発明は、一般的には哺乳動物のサイト力イン、特に哺乳動物におけるヒトルー１αの生物活性同族体、例えばウシのインターロイキン−１αのクローニングおよび発現に関する。インターロイキン−１（ＩＬ−１）は免疫原および外傷性の刺激に応答してマクロファージおよびその他のある種の細胞によって放出されるポリペプチド類に与えられる名称であって、損傷および怒染に対して宿主応答を開始させることを主要な役割とする。

これらのサイト力インは生物活性の複雑なスペクトルと関連している。ＩＬ−１インターロイキン−２の放出の誘導を通して胸腺細胞の増殖を誘導する能力ならびにＢリンパ球の増殖および成熟を刺激する能力をもつ一次免疫刺激性信号である。さらに、ＩＬ−１は発熱およびプラスタグランジンの生産、ならびに傷癒合の促進と関連している。ＩＬ−１に関係する文献のレビューにはオッヘンハイム（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ）　　ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ　　Ｔ９ｉ？ＬＬＬ７．４５（１９８６）、およびデュラム（Ｄｕｒｕｍ）　　ら、Ａｎｎ、Ｒｒｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　＋　３゜２６３　（１９８５）がある。

ヒトルー１の活性は２つの少し関連している蛋白質に備っており、ＩＬ−１αおよびルー１βと名付けられている。〔マーチ（Ｍａｒｃｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　、１１５．６４０１９８５））　、両分子は通常的３１．０００ダルトンの分子量をもつより大きい前駆体として合成され、その後蛋白室分解による切断によってプロセッシングされおよそ１７．５００ダルトンの分子量をもつ成熟型になる。ヒトＩＬ−１α前駆体はＩＬ−１の生物活性を発現するが、ヒトルー１βの前駆体は生物学的に不活性であり、ＩＬ−１活性をもつ成熟型を提供するためには切断される必要がある。

最近、ヒトＩＬ−１種の両方をコードするｃＤＮＡがクローン化され、微生物で発現され、前臨床研究および治療に使用するのに充分な量のＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの生産が可能になった。

ワクチンアジュバントおよび傷治療用組成物の構成成分として可能な治療法に利用するという観点において、獣医学分野においてウシのＩＬ−１蛋白質を使用することは興味深い。生物学的活性量のウシＩＬ−１蛋白質または活性同族体からなる治療用組成物はワクチン抗原に応答して抗体の生産を増強するために、さらに傷表皮のすみやかな癒合を促進するためにも使用することができるであろう。

光里皇塁！本発明は組換え型ウシ比−１α蛋白質、および本質的にはウシのインターロイキン１α（ｂｌＬ−１α）をコードする単一のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）ヌクレオチド配列からなるＤＮＡセグメントを提供する。好適には、そのようなセグメントは微生物またはウィルスのオペロンに起源を有する誘導可能な調節エレメントからなる組換え型転写ユニット中で発現可能である合成遺伝子のかたちで提供される。また、本発明は前記ＤＮＡセグメントからなる組換え発現ベクター、組換え発現ベクターを含む微生物発現システム、および微生物発現システムを用いた前記蛋白質調製のための方法をも提供する。

辺二旦員星に里第１図はウシＩＬ−１αをコードする配列を含むｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を示す。

第２図は第１図に示したクローンのコード領域のヌクレオチド配列およびそれより導かれるアミノ酸配列を示す。

１班皇昆豊星■皿ウシＩＬ−１αをコードするＤＮＡセグメントはウシの肺胞マクロファージより単離されたポリアデニル化ＲＮ＾の逆転写によって調製されたｃＤＮＡライブラリーより単離された。ヒトＴＬ−１αのコード配列の一部に相当するｃＤＮＡフラグメントが慣用的なりＮＡパイプリダイゼーション技術によってライブラリーをスクリーニングするために用いられた。プローブとハイブリダイゼーションするクローンは制限エンドヌクレアーゼ分解、アガロースゲル電気泳動、および電気泳動したフラグメントからなるさらなるハイブリダイゼーション実験〔“サザンプロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ）”〕によって分析した。ヒトｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーシヨンした数種のクローンを単離した後、１個のｂｌＬ−１αクローンのハイブリダイゼーシッンセグメントをサブクローン化し、慣用的技術を用いてその配列を決定した。

組換え型蛋白質を得るために、成熟型ｂｌＬ−１αのポリペプチド配列をコードするｃＤＮＡ配列を適切な発現ベクター内に挿入し、さらにこれを用いて大腸Ｗ（Ｅ、ｃｏｌｉ）の適切な株を形質転換し、次いで形質転換株を組換え型転写ユニットの抑制解除に好都合な条件下、培養液中で増殖させた。培養細胞を収集し、細胞質ゾル蛋白質を抽出し、さらにウシの胸腺細胞増殖アンセイおよびネズミのリンパ球ＩＬ−２生産アッセイによってウシ・インターロイキン−１活性の発現について試験した。

また、発現ベクターは他の細菌、酵母、バクテリオファージ、またはウィルスの遺伝子に起源を含する誘導性エレメントとこれに機能しうるように連結したｂｌＬ−１αまたは生物学的に同等な同族体をコードする合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントから組み立てられる。適切な細胞系の形質転換またはトランスフェクションに次いで、そのようなベクターは組換え型蛋白質を発現させるために誘導されうる。

核酸に関する態様において、本発明は本質的にウシのインターロイキン−１α（ｂｌＬ−１α）をコードする単一オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列からなるＤＮＡセグメントを提供する。前述のように、そのようなりＮＡ上セグメント、好適には、本質的に微生物またはウィルスオペロンに起源を有する誘導性調節エレメントからなる組換え型転写ユニット中で発現する能力をもつｂＩＬ−１αをコードする合成遺伝子からなる。

好適な態様において、ＤＮＡセグメントはｃＤＮＡ配列またはそのコピーに起源を有する少な（とも１個、任意には１個以上の配列成分からなる。そのような配列は合成オリゴヌクレオチドの組み合わせによって調製したＤＮＡ配列によって連結または結合される場合もある。例示的配列には第２図に示したポリペプチド配列のアミノ酸１２０−２６８をコードするヌクレオチド配列と実質的に相同な配列が含まれる。任意には、コード配列は１２０番目のセリンのすぐ前に１個以上のさらなるアミノ酸をコードするコドン、例えばリーディングフレーム中でヌクレオチド配列と連結されたグルタミン残基を指定するコドンまたはメチオニンを指定するＮ末端ＡＴＧコドン、を含む場合もある。コードの縮重のため、同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にはいろいろの異なる配列が存在しうる；例示的なりＮＡの実施！！様の１つに第２図のヌクレオチド配列３６０ −８０４に相当するそれがある。また、本発明は任意の前述のＤＮＡセグメントからなる組換え型発現ベクターを提供する。ベクターは以下により詳細に記載するような調節領域を含む。

方法に関する観点において、本発明は組換え蛋白質の発現を可能にする条件下で適切な宿主／ベクター発現システムを培養することからなる精製ｒｂｌＬ　　１ αおよびその同族体の調製方法を提供する。

蛋白質に関する実施態様において、本発明は内因性物質の混入ガくなくかつ任意には結合された天然型のグリコジル化を伴わない実質的に均質なりＩＬ−１αに相当するポリペプチドを提供する。そのような蛋白質は本発明のＤＮＡによってコードされた蛋白質に相当し、その１つの実施態様としてＮ末端メチオニル化ｂＩＬ−１αが含まれる０組成物および使用方法に関する観点において、本発明は、有効量の本発明のいずれかのｂｌＬ−α蛋白質および適切な希釈剤またはキャリアーからなるワクチンアジュバント組成物、ならびに有効量の前述のいずれかの組成物を投与することからなるウシ哺乳動物において抗原に対する免疫応答を増強するための方法を提供する。さらには、治療上有効な量の本発明のいずれかのｂｌＬ−α蛋白質および適切な希釈剤またはベヒクルからなる創傷治療用組成物、ならびに治療上有効な量のそのような組成物を投与することからなるウシ哺乳動物における創傷癒合を促進するための方法が提供される。その他に免疫を刺激するような使用法および組成物もまた考えら“ウシのインターロイキン−１α ”および’ｂｌＬ−１α”とは、ＩＬ−２の放出を誘導することを通してウシの胸腺細胞の増殖を誘導すること、ならびにウシのＢリンパ球の増殖および成熟を刺激することを含む生物学的特徴をもつウシの内因性分泌蛋白質を指す、ウシＩＬ−１αのヒト同族体に観察される生物学的特徴にもまたプロスタグランジン生産を誘導することおよび繊維芽細胞に対して走化性信号を与えることが含まれる。明細書を通じて用いられる“成熟型ｂＩＬ−１α”という言葉はｂｌＬ−１の生物学的活性およびアミノ酸１２０で始まりアミノ酸２６８で終わる第２図に示したポリペプチド配列と実質的に相同なアミノ酸配列をもつｂｌＬ−１α蛋白質を意味する。

核酸およびアミノ酸配列の両方について用いる“実質的に相同な”とは、個々の従属配列、例えは突然変異体の配列が基準配列から１個以上の置換、欠落、または挿入によって、その正味の影響によって基準配列と従属配列との間に悪い機能的相違点を生じないような、変化をすることを意味する０本発明の目的のためには、９０％以上の相同性、同等の生物活性、および等しい発現特徴を有する配列は実質的に相同であると考えられる。

相同性を測定する目的のためには、成熟型配列の切り出しは無視されねばならない。より低い程度の相同性、比較しうる程度の生物活性、および同等の発現特徴を有する配列が同等物であると考えられる。一般的に、相同なりＮＡ配列は中程度にストリンシェドな標準的ハイブリダイゼーション条件下のクロスフ１イブリダイゼーシヨンによって同定されうる。

本明細書中に用いられる“組換え（型）”とは、蛋白質が組換え型（例えば微生物または哺乳動物）発現システムに起源を有することを意味する＠　　”ｒｂｌＬ　　ｌｚ’は組換え型′″ｂＩＬ−１α”を意味する。“微生物（の）”とは、細菌または真菌（例えば酵母）発現システム中で作られた組換え（型）蛋白質を指す、生成物としての”組換え（型）微生物（の）”は、本質的に天然の内因性物質を含まず、かつ結合した天然型のグリコジル化を伴わないウシの蛋白質を意味する。ｍ菌培養液中で発現した蛋白質はポリ多糖を含まないであろう；酵母で発現した蛋白質は哺乳動物細菌で発現したのとは異なるグリコジル化パターンを有するであろう。

“実質的に均質なり１Ｌ−１α”とは、例えばポリアクリルアミドゲル染色のような慣用的な手段によって検出可能な量の夾雑蛋白質を含まない精製されたｂ　ＩＬ−１αからなる蛋白質組成物を意味する０本明細書に開示した微生物発現システムの能力によって治療上有効な量の実質的に均質な物質を提供するために十分な量のウシＩＬ−１αの生産が可能になる。

”　ＤＮＡセグメント”は、分離したフラグメントの形のまたはより大きなりＮＡ構築物の構成成分としてのＤＮＡポリマーであって、少なくとも一度は実質的に純粋な形で単離されたＤＮＡ、即ち内因性物質の夾雑がなく、かつ例えばクローニングベクターを使用するといったような標準的な生化学的方法によるセグメントおよびその構成成分であるヌクレオチドの配列の同定、操作、および回収を可能にする量または濃度の上記ＤＮＡに起源を有する上記ＤＮＡポリマーを指す。そのようなセグメントは、典型的には哺乳動物に存在する翻訳されない内部配列またはイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形で提供される。翻訳されないＤＮＡ配列は、同ＤＮＡ配列がコード領域の操作または発現を妨害しないオーブンリーディングフレームの下流に存在する場合がある。“ヌクレオチド配列”とはデオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを指す、一般的に本発明によって提供される蛋白質をコードするＤＮＡセグメントは　ｃＤＮＡフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカー、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、微生物またはウィルスのオペロンに起源を有する誘導性調節エレメントからなる組換え型転写ユニット中で発現する能力をもつ合成遺伝子を提供する。

“組換え型発現ベクター”とは、（１）遺伝子の発現を調節する役割をもつ遺伝子エレメントまたはエレメント類、例えばプロモーターまたはエンハンサ−１（２）ｍ　ＲＮ　Ａに転写され蛋白質に翻訳される構造配列またはコード配列、および（３）適切な転写開始配列および転写終止配列：の組み合わせからなる転写ユニットを含むプラスミドを指す、好適には、酵母発現システムで使用を予定している転写ユニットは宿主細胞によって翻訳された蛋白質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む、また、リーダー配列または輸送配列なしで発現した組換え型蛋白質はＮ末端にメチオニン残基を含む場合がある。その後、この残基は発現した組換え型蛋白質から切断されてもしくは切断されないままで最終生成物が提供される。

“組換え型発現システム”は、組換え型転写ユニットが安定に組み込まれた染色体ＤＮＡを有しているか、または常在性プラスミドの構成成分として組換え型転写ユニットを保持している適切な宿主微生物、例えば太盪回（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）のような微生物または土ユ左旦ｌ立ス　セレビシアエ（Ｓ、　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母、の実質的に均質な単一培養を意味する。一般的に、システムを構成する細胞は単一の先祖をもつ形質転換体の子孫である０本明細書で定義した組換え型発現システムは発現されるべきＤＮＡセグメントまたは合成遺伝子に連結した調節エレメントの誘導時に異種蛋白質を発現するであろう。

ｂｌＬ−１αの　　　・ゝ　のア・・セー瓜ａ　　シの　　　　の　、　迭　アーセイウシのＩＬ−１α活性は、殺したばかりの子牛の胸腺細胞の増殖を誘導するサンプルの能力を確認することを含む胸腺細胞の有糸分裂誘発アッセイによってモニターされうる。このアッセイにおいては、およそ１．５　Ｘ　１０ｂ個のフィコニル−ハイバック（Ｆｉｃｏｌ　］−Ｈｙｐａｑｕｅ）で精製したウシの胸腺細胞を、サブマイトゲン（ｓｕｂｍｉ　ｔｏｇｅｎ）濃度のフォトへマグルチニン−Ｍ（ＰＨＡ−Ｍ）およびｂＩＬ−１の活性について試験されるサンプルの一連の二倍希釈物を入れた平底のミクロタイタープレート〔コーニング　プラスチックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ）、コーニング、ニューヨーク、米国〕のウェル（Ｗｅｌｌ）の中に分注する。

ウェル当りの総培養液容量は２００μ！である。胸腺細胞を５００／ｄペニシリン、５０４／ｄストレプトマイシン、２１１Ｍグルタミン、０．２．Ｍゲンタマイシン、１請１’１−ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’ −２−エタンスルホン酸）バッファー、ｐＨ７，４，１０−５Ｍ　２−メルカプトエタノール、および１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地中で培養する。サンプルは空気中に５％ＣＯ２を含む加温雰囲気中で６８時間３７°Ｃにインキュベーションする。そうした後、培養液をおよそ４時間の間０．５μＣｉのトリチウム化されたチミジン（’）ｌ−Ｔｄ、）でパルス標識し、さらに４時間インキュベーションし、次いでマルチプルーオートメイティッド　サンプル　ハーベスタ−（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ｓａｍｐｌｅｈａｒｖｅｓ　ｔｅｒ）を用いてガラス　ファイバー　フィルター　ストリップ（ｇｌａｓｓ　ｆｉｂｅｒ　ｆｉｌｔｅｒ　５ｔｒｉｐ）上に収集した。この方法の詳細は米国特許第４，４１１．９９２号に提供されている。

このアッセイにおいては、ＩＬ−１の存在下で培養した細胞のみが投与量に依存した方式で３８−Ｔｄ、を取り込む。ＩＬ−１不在下で培養したウシの胸腺細胞はバックグラウンドレベルの放射能標識を取り込んでいるのみである。ＩＬ−１活性は３Ｈ−Ｔｄ、取り込みデータの直線部分より計算される。ＩＬ−１活性の単位は与えられたアッセイにおいて胸腺細胞の”Ｈ−Ｔｄ、の最火取り込みの５０％を生ずるサンプルの希釈倍率の逆数として決定される。所望するならば、ある濃度の精製した組換え型のヒトＩＬ−１βの標準溶液を対照の目的で使用しうる。

ｂ　　ＴＬ−六　アーセイまたＩＬ−１活性はＩＬ−１交換アツセイによってもアッセイすることができ、このＩＬ−１変換アツセイはｂＩＬ−１蛋白質がある種のＩＬ−１依存性ＩＬ− ２生産細胞系、例えばマウスのＴ細胞系ＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５（ＡＴＣＣＣＲＬ−８０７９）を誘導してＩＬ−２を生産するという所見に基づいている。ＩＬ −１変換アツセイはコロン（Ｃｏｎｌｏｎ）　＋ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、ＬＬｌ、　１２８０（１９８３）およびロウエンタル（ｌｏｗｅｎ　ｔ−ｈａｌ）ら、ム　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．、　Ｌυ工１２２６（１９８６）に記載されている。

これらのアッセイにおいては、誘導された細胞を５０．７ｄのマイトマイシンＣで処理することによって最初に不活性化し、次いで亜最適マイトジェニック濃度のＰＨＡ−Ｍ　、いろいろな希釈倍率のサンプル希釈物、およびＩＬ−２依存性細胞、例えばマウスのＴ細胞系ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣＴｌＢ２１４）　、の存在下でインキュベーションする。前もってルー１と接触させたウェル（それによって、不活性化細胞によるＩＬ−２生産が誘導される）に添加したＩＬ−２依存性細胞のみが増殖し、放射能標識を取り込むであろう。

こういった形の変換アッセイは胸腺細胞を糸分裂誘発（ｍｉｔｏｇｅ−ｎｅｓｉｓ）アッセイよりも迅速でありかつ高怒度である。

好適な変換アッセイにおいては、およそ５Ｘ１０’個の不活性化ＥＬ４−６．１細胞（マウスのＥＬ４細胞系に起源を有するクローン、ＡＴＣＣＴｌＢ５９）が活性について試験されるサンプルの一連の３倍希釈物を含む平底ミクロタイタープレートのウェル内に分注される。ｍ胞は５０υ／ｄペニシリン、５０■／ｉストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、０．’２ｍＭゲンタマイシン、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７，４，１０−’Ｍ　２−メルカプトエタノールおよび１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含む総容量１００ｐＺの完全クリックス（Ｃ１１ｃｋｓ）培地中で培養する。

サンプルは空気中に５％のＣＯｔを含む加湿雰囲気中で２４時間、３７°Ｃでインキュベーションする。この時点で、およそ４Ｘ１０”個の洗浄ＣＴＬＬ−２ＴｌＢ２１４インキュベーションをさらに２０時間続ける。最終的に、培養液はおよそ４時間の間、０．５μＣｉのトリチウム化チミジン（３）１−Ｔｄ、）でパルス標識し、さらに４時間インキュベーションし、その結果得られたパルス標識した培養液を上述の方法に従ってチミジンの取り込みについてアラ蛋白質の濃度は任意の適切な方法によって定量されうる。しかしながらバイオ・ラド　トータル　プロティン　アッセイ（Ｂｉｏ−ｒａｄ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ）　　（バイオ・ラド　ラボラドリース（Ｂｉｏ−ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア、米国〕が望ましい、実質的にはクロンヘイム（Ｋｒｏｎｈｅｉｍ）ら２．シｂ且Ｊ到ヨ、　１ｆｉ１．４９０（１９８５）に記載の方法またはその他の適切な技術による５ＤＳ−ＰＡＧＥもまた精製過程をモニターするために用いられる。上記のさまざまなＩＬ−１アツセイの利用に関するさらなる詳細はコンロン（Ｃｏｎｌｏｎ）、ム　ｌｍ５ｕｎ、＋１ｉＬＬ１２８０（１９８３）およびクロンヘイムら、↓記、に開示されている。

蛋白質組成物中の内毒素の濃度はライツタケル　バイオプロダクツ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）　（ワーカ−スピル（Ｗａｌｋｅｒｓｖ− ｉｌｌｅ）　、マリ−ランド、米国〕から入手可能な商品キット〔クウォンティテイティプ　クロモゲニック（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｃｈｒｏｍ−ｏｇｅｎｉｃ）ＬＡＬ　ＱＣＬ−１０００））　、またはこれと同等の物を用いて慣用的にアッセイされる。この方法では修飾したカブトガニのアメ−バ一様細胞溶解液および合成色素生成基質を使用し、発色によって内毒素を検出する。精製した組換え型ｂＩＬ−１αは複数の希釈物を用いて内毒素の存在について試験する。

好適には、アッセイは精製完了直後、−７０°Ｃで保存する前に行なわれる。

精製過程の間の細菌汚染の可能性を最少限にするためには無菌バッファー・を用いるべきである。

鋏のｂｌＬ−１α　１ウシ肺胞細胞マクロファージライブラリーより単離したｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を第１図に示す。イニシェークーのメチオニン（ヌクレオチド５５）、成熟型ｂＩＬ−１αの第一コドン（ヌクレオチド４１２）および終止コドン（ヌクレオチド８５９）に下線を付けた。

第２図に、ｃＤＮＡおよび第１図にそのすべてを示したｂｌＬ−１αクローンのコード領域の推定アミノ酸配列を示す、ヒトＩＬ−１αの場合と同様に、ｂＩＬ −１αはインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）ではおよそ３１．０００ダルトンの分子量の前駆体蛋白質として翻訳され、後に内因性プロテアーゼまたはプロテアーゼ類によってプロセッシングされて、推定分子量約１７，５００ダルトンの成熟型蛋白質になる。第２図において、ヌクレオチドおよびアミノ酸は前駆体のイニシエーターのメチオニンからの番号を付けた。下線を付けた成熟型配列変異体の１つは残基１２０の矢印によって示されたセリン残基を特定するＡＧＴコドンから始まる。ｂｌＬ−１αの推定アミノ酸配列は第２図の残基番号１４１−１４３にＡｓｎ−Ｇｌｎ−５ｅｒ配列を含み、この配列はＮ−結合グリコシル化部位としての可能性がある。

ｂＩＬ−１αのアミノ酸配列をコードする組換え型ＤＮＡセグメントは適切なプローブを使用して適切なＣＤＮＡライブラリーを選択することによって、または人工合成オリゴヌクレオチドの組み立てによって得られうる。

ベ　　　−の成熟型ｂｌＬ−１αは適切な誘導性プロモーターの調節下、細菌、酵母、哺乳動物、およびその他の細胞内で発現しうる。

細−での使用に適切な発現ベクターは機能的プロモーターで機能、しうる読み枠（ｒｅａｄｉｎｇ　ｐｈａｓｅ）内に翻訳開始および終止コドンを伴うｂｌＬ− １αをコードする異種のＤＮＡ構造遺伝子を挿入することによって構築される。

ベクターは１個以上の表現型選択可能マーカーおよび宿主内での増幅を確実なものにする複製開始点からなるであろう、任意には、異種配列は同定用配列（例えばＤＹＫＤＤＤＤＫ）まはた発現蛋白質の安定性あるいは精製に関連した望ましい特徴を付加する他の配列と結合している融合蛋白質として翻訳されるようにベクター内に組み込まれうる。

形質転換に適切な原核生物宿主には、Ｖｌｌ（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）　、　ｌ！Ｅ！ヱユ球回（鉦鉦り圏匹匹■）属内のその他の種が含まれるが、その他の細胞を必要に応じて使用する場合もある。

数多くの細菌、真菌、および酵母宿主での使用にあたって、適切なりローニング、及び発現ベクターはホウウェルズ（Ｐｏｕ−ｗｅｌｓ）　　ら、Ｃ１ｏｎｉｎ　　Ｖｅｃｔｏｒ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ　（エルセピア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）　、　ニューヨーク、１９８５）に記載されており、この単行本に関連した開示をニーに参照として合体させる。

制限的なものではなく代表的な例として、細菌での使用に有用な発現ベクターはよく知られているクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）に起源を有する商品として入手可能なプラスミドに由来する選択可能マーカーおよび細菌複製開始点を含みうる。そのような商品として入手可能なベクターには、例えばＩ）ＫＫ２２３−３　（ファルマシア　ファイン　ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｓ−ｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ラップサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）　、スウェーデン〕およびｐＧＥＭＩ　（プロメガ　バイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）、メディソン（Ｍｅｄｉｓｏｎ）　、ライスコンシン、米国〕が含まれる。

これらの”バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）　”部分は適切なプロモーターおよび発現されるべき構造遺伝子と結合される。

特に有用な細菌発現システムは、ファージλＰＬプロモーターおよびＣｌ８５７ｔｓ熱怒受性リプレツサーを使用している。アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能でλＰＬプロモーターの誘導体を取り込むプラスミドベクターには、太■皿ＪＭＢ９株（ＡＴＣＣ３７０９２）内に保持されるプラスミドｐＨＵＢ２およびＪＲ１？１　（ＡＴＣＣ５３０８２）内に保持されｐＰＬｃ２８が含まれる。１ｌＩＩＬｉ内での発現に有用な他のプロモーターには、スツジェル（Ｓｔｕｄｉｅｒ）　ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋１ｆ１９゜１１３（１９８６）記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ラウェル（Ｌａｕｅｒ）、Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　　１．Ｇｅｎｅｔ、、ｌ　１３９−１４７（１９８１）記載のＡＴＣＣ３７１２１として入手可能な１ａｃＺプロモーター、およびマニアチス（Ｍａｎｉ−ａｔｉｓ）＋Ｍｏ土ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　：　Ａ　Ｌｌ山ｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ　　（コールドスプリング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、　１９８２．４１２頁〕に記載されておりかつＡＴＣＣ３７１３８として入手可能なｔａｃプロモーターが含まれる。

適切な宿主株へ形質転換し、さらに適切な細胞密度に迄宿主株を増殖させた後、選択プロモーターを適切な手段（例えば温度シフトまたは化学誘導）によって抑制解除し、細胞をさらなる期間培養する。細胞は典型的には遠心分離によって収集し、物理的または化学的手段によって破砕し、得られた粗抽出物はさらに精製するために取ってお（。

好適には、ヱユ左二ヱ不立ス　セレビシアエ（シ匹旦−工」す！じ一≧ｅｖｉｓｉａｅ）を用いる酵母システムもまた本発明の組換え型蛋白質を発現するために使用される場合がある。その他の種、例一般的に、有用な酵母ベクターには酵母および大腸菌の両方の形質転換を可能にする複製開始点および選択可能マーカー、例えば大１１ｉのアンピシリン耐性遺伝子および酵母のＴＲＰＩ遺伝子、ならびに下流の構造遺伝子の転写を誘導する高発現酵母遺伝子に起源を有するプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＭ）のような解糖系酵素、α−ファクター、酸性ホスファターゼ、または熱ショック蛋白質性をコードする酵母オペロンから誘導されうる。

異種の構造配列は転写開始および終止配列、ならびに好適には翻訳蛋白質の細胞外培地への分泌を命令する能力をもつリーダー配列の適切なフェーズ内に組み立てられうる。

有用な酵母ベクターは大腸菌内で選択および複製するためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｐ’遺伝子および複製開始点）ならびにグルコース−抑制性アルコールデヒドロゲナーゼ１または２（ＡＤＨＩまたは２）プロモーターを含む酵母のＤＮＡ配列を用いて組み立てられうる。ＡＤＨ２プロモーターはルッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、、　■紅２６７４（１９８２）およびベイエル（Ｂｅｉｅｒ）　ら、Ｎａｔｕｒｅ＋皿７２４　（１９８２）に記載されている。また、そのようなベクターには選択可能なマーカーとしての酵母ＴＲＰＩ遺伝子および酵母２μ複製開始点が含まれる場合もある。酵母宿主からの異種蛋白質の分泌を可能にする酵母のリーダー配列、例えばα−ファクターのリーダー配列はプロモーターおよび転写開始配列に隣接し、かつ発現される構造遺伝子のフェーズ内に挿入されうる。リーダー配列はその３′末端付近に外来遺伝子へのリーダー配列の融合を容易にする１個以上の有用な制限サイトを含むように修飾される場合もある。

適切な酵母の形質転換の処方せんは当業者らに知られている。

典型的な技術はヒンメン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ＳｃｉＨ，１９２９（１９７８）に記載されており；この文献では０．６７％酵母窒素塩基、０．５％カザミン酸、２％グルコース、１０Ｍ／ｄアテニンおよび２０■／ｄウラシルを含む選択培地中でＴｒｐ’形質転換体を選択している。

ＡＤＨＩまたはＡＤＨ２プロモーターからなるベクターによって形質転換した宿主株は８０！！ｇ／ｊ！１！アデニンおよび８０ｇ／ｄウラシルを補足した１％酵母エキス、２％ペプトンおよび１％グルコースからなる冨栄養培地中で発現させるために増殖させた。　ＡＤ）ＩＩおよびＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は培地グルコースの枯渇によって起こる。酵母の組上澄液は濾過によって収集し、凍結させるかまたはさらなる精製迄４°Ｃに保った。

いろいろな哺乳動物細胞の培養システムもまた組換え蛋白質を発現させるために使用されうる。＠乳動物発現システムの例としてグルズマン（Ｇｌｕｚｗａｎ）、皿、　ｕ、１７５（１９８１）に記載のサル腎臓繊維芽細胞のＣＯ５−７系ならびに適合性ベクターを発現させる能力をもつ他の細胞系、例えばＣｌ２７．３Ｔ３　、ＣＩＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系、が挙げられる。＠乳動物の発現ベクターは複製開始点、適切なプロモーターおよびエンハンサ−を含ム場合があり、さらに任意の必要なリポソーム結合サイト、ポリアデニル化サイト、スプライシング供与体および受容体サイト、転写終止配列、ならびに５′−フランキング非転写配列をも含む場合がある。　ＳＶ４０ウィルスゲノムに起源を有するＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の複製開始点、初期プロモーター、エンハンサ−、スプライシング、およびポリアデニル化サイトは必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使われる。

゛　　　　の　　　お　　び　　　　　の　　１１本明細書に記載した一般的精製計画には最初に行なう細胞ペレットの酸抽出、これに続く水性媒体中でのイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。イオン交換クロマトグラフィーは陽イオン交換クロマトグラフィーとこれに続いて行なわれる陰イオン交換クロマトグラフィーからなる場合がある。

ｒｂｌＬ−１αの発現に用いた微生物細胞は凍結−解凍のくり返し、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を含む任意の都合の良い方法によって破砕されうる。好適には、ｒｂＩＬ−１αの酸媒介抽出段階はｐＨ約２．０〜４．０１最適にはｐＨ約２．５〜３．５の水性の緩衝化媒体中で行なわれる。一般的に、最初の酸抽出段階は次の水性媒体中でのクロマトグラフィーと組み合わせて行なわれる。好適には、この部分の精製過程は最初に行なうイオン交換クロマトグラフィー、任意にこれに次いで行なわれる１種類以上のサイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはＩ（ＰＬＣ段階を含む、イオン交換段階は、好適な態様においては、陽イオン交換クロマトグラフィーとこれに続く陰イオン交換クロマトグラフィーからなる。

適切な陽イオン交換クロマトグラフィー媒体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基からなるさまざまな不溶性マトリックスを含む、スルホプロピル基が望ましい、マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白質精製に共通して用いられるその他のイオン交換樹脂あるいは基質である。ｒｂＩＬ−３αの陽イオン交換クロマトグラフィーは特に有用な物質はスルホプロピルセファデックスＣ−２５〔ファルマシア　ファインケミカルズ（Ｐｈａｒｖａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈ−ｅｍｉｃａｌｓ）、ラップサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）　、スウェーデン〕である。スルホプロピル基を含む媒体を用いる場合、ｒｂＩＬ−１αを含む抽出物はクエン酸ナトリウムのような適切なバッファーを用い、ｐＨ約２．５〜５．０、好適にはｐＨ約４．０で負荷する。ｒｌＬ −１ａ種はイオン交換体に結合し、ｐＨ約７．５〜９．０の弱塩基性溶出側、例えば１０ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ）−Ｈ（Ｊ、ｐ）１８．１を流すことによってさらに精製された形で溶出されうる。

適切な陰イオン交換クロマトグラフィー媒体には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはジエチル（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）基からなるさまざまな不溶性マトリックスが含まれる。　ＤＥＡＥ基が望ましい、マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白質の精製に共通して用いられるその他の型である。　ｒｂＩＬ　−１αの陰イオン交換クロマトグラフィーに特に有用な物質はＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃ、ｅｌ）　（ファルマシア）である、　ＤＥＡＥ基を含む媒体を用いる場合、ｒｂｌＬ　　１α含有抽出物は弱塩基性のｐ）ｌで負荷する。

例えば前の陽イオン交換クロマトグラフィ一段階（ｐ）ｌ約８．１）から得られたプールしたｒｂｌＬ−１α含有フラクシヨンはトリス−ＨＣｌのような適切なバッファー中で直接負荷することができる。

ｒｂｌＬ　　１α種は陰イオン交換媒体に結合し、同一バッファーの塩濃度勾配を流すことによってより精製された形で溶出されうる。一般的に濃度勾配の指標は少量の組換え蛋白質を用いた溶出の予備実験によって決定されうる。比較すると、組換え型ヒ）ＩＬ−１ａはＤＥＡＥ−セファアセルから０．１７〜０．２２＋１ＮａＣＺで溶出することが知られている。

最初の抽出バフファーのｐＨを変化させる実験によって、大腸菌からの組換え型ヒ）ＩＬ−１αの抽出は非所望蛋白質を沈殿させるがｒｈＩＬ　　１αを可溶化するために例えばｐＨ２，５〜３．５の酸性条件下で任意に成し遂げられることが分かっている。　ｒｂｌＬ−１αの最初の抽出段階の最適ｐＨはヒト蛋白質とは異なる場合もあり、醗酵槽バラ千間で異なる場合もある。このような理由から特に大量の物質を含む小ＭＬ模のパイロット運転を最適ｐＨの決定のために用いる場合もある。

前述のように、ｒｂＩＬ　　１αは熱誘導性の高頻度発現プラスミドをもつ適切な大腸菌細胞の増殖および抑制解除によって効率良く生産されうる。細胞は、例えば、最大限に通気しかつ激しく攪拌する条件を用いて１０１発酵槽中で増殖させる。好適には消泡剤〔アンチフオーム（Ａｎｔｉｆｏａｍ）　Ａ　）を使用する。細胞は、任意には抗生物質を含むセント（Ｍｏｔｔ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

用紅　８２．８８（１９８５）に開示の超誘導培地中３０″Ｃで増殖させ、細胞密度Ａ、。。＝０．４〜０．５になった時点で温度を４２°Ｃに上昇させることによって抑制を解除し、さらに温度上昇させた後２〜２０時間、好適には３〜６時間後に収面する。細胞は最初に濾過または他の手段によって濃縮され、その後１０．０００ｇで１０分間４°Ｃで遠心分離を行ない、次いで細胞ベレットを急速凍結させる。

最初の酸抽出を行なうために、細胞ベレットは５　ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭフェニル−メチルスルホニル　フルオリド（ＰＭＳＦ）を含む３０ｎ＋Ｍ　）リス −ＨＣｌバッファー、ｐＨ８中に懸濁する。得られた懸濁液はドライアイス／メタノール浴中でゑ、速凍結させ、その後解凍する０次に５　ｍＭＥＤＴＡを含む３００１Ｍクエン酸ナトリウムバッファーｐｎ３．ｏを懸濁液に添加し、細胞ホモジナイザーを用いて細胞を破砕する。得られた酸性懸濁液は６０分間、３７° Ｃの水浴中でインキュベーションする。インキュベーションに次いで、抽出物とドライアイス／メタノール浴中で急速凍結させ、解凍し、その後４°Ｃで４５分間３８．０００　ｇで遠心分離を行なう、そうした後、上澄液は次の精製段階で用いるためにデカントされる。

ｐ）１３．０で大腸菌の細胞懸濁液からｒｂｌＬ　　１αの抽出を行なうと、その結果大部分の混入蛋白質が沈殿し、ｒｂＩＬ　−１α活性ははヌ“回収される。ｒｂＩＬ　　１αを含む抽出物は適切なバッファーヲ用イテｐＨ４，０ニ調整し、０．１χトリドア　（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００（ポリオキシエチレンエーテル：シグマケミカルカンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐｎｙ）、セントルイス、ミズーリー、米国〕および１０％ウシ胎児血清で前処理したＳＰＳ　Ｃ−２５カラムに負荷する１次いでカラムはカラムの３倍容量の１０ｍＭ　２　　（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファーｐＨ５，０で洗條し、蛋白質は１０ｓ＋Ｍ　）リス−ＨＣ！ｐ）１８．１でカラムから溶出させる。

次いでＳＰＳ段階で得られたｂｌＬ−１活性含有フラクシヨンを集め、前もって１１０１１Ｉトリス−ＨＣｌ、’　ｐＨ８，１で平衡化したＤＥＡＥ−セファアセルを詰めたカラムに負荷する。ＤＥＡＥカラムはさらに初発バッファーで洗條してｂｌＬ−１αを溶出させる。得られたｂＩＬ−１αは５ＤＳ−ＰＡＧＥではＮ゛純粋ある。

前述のイオン交換クロマトグラフィー法はさらなる精製を達成するために繰り返したり、または比較的高純度の最終生成物を得るためにさらにサイズ排除クロマトグラフィーあるいは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）段階と組み合わせたりすることが可能である。

几二上Ｑ役並使用において、精製したウシＩＬ−１αは治療のために症状に適した方式で哺乳動物に投与される。このように、例えばワクチンアジュバントとして投与されるｂｌＬ−１αは適切なワクチン抗原の投与と共に、または抗原投与後すぐに投与されるであろう、投与は注射、連続注入、挿入物からの持続的放出、またはその他の適切な技術による場合がある。　ｂＩＬ−１αを傷治療の補助剤として投与する場合、典型的には例えば外傷用医薬材料と共に損傷部位に局所塗布するであろう、典型的には、ｂＩＬ−１αは生理学的に受容しうる担体、賦形剤、または希釈剤を伴なう精製した蛋白質からなる組成物の形で投与されるであろう。中性にバッファー化した生理食塩水または同一種の血清アルブミンを混合した生理食塩水が適切な希釈剤として代表的である。

１：ｂＴＬ−１ｔｘ　　コー゛　るｃＤＮＡの　　および゛ｍ建λ九現ｃＤＮＡポリヌクレオチドプローブはヒトＩＬ−１αｃＤＮＡの構造遺伝子の８４７塩基対（ｂｐ）のＰｓｔ　Ｉ　／Ｈｉｎｃ　Ｉ［フラグメントからＤＮＡポリメラーゼ■を用いたニックトランスレーションによって調製した。使用した方法は本質的にはマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、ＵＳ１０９頁に開示された方法と同様である。

ｃＤＮＡライブラリーはウシの肺胞マクロファージ（ＲＡＭ）から抽出した全ＲＮＡから単離したポリアデニル化ｍＲＮＡの逆転写によって構築した。　ＲＡＭは最大のＩＬ−１特異的メツセンジヤーＲＮＡ生産を引き出すためにＲＰＭ１１６４０培地＋１０％ウ培地＋１情１０ＪＺｇ／　ｌｄ−　土土天生立±工土ムユ立Ｌ　（Ｓｍａｌｍｏｎｅｌｌａ　　皿−７−リボ多糖（ＬＰＳ）と共に培養した，　ｃＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼ■を用いて二本鎖にし、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼでプラントエンドにし、ＥｃｏＲＩメチラーゼでメチル化してｃＤＮＡ内のＥｃｏＲＩ切断サイトを保護し、ＥｃｏＲＩリンカ−に結合させた．得られた構築物はｌｌ：ｃｏＲＩで消化してｃＤＮＡの各々の末端に位置するすべてのリンカ−（この場合はｃＤＮＡ各末端の１コピーのリンカ−）を取り除き、ＥｃｏＲＩ−カット部位とバクテリオファージλｇｔｌＯ　Ｃフィコ４　−　（Ｈｕｙｎｈ）　　ら、ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎ　：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　　ｒｏａｃｈ，　　グローベル（Ｇｌｏｖｅｒ）縄、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ＋　４９− ７８頁）〕の脱リン酸化アーム（ａｒ■）に結合させた．結合させたＤＮＡは組換え体のライブラリーを作製するための商品として入手可能なキット〔ストラタジーン　クローニング　システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃ１ｏｒ＋ｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｔｍ）　。

サンジエゴ、カルフォルニア、米国９２１２１　）を用いてファージ粒子内にパックした。組換え体を天［１Ｃ６００　（ｈｆｌ−）採土で平板培養し、中程度にストリンシェドな条件（６０″Ｃ１６ｘＳＳＣ）下標準的なプラーク　ハイブリダイゼーション技術を行なうことによって選択した．数回の選択をくり返した結果、４個のクローンがｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションしたライブラリーから単離された．クローンをプラーク精製し、これを用いてＥｃｏＲ　Ｉ消化のバクテリオファージＤＮＡを調製した．消化物はアガロースゲル上を電気泳動させ、ナイロンフィルター上にプロットし、ハイブリダイゼーションの再試験を行なった．クローンをＥｃｏＲＩで消化し、次に調製用アガロースゲル電気泳動を行い、その後唯−のＥｃｏＲＩサイト、ＢａｍＦ１１サイトおよびその他の唯一の制限サイトを多数含むポリリンカーを含む標準的クローニングベクターｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ　Ｉ切断誘導体（ｐＧＥＭＢＬ）内にサブクローニングした．この種のベクターの代表例はアンチ（Ｄｅｎｔ６）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　、ｌｌ＋１６４５　（１９８３）に記載されている。

制限地図の作成から、１個のクローン内におよそ２．１キロベース（Ｋｂ）の挿入物が存在していることがわかった．この挿入物をサブクローン化し、その配列を決定した。クローンｂｏｖｌＬ−１α７゜４は３１キロダルトン（Ｋｄ）の推定分子量をもち、且つヒトＩＬ−１αとおよそ７２％の相同性を有する２６８個のアミノ酸からなる蛋白質をコードするＤＮＡセグメントを含んでいる。

細菌発現ベクターはｂＩＬ−１α配列を含むクローニングベクターをＢｓｍＩおよびＰｓｔｌで消化し、その結果生じた成熟型ｂｌＬ−１αをコードする１０８０ｂｐのフラグメントを単離することによって構築されうる０次いでこのフラグメントは次のオリゴヌクレオチドリンガ−と結合させる：得られた構築物は適切な宿主株、例えば大腸菌に８０２　（ｐＲＫ２４８ｃＩ　ｔｓ　；ＡＴＣＣ３３５２６）内で熱誘導によって発現させるためにＣ１ａｌ− 切断およびＰｓｔＩ−切断のｐＰＬ３に結合させる。　ｐＰＬ３は前述のようにファージλＰＬプロモーターの誘導体を含むｐＢＲ３２２の誘導体である。

発現後、ｂｌＬ−１α発現ベクターを含む細胞のＳＤＳ粗抽出物はウシ胸腺細胞増殖アッセイによってアッセイを行ないその生物学的活性を確認することができる。さらなる量の精製組換え型蛋白質は前述のような酸抽出から得ることができる。

２：″　シスーム　でのｂｌＬ−αのｂｌＬ−１α遺伝子のコード領域は適切なｃＤＮＡクローンから取得するかまたは合成オリゴヌクレオチドから組み立てるかじて以下にその詳細を記載する細菌／酵母シャトルベクターｐＹＡＤＨ（ＡＴＣＣ３９９６７）内に挿入する。得られた発現ベクターはｆＪＪａ宿主細胞内で増幅させ、次いで酵母ＡＤＨＩプロモーター制御下で組換え型蛋白質を発現させるために、このベクターを用いて酵母宿主細胞を形質転換する。

ｂＩＬ−１α遺伝子のコード領域を含むプラスミドを遺伝子の３′フランキング領域内に位置するＰｓｔｌサイトで最初に消化する。

Ｓ１ヌクレアーゼを用いて、ＰｓｔＩサイトをプラントエンドにして、プラスミドｐＹＡＤＨの５ｔｕＩサイトに結合するための適切な末端を提供する。次いで得られたプラントエンドの線状フラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓ＋＋Ｉで切断してｂｌＬ−１α遺伝子のコード領域の主要部分を含むフラグメントを提供する。

合成オリゴヌクレオチドを化学合成してｂｌＬ−１α遺伝子のコード領域の５′ 末端部分に添加し、さらにコード領域の５′末端に翻訳開始コドンを作り出す。

合成オリゴヌクレオチド組成を以下に示すが、このオリゴヌクレオチドはＥｃｏＲＩ付着５′末端、それに続＜　ＡＴＧ開始コドン、およびこれに続＜Ｂｓ蒙Ｉサイト迄を含むＩＬ−１遺伝子コード領域の５′末端を含む。

Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ＣｙｓｐＹＡＤＨ発現ベクターは、成分ヌクレオチドおよび削出したｂＩＬ−１α遺伝子コード領域の主要部分と結合させるために、マニアチスら、圧、１０４頁に示す標準的技術に従って制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよび５ｔｕｌを用いて完全にベクターを消化することによって調製される。所望の大きい方のフラグメントは０．７％アガロースゲルを用いて１００ボルト、２２℃で２時間電気泳動を行なうことによって消化物より単離する。

合成りＮＡオリゴマー、削り出したｂｌＬ−１α遺伝子コード領域の主要部分、および所望の線状化ｐＹＡＤ）ｌフラグメントは、１ｔｒｇ／ｒｄのｐＹＡＤＨベクターフラグメント（ＥｃｏＲＩ−Ｓｔｕｌ）　、０．４　ｔｒｇ／１ｌＢｔの主要ｂｌＬ−１ａＤＮＡフラグメント（Ｂｓａ＋Ｉ、　ＰｓｔＩ　（プラントエンド）　）　、０．００５１１ｇ／ｄの合成オリゴヌクレオチド（ＥｃｏＲＩ −Ｂｓ＋ｓｌ）　、および十分量のＴ４ＤＮＡリガーゼ用バッファー（１０ｘ　Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用バッファーは０．４１１１）リス（ｐＨ７，４）、Ｏ，ＩＭ−ＭｇＣ７ｚ。

０．１Ｍジチオスレイトール、１０ｍＭスペルミジン、１０ＩａＭ・ＡＴＰおよび／ｌＩｇ／ｄ　ＢＳ＾〕に溶解したＳＯＵ／ｄの７４［ＩＷＡリガーゼからなる反応容量２０ｐｌの反応混合液中で一緒に結合させる０反応は１５°Ｃで１５時間インキュベーションすることによって行なわれる。

次いで、得られた組換え型プラスミドは標準的技術を用いて１ｌｌｉｌＲＲ１株を形質転換するために用いられる。宿主細胞を培養液中で増殖させてプラスミドＤＮＡを増幅させ、このプラスミドを例えばマニアチスら、圧３６８真に記載の標準法に従って単離する。プラスミドＤＮＡは塩化セシウム−臭化エチジウム密度勾配中での平衡遠心分離によって精製し、次いで欧州特許明細書ＥＰＡＯ１６５６５４に開示されているようなトリプトファン原栄養体を選択する標準的な方法に従って並ユ互旦ヱヱ丈ス　セレビ之ヱｘ　（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプロアーゼ欠！ｉ酵母株〔例えば２０Ｂ−１２（α、ＰＥＰ４．３．　ＴＲＰＩ）　）を形質転換するために使用した。

組換え型蛋白質を発現させるために、酵母形質転換体は最少培地から富栄養培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）内に植菌し、対数増殖末期上３０°Ｃで１５〜２０時間増殖させた。収面時、プロテアーゼ阻害剤であるフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を濃度が１ｍＭになるように添加する。

次いで培養液は４００ｘｇで遠心分離して細胞をペレット状にし、その細胞を０．１倍容量の冷Ｈ２０で１回洗條し、ｌ　ｍＭ−ＰＭＳＦを含む０．０１倍容量の冷Ｈ，０に再懸濁し、さらにガラスピーズ（重へ倍容量）と共に２分間渦巻撹拌を行なう、細胞破片およびガラスピーズは遠心分離によってペレット状にする。その後、得られた上澄液はウシ胸腺細胞の増殖アッセイおよびルー１変換アツセイを行なうことによって組換え型蛋白質の存在について試験する。

ＦＩＧＵＲＥ　　１厄虹ユＧＡＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＣＴＡＣＡＧＴ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＧＡＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴ　ＣＴＣＡＡＴ　ＣＡＧ　　　　９６Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｓ＠ｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ａｓｐ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　@３２ＣＩＴ　ＡＧＣＴＴＣＡＡＧ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＧＴＧ　にＣＡ　ＧＣＣＡＧＴ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＡＴＴ　　２S０Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｍ＠ｔ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ工ｌｅ　@８０国際調査報告に％ａｌｌｅｅａｌ　Ａａｐｈｃａ１１１ＩｓｐＣＴ／　ｐ　ＣＦ　Ｂ　ｐ　ｌ　Ｑ　１４４１

Claims

【特許請求の範囲】

１．ウシのインターロイキン−１α（ｂＩＬ−１α）をコードするＤＮＡセグメント。
２．第２図に示すポリペプチド配列のアミノ酸１２０〜２６８をコードするヌクレオチド配列と実質的に相同であるＤＮＡセグメント。
３．第２図に示すヌクレオチド３６０〜８０４の配列を有するＤＮＡセグメント。
４．請求項１記載のＤＮＡセグメントを含む組換え型発現ベクター。
５．請求項２記載のＤＮＡセグメントを含む組換え型発現ベクター。
６．請求項３記載のＤＮＡセグメントを含む組換え型発現ベクター。
７．請求項４記載のベクターを含む組換え型発現システム。
８．請求項５記載のベクターを含む組換え型発現システム。
９．請求項６記載のベクターを含む組換え型発現システム。
１０．請求項７記載のシステムを発現促進条件下で培養することからなる、精製ｒｂＩＬ−１αまたはその同族体の調製方法。
１１．請求項８記載のシステムを発現促進条件下で培養することからなる、精製ｒｂＩＬ−１αまたはその同族体の調製方法。
１２．請求項９記載のシステムを発現促進条件下で培養することからなる、精製ｒｂＩＬ−１αまたはその同族体の調製方法。
１３．実質的に均質なｂＩＬ−１α。
１４．請求項２記載のＤＮＡセグメントによってコードされる蛋白質。
１５．請求項３記載のＤＮＡセグメントによってコードされる蛋白質。
１６．有効量の請求項１３記載のｂＩＬ−１αおよび適切な希釈剤または担体からなるワクチンアジュバント組成物。
１７．請求項１６記載の組成物の有効量を投与することからなる、ウシ哺乳類の抗原に対する免疫応答増強方法。
１８．治療上有効な量の請求項１３記載のｂＩＬ−１αおよび適切な担体またはベヒクルからなる創傷治療用組成物。
１９．請求項１８記載の組成物の治療上有効な量を投与することからなる、ウシ哺乳類の創傷癒合を促進するための方法。