WO2014200045A1 - ヘパロサン-グルクロン酸-5-エピメラーゼ、およびそれを用いた多糖の製造方法 - Google Patents

ヘパロサン-グルクロン酸-5-エピメラーゼ、およびそれを用いた多糖の製造方法 Download PDF

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WO2014200045A1
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acid residue
polypeptide
activity
residue
dna
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望月 秀雄
山岸 究
鈴木 喜義
金 永植
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生化学工業株式会社
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90Isomerases (5.)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08BPOLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y501/00Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to heparosan-glucuronic acid-5-epimerase. Specifically, the present invention relates to the activity of isomerizing the glucuronic acid residue of N-acetylheparosan to an iduronic acid residue and / or the iduronic acid residue of fully desulfated / N-acetylated heparin.
  • the present invention relates to a method for producing the polypeptide, a method for producing a polysaccharide in which hexuronic acid residues are isomerized using the enzyme and / or the polypeptide.
  • GAG glycosaminoglycan PG: proteoglycan
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • GlcNS N-sulfated glucosamine
  • GlcN glucosamine
  • GlcA glucuronic acid
  • IdoA iduronic acid
  • 2S 2-O-sulfated iduronic acid
  • HexA hexonic acid
  • aMan 2,5-Anhydromannose
  • AS Akaran sulfate ACH: Akaran (2-O-desulfated AS)
  • NAH N-acetylheparosan
  • NSH N-deacetylated / N-sulfated heparosan
  • HEP heparin CDSNAc-HEP: fully desulfated / N-acetylated heparin
  • CDSNS-HEP fully desulfated / N-acetylated heparin
  • Acalane sulfate is a kind of glycosaminoglycan (GAG) isolated from African maimai (Achatina falica), and is a disaccharide composed of GlcNAc and IdoA (2S) represented by the following structural formula (1) It is known to be a linear GAG having a structure in which (-[4GlcNAc ⁇ 1-4IdoA (2S) ⁇ 1]-) is repeatedly polymerized (Non-patent Documents 1 and 2).
  • AS has a physiological activity similar to heparin (HEP) or heparan sulfate (HS), which are GAGs having a common sugar chain skeleton, and specifically, angiogenesis inhibitory activity (Non-patent Document 3), immunity Stimulating activity (Non-patent document 4), hypoglycemic activity (Non-patent document 4), anticoagulant activity (Non-patent document 5), anti-tumor activity (Non-patent document 6), adhesion inhibitory activity of Helicobacter pylori (Non-patent document 7) and the like are known.
  • HEP heparin
  • HS heparan sulfate
  • the biosynthesis of HEP and HS is based on the analysis of the sugar chain structure expressed in knockout mice or mutant cell lines and the results of experiments evaluating the substrate specificity of the enzyme, and the disaccharide consisting of GlcNAc and GlcA (-[4GlcNAc ⁇ 1-4GlcA ⁇ 1 ]-) Synthesis of N-acetylheparosan (NAH), a GAG having a structure repeatedly polymerized, N-deacetylation and N-sulfation, isomerization of GlcA residue to IdoA residue, O-sulfuric acid It has been clarified that they are performed in the order of conversion (Non-Patent Documents 8 and 9).
  • An object of the present invention is to provide heparosan-glucuronic acid-5-epimerase (HG-5epi). Specifically, the present invention relates to the activity of isomerizing a GlcA residue of NAH to an IdoA residue and / or the activity of isomerizing an IdoA residue of CDSNAC-HEP to a GlcA residue (hereinafter collectively referred to as generic name).
  • An enzyme derived from an African maimai having a HG-5 epi activity a polypeptide having the activity, a nucleic acid encoding the polypeptide, a vector containing the nucleic acid, the nucleic acid and / or the vector It is an object of the present invention to provide a host cell, a method for producing the polypeptide, a method for producing a polysaccharide in which HexA residues are isomerized using the enzyme and / or the polypeptide.
  • AS is a GAG containing GlcNAc and IdoA (2S) as components and does not contain GlcNS in the skeleton, and is known to African mimais to be involved in the biosynthesis of HEP and HS.
  • AS is a GAG containing GlcNAc and IdoA (2S) as components and does not contain GlcNS in the skeleton, and is known to African mimais to be involved in the biosynthesis of HEP and HS.
  • HG-5epi which is an isomerase using NAH as a substrate exists in African mimai and is involved in the biosynthesis of AS.
  • HG-5epi a novel isomerase, exists in African maimai, and isolates DNA encoding HG-5epi from African maimai.
  • the present invention has been completed successfully.
  • the present invention is exemplified as follows.
  • An enzyme derived from African maimai having the following characteristics (A) and (B).
  • A1) An amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 601 in SEQ ID NO: 2.
  • A2) An amino acid sequence represented by amino acid numbers 34 to 601 in SEQ ID NO: 2.
  • A Activity to isomerize glucuronic acid residue of N-acetylheparosan to iduronic acid residue and / or isomerize iduronic acid residue of fully desulfated / N-acetylated heparin to glucuronic acid residue Activity.
  • B The optimum pH is 5.5 to 6.0.
  • C The activity is substantially lost in the presence of 0.1% (w / v) or more sodium deoxycholate.
  • DNA selected from the group consisting of the following (A) to (C).
  • A1 A base sequence represented by base numbers 1-1806 in SEQ ID NO: 1.
  • A2 A base sequence represented by base numbers 100 to 1806 in SEQ ID NO: 1.
  • B an activity of hybridizing with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (A) under stringent conditions and isomerizing a glucuronic acid residue of N-acetylheparosan to an iduronic acid residue; And / or DNA encoding a polypeptide having the activity of isomerizing the iduronic acid residue of fully desulfated N-acetylated heparin to a glucuronic acid residue.
  • (C) including a base sequence of a fusion DNA obtained by adding a DNA encoding a peptide tag to the DNA of (A) or (B), and isomerizing a glucuronic acid residue of N-acetylheparosan to an iduronic acid residue And / or a DNA encoding a polypeptide having the activity of isomerizing the iduronic acid residue of fully desulfated N-acetylated heparin into a glucuronic acid residue.
  • a vector comprising the nucleic acid and / or the DNA.
  • a host cell carrying the nucleic acid, the DNA, and / or the vector.
  • a method for producing a polysaccharide in which a hexuronic acid residue is isomerized comprising a step of bringing the enzyme and / or the polypeptide into contact with a polysaccharide containing a disaccharide consisting of an N-acetylglucosamine residue and a hexuronic acid residue.
  • a polysaccharide obtained by the above method [13] A polysaccharide comprising a structure in which a glucuronic acid residue of N-acetylheparosan is isomerized to an iduronic acid residue.
  • the polysaccharide, wherein the ratio of iduronic acid residues to hexuronic acid residues present in the backbone of the polysaccharide is 20% to 75%.
  • FIG. 4 is a photographic image view after CBB staining of a gel obtained by subjecting an elution fraction of HG-5epi obtained by column purification to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions. It is a figure which shows the flow diagram of the HPLC post column label method.
  • FIG. 3 is a diagram showing a chromatogram obtained by subjecting NAH or CDSNac-HEP to N-deacetylation and nitrous acid decomposition, followed by HPLC post-column labeling.
  • FIG. 3 is a diagram showing a chromatogram obtained by subjecting NAH or CDSNac-HEP to N-deacetylation and nitrous acid decomposition, followed by HPLC post-column labeling.
  • FIG. 3 is a diagram showing a chromatogram obtained by subjecting NAH contacted with crudely purified HG-5epi to N-deacetylation and nitrous acid decomposition, followed by HPLC post-column labeling.
  • FIG. 2 is a diagram showing a chromatogram obtained by subjecting NSH brought into contact with crudely purified HG-5epi to nitrous acid decomposition and then subjecting it to HPLC post-column labeling.
  • FIG. 3 is a diagram showing a chromatogram obtained by subjecting NAH contacted with HG-5 epi to N-deacetylation and nitrous acid decomposition, followed by HPLC post-column labeling.
  • the enzyme of the present invention is an enzyme derived from African maimai having the following characteristics (A) and (B).
  • A) It has an activity of isomerizing a GlcA residue of NAH to an IdoA residue and / or an activity of isomerizing an IdoA residue of CDSNAc-HEP to a GlcA residue.
  • B) It has substantially no activity of isomerizing the GlcA residue of NSH to an IdoA residue and / or the activity of isomerizing an IdoA residue of CDSNS-HEP to a GlcA residue.
  • the enzyme of the present invention is an enzyme having HG-5 epi activity.
  • HG-5 epi activity refers to the activity of isomerizing a GlcA residue of NAH to an IdoA residue, and / or complete desulfated / N-acetylated heparin (CDSNac-HEP). ) To isomerize the IdoA residue into a GlcA residue.
  • the HG-5 epi activity can be measured, for example, by the method using the HPLC post-column labeling method described in ⁇ Example 14>, ⁇ Example 16>, or ⁇ Example 17> described later.
  • the HG-5 epi activity can also be measured, for example, by a method using a radioisotope described in ⁇ Example 20> or ⁇ Example 21> described later.
  • the activity of isomerizing a GlcA residue of NAH to an IdoA residue is determined according to the method of ⁇ Example 14>, ⁇ Example 16>, ⁇ Example 20>, or ⁇ Example 21> described later.
  • the activity of isomerizing the CDDoNAc-HEP IdoA residue to a GlcA residue can be measured according to the method of ⁇ Example 17> described later.
  • the enzyme of the present invention may have both an activity of isomerizing a GlcA residue of NAH to an IdoA residue and an activity of isomerizing an IdoA residue of CDSNAc-HEP to a GlcA residue. You may have only one side.
  • the enzyme of the present invention has an activity to isomerize a GlcA residue of NAH to an IdoA residue, and substantially has an activity to isomerize an IdoA residue of CDSNAC-HEP to a GlcA residue. It does not have to be.
  • NAH is a polysaccharide containing a disaccharide composed of a GlcNAc residue and a GlcA residue.
  • CDSNAc-HEP is a polysaccharide containing a disaccharide consisting of a GlcNAc residue and a GlcA residue, and a disaccharide consisting of a GlcNAc residue and an IdoA residue.
  • GlcA and IdoA are collectively referred to as “HexA”. That is, both NAH and CDSNac-HEP are polysaccharides containing a disaccharide consisting of a GlcNAc residue and a HexA residue.
  • NAH and CDSNac-HEP are examples of substrates on which the enzyme of the present invention acts, and are not intended to limit the substrates on which the enzyme of the present invention acts. That is, as long as the enzyme of the present invention has HG-5 epi activity, the enzyme of GlcNAc in other polysaccharides (polysaccharides other than NAH and CDSNAc-HEP) including disaccharides consisting of GlcNAc residues and HexA residues. It may have an activity to isomerize adjacent HexA residues.
  • the “other polysaccharide” here is not particularly limited as long as it is a polysaccharide containing a disaccharide composed of a GlcNAc residue and a HexA residue.
  • the “other polysaccharide” referred to here is a polysaccharide containing a disaccharide consisting of a GlcNAc residue and a GlcA residue and / or a disaccharide consisting of a GlcNAc residue and an IdoA residue.
  • “isomerization of HexA residue” means isomerization from a GlcA residue to an IdoA residue and / or isomerization from an IdoA residue to a GlcA residue.
  • a disaccharide composed of a GlcNAc residue and a HexA residue means a disaccharide formed by combining a GlcNAc residue and a HexA residue.
  • the binding order of the GlcNAc residue and the HexA residue in the “disaccharide consisting of the GlcNAc residue and the HexA residue” here is not limited.
  • Specific examples of the “disaccharide consisting of GlcNAc residue and HexA residue” include disaccharides represented by the following structural formulas (2) to (5).
  • the enzyme of the present invention specifically includes, for example, a disaccharide (GlcNAc ⁇ 1-4GlcA) consisting of a GlcNAc residue and a GlcA residue represented by the following structural formula (2) present in the backbone of the polysaccharide:
  • the activity of isomerizing to a disaccharide (GlcNAc ⁇ 1-4 IdoA) consisting of a GlcNAc residue and an IdoA residue represented by the structural formula (3) and / or the following structural formula (3) existing in the skeleton of the polysaccharide It may be an enzyme having an activity of isomerizing the disaccharide to be disaccharide represented by the following structural formula (2).
  • the enzyme of the present invention specifically includes, for example, a disaccharide (GlcA ⁇ 1-4GlcNAc) consisting of a GlcA residue and a GlcNAc residue represented by the following structural formula (4) present in the skeleton of the polysaccharide:
  • the activity of isomerizing into a disaccharide (IdoA ⁇ 1-4GlcNAc) consisting of an IdoA residue and a GlcNAc residue represented by the structural formula (5) and / or the following structural formula (5) present in the backbone of the polysaccharide It may be an enzyme having an activity to isomerize a disaccharide to be converted into a disaccharide represented by the following structural formula (4).
  • the position of a GlcA residue that is isomerized to an IdoA residue by the enzyme of the present invention in a polysaccharide such as NAH is not particularly limited. That is, such a GlcA residue exists in a polysaccharide skeleton such as NAH in three ways: when present at the reducing end, when present at the non-reducing end, and when present at the intermediate portion of the polysaccharide skeleton. Any of these may be used.
  • the position of the IdoA residue isomerized to the GlcA residue by the enzyme of the present invention in a polysaccharide such as CDSNAc-HEP is not particularly limited. That is, there are three types of such IdoA residues: in the backbone of polysaccharides such as CDSNAC-HEP, when present at the reducing end, when present at the non-reducing end, and when present at the intermediate portion of the polysaccharide backbone. However, either of these may be used.
  • the enzyme of the present invention is an enzyme having substantially no C5-epi activity.
  • C5-epi activity refers to the activity of isomerizing the GlcA residue of NSH to an IdoA residue and / or the IdoA residue of fully desulfated / N-resulfated heparin (CDSNS-HEP). Is the activity of isomerizing to GlcA residues.
  • C5-epi activity can be measured, for example, by the method using the HPLC post-column labeling method described in ⁇ Example 15> or ⁇ Example 18> described later.
  • the activity of isomerizing a GlcA residue of NSH to an IdoA residue can be measured according to the method of ⁇ Example 15> described later.
  • the activity of isomerizing an IdoA residue of CDSNS-HEP into a GlcA residue can be measured according to the method of ⁇ Example 18> described later.
  • substantially having no activity means that the IdoA content is not changed (increased or decreased) at all, or hardly changed (increased or decreased) when the polysaccharide corresponding to the activity is compared before and after contacting with the enzyme. It means not to decrease. That is, for example, “substantially has no C5-epi activity” means that the IdoA content is not changed (increased or decreased) or hardly changed (increased or decreased) when compared before and after contacting NSH with the enzyme. Means that the IdoA content is not changed (increased or decreased) or hardly changed (increased or decreased) when compared before and after contacting the CDSNS-HEP with the enzyme. .
  • IdoA content refers to the ratio of IdoA residues to HexA residues present in the backbone of the polysaccharide, that is, the total number of IdoA residues, the total number of HexA residues (the total number of GlcA residues and the IdoA residues). It is the value converted as a percentage by dividing by the total number of Such IdoA content can be measured, for example, according to the method of ⁇ Example 14>, ⁇ Example 15>, ⁇ Example 16>, ⁇ Example 17>, or ⁇ Example 18> described later.
  • IdoA content hardly changes here means, for example, when the polysaccharide before and after contacting with the enzyme of the present invention is subjected to HPLC post-column labeling method, and the IdoA content is measured and compared.
  • the IdoA content after the enzymatic reaction is n-5 (%) or more and n + 5 (%) or less, n-2 (%) or more and n + 2 (%) or less, n-1 (%) or more and n + 1 ( %) Or less, or n-0.5 (%) or more and n + 0.5 (%) or less).
  • Whether or not a protein has HG-5 epi activity is determined according to the method of ⁇ Example 14>, ⁇ Example 16>, ⁇ Example 17>, ⁇ Example 20>, or ⁇ Example 21> described later. can do. Whether or not a certain protein substantially has C5-epi activity can be determined according to the method of ⁇ Example 15> or ⁇ Example 18> described later. Therefore, according to these methods, it can be determined whether or not any protein derived from African maimai is the enzyme of the present invention.
  • the enzyme of the present invention can be obtained from African Maimai.
  • the enzyme of the present invention can be obtained from a cell lysate or cell extract obtained by crushing cells of African mussel. Such “disruption” can be carried out by a method appropriately selected according to the type of cell. Examples of the crushing method include a method of homogenizing, a method of ultrasonic treatment, a method of freezing and thawing, a method of adding a surfactant, and the like. These methods can be used in appropriate combination.
  • the cell from which the enzyme of the present invention is obtained is not particularly limited as long as the enzyme of the present invention is expressed. Examples of such cells include mucous gland cells.
  • the enzyme of the present invention can be obtained by a known method used for protein separation and purification. Examples of such a method include ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxyapatite chromatography, and affinity chromatography. These methods can be used in appropriate combination.
  • the enzyme of the present invention may be composed only of the enzyme of the present invention or may contain components other than the enzyme of the present invention.
  • components other than the enzyme of the present invention include alkali metal salts, surfactants, buffers, components derived from African mussel, and the like.
  • the shape of the enzyme of the present invention is not particularly limited, and may be liquid or solid. When the enzyme of the present invention is provided in a liquid state, it may be provided in a frozen state or in a liquid state (melted state). Examples of the case where the enzyme of the present invention is provided in a solid form include provision as an immobilized enzyme bound to a lyophilized product, agarose beads, or the like.
  • the weight concentration occupied by the enzyme of the present invention can be appropriately set to an arbitrary concentration.
  • the weight concentration occupied by the enzyme of the present invention is, for example, 0.001% or more, 0.01% or more, 0.1% or more, 1% or more, 5% or more, 10% or more, 25% Or 50% or more.
  • the weight concentration occupied by the enzyme of the present invention is, for example, 100% or less, 75% or less, 50% or less, 25% or less, 10% or less, 5% or less, or 1% or less. It's okay.
  • polypeptide of the present invention is a polypeptide having HG-5 epi activity.
  • the polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polypeptide having HG-5 epi activity.
  • One embodiment of the polypeptide of the present invention may be one embodiment of the enzyme of the present invention described above.
  • the polypeptide of the present invention may be a polypeptide having a specific amino acid sequence and having HG-5 epi activity, for example.
  • the polypeptide of the present invention may be, for example, a polypeptide selected from the group consisting of the following (A) to (C).
  • A1) An amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 601 in SEQ ID NO: 2.
  • A2) An amino acid sequence represented by amino acid numbers 34 to 601 in SEQ ID NO: 2.
  • B) In the amino acid sequence of the polypeptide of (A), one or several amino acid residues includes an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and has HG-5 epi activity Polypeptide.
  • C A polypeptide comprising the amino acid sequence of a fusion polypeptide obtained by adding a peptide tag to the polypeptide of (A) or (B) and having HG-5 epi activity.
  • the polypeptide of the present invention includes the following three aspects.
  • the first embodiment is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 601 or 34 to 601 in SEQ ID NO: 2.
  • the second aspect includes an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence of the polypeptide shown in the first aspect, and HG A polypeptide having -5 epi activity.
  • the third aspect is a polypeptide comprising the amino acid sequence of a fusion polypeptide obtained by adding a peptide tag to the polypeptide shown in the first aspect or the second aspect, and having HG-5 epi activity.
  • the expression “including an amino acid sequence” includes the case of “consisting of an amino acid sequence”.
  • the term “several” as used in the second aspect means the number of amino acid residues that do not lose HG-5 epi activity even when substitutions, deletions, insertions, and / or additions are made.
  • the total number of amino acid residues is preferably 10% or less, more preferably 5% or less, further preferably 2% or less, and particularly preferably 1% or less.
  • “several” is preferably 2 to 60, more preferably 2 The number may be ⁇ 30, more preferably 2 to 12, and particularly preferably 2 to 6.
  • “several” is preferably 2 to 56, more preferably 2 to The number may be 28, more preferably 2 to 11, particularly preferably 2 to 5.
  • the “several” may be 2, 2, 3, 2-4, or 2-5.
  • substitution, deletion, insertion, and / or addition in the second aspect is, for example, a conservative mutation that does not lose HG-5 epi activity.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid.
  • Gln and Asn in the case of a basic amino acid, between Lys, Arg and His, in the case of an acidic amino acid, between Asp and Glu, an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln substitution, Cys to Ser or Ala substitution, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, Met to Ile, L u, Val or Phe substitution, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu substitution, Ser to Thr or Ala substitution, Thr to Ser or Ala substitution, Trp to Phe or Tyr substitution , Sub
  • the polypeptide shown in the second aspect is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably, with respect to the entire amino acid sequence of the polypeptide shown in the first aspect.
  • the term “homology” as used herein may mean “identity”.
  • the “peptide tag” in the third aspect means a peptide consisting of an amino acid sequence for facilitating protein detection and purification.
  • the length and amino acid sequence of the “peptide tag” as used herein are not particularly limited as long as the fusion polypeptide in which this peptide tag is added to the polypeptide shown in the first embodiment or the second embodiment does not lose HG-5 epi activity. It is not limited.
  • Such peptide tags include FLAG (registered trademark) peptide (FLAG tag), 6 ⁇ His peptide (His Tag (registered trademark)), c-myc peptide (myc tag), protein A, MBP (maltose binding protein) ), GST (glutathione-S-transferase) and the like, among which FLAG peptide (SEQ ID NO: 32) is preferred.
  • Such a “peptide tag” may be added directly to the polypeptide shown in the first aspect or the second aspect, or may be added via a peptide linker consisting of any amino acid sequence. .
  • the length and amino acid sequence of the “peptide linker” here is the same as in the case of the peptide tag, and the fusion polypeptide added to the polypeptide shown in the first embodiment or the second embodiment does not lose HG-5epi activity.
  • Examples of such a peptide linker include a dipeptide in which the N-terminal side is asparagine and the C-terminal side is serine, and a dipeptide in which the N-terminal side is valine and the C-terminal side is aspartic acid.
  • such a “peptide tag” may be added only to the N-terminal side of the polypeptide shown in the first aspect or the second aspect, or may be added only to the C-terminal side, although it may be added to both ends, it is preferably added only to the N-terminal side.
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide having HG-5 epi activity.
  • the presence or absence of HG-5 epi activity can be determined, for example, according to the method of ⁇ Example 14>, ⁇ Example 16>, ⁇ Example 17>, ⁇ Example 20>, or ⁇ Example 21> described later. . Therefore, the polypeptide shown in the second aspect or the third aspect can be selected by these methods. That is, the polypeptide shown in the second aspect is, for example, the substitution, deletion, insertion of one or several amino acid residues without loss of HG-5 epi activity, using as an index the presence or absence of HG-5 epi activity.
  • the polypeptide shown in the third aspect has, for example, an amino acid sequence to which a peptide tag can be added without losing HG-5 epi activity, using the presence or absence of HG-5 epi activity as an index. It can be obtained by selecting from the amino acid sequence of the polypeptide shown in the embodiment.
  • the polypeptide of the present invention is adjacent to the GlcNAc residue in other polysaccharides (polysaccharides other than NAH and CDSNAc-HEP) including disaccharides consisting of GlcNAc and HexA residues. It may have an activity to isomerize the HexA residue.
  • the polypeptide of the present invention may or may not have C5-epi activity.
  • the presence or absence of C5-epi activity can be determined, for example, according to the method of ⁇ Example 15> or ⁇ Example 18> described later.
  • the polypeptide of the present invention may have a feature that the optimum pH of HG-5 epi activity is 5.5 to 6.0.
  • the optimum pH can be determined, for example, according to the method described in ⁇ Example 22> described later.
  • the polypeptide of the present invention may have a characteristic that HG-5 epi activity is substantially lost in the presence of 0.1% (w / v) or more of sodium deoxycholate.
  • the polypeptide of the present invention is characterized in that HG-5 epi activity decreases depending on the concentration of alkali metal chloride and / or alkaline earth metal chloride (ie, alkali metal chloride and / or alkali metal chloride).
  • the HG-5epi activity may decrease as the concentration of the earth metal chloride increases.
  • alkali metal chloride used herein include sodium chloride.
  • alkaline earth metal chloride used herein include magnesium chloride, calcium chloride, and manganese chloride.
  • the feature may be prominent in alkaline earth metal chlorides, especially calcium chloride.
  • the feature may be, for example, a feature that HG-5 epi activity is substantially lost in the presence of 64 mM or more of calcium chloride.
  • HG-5 epi activity is substantially lost means, for example, that HG-5 epi activity in the presence of a target substance (sodium deoxycholate, alkali metal chloride, alkaline earth metal chloride, etc.) is present. It may mean 10% or less, 5% or less, 2% or less, or 1% or less of the HG-5epi activity in the absence of the target substance.
  • a target substance sodium deoxycholate, alkali metal chloride, alkaline earth metal chloride, etc.
  • HG-5epi activity has been substantially lost can be determined, for example, according to the method using a radioisotope described in ⁇ Example 23> or ⁇ Example 24> described later.
  • “HG-5 epi activity is substantially lost” specifically means, for example, in the presence of a target substance (sodium deoxycholate, alkali metal chloride, alkaline earth metal chloride, etc.).
  • the polypeptide is brought into contact with a target polysaccharide (eg, [5- 3 H] NAH) in which the hydrogen atom at the 5-position of the HexA residue is substituted with 3 H (tritium), and the target polysaccharide (eg, [5 -3 H] NAH) is removed and the collected solution is subjected to a scintillation counter, which is generated when the HexA residue in the target polysaccharide (eg, [5- 3 H] NAH) is isomerized by HG-5 epi activity
  • the measured value (dpm) is not significantly different, for example, the measured value of the solution derived from the reaction solution after contact is derived from the reaction solution before contact. Solution It may mean that the value is not more than three times the measured value.
  • the “[5- 3 H] NAH” here can be prepared, for example, according to the method of ⁇ Example 19> described later.
  • polypeptide of the present invention is not limited to a polypeptide having a specific amino acid sequence as shown in the first to third aspects as long as it is a polypeptide having HG-5 epi activity.
  • the polypeptide of the present invention may be, for example, a polypeptide having HG-5 epi activity and having one or more of the characteristics exemplified above.
  • the polypeptide of the present invention may be, for example, a polypeptide having the following characteristics (A) to (C).
  • A) Has HG-5 epi activity.
  • B) The optimum pH is 5.5 to 6.0.
  • Such a polypeptide may further have one or more of the features exemplified above. That is, such a polypeptide has, for example, isomerization of HexA residues adjacent to GlcNAc residues in other polysaccharides (polysaccharides other than NAH and CDSNAc-HEP) including disaccharides consisting of GlcNAc residues and HexA residues. It may have the activity to convert. Further, such a polypeptide may have, for example, C5-epi activity, or may not have substantially. In addition, such a polypeptide may have a feature that the activity decreases depending on, for example, the concentration of alkali metal chloride and / or alkaline earth metal chloride.
  • polypeptide of the present invention can be prepared by a genetic engineering technique using, for example, the host cell of the present invention described later.
  • Genetic engineering techniques include methods using insect cells described in ⁇ Example 6> to ⁇ Example 13> described later.
  • nucleic acid of the present invention is a nucleic acid encoding the enzyme of the present invention or the polypeptide of the present invention.
  • one embodiment of the polypeptide of the present invention may be one embodiment of the enzyme of the present invention described above. Therefore, one aspect of the nucleic acid of the present invention may be a nucleic acid encoding the enzyme of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the polypeptide of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention includes all nucleic acids having different base sequences due to the degeneracy of the genetic code as long as they encode the polypeptide of the present invention.
  • Nucleic acid as used herein includes DNA and RNA. Further, the nucleic acid of the present invention may be double-stranded or single-stranded, and in the case of double-stranded, it may be a hybrid strand composed of DNA and RNA. Furthermore, the nucleic acid of the present invention may be a nucleic acid containing an intron sequence in the region encoding the polypeptide of the present invention as long as it encodes the polypeptide of the present invention, and encodes the polypeptide of the present invention. The nucleic acid may not contain an intron sequence in the region.
  • nucleic acid of the present invention examples include mRNA derived from African mimy (mRNA precursor or mature mRNA) and cDNA synthesized from mRNA by reverse transcription reaction. Moreover, the nucleic acid of the present invention may be an isolated nucleic acid.
  • the nucleic acid of the present invention may be, for example, a nucleic acid encoding a polypeptide having a specific base sequence and having HG-5 epi activity.
  • the nucleic acid of the present invention may be, for example, DNA selected from the group consisting of the following (A) to (C).
  • A1) A base sequence represented by base numbers 1-1806 in SEQ ID NO: 1.
  • A2) A base sequence represented by base numbers 100 to 1806 in SEQ ID NO: 1.
  • B) A DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the DNA of (A) above under stringent conditions and encodes a polypeptide having HG-5 epi activity.
  • C A DNA comprising a base sequence of a fusion DNA obtained by adding a DNA encoding a peptide tag to the DNA of (A) or (B), and encoding a polypeptide having HG-5 epi activity.
  • the nucleic acid of the present invention includes the following three aspects.
  • the first embodiment is a DNA comprising the base sequence represented by base numbers 1-1806 or 100-1806 in SEQ ID NO: 1.
  • the second aspect is DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the DNA shown in the first aspect and encodes a polypeptide having HG-5 epi activity.
  • the third aspect includes a DNA encoding a polypeptide having a base sequence of a fusion DNA obtained by adding a DNA encoding a peptide tag to the DNA shown in the first aspect or the second aspect, and having HG-5 epi activity It is.
  • Such DNA may be isolated DNA.
  • the expression “including a base sequence” includes the case of “consisting of a base sequence”.
  • the DNA shown in the first embodiment can be obtained, for example, by the method described in ⁇ Example 1> to ⁇ Example 5> described later.
  • the DNA shown in the first embodiment is a nucleic acid (chromosomal DNA or cDNA) derived from African maimai by PCR (Polymerase Chain Reaction) reaction using an oligonucleotide prepared based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a primer. ) As a template to amplify the DNA fragment.
  • the “stringent condition” in the second aspect means a condition in which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. That is, the “stringent conditions” referred to herein means conditions under which a specific hybrid is formed with respect to DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA shown in the first embodiment.
  • stringent conditions DNAs having high homology, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more have homology. Examples include conditions in which DNAs hybridize and DNAs having lower homology do not hybridize.
  • Such conditions include 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 60 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, which are washing conditions for normal Southern hybridization. More preferably, the conditions include washing once, preferably 2 to 3 times at a salt concentration and temperature corresponding to 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • Such conditions include, for example, 42 ° C. in a solution composed of 50% formamide, 4 ⁇ SSC, 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.0), 10 ⁇ Denhardt's solution, and 100 ⁇ g / mL salmon sperm DNA.
  • the DNA shown in the second embodiment is, for example, a nucleic acid residue substitution, deletion, insertion, and / or addition (hereinafter collectively referred to as “mutation”) with respect to the base sequence of the DNA shown in the first embodiment. It can be prepared by performing “introduction”.
  • the “mutation introduction” here can be performed by, for example, a known method.
  • Examples of the method for performing “introduction of mutation” include a method using a restriction enzyme and T4 DNA ligase. That is, it consists of the base sequence of SEQ ID NO: 1 obtained by subjecting both ends of a DNA fragment having a mutation introduced to the base sequence so as to encode a polypeptide having a desired amino acid sequence to be restricted with a restriction enzyme and restricted with the same restriction enzyme. After mixing with a vector into which the DNA has been subcloned, both are ligated with T4 DNA ligase, whereby DNA into which the mutation has been introduced can be obtained.
  • Such a “DNA fragment having a mutation introduced into a base sequence” can be obtained, for example, by a PCR reaction using an oligonucleotide having such a mutation as a primer.
  • two complementary oligonucleotides synthesized so as to have a sequence in which a mutation is introduced into a base at a desired site are mixed in an aqueous solution, heated at 90 to 100 ° C. for 1 to 2 minutes, and then cooled to room temperature. Can also be obtained.
  • a site-specific mutagenesis method for example, a method using a PCR reaction (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)) and methods using phage (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • the site-specific mutagenesis method can be performed using, for example, KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • the “peptide tag” referred to in the third aspect is the same as the peptide tag described in detail in the above “(2) Polypeptide of the present invention”. Therefore, as long as the encoded polypeptide has HG-5 epi activity, a fusion DNA to which a DNA encoding a peptide tag is added is also exemplified as the nucleic acid of the present invention.
  • “DNA encoding a peptide tag” may be DNA encoding only a peptide tag, or may be fusion DNA comprising DNA encoding a peptide tag and DNA encoding a linker sequence.
  • the nucleic acid of the present invention can also be obtained by chemically total synthesis of the base sequence.
  • the polypeptide encoded by the nucleic acid of the present invention has HG-5 epi activity.
  • the polypeptide encoded by the nucleic acid of the present invention can be prepared by the method described in “(2) Polypeptide of the present invention”.
  • the presence or absence of HG-5 epi activity of the polypeptide encoded by the nucleic acid of the present invention can be determined by the method described in the above “(2) Polypeptide of the present invention”.
  • the vector of the present invention is a vector containing the nucleic acid of the present invention.
  • the vector of the present invention may contain one type of nucleic acid of the present invention, or may contain two or more types of nucleic acid of the present invention.
  • the vector of the present invention may contain one copy of the nucleic acid of the present invention, or may contain two copies or more of the nucleic acid of the present invention.
  • vector means a nucleic acid molecule used to introduce the nucleic acid of the present invention into a host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as the nucleic acid of the present invention can be amplified or the polypeptide encoded by the nucleic acid of the present invention can be expressed in a host cell. Examples of such vectors include phages, plasmids, viruses and the like.
  • the vector can be appropriately selected according to various conditions such as the type of host cell and the desired expression level of the polypeptide encoded by the nucleic acid of the present invention.
  • a prokaryotic cell such as a bacterial cell
  • a phage or a plasmid can be preferably used as the vector.
  • a eukaryotic cell such as an insect cell
  • a plasmid or a virus can be preferably used as the vector.
  • phage that can be used in bacterial cells examples include phage particles packaged with a plasmid that functions as phage DNA.
  • plasmids that can be used in bacterial cells include pBlue Script II SK (+).
  • examples of the plasmid that can be used in insect cells include pIZ-V5 (manufactured by Life Technologies).
  • viruses that can be used in insect cells include baculovirus.
  • the baculovirus is preferably a nuclear polyhedrosis virus (NPV).
  • NPV nuclear polyhedrosis virus
  • examples of NPV include AcNPV (Autographa californica NPV) and BmNPV (Bombyx mori NPV). Among them, AcNPV is preferable.
  • the introduction of the nucleic acid of the present invention into the phage can be performed according to a conventional method.
  • Examples of the method for introducing the nucleic acid of the present invention into the phage include the method described in ⁇ Example 2> below. That is, for example, the phage DNA containing the nucleic acid of the present invention may be packaged in phage particles. Specifically, for example, any two of restriction enzyme sites present at a multicloning site of a plasmid that functions as a phage DNA are selected, and the plasmid and the nucleic acid of the present invention are subjected to limited digestion with these restriction enzymes, followed by ligation. That's fine.
  • An example of such a plasmid is Lambda ZAP II.
  • nucleic acid of the present invention DNA obtained by PCR reaction using an oligonucleotide having a restriction enzyme site added to the 5 ′ end side as a primer may be used.
  • the restriction enzyme site is introduced into the nucleic acid of the present invention by ligating a DNA fragment having a structure generated at the time of limited degradation with a restriction enzyme at the 5 ′ end to the DNA fragment which is the nucleic acid of the present invention. Also good.
  • nucleic acid of the present invention into a plasmid can be performed according to a conventional method.
  • Examples of the method for introducing the nucleic acid of the present invention into a plasmid include the methods described in ⁇ Example 6> or ⁇ Example 10> described later. That is, for example, any two of restriction enzyme sites present in a multicloning site of a plasmid may be selected, and the plasmid and the nucleic acid of the present invention may be limitedly decomposed with these restriction enzymes and then ligated.
  • DNA obtained by a PCR reaction using an oligonucleotide having a restriction enzyme site added to the 5 'end side as a primer may be used.
  • the restriction enzyme site is introduced into the nucleic acid of the present invention by ligating a DNA fragment having a structure generated at the time of limited degradation with a restriction enzyme at the 5 ′ end to the DNA fragment which is the nucleic acid of the present invention. Also good.
  • Introduction of the nucleic acid of the present invention into a virus can be performed according to a conventional method.
  • introduction of the nucleic acid of the present invention into a virus can be performed by preparing a bacmid.
  • a bacmid introduced with the nucleic acid of the present invention can be prepared by transforming a bacterial strain for preparing the bacmid using a donor plasmid introduced with the nucleic acid of the present invention.
  • the bacterial strain for preparing the bacmid include E. coli DH10Bac strain.
  • An example of the donor plasmid is pFastBac1.
  • the bacmid thus prepared functions as a virus as it is by transforming host cells such as insect cells.
  • the nucleic acid of the present invention can be introduced into a virus by using a plasmid called a transfer vector.
  • a virus into which the nucleic acid of the present invention has been introduced can be obtained by co-transfecting a transfer vector into which the nucleic acid of the present invention has been introduced and a viral genome into a host cell such as an insect cell.
  • the transfer vector include pPSC8 (manufactured by Protein Science) and pVL1393 (manufactured by AB Vector).
  • the host cell of the present invention is a host cell that holds the nucleic acid of the present invention and / or the vector of the present invention (hereinafter collectively referred to as “the vector of the present invention”). is there. Since the vector of the present invention is a vector containing the nucleic acid of the present invention, the host cell holding the vector of the present invention also corresponds to the host cell holding the nucleic acid of the present invention.
  • the host cell of the present invention may hold one type of the vector of the present invention, or may hold two or more types of the vector of the present invention.
  • the host cell of the present invention may hold one copy of the vector of the present invention or the like, or may hold two copies or more of the vector of the present invention.
  • the host cell of the present invention may hold the vector of the present invention on the chromosome, may hold the vector of the present invention outside the chromosome, and both of the present invention both on the chromosome and extrachromosomally.
  • a vector or the like may be held.
  • the host cell of the present invention may be a host cell transformed with the vector of the present invention.
  • the “host cell” as used herein means a cell used as a host for amplifying the vector of the present invention or a host for expressing a polypeptide encoded by the vector of the present invention. Such host cells are not particularly limited as long as transformation using the vector of the present invention is possible.
  • the host cell is preferably an isolated cell. The host cell can be appropriately selected depending on the purpose of using the vector of the present invention.
  • the host cell is preferably, for example, a prokaryotic cell, specifically a bacterial cell, and more preferably Escherichia coli.
  • E. coli include XL-1 Blue MRF 'strain, JM109 strain, and DH5 ⁇ strain.
  • a host cell commonly used for the expression of a heterologous protein can be used.
  • a host cell is preferably, for example, a eukaryotic cell, specifically an insect cell, an animal cell, a plant cell, or a yeast cell, and more preferably an insect cell.
  • insect cells include Sf9 cells, Sf21 cells, and SF + cells derived from Spodoptera frugiperda, and High Five cells derived from nettle guava (Trichoplusia ni).
  • Insect cells are preferably derived from sugar beet, especially Sf21 cells.
  • Transformation of host cells can be performed according to a conventional method.
  • the method for transforming the host cell is not particularly limited as long as the vector of the present invention can be introduced into the host cell.
  • Specific examples of methods for transforming host cells include the calcium phosphate method, the lipofection method, the DEAE dextran method, the electroporation method, and the microinjection method. Among these, the lipofection method is preferable.
  • the lipofection method is preferably performed using Cellfectin II Reagent.
  • polypeptide production method of the present invention can be produced using, for example, the host cell of the present invention. That is, the polypeptide of the present invention is produced, for example, by a polypeptide production method (hereinafter referred to as “the polypeptide production method of the present invention”) comprising the following steps (A) and (B). Can do.
  • the polypeptide production method of the present invention comprising the following steps (A) and (B). Can do.
  • A A step of expressing a polypeptide having HG-5 epi activity using the host cell of the present invention.
  • B A step of collecting the polypeptide expressed in the step (A).
  • the step (A) is a step of culturing the host cell of the present invention and expressing a polypeptide having HG-5 epi activity encoded by the vector of the present invention (ie, the polypeptide of the present invention).
  • step (A) specifically, for example, Sf21 obtained by extracting bacmid from E. coli DH10Bac strain transformed with pFastBac1 into which the nucleic acid of the present invention has been introduced, and transforming this bacmid by the lipofection method.
  • a step of culturing cells can be mentioned.
  • the culture conditions for culturing host cells are not particularly limited as long as the polypeptide of the present invention encoded by the vector of the present invention can be expressed.
  • the culture conditions can be appropriately selected according to various conditions such as the type of host cell and the desired expression level of the polypeptide of the present invention encoded by the vector of the present invention.
  • a medium usually used for culturing insect cells can be used for culturing insect cells. Examples of such a medium include a commercially available serum-free medium for insect cells, and specifically, an Sf900III serum-free medium.
  • the culture can be performed, for example, by shaking culture at 27 ° C. to 28 ° C.
  • the step (B) is a step of collecting the polypeptide of the present invention expressed in the host cell in the step (A).
  • collecting means obtaining a fraction containing the polypeptide of the present invention from a culture of host cells. That is, when the polypeptide of the present invention is expressed in a form secreted extracellularly, the culture solution itself may be collected as the polypeptide of the present invention, or the supernatant after centrifugation may be collected as the polypeptide of the present invention. It may be collected as a peptide, or a fraction after being purified by column or the like may be collected as a polypeptide of the present invention.
  • polypeptide of the present invention when expressed in a form that accumulates in cells, an extract obtained by disrupting the cells may be collected as the polypeptide of the present invention, or this extract may be collected in a column or the like. The fraction obtained after purification by use may be collected as the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention when expressed in a form that accumulates on the cell membrane, the cell itself may be collected as the polypeptide of the present invention, or a crushed product obtained by crushing the cell may be used as the polypeptide of the present invention.
  • Such “disruption” can be carried out by a method appropriately selected according to the type of the host cell, and examples thereof include a homogenization method, a sonication method, a freeze-thaw method, and a surfactant addition method. The These methods can be used in appropriate combination.
  • Purification can be performed by a known method used for protein separation and purification. Examples of such a method include ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxyapatite chromatography, and affinity chromatography.
  • purification can be performed by affinity chromatography using affinity for the tag.
  • the weight concentration in the fraction collected by the polypeptide of the present invention is, for example, 0.001% or more, 0.01% or more, 0.1% or more, 1% or more, 5% or more, 10% or more, 25 % Or more, or 50% or more. Further, the weight concentration in the fraction collected by the polypeptide of the present invention is, for example, 100% or less, 75% or less, 50% or less, 25% or less, 10% or less, 5% or less, or 1% or less. It may be.
  • Whether the polypeptide of the present invention is contained in the fraction collected in this manner is determined by measuring the presence or absence of HG-5 epi activity according to the method described in “(2) Polypeptide of the present invention”. Can be determined. Moreover, whether or not the polypeptide of the present invention is contained in the fraction collected in this manner can also be determined by Western blotting using an antibody that binds to the polypeptide of the present invention. Western blotting can be performed according to the method of ⁇ Example 9> described later.
  • the polysaccharide production method of the present invention comprises an enzyme and / or polypeptide having HG-5 epi activity (hereinafter collectively referred to as “HG-5 epi of the present invention”) as GlcNAc.
  • HG-5 epi of the present invention HG-5 epi activity
  • the HG-5epi of the present invention may have C5-epi activity or may not have substantially any.
  • HG-5epi of the present invention one enzyme having HG-5epi activity may be used, or two or more enzymes having HG-5epi activity may be used.
  • HG-5epi of the present invention one kind of polypeptide having HG-5epi activity may be used, or two or more kinds of polypeptides having HG-5epi activity may be used.
  • one or more enzymes having HG-5epi activity may be used in combination with one or more polypeptides having HG-5epi activity.
  • the “enzyme having HG-5 epi activity” include the enzyme of the present invention.
  • polypeptide having HG-5 epi activity include the polypeptide of the present invention.
  • polysaccharide containing a disaccharide consisting of a GlcNAc residue and a HexA residue is not particularly limited as long as it is a substrate on which HG-5epi of the present invention acts.
  • a disaccharide composed of a GlcNAc residue and a HexA residue means a disaccharide formed by combining a GlcNAc residue and a HexA residue.
  • the order of binding of GlcNAc residue and HexA residue in the “disaccharide consisting of GlcNAc residue and HexA residue” is not limited.
  • the “disaccharide consisting of GlcNAc residue and HexA residue” may be present in at least one position in the backbone of one molecule of polysaccharide.
  • the “disaccharide consisting of a GlcNAc residue and a HexA residue” may exist only in one position in the backbone of one molecule of polysaccharide, or may exist in two positions or more.
  • a tetrasaccharide or more chain formed by linking two or more disaccharides It may be present in the polysaccharide skeleton as a sugar chain having a long length, or may be present in the polysaccharide skeleton as being bound via another molecule.
  • Examples of the “other molecule” include a sugar chain composed of one or more sugar residues and a sugar residue other than a disaccharide composed of a GlcNAc residue and a HexA residue. .
  • the binding mode of the GlcNAc residue and the HexA residue in the “disaccharide consisting of the GlcNAc residue and the HexA residue” is not particularly limited as long as the HG-5epi of the present invention can act.
  • the binding mode of “a disaccharide consisting of a GlcNAc residue and a HexA residue” is preferably a 1-4 glycosidic bond.
  • the GlcNAc residue and HexA residue anomers in the “disaccharide consisting of GlcNAc residue and HexA residue” are: GlcNAc residue is ⁇ anomer, GlcA residue is ⁇ anomer, and IdoA residue is ⁇ anomer Is preferred.
  • a “disaccharide consisting of a GlcNAc residue and a HexA residue” specifically, a bond between a GlcNAc residue and a GlcA residue is [-4GlcNAc ⁇ 1-4GlcA ⁇ 1-] or [-4GlcA ⁇ 1-4GlcNAc ⁇ 1-].
  • a disaccharide in which the bond between a GlcNAc residue and an IdoA residue is represented by [-4GlcNAc ⁇ 1-4IdoA ⁇ 1-] or [-4IdoA ⁇ 1-4GlcNAc ⁇ 1-].
  • polysaccharide containing “a disaccharide comprising a GlcNAc residue and a HexA residue” include NAH, complete desulfated / N-acetylated HS (CDSNac-HS), CDSNAC-HEP, ACH ( 2-0-desulfated AS) and the like are exemplified, among which NAH and CDSNac-HEP are preferable.
  • “isomerization of HexA residue” means isomerization from a GlcA residue to an IdoA residue and / or isomerization from an IdoA residue to a GlcA residue. That is, the “polysaccharide in which the HexA residue is isomerized” as used herein refers to a step of bringing the HG-5epi of the present invention into contact with a polysaccharide containing a disaccharide composed of a GlcNAc residue and a HexA residue, specifically, Isomerizing all or part of the GlcA residues of the disaccharide contained in the polysaccharide backbone to IdoA residues, and / or all of the IdoA residues of the disaccharide contained in the polysaccharide backbone Or the polysaccharide obtained by the process of isomerizing a part to GlcA residue.
  • the HexA residue ie, the HexA residue adjacent to the GlcNAc residue
  • the HexA residue is isomerized.
  • a method for increasing or decreasing the IdoA content of the polysaccharide, and a method for producing a polysaccharide using the method isomerized.
  • the “HexA residue isomerized polysaccharide” as used herein specifically includes, for example, a polysaccharide containing a structure in which all or part of the NAc GlcA residue is isomerized to an IdoA residue, CDSNAc ⁇ A polysaccharide comprising a structure in which all or part of the GlcA residue of HEP is isomerized to an IdoA residue and / or a structure in which all or part of an IdoA residue is isomerized to a GlcA residue. It is done.
  • the “polysaccharide in which the HexA residue is isomerized” may be a polysaccharide having an IdoA residue.
  • the IdoA content in the “polysaccharide in which the HexA residue is isomerized” is not particularly limited, and is arbitrary depending on the conditions in which the HG-5epi of the present invention is contacted with a polysaccharide containing a disaccharide composed of a GlcNAc residue and a HexA residue.
  • the value can be controlled. Specifically, various conditions such as the amount of the HG-5 epi of the present invention to be added to the reaction system and the reaction time may be set as appropriate so as to obtain a desired IdoA content.
  • the definition of “IdoA content” here is as described in detail in the above “(1) Enzyme of the present invention”.
  • Such “polysaccharides with isomerized HexA residues” include, for example, HEP with an IdoA content of 77% and HS with a content of 19% (Hook M, Lindahl U, Iverius PH., Biochem J. 1974 Jan; 137 (1): 33-43.) May be a polysaccharide characterized by a different IdoA content.
  • the IdoA content of the “polysaccharide in which the HexA residue is isomerized” can be appropriately set.
  • the IdoA content in the “HexA residue isomerized polysaccharide” is, for example, 0.1% or more, 1% or more, 5% or more, 10% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% It may be 40% or more, or 50% or more.
  • the “IdoA content” mentioned here is, for example, 100% or less, 99% or less, 95% or less, 90% or less, 80% or less, 75% or less, 70% or less, 65% or less, 60% or less, 50 % Or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 1% or less.
  • the IdoA content in the “HexA residue isomerized polysaccharide” is 20% to 75%, 25% to 75%, 30% to 75%, 35% to 75%, 40% to 75%, 20% to 70%, 25% to 70%, 30% to 70%, 35% to 70%, 40% to 70%, 20% to 65%, 25% to 65%, 30% to 65%, 35% to 65% 40% to 65%, 20% to 60%, 25% to 60%, 30% to 60%, 35% to 60%, 40% to 60%, and the like.
  • the polysaccharide obtained by isomerizing the HexA residue obtained by the polysaccharide production method of the present invention is useful as a novel material.
  • CDSNac-HEP, CDSNS-HEP, NAH, and NSH used in this example were obtained according to methods described in known literatures.
  • CDSNac-HEP and CDSNS-HEP completely desulfated heparin (CDS-HEP) was used as an intermediate.
  • CDS-HEP was obtained by desulfating HEP by a method referring to known literature. That is, HEP derived from porcine intestinal tract (manufactured by Sigma-Aldrich) was subjected to 6-O-desulfation using N-methyl-N- (trimethylsilyl) -trifluoroacetamide (MTSTFA) and in the presence of sodium hydroxide. Freeze-dried 2-O-desulfation (Kariya Y, Herrmann J, Suzuki K, Isomura T, Ishihara M., J Biochem. 1998 Feb; 123 (2): 240-6.) And heating in DMSO solvent N-desulfation (Ayotte ⁇ ⁇ L, Perlin AS., Carbohydr Res. 1986 Jan 1; 145 (2): 267-77.) By the solvolysis reaction. CDS-HEP thus obtained has a structure in which substantially all sulfate groups have been removed from HEP.
  • MTSTFA N-methyl-N- (trimethyls
  • CDSNac-HEP was obtained by subjecting CDS-HEP to N-acetylation using acetic anhydride (Danishefsky I., Methods Carbohydr. Chem. 1965; 5: 407-409.).
  • CDSNS-HEP is obtained by N-sulfation of CDS-HEP using a sulfur trioxide pyridine complex (Leali D, Belleri M, Urbinati C, Coltrini D, Oreste P, Zoppetti G, Ribatti D, Rusnati M, Presta M., J Biol Chem. 2001 Oct 12; 276 (41): 37900-8.).
  • NAH is cultured according to a method described in a known document (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-018840) by culturing E. coli K5 strain (Serotype O10: K5 (L): H4, ATCC 23506) and subjecting the culture supernatant to purification. It is obtained.
  • NSH consists of N-deacetylation in which NAH is heated in aqueous sodium hydroxide and N-sulfation with sulfur trioxide pyridine complex (Leali D, Belleri M, Urbinati C, Coltrini D, Oreste P, Zoppetti G, Ribatti D, Rusnati M, Presta M., J Biol Chem. 2001 Oct 12; 276 (41): 37900-8.).
  • RNA derived from African Maimai mucus gland The mRNA of African Maimai was obtained by hot phenol method (for example, Verwoerd TC, Dekker BM, Hoekema A., Nucleic Acids Res. 1989 Mar 25; 17 (6): 2362. The total RNA was extracted from the mucous gland by the method described above and then subjected to a purification method using magnetic beads to obtain mRNA. The procedure is shown below.
  • the mucous gland extracted by incising one African Maimai with a scalpel was washed with distilled water and then sealed in a 1.5 mL screw cap tube.
  • the tube was immersed in liquid nitrogen for 1 minute to freeze, then the mucous gland was crushed using a homogenizer and heated in a water bath at 80 ° C. for hot extraction buffer (heated in a 55 ° C. water bath for thawing).
  • 0.25 mL of a chloroform solution (a solution prepared by adding chloroform and isoamyl alcohol at a ratio of 24: 1) was added, and the mixture was further stirred for 30 seconds using a test tube mixer.
  • This solution was centrifuged at 20,000 ⁇ g for 5 minutes, 0.2 mL from the upper layer (aqueous layer) was transferred to another tube, 0.2 mL of 4M LiCl was added, mixed, and left at ⁇ 20 ° C. overnight. did. Thereafter, the mixture was centrifuged at 20,000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed to obtain a total RNA precipitate. The precipitate was dissolved in 0.25 mL of distilled water, and 0.025 mL of 3M CH 3 COONa (pH 5.2) and 0.5 mL of ethanol were added and mixed.
  • RNA precipitate was obtained again. After adding 0.5 mL of 70% ethanol to wash the precipitate, the supernatant was removed and air-dried to obtain a total RNA precipitate again.
  • RNA precipitate 0.5 mL of distilled water was added and gently pipetted to dissolve the precipitate.
  • PolyATract registered trademark
  • mRNA Isolation System manufactured by Promega Corporation
  • ⁇ Example 2> Preparation of African Myamy cDNA Phage Library Using AccuScript Hi-Fi cDNA Synthesis Kit (manufactured by Agilent Technologies), following the attached protocol, it was obtained according to ⁇ Example 1> above.
  • cDNA was obtained from mRNA. That is, using the mRNA obtained in the above ⁇ Example 1> as a template, an oligo dT primer (SEQ ID NO: 6) to which an XhoI site was added, 5-methyl dCTP, and Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (MMLV-RT) were used. Reverse transcription reaction was performed. Next, a nick translation reaction with DNA polymerase I was performed in the presence of RNase H to obtain double-stranded cDNA.
  • SEQ ID NO: 6 oligo dT primer
  • MMLV-RT Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase
  • the Pfu DNA Polymerase attached to the kit is allowed to act on the double-stranded cDNA to smooth both ends of the cDNA, and then DNA Ligation Kit Ver. 2.1 (manufactured by Takara Bio Inc.) was used and an operation according to the attached protocol was performed to ligate an EcoRI adapter (described later) to this double-stranded cDNA.
  • the “EcoRI adapter” referred to here is a DNA fragment having a structure at the 5 ′ end that is generated when limited digestion is performed with the restriction enzyme EcoRI.
  • a DNA is prepared by mixing DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 and DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 in a solution, heating at 90-100 ° C for 1-2 minutes, and then cooling to room temperature.
  • the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 is preferably used for the preparation of an EcoRI adapter after phosphorylating the 5 'end.
  • DNA Ligation Kit Ver Using 2.1, following the attached protocol, the above cDNA fragment and Uni-ZAP XR (Lambda ZAP II (manufactured by Agilent Technologies)) were subjected to limited digestion with EcoRI and XhoI, and the 5 ′ end was The dephosphorylated cloning vector) was ligated. Next, using Gigapack III Gold Packaging Extract (manufactured by Agilent Technologies), an operation according to the attached protocol was performed, and the ligated vector was packaged into phage particles to obtain an African mai cDNA cDNA library. The titer of the packaged phage solution was 1.0 ⁇ 10 7 pfu / mL.
  • Example 3 Acquisition of DNA fragment encoding HG-5epi polypeptide Escherichia coli XL-1 Blue MRF '(as a host cell) infected with the cDNA phage library obtained in ⁇ Example 2> above ( Using Agilent Technology, phages were amplified and recovered by the plate lysate method described in detail below.
  • the host fungus was inoculated into 20 mL of LB medium (containing 0.2% maltose and 10 mM MgSO 4 ) and cultured with shaking at 37 ° C. overnight to obtain a culture solution having an absorbance at a measurement wavelength of 600 nm of about 1.5.
  • 30 ⁇ L each of the phage library solution obtained in ⁇ Example 2> above was dispensed into three 50 mL test tubes, and 5 mL of the culture solution of the host bacteria was added to each and mixed. Thereafter, the phage particles were infected with the host bacteria by standing in a 37 ° C. water bath for 15 minutes.
  • SM buffer 0.1 M NaCl, 10 mM MgSO 4 ⁇ H 2 O, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.01% gelatin
  • 40 mL of the supernatant from each plate was collected in a separate centrifuge tube, 2 mL of chloroform was added, and the mixture was stirred for several seconds using a test tube mixer.
  • These centrifuge tubes were centrifuged at 8,000 ⁇ g for 15 minutes, and 35 mL each of the supernatants were collected and combined to use as a phage solution.
  • the titer of the collected phage solution was 3.4 ⁇ 10 9 pfu / mL.
  • Lambda Mini Kit manufactured by Qiagen
  • an operation according to the attached protocol was performed to obtain ⁇ DNA from this phage solution.
  • PCR reaction was performed using 0.5 ⁇ g of this ⁇ DNA as a template.
  • primers for the PCR reaction oligonucleotides of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 were used as sense primers, and oligonucleotides of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 were used in combination as antisense primers.
  • Ex Taq DNA Polymerase manufactured by Takara Bio Inc.
  • the gene was amplified by an operation according to the attached protocol.
  • the conditions for the PCR reaction were 94 ° C. for 2 minutes, (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 2 minutes) ⁇ 40 cycles, 72 ° C. for 5 minutes.
  • a DNA fragment of about 0.3 kbp was obtained by a PCR reaction performed using the primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 13.
  • the above DNA fragment was purified by an operation according to the attached protocol.
  • Blunting Kination Ligation Kit manufactured by Takara Bio Inc.
  • operations according to the attached protocol were performed to smooth the DNA fragment end and phosphorylate the 5 'end, and then the DNA fragment was purified again.
  • the 6 ⁇ g of ⁇ DNA obtained in the above ⁇ Example 3> was limitedly digested with the restriction enzyme BamHI (manufactured by Takara Bio Inc.) and then subjected to agarose gel electrophoresis, and the range of 0.5 to 4.0 kbp was cut out with a scalpel and collected. Thereafter, using QIAEX II Gel Extraction Kit, an operation according to the attached protocol was performed to obtain a fragment of ⁇ DNA that was limitedly decomposed with BamHI. Next, DNA Ligation Kit Ver. The fragment of ⁇ DNA was self-ligated using 2.1 and following the attached protocol.
  • PCR reaction was performed using the ligation reaction solution as a template and the oligonucleotides of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 as primers.
  • Ex Taq DNA Polymerase was used, and an operation according to the attached protocol was performed to prepare a PCR reaction solution.
  • the PCR reaction conditions were 94 ° C. for 2 minutes, (94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 3 minutes) ⁇ 40 cycles, 72 ° C. for 5 minutes.
  • Nested PCR was performed using the reaction solution of Inverse PCR as a template.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 were used as primers for the PCR reaction.
  • Ex Taq DNA Polymerase was used, and an operation according to the attached protocol was performed to prepare a PCR reaction solution.
  • the PCR reaction was carried out under the conditions of 40 cycles (94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 3 minutes). As a result, a DNA fragment of about 1.8 kbp was obtained.
  • E. coli JM109 strain After transformation of E. coli JM109 strain using this ligation reaction solution, it was applied on a plate of LB / Amp agar medium, and allowed to stand at 37 ° C. overnight to obtain a single colony. This colony was inoculated into 4 mL of LB / Amp medium and cultured with shaking at 37 ° C. overnight to obtain Escherichia coli cells. Using QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by Qiagen), an operation was performed according to the attached protocol to obtain a plasmid from the cells. Next, in order to analyze the base sequence of the DNA fragment possessed by this plasmid, a sequencing reaction was performed using this plasmid as a template.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit manufactured by Qiagen
  • PCR reaction was performed using 0.5 ⁇ g of ⁇ DNA prepared in ⁇ Example 3> as a template using the oligonucleotides of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 as primers.
  • PfuTurbo DNA Polymerase manufactured by Agilent Technologies
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 94 ° C. for 2 minutes, (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 2 minutes) ⁇ 40 cycles, 72 ° C. for 5 minutes.
  • a DNA fragment of about 1.1 kbp was obtained.
  • the above DNA fragment was purified by an operation according to the attached protocol.
  • the operation according to the attached protocol was performed to smooth the DNA fragment end and phosphorylate the 5 'end, and then the DNA fragment was purified again. Thereafter, this DNA fragment was ligated with pBS dephosphorylated with CIP after limited digestion with EcoRV.
  • the ligation reaction solution was used to transform Escherichia coli JM109 strain, which was then applied to an LB / Amp agar medium and incubated at 37 ° C. overnight. Three single colonies were each inoculated into 4 mL of LB / Amp medium, cultured with shaking at 37 ° C. overnight, centrifuged at 20,000 ⁇ g for 1 minute, the supernatant was removed, and E. coli cells were removed. Obtained. Then, using a Plus Plus SV Minipreps DNA Purification System, an operation was performed according to the attached protocol, and a plasmid was obtained from the cells.
  • RNA used as a material for cDNA synthesis 0.5 ⁇ g of mRNA purified in ⁇ Example 1> was used. Oligonucleotides of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25 were used as primers.
  • a PCR reaction solution was prepared by using the dilution solution of Marathon cDNA coupled with a cDNA adapter as a template and using the Advantage (registered trademark) 2 Polymerase mix (manufactured by Clontech) for the PCR reaction, and following the attached protocol. .
  • the conditions of the PCR reaction were 94 ° C. for 30 seconds, (94 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 4 minutes) ⁇ 5 cycles, (94 ° C. for 5 seconds, 70 ° C. for 4 minutes) ⁇ 5 cycles, (94 ° C. for 5 seconds, 68 ° C. for 4 minutes) Min) ⁇ 25 cycles.
  • nested PCR was performed using the 5 'RACE reaction solution as a template.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 were used as PCR reaction primers.
  • Advantage 2 Polymerase mix was used, and an operation according to the attached protocol was performed to prepare a PCR reaction solution.
  • the conditions of the PCR reaction were 94 ° C. for 30 seconds, (94 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 4 minutes) ⁇ 5 cycles, (94 ° C. for 5 seconds, 70 ° C. for 4 minutes) ⁇ 5 cycles, (94 ° C. for 5 seconds, 68 ° C. for 4 minutes) Min) ⁇ 25 cycles.
  • a DNA fragment of about 1.2 kbp was obtained.
  • the above DNA fragment was purified by an operation according to the attached protocol.
  • the operation according to the attached protocol was performed to smooth the DNA fragment end and phosphorylate the 5 'end, and then the DNA fragment was purified again. Thereafter, this DNA fragment was ligated with pBS dephosphorylated with CIP after limited digestion with EcoRV.
  • the ligation reaction solution was used to transform Escherichia coli JM109 strain, which was then applied to an LB / Amp agar medium and incubated at 37 ° C. overnight. Three single colonies were each inoculated into 4 mL of LB / Amp medium, cultured with shaking at 37 ° C. overnight, centrifuged at 20,000 ⁇ g for 1 minute, the supernatant was removed, and E. coli cells were removed. Obtained. Thereafter, using a Plus Plus SV Minipreps DNA Purification System according to the attached protocol, a plasmid was obtained from the cells.
  • PBS ligated with DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 is subjected to limited digestion with EcoRI (manufactured by Takara Bio Inc.) and EcoRV to obtain a DNA fragment of about 1.2 kbp containing DNA encoding the N-terminal side of HG-5epi. It was. This DNA fragment was purified using QIAEX II Gel Extraction Kit according to the attached protocol.
  • pBS obtained by ligation of DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 is subjected to limited digestion with EcoRI and EcoRV to obtain a DNA fragment of about 3.7 kbp consisting of DNA encoding the C-terminal side of HG-5epi and pBS DNA. It was.
  • This DNA fragment was purified using QIAEX II Gel Extraction Kit according to the attached protocol. Next, this DNA fragment was dephosphorylated with CIP and purified again.
  • EcoRI cuts one pBS.
  • EcoRV cleaves DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 28 and DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 23 at one place in the overlapping region. Therefore, by ligating the two DNA fragments obtained above, DNA encoding the full length of HG-5epi subcloned into pBS can be obtained.
  • DNA Ligation Kit Ver The two DNA fragments obtained as described above were ligated using 2.1 according to the attached protocol. Escherichia coli JM109 strain was transformed with this ligation reaction solution, and then applied on a plate of LB / Amp agar medium and allowed to stand at 37 ° C. overnight to obtain a single colony. This colony was inoculated into 4 mL of LB / Amp medium and cultured with shaking at 37 ° C. overnight to obtain Escherichia coli cells. Using QIAprep Spin Miniprep Kit, an operation was performed according to the attached protocol to obtain a plasmid from the cells.
  • HG-5 epi (SEQ ID NO: 2) encoded by the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1, the known amino acid sequence of C5-epi Homogeneity with GENETYX (registered trademark) Ver. 11 (manufactured by Genetics), 39% from human origin (NCBI deposit number: NP_056369, SEQ ID NO: 3), 39% from zebrafish (NCBI deposit number: NP_998015, SEQ ID NO: 4), nematode Origin (NCBI deposit number: NP_497876, SEQ ID NO: 5) was 30%.
  • PCR reaction was performed using pBS / HG-5epi obtained in ⁇ Example 5> as a template.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 were used as primers for the PCR reaction.
  • AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity manufactured by Invitrogen
  • the PCR reaction conditions were 94 ° C. for 20 seconds (94 ° C. for 20 seconds, 58 ° C. for 20 seconds, 68 ° C. for 3 minutes) ⁇ 20 cycles. As a result, a DNA fragment of about 1.7 kbp was obtained.
  • MinElute Gel Extraction Kit manufactured by Qiagen
  • the operation was performed according to the attached protocol, and the DNA fragment was purified.
  • This DNA fragment was subjected to limited digestion using restriction enzymes EcoRI and NotI (Takara Bio Inc.), and the DNA fragment was again purified in the same manner.
  • restriction enzymes EcoRI and NotI Takara Bio Inc.
  • limited digestion and purification with the same restriction enzymes were performed.
  • T4 DNA Ligase manufactured by New England Biolabs
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • This colony was inoculated into 4 mL of LB / Amp medium and cultured with shaking at 37 ° C. overnight to obtain Escherichia coli cells.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit an operation was performed according to the attached protocol to obtain a vector from the cells.
  • the pFBIF1 referred to here is a DNA encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 34) of a polypeptide comprising the amino acid sequence (SEQ ID NO: 31) of the secretory signal peptide of mouse Ig ⁇ chain and the amino acid sequence of the FLAG tag (SEQ ID NO: 32).
  • This is an insect cell expression vector prepared by inserting into the multicloning site of pFastBac1 (Invitrogen).
  • pFBIF1 is a DNA fragment obtained by PCR reaction using as a template a vector obtained by subcloning DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33, and using oligonucleotides of SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 as primers. And a vector obtained by inserting BamHI and EcoRI of pFastBac1 into both ends in the same manner as described above using T4 DNA Ligase.
  • the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 33 is synthesized, for example, by synthesizing an oligonucleotide having the base sequence and a complementary nucleotide thereto, phosphorylating each 5 ′ end with T4 Polynucleotide Kinase, and then mixing in solution. It can be prepared by heating at 90-100 ° C. for 1-2 minutes and then cooling to room temperature. Therefore, this DNA can be used as a template for the PCR reaction by subcloning into an arbitrary vector, for example, pBS dephosphorylated with CIP after limited digestion with EcoRV.
  • pFBIF1 / HG-5epi is a mouse Ig ⁇ chain secretion signal, a FLAG tag, a dipeptide linker comprising asparagine and serine, a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 34 to 601 in SEQ ID NO: 2 Is a vector for expressing a fused polypeptide.
  • Example 7 Preparation of bacmid for expression of HG-5epi (1) Subsequently, using a Bac-to-Bac (registered trademark) baculovirus expression system (manufactured by Invitrogen), an operation according to the attached protocol was performed to recombine the gene between pFBIF1 / HG-5epi and bacmid.
  • DH10Bac strain manufactured by Invitrogen
  • Escherichia coli for bacmid preparation was transformed with pFBIF1 / HG-5epi, and kanamycin, gentamicin, tetracycline, 5-bromoindolyl ⁇ -D-galactopyranoside (Bluo -Gal) and isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) and spread on a plate of LB agar medium, and left to stand overnight at 37 ° C. to obtain a white single colony. This colony was inoculated into 1.5 mL of LB medium and cultured overnight at 37 ° C.
  • ⁇ Example 8> Preparation of HG-5epi using insect cells (1)
  • the bacmid obtained in ⁇ Example 7> above was introduced into insect cell Sf21. That is, 2 mL of Grace's Insect Medium, Unsupplemented (manufactured by Invitrogen) was used, seeded with 8 ⁇ 10 5 Sf21 cells in a 35 mm dish, and incubated at 27 ° C. for 1 hour to adhere the cells to the dish. After confirming that the cells adhered to the petri dish, 0.2 mL of lipid-DNA complexes solution (described later) was added and incubated at 27 ° C. for 5 hours.
  • Sf900 III medium (Invitrogen) was added and incubated at 27 ° C. for 72 hours. Thereafter, the cells released from the plate and the culture solution were collected by pipetting, and centrifuged at 5,000 ⁇ g for 5 minutes, and then the supernatant was collected as a primary virus solution.
  • the lipid-DNA complexes solution is a separately prepared solution A (Grace's Insect Medium, Unmixed 100 ⁇ L and Bacmid (0.1 ⁇ g / ⁇ L) 10 ⁇ L) and B solution (Grace's Insect Medium, It means a solution that was gently mixed well with Unfused 100 ⁇ L and Cellfectin (registered trademark) II Reagent (manufactured by Invitrogen) (8 ⁇ L), and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • A Gram's Insect Medium, Unmixed 100 ⁇ L and Bacmid (0.1 ⁇ g / ⁇ L) 10 ⁇ L
  • B solution Gram's Insect Medium, It means a solution that was gently mixed well with Unfused 100 ⁇ L and Cellfectin (registered trademark) II Reagent (manufactured by Invitrogen) (8 ⁇ L), and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • the entire amount of the primary virus solution was added to the culture solution in which 5 ⁇ 10 7 Sf21 cells were seeded in a spinner flask (volume: 100 mL), and the mixture was stirred and cultured at 27 ° C. for 72 hours. Thereafter, the culture solution was centrifuged at 5,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was recovered as a secondary virus solution.
  • HG-5epi Purification of HG-5epi (1) 1.6 mL of 10% CHAPS (3-[(3-Cholamidopropylo) dimethylaminosulfonate) was added to 80 mL of the culture solution containing HG-5 epi obtained in the above ⁇ Example 8> and gently mixed. The total amount of this solution was applied to 1 mL of Hi Trap Heparin HP column (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mL of 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) /0.1% CHAPS at a flow rate of 1 mL / min. Subsequently, 4 mL of 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) /0.1% CHAPS was passed at a flow rate of 0.2 mL / min to elute HG-5 epi.
  • CHAPS 3-[(3-Cholamidopropylo) dimethylaminosulfonate
  • the elution fraction of HG-5 epi was confirmed by Western blotting method using M2 monoclonal antibody (manufactured by Sigma-Aldrich) which is an anti-FLAG antibody. That is, the fraction eluted in the column purification was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions, and proteins separated in the gel were transferred to a PVDF membrane by a semi-dry method.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the PVDF membrane after transfer is immersed in TBS-T (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, 0.2% Triton X-100, 0.05% Tween 20) containing 5% skim milk, and 1 hour at room temperature. Shake to block.
  • the PVDF membrane was immersed in a solution obtained by diluting a peroxidase-labeled anti-FLAG antibody (manufactured by Sigma-Aldrich) 2,000 times with TBS-T containing 5% skim milk, and the antibody was stained by shaking at room temperature for 1 hour. .
  • the PVDF membrane was washed with TBS-T, immersed in SuperSignal (registered trademark) West Dura (Thermo Scientific) for 1 minute, and then the luminescence signal was detected using Image Quant LAS4000 (GE Healthcare). .
  • the HG-5epi elution fraction thus obtained was used as a “crudely purified recombinant HG-5epi” for subsequent experiments.
  • PCR reaction was performed using pBS / HG-5epi obtained in ⁇ Example 5> as a template.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 were used as PCR reaction primers.
  • a PCR reaction solution was prepared by performing an operation according to the attached protocol using Accurate Taq DNA Polymerase High Fidelity for the PCR reaction.
  • the PCR reaction conditions were 94 ° C. for 20 seconds (94 ° C. for 20 seconds, 62 ° C. for 20 seconds, 68 ° C.
  • TOPO registered trademark
  • TA Cloning registered trademark Kit (manufactured by Invitrogen) was used in accordance with the attached protocol to insert the amplified DNA fragment into pCR (registered trademark) 2.1-TOPO Got.
  • This vector was subjected to limited digestion using restriction enzymes SalI (Takara Bio) and KpnI (Takara Bio), followed by operation according to the attached protocol using MinElute Gel Extraction Kit, and DNA fragments (about 1.7 kbp) was obtained by purification.
  • restriction enzymes SalI Tikara Bio
  • KpnI Tikara Bio
  • DNA fragments about 1.7 kbp
  • pFBIF2 limited digestion and purification with the same restriction enzyme were performed.
  • this DNA fragment and pFBIF2 were ligated using T4 DNA Ligase according to the attached protocol.
  • E. coli TOP10 strain manufactured by Invitrogen
  • E. coli TOP10 strain was transformed, and then applied onto a plate of LB / Amp agar medium, and allowed to stand at 37 ° C. overnight to obtain a single colony.
  • This colony was inoculated into 4 mL of LB / Amp medium and cultured with shaking at 37 ° C. overnight to obtain Escherichia coli cells.
  • QIAprep Spin Miniprep Kit an operation was performed according to the attached protocol to obtain a vector from the cells.
  • a sequence reaction was performed using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, and sequence analysis was performed using Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer.
  • pFBIF2 is a DNA encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 34) of a polypeptide comprising the amino acid sequence (SEQ ID NO: 31) of the secretory signal peptide of mouse Ig ⁇ chain and the amino acid sequence of the FLAG tag (SEQ ID NO: 32).
  • This is an insect cell expression vector prepared by inserting into the multi-cloning site of pFastBac1.
  • pFBIF2 is a DNA fragment obtained by PCR reaction using a vector obtained by subcloning DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 as a template and using oligonucleotides of SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 40 as primers, And a vector obtained by inserting the EcoRI and SalI of pFastBac1 into both ends in the same manner as described above using T4 DNA Ligase.
  • pFBIF2 / HG-5epi is a mouse Ig ⁇ chain secretion signal, a FLAG tag, a dipeptide linker composed of valine and aspartic acid, a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 34 to 601 in SEQ ID NO: 2.
  • This is a vector for expressing a polypeptide fused with a peptide.
  • Example 11 Preparation of bacmid for expression of HG-5epi (2) Subsequently, using the Bac-to-Bac baculovirus expression system, the gene is recombined between pFBIF2 / HG-5epi and the bacmid by performing an operation according to the attached protocol, and the mouse Ig ⁇ chain is secreted into the bacmid.
  • a signal, a FLAG tag, a linker of a dipeptide consisting of valine and aspartic acid, and a DNA encoding a fusion polypeptide of a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown by amino acid numbers 34 to 601 in SEQ ID NO: 2 were inserted.
  • DH10Bac strain which is E. coli for bacmid preparation, and kanamycin, gentamicin, tetracycline, 5-bromoindolyl ⁇ -D-galactopyranoside (Bluo-gal), and The mixture was applied onto a plate of LB agar medium containing isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) and allowed to stand at 37 ° C. overnight to obtain a white single colony. This colony was inoculated into 1.5 mL of LB medium and cultured overnight at 37 ° C. with shaking to obtain Escherichia coli cells.
  • IPTG isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • ⁇ Example 12> Preparation of HG-5epi using insect cells (2)
  • the bacmid obtained in ⁇ Example 11> above was introduced into insect cell Sf21. Specifically, 2 mL of Grace's Insect Medium, Unsupplemented was used, 8 ⁇ 10 5 Sf21 cells were seeded in a 35 mm dish, and the cells were allowed to adhere to the dish by incubating at 27 ° C. for 1 hour. After confirming that the cells adhered to the petri dish, 0.2 mL of lipid-DNA complexes solution (described later) was added and incubated at 27 ° C. for 5 hours.
  • the lipid-DNA complexes solution is a separately prepared solution A (Grace's Insect Medium, Unmixed 100 ⁇ L and Bacmid (0.1 ⁇ g / ⁇ L) 10 ⁇ L) and B solution (Grace's Insect Medium, It means a solution that was mixed gently and well mixed (Unmixed 100 ⁇ L and Cellfectin II Reagent 8 ⁇ L) and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • the whole amount of the primary virus solution was added to the culture solution in which 1 ⁇ 10 8 Sf21 cells were seeded in a spinner flask (volume: 200 mL), and the mixture was stirred and cultured at 27 ° C. for 72 hours. Thereafter, the culture solution was recovered as a secondary virus solution.
  • the whole amount of the secondary virus solution was added to the culture solution in which 2 ⁇ 10 9 Sf21 cells were seeded in a flask with baffle (volume: 3 L) using 1.8 L of Sf900 III medium, and cultured with shaking at 27 ° C. for 96 hours. . Thereafter, the culture solution was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 20 minutes, and then the supernatant was recovered to obtain a culture solution containing HG-5 epi.
  • Example 13 Purification of HG-5epi (2) To 400 mL of the culture solution containing HG-5 epi obtained in the above ⁇ Example 12>, 8 mL of 10% CHAPS (3-[(3-Cholamidopropylo) dimethylaminosulfonate) was added and mixed gently. The total amount of this solution was applied to 5 mL of a Hi Trap Heparin HP column equilibrated with 50 mL of distilled water at a flow rate of 2 mL / min.
  • CHAPS 3-[(3-Cholamidopropylo) dimethylaminosulfonate
  • the column was washed by passing 10 mL of 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) /0.1% CHAPS / 0.5 M NaCl at a flow rate of 0.2 mL / min, and then 0.4 mg / mL FLAG peptide.
  • 6 mL of 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) /0.1% CHAPS / 150 mM NaCl containing was added at a flow rate of 0.2 mL / min, and HG-5 epi was eluted and fractionated and collected.
  • the eluted fraction of HG-5epi was confirmed by Western blotting using M2 monoantibody, which is an anti-FLAG antibody. That is, the fraction eluted in the column purification was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions, and proteins separated in the gel were transferred to a PVDF membrane by a semi-dry method.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the PVDF membrane after transfer is immersed in TBS-T (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, 0.2% Triton X-100, 0.05% Tween 20) containing 5% skim milk, and 1 hour at room temperature. Shake to block.
  • the PVDF membrane was immersed in a solution obtained by diluting the peroxidase-labeled anti-FLAG antibody 2,000 times with TBS-T containing 5% skim milk, and the antibody was stained by shaking at room temperature for 1 hour.
  • the PVDF membrane was washed with TBS-T, immersed in SuperSignal West Dura for 1 minute, and then the luminescence signal was detected using Image Quant LAS4000.
  • the concentration of HG-5 epi is 0.5 ⁇ g / ⁇ L. there were.
  • the eluted fraction of HG-5epi obtained by the column purification described above is a molecular weight standard (Precision plus protein unstained) when the gel subjected to SDS-PAGE under reducing conditions is stained with CBB. It was a fraction in which only a single band of about 75 kDa was observed as compared with standards (manufactured by Biorad).
  • HG-5epi The elution fraction of HG-5epi thus obtained was used as a “recombinant HG-5epi” for subsequent experiments.
  • the HPLC pump for feeding the labeled reagent used was 600E (Waters).
  • solvent C (0.5% 2-cyanoacetamide)
  • solvent D (0.25 M NaOH) were used.
  • the solution was fed by isocratic, and a solution in which solvent C and solvent D were mixed online at a ratio of 1: 1 was fed.
  • the flow rate was 0.6 mL / min.
  • the eluent passed through the column according to the above conditions and the labeling reagent were joined through a three-way joint, and then a reaction coil (inner diameter: 0.5 mm ⁇ length: 10 m), a cooling coil (inner diameter: 0.25 mm ⁇
  • the liquid was passed in the order of length: 3 m) and fluorescence detector.
  • the reaction coil was heated to 125 ° C. using Dry Reaction Bath DB-5 (manufactured by Shimamura Tech).
  • the cooling coil was used in a state immersed in distilled water at room temperature.
  • the fluorescence detector 2475 (manufactured by Waters) was used, and the excitation wavelength was set to 346 nm and the fluorescence wavelength was set to 410 nm.
  • FIG. 3 shows a chromatogram obtained by subjecting NAH or CDSNac-HEP to N-deacetylation and nitrous acid decomposition and subjecting to HPLC post-column labeling.
  • N-deacetylation and nitrous acid decomposition were performed according to the methods described in ⁇ Example 14>, ⁇ Example 16>, or ⁇ Example 17> below.
  • the disaccharide obtained by N-deacetylation and nitrite decomposition is only a disaccharide consisting of GlcA and aMan (GlcA-aMan), and in the case of CDSNAC-HEP, the disaccharide consisting of IdoA and aMan. (IdoA-aMan) and GlcA-aMan. Therefore, it can be seen from the comparison of both chromatograms that GlcA-aMan and IdoA-aMan were separated and detected.
  • the amount of substance per peak area was 1.33 of GlcA-aMan. It turned out to be double. Therefore, the IdoA content can be calculated by substituting the peak areas of GlcA-aMan and IdoA-aMan into the following formula.
  • This dry powder was dissolved in 3 mL of 33% acetic acid, mixed with 3 mL of 5% aqueous sodium nitrite, and allowed to stand at room temperature for 90 minutes. 3 mL of 12.5% ammonium sulfamate aqueous solution was added to and mixed with this solution, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes. In this way, a solution containing GlcA-aMan was obtained.
  • the solution was concentrated to 1 mL using a centrifugal evaporator, and the whole amount was subjected to a gel filtration column for desalting.
  • a gel filtration column a column (inner diameter: 2 cm ⁇ length: 120 cm) packed with Bio-Gel P-4 Gel (manufactured by Bio-Rad) was used.
  • the column temperature was 4 ° C.
  • the mobile phase was 0.1M ammonium acetate and the flow rate was 0.15 mL / min.
  • the eluate was fractionated by 4.3 mL, and the elution fraction of GlcA-aMan was confirmed by the carbazole sulfate method (BITTER T, MUIR HM., Anal Biochem. 1962 Oct; 4: 330-4.).
  • the eluted fractions of GlcA-aMan were combined and subjected to lyophilization to a dry powder.
  • the dried powder was dissolved in 0.2 mL of distilled water, and the whole amount was divided into two portions and purified by using CarboPac PA1 (inner diameter: 9 mm ⁇ length: 250 mm) (manufactured by Nippon Dionex).
  • CarboPac PA1 inner diameter: 9 mm ⁇ length: 250 mm
  • solvent A distilled water
  • solvent B 0.1 M sodium acetate
  • Elution is performed with a linear gradient.
  • the ratio of solvent B is 0% until 0 to 5 minutes
  • the ratio of solvent B is 0% to 5% until 5 to 12 minutes
  • the solvent is until 12 to 162 minutes.
  • the ratio of B was changed from 5% to 10%.
  • the flow rate was 1.6 mL / min.
  • the eluate was fractionated by 0.8 mL, and each fraction was subjected to HPLC post column labeling to confirm the eluted fraction of GlcA-aMan.
  • the eluted fractions of GlcA-aMan were combined, and the molar concentration was quantified by the carbazole sulfate method.
  • the solution was concentrated to 1 mL using a centrifugal evaporator, and the whole amount was subjected to a gel filtration column for desalting.
  • a gel filtration column a column (inner diameter: 2 cm ⁇ length: 120 cm) packed with Bio-Gel P-4 Gel was used. The column temperature was 4 ° C.
  • the mobile phase was 0.1M ammonium acetate and the flow rate was 0.24 mL / min.
  • the eluate was fractionated by 4 mL, and the elution fraction of IdoA-aMan was confirmed by the carbazole sulfate method.
  • the eluted fractions of IdoA-aMan were combined and subjected to lyophilization to a dry powder.
  • the dried powder was dissolved in 0.2 mL of distilled water, and the whole amount was divided into three times and purified by using CarboPac PA1 (inner diameter: 9 mm ⁇ length: 250 mm).
  • solvent A distilled water
  • solvent B 0.1 M sodium acetate
  • Elution is performed with a linear gradient.
  • the ratio of solvent B is 0% until 0 to 5 minutes
  • the ratio of solvent B is 0% to 5% until 5 to 12 minutes
  • the solvent is until 12 to 162 minutes.
  • the ratio of B was changed from 5% to 10%.
  • the flow rate was 1.6 mL / min.
  • the eluate was fractionated by 0.8 mL, and each fraction was subjected to HPLC post-column labeling to confirm the elution fraction of IdoA-aMan.
  • the eluted fractions of IdoA-aMan were combined and the molar concentration was quantified by the carbazole sulfate method.
  • ⁇ Example 14> Measurement of activity of crude purified HG-5 epi using NAH as a substrate Using 5 ⁇ L (2 ⁇ g) of crude purified recombinant HG-5 epi obtained in ⁇ Example 9> above, a reaction solution of 50 ⁇ L in total was prepared. Incubated for 17 hours in a 30 ° C. water bath. The reaction solution was prepared to have a final concentration of 50 mM PIPES-NaOH (pH 7.0), 0.1% CHAPS, 10 mg / mL NAH. Thereafter, 117 ⁇ L of ethanol containing 1.3% potassium acetate was added and mixed, and then centrifuged at 20,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the polysaccharide.
  • the supernatant was removed and the precipitate was dissolved in 100 ⁇ L of distilled water. Further, 234 ⁇ L of ethanol containing 1.3% potassium acetate was added and mixed, and then centrifuged at 20,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the polysaccharide again. After removing the supernatant and air-drying, the precipitate was dissolved in 60 ⁇ L of distilled water and subjected to lyophilization to a dry powder.
  • the dried powder was dissolved in 0.12 mL of a hydrazine reagent (a solution of 40 mg of hydrazine sulfate dissolved in 1 mL of hydrazine monohydrate), and incubated at 96 ° C. for 5 hours using a heat block. After diluting by adding 0.2 mL of distilled water, the whole amount was transferred to Slide-A-Lyzer 2.0K MWCO Dialysis Cassette and dialyzed overnight in distilled water for desalting. Thereafter, it was subjected to freeze-drying to obtain a dry powder.
  • a hydrazine reagent a solution of 40 mg of hydrazine sulfate dissolved in 1 mL of hydrazine monohydrate
  • This dry powder was dissolved in 80 ⁇ L of 33% acetic acid, mixed with 80 ⁇ L of 5% aqueous sodium nitrite solution, and then allowed to stand at room temperature for 80 minutes. Thereafter, 80 ⁇ L of a 12.5% ammonium sulfamate aqueous solution was added and mixed, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After drying using a centrifugal evaporator, it was dissolved in 50 ⁇ L of distilled water, and the entire amount was subjected to a gel filtration column for desalting. As the gel filtration column, two Superdex Peptide 10 / 300GL (manufactured by GE Healthcare) were connected in series. The column temperature was room temperature.
  • the mobile phase was 0.1M ammonium acetate and the flow rate was 0.6 mL / min.
  • a spectroscopic detector was used to detect the eluate, and the ultraviolet wavelength was set to 200 nm.
  • the peak fraction containing disaccharide (GlcA-aMan or IdoA-aMan) was collected and subjected to lyophilization to a dry powder.
  • the collected sample was subjected to analysis. Specifically, a solution obtained by dissolving this dry powder in 300 ⁇ L of distilled water was used as an analysis sample, and 50 ⁇ L was subjected to the HPLC post column label method. The result is shown in FIG. As shown in the chromatogram of FIG. 4, since the peak of IdoA-aMan was confirmed, it was found that HG-5epi is an enzyme that isomerizes the GlcA residue of NAH to the IdoA residue.
  • the peak area ratio between GlcA-aMan and IdoA-aMan was 72.7: 27.3. Therefore, the IdoA content was calculated to be 32.8% according to Equation 1 above.
  • Example 15 Measurement of activity of crude purified HG-5 epi using NSH as a substrate Using 20 ⁇ L (8 ⁇ g) of the crude purified recombinant HG-5 epi obtained in ⁇ Example 9> above, a reaction solution of 50 ⁇ L in total was prepared. Incubated for 17 hours in a 30 ° C. water bath. The reaction solution was prepared to have a final concentration of 50 mM PIPES-NaOH (pH 7.0), 0.1% CHAPS, 5 mg / mL NSH. Thereafter, 117 ⁇ L of ethanol containing 1.3% potassium acetate was added and mixed, and then centrifuged at 20,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the polysaccharide.
  • the supernatant was removed and the precipitate was dissolved in 100 ⁇ L of distilled water. Further, 234 ⁇ L of ethanol containing 1.3% potassium acetate was added and mixed, and then centrifuged at 20,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the polysaccharide again. The supernatant was removed and the precipitate was air-dried and then dissolved in 10 ⁇ L of distilled water.
  • the mobile phase was 0.1M ammonium acetate and the flow rate was 0.6 mL / min.
  • a spectroscopic detector was used to detect the eluate, and the ultraviolet wavelength was set to 200 nm.
  • the peak fraction containing disaccharide (GlcA-aMan or IdoA-aMan) was collected and subjected to lyophilization to a dry powder.
  • the collected sample was subjected to analysis. Specifically, a solution obtained by dissolving this dry powder in 300 ⁇ L of distilled water was used as an analysis sample, and 50 ⁇ L was subjected to the HPLC post column label method. The result is shown in FIG. As shown in the chromatogram of FIG. 5, since no IdoA-aMan peak was detected, it was found that HG-5epi is an enzyme that does not substantially isomerize the GlcA residue of NSH to an IdoA residue.
  • ⁇ Example 16> Measurement of activity of HG-5 epi using NAH as a substrate Using 10 ⁇ L (5 ⁇ g) of the recombinant HG-5 epi obtained in the above ⁇ Example 13>, a reaction solution having a total amount of 50 ⁇ L was prepared. Incubate for 12 hours in water bath. The reaction solution was prepared to have a composition of 50 mM BisTris-NaOH (pH 6.0), 5 mg / mL NAH at a final concentration. Thereafter, 117 ⁇ L of ethanol containing 1.3% potassium acetate was added and mixed, and then centrifuged at 20,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the polysaccharide.
  • the supernatant was removed and the precipitate was dissolved in 100 ⁇ L of distilled water. Further, 234 ⁇ L of ethanol containing 1.3% potassium acetate was added and mixed, and then centrifuged at 20,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the polysaccharide again. After removing the supernatant and air-drying, the precipitate was dissolved in 60 ⁇ L of distilled water and subjected to lyophilization to a dry powder.
  • the dried powder was dissolved in 0.12 mL of a hydrazine reagent (a solution of 40 mg of hydrazine sulfate dissolved in 1 mL of hydrazine monohydrate), and incubated at 96 ° C. for 5 hours using a heat block. After diluting by adding 0.2 mL of distilled water, the whole amount was transferred to Slide-A-Lyzer 2.0K MWCO Dialysis Cassette and dialyzed overnight in distilled water for desalting. Thereafter, it was subjected to freeze-drying to obtain a dry powder.
  • a hydrazine reagent a solution of 40 mg of hydrazine sulfate dissolved in 1 mL of hydrazine monohydrate
  • This dry powder was dissolved in 100 ⁇ L of 33% acetic acid, mixed with 100 ⁇ L of 5% aqueous sodium nitrite solution, and then allowed to stand at room temperature for 80 minutes. Thereafter, 100 ⁇ L of a 12.5% aqueous ammonium sulfamate solution was added and mixed, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After drying using a centrifugal evaporator, it was dissolved in 50 ⁇ L of distilled water, and the entire amount was subjected to a gel filtration column for desalting. As the gel filtration column, two Superdex Peptide 10 / 300GL (manufactured by GE Healthcare) were connected in series. The column temperature was room temperature.
  • the mobile phase was 0.1M ammonium acetate and the flow rate was 0.6 mL / min.
  • a spectroscopic detector was used to detect the eluate, and the ultraviolet wavelength was set to 200 nm.
  • the elution fraction of disaccharide (GlcA-aMan or IdoA-aMan) was confirmed by the carbazole sulfate method and collected, and then subjected to lyophilization to a dry powder.
  • the collected sample was subjected to analysis. Specifically, a solution obtained by dissolving this dry powder in 250 ⁇ L of distilled water was used as an analysis sample, and 50 ⁇ L was subjected to the HPLC post column label method. The result is shown in FIG. As shown in the chromatogram of FIG. 6, since the peak of IdoA-aMan could be confirmed, it was found that HG-5epi is an enzyme that isomerizes the GlcA residue of NAH to an IdoA residue.
  • the ratio of the peak areas of GlcA-aMan and IdoA-aMan was 73.1: 26.9. Therefore, the IdoA content was calculated to be 32.4% according to Equation 1 above.
  • ⁇ Example 17> Measurement of activity of HG-5 epi using CDSNac-HEP as a substrate 2 to 16 ⁇ L (1.0 to 8.0 ⁇ g) of the recombinant HG-5 epi obtained in ⁇ Example 13> above was used to make a total amount of 100 ⁇ L.
  • a reaction solution was prepared, allowed to stand on a heat block at 30 ° C., and incubated for 6 hours. The reaction solution was prepared to have a final concentration of 50 mM BisTris-NaOH (pH 6.0), 0.1% CHAPS, 5 mg / mL CDSNac-HEP.
  • the dried powder was dissolved in 0.3 mL of a hydrazine reagent (a solution of 40 mg of hydrazine sulfate dissolved in 1 mL of hydrazine monohydrate) and incubated at 96 ° C. for 7 hours using a heat block. After diluting by adding 0.2 mL of distilled water, the whole amount was transferred to Slide-A-Lyzer 2.0K MWCO Dialysis Cassette and dialyzed using distilled water. Thereafter, it was subjected to freeze-drying to obtain a dry powder.
  • a hydrazine reagent a solution of 40 mg of hydrazine sulfate dissolved in 1 mL of hydrazine monohydrate
  • This dry powder was dissolved in 200 ⁇ L of 33% acetic acid, 200 ⁇ L of 5% aqueous sodium nitrite solution was added and mixed, and then allowed to stand at room temperature for 90 minutes. Thereafter, 200 ⁇ L of a 12.5% aqueous ammonium sulfamate solution was added and mixed, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes. It concentrated to 100 microliters using a centrifugal evaporator, and the whole quantity was used for the gel filtration column and desalted. As the gel filtration column, two Superdex Peptide 10 / 300GL (manufactured by GE Healthcare) were connected in series. The column temperature was room temperature.
  • the mobile phase was 0.1M ammonium acetate and the flow rate was 0.6 mL / min.
  • a spectroscopic detector was used to detect the eluate, and the ultraviolet wavelength was set to 200 nm.
  • the peak fraction containing disaccharide (GlcA-aMan or IdoA-aMan) was collected and subjected to lyophilization to a dry powder.
  • the collected sample was subjected to analysis. Specifically, a solution obtained by dissolving this dry powder in 300 ⁇ L of distilled water was used as an analysis sample, and 50 ⁇ L was subjected to the HPLC post column label method. The results are shown in Table 1.
  • HG-5epi is an enzyme that isomerizes the IdoA residue of CDSNAc-HEP into a GlcA residue because the IdoA content tended to decrease depending on the amount of HG-5epi added. I understood that.
  • ⁇ Example 18> Measurement of activity of HG-5 epi using CDSNS-HEP as a substrate Using 5 ⁇ L (2.5 ⁇ g) of the recombinant HG-5 epi obtained in ⁇ Example 13> above, a reaction solution of 50 ⁇ L in total was prepared. Incubated for 17 hours in a 30 ° C. water bath. The reaction solution was prepared to have a final concentration of 50 mM PIPES-NaOH (pH 7.0), 0.1% CHAPS, 5 mg / mL CDSNS-HEP. Thereafter, 117 ⁇ L of ethanol containing 1.3% potassium acetate was added and mixed, and then centrifuged at 20,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the polysaccharide.
  • the supernatant was removed and the precipitate was dissolved in 100 ⁇ L of distilled water. Further, 234 ⁇ L of ethanol containing 1.3% potassium acetate was added and mixed, and then centrifuged at 20,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the polysaccharide again. The supernatant was removed and the precipitate was air-dried and then dissolved in 10 ⁇ L of distilled water.
  • the mobile phase was 0.1M ammonium acetate and the flow rate was 0.6 mL / min.
  • a spectroscopic detector was used to detect the eluate, and the ultraviolet wavelength was set to 200 nm.
  • the elution fraction of disaccharide (GlcA-aMan or IdoA-aMan) was confirmed by the carbazole sulfate method and collected, and then subjected to lyophilization to a dry powder.
  • the collected sample was subjected to analysis. Specifically, a solution obtained by dissolving this dry powder in 300 ⁇ L of distilled water was used as an analysis sample, and 50 ⁇ L was subjected to the HPLC post column label method. The results are shown in Table 2.
  • HG-5epi is an enzyme that does not substantially isomerize the CDSNS-HEP IdoA residue to the GlcA residue, and It was found that the enzyme does not substantially isomerize the GlcA residue of CDSNS-HEP to the IdoA residue.
  • reaction solution was prepared by lyophilizing a mixture of 0.25 mL of 0.5 M PIPES-NaOH (pH 7.0), 0.025 mL of 10% CHAPS, 1 mL of 50 mg / mL NAH, and then adding 2.5 mL of the lyophilized product to 3 mL.
  • a solution obtained by re-dissolving in H 2 O was prepared by mixing 0.2 mL of recombinant HG-5epi. Then, it incubated at 95 degreeC for 5 minute (s) using the heat block, and the enzyme was deactivated.
  • Example 20 Measurement of HG-5epi activity using a radioisotope
  • the method for measuring HG-5epi activity using a radioisotope is that when [5- 3 H] NAH is used as a substrate and the HexA residue in [5- 3 H] NAH is isomerized by HG-5epi activity.
  • HG-5epi activity is determined by measuring the radioactivity of 3 H 2 O produced in the above. The procedure is shown below.
  • a total amount of 50 ⁇ L of a reaction solution was prepared and incubated in a 30 ° C. water bath for 4 hours.
  • the reaction solution was prepared so that the final concentration was 50 mM PIPES-NaOH (pH 7.0), 0.1% CHAPS, 100 kdpm / mL [5- 3 H] NAH.
  • the whole amount was applied to a spin column packed with 0.16 mL of Q Sepharose HP equilibrated with distilled water, and 2,000 ⁇ g.
  • HG-5epi activity could be quantified by the method described in this example. I understood. It was also found that a polysaccharide having a desired IdoA content can be obtained by appropriately setting the mixing amount of recombinant HG-5epi.
  • Example 21 Measurement of HG-5 epi activity using radioisotopes (2) Using 0.21 to 5 ⁇ L (0.110 to 2.630 ⁇ g) of the recombinant HG-5epi obtained in ⁇ Example 13> above, a total amount of 50 ⁇ L of the reaction solution was prepared, and 2 to 48 in a 30 ° C. water bath. Incubated for hours. The reaction solution was prepared to have a final concentration of 50 mM Bis-Tris-HCl (pH 6.0) and 180 kdpm / mL [5- 3 H] NAH. Thereafter, 0.1 mL of 0.1 M Tris was mixed to stop the enzyme reaction.
  • the value (dpm / ⁇ g) shown in Table 4 is a value calculated by subtracting the blank value from the measured value of 3 H concentration (dpm) and then dividing by the amount of HG-5 epi mixed ( ⁇ g). .
  • the measured value (dpm) was measured in the activity measurement of HG-5epi using [5- 3 H] NAH. ) was positively correlated with the product of the mixing amount of HG-5epi (the amount of HG-5epi activity) and the reaction time.
  • reaction time and the measured value were positively correlated, and HG-5 epi activity could be quantified by measuring the time course of 3 H concentration (dpm). Moreover, it turned out that the polysaccharide which consists of desired IdoA content can be obtained by setting reaction time suitably.
  • a total reaction volume of 50 ⁇ L was prepared and incubated in a 30 ° C. water bath for 2 hours.
  • the reaction solution was prepared to have a final concentration of 50 mM McIlvine Buffer (pH 4.5 to 7.5), 0.1% CHAPS, 180 kdpm / mL [5- 3 H] NAH. Thereafter, 0.1 mL of 0.1 M Tris was mixed to stop the enzyme reaction.
  • the measured value (dpm) shown in Table 5 is the blank value at pH 7.0, that is, the solution obtained by adding the same amount of water instead of recombinant HG-5epi and performing the same operation as above. This is the value after subtracting the measured value.
  • HG-5 epi activity was maximum at pH 5.5, and the same activity was exhibited at pH 6.0. Therefore, it was found that HG-5epi is an enzyme having an optimum pH of 5.5 to 6.0.
  • reaction solution Using 2 ⁇ L (1 ⁇ g) of the recombinant HG-5epi obtained in ⁇ Example 13> above, a total volume of 50 ⁇ L of the reaction solution was prepared and incubated in a 30 ° C. water bath for 5 hours. In addition to adding salt to the desired final concentration, the reaction solution has a final concentration of 50 mM Bis-Tris-HCl Buffer (pH 6.0), 180 kdpm / mL [5- 3 H] NAH. It was prepared as follows. Thereafter, 0.1 mL of 0.1 M Tris was mixed to stop the enzyme reaction.
  • reaction solution was adjusted to 50 mM Bis-Tris-HCl Buffer (pH 6.0), 180 kdpm / mL [5- 3 H] NAH at a final concentration. It prepared so that it might become a composition. Thereafter, 0.1 mL of 0.1 M Tris was mixed to stop the enzyme reaction.
  • HG-5 epi activity was inhibited depending on the concentration of CHAPS, sodium deoxycholate, or n-octyl- ⁇ -D-glucoside.
  • HG-5 epi activity was strongly inhibited by sodium deoxycholate, and it was found that HG-5 epi activity was completely inhibited in the presence of sodium deoxycholate at a final concentration of 0.1% or more.
  • an enzyme or polypeptide having HG-5 epi activity can be provided, and thus a polysaccharide in which the HexA residue is isomerized can be produced.
  • a polysaccharide in which the HexA residue is isomerized is expected to be useful as a novel material.

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Abstract

ヘパロサン-グルクロン酸-5-エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを提供し、以て、ヘキスロン酸残基が異性化された多糖を製造する手段を提供する。アフリカマイマイcDNAライブラリーをスクリーニングし、N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基に作用する異性化酵素であるヘパロサン-グルクロン酸-5-エピメラーゼのポリペプチドをコードするDNAを得る。このDNAにコードされたポリペプチドを昆虫細胞に発現させ、ヘパロサン-グルクロン酸-5-エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを得る。このポリペプチドをN-アセチルヘパロサン、又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンと接触させることにより、ヘキスロン酸残基が異性化された多糖を得る。

Description

ヘパロサン-グルクロン酸-5-エピメラーゼ、およびそれを用いた多糖の製造方法
 本発明は、ヘパロサン-グルクロン酸-5-エピメラーゼに関する。具体的には、本発明は、N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するアフリカマイマイ由来の酵素、該活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該核酸及び/又は該ベクターを保持する宿主細胞、該ポリペプチドの製造方法、該酵素及び/又は該ポリペプチドを用いたヘキスロン酸残基が異性化された多糖の製造方法等に関する。
 本願の明細書においては、以下の略号を使用することがある。
  GAG:グリコサミノグリカン
  PG:プロテオグリカン
  GlcNAc:N-アセチルグルコサミン
  GlcNS:N-硫酸化グルコサミン
  GlcN:グルコサミン
  GlcA:グルクロン酸
  IdoA:イズロン酸
  IdoA(2S):2-O-硫酸化イズロン酸
  HexA:ヘキスロン酸
  aMan:2,5-アンヒドロマンノース
  AS:アカラン硫酸
  ACH:アカラン(2-O-脱硫酸化AS)
  NAH:N-アセチルヘパロサン
  NSH:N-脱アセチル化・N-硫酸化ヘパロサン
  HEP:ヘパリン
  CDSNAc-HEP:完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリン
  CDSNS-HEP:完全脱硫酸化・N-再硫酸化ヘパリン
  HS:ヘパラン硫酸
  C5-epi:ヘパロサン-N-硫酸-グルクロン酸-5-エピメラーゼ
  HG-5epi:ヘパロサン-グルクロン酸-5-エピメラーゼ
 アカラン硫酸(AS)は、アフリカマイマイ(Achatina fulica)から単離されたグリコサミノグリカン(GAG)の一種であり、下記構造式(1)で表されるGlcNAcとIdoA(2S)からなる二糖(-[4GlcNAcα1-4IdoA(2S)α1]-)が繰り返し重合した構造からなる直鎖状のGAGであることが知られている(非特許文献1、2)。また、ASは、糖鎖骨格が共通するGAGであるヘパリン(HEP)またはヘパラン硫酸(HS)と類似した生理活性を有し、具体的には、血管新生阻害活性(非特許文献3)、免疫刺激活性(非特許文献4)、血糖降下活性(非特許文献4)、抗凝固活性(非特許文献5)、抗腫瘍活性(非特許文献6)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の接着阻害活性(非特許文献7)等を示すことが知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 HEPおよびHSの生合成は、ノックアウトマウスまたは変異細胞株が発現する糖鎖構造の解析や、酵素の基質特異性を評価する実験の結果から、GlcNAcとGlcAからなる二糖(-[4GlcNAcα1-4GlcAβ1]-)が繰り返し重合した構造からなるGAGであるN-アセチルヘパロサン(NAH)の合成、N-脱アセチル化およびN-硫酸化、GlcA残基のIdoA残基への異性化、O-硫酸化、の順に行われていることが明らかにされている(非特許文献8、9)。これらのステップの内、GlcA残基のIdoA残基への異性化は、ヘパロサン-N-硫酸-グルクロン酸-5-エピメラーゼ(C5-epi、EC:5.1.3.17)により触媒される。すなわち、HEPおよびHSの生合成に関与する公知のC5-epiは、いずれも、NAHがN-脱アセチル化およびN-硫酸化されて生じるGAGであるN-脱アセチル化・N-硫酸化ヘパロサン(NSH)を基質とするが、NAHそのものを基質としないことが知られている(非特許文献10~14、特許文献1、2)。
 アフリカマイマイにおいては、プロテオグリカン(PG)を生合成する酵素群を網羅的に同定するプロテオーム解析が行われており、既知タンパク質との相同性から、PGのコアタンパク質またはGAGを生合成する酵素が種々見出されている(非特許文献15)。HEPおよびHSの合成系については、NAHの合成酵素、N-脱アセチル化/N-硫酸化酵素、およびO-硫酸化酵素と推定されるタンパク質が見出されている。しかしながら、公知の異性化酵素であるC5-epiと相同性を有するタンパク質は見出されていない。また、アフリカマイマイにおいては、ASの生合成に関する酵素カスケードは解明されておらず、IdoAを合成する酵素が作用する基質や酵素反応によって得られるプロダクトは不明であった。
国際公開第1998/048006号パンフレット 国際公開第2002/046379号パンフレット
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 本発明は、ヘパロサン-グルクロン酸-5-エピメラーゼ(HG-5epi)を提供することを課題とする。具体的には、本発明は、NAHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する活性、及び/又は、CDSNAc-HEPのIdoA残基をGlcA残基に異性化する活性(以下、総称して「HG-5epi活性」と言う。)、を有するアフリカマイマイ由来の酵素、該活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該核酸及び/又は該ベクターを保持する宿主細胞、該ポリペプチドの製造方法、該酵素及び/又は該ポリペプチドを用いたHexA残基が異性化された多糖の製造方法等を提供することを課題とする。
 本発明者らは、ASがGlcNAcとIdoA(2S)を構成成分とし、GlcNSを骨格中に含まないGAGであることに着目し、アフリカマイマイには、HEPおよびHSの生合成に関与する公知のC5-epiとは基質特異性が全く異なる新規の異性化酵素が存在すると考えた。すなわち、本発明者らは、アフリカマイマイには、NAHを基質とする異性化酵素であるHG-5epiが存在し、ASの生合成に関与していると考えた。
 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、新規異性化酵素であるHG-5epiがアフリカマイマイに存在する事を見出し、HG-5epiをコードするDNAをアフリカマイマイから単離することに成功して、本発明を完成するに至った。
 すなわち、本発明は、以下の通り例示される。
[1]
 以下の(A)及び(B)の特徴を有する、アフリカマイマイ由来の酵素。
(A)N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有する。
(B)N-硫酸化ヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-再硫酸化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を実質的に有しない。
[2]
 以下の(A)~(C)からなる群から選択されるポリペプチド。
(A)以下の(a1)又は(a2)のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
 (a1)配列番号2におけるアミノ酸番号1~601で示されるアミノ酸配列。
 (a2)配列番号2におけるアミノ酸番号34~601で示されるアミノ酸配列。
(B)前記(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつN-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチド。
(C)前記(A)又は(B)のポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、かつN-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチド。
[3]
 以下の(A)~(C)の特徴を有するポリペプチド。
(A)N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有する。
(B)至適pHが5.5~6.0である。
(C)0.1%(w/v)以上のデオキシコール酸ナトリウムの存在下で前記活性が実質的に失われる。
[4]
 前記酵素、又は前記ポリペプチド、をコードする核酸。
[5]
 以下の(A)~(C)からなる群から選択されるDNA。
(A)以下の(a1)又は(a2)の塩基配列を含むDNA。
 (a1)配列番号1における塩基番号1~1806で示される塩基配列。
 (a2)配列番号1における塩基番号100~1806で示される塩基配列。
(B)前記(A)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつN-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドをコードするDNA。
(C)前記(A)又は(B)のDNAにペプチドタグをコードするDNAを付加した融合DNAの塩基配列を含み、かつN-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドをコードするDNA。
[6]
 前記核酸、及び/又は前記DNA、を含むベクター。
[7]
 前記核酸、前記DNA、及び/又は前記ベクター、を保持する宿主細胞。
[8]
 以下の(A)及び(B)を含む、ポリペプチドの製造方法。
(A)前記宿主細胞を用いて、N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドを発現させる工程。
(B)前記(A)の工程において発現させたポリペプチドを採取する工程。
[9]
 前記方法により得られるポリペプチド。
[10]
 N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有する酵素及び/又はポリペプチドを、N-アセチルグルコサミン残基とヘキスロン酸残基からなる二糖を含む多糖と接触させる工程を含む、ヘキスロン酸残基が異性化された多糖の製造方法。
[11]
 前記酵素及び/又は前記ポリペプチドを、N-アセチルグルコサミン残基とヘキスロン酸残基からなる二糖を含む多糖と接触させる工程を含む、ヘキスロン酸残基が異性化された多糖の製造方法。
[12]
 前記方法により得られる多糖。
[13]
 N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基がイズロン酸残基に異性化された構造を含む多糖。
[14]
 多糖の骨格中に存在するヘキスロン酸残基におけるイズロン酸残基の割合が20%~75%である、前記多糖。
カラム精製して得たHG-5epiの溶出画分を還元条件下におけるSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供して得られるゲルのCBB染色後の写真像図である。 HPLCポストカラムラベル法のフローダイアグラムを示す図である。 NAHまたはCDSNAc-HEPをN-脱アセチル化および亜硝酸分解した後、HPLCポストカラムラベル法に供して得られるクロマトグラムを示す図である。 粗精製HG-5epiと接触させたNAHをN-脱アセチル化および亜硝酸分解した後、HPLCポストカラムラベル法に供して得られるクロマトグラムを示す図である。 粗精製HG-5epiと接触させたNSHを亜硝酸分解した後、HPLCポストカラムラベル法に供して得られるクロマトグラムを示す図である。 HG-5epiと接触させたNAHをN-脱アセチル化および亜硝酸分解した後、HPLCポストカラムラベル法に供して得られるクロマトグラムを示す図である。
(1)本発明の酵素
 本発明の酵素は、以下の(A)および(B)の特徴を有する、アフリカマイマイ由来の酵素である。
(A)NAHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する活性、及び/又は、CDSNAc-HEPのIdoA残基をGlcA残基に異性化する活性、を有する。
(B)NSHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する活性、及び/又は、CDSNS-HEPのIdoA残基をGlcA残基に異性化する活性、を実質的に有しない。
 ここにいう「アフリカマイマイ由来」とは、アフリカマイマイから取得できることを意味する。
 本発明の酵素は、HG-5epi活性を有する酵素である。ここにいう「HG-5epi活性」とは、先に述べた通り、NAHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリン(CDSNAc-HEP)のIdoA残基をGlcA残基に異性化する活性、を意味する。HG-5epi活性は、例えば、後述する<実施例14>、<実施例16>、または<実施例17>に記載のHPLCポストカラムラベル法を用いる方法により測定することができる。また、HG-5epi活性は、例えば、後述する<実施例20>または<実施例21>に記載の放射性同位体を用いる方法によっても測定することができる。具体的には、NAHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する活性は、後述する<実施例14>、<実施例16>、<実施例20>、または<実施例21>の方法に従って測定することができる。また、具体的には、CDSNAc-HEPのIdoA残基をGlcA残基に異性化する活性は、後述する<実施例17>の方法に従って測定することができる。
 本発明の酵素は、NAHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する活性、及び、CDSNAc-HEPのIdoA残基をGlcA残基に異性化する活性、の両方を有していてもよく、片方のみを有していてもよい。例えば、本発明の酵素は、NAHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する活性を有し、且つ、CDSNAc-HEPのIdoA残基をGlcA残基に異性化する活性を実質的に有していなくてもよい。
 NAHは、GlcNAc残基とGlcA残基からなる二糖を含む多糖である。CDSNAc-HEPは、GlcNAc残基とGlcA残基からなる二糖、及び、GlcNAc残基とIdoA残基からなる二糖、を含む多糖である。以下、GlcAとIdoAを総称して「HexA」ともいう。すなわち、NAHおよびCDSNAc-HEPは、いずれも、GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖を含む多糖である。
 NAHおよびCDSNAc-HEPは、本発明の酵素が作用する基質の例示であり、本発明の酵素が作用する基質を限定するものではない。すなわち、本発明の酵素は、HG-5epi活性を有する限り、さらに、GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖を含む他の多糖(NAHおよびCDSNAc-HEP以外の多糖)における、GlcNAc残基に隣接したHexA残基を異性化する活性を有していてもよい。ここにいう「他の多糖」は、GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖を含む多糖である限り特に限定されない。ここにいう「他の多糖」は、より具体的には、GlcNAc残基とGlcA残基からなる二糖、及び/又は、GlcNAc残基とIdoA残基からなる二糖、を含む多糖である。ここにいう「HexA残基の異性化」とは、GlcA残基からIdoA残基への異性化、及び/又は、IdoA残基からGlcA残基への異性化、を意味する。
 ここにいう「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」とは、GlcNAc残基とHexA残基が結合してなる二糖を意味する。ここにいう「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」におけるGlcNAc残基とHexA残基の結合の順序は限定されない。「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」としては、具体的には、例えば、下記構造式(2)~(5)で表される二糖が挙げられる。
 すなわち、本発明の酵素は、具体的には、例えば、多糖の骨格中に存在する下記構造式(2)で表されるGlcNAc残基とGlcA残基からなる二糖(GlcNAcα1-4GlcA)を下記構造式(3)で表されるGlcNAc残基とIdoA残基からなる二糖(GlcNAcα1-4IdoA)に異性化する活性、及び/又は、多糖の骨格中に存在する下記構造式(3)で表される二糖を下記構造式(2)で表される二糖に異性化する活性、を有する酵素であってよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 また、本発明の酵素は、具体的には、例えば、多糖の骨格中に存在する下記構造式(4)で表されるGlcA残基とGlcNAc残基からなる二糖(GlcAβ1-4GlcNAc)を下記構造式(5)で表されるIdoA残基とGlcNAc残基からなる二糖(IdoAα1-4GlcNAc)に異性化する活性、及び/又は、多糖の骨格中に存在する下記構造式(5)で表される二糖を下記構造式(4)で表される二糖に異性化する活性、を有する酵素であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 本発明の酵素によりIdoA残基に異性化されるGlcA残基の、NAH等の多糖における位置は、特に限定されない。すなわち、このようなGlcA残基は、NAH等の多糖の骨格中において、還元末端に存在する場合、非還元末端に存在する場合、多糖の骨格中間部位に存在する場合の3通りが存在するが、このいずれであってもよい。
 本発明の酵素によりGlcA残基に異性化されるIdoA残基の、CDSNAc-HEP等の多糖における位置は、特に限定されない。すなわち、このようなIdoA残基は、CDSNAc-HEP等の多糖の骨格中において、還元末端に存在する場合、非還元末端に存在する場合、多糖の骨格中間部位に存在する場合の3通りが存在するが、このいずれであってもよい。
 また、本発明の酵素は、C5-epi活性を実質的に有しない酵素である。ここにいう「C5-epi活性」とは、NSHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-再硫酸化ヘパリン(CDSNS-HEP)のIdoA残基をGlcA残基に異性化する活性、を意味する。C5-epi活性は、例えば、後述する<実施例15>または<実施例18>に記載のHPLCポストカラムラベル法を用いる方法により測定することができる。具体的には、NSHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する活性は、後述する<実施例15>の方法に従って測定することができる。また、具体的には、CDSNS-HEPのIdoA残基をGlcA残基に異性化する活性は、後述する<実施例18>の方法に従って測定することができる。
 ここにいう「活性を実質的に有しない」とは、活性に対応する多糖を酵素と接触させる前後で比較した場合において、IdoA含量が全く変化(増加または減少)しない、あるいはほとんど変化(増加または減少)しないことを意味する。すなわち、例えば、「C5-epi活性を実質的に有しない」とは、NSHを酵素と接触させる前後で比較した場合において、IdoA含量が全く変化(増加または減少)しない、あるいはほとんど変化(増加または減少)しないこと、及び/又は、CDSNS-HEPを酵素と接触させる前後で比較した場合において、IdoA含量が全く変化(増加または減少)しない、あるいはほとんど変化(増加または減少)しないこと、を意味する。
 ここにいう「IdoA含量」とは、多糖の骨格中に存在するHexA残基におけるIdoA残基の割合、すなわち、IdoA残基の総数をHexA残基の総数(GlcA残基の総数とIdoA残基の総数の合計)で除して百分率換算した値を意味する。このようなIdoA含量は、例えば、後述する<実施例14>、<実施例15>、<実施例16>、<実施例17>、または<実施例18>の方法に従って測定することができる。よって、ここにいう「IdoA含量がほとんど変化しない」とは、例えば、本発明の酵素と接触させる前後の多糖をそれぞれHPLCポストカラムラベル法に供し、IdoA含量を測定して比較した場合に、測定誤差程度の変化しか起こらない、具体的には、5%以下、2%以下、1%以下、または0.5%以下の変化しか起こらない(すなわち、酵素反応前のIdoA含量がn(%)である場合に、酵素反応後のIdoA含量がn-5(%)以上且つn+5(%)以下、n-2(%)以上且つn+2(%)以下、n-1(%)以上且つn+1(%)以下、またはn-0.5(%)以上且つn+0.5(%)以下である)、ことを意味してよい。
 あるタンパク質がHG-5epi活性を有するか否かは、後述する<実施例14>、<実施例16>、<実施例17>、<実施例20>、または<実施例21>の方法に従って判定することができる。また、あるタンパク質がC5-epi活性を実質的に有しないか否かは、後述する<実施例15>または<実施例18>の方法に従って判定することができる。よって、これらの方法に従えば、アフリカマイマイ由来の任意のタンパク質が本発明の酵素であるか否かを判定することができる。
 本発明の酵素は、アフリカマイマイから取得することができる。具体的には、例えば、アフリカマイマイの細胞を破砕して得られる細胞破砕物または細胞抽出液から本発明の酵素を取得することができる。このような「破砕」は、細胞の種類に応じて適宜選択した方法により実施できる。破砕方法としては、ホモジェナイズする方法、超音波処理する方法、凍結融解する方法、界面活性剤を添加する方法等が例示される。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。本発明の酵素を取得する細胞は、本発明の酵素を発現している限り特に限定されない。そのような細胞としては、例えば、粘液腺の細胞が挙げられる。
 本発明の酵素の取得は、タンパク質の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
 本発明の酵素は、本発明の酵素のみからなるものであってもよく、本発明の酵素以外の成分を含むものであってもよい。このような「本発明の酵素以外の成分」としては、アルカリ金属塩、界面活性剤、緩衝剤、アフリカマイマイ由来の成分等が例示される。また、本発明の酵素は形状についても特に限定されず、液状であってもよく、固形状であってもよい。本発明の酵素が液状で提供される場合は、凍結状態で提供されてもよいし、液体状態(融解状態)で提供されてもよい。また、本発明の酵素が固形状で提供される場合としては、凍結乾燥物、アガロースビーズ等に結合させた固定化酵素等としての提供が例示される。
 本発明の酵素において、本発明の酵素が占める重量濃度は、任意の濃度に適宜設定することができる。本発明の酵素において、本発明の酵素が占める重量濃度は、例えば、0.001%以上、0.01%以上、0.1%以上、1%以上、5%以上、10%以上、25%以上、または50%以上であってよい。また、本発明の酵素において、本発明の酵素が占める重量濃度は、例えば、100%以下、75%以下、50%以下、25%以下、10%以下、5%以下、または1%以下であってよい。
(2)本発明のポリペプチド
 本発明のポリペプチドは、HG-5epi活性を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、HG-5epi活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されない。本発明のポリペプチドの一態様は、上述した本発明の酵素の一態様であってよい。
 本発明のポリペプチドは、例えば、特定のアミノ酸配列を含み、且つ、HG-5epi活性を有するポリペプチドであってよい。
 本発明のポリペプチドは、具体的には、例えば、以下の(A)~(C)からなる群から選択されるポリペプチドであってよい。
(A)以下の(a1)または(a2)のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
 (a1)配列番号2におけるアミノ酸番号1~601で示されるアミノ酸配列。
 (a2)配列番号2におけるアミノ酸番号34~601で示されるアミノ酸配列。
(B)上記(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつHG-5epi活性を有するポリペプチド。
(C)上記(A)または(B)のポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、かつHG-5epi活性を有するポリペプチド。
 すなわち、本発明のポリペプチドとしては、次の三つの態様が挙げられる。第一の態様は、配列番号2におけるアミノ酸番号1~601または34~601で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。第二の態様は、第一の態様で示されるポリペプチドのアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつHG-5epi活性を有するポリペプチドである。第三の態様は、第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、かつHG-5epi活性を有するポリペプチドである。
 なお、本願において、「アミノ酸配列を含む」という表現は、当該「アミノ酸配列からなる」場合を包含する。
 第二の態様においていう「数個」とは、置換、欠失、挿入、及び/又は付加してもHG-5epi活性を失わないアミノ酸残基の数を意味し、例えば、ポリペプチドを構成する全アミノ酸残基数に対して、好ましくは10%以下、より好ましくは5%以下、さらに好ましくは2%以下、特に好ましくは1%以下、の数であってよい。
 すなわち、配列番号2におけるアミノ酸番号1~601で示したアミノ酸配列からなるポリペプチドの場合、全アミノ酸数が601であるので、「数個」とは、好ましくは2~60個、より好ましくは2~30個、さらに好ましくは2~12個、特に好ましくは2~6個であってよい。また、配列番号2におけるアミノ酸番号34~601のアミノ酸配列からなるポリペプチドの場合は、全アミノ酸数が568であるので、「数個」とは、好ましくは2~56個、より好ましくは2~28個、さらに好ましくは2~11個、特に好ましくは2~5個であってよい。また、これらのポリペプチドにおいて、「数個」とは、2個、2~3個、2~4個、または2~5個であってもよい。
 第二の態様においていう「置換、欠失、挿入、及び/又は付加」は、例えば、HG-5epi活性が失われない保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
 また、第二の態様で示されるポリペプチドは、言い換えれば、例えば、第一の態様で示されるポリペプチドのアミノ酸配列全体に対して、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつHG-5epi活性を有するポリペプチドであってもよい。なお、ここでいう「相同性」(homology)とは、「同一性」(identity)を意味してもよい。
 第三の態様においていう「ペプチドタグ」とは、タンパク質の検出や精製を容易にするためのアミノ酸配列からなるペプチドを意味する。ここにいう「ペプチドタグ」の長さおよびアミノ酸配列は、このペプチドタグを第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドに付加した融合ポリペプチドがHG-5epi活性を失わない限り、特に限定されない。このようなペプチドタグとしては、FLAG(登録商標)ペプチド(FLAGタグ)、6×Hisペプチド(His・Tag(登録商標))、c-mycペプチド(mycタグ)、プロテインA、MBP(マルトース結合タンパク質)、GST(グルタチオン-S-転移酵素)等が例示されるが、中でもFLAGペプチド(配列番号32)が好ましい。
 このような「ペプチドタグ」は、第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドに直接付加されていてもよいし、任意のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーを介して付加されていてもよい。ここにいう「ペプチドリンカー」の長さおよびアミノ酸配列は、ペプチドタグの場合と同様、第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドに付加した融合ポリペプチドがHG-5epi活性を失わない限り、特に限定されない。このようなペプチドリンカーとしては、例えば、N末端側がアスパラギンでありC末端側がセリンであるジペプチド、N末端側がバリンでありC末端側がアスパラギン酸であるジペプチド、が挙げられる。
 また、このような「ペプチドタグ」は、第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドのN末端側にのみ付加されてもよいし、C末端側にのみ付加されてもよいし、両末端に付加されてもよいが、中でもN末端側にのみ付加されることが好ましい。
 本発明のポリペプチドは、HG-5epi活性を有するポリペプチドである。HG-5epi活性の有無は、例えば、後述する<実施例14>、<実施例16>、<実施例17>、<実施例20>、または<実施例21>の方法に従って判定することができる。よって、これらの方法によって、第二の態様または第三の態様で示されるポリペプチドを選択することができる。すなわち、第二の態様で示されるポリペプチドは、例えば、HG-5epi活性の有無を指標として、HG-5epi活性を失わずに1個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を導入可能な部位を、第一の態様で示されるポリペプチドのアミノ酸配列から選択して得ることができる。また、第三の態様で示されるポリペプチドは、例えば、HG-5epi活性の有無を指標として、HG-5epi活性を失わずにペプチドタグを付加できるアミノ酸配列を、第一の態様または第二の態様で示されるポリペプチドのアミノ酸配列から選択して得ることができる。
 本発明のポリペプチドは、HG-5epi活性を有する限り、さらに、GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖を含む他の多糖(NAHおよびCDSNAc-HEP以外の多糖)における、GlcNAc残基に隣接したHexA残基を異性化する活性を有していてもよい。
 本発明のポリペプチドは、C5-epi活性を有していてもよく、実質的に有していなくてもよい。C5-epi活性の有無は、例えば、後述する<実施例15>または<実施例18>の方法に従って判定することができる。
 本発明のポリペプチドは、HG-5epi活性の至適pHが5.5~6.0であるという特徴を有していてもよい。至適pHは、例えば、後述する<実施例22>に記載の方法に従って決定することができる。
 本発明のポリペプチドは、0.1%(w/v)以上のデオキシコール酸ナトリウムの存在下でHG-5epi活性が実質的に失われるという特徴を有していてもよい。
 本発明のポリペプチドは、アルカリ金属塩化物、及び/又は、アルカリ土類金属塩化物の濃度に依存してHG-5epi活性が低下するという特徴(すなわち、アルカリ金属塩化物、及び/又は、アルカリ土類金属塩化物の濃度が増大するとHG-5epi活性が低下するという特徴)を有していてもよい。ここにいう「アルカリ金属塩化物」としては、塩化ナトリウムが例示される。また、ここにいう「アルカリ土類金属塩化物」としては、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化マンガンが例示される。当該特徴は、アルカリ土類金属塩化物、中でも塩化カルシウムにおいて顕著であってもよい。また、当該特徴は、具体的には、例えば、64mM以上の塩化カルシウムの存在下でHG-5epi活性が実質的に失われるという特徴であってもよい。
 ここにいう「HG-5epi活性が実質的に失われる」とは、例えば、対象物質(デオキシコール酸ナトリウム、アルカリ金属塩化物、アルカリ土類金属塩化物等)の存在下におけるHG-5epi活性が、対象物質の非存在下におけるHG-5epi活性の10%以下、5%以下、2%以下、または1%以下であることを意味してよい。
 また、HG-5epi活性が実質的に失われたか否かは、例えば、後述する<実施例23>または<実施例24>に記載の放射性同位体を用いる方法に従って判定することができる。その場合、「HG-5epi活性が実質的に失われる」とは、具体的には、例えば、対象物質(デオキシコール酸ナトリウム、アルカリ金属塩化物、アルカリ土類金属塩化物等)の存在下でポリペプチドをHexA残基の5位の水素原子をH(トリチウム)で置換した対象多糖(例えば[5-H]NAH)に接触させ、接触前後の反応液から前記対象多糖(例えば[5-H]NAH)を除去して回収した溶液をシンチレーションカウンターに供し、HG-5epi活性によって前記対象多糖(例えば[5-H]NAH)中のHexA残基が異性化された際に生じるOの放射活性を測定して比較した場合に、測定値(dpm)に有意差がないこと、例えば、接触後の反応液に由来する溶液の測定値が接触前の反応液に由来する溶液の測定値の3倍以下の値であること、を意味してもよい。ここにいう「[5-H]NAH」は、例えば、後述する<実施例19>の方法に従って調製することができる。
 本発明のポリペプチドは、HG-5epi活性を有するポリペプチドである限り、第一の態様~第三の態様に示されるような特定のアミノ酸配列を含むポリペプチドには限定されない。本発明のポリペプチドは、例えば、HG-5epi活性を有し、且つ、上記に例示した特徴の1またはそれ以上を有するポリペプチドであってもよい。
 本発明のポリペプチドは、具体的には、例えば、以下の(A)~(C)の特徴を有するポリペプチドであってもよい。
(A)HG-5epi活性を有する。
(B)至適pHが5.5~6.0である。
(C)0.1%(w/v)以上のデオキシコール酸ナトリウムの存在下でHG-5epi活性が実質的に失われる。
 このようなポリペプチドは、さらに、上記に例示した特徴の1またはそれ以上を有していてよい。すなわち、このようなポリペプチドは、例えば、GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖を含む他の多糖(NAHおよびCDSNAc-HEP以外の多糖)における、GlcNAc残基に隣接したHexA残基を異性化する活性を有していてもよい。また、このようなポリペプチドは、例えば、C5-epi活性を有していてもよく、実質的に有していなくてもよい。また、このようなポリペプチドは、例えば、アルカリ金属塩化物、及び/又は、アルカリ土類金属塩化物の濃度に依存して活性が低下するという特徴を有していてもよい。
 本発明のポリペプチドは、例えば、後述する本発明の宿主細胞を用いることで、遺伝子工学的手法によって調製することが可能である。このような「遺伝子工学的手法」としては、後述する<実施例6>~<実施例13>に記載の昆虫細胞を用いた方法が例示される。
(3)本発明の核酸
 本発明の核酸は、本発明の酵素または本発明のポリペプチドをコードする核酸である。なお、上述の通り、本発明のポリペプチドの一態様は、上述した本発明の酵素の一態様であってよい。よって、本発明の核酸の一態様は、本発明の酵素をコードする核酸であってよい。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする限り、特に限定されない。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする限りにおいて、遺伝子暗号の縮重による異なった塩基配列からなる全ての核酸を包含する。
 ここにいう「核酸」には、DNAおよびRNAが包含される。また、本発明の核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、二本鎖の場合はDNAとRNAからなるハイブリッド鎖であってもよい。さらに、本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする限り、本発明のポリペプチドをコードする領域内にイントロンの配列を含んだ核酸であってもよく、本発明のポリペプチドをコードする領域内にイントロンの配列を含まない核酸であってもよい。本発明の核酸としては、例えば、アフリカマイマイに由来するmRNA(mRNA前駆体または成熟mRNA)、mRNAから逆転写反応によって合成されたcDNAが挙げられる。また、本発明の核酸は、単離された核酸であってよい。
 本発明の核酸は、例えば、特定の塩基配列を含み、且つ、HG-5epi活性を有するポリペプチドをコードする核酸であってよい。
 本発明の核酸は、具体的には、例えば、以下の(A)~(C)からなる群から選択されるDNAであってよい。
(A)以下の(a1)または(a2)の塩基配列を含むDNA。
 (a1)配列番号1における塩基番号1~1806で示される塩基配列。
 (a2)配列番号1における塩基番号100~1806で示される塩基配列。
(B)上記(A)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつHG-5epi活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(C)上記(A)または(B)のDNAにペプチドタグをコードするDNAを付加した融合DNAの塩基配列を含み、かつHG-5epi活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
 すなわち、本発明の核酸としては、次の三つの態様が挙げられる。第一の態様は、配列番号1における塩基番号1~1806または100~1806で示される塩基配列を含むDNAである。第二の態様は、第一の態様で示されるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつHG-5epi活性を有するポリペプチドをコードするDNAである。第三の態様は、第一の態様または第二の態様で示されるDNAにペプチドタグをコードするDNAを付加した融合DNAの塩基配列を含み、かつHG-5epi活性を有するポリペプチドをコードするDNAである。このようなDNAは、単離されたDNAであってよい。
 なお、本願において、「塩基配列を含む」という表現は、当該「塩基配列からなる」場合を包含する。
 第一の態様で示されるDNAは、例えば、後述する<実施例1>~<実施例5>に記載の方法により得ることができる。また、第一の態様で示されるDNAは、配列番号1に示す塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるPCR(Polymerase Chain Reaction)反応により、アフリカマイマイに由来する核酸(染色体DNAまたはcDNA)を鋳型としてDNA断片を増幅させることによっても得ることができる。
 第二の態様においていう「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。すなわち、ここにいう「ストリンジェントな条件」とは、第一の態様で示されるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAに対し、特異的なハイブリッドが形成される条件を意味する。ストリンジェントな条件としては、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。このような条件としては、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1%SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1%SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1%SDS、に相当する塩濃度および温度で、1回、好ましくは2~3回洗浄する条件が挙げられる。また、このような条件としては、例えば、50%ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES-NaOH(pH7.0)、10×Denhardt’s solution、および100μg/mLサケ精子DNAからなる溶液中で42℃においてハイブリダイズさせ、2×SSCおよび0.1%SDSからなる溶液で室温において洗浄し、0.1×SSCおよび0.1%SDSからなる溶液で50℃においてさらに洗浄する条件も挙げられる(Sambrook J, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))。
 第二の態様で示されるDNAは、例えば、第一の態様で示されるDNAの塩基配列に対して核酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加(以下、総称して「変異の導入」と言う。)を行うことで調製することができる。ここにいう「変異の導入」は、例えば、公知の方法により行うことが可能である。
 「変異の導入」を行う方法としては、例えば、制限酵素およびT4DNAリガーゼを用いる方法が挙げられる。すなわち、所望のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするように塩基配列に変異を導入したDNA断片の両末端を制限酵素によって限定分解し、同じ制限酵素で限定分解した配列番号1の塩基配列からなるDNAをサブクローニングしたベクターと混合した後、T4DNAリガーゼによって両者をライゲーションさせることにより、変異を導入したDNAを得ることができる。このような「塩基配列に変異を導入したDNA断片」は、例えば、そのような変異を導入したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるPCR反応により得ることができる。また、所望の部位の塩基に変異を導入した配列となるように合成した2本の相補的なオリゴヌクレオチドを水溶液中で混合し、90~100℃で1~2分間加熱した後、室温まで冷却することによっても得ることができる。
 また、「変異の導入」を行う方法としては、例えば、部位特異的変異導入法も挙げられる。部位特異的変異導入法としては、例えば、PCR反応を用いる方法(Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987))や、ファージを用いる方法(Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987))が挙げられる。部位特異的変異導入法は、具体的には、例えば、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(東洋紡社製)を利用して行うことができる。
 第三の態様においていう「ペプチドタグ」は、前記「(2)本発明のポリペプチド」において詳述したペプチドタグと同じである。よって、コードするポリペプチドがHG-5epi活性を有する限りにおいて、ペプチドタグをコードするDNAを付加した融合DNAも本発明の核酸として例示される。ここにいう「ペプチドタグをコードするDNA」は、ペプチドタグのみをコードするDNAであってもよく、ペプチドタグをコードするDNAとリンカー配列をコードするDNAからなる融合DNAであってもよい。
 また、本発明の核酸は、その塩基配列を化学的に全合成することによっても得ることができる。
 本発明の核酸がコードするポリペプチドは、HG-5epi活性を有する。本発明の核酸がコードするポリペプチドは、前記「(2)本発明のポリペプチド」において記載した方法によって調製することができる。本発明の核酸がコードするポリペプチドのHG-5epi活性の有無は、前記「(2)本発明のポリペプチド」において記載した方法によって判定することができる。
(4)本発明のベクター
 本発明のベクターは、本発明の核酸を含むベクターである。本発明のベクターは、1種の本発明の核酸を含んでいてもよく、2種またはそれ以上の本発明の核酸を含んでいてもよい。本発明のベクターは、1コピーの本発明の核酸を含んでいてもよく、2コピーまたはそれ以上の本発明の核酸を含んでいてもよい。
 ここにいう「ベクター」は、本発明の核酸を宿主細胞へ導入するために用いる核酸分子を意味する。ベクターは、宿主細胞において本発明の核酸の増幅または本発明の核酸がコードするポリペプチドの発現が可能である限り、特に限定されない。このようなベクターとしては、ファージ、プラスミド、ウイルス等が例示される。ベクターは、宿主細胞の種類や本発明の核酸がコードするポリペプチドの所望の発現量等の諸条件に応じて適宜選択することができる。例えば、宿主細胞として細菌細胞等の原核細胞を利用する場合、ベクターとしては、ファージやプラスミドを好適に利用することができる。また、例えば、宿主細胞として昆虫細胞等の真核細胞を利用する場合、ベクターとしては、プラスミドやウイルスを好適に利用することができる。
 細菌細胞で利用できるファージとしては、例えば、ファージDNAとして機能するプラスミドをパッケージングしたファージ粒子が挙げられる。細菌細胞で利用できるプラスミドとしては、例えば、pBlue Script II SK(+)が挙げられる。昆虫細胞等で利用できるプラスミドとしては、例えば、pIZ-V5(ライフテクノロジーズ社製)が挙げられる。
 昆虫細胞等で利用できるウイルスとしては、例えば、バキュロウイルス(Baculovirus)が挙げられる。バキュロウイルスとしては、核多角体病ウイルス(Nuclear Polyhedrosis Virus;NPV)が好ましい。NPVとしては、AcNPV(Autographa californica NPV)やBmNPV(Bombyx mori NPV)が挙げられるが、中でもAcNPVが好ましい。本発明の核酸が導入されたウイルスを常法により昆虫細胞等の宿主細胞に感染させることで、本発明の核酸を保持し、本発明の核酸がコードするポリペプチドを発現する宿主細胞が得られる。
 ファージへの本発明の核酸の導入は、常法に従って行うことができる。ファージに本発明の核酸を導入する方法としては、後述の<実施例2>に記載の方法が例示される。すなわち、例えば、本発明の核酸を含むファージDNAをファージ粒子にパッケージングすればよい。具体的には、例えば、ファージDNAとして機能するプラスミドのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素サイトから任意の2つを選択し、プラスミドと本発明の核酸をこれらの制限酵素で限定分解した後にライゲーションすればよい。このようなプラスミドとしては、例えば、Lambda ZAP IIが挙げられる。また、本発明の核酸としては、制限酵素サイトを5’末端側に付加したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCR反応によって得られるDNAを用いればよい。また、本発明の核酸への制限酵素サイトの導入は、制限酵素で限定分解された際に生じる構造を5’末端に有するDNA断片を、本発明の核酸であるDNA断片にライゲーションして行ってもよい。
 プラスミドへの本発明の核酸の導入は、常法に従って行うことができる。プラスミドに本発明の核酸を導入する方法としては、後述の<実施例6>、または<実施例10>に記載の方法が例示される。すなわち、例えば、プラスミドのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素サイトから任意の2つを選択し、プラスミドと本発明の核酸をこれらの制限酵素で限定分解した後にライゲーションすればよい。本発明の核酸としては、制限酵素サイトを5’末端側に付加したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCR反応によって得られるDNAを用いればよい。また、本発明の核酸への制限酵素サイトの導入は、制限酵素で限定分解された際に生じる構造を5’末端に有するDNA断片を、本発明の核酸であるDNA断片にライゲーションして行ってもよい。
 ウイルスへの本発明の核酸の導入は、常法に従って行うことができる。例えば、ウイルスへの本発明の核酸の導入は、バクミドを調製することにより行うことができる。具体的には、例えば、本発明の核酸を導入したドナープラスミドを用いてバクミド調製用の細菌株を形質転換することで、本発明の核酸が導入されたバクミドを調製することができる。バクミド調製用の細菌株としては、例えば、大腸菌DH10Bac株が挙げられる。ドナープラスミドとしては、例えば、pFastBac1が挙げられる。このようにして調製したバクミドは、昆虫細胞等の宿主細胞を形質転換することで、そのままウイルスとして機能する。
 また、例えば、ウイルスへの本発明の核酸の導入は、トランスファーベクターと呼ばれるプラスミドを利用することによっても行うことができる。具体的には、例えば、本発明の核酸を導入したトランスファーベクターとウイルスゲノムとを昆虫細胞等の宿主細胞にコトランスフェクションさせることにより、本発明の核酸が導入されたウイルスが得られる。トランスファーベクターとしては、pPSC8(プロテインサイエンス社製)やpVL1393(ABベクター社製)が挙げられる。
(5)本発明の宿主細胞
 本発明の宿主細胞は、本発明の核酸、及び/又は本発明のベクター(以下、総称して「本発明のベクター等」と言う。)を保持する宿主細胞である。なお、本発明のベクターは本発明の核酸を含むベクターであるため、本発明のベクターを保持する宿主細胞は、本発明の核酸を保持する宿主細胞にも該当する。本発明の宿主細胞は、1種の本発明のベクター等を保持していてもよく、2種またはそれ以上の本発明のベクター等を保持していてもよい。本発明の宿主細胞は、1コピーの本発明のベクター等を保持していてもよく、2コピーまたはそれ以上の本発明のベクター等を保持していてもよい。本発明の宿主細胞は、染色体上に本発明のベクター等を保持していてもよく、染色体外に本発明のベクター等を保持していてもよく、染色体上と染色体外の両方に本発明のベクター等を保持していてもよい。本発明の宿主細胞は、具体的には、本発明のベクター等を用いて形質転換された宿主細胞であってよい。ここにいう「宿主細胞」は、本発明のベクター等を増幅させるための宿主、または本発明のベクター等がコードするポリペプチドを発現させるための宿主として用いられる細胞を意味する。このような宿主細胞は、本発明のベクター等を用いた形質転換が可能である限り特に限定されない。宿主細胞は、単離された細胞であることが好ましい。宿主細胞は、本発明のベクター等を使用する目的に応じて適宜選択できる。
 本発明のベクター等の増幅を目的とする場合は、宿主細胞は、例えば、原核細胞、具体的には、細菌細胞であることが好ましく、中でも大腸菌(Escherichia coli)であることが好ましい。大腸菌としては、例えば、XL-1 Blue MRF’株、JM109株、DH5α株が挙げられる。
 本発明のベクター等がコードするポリペプチドの発現を目的とする場合は、宿主細胞としては、例えば、異種タンパク質の発現に通常用いられるものを利用できる。このような宿主細胞は、例えば、真核細胞、具体的には、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞、または酵母細胞であることが好ましく、中でも昆虫細胞であることが好ましい。昆虫細胞としては、例えば、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)由来のSf9細胞、Sf21細胞、SF+細胞や、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)由来のHigh Five細胞が挙げられる。昆虫細胞は、ヨトウガ由来であることが好ましく、中でもSf21細胞であることが好ましい。
 宿主細胞の形質転換は、常法に従って行うことができる。宿主細胞を形質転換する方法は、宿主細胞へ本発明のベクター等を導入可能である限り特に限定されない。宿主細胞を形質転換する方法としては、具体的には、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等が例示されるが、中でもリポフェクション法であることが好ましい。リポフェクション法は、Cellfectin II Reagentを用いて実施することが好ましい。
(6)本発明のポリペプチド製造方法
 本発明のポリペプチドは、例えば、本発明の宿主細胞を用いて製造することができる。すなわち、本発明のポリペプチドは、例えば、以下の(A)および(B)の工程を含む、ポリペプチドの製造方法(以下、「本発明のポリペプチド製造方法」と言う。)により製造することができる。
(A)本発明の宿主細胞を用いてHG-5epi活性を有するポリペプチドを発現させる工程。
(B)前記(A)の工程において発現させたポリペプチドを採取する工程。
 上記(A)の工程は、本発明の宿主細胞を培養し、本発明のベクター等がコードするHG-5epi活性を有するポリペプチド(すなわち、本発明のポリペプチド)を発現させる工程である。
 上記(A)の工程として、具体的には、例えば、本発明の核酸を導入したpFastBac1を用いて形質転換した大腸菌DH10Bac株からバクミドを抽出し、このバクミドを用いてリポフェクション法により形質転換したSf21細胞を培養する工程が挙げられる。
 宿主細胞を培養する際の培養条件は、本発明のベクター等がコードする本発明のポリペプチドを発現できる限り特に限定されない。培養条件は、宿主細胞の種類や本発明のベクター等がコードする本発明のポリペプチドの所望の発現量等の諸条件に応じて適宜選択することができる。例えば、昆虫細胞の培養には、昆虫細胞の培養に通常用いられる培地を用いることができる。そのような培地としては、例えば、市販の昆虫細胞用の無血清培地が挙げられ、具体的には、Sf900III無血清培地が挙げられる。培養は、例えば、27℃~28℃で、振とう培養により行うことができる。
 上記(B)の工程は、上記(A)の工程で宿主細胞に発現させた本発明のポリペプチドを採取する工程である。ここにいう「採取」とは、宿主細胞の培養液から本発明のポリペプチドを含む画分を得ることを意味する。すなわち、本発明のポリペプチドが細胞外に分泌される形態で発現された場合は、培養液そのものを本発明のポリペプチドとして採取してもよいし、遠心分離後の上清を本発明のポリペプチドとして採取してもよいし、カラム等に供して精製した後の画分を本発明のポリペプチドとして採取してもよい。
 また、本発明のポリペプチドが細胞内に蓄積する形態で発現された場合は、細胞を破砕して得る抽出液を本発明のポリペプチドとして採取してもよいし、この抽出液をカラム等に供して精製した後の画分を本発明のポリペプチドとして採取してもよい。また、本発明のポリペプチドが細胞膜に蓄積する形態で発現された場合は、細胞そのものを本発明のポリペプチドとして採取してもよいし、細胞を破砕して得る破砕物を本発明のポリペプチドとして採取してもよい。このような「破砕」は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択した方法により実施できるが、ホモジェナイズする方法、超音波処理する方法、凍結融解する方法、界面活性剤を添加する方法等が例示される。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
 精製は、タンパク質の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、が挙げられる。特に、本発明のポリペプチドにペプチドタグが付加されている場合は、当該タグに対する親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行うことができる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
 精製は、所望の程度に行うことができる。本発明のポリペプチドが採取した画分中に占める重量濃度は、例えば、0.001%以上、0.01%以上、0.1%以上、1%以上、5%以上、10%以上、25%以上、または50%以上であってよい。また、本発明のポリペプチドが採取した画分中に占める重量濃度は、例えば、100%以下、75%以下、50%以下、25%以下、10%以下、5%以下、または1%以下であってよい。
 このようにして採取した画分に本発明のポリペプチドが含まれているか否かは、前記「(2)本発明のポリペプチド」において記載した方法に従い、HG-5epi活性の有無を測定することにより判定することができる。また、このようにして採取した画分に本発明のポリペプチドが含まれているか否かは、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いたWestern Blottingによっても、判定することができる。Western Blottingは、後述する<実施例9>の方法に従って行うことができる。
(7)本発明の多糖製造方法
 本発明の多糖製造方法は、HG-5epi活性を有する酵素及び/又はポリペプチド(以下、総称して「本発明のHG-5epi」と言う。)を、GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖を含む多糖と接触させる工程を含む、HexA残基が異性化された多糖の製造方法である。本発明のHG-5epiは、C5-epi活性を有していてもよく、実質的に有しなくてもよい。本発明のHG-5epiとしては、HG-5epi活性を有する1種の酵素を用いてもよく、HG-5epi活性を有する2種またはそれ以上の酵素を用いてもよい。本発明のHG-5epiとしては、HG-5epi活性を有する1種のポリペプチドを用いてもよく、HG-5epi活性を有する2種またはそれ以上のポリペプチドを用いてもよい。本発明のHG-5epiとしては、HG-5epi活性を有する1種またはそれ以上の酵素とHG-5epi活性を有する1種またはそれ以上のポリペプチドを組み合わせて用いてもよい。「HG-5epi活性を有する酵素」としては、本発明の酵素が挙げられる。「HG-5epi活性を有するポリペプチド」としては、本発明のポリペプチドが挙げられる。
 ここにいう「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖を含む多糖」は、本発明のHG-5epiが作用する基質である限り特に限定されない。
 ここにいう「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」とは、GlcNAc残基とHexA残基が結合してなる二糖を意味する。「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」におけるGlcNAc残基とHexA残基の結合の順序は限定されない。「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」は、1分子の多糖の骨格中に少なくとも1箇所存在すればよい。「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」は、1分子の多糖の骨格中に1箇所のみ存在してもよいし、2箇所またはそれ以上存在してもよい。「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」が1分子の多糖中に2箇所またはそれ以上存在する場合は、2つまたはそれ以上の二糖が結合してなる四糖またはそれ以上の鎖長を有する糖鎖として多糖の骨格中に存在してもよいし、他の分子を介して結合している状態として多糖の骨格中に存在してもよい。ここにいう「他の分子」としては、例えば、1つまたはそれ以上の糖残基からなる糖鎖であって、GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖以外の糖残基、が挙げられる。
 「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」におけるGlcNAc残基とHexA残基の結合様式は、本発明のHG-5epiが作用可能である限り特に限定されない。「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」の結合様式は、1-4グリコシド結合であることが好ましい。また、「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」におけるGlcNAc残基とHexA残基のアノマーは、GlcNAc残基はαアノマー、GlcA残基はβアノマー、IdoA残基はαアノマーであることが好ましい。
 このような「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」としては、具体的には、GlcNAc残基とGlcA残基との結合が[-4GlcNAcα1-4GlcAβ1-]または[-4GlcAβ1-4GlcNAcα1-]で示される二糖、GlcNAc残基とIdoA残基との結合が[-4GlcNAcα1-4IdoAα1-]または[-4IdoAα1-4GlcNAcα1-]で示される二糖、が例示される。このような「GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖」を含む多糖としては、具体的には、NAH、完全脱硫酸化・N-アセチル化HS(CDSNAc-HS)、CDSNAc-HEP、ACH(2-0-脱硫酸化AS)等が例示されるが、中でもNAH、CDSNAc-HEPが好ましい。
 ここにいう「HexA残基の異性化」とは、GlcA残基からIdoA残基への異性化、及び/又は、IdoA残基からGlcA残基への異性化、を意味する。すなわち、ここにいう「HexA残基が異性化された多糖」とは、本発明のHG-5epiを、GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖を含む多糖と接触させる工程、具体的には、多糖の骨格中に含まれる該二糖のGlcA残基の全てまたは一部をIdoA残基に異性化する工程、及び/又は、多糖の骨格中に含まれる該二糖のIdoA残基の全てまたは一部をGlcA残基に異性化する工程、によって得られる多糖を意味する。
 本発明の多糖製造方法は、GlcNAc残基とHexA残基からなる二糖を含む多糖の骨格中に含まれる該二糖のHexA残基(すなわち、GlcNAc残基に隣接したHexA残基)を異性化し、該多糖のIdoA含量を増加または減少させる方法、および、当該方法を利用した多糖の製造方法、を包含する。
 ここにいう「HexA残基が異性化された多糖」としては、具体的には、例えば、NAHのGlcA残基の全てまたは一部がIdoA残基に異性化された構造を含む多糖、CDSNAc-HEPのGlcA残基の全てまたは一部がIdoA残基に異性化された構造、及び/又は、IdoA残基の全てまたは一部がGlcA残基に異性化された構造、を含む多糖、が挙げられる。
 ここにいう「HexA残基が異性化された多糖」は、IdoA残基を有する多糖であってよい。「HexA残基が異性化された多糖」におけるIdoA含量は特に限定されず、本発明のHG-5epiをGlcNAc残基とHexA残基からなる二糖を含む多糖と接触させる条件に応じて、任意の値に制御することができる。具体的には、反応系に添加する本発明のHG-5epiの量、反応時間等の諸条件を適宜設定し、所望のIdoA含量となる条件に設定すればよい。ここにいう「IdoA含量」の定義は、前記「(1)本発明の酵素」において詳述した通りである。
 このような「HexA残基が異性化された多糖」は、例えば、IdoA含量が77%であるHEPや同含量が19%であるHS(Hook M, Lindahl U, Iverius PH., Biochem J. 1974 Jan; 137(1): 33-43.)とはIdoA含量が異なることを特徴とする多糖であってよい。
 「HexA残基が異性化された多糖」のIdoA含量は適宜設定することができる。「HexA残基が異性化された多糖」におけるIdoA含量は、例えば、0.1%以上、1%以上、5%以上、10%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、または50%以上であってよい。また、ここにいう「IdoA含量」は、例えば、100%以下、99%以下、95%以下、90%以下、80%以下、75%以下、70%以下、65%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下、5%以下、または1%以下であってよい。「HexA残基が異性化された多糖」におけるIdoA含量としては、20%~75%、25%~75%、30%~75%、35%~75%、40%~75%、20%~70%、25%~70%、30%~70%、35%~70%、40%~70%、20%~65%、25%~65%、30%~65%、35%~65%、40%~65%、20%~60%、25%~60%、30%~60%、35%~60%、40%~60%等が好ましく例示される。
 本発明の多糖製造方法により得られるHexA残基が異性化された多糖は、新規素材として有用である。
 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を何ら限定するものではない。
 本実施例で使用したCDSNAc-HEP、CDSNS-HEP、NAH、およびNSHは、公知の文献に記載の方法に従って得たものである。
 CDSNAc-HEPおよびCDSNS-HEPの調製においては、完全脱硫酸化ヘパリン(CDS-HEP)を中間体として用いた。
 CDS-HEPは、公知の文献を参照した方法によりHEPを脱硫酸化して得たものである。すなわち、豚腸管由来のHEP(シグマ・アルドリッチ社製)をN-メチル-N-(トリメチルシリル)-トリフルオロアセトアミド(MTSTFA)を用いた6-O-脱硫酸化、および、水酸化ナトリウムの存在下で凍結乾燥する2-O-脱硫酸化(Kariya Y, Herrmann J, Suzuki K, Isomura T, Ishihara M., J Biochem. 1998 Feb; 123(2): 240-6.)、ならびに、DMSO溶媒中で加熱するソルボリシス反応によるN-脱硫酸化(Ayotte L, Perlin AS., Carbohydr Res. 1986 Jan 1; 145(2): 267-77.)、に供して得たものである。このようにして得られるCDS-HEPは、HEPから実質的に全ての硫酸基が除去された構造を有する。
 CDSNAc-HEPは、CDS-HEPを無水酢酸を用いたN-アセチル化(Danishefsky I., Methods Carbohydr. Chem. 1965; 5: 407-409.)に供して得たものである。
 CDSNS-HEPは、CDS-HEPを三酸化硫黄ピリジン錯体を用いたN-硫酸化(Leali D, Belleri M, Urbinati C, Coltrini D, Oreste P, Zoppetti G, Ribatti D, Rusnati M, Presta M., J Biol Chem. 2001 Oct 12; 276(41): 37900-8.)に供して得たものである。
 NAHは、公知の文献(特開2004-018840号公報)に記載の方法に従い、大腸菌K5株(Serotype O10:K5(L):H4, ATCC 23506)を培養し、培養上清を精製に供して得たものである。
 NSHは、NAHを水酸化ナトリウム水溶液中で加熱するN-脱アセチル化、および、三酸化硫黄ピリジン錯体を用いたN-硫酸化(Leali D, Belleri M, Urbinati C, Coltrini D, Oreste P, Zoppetti G, Ribatti D, Rusnati M, Presta M., J Biol Chem. 2001 Oct 12; 276(41): 37900-8.)に供して得たものである。
<実施例1>アフリカマイマイ粘液腺由来mRNAの分取
 アフリカマイマイのmRNAは、ホットフェノール法(例えば、Verwoerd TC, Dekker BM, Hoekema A., Nucleic Acids Res. 1989 Mar 25; 17(6): 2362.)によって粘液腺からトータルRNAを抽出した後、磁気ビーズを用いる精製法に供してmRNAを分取することにより得た。手順を以下に示す。
 アフリカマイマイ1匹をメスで切開して摘出した粘液腺を蒸留水で洗浄した後、1.5mLのスクリューキャップチューブに密閉した。チューブを液体窒素に1分間浸して凍結させた後、ホモジェナイザーを用いて粘液腺を破砕し、水浴中で80℃に加熱したhot extraction buffer(55℃の水浴中で加熱して融解させたフェノールと緩衝液(0.1M LiCl、100mM Tris-HCl(pH=8.0)、10mM EDTA、1% SDS)を1:1で加えて撹拌した溶液)を0.5mL加え、試験管ミキサーを用いて30秒間撹拌した。その後、クロロホルム溶液(クロロホルムとイソアミルアルコールを24:1で加えて撹拌した溶液)を0.25mL加え、試験管ミキサーを用いてさらに30秒間撹拌した。
 この溶液を20,000×gで5分間遠心し、上層(水層)から0.2mLを別のチューブに移した後、4M LiClを0.2mL加えて混合し、-20℃に終夜静置した。その後、4℃において20,000×gで5分間遠心し、上清を除去してトータルRNAの沈殿を得た。この沈殿を蒸留水0.25mLに溶解させた後、3M CHCOONa(pH5.2)を0.025mL、エタノールを0.5mL加えて混合した。その後、20,000×gで5分間遠心し、上清を除去してトータルRNAの沈殿を再度得た。70%エタノールを0.5mL加えて沈殿を洗浄した後に上清を除去し、風乾させてトータルRNAの沈殿を再々度得た。
 このトータルRNAの沈殿に0.5mLの蒸留水を加え、穏やかにピペッティングして沈殿を溶解させた。次に、PolyATract(登録商標) mRNA Isolation System(プロメガ社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この溶液からアフリカマイマイ粘液腺由来mRNAを分取した。
<実施例2>アフリカマイマイcDNAファージライブラリーの調製
 AccuScript Hi-Fi cDNA Synthesis Kit(アジレント・テクノロジー社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記<実施例1>により得たmRNAからcDNAを得た。すなわち、上記<実施例1>で得たmRNAを鋳型とし、XhoIサイトを付加したオリゴdTプライマー(配列番号6)、5-メチルdCTP、およびMoloney murine leukemia virus reverse transcriptase(MMLV-RT)を用いた逆転写反応を行った。次に、RNaseHの存在下でDNA polymerase Iによるニックトランスレーション反応を行い、二本鎖cDNAを得た。
 この二本鎖cDNAに対して、キットに添付のPfu DNA Polymeraseを作用させて、cDNAの両末端を平滑化した後、DNA Ligation Kit Ver.2.1(タカラバイオ社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この二本鎖cDNAにEcoRIアダプター(後述)をライゲーションさせた。次に、制限酵素XhoI(タカラバイオ社製)を用いて限定分解し、QIAEX II Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って精製し、5’末端にEcoRIの粘着末端および3’末端にXhoIの粘着末端を有するcDNA断片を得た。
 ここにいう「EcoRIアダプター」とは、制限酵素EcoRIで限定分解された際に生じる構造を5’末端に有するDNA断片である。このようなDNAは、例えば、配列番号7の塩基配列からなるDNAと配列番号8の塩基配列からなるDNAを溶液中で混合し、90~100℃で1~2分間加熱した後、室温まで冷却することで調製することができる。配列番号8の塩基配列からなるDNAは、5’末端をリン酸化した後にEcoRIアダプターの作製に用いることが好ましい。
 次に、DNA Ligation Kit Ver.2.1を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記のcDNA断片とUni-ZAP XR(Lambda ZAP II(アジレント・テクノロジー社製)をEcoRIとXhoIで限定分解し、5’末端を脱リン酸化したクローニング用ベクター)をライゲーションした。次に、Gigapack III Gold Packaging Extract(アジレント・テクノロジー社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ライゲーションしたベクターをファージ粒子にパッケージングし、アフリカマイマイcDNAファージライブラリーを得た。パッケージングしたファージ溶液の力価は1.0×107 pfu/mLであった。
<実施例3>HG-5epiのポリペプチドをコードするDNA断片の取得
 上記<実施例2>で得たcDNAファージライブラリーを感染させる宿主細胞(宿主菌)として大腸菌XL-1 Blue MRF’株(アジレント・テクノロジー社製)を用い、下記に詳細を説明するプレートライセート法によりファージの増幅と回収を行った。
 宿主菌を20mLのLB培地(0.2%マルトース、10mM MgSO含有)に植菌して37℃で終夜振盪培養し、測定波長600nmにおける吸光度が1.5程度の培養液を得た。上記<実施例2>で得たファージライブラリーの溶液を50mLの試験管3本に30μLずつ分注し、それぞれに宿主菌の培養液を5mL加えて混合した。その後、37℃の水浴中に15分間静置してファージ粒子を宿主菌に感染させた。
 ファージ粒子が感染した宿主菌をプレート上で培養してプラークを形成させるため、このファージ粒子と宿主菌の混合液それぞれに45℃に加温したLBトップアガー(寒天濃度:0.7%)35mLを加えて手早く混合し、3枚のLBプレート(縦:24cm×横:24cm)にそれぞれ重層した。その後、37℃で6時間静置培養してプラークを形成させた。
 プラークを形成させた各プレートそれぞれにSM緩衝液(0.1M NaCl、10mM MgSO4・H2O、50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.01% ゼラチン)50mLとクロロホルム1mLの混合液を加えた後、4℃に終夜静置した。それぞれのプレートから40mLの上清を別々の遠心管に回収し、2mLのクロロホルムを加えた後、試験管ミキサーを用いて数秒間撹拌した。これらの遠心管を8,000×gで15分間遠心し、上清からそれぞれ35mLを回収して合一した溶液をファージ溶液として使用した。回収したファージ溶液の力価は3.4×109 pfu/mLであった。
 次に、Lambda Mini Kit(キアゲン社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、このファージ溶液からλDNAを得た。このλDNA0.5μgを鋳型としてPCR反応を行った。PCR反応のプライマーには、配列番号9、配列番号10、または配列番号11のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーとして、配列番号12または配列番号13のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして、それぞれ組み合わせて用いた。PCR反応にはEx Taq DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って遺伝子を増幅させた。PCR反応の条件は、94℃2分間、(94℃30秒間、55℃1分間、72℃2分間)×40サイクル、72℃5分間とした。その結果、配列番号9および配列番号13のプライマーを用いて実施したPCR反応により、約0.3kbpのDNA断片を得た。
 QIAEX II Gel Extraction Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記のDNA断片を精製した。次に、Blunting Kination Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってDNA断片末端の平滑化と5’末端のリン酸化をした後、再度DNA断片を精製した。その後、制限酵素EcoRV(ニュー・イングランド・バイオラボ社製)で限定分解した後にAlkaline Phosphatase, Calf Intestinal(CIP)(ニュー・イングランド・バイオラボ社製)で脱リン酸化したpBlue Script II SK(+)(アジレント・テクノロジー社製)(以下、pBSとする。)とこのDNA断片をライゲーションさせた。
 このライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株(タカラバイオ社製)を形質転換した後、50μg/mLのアンピシリンを含むLB培地(以下、LB/Ampとする。)の寒天培地に塗布し、37℃で終夜静置培養した。プレート上から任意の3個のシングルコロニーを、それぞれ1mLのLB/Amp培地に植菌して37℃で5時間振盪培養し、培養液から0.5mLをサンプリングして20,000×gで1分間遠心した後、上清を除去して大腸菌の菌体を得た。また、残りの培養液から10μLを2mLのLB/Amp培地に植菌し、37℃で終夜振盪培養した。
 常法に従ったアルカリミニプレップ法(Sambrook J, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))によりこの菌体からプラスミドの沈殿を得た後、風乾させた沈殿を10μLの蒸留水に溶解した。次に、このプラスミドを鋳型とし、T3プライマー(配列番号14)とT7プライマー(配列番号15)を用いたPCR反応を行った。PCR反応にはEx Taq DNA Polymeraseを用い、添付のプロトコールに従った操作を実施して遺伝子を増幅させた。PCR反応の条件は(94℃30秒間、60℃30秒間、72℃1分間)×25サイクルとした。PCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供した結果、すべてのPCR反応液において約0.4kbpのDNA断片を確認した。
 次に、終夜振盪培養した上記の培養液2mLを20,000×gで1分間遠心した後、上清を除去して大腸菌の菌体を得た。その後、Wizard(登録商標) Plus SV Minipreps DNA Purification System(プロメガ社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からプラスミドを得た。次に、このプラスミドが有するDNA断片の塩基配列を解析するため、このプラスミドを鋳型としたシークエンス反応を行った。シークエンス反応にはBigDye(登録商標) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行った。シークエンスの解析は、ABI PRISM(登録商標) 310 Genetic Analyzer(アプライド・バイオシステムズ社製)を用いて実施した。その結果、DNAの塩基配列は配列番号16に示す通りであった。
<実施例4>HG-5epiのポリペプチドをコードするDNAのシークエンス
 HG-5epiのポリペプチドをコードするDNAをシークエンスするため、<実施例3>で得られたDNA断片の5’側および3’側の未知領域について、Inverse PCRによるシークエンスを実施した。
 上記<実施例3>で得たλDNA6μgを制限酵素BamHI(タカラバイオ社製)により限定分解した後、アガロースゲル電気泳動に供し、0.5~4.0kbpの範囲をメスで切り出して回収した。その後、QIAEX II Gel Extraction Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、BamHIで限定分解されたλDNAの断片を得た。次に、DNA Ligation Kit Ver.2.1を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、λDNAの断片をセルフライゲーションさせた。このライゲーション反応液を鋳型とし、配列番号17および配列番号18のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR反応を行った。PCR反応にはEx Taq DNA Polymeraseを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってPCR反応液を調製した。PCR反応の条件は、94℃2分間、(94℃30秒間、50℃30秒間、72℃3分間)×40サイクル、72℃5分間とした。
 さらに、このInverse PCRの反応液を鋳型として、Nested PCRを行った。PCR反応のプライマーには、配列番号19および配列番号20のオリゴヌクレオチドを用いた。PCR反応にはEx Taq DNA Polymeraseを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってPCR反応液を調製した。PCR反応は、(94℃30秒間、50℃30秒間、72℃3分間)×40サイクルの条件で実施した。その結果、約1.8kbpのDNA断片を得た。
 Blunting Kination Ligation Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、DNA断片末端の平滑化と5’末端のリン酸化をした後、Micropure EZ Enzyme Removers(ミリポア社製)を用いてDNA断片を精製した。その後、EcoRVで限定分解した後にCIPで脱リン酸化したpBSとこのDNA断片をライゲーションさせた。
 このライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換した後、LB/Amp寒天培地のプレート上に塗布し、37℃で終夜静置培養してシングルコロニーを得た。このコロニーをLB/Amp培地4mLに植菌して37℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。QIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からプラスミドを得た。次に、このプラスミドが有するDNA断片の塩基配列を解析するため、このプラスミドを鋳型としたシークエンス反応を行った。シークエンス反応にはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行った。シークエンスの解析は、ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて行った。その結果、Nested PCRにより得たDNA断片が、<実施例3>で得られた配列番号16の塩基配列の一部を両端に含むDNAであることを確認した。また、これにより、セルフライゲーションしたλDNAの断片中の、配列番号16の塩基配列を含むcDNAの両末端の塩基配列も決定された。
 次に、当該cDNAの両末端のそれぞれとアニーリングするプライマーを用いたPCRクローニングを実施し、HG-5epiをコードするDNA全長の取得を試みた。すなわち、配列番号21および配列番号22のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、<実施例3>で調製したλDNA0.5μgを鋳型としたPCR反応を行った。PCR反応にはPfuTurbo DNA Polymerase(アジレント・テクノロジー社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってPCR反応液を調製した。PCR反応は、94℃2分間、(94℃30秒間、55℃30秒間、72℃2分間)×40サイクル、72℃5分間の条件で実施した。その結果、約1.1kbpのDNA断片を得た。
 QIAEX II Gel Extraction Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記のDNA断片を精製した。次に、Blunting Kination Ligation Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってDNA断片末端の平滑化と5’末端のリン酸化をした後、再度DNA断片を精製した。その後、EcoRVで限定分解した後にCIPで脱リン酸化したpBSとこのDNA断片をライゲーションさせた。
 このライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換した後、LB/Amp寒天培地に塗布し、37℃で終夜静置培養した。3個のシングルコロニーを、それぞれ4mLのLB/Amp培地に植菌して37℃で終夜振盪培養し、20,000×gで1分間遠心した後、上清を除去して大腸菌の菌体を得た。その後、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systemを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からプラスミドを得た。次に、このプラスミドが有するDNA断片の塩基配列を解析するため、このプラスミドを鋳型としたシークエンス反応を行った。シークエンス反応にはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行った。シークエンスの解析は、ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて実施した。その結果、PCRクローニングにより得たDNAの塩基配列は配列番号23に示す通りであった。
 しかしながら、配列番号23の塩基配列から予想されるHG-5epiのアミノ酸配列を公知のC5-epi(参考例1に記載のもの)のアミノ酸配列と比較したところ、配列番号23の塩基配列は、HG-5epiのN末側をコードする領域を欠く不完全なものであると考えられた。そこで、この配列番号23の塩基配列を含むcDNAの5’側の配列をさらにシークエンスするため、5’RACE法による未知領域DNAの増幅反応を行った。5’RACE反応の鋳型となるcDNAの調製および5’RACE反応は、Marathon(登録商標) cDNA Amplification Kit(クロンテック社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。cDNA合成の材料となるRNAは、<実施例1>において精製したmRNA0.5μgを使用した。プライマーには配列番号24と配列番号25のオリゴヌクレオチドを用いた。Marathon cDNAアダプターを結合させたcDNA希釈液を鋳型とし、PCR反応にはAdvantage(登録商標) 2 Polymerase mix(クロンテック社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってPCR反応液を調製した。PCR反応の条件は、94℃30秒間、(94℃5秒間、72℃4分間)×5サイクル、(94℃5秒間、70℃4分間)×5サイクル、(94℃5秒間、68℃4分間)×25サイクルとした。
 さらに、この5’RACEの反応液を鋳型としてNested PCRを行った。PCR反応のプライマーには配列番号26および配列番号27のオリゴヌクレオチドを用いた。PCR反応にはAdvantage 2 Polymerase mixを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってPCR反応液を調製した。PCR反応の条件は、94℃30秒間、(94℃5秒間、72℃4分間)×5サイクル、(94℃5秒間、70℃4分間)×5サイクル、(94℃5秒間、68℃4分間)×25サイクルとした。その結果、約1.2kbpのDNA断片を得た。
 QIAEX II Gel Extraction Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記のDNA断片を精製した。次に、Blunting Kination Ligation Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってDNA断片末端の平滑化と5’末端のリン酸化をした後、再度DNA断片を精製した。その後、EcoRVで限定分解した後にCIPで脱リン酸化したpBSとこのDNA断片をライゲーションさせた。
 このライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換した後、LB/Amp寒天培地に塗布し、37℃で終夜静置培養した。3個のシングルコロニーを、それぞれ4mLのLB/Amp培地に植菌して37℃で終夜振盪培養し、20,000×gで1分間遠心した後、上清を除去して大腸菌の菌体を得た。その後、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systemを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からプラスミドを得た。次に、このプラスミドが有するDNA断片の塩基配列を解析するため、このプラスミドを鋳型としたシークエンス反応を行った。シークエンス反応にはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行った。シークエンスの解析は、ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて実施した。その結果、5’RACE反応により得たDNAの塩基配列は配列番号28に示す通りであった。
<実施例5>HG-5epiのポリペプチド全長をコードするDNAのクローニング
 上記<実施例4>において得たHG-5epiのDNA断片をライゲーションしたpBSそれぞれについて、同じ制限酵素で限定分解した後にライゲーションし、HG-5epiの全長をコードするDNAをサブクローニングしたベクター(pBS/HG-5epi)を得た。手順を以下に示す。
 配列番号28の塩基配列からなるDNAをライゲーションしたpBSをEcoRI(タカラバイオ社製)とEcoRVで限定分解し、HG-5epiのN末端側をコードするDNAを含む約1.2kbpのDNA断片を得た。QIAEX II Gel Extraction Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、このDNA断片を精製した。
 また、配列番号23の塩基配列からなるDNAをライゲーションしたpBSをEcoRIとEcoRVで限定分解し、HG-5epiのC末端側をコードするDNAとpBSのDNAからなる約3.7kbpのDNA断片を得た。QIAEX II Gel Extraction Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、このDNA断片を精製した。次に、CIPでこのDNA断片を脱リン酸化した後、再度精製した。
 なお、EcoRIはpBSを1ヶ所切断する。また、EcoRVは、配列番号28の塩基配列からなるDNAおよび配列番号23の塩基配列からなるDNAを、その重複する領域において1ヶ所切断する。よって、上記により得た2つのDNA断片をライゲーションすることにより、pBSにサブクローニングされたHG-5epiの全長をコードするDNAが得られる。
 DNA Ligation Kit Ver.2.1を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記により得た2つのDNA断片をライゲーションした。このライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換した後、LB/Amp寒天培地のプレート上に塗布し、37℃で終夜静置培養してシングルコロニーを得た。このコロニーをLB/Amp培地4mLに植菌して37℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。QIAprep Spin Miniprep Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からプラスミドを得た。次に、このプラスミドが有するDNA断片の塩基配列を解析するため、このプラスミドを鋳型としたシークエンス反応を行った。シークエンス反応にはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行った。シークエンスの解析は、ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて実施した。その結果、pBSにサブクローニングしたDNAが配列番号1の塩基配列を含むDNAであることを確認した。
<参考例1>公知のC5-epiとHG-5epiの相同性
 配列番号1の塩基配列からなるDNAがコードするHG-5epiのアミノ酸配列(配列番号2)について、公知のC5-epiのアミノ酸配列との相同性をGENETYX(登録商標) Ver.11(ゼネティックス社製)で解析した結果、ヒト由来(NCBI寄託番号:NP_056369、配列番号3)とは39%、ゼブラフィッシュ由来(NCBI寄託番号:NP_998015、配列番号4)とは39%、線虫由来(NCBI寄託番号:NP_497876、配列番号5)とは30%であった。
<参考例2>HG-5epiの疎水性プロファイル解析
 HG-5epiのアミノ酸配列(配列番号2)の疎水性プロファイル解析を行ったところ、HG-5epiはN末に膜貫通領域を有する可能性が示唆された。そこで、以降のHG-5epiの発現実験には、配列番号1に示す塩基配列の内、N末の膜貫通領域をコードすると予想される部分を除いた、塩基番号100~1806の領域を利用した。
<実施例6>HG-5epiの昆虫細胞発現系用ベクターの作製(1)
 HG-5epiの昆虫細胞発現系用ベクターを得るため、上記<実施例5>で得たpBS/HG-5epiを鋳型としたPCR反応を行った。PCR反応のプライマーには、配列番号29および配列番号30のオリゴヌクレオチドを用いた。PCR反応にはAccuprime Taq DNA Polymerase High Fidelity(インビトロジェン社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってPCR反応液を調製した。PCR反応の条件は、94℃20秒間、(94℃20秒間、58℃20秒間、68℃3分間)×20サイクルとした。その結果、約1.7kbpのDNA断片を得た。
 MinElute Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、上記DNA断片を精製した。このDNA断片を制限酵素EcoRIおよびNotI(タカラバイオ社製)を用いて限定分解した後、再度同様にDNA断片を精製した。発現ベクターであるpFBIF1(後述)についても同じ制限酵素による限定分解と精製を実施した。次に、T4 DNA Ligase(ニュー・イングランド・バイオラボ社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、このDNA断片とpFBIF1をライゲーションさせた。
 このライゲーション反応液を用いて大腸菌DH5α株(東洋紡社製)を形質転換した後、LB/Amp寒天培地のプレート上に塗布し、37℃で終夜静置培養してシングルコロニーを得た。このコロニーをLB/Amp培地4mLに植菌して37℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。QIAprep Spin Miniprep Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からベクターを得た。次に、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いたシークエンス反応を行い、Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer(アプライド・バイオシステムズ社製)を用いてシークエンス解析を行った。その結果、ライゲーションしたDNA断片の塩基配列が、配列番号1の塩基番号100~1806の塩基配列と同じであることを確認した。このようにして、HG-5epiの昆虫細胞発現用ベクター(pFBIF1/HG-5epi)を得た。
 ここにいうpFBIF1とは、マウスIgκ鎖の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列(配列番号31)とFLAGタグのアミノ酸配列(配列番号32)からなるポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号34)をコードするDNAを、pFastBac1(インビトロジェン社製)のマルチクローニングサイトに挿入して作製した昆虫細胞発現用ベクターである。具体的には、pFBIF1は、配列番号33の塩基配列からなるDNAをサブクローニングしたベクターを鋳型とし、配列番号35および配列番号36のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR反応により得られるDNA断片を、制限酵素とT4 DNA Ligaseを用いた上記の方法と同様にして、pFastBac1のBamHIおよびEcoRIを両端とする部位に挿入することで得られたベクターである。
 配列番号33の塩基配列からなるDNAは、例えば、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとそれに相補的なヌクレオチドを合成し、それぞれの5’末端をT4 Polynucleotide Kinaseでリン酸化してから溶液中で混合し、90~100℃で1~2分間加熱した後、室温まで冷却することで調製することができる。よって、このDNAを任意のベクター、例えば、EcoRVで限定分解した後にCIPで脱リン酸化したpBSにサブクローニングすることで、上記PCR反応の鋳型として使用することができる。
 このようにして得られるpFBIF1/HG-5epiは、マウスIgκ鎖の分泌シグナル、FLAGタグ、アスパラギンとセリンからなるジペプチドのリンカー、配列番号2におけるアミノ酸番号34~601で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、が融合されたポリペプチドを発現させるためのベクターである。
<実施例7>HG-5epi発現用バクミドの調製(1)
 続いて、Bac-to-Bac(登録商標)バキュロウイルス発現システム(インビトロジェン社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、pFBIF1/HG-5epiとバクミドの間で遺伝子の組換えを行い、バクミドにマウスIgκ鎖の分泌シグナル、FLAGタグ、アスパラギンとセリンからなるジペプチドのリンカー、配列番号2におけるアミノ酸番号34~601で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの融合ポリペプチドをコードするDNAを挿入した。
 すなわち、pFBIF1/HG-5epiを用いてバクミド調製用の大腸菌であるDH10Bac株(インビトロジェン社製)を形質転換し、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、5-ブロモインドリルβ-D-ガラクトピラノシド(Bluo-gal)、およびイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を含むLB寒天培地のプレート上に塗布し、37℃で終夜静置培養して白色のシングルコロニーを得た。このコロニーをLB培地1.5mLに植菌して37℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。その後、Bac-to-Bacバキュロウイルス発現システムに添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からバクミドを得た。M13 Forward(-40)(配列番号41)とM13 Reverse(配列番号42)をプライマーとしたPCR反応によって増幅されるDNA断片の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認し、バクミドに目的のDNAが全長挿入されたことを確認した。
<実施例8>昆虫細胞を用いたHG-5epiの調製(1)
 上記<実施例7>で得たバクミドを、昆虫細胞Sf21に導入した。すなわち、Grace’s Insect Medium, Unsupplemented(インビトロジェン社製)を2mL用い、35mmシャーレにSf21細胞を8×105個播種し、27℃で1時間インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。細胞がシャーレに接着したことを確認した後、lipid-DNA complexes溶液(後述)を0.2mL添加し、27℃で5時間インキュベートした。その後、シャーレから培地を吸引除去した後にSf900 III培地(インビトロジェン社製)を4mL添加し、27℃で72時間インキュベートした。その後、ピペッティング操作によりプレートから遊離させた細胞と培養液を回収し、5,000×gで5分間遠心した後、上清を一次ウイルス液として回収した。
 ここで、lipid-DNA complexes溶液とは、別々に調製したA溶液(Grace's Insect Medium, Unsupplemented 100μLとバクミド(0.1μg/μL)10μLの混合液)とB溶液(Grace’s Insect Medium, Unsupplemented 100μLとCellfectin(登録商標) II Reagent(インビトロジェン社製) 8μLの混合液)を穏やかによく混合した後、室温で30分間静置した溶液のことを意味する。
 Sf900 III培地を50mL用い、スピナーフラスコ(容量:100mL)にSf21細胞を5×107個播種した培養液に対して一次ウイルス液を全量添加し、27℃で72時間撹拌培養した。その後、培養液を5,000×gで5分間遠心した後、上清を二次ウイルス液として回収した。
 Sf900 III培地を900mL用い、バッフル付きフラスコ(容量:3L)にSf21細胞を1×109個播種した培養液に対して二次ウイルス液を40mL添加し、27℃で72時間振盪培養した。その後、培養液を10,000×gで20分間遠心した後、上清を回収してHG-5epiを含む培養液を得た。
<実施例9>HG-5epiの精製(1)
 上記<実施例8>で得たHG-5epiを含む培養液80mLに対し、10%CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate)を1.6mL加えて穏やかに混合した。この溶液を50mM Tris-HCl(pH7.4)/0.1% CHAPS 10mLを用いて平衡化したHi Trap Heparin HPカラム(GEヘルスケア社製)1mLに流速1mL/minで全量アプライした。続いて、50mM Tris-HCl(pH7.4)/0.1% CHAPSを流速0.2mL/minで4mL通液し、HG-5epiを溶出させた。
 HG-5epiの溶出画分は、抗FLAG抗体であるM2 monoclonal antibody(シグマ・アルドリッチ社製)を用いたWestern Blotting法により確認した。すなわち、上記のカラム精製における溶出画分を、還元条件下におけるSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供し、ゲル内で分離されたタンパク質をセミドライ法によりPVDF膜に転写した。転写後のPVDF膜を5%スキムミルクを含有するTBS-T(20mM Tris-HCl(pH7.4)、500mM NaCl、0.2% TritonX-100、0.05% Tween20)に浸し、室温で1時間振盪させてブロッキングした。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗FLAG抗体(シグマ・アルドリッチ社製)を5%スキムミルクを含有するTBS-Tで2,000倍に希釈した溶液にPVDF膜を浸し、室温で1時間振盪させて抗体染色した。TBS-TでPVDF膜を洗浄し、SuperSignal(登録商標) West Dura(サーモサイエンティフィック社製)に1分間浸した後、発光シグナルをImage Quant LAS4000(GEヘルスケア社製)を用いて検出した。濃度既知の標準試料として同時に電気泳動に供したAmino-terminal FLAG-BAP Fusion Protein(シグマ・アルドリッチ社製)の発光シグナル強度(輝度)との比較からタンパク質濃度を算出した結果、HG-5epiの濃度は0.4μg/μLであった。
 このようにして得られたHG-5epiの溶出画分を、「粗精製組換えHG-5epi」として、以後の実験に供した。
<実施例10>HG-5epiの昆虫細胞発現用ベクターの作製(2)
 HG-5epiの昆虫細胞発現系用ベクターを得るため、上記<実施例5>で得たpBS/HG-5epiを鋳型としたPCR反応を行った。PCR反応のプライマーには、配列番号37および配列番号38のオリゴヌクレオチドを用いた。PCR反応にはAccuprime Taq DNA Polymerase High Fidelityを用い、添付のプロトコールに従った操作を行ってPCR反応液を調製した。PCR反応の条件は、94℃20秒間、(94℃20秒間、62℃20秒間、68℃4分間)×18サイクルとした。TOPO(登録商標) TA Cloning(登録商標) Kit(インビトロジェン社製)を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、pCR(登録商標)2.1-TOPOに増幅したDNA断片を挿入したベクターを得た。
 このベクターを用いて大腸菌DH5α株を形質転換した後、LB/Amp寒天培地のプレート上に塗布し、37℃で終夜静置培養してシングルコロニーを得た。このコロニーをLB/Amp培地2mLに植菌して37℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。QIAprep Spin Miniprep Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からベクターを得た。このベクターを制限酵素SalI(タカラバイオ社製)およびKpnI(タカラバイオ社製)を用いて限定分解した後、MinElute Gel Extraction Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、DNA断片(約1.7kbp)を精製して得た。発現ベクターであるpFBIF2(後述)についても同じ制限酵素による限定分解と精製を実施した。次に、T4 DNA Ligaseを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、このDNA断片とpFBIF2をライゲーションさせた。
 このライゲーション反応液を用いて大腸菌TOP10株(インビトロジェン社製)を形質転換した後、LB/Amp寒天培地のプレート上に塗布し、37℃で終夜静置培養してシングルコロニーを得た。このコロニーをLB/Amp培地4mLに植菌して37℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。QIAprep Spin Miniprep Kitを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からベクターを得た。次に、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いたシークエンス反応を行い、Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzerを用いてシークエンス解析を行った。その結果、ライゲーションしたDNA断片の塩基配列が、配列番号1の塩基番号100~1806の塩基配列と同じであることを確認した。このようにして、HG-5epiの昆虫細胞発現用ベクター(pFBIF2/HG-5epi)を得た。
 ここにいうpFBIF2とは、マウスIgκ鎖の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列(配列番号31)とFLAGタグのアミノ酸配列(配列番号32)からなるポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号34)をコードするDNAを、pFastBac1のマルチクローニングサイトに挿入して作製した昆虫細胞発現用ベクターである。具体的には、pFBIF2は、配列番号33の塩基配列からなるDNAをサブクローニングしたベクターを鋳型とし、配列番号39および配列番号40のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR反応により得られるDNA断片を、制限酵素とT4 DNA Ligaseを用いた上記の方法と同様にして、pFastBac1のEcoRIおよびSalIを両端とする部位に挿入することで得られたベクターである。
 このようにして得られるpFBIF2/HG-5epiは、マウスIgκ鎖の分泌シグナル、FLAGタグ、バリンとアスパラギン酸からなるジペプチドのリンカー、配列番号2におけるアミノ酸番号34~601で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、が融合されたポリペプチドを発現させるためのベクターである。
<実施例11>HG-5epi発現用バクミドの調製(2)
 続いて、Bac-to-Bacバキュロウイルス発現システムを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、pFBIF2/HG-5epiとバクミドの間で遺伝子の組換えを行い、バクミドにマウスIgκ鎖の分泌シグナル、FLAGタグ、バリンとアスパラギン酸からなるジペプチドのリンカー、配列番号2におけるアミノ酸番号34~601で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの融合ポリペプチドをコードするDNAを挿入した。
 すなわち、pFBIF2/HG-5epiを用いてバクミド調製用の大腸菌であるDH10Bac株を形質転換し、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、5-ブロモインドリルβ-D-ガラクトピラノシド(Bluo-gal)、およびイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を含むLB寒天培地のプレート上に塗布し、37℃で終夜静置培養して白色のシングルコロニーを得た。このコロニーをLB培地1.5mLに植菌して37℃で終夜振盪培養し、大腸菌の菌体を得た。その後、Bac-to-Bacバキュロウイルス発現システムに添付のプロトコールに従った操作を行って、この菌体からバクミドを得た。M13 Forward(-40)(配列番号41)とM13 Reverse(配列番号42)をプライマーとしたPCR反応によって増幅されるDNA断片の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認し、バクミドに目的のDNAが全長挿入されたことを確認した。
<実施例12>昆虫細胞を用いたHG-5epiの調製(2)
 上記<実施例11>で得たバクミドを、昆虫細胞Sf21に導入した。すなわち、Grace’s Insect Medium, Unsupplementedを2mL用い、35mmシャーレにSf21細胞を8×105個播種し、27℃で1時間インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。細胞がシャーレに接着したことを確認した後、lipid-DNA complexes溶液(後述)を0.2mL添加し、27℃で5時間インキュベートした。その後、シャーレから培地を吸引除去した後にSf900 III培地を4mL添加し、27℃で72時間インキュベートした。その後、ピペッティング操作によりプレートから遊離させた細胞と培養液を一次ウイルス液として回収した。
 ここで、lipid-DNA complexes溶液とは、別々に調製したA溶液(Grace's Insect Medium, Unsupplemented 100μLとバクミド(0.1μg/μL)10μLの混合液)とB溶液(Grace’s Insect Medium, Unsupplemented 100μLとCellfectin II Reagent 8μLの混合液)を穏やかによく混合した後、室温で30分間静置した溶液のことを意味する。
 Sf900 III培地を100mL用い、スピナーフラスコ(容量:200mL)にSf21細胞を1×10個播種した培養液に対して一次ウイルス液を全量添加し、27℃で72時間撹拌培養した。その後、培養液を二次ウイルス液として回収した。
 Sf900 III培地を1.8L用い、バッフル付きフラスコ(容量:3L)にSf21細胞を2×109個播種した培養液に対して二次ウイルス液を全量添加し、27℃で96時間振盪培養した。その後、培養液を10,000×gで20分間遠心した後、上清を回収してHG-5epiを含む培養液を得た。
<実施例13>HG-5epiの精製(2)
 上記<実施例12>で得たHG-5epiを含む培養液400mLに対し、10% CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate)を8mL加えて穏やかに混合した。この溶液を蒸留水50mLを用いて平衡化したHi Trap Heparin HPカラム 5mLに流速2mL/minで全量アプライした。続いて、20mM Tris-HCl(pH7.4)/0.1% CHAPSを流速1mL/minで22mL通液し、HG-5epiを溶出させて分画回収した。HG-5epiを含む画分を合一し、20mM Tris-HCl(pH7.4)/0.1% CHAPS 10mLを用いて平衡化したANTI-FLAG(登録商標) M2 Affinity Gelカラム(シグマ・アルドリッチ社製)1mLに流速0.2mL/minで全量アプライした。続いて、20mM Tris-HCl(pH7.4)/0.1% CHAPS/0.5M NaClを流速0.2mL/minで10mL通液してカラムを洗浄した後、0.4mg/mLのFLAGペプチドを含む20mM Tris-HCl(pH7.4)/0.1% CHAPS/150mM NaClを流速0.2mL/minで6mL通液し、HG-5epiを溶出させて分画回収した。HG-5epiを含む画分を合一し、Slide-A-Lyzer 7.0K MWCO Dialysis Cassette(サーモサイエンティフィック社製)に全量を移し、20mM Tris-HCl(pH7.4)/0.1% CHAPS/150mM NaClを用いて透析した。
 それぞれの精製工程において、HG-5epiの溶出画分は、抗FLAG抗体であるM2 monoclonal antibodyを用いたWestern Blotting法により確認した。すなわち、上記のカラム精製における溶出画分を、還元条件下におけるSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供し、ゲル内で分離されたタンパク質をセミドライ法によりPVDF膜に転写した。転写後のPVDF膜を5%スキムミルクを含有するTBS-T(20mM Tris-HCl(pH7.4)、500mM NaCl、0.2% TritonX-100、0.05% Tween20)に浸し、室温で1時間振盪させてブロッキングした。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗FLAG抗体を5%スキムミルクを含有するTBS-Tで2,000倍に希釈した溶液にPVDF膜を浸し、室温で1時間振盪させて抗体染色した。TBS-TでPVDF膜を洗浄し、SuperSignal West Duraに1分間浸した後、発光シグナルをImage Quant LAS4000を用いて検出した。濃度既知の標準試料として同時に電気泳動に供したAmino-terminal FLAG-BAP Fusion Proteinの発光シグナル強度(輝度)との比較からタンパク質濃度を算出した結果、HG-5epiの濃度は0.5μg/μLであった。
 また、上記のカラム精製によって得られたHG-5epiの溶出画分は、図1に示す通り、還元条件下におけるSDS-PAGEに供したゲルをCBB染色した際に、分子量スタンダード(Precision plus protein unstained standards;バイオラッド社製)と比較して約75kDaの単一バンドのみが認められる画分であった。
 このようにして得られたHG-5epiの溶出画分を、「組換えHG-5epi」として、以後の実験に供した。
<参考例3>HPLCポストカラムラベル法によるIdoA含量の測定方法
 IdoA含量の測定は、図2にフローダイアグラムを示したHPLCポストカラムラベル法により行った。蛍光光度計による検出のために糖を標識する試薬(ラベル化試薬)には2-シアノアセトアミドを用いた。分析カラムには、ガードカラムとしてCarboPac PA1(内径:4mm×長さ:50mm)(日本ダイオネクス社製)を、分離カラムとしてCarboPac PA1(内径:4mm×長さ:250mm)(日本ダイオネクス社製)を用い、両者を直列に接続したカラムを使用した。また、カラム温度は室温とした。
 溶離液を送液するHPLCシステムは、Alliance2695(ウォーターズ社製)を用いた。移動相には、溶媒A(蒸留水)および溶媒B(0.1M 酢酸ナトリウム)を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、分析開始から2分後までは溶媒Bの割合を0%とし、2分後から5分後までの間に溶媒Bの割合を0%から5%に、5分後から65分後までの間に溶媒Bの割合を5%から10%に変化させた。流速は0.8mL/minとした。
 ラベル化試薬を送液するHPLCポンプは、600E(ウォーターズ社製)を用いた。移動相には、溶媒C(0.5% 2-シアノアセトアミド)および溶媒D(0.25M NaOH)を用いた。送液はアイソクラティックで行い、溶媒Cと溶媒Dをオンラインで1:1の割合で混合させた溶液を送液した。流速は0.6mL/minとした。
 上記の条件に従ってカラムを通液させた溶離液とラベル化試薬を3方ジョイントを通じて合流させた後、反応コイル(内径:0.5mm×長さ:10m)、冷却コイル(内径:0.25mm×長さ:3m)、蛍光検出器の順に通液させた。カラムから溶出された糖を2-シアノアセトアミドで標識するため、反応コイルはDry Reaction Bath DB-5(シマムラテック社製)を用いて125℃に加熱した。反応コイルで加熱された溶液を冷却するため、冷却コイルは室温の蒸留水に浸した状態で使用した。蛍光検出器には2475(ウォーターズ社製)を用い、励起波長を346nmおよび蛍光波長を410nmに設定した。
 NAHまたはCDSNAc-HEPをN-脱アセチル化および亜硝酸分解し、HPLCポストカラムラベル法に供して得られたクロマトグラムを図3に示す。N-脱アセチル化および亜硝酸分解は、後述の<実施例14>、<実施例16>、または<実施例17>に記載した方法に従って実施した。N-脱アセチル化および亜硝酸分解して得られる二糖は、NAHの場合はGlcAとaManからなる二糖(GlcA-aMan)のみであり、CDSNAc-HEPの場合はIdoAとaManからなる二糖(IdoA-aMan)とGlcA-aManの2種類である。よって、両クロマトグラムの比較から、GlcA-aManとIdoA-aManを分離して検出できたことが分かる。
 また、GlcA-aManとIdoA-aManの標準品をそれぞれHPLCポストカラムラベル法に供して得られたピーク面積を比較した結果、ピーク面積あたりの物質量はIdoA-aManがGlcA-aManの1.3倍であることが分かった。よって、IdoA含量は、下記の数式にGlcA-aManとIdoA-aManのピーク面積を代入して算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
 ここで用いたGlcA-aManの標準品は、後述する<参考例4>により得たものである。また、ここで用いたIdoA-aManの標準品は、後述する<参考例5>により得たものである。
<参考例4>GlcA-aMan標準品の調製
 NAHの乾燥粉末20mgをヒドラジン試薬(ヒドラジン硫酸40mgをヒドラジン一水和物1mLに溶解した溶液)4mLに溶解し、ヒートブロックを用いて96℃で5時間インキュベートした。この溶液に蒸留水4mLを加えて希釈した後、Slide-A-Lyzer 2.0K MWCO Dialysis Cassetteに全量を移し、蒸留水中で終夜透析して脱塩した。その後、この溶液を凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。この乾燥粉末を3mLの33%酢酸に溶解し、3mLの5%亜硝酸ナトリウム水溶液を加えて混合した後、室温に90分間静置した。この溶液に3mLの12.5%スルファミン酸アンモニウム水溶液を加えて混合した後、室温に30分間静置した。このようにして、GlcA-aManを含有する溶液を得た。
 遠心エバポレーターを用いてこの溶液を1mLに濃縮し、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムには、Bio-Gel P-4 Gel(バイオラッド社製)を充填したカラム(内径:2cm×長さ:120cm)を使用した。また、カラム温度は4℃とした。移動相には0.1M酢酸アンモニウムを用い、流速は0.15mL/minとした。溶出液を4.3mLずつ分画し、カルバゾール硫酸法(BITTER T, MUIR HM., Anal Biochem. 1962 Oct; 4: 330-4.)によって、GlcA-aManの溶出画分を確認した。GlcA-aManの溶出画分を合一し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 この乾燥粉末を0.2mLの蒸留水に溶解し、全量を2回に分けてCarboPac PA1(内径:9mm×長さ:250mm)(日本ダイオネクス社製)に供して精製した。移動相には、溶媒A(蒸留水)および溶媒B(0.1M 酢酸ナトリウム)を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、0~5分後までは溶媒Bの割合を0%とし、5~12分後までは溶媒Bの割合を0%から5%に、12~162分後までは溶媒Bの割合を5%から10%に変化させた。流速は1.6mL/minとした。溶出液を0.8mLずつ分画し、各画分をHPLCポストカラムラベル法に供して、GlcA-aManの溶出画分を確認した。GlcA-aManの溶出画分を合一し、カルバゾール硫酸法によってモル濃度を定量した。
 以上によって、256μMのGlcA-aMan標準品の溶液3.2mLを得た。
<参考例5>IdoA-aMan標準品の調製
 CDSNS-HEPの乾燥粉末40mgを蒸留水0.4mLに溶解し、3.6mLの亜硝酸-硫酸溶液(2mLの氷冷した0.5M亜硝酸バリウムに2mLの0.5M硫酸を加えて混合した後、20,000×gで1分間遠心して得られた上清)を加えて混合した後、室温に20分間静置した。このようにして、IdoA-aManを含有する溶液を得た。
 この溶液に1.1mLの1M炭酸ナトリウムを加えて混合した後、遠心エバポレーターを用いて1mLに濃縮し、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムには、Bio-Gel P-4 Gelを充填したカラム(内径:2cm×長さ:120cm)を使用した。また、カラム温度は4℃とした。移動相には0.1M酢酸アンモニウムを用い、流速は0.24mL/minとした。溶出液を4mLずつ分画し、カルバゾール硫酸法によって、IdoA-aManの溶出画分を確認した。IdoA-aManの溶出画分を合一し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 この乾燥粉末を0.2mLの蒸留水に溶解し、全量を3回に分けてCarboPac PA1(内径:9mm×長さ:250mm)に供して精製した。移動相には、溶媒A(蒸留水)および溶媒B(0.1M 酢酸ナトリウム)を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、0~5分後までは溶媒Bの割合を0%とし、5~12分後までは溶媒Bの割合を0%から5%に、12~162分後までは溶媒Bの割合を5%から10%に変化させた。流速は1.6mL/minとした。溶出液を0.8mLずつ分画し、各画分をHPLCポストカラムラベル法に供して、IdoA-aManの溶出画分を確認した。IdoA-aManの溶出画分を合一し、カルバゾール硫酸法によってモル濃度を定量した。
 以上によって、362μMのIdoA-aMan標準品の溶液8mLを得た。
<実施例14>NAHを基質とした粗精製HG-5epiの活性測定
 上記<実施例9>で得た粗精製組換えHG-5epiを5μL(2μg)用い、全量50μLの反応液を調製して、30℃の水浴中で17時間インキュベートした。反応液は、終濃度で50mM PIPES-NaOH(pH7.0)、0.1% CHAPS、10mg/mL NAH、の組成となるように調製した。その後、1.3%酢酸カリウム含有エタノールを117μL加えて混合した後、20,000×gで5分間遠心して多糖を沈殿させた。上清を除去し、沈殿を蒸留水100μLに溶解した。さらに、1.3%酢酸カリウム含有エタノールを234μL加えて混合した後、20,000×gで5分間遠心して多糖を再度沈殿させた。上清を除去して風乾させた後、沈殿を蒸留水60μLに溶解し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 この乾燥粉末をヒドラジン試薬(ヒドラジン硫酸40mgをヒドラジン一水和物1mLに溶解した溶液)0.12mLに溶解し、ヒートブロックを用いて96℃で5時間インキュベートした。蒸留水0.2mLを加えて希釈した後、Slide-A-Lyzer 2.0K MWCO Dialysis Cassetteに全量を移し、蒸留水中で終夜透析して脱塩した。その後、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 この乾燥粉末を80μLの33%酢酸に溶解し、80μLの5%亜硝酸ナトリウム水溶液を加えて混合した後、室温に80分間静置した。その後、80μLの12.5%スルファミン酸アンモニウム水溶液を加えて混合した後、室温に30分間静置した。遠心エバポレーターを用いて乾燥させた後、蒸留水50μLに溶解し、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムは、Superdex Peptide 10/300GL(GEヘルスケア社製)2本を直列に接続して使用した。また、カラム温度は室温とした。移動相には0.1M酢酸アンモニウムを用い、流速は0.6mL/minとした。溶出物の検出には分光検出器を用い、紫外波長を200nmに設定した。二糖(GlcA-aManまたはIdoA-aMan)が含まれるピークの画分を分取し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 続いて、上記<参考例3>に記載した方法に従って、分取した試料を分析に供した。具体的には、この乾燥粉末を300μLの蒸留水に溶解した溶液を分析試料とし、50μLをHPLCポストカラムラベル法に供した。その結果を図4に示す。図4のクロマトグラムに示した通り、IdoA-aManのピークを確認できたため、HG-5epiがNAHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する酵素であることが分かった。また、GlcA-aManとIdoA-aManのピーク面積比(GlcA-aManのピーク面積:IdoA-aManのピーク面積)は72.7:27.3であった。よって、上記の数式1により、IdoA含量は32.8%と算出された。
<実施例15>NSHを基質とした粗精製HG-5epiの活性測定
 上記<実施例9>で得た粗精製組換えHG-5epiを20μL(8μg)用い、全量50μLの反応液を調製して、30℃の水浴中で17時間インキュベートした。反応液は、終濃度で50mM PIPES-NaOH(pH7.0)、0.1% CHAPS、5mg/mL NSH、の組成となるように調製した。その後、1.3%酢酸カリウム含有エタノールを117μL加えて混合した後、20,000×gで5分間遠心して多糖を沈殿させた。上清を除去し、沈殿を蒸留水100μLに溶解した。さらに、1.3%酢酸カリウム含有エタノールを234μL加えて混合した後、20,000×gで5分間遠心して多糖を再度沈殿させた。上清を除去して沈殿を風乾させた後、蒸留水10μLに溶解した。
 この溶液に40μLの亜硝酸-硫酸溶液(0.5mLの氷冷した0.5M亜硝酸バリウムに0.5mLの0.5M硫酸を加えて混合した後、20,000×gで1分間遠心して得られた上清)を加えて混合した後、室温に15分間静置した。12μLの1M炭酸ナトリウムを加えて混合した後、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムは、Superdex Peptide 10/300GL(GEヘルスケア社製)2本を直列に接続して使用した。また、カラム温度は室温とした。移動相には0.1M酢酸アンモニウムを用い、流速は0.6mL/minとした。溶出物の検出には分光検出器を用い、紫外波長を200nmに設定した。二糖(GlcA-aManまたはIdoA-aMan)が含まれるピークの画分を分取し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 続いて、上記<参考例3>に記載した方法に従って、分取した試料を分析に供した。具体的には、この乾燥粉末を300μLの蒸留水に溶解した溶液を分析試料とし、50μLをHPLCポストカラムラベル法に供した。その結果を図5に示す。図5のクロマトグラムに示した通り、IdoA-aManのピークは検出されなかったため、HG-5epiがNSHのGlcA残基をIdoA残基に実質的に異性化しない酵素であることが分かった。
<実施例16>NAHを基質としたHG-5epiの活性測定
 上記<実施例13>で得た組換えHG-5epiを10μL(5μg)用い、全量50μLの反応液を調製して、30℃の水浴中で12時間インキュベートした。反応液は、終濃度で50mM BisTris-NaOH(pH6.0)、5mg/mL NAH、の組成となるように調製した。その後、1.3%酢酸カリウム含有エタノールを117μL加えて混合した後、20,000×gで5分間遠心して多糖を沈殿させた。上清を除去し、沈殿を蒸留水100μLに溶解した。さらに、1.3%酢酸カリウム含有エタノールを234μL加えて混合した後、20,000×gで5分間遠心して多糖を再度沈殿させた。上清を除去して風乾させた後、沈殿を蒸留水60μLに溶解し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 この乾燥粉末をヒドラジン試薬(ヒドラジン硫酸40mgをヒドラジン一水和物1mLに溶解した溶液)0.12mLに溶解し、ヒートブロックを用いて96℃で5時間インキュベートした。蒸留水0.2mLを加えて希釈した後、Slide-A-Lyzer 2.0K MWCO Dialysis Cassetteに全量を移し、蒸留水中で終夜透析して脱塩した。その後、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 この乾燥粉末を100μLの33%酢酸に溶解し、100μLの5%亜硝酸ナトリウム水溶液を加えて混合した後、室温に80分間静置した。その後、100μLの12.5%スルファミン酸アンモニウム水溶液を加えて混合した後、室温に30分間静置した。遠心エバポレーターを用いて乾燥させた後、蒸留水50μLに溶解し、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムは、Superdex Peptide 10/300GL(GEヘルスケア社製)2本を直列に接続して使用した。また、カラム温度は室温とした。移動相には0.1M酢酸アンモニウムを用い、流速は0.6mL/minとした。溶出物の検出には分光検出器を用い、紫外波長を200nmに設定した。二糖(GlcA-aManまたはIdoA-aMan)の溶出画分をカルバゾール硫酸法によって確認して分取し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 続いて、上記<参考例3>に記載した方法に従って、分取した試料を分析に供した。具体的には、この乾燥粉末を250μLの蒸留水に溶解した溶液を分析試料とし、50μLをHPLCポストカラムラベル法に供した。その結果を図6に示す。図6のクロマトグラムに示した通り、IdoA-aManのピークを確認できたため、HG-5epiがNAHのGlcA残基をIdoA残基に異性化する酵素であることが分かった。また、GlcA-aManとIdoA-aManのピーク面積比(GlcA-aManのピーク面積:IdoA-aManのピーク面積)は73.1:26.9であった。よって、上記の数式1により、IdoA含量は32.4%と算出された。
<実施例17>CDSNAc-HEPを基質としたHG-5epiの活性測定
 上記<実施例13>で得た組換えHG-5epiを2~16μL(1.0~8.0μg)用いて全量100μLの反応液を調製し、30℃のヒートブロックに静置して6時間インキュベートした。反応液は、終濃度で50mM BisTris-NaOH(pH6.0)、0.1% CHAPS、5mg/mL CDSNAc-HEP、の組成となるように調製した。その後、1.3%酢酸カリウム含有エタノールを234μL加えて混合した後、20,000×gで5分間遠心して多糖を沈殿させた。上清を除去し、沈殿を蒸留水100μLに溶解した。さらに、1.3%酢酸カリウム含有エタノールを234μL加えて混合した後、20,000×gで5分間遠心して多糖を再度沈殿させた。上清を除去して風乾させた後、沈殿を蒸留水200μLに溶解し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 この乾燥粉末をヒドラジン試薬(ヒドラジン硫酸40mgをヒドラジン一水和物1mLに溶解した溶液)0.3mLに溶解し、ヒートブロックを用いて96℃で7時間インキュベートした。蒸留水0.2mLを加えて希釈した後、Slide-A-Lyzer 2.0K MWCO Dialysis Cassetteに全量を移し、蒸留水を用いて透析した。その後、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 この乾燥粉末を200μLの33%酢酸に溶解し、200μLの5%亜硝酸ナトリウム水溶液を加えて混合した後、室温に90分間静置した。その後、200μLの12.5%スルファミン酸アンモニウム水溶液を加えて混合した後、室温に30分間静置した。遠心エバポレーターを用いて100μLに濃縮し、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムは、Superdex Peptide 10/300GL(GEヘルスケア社製)2本を直列に接続して使用した。また、カラム温度は室温とした。移動相には0.1M酢酸アンモニウムを用い、流速は0.6mL/minとした。溶出物の検出には分光検出器を用い、紫外波長を200nmに設定した。二糖(GlcA-aManまたはIdoA-aMan)が含まれるピークの画分を分取し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 続いて、上記<参考例3>に記載した方法に従って、分取した試料を分析に供した。具体的には、この乾燥粉末を300μLの蒸留水に溶解した溶液を分析試料とし、50μLをHPLCポストカラムラベル法に供した。その結果を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 表1に示した通り、HG-5epiの添加量に依存してIdoA含量が減少する傾向が認められたため、HG-5epiがCDSNAc-HEPのIdoA残基をGlcA残基に異性化する酵素であることが分かった。
<実施例18>CDSNS-HEPを基質としたHG-5epiの活性測定
 上記<実施例13>で得た組換えHG-5epiを5μL(2.5μg)用い、全量50μLの反応液を調製して、30℃の水浴中で17時間インキュベートした。反応液は、終濃度で50mM PIPES-NaOH(pH7.0)、0.1% CHAPS、5mg/mL CDSNS-HEP、の組成となるように調製した。その後、1.3%酢酸カリウム含有エタノールを117μL加えて混合した後、20,000×gで5分間遠心して多糖を沈殿させた。上清を除去し、沈殿を蒸留水100μLに溶解した。さらに、1.3%酢酸カリウム含有エタノールを234μL加えて混合した後、20,000×gで5分間遠心して多糖を再度沈殿させた。上清を除去して沈殿を風乾させた後、蒸留水10μLに溶解した。
 この溶液に40μLの亜硝酸-硫酸溶液(0.5mLの氷冷した0.5M亜硝酸バリウムに0.5mLの0.5M硫酸を加えて混合した後、20,000×gで1分間遠心して得られた上清)を加えて混合した後、室温に15分間静置した。12μLの1M炭酸ナトリウムを加えて混合した後、全量をゲルろ過カラムに供して脱塩した。ゲルろ過カラムは、Superdex Peptide 10/300GL(GEヘルスケア社製)2本を直列に接続して使用した。また、カラム温度は室温とした。移動相には0.1M酢酸アンモニウムを用い、流速は0.6mL/minとした。溶出物の検出には分光検出器を用い、紫外波長を200nmに設定した。二糖(GlcA-aManまたはIdoA-aMan)の溶出画分をカルバゾール硫酸法によって確認して分取し、凍結乾燥に供して乾燥粉末にした。
 続いて、上記<参考例3>に記載した方法に従って、分取した試料を分析に供した。具体的には、この乾燥粉末を300μLの蒸留水に溶解した溶液を分析試料とし、50μLをHPLCポストカラムラベル法に供した。その結果を表2に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 表2に示した通り、反応前後におけるIdoA含量が実質的に変化しなかったため、HG-5epiがCDSNS-HEPのIdoA残基をGlcA残基に実質的に異性化しない酵素であること、および、CDSNS-HEPのGlcA残基をIdoA残基に実質的に異性化しない酵素であること、が分かった。
<実施例19>[5-H]NAHの調製
 放射性同位体を用いたHG-5epi活性の測定における基質として用いるため、HexA残基の5位の水素原子をH(トリチウム)で置換したNAH(以下、「[5-H]NAH」と言う。)を調製した。手順を以下に示す。
 上記<実施例9>で得た粗精製組換えHG-5epiを0.2mL(0.08mg)用い、全量2.7mLの反応液を調製して、30℃のヒートブロックで24時間インキュベートした。反応液は、0.5M PIPES-NaOH(pH7.0) 0.25mL、10% CHAPS 0.025mL、50mg/mL NAH 1mL、の混合液を凍結乾燥した後、凍結乾燥物を2.5mLのO(トリチウム水)に再溶解して得た溶液に対し、組換えHG-5epiを0.2mL混合して調製した。その後、ヒートブロックを用いて95℃で5分間インキュベートし、酵素を失活させた。
 この溶液を20mM PIPES-NaOH(pH 7.0)/0.1% CHAPS 100mLを用いて平衡化したQ Sepharose HPカラム(GEヘルスケア社製)20mLに流速2mL/minで全量アプライした。続いて、20mM PIPES-NaOH(pH7.0)/0.1% CHAPS/0.1M NaClを66mL通液してカラムを洗浄した後、20mM PIPES-NaOH(pH7.0)/0.1% CHAPS/0.5M NaClを34mL通液し、[5-H]NAHを溶出させて分画回収した。
 [5-H]NAHの溶出画分は、液体シンチレーションカウンター(Tri-Carb 3110TR;パーキンエルマー社製)を用いた測定により確認した。[5-H]NAHを含む画分を合一し、Slide-A-Lyzer 2.0K MWCO Dialysis Cassetteに全量を移し、蒸留水を用いた透析により脱塩した。この溶液を凍結乾燥に供して乾燥粉末にした後、蒸留水1.6mLに再溶解した。
 上記の酵素反応から[5-H]NAHの回収に至るまでの操作は2回行い、得られた画分を合一した。以上によって、6.3KBq/mLの[5-H]NAHの溶液を3.0mL得た。
<実施例20>放射性同位体を用いたHG-5epiの活性測定(1)
 放射性同位体を用いたHG-5epi活性の測定方法は、基質として[5-H]NAHを用い、HG-5epi活性によって[5-H]NAH中のHexA残基が異性化された際に生じるOの放射活性を測定してHG-5epi活性を定量する方法である。手順を以下に示す。
 上記<実施例13>で得た組換えHG-5epiを0.3~10μL(0.15~5μg)用い、全量50μLの反応液を調製して、30℃の水浴中で4時間インキュベートした。反応液は、終濃度で50mM PIPES-NaOH(pH7.0)、0.1% CHAPS、100kdpm/mL [5-H]NAH、の組成となるように調製した。反応終了後、この溶液から[5-H]NAHを除去するため、蒸留水を用いて平衡化したQ Sepharose HP 0.16mLを充填したスピンカラムに全量をアプライし、2,000×gで20秒間遠心した。次に、0.1mLの蒸留水をスピンカラムにアプライし、2,000×gで20秒間遠心する操作を2回繰り返した。スピンカラムから溶出された溶液を全量回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて溶液中のH濃度(dpm)を測定した。その結果を表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 表3に示した通り、組換えHG-5epiの混合量(HG-5epi活性の量)と測定値(dpm)が正に相関したため、本実施例に記載の方法によってHG-5epi活性を定量できることが分かった。また、組換えHG-5epiの混合量を適宜設定することで、所望のIdoA含量からなる多糖を得られることが分かった。
<実施例21>放射性同位体を用いたHG-5epiの活性測定(2)
 上記<実施例13>で得た組換えHG-5epiを0.21~5μL(0.110~2.630μg)用い、全量50μLの反応液を調製して、30℃の水浴中で2~48時間インキュベートした。反応液は、終濃度で50mM Bis-Tris-HCl(pH6.0)、180kdpm/mL [5-H]NAH、の組成となるように調製した。その後、0.1M Trisを0.1mL混合して酵素反応を停止させた。この溶液から[5-H]NAHを除去するため、蒸留水を用いて平衡化したQ Sepharose HP 0.16mLを充填したスピンカラムに全量をアプライし、2,000×gで20秒間遠心した。次に、0.1mLの0.1M Trisをスピンカラムにアプライし、2,000×gで20秒間遠心する操作を2回繰り返した。スピンカラムから溶出された溶液を全量回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて溶液中のH濃度(dpm)を測定した。その結果を表4に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 表4に示した値(dpm/μg)は、H濃度の測定値(dpm)からブランクの値を減算した後、混合したHG-5epiの量(μg)で除して算出した値である。表4に示した通り、反応時間と単位酵素量あたりの測定値(dpm/μg)は正に相関したため、[5-H]NAHを用いるHG-5epiの活性測定においては、測定値(dpm)はHG-5epiの混合量(HG-5epi活性の量)と反応時間の積に対して正に相関することが分かった。よって、反応時間と測定値は正に相関し、H濃度(dpm)の経時変化を測定することによってHG-5epi活性を定量できることが分かった。また、反応時間を適宜設定することで、所望のIdoA含量からなる多糖を得られることが分かった。
<実施例22>HG-5epi活性の至適pHの検討
 HG-5epi活性の至適pHを検討するため、pH4.5~pH7.5の水溶液中で酵素反応を行い、HG-5epi活性を測定した。
 上記<実施例13>で得た組換えHG-5epiを5μL(2.5μg)用い、全量50μLの反応液を調製して、30℃の水浴中で2時間インキュベートした。反応液は、終濃度で50mM McIlvaine Buffer(pH4.5~7.5)、0.1% CHAPS、180kdpm/mL [5-H]NAH、の組成となるように調製した。その後、0.1M Trisを0.1mL混合して酵素反応を停止させた。この溶液から[5-H]NAHを除去するため、蒸留水を用いて平衡化したQ Sepharose HP 0.16mLを充填したスピンカラムに全量をアプライし、2,000×gで20秒間遠心した。次に、0.1mLの0.1M Trisをスピンカラムにアプライし、2,000×gで20秒間遠心する操作を2回繰り返した。スピンカラムから溶出された溶液を全量回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて溶液中のH濃度(dpm)を測定した。その結果を表5に示す。なお、表5に記載した測定値(dpm)は、pH7.0におけるブランクの値、すなわち、組換えHG-5epiの代わりに等量の水を加えて上記と同じ操作を行って得た溶液の測定値、を減算した後の値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 表5に示した通り、HG-5epi活性はpH5.5で最大となり、pH6.0においても同等の活性を示した。よって、HG-5epiは至適pHがpH5.5~6.0の酵素であることが分かった。
<実施例23>塩がHG-5epi活性に与える影響の検討
 塩がHG-5epi活性に与える影響を評価するため、塩化ナトリウム(NaCl)、塩化マグネシウム(MgCl)、塩化カルシウム(CaCl)、または塩化マンガン(MnCl)、を終濃度で1~64mMとなるように混合して酵素反応を行い、HG-5epi活性を測定した。
 上記<実施例13>で得た組換えHG-5epiを2μL(1μg)用い、全量50μLの反応液を調製して、30℃の水浴中で5時間インキュベートした。反応液は、所望の終濃度となるように塩を添加することの他、終濃度で50mM Bis-Tris-HCl Buffer(pH6.0)、180kdpm/mL [5-H]NAH、の組成となるように調製した。その後、0.1M Trisを0.1mL混合して酵素反応を停止させた。この溶液から[5-H]NAHを除去するため、蒸留水を用いて平衡化したQ Sepharose HP 0.16mLを充填したスピンカラムに全量をアプライし、2,000×gで20秒間遠心した。次に、0.1mLの0.1M Trisをスピンカラムにアプライし、2,000×gで20秒間遠心する操作を2回繰り返した。スピンカラムから溶出された溶液を全量回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて溶液中のH濃度(dpm)を測定した。その結果を表6に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 表6に示した通り、HG-5epi活性はNaCl、MgCl、CaCl、またはMnClの濃度に依存して阻害されることが分かった。特に、64mM CaClの存在下では、測定値がブランク値(30dpm)の3倍以下であったため、HG-5epi活性が実質的に失われることが分かった。
<実施例24>界面活性剤がHG-5epi活性に与える影響の検討
 界面活性剤がHG-5epi活性に与える影響を評価するため、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸(CHAPS)、デオキシコール酸ナトリウム、n-オクチル-β-D-グルコシド、またはTriton X-100、を終濃度で0.01~0.3%(w/v)となるように混合して酵素反応を行い、HG-5epi活性を測定した。
 上記<実施例13>で得た組換えHG-5epiを2μL(1μg)用い、全量50μLの反応液を調製して、30℃の水浴中で5時間インキュベートした。反応液は、所望の終濃度となるように界面活性剤を添加することの他、終濃度で50mM Bis-Tris-HCl Buffer(pH6.0)、180kdpm/mL [5-H]NAH、の組成となるように調製した。その後、0.1M Trisを0.1mL混合して酵素反応を停止させた。この溶液から[5-H]NAHを除去するため、蒸留水を用いて平衡化したQ Sepharose HP 0.16mLを充填したスピンカラムに全量をアプライし、2,000×gで20秒間遠心した。次に、0.1mLの0.1M Trisをスピンカラムにアプライし、2,000×gで20秒間遠心する操作を2回繰り返した。スピンカラムから溶出された溶液を全量回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて溶液中のH濃度(dpm)を測定した。その結果を表7に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 表7に示した通り、HG-5epi活性はCHAPS、デオキシコール酸ナトリウム、またはn-オクチル-β-D-グルコシドの濃度に依存して阻害されることが分かった。特に、HG-5epi活性はデオキシコール酸ナトリウムによって強く阻害され、終濃度0.1%以上のデオキシコール酸ナトリウムの存在下ではHG-5epi活性が完全に阻害されることが分かった。
 本発明によれば、HG-5epi活性を有する酵素またはポリペプチドを提供することができ、よって、HexA残基が異性化された多糖を製造することができる。このようなHexA残基が異性化された多糖は、新規素材として有用であると期待される。
<配列表の説明>
配列番号1:アフリカマイマイのHG-5epiのcDNAの塩基配列
配列番号2:アフリカマイマイのHG-5epiのアミノ酸配列
配列番号3:ヒトのC5-epiのアミノ酸配列
配列番号4:ゼブラフィッシュのC5-epiのアミノ酸配列
配列番号5:線虫のC5-epiのアミノ酸配列
配列番号6:プライマー
配列番号7、8:EcoRIアダプター
配列番号9~15:プライマー
配列番号16:アフリカマイマイのHG-5epiのcDNAの部分配列
配列番号17~22:プライマー
配列番号23:アフリカマイマイのHG-5epiのcDNAの部分配列
配列番号24~27:プライマー
配列番号28:アフリカマイマイのHG-5epiのcDNAの部分配列
配列番号29、30:プライマー
配列番号31:マウスIgκ鎖の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号32:FLAGタグのアミノ酸配列
配列番号33:マウスIgκ鎖の分泌シグナルペプチドおよびFLAGタグをコードする組換えDNAの塩基配列
塩基番号34:マウスIgκ鎖の分泌シグナルペプチドおよびFLAGタグからなるポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号35~42:プライマー

Claims (14)

  1.  以下の(A)及び(B)の特徴を有する、アフリカマイマイ由来の酵素。
    (A)N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有する。
    (B)N-硫酸化ヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-再硫酸化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を実質的に有しない。
  2.  以下の(A)~(C)からなる群から選択されるポリペプチド。
    (A)以下の(a1)又は(a2)のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
     (a1)配列番号2におけるアミノ酸番号1~601で示されるアミノ酸配列。
     (a2)配列番号2におけるアミノ酸番号34~601で示されるアミノ酸配列。
    (B)前記(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつN-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチド。
    (C)前記(A)又は(B)のポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、かつN-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチド。
  3.  以下の(A)~(C)の特徴を有するポリペプチド。
    (A)N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有する。
    (B)至適pHが5.5~6.0である。
    (C)0.1%(w/v)以上のデオキシコール酸ナトリウムの存在下で前記活性が実質的に失われる。
  4.  請求項1に記載の酵素、又は請求項2若しくは3に記載のポリペプチド、をコードする核酸。
  5.  以下の(A)~(C)からなる群から選択されるDNA。
    (A)以下の(a1)又は(a2)の塩基配列を含むDNA。
     (a1)配列番号1における塩基番号1~1806で示される塩基配列。
     (a2)配列番号1における塩基番号100~1806で示される塩基配列。
    (B)前記(A)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつN-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドをコードするDNA。
    (C)前記(A)又は(B)のDNAにペプチドタグをコードするDNAを付加した融合DNAの塩基配列を含み、かつN-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドをコードするDNA。
  6.  請求項4に記載の核酸、及び/又は請求項5に記載のDNA、を含むベクター。
  7.  請求項4に記載の核酸、請求項5に記載のDNA、及び/又は請求項6に記載のベクター、を保持する宿主細胞。
  8.  以下の(A)及び(B)を含む、ポリペプチドの製造方法。
    (A)請求項7に記載の宿主細胞を用いて、N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有するポリペプチドを発現させる工程。
    (B)前記(A)の工程において発現させたポリペプチドを採取する工程。
  9.  請求項8に記載の方法により得られるポリペプチド。
  10.  N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基をイズロン酸残基に異性化する活性、及び/又は、完全脱硫酸化・N-アセチル化ヘパリンのイズロン酸残基をグルクロン酸残基に異性化する活性、を有する酵素及び/又はポリペプチドを、N-アセチルグルコサミン残基とヘキスロン酸残基からなる二糖を含む多糖と接触させる工程を含む、ヘキスロン酸残基が異性化された多糖の製造方法。
  11.  前記酵素が請求項1に記載の酵素であり、前記ポリペプチドが請求項2、3、又は9に記載のポリペプチドである、請求項10に記載の方法。
  12.  請求項10又は11に記載の方法により得られる多糖。
  13.  N-アセチルヘパロサンのグルクロン酸残基がイズロン酸残基に異性化された構造を含む多糖。
  14.  多糖の骨格中に存在するヘキスロン酸残基におけるイズロン酸残基の割合が20%~75%である、請求項12又は13に記載の多糖。
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