JPWO2018135027A1 - ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕以下(A)〜(F)からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において、ヘパロサン化合物からヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物を生成することを含む、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法:
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;
(C)配列番号2のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;
(D)配列番号5のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)配列番号5のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F)配列番号5のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
〔2〕(B)のタンパク質が(B’)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質であり、
(E)のタンパク質が(E’)配列番号5のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である、
〔1〕の方法。
〔3〕前記タンパク質が以下(E1)〜(F1)からなる群より選ばれるタンパク質である、〔1〕または〔2〕の方法:
(E1)配列番号56、59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E2)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F1)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
〔4〕前記タンパク質がゼブラフィッシュに由来する、〔1〕〜〔3〕のいずれかの方法。
〔5〕前記タンパク質を産生する形質転換微生物、またはその抽出物の存在下において、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物が生成される、〔1〕〜〔4〕のいずれかの方法。
〔6〕前記形質転換微生物が、以下(a)〜(j)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む宿主細胞である、〔5〕の方法:
(a)配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号1のヌクレオチド配列と80%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)配列番号3のヌクレオチド配列と80%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号3のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(g)配列番号4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(h)配列番号4のヌクレオチド配列と80%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(i)配列番号4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;ならびに
(j)(a)〜(i)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
〔7〕(b)のポリヌクレオチドが(b’)配列番号1のヌクレオチド配列と90%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
(e)のポリヌクレオチドが(e’)配列番号3のヌクレオチド配列と90%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
(h)のポリヌクレオチドが(h’)配列番号4のヌクレオチド配列と90%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、
〔6〕の方法。
〔8〕前記ポリヌクレオチドが以下(e1)〜(j1)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドである、〔6〕または〔7〕の方法:
(e1)配列番号55、58、61、64、および67からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e2)配列番号58、61、64、および67からなる群より選ばれるヌクレオチド配列と95%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;ならびに
(j1)(e1)または(e2)のポリヌクレオチドの縮重変異体。
〔9〕前記形質転換微生物が、エシェリヒア属細菌である、〔6〕〜〔8〕のいずれかの方法。
〔10〕前記形質転換微生物が、エシェリヒア・コリである、〔9〕の方法。
〔11〕前記ヘパロサン化合物がN−硫酸化ヘパロサンである、〔1〕〜〔10〕のいずれかの方法。
〔12〕前記ヘパロサン化合物が低分子化ヘパロサンである、〔1〕〜〔11〕のいずれかの方法。
〔13〕ヘパラン硫酸の製造方法であって、
ヘパロサンを、ヘキスロン酸残基のC5−エピメリ化、ヘキスロン酸残基の2−O−硫酸化、α−D−グルコサミン残基のN−脱アセチル化、α−D−グルコサミン残基のN−硫酸化、α−D−グルコサミン残基の3−O−硫酸化、およびα−D−グルコサミン残基の6−O−硫酸化を含む処理に供して、ヘパラン硫酸を生成することを含み、
C5−エピメリ化が、以下(A)〜(F)からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において行われる、方法:
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;
(C)配列番号2のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;
(D)配列番号5のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)配列番号5のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F)配列番号5のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
〔14〕(B)のタンパク質が(B’)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質であり、
(E)のタンパク質が(E’)配列番号5のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である、
〔13〕の方法。
〔15〕前記タンパク質が以下(E1)〜(F1)からなる群より選ばれるタンパク質である、〔13〕または〔14〕の方法:
(E1)配列番号56、59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E2)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F1)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
〔16〕処理が、ヘパロサンの低分子化をさらに含む、〔13〕〜〔15〕のいずれかの方法。
〔17〕以下(E1)〜(F1)からなる群より選ばれるタンパク質:
(E1)配列番号56、59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E2)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F1)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;
(C)配列番号2のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;
(D)配列番号5のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)配列番号5のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F)配列番号5のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
(E1)配列番号56、59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E2)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F1)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
(1)低分子化;
(2)ヘパロサン中のα−D−グルコサミン残基のN−アセチル基のN−脱アセチル化(例、部分的N−脱アセチル化);
(3)ヘパロサン中のα−D−グルコサミン残基のアミノ基のN−硫酸化;
(4)ヘパロサン中のヘキスロン酸残基の2位の水酸基の硫酸化(2−O−硫酸化);
(5)α−D−グルコサミン残基の3位の水酸基の硫酸化(3−O−硫酸化);および
(6)α−D−グルコサミン残基の6位の水酸基の硫酸化(6−O−硫酸化)。
このような誘導体は、後述するような、α−D−グルコサミン残基のN−脱アセチル化、低分子化、α−D−グルコサミン残基のN−硫酸化、ヘキスロン酸残基の2−O−硫酸化、α−D−グルコサミン残基の3−O−硫酸化、およびα−D−グルコサミン残基の6−O−硫酸化の処理を利用することにより得ることができる。
(a)配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号1のヌクレオチド配列と80%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)配列番号3のヌクレオチド配列と80%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号3のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(g)配列番号4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(h)配列番号4のヌクレオチド配列と80%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(i)配列番号4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;ならびに
(j)(a)〜(i)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
(e1)配列番号55、58、61、64、および67からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e2)配列番号58、61、64、および67からなる群より選ばれるヌクレオチド配列と95%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;ならびに
(j1)(e1)または(e2)のポリヌクレオチドの縮重変異体。
i)Argをコードする4種のコドン(AGG、AGA、CGG、およびCGA)からなる群より選ばれる少なくとも1種のコドンの、Argをコードする別のコドン(CGU、またはCGC)への変更;
ii)Glyをコードする1種のコドン(GGA)の、別のコドン(GGG、GGU、またはGGC)への変更;
iii)Ileをコードする1種のコドン(AUA)の、別のコドン(AUU、またはAUC)への変更;
iv)Leuをコードする1種のコドン(CUA)の、別のコドン(UUG、UUA、CUG、CUU、またはCUC)への変更;ならびに
v)Proをコードする1種のコドン(CCC)の、別のコドン(CCG、CCA、またはCCU)への変更。
本発明の縮重変異体がRNAの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「U」が利用されるべきであるが、本発明の縮重変異体がDNAの場合、ヌクレオチド残基「U」の代わりに「T」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、1〜400個、1〜300個、1〜200個、または1〜100個である。
1.ヘパロサン化合物のN−脱アセチル化;
2.α−D−グルコサミン残基のN−硫酸化;
3.ヘキスロン酸残基のC5−エピメリ化;および
4.ヘキスロン酸残基の2−O−硫酸化、α−D−グルコサミン残基の3−O−硫酸化、およびα−D−グルコサミン残基の6−O−硫酸化。
また、2以上の処理は、並行して行うこともできる。
(E1)配列番号56、59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E2)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F1)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
(1)ヘパロサン発酵
WO2015/050184の実施例1に記載のヘパロサン生産菌(エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pVK9−kfiABCD株)および培養条件にてヘパロサンを含有する培養液を得た。
培養液から遠心分離により培養上清を回収した。培地成分を除去するために1mLの培養上清をUF膜を用いてmilliQ水で洗浄し、250μLまで濃縮した。UF膜濃縮液250μLに500μLの100%エタノールを加え、遠心分離によってヘパロサンを沈降させた。得られた沈殿を風乾させ、ヘパロサンを得た。残りの培養上清から同様の手順でヘパロサンを精製し、ヘパロサン計10gを得た。
1) ヘパロサン1.22gにHydrazine・H2O 61mLおよび1N硫酸4.7mLを添加し、気相を窒素置換後、100℃に加温し、4.75時間反応させた。
1)ヘパリナーゼIIIの調製
<Flavobacterium heparinum由来hepC遺伝子の発現プラスミドの構築>
Flavobacterium heparinum(ATCC13125)よりヘパリナーゼIIIをコードするhepC遺伝子をpMIV−Pnlp0ベクター(米国特許出願公開20050196846号)にクローニングし、hepC遺伝子の発現プラスミドpMIV−Pnlp0−hepCを構築した。pMIV−Pnlp0−terには強力なnlp0プロモーター(Pnlp0)とrrnBターミネーターが組み込まれており、プロモーターとターミネーターの間に目的の遺伝子を挿入することで発現ユニットとして機能させることができる。「Pnlp0」はエシェリヒア・コリK−12株由来の野生型nlpD遺伝子のプロモーターを示す。
hepC遺伝子の発現プラスミドpMIV−Pnlp0−hepCをエシェリヒア・コリBL21(DE3)株(ライフテクノロジーズ社)へエレクトロポレーション(Cell:80μL,200Ω,25μF,1.8kV,キュベット:0.1mL)により導入し、ヘパリナーゼIII生産株としてエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pMIV−Pnlp0−hepC株を得た。この株を25μg/mLクロラムフェニコール添加LB培地にて37℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を、坂口フラスコに300mL張りこんだLB培地中に終濃度2%v/vとなるよう植菌した。37℃にて4時間振とう培養を行い、培養を終了した。遠心分離後、菌体を0.85%NaClにて2回洗浄し、30mLの50mM HEPESバッファー(pH7.0)にて懸濁した。懸濁液を超音波破砕に供して菌体を破砕した。細胞破砕液を遠心分離し、上清(無細胞抽出液)としてヘパリナーゼIII酵素液を調製した。
上記(3)で得られたN−アセチル基残存率14.9%のN−脱アセチル化ヘパロサン1gおよび31.3mIU/μLのヘパリナーゼIII溶液2mLを100mM NaClおよび1.5mM CaCl2を含むTris緩衝溶液(pH8.0)100mLに溶解し、37℃にて5.3時間反応させた。反応液に16%NaCl水溶液100mLおよびEtOH 900mLを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、低分子化N−脱アセチル化ヘパロサンを得た。ヘパリナーゼIIIによる低分子化後の分子量について、プルランを標準としてGPCにより測定した。その結果、数平均分子量(Mn)は、9860、重量平均分子量(Mw)は、15430であった。
1) 上記(4)で得られた低分子化N−脱アセチル化ヘパロサン1gをmilliQ水50mLに溶解させ、20mg/mL NaHCO3/20mg/mL Trimethylamine・SO3水溶液を50mL添加して55℃で一晩反応させた。
N−硫酸化低分子化ヘパロサンの二糖分析は、既報(T.Imanari,et.al.,“High−performance liquid chromatographic analysis of glycosaminoglycan−derived oligosaccharides.”J.O.Chromato.A,720,275−293(1996))の条件に従い実施した。すなわち、N−硫酸化低分子化ヘパロサンをヘパリナーゼIIおよびIIIを用いて不飽和二糖に分解し、分解物をHPLCで分析することにより、各構成二糖の量を定量した。
2) 反応溶液を37℃で16時間以上反応させた後、100℃にて2分間煮沸し、反応を停止させた。
3) 0.45μmのフィルターで不溶物を除去した溶液を二糖分析用サンプルとした。
4) 分析は、カラムにはInertsil ODS−3 150mm×2.1mm、粒子径5μmを用い、温度は50℃、流速は0.25mL/min、検出波長は230nm、溶離液はA液として4%Acetonitrile、1.2mM Tributylamineを用い、B液として4%Acetonitrile、0.1M CsClを用い、B液1−90%のグラジエント条件で行った。
各多糖サンプルから生成した構成二糖の量の合計から、収率を算出した。すなわち、収率は、N−脱アセチル化ヘパロサンから生成した二糖の全量に対する、N−硫酸化低分子化ヘパロサンから生成した二糖の全量の比率(モル比)として算出した。また、この時、得られたN−硫酸化低分子化ヘパロサンにおいて、N−脱アセチル化により生じたアミノ基の99%以上がN−硫酸化されていることを確認した。
また、N−脱アセチル化ヘパロサンから生成した各構成二糖の量に基づき、N−脱アセチル化ヘパロサンにおけるN−アセチル基の残存率を算出した。すなわち、アセチル基の残存率は、二糖の総量に対する、N−アセチル基を有する二糖の量の比率(モル比)として算出した。アセチル基の残存率は、14.9%であった。
(1)ヒト由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼ(hspDlce)発現菌株の構築
pMAL−c2x(配列番号20、New England BioLabs社)をテンプレートDNAとし、配列番号34および35をプライマーとして用いたPCR反応によって、変異型Maltose binding protein(MBP*)のC末端領域DNA断片を得た。上記PCR反応においては、5’末端に制限酵素BglII、3’末端に制限酵素HindIII、BamHI、SacI、XhoI、およびNotIの認識サイトを付加した。pMAL−c2xプラスミドDNAおよびMBP*のC末端領域DNA断片をBglIIおよびHindIIIにより切断し、ライゲーション反応を行うことによりpMAL−MBP*プラスミドを得た。pMAL−MBP*プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号21に示す。
pMAL−MBP*をテンプレートDNAとして、ポリメラーゼとしてPrimeStarポリメラーゼ(TaKaRa社)を使用して、製造元のプロトコールに従って98℃5秒、55℃10秒、72℃2分の条件で30サイクルのPCRを行い、pMAL−MBP*のDNA断片を得た。プライマーとしては配列番号38および39の組み合わせを使用した。
エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−hspDlce(G101)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−mdoDlce(G100)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−ggaDlce(G88)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−xtrDlce(G92)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−dreDlce(G70)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−cinDlce(K92)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−dmeDlce(Y66)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−celDlceをLB培地(1.0%(w/v)ペプトン、0.5%(w/v)酵母エキス、1.0%(w/v)NaCl)に100μg/mLアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を3mLのLB培地中に終濃度1%となるよう植菌し37℃にて3時間振とう培養後、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)(ナカライテスク社)を終濃度0.5mMとなるよう添加し、さらに一晩22℃にて培養を行い、各生物種由来Dlceを菌体において発現させた。
(1)C5−エピメリ化反応
反応液(2mg/mL N−硫酸化低分子化ヘパロサン、50mM MES(pH7.0)、1mM塩化カルシウム)に各生物種由来Dlce含有無細胞抽出液を30%添加し、37℃で30分間または12時間反応を行った。陰性対照として、反応液に無細胞抽出液の代わりに洗浄液を添加した条件で酵素反応を実施した。
C5−エピメリ化率の定量は、亜硝酸分解による二糖組成分析により実施した。
<試薬>
NaNO2(CAS No.:7632−00−0,MW:69.01)
クエン酸(CAS No.:77−92−9,MW:192.1)
2,4−ジニトロフェニルヒドラジン(CAS No.:119−26−6,MW:198.1)50%含水品(略:DNPH)
<試験液>
NaNO2水溶液:試薬49.5mgをH2O 1mLに溶解
クエン酸水溶液:試薬384.2mgをH2O 1mLに溶解
DNPH溶液:試薬20.4mg(50%含水)をアセトニトリル1mLに溶解
<分析手順>
1.5mLマイクロチューブ(Eppendorf)に反応液10μL、クエン酸緩衝液20μL、NaNO2水溶液10μLを順に添加し、混合溶液を65℃で2hr撹拌(1000rpm)し、亜硝酸分解液を得た。得られた亜硝酸分解液40μLにDNPH溶液20μLを添加し、45℃で2hr撹拌(1000rpm)し、誘導化液を得た。得られた誘導化液の組成を下記に示す条件によりHPLCで分析した。
<HPLC分析条件>
カラム:住化分析センター製ODS Z−CLUE3μm 2.0mm×250mm
カラム槽温度:50℃
溶離液流量:0.3mL/min
検出:UV365nm
注入量:5μL
溶離液組成:A液 50mM−HCOONH4(pH4.5)
B液 MeCN
HPLC分析により求めたGlcA−GlcN(NS)とIdoA−GlcN(NS)の比率からC5−エピメリ化率を算出し、その結果を表3に示す。反応時間30分間での比較から、MBP*−dreDlce(G70)を含有する無細胞抽出液が優位に高いC5−エピメリ化率を示すことが明らかとなった。表中の−はデータを取得していないことを示す。
ゼブラフィッシュ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼ(dreDlce)の改変体であるFcDlce−02、FcDlce−04、FcDlce−05、FcDlce−06、FcDlce−07の触媒部位(G70−Asn585)のcDNAを人工遺伝子合成(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)により調製した。野生型および各改変体の全長タンパク質間の改変度(ClustalWを用いて算出したアミノ酸配列相同性で示す)を表4に示す。
エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−dreDlce(G70)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−FcDlce−02(G70)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−FcDlce−04(G70)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−FcDlce−05(G70)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−FcDlce−06(G70)、エシェリヒア・コリOrigami B(DE3)/pMAL−MBP*−FcDlce−07(G70)を用いて、実施例3と同様の方法にて野生型および改変Dlceを菌体で発現させ、Dlce含有無細胞抽出液を取得した。
野生型および改変Dlce含有無細胞抽出液によるC5−エピメリ化反応、およびC5−エピメリ化率の定量を、実施例4と同様の方法にて行った。陰性対照は、実施例4と同様とした。
HPLC分析により求めたGlcA−GlcN(NS)とIdoA−GlcN(NS)の比率からC5−エピメリ化率を算出し、その結果を表5に示す。MBP*−FcDlce−02(G70)、MBP*−FcDlce−04(G70)、MBP*−FcDlce−05(G70)、MBP*−FcDlce−06(G70)、MBP*−FcDlce−07(G70)を含有する無細胞抽出液がMBP*−dreDlce(G70)を含有する無細胞抽出液と同等以上のC5−エピメリ化率を示すことが明らかとなった。
配列番号2は、ゼブラフィッシュ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの天然型の全長アミノ酸配列(GenBankアクセッション番号:AY388517.1)を示す。
配列番号3は、ゼブラフィッシュ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(配列番号2におけるGly70−Asn585)をコードする天然型ヌクレオチド配列を示す。
配列番号4は、ゼブラフィッシュ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(配列番号2におけるGly70−Asn585)をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示す。
配列番号5は、ゼブラフィッシュ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(配列番号2におけるGly70−Asn585)を示す。
配列番号6は、ヒト由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(Gly101−Asn617)をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号7は、ヒト由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(Gly101−Asn617)を示す。
配列番号8は、オポッサム由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(Gly100−Asn617)をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号9は、オポッサム由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(Gly100−Asn617)を示す。
配列番号10は、ニワトリ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(Gly88−Asn605)をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号11は、ニワトリ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(Gly88−Asn605)を示す。
配列番号12は、カエル由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(Gly92−Asn607)をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号13は、カエル由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(Gly92−Asn607)を示す。
配列番号14は、ホヤ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(K92−Asn637)をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号15は、ホヤ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(K92−Asn637)を示す。
配列番号16は、ショウジョウバエ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(Y66−Asn614)をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号17は、ショウジョウバエ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの部分アミノ酸配列(Y66−Asn614)を示す。
配列番号18は、線虫由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号19は、線虫由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの全長アミノ酸配列を示す。
配列番号20は、pMAL−c2xプラスミドのヌクレオチド配列を示す。
配列番号21は、pMAL−MBP*プラスミドのヌクレオチド配列を示す。
配列番号22〜31は、実施例1でhepC遺伝子発現プラスミドを構築するために使用したプライマーおよび断片のヌクレオチド配列を示す。
配列番号22は、プライマーP1のヌクレオチド配列を示す。
配列番号23は、プライマーP2のヌクレオチド配列を示す。
配列番号24は、Pnlp0プロモーターのPaeI−SalI断片のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を示す。
配列番号25は、プライマーP3のヌクレオチド配列を示す。
配列番号26は、プライマーP4のヌクレオチド配列を示す。
配列番号27は、rrnB遺伝子のターミネーター領域約300bpを含むDNA断片(配列番号6)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号28は、プライマーP5のヌクレオチド配列を示す。
配列番号29は、プライマーP6のヌクレオチド配列を示す。
配列番号30は、プライマーP7のヌクレオチド配列を示す。
配列番号31は、プライマーP8のヌクレオチド配列を示す。
配列番号32は、実施例1でクローニングされたhepC遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号33は、配列番号32のヌクレオチド配列がコードするヘパリナーゼIII(HepC)のアミノ酸配列を示す。
配列番号34および35は、実施例2でMBP*を作成するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号36および37は、実施例2でヒト由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号38および39は、実施例2でpMAL−MBP*のDNA断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号40および41は、実施例2でオポッサム由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号42および43は、実施例2でニワトリ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号44および45は、実施例2でカエル由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号46および47は、実施例2でゼブラフィッシュ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号48および49は、実施例2でホヤ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号50および51は、実施例2でショウジョウバエ由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号52および53は、実施例2で線虫由来D−グルクロニル C5−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号54は、改変体FcDlce−02の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号55は、改変体FcDlce−02のGly70−Asn585部分アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号56は、改変体FcDlce−02のGly70−Asn585部分アミノ酸配列を示す。
配列番号57は、改変体FcDlce−04の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号58は、改変体FcDlce−04のGly70−Asn585部分アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号59は、改変体FcDlce−04のGly70−Asn585部分アミノ酸配列を示す。
配列番号60は、改変体FcDlce−05の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号61は、改変体FcDlce−05のGly70−Asn585部分アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号62は、改変体FcDlce−05のGly70−Asn585部分アミノ酸配列を示す。
配列番号63は、改変体FcDlce−06の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号64は、改変体FcDlce−06のGly70−Asn585部分アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号65は、改変体FcDlce−06のGly70−Asn585部分アミノ酸配列を示す。
配列番号66は、改変体FcDlce−07の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号67は、改変体FcDlce−07のGly70−Asn585部分アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号68は、改変体FcDlce−07のGly70−Asn585部分アミノ酸配列を示す。
配列番号69および70は、実施例5で改変体FcDlce−02の断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号71は、実施例5で改変体FcDlce−04の断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号72は、実施例5で改変体FcDlce−05の断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
Claims (17)
- 以下(A)〜(F)からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において、ヘパロサン化合物からヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物を生成することを含む、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物の製造方法:
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;
(C)配列番号2のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;
(D)配列番号5のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)配列番号5のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F)配列番号5のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。 - (B)のタンパク質が(B’)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質であり、
(E)のタンパク質が(E’)配列番号5のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である、
請求項1記載の方法。 - 前記タンパク質が以下(E1)〜(F1)からなる群より選ばれるタンパク質である、請求項1または2記載の方法:
(E1)配列番号56、59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E2)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F1)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記タンパク質がゼブラフィッシュに由来する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記タンパク質を産生する形質転換微生物、またはその抽出物の存在下において、ヘキスロン酸残基が異性化されたヘパロサン化合物が生成される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 前記形質転換微生物が、以下(a)〜(j)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む宿主細胞である、請求項5記載の方法:
(a)配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号1のヌクレオチド配列と80%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e)配列番号3のヌクレオチド配列と80%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号3のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(g)配列番号4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(h)配列番号4のヌクレオチド配列と80%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(i)配列番号4のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;ならびに
(j)(a)〜(i)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。 - (b)のポリヌクレオチドが(b’)配列番号1のヌクレオチド配列と90%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
(e)のポリヌクレオチドが(e’)配列番号3のヌクレオチド配列と90%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
(h)のポリヌクレオチドが(h’)配列番号4のヌクレオチド配列と90%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、
請求項6記載の方法。 - 前記ポリヌクレオチドが以下(e1)〜(j1)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドである、請求項6または7記載の方法:
(e1)配列番号55、58、61、64、および67からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(e2)配列番号58、61、64、および67からなる群より選ばれるヌクレオチド配列と95%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;ならびに
(j1)(e1)または(e2)のポリヌクレオチドの縮重変異体。 - 前記形質転換微生物が、エシェリヒア属細菌である、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
- 前記形質転換微生物が、エシェリヒア・コリである、請求項9記載の方法。
- 前記ヘパロサン化合物がN−硫酸化ヘパロサンである、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 前記ヘパロサン化合物が低分子化ヘパロサンである、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- ヘパラン硫酸の製造方法であって、
ヘパロサンを、ヘキスロン酸残基のC5−エピメリ化、ヘキスロン酸残基の2−O−硫酸化、α−D−グルコサミン残基のN−脱アセチル化、α−D−グルコサミン残基のN−硫酸化、α−D−グルコサミン残基の3−O−硫酸化、およびα−D−グルコサミン残基の6−O−硫酸化を含む処理に供して、ヘパラン硫酸を生成することを含み、
C5−エピメリ化が、以下(A)〜(F)からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において行われる、方法:
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;
(C)配列番号2のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;
(D)配列番号5のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)配列番号5のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F)配列番号5のアミノ酸配列において1個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。 - (B)のタンパク質が(B’)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質であり、
(E)のタンパク質が(E’)配列番号5のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質である、
請求項13記載の方法。 - 前記タンパク質が以下(E1)〜(F1)からなる群より選ばれるタンパク質である、請求項13または14記載の方法:
(E1)配列番号56、59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E2)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
(F1)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列において1〜25個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質。 - 処理が、ヘパロサンの低分子化をさらに含む、請求項13〜15のいずれか一項記載の方法。
- 以下(E1)〜(F1)からなる群より選ばれるタンパク質:
(E1)配列番号56、59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E2)配列番号59、62、65、および68からなる群より選ばれるアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつD−グルクロニル C5−エピメラーゼ活性を有するタンパク質;および
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