JP4730302B2 - タンパク質の製造法 - Google Patents
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Description
コリネ型細菌は、L−グルタミン酸、L−リジンを始めとするL−アミノ酸、核酸生産菌として発酵工業上、非常に有用な細菌である。また、コリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌に好適とされるカビ、酵母やBacillus属細菌と比べ、もともと菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程が簡略化、省略化できることであり、また糖、アンモニアや無機塩等のシンプルな培地で早く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れており、異種タンパク生産においても非常に有用な細菌であると考えられている。
しかしながら、コリネ型細菌に於いてSec系による分泌生産が困難なタンパク質も存在することが知られている。そのような例には、イソマルトデキストラナーゼやプロテイントランスグルタミナーゼ等産業上有用なタンパク質が含まれる。
また、Sec系ではタンパク質が高次構造形成する前の状態で分泌されるのに対し、Tat系ではタンパク質は細胞内で高次構造を形成した後に細胞膜を通過して分泌されることが特徴的である[J Biol Chem25;273(52):34868-74(1998)]。
また、エシェリヒア・コリにおいてはTat系分泌装置をコードする遺伝子tatA、tatB、tatCを発現するプラスミドを導入することにより、Tat経路におけるペリプラズムへの分泌量の向上が認められた例があるが、その蓄積量は5−10mg/Lであり、産業上実用的なレベルには達していない。[Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:279-284.(2003) ]
本発明は、コリネ型細菌において、タンパク質分泌経路の一つであるSec系を利用したのでは分泌させることが困難であった産業上有用な異種タンパク質を効率的に菌体外に分泌(分泌生産)させる方法を提供することを目的とする。
より具体的には、本発明は、タンパク質分泌経路の一つであるSec系を利用したのでは分泌させることが困難であった産業上有用な異種タンパク質をコリネ型細菌において産生させ、かつ、効率的に菌体外に分泌(分泌生産)させることによって、異種タンパク質を効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
より具体的には、本発明は、上記方法において、Tat系依存シグナルペプチドが配列番号31または32記載の配列を含む、異種タンパク質の製造方法である。
更に具体的には、本発明は、上記方法において、Tat系依存シグナルペプチドが配列番号28〜30のいずれかの配列を含む、異種タンパク質の製造方法である。
特に、本発明は、上記方法において、Tat系依存シグナルペプチドがイソマルトデキストラナーゼのシグナルペプチドまたはトリメチルアミンN−オキシドレダクターゼのシグナルペプチドである、異種タンパク質の製造方法である。
さらに具体的には、本発明は、上記方法において、上記イソマルトデキストラナーゼのTat系依存シグナルペプチドが配列番号6記載のアミノ酸配列を有する、または、トリメチルアミンN−オキシドレダクターゼのシグナルペプチドが配列番号8記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、異種タンパク質の製造方法である。
本発明の方法においては、コリネ型細菌が宿主ベクター系として用いられ、コリネ型細菌のTat系依存シグナルペプチドの下流に分泌させる目的タンパク質の遺伝子を結合した発現構築物が作製され、これがコリネ型細菌内に導入され、発現され、目的タンパク質が菌体外に分泌される。
なお、本明細書において、タンパク質またはペプチドが「分泌」されるとは、タンパク質またはペプチドの分子が細菌菌体外(細胞外)に移送されることをいい、最終的にそのタンパク質またはペプチド分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合はもちろん、一部のみが菌体外に存在している場合、菌体表層に存在している場合も含む。
例えば、タンパク質がプロテイングルタミナーゼの場合は、それぞれ「プレプロプロテイングルタミナーゼ」、「プロプロテイングルタミナーゼ」および「異種融合プレプロプロテイングルタミナーゼ」と称される。また、「プロ部分を切断した」タンパク質とは、ペプチド結合を切断することによってプロ部分を構成する少なくとも1以上のアミノ酸を除去したタンパク質をいい、そのN末端領域が天然の成熟型タンパク質のものと完全に一致するタンパク質、および、そのタンパク質の活性を有する限り、天然のタンパク質に比較してN末端にプロ部分に由来する1以上の余分のアミノ酸を有するものおよび天然の成熟型タンパク質よりもアミノ酸配列が短いタンパク質も含まれる。
本発明で用いるコリネ型細菌において、増幅されていても良いTat系分泌装置は、アミノ酸配列の一部欠損または一部付加した場合、また、C.glutamicum由来のTat系分泌装置に限らずコリネ型細菌において機能し得るいずれのTat系分泌装置をも含む。
TorAシグナルペプチド:MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA(配列番号8)
SufIシグナルペプチド:MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA (配列番号28)
PhoDシグナルペプチド:MAYDSRFDEWVQKLKEESFQNNTFDRRKFIQGAGKIAGLSLGLTIAQS (配列番号29)
LipAシグナルペプチド:MKFVKRRTTALVTTLMLSVTSLFALQPSAKAAEH (配列番号30)
IMDシグナルペプチド: MMNLSRRTLLTTGSAATLAYALGMAGSAQA (配列番号6)
このような置換、欠失、挿入又は付加を有するシグナルペプチドをコードする核酸配列は、大腸菌、バチルス・ズブチリス、アルスロバクター・グロビフォルミスの変種、自然突然変異株又は人為突然変異株、アルスロバクター・グロビフォルミス以外のアルスロバクター属微生物やバチルス・ズブチリス以外のバチルス属微生物から取得され得る。また、置換、欠失、付加又は挿入を有するTat系依存シグナルペプチドをコードする核酸配列は、配列番号8、28、29、30又は配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するTat系依存シグナルペプチドをコードする核酸をインビトロ変異処理、あるいは部位特異的変異処理することによっても取得され得る。これらの突然変異処理は、当業者に周知の方法によって行うことができる。
上記のような置換、欠失、挿入又は付加は、後述するコンセンサスモチーフが保持されるような保存的変異である。保存的変異は、代表的には保存的置換である。これらのシグナルペプチドの元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム、
コリネバクテリウム・カルナエ、
コリネバクテリウム・グルタミカム、
コリネバクテリウム・リリウム、
コリネバクテリウム・メラセコーラ、
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、
コリネバクテリウム・ハーキュリス、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム、
ブレビバクテリウム・フラバム、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、
ブレビバクテリウム・ロゼウム、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、
ブレビバクテリウム・アルバム、
ブレビバクテリウム・セリヌム、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511、
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991、
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060、
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990、
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965、
コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(FERM BP-1539)、
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020、
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869、
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872、
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111、
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354。
とりわけ、野生株コリネバクテリウム・グルタミカム(C. glutamicum)ATCC13869よりストレプトマイシン(Sm)耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(FERM BP-734)(昭和59年3月26日原寄託)(現、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国つくば市東1−1−1 中央第6、郵便番号305-8566)はその親株(野生株)に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ2〜3倍と極めて高いため、宿主菌として好適である(WO 02/081694参照)。
さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、AJ12036の細胞表層タンパク質(PS2)破壊株であるC. glutamicum YDK010株が挙げられる(国際公開パンフレット WO 01/23591)。
本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。
実施例1.Arthrobacter globiformis(A. globiformis)由来のイソマルトデキストラナーゼのシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼの分泌発現
(1−1) C.glutamicumによるイソマルトデキストラナーゼのシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼ分泌発現プラスミドの構築
A. globiformis T6株由来イソマルトデキストラナーゼ(EC.3.2.1.94; 1,6-α-D-グルカンイソマルトデキストラナーゼ;1,6-α-D-glucan isomalto-dextranase)遺伝子の配列は既に決定されている[Journal of Bacteriology, 176, 7730-7734 (1994)]。この配列を参考にして、配列番号11(5’-ATGATGAACCTGTCCCGCCG-3')と配列番号12(5’-CGCGGATCCCTGAGGGCGGGAAC-3')に示した配列を有するプライマーを合成し、常法に従って(斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619. (1963)]調製したA. globiformisの染色体DNAを鋳型としてイソマルトデキストラナーゼをコードする領域をPCR法にて増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA ポリメラーゼ(宝酒造社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列番号12の配列は制限酵素BamHIの認識配列を含んでいる。
また、上述のpPKSPTG1(WO 01/23591記載)を鋳型として、プロモーターおよびシグナル配列をコードする領域を、配列番号14(5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3')、配列番号16(5’- GGCGGGACAGGTTCATCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAA -3’)に示したプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅した。配列番号16に示した配列は、イソマルトデキストラナーゼのシグナル配列のN末端側をコードする配列を含んでいる。
構築したプラスミドpPKI-IMDを用いてC.glutamicum ATCC13869のストレプトマイシン(Sm)耐性株AJ12036の細胞表層タンパク質(PS2)破壊株であるC.glutamicum YDK010株(特許WO 01/23591記載)に形質転換し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地で30℃にて48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEは12.5%のゲル(第一化薬製)を用い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク質のバンドを検出した。その結果、予想される分子量である約65kDaのバンドを検出した。さらに逆相クロマトグラフィー分析によりタンパク質の定量を行った結果、タンパク質濃度は約120mg/lであることが示された。また、Journal of Bacteriology, 176, 7730-7734 (1994)に記載の方法に従いイソマルトデキストラナーゼの酵素活性を測定し、得られたタンパク質が実際にイソマルトデキストラナーゼの酵素活性を有していることを確認した。
また、分泌されたイソマルトデキストラナーゼのN末端アミノ酸配列をプロテインシークエンサーで解析を行った。その結果、配列番号2に示したアミノ酸配列の31番目のAlaから始まるイソマルトデキストラナーゼが分泌されていることが確認できた。従ってシグナル配列領域は、配列番号5(ヌクレオチド配列)及び6(アミノ酸配列)に示した配列であることが確認された。
Corynebacterium ammoniagenesの細胞表層タンパク質SlpAに由来するシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼの分泌発現
(A−1)A. globiformis T6(NRRL B-4425,IMA12103)由来イソマルトデキストラナーゼ遺伝子の取得
配列番号11と配列番号12に示した配列を有するプライマーを合成し、常法に従って(斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619. (1963)]に従って調製したA. globiformisの染色体DNAからイソマルトデキストラナーゼをコードする領域をPCR法にて増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA ポリメラーゼ(宝酒造社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列番号12の配列は制限酵素BamHIの認識配列を含んでいる。
次にPCR法にて増幅したDNA断片を鋳型として、配列番号13(5'-GTCCCCGTCACGGCCGCGCC-3')と配列番号12に示した配列のプライマーを用いてPCRを行い、シグナル配列を除いた成熟型イソマルトデキストラナーゼをコードする領域を増幅した。
WO 01/23591記載のプラスミドpPKSPTG1を鋳型とし、プロモーターおよびシグナル配列をコードする領域を、配列番号14、配列番号15(5’- CCCGGGCGGGCGGTGACGGCGGTGGCTGCCGTTGCCACAGGTGCGG -3’)に示した配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅した。鋳型としたプラスミドpPKSPTG1はC. glutamicum由来の細胞表層タンパク質であるPS2のプロモーター、C. ammoniagenesの細胞表層タンパク質SlpAに由来するシグナル配列をコードする領域、およびS. mobaraenseに由来するプロトランスグルタミナーゼをコードする領域を含んでいる。前述のPCRにより、このプラスミド中のPS2プロモーター及びSlpAシグナル配列をコードする領域を含む断片が増幅される。なお、配列番号15に示したプライマーは、成熟型イソマルトデキストラナーゼのN末端側アミノ酸領域をコードする配列を含んでいる。
次に(A-1)において配列番号13と配列番号12に示した配列を有するプライマーを用いて増幅したPCR産物と、配列番号14と配列番号15に示した配列を有するプライマーにより増幅したPCR産物とを混合し、これらを鋳型として配列番号14と配列番号12に示した配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーPCRを行い、PS2プロモーターおよびSlpAのシグナルペプチド配列と成熟型イソマルトデキストラナーゼとの融合遺伝子を増幅した。このPCR産物を制限酵素ScaIとBamHIにより消化した後、アガロースゲル電気泳動により約2.5kbのDNA断片を回収し、特開平9−322774記載のプラスミドpPK4のScaI-BamHI部位に挿入して成熟型イソマルトデキストラナーゼの発現プラスミドpPKSIMDを構築した。
構築したプラスミドpPKSIMDを用いてC.glutamicum ATCC13869のストレプトマイシン(Sm)耐性株AJ12036の細胞表層タンパク質(PS2)破壊株であるC.glutamicum YDK010株(WO 01/23591記載)を形質転換し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地(酵母エキストラクト10g、トリプトン10g、グルコース5g、NaCl 5g、寒天 15g、水で1Lにする)で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地で30℃にて48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを12.5%のゲル(第一化薬製)を用いて行い、ゲルをクマシーブリリアントブルー染色してタンパク質を検出した。その結果、非常に微量の約65kDaのバンドを検出した。さらに逆相クロマトグラフィー分析によりタンパク質の定量を行った結果、濃度は約10mg/lであることが示された。これは、Arthrobacter globiformis由来のIMDのシグナル配列を用いた場合と比べ、タンパク分泌量が低下していたことを示す。逆相クロマトグラフィーの条件は、以下に記載したとおりである。
カラム:protein C4 214TP5410(Vydac社製)、
溶出条件:24-80% アセトニトリル リニアグラジエント/0.1%Tトリフルオロ酢酸、
流速:1.0ml/min
また、Journal of Bacteriology, 176, 7730-7734 (1994)に記載の方法に従いイソマルトデキストラナーゼの酵素活性を測定し、分泌されたタンパク質が実際にイソマルトデキストラナーゼ活性を有していることを確認した。
(2−1)Chryseobacterium proteolyticum由来プロテイングルタミナーゼ遺伝子の取得
Chryseobacterium proteolyticum株由来プロテイングルタミナーゼ(EC.3.5.1)遺伝子の配列はすでに決定されている[Eur.J.Biochem. 268. 1410-1421(2001)]。この配列を参考にして、Corynebacterium glutamicumにおいて使用頻度の高いコドンへの変換を行い配列番号3に示した遺伝子配列を構築した。この配列はプロテイングルタミナーゼのシグナル配列(プレ部分)とプロ部分および成熟型プロテイングルタミナーゼをコードする領域を含んでいる。この全遺伝子配列を合成により作製した。
構築した配列番号3の遺伝子配列情報に基づいて、配列番号17(5’-CATGAAGAACCTTTTCCTGTC-3’)と配列番号18(5’-GTAAAAGGATCCATTAATTAAAATCC-3’)に示した配列のプライマーを合成した。配列番号17に示したプライマーはプロテイングルタミナーゼのシグナル配列のN末端配列を含んでおり、配列番号18に示したプライマーは成熟型プロテイングルタミナーゼのC末端とBamHIの認識配列を含んでいる。配列番号3に示した配列を有するDNAを鋳型として配列番号17と配列番号18に示した配列のプライマーを用いてPCRを行い、プロテイングルタミナーゼのプロ部分および成熟型プロテイングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。このPCR断片を特開平9-070291記載のpVC7のSmaI部位に挿入した後E.coli JM109のコンピテントセル(宝酒造社製)に導入した。プロテイングルタミナーゼ遺伝子がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、プラスミドを回収した。このプラスミドにクローン化された断片の塩基配列を決定し、配列番号3に示した配列と一致することを確認した。
実施例1(1−1)に記載したIMD発現プラスミドpPKI-IMDを鋳型として、プロモーターおよびシグナルペプチドをコードする領域を、配列番号14、配列番号21(5’-CCTGGTTGCCGTTGGAATCGGCCTGGGCGGAGCCTGCC- 3’)に示した配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅した。増幅した領域はPS2プロモーターおよびIMDシグナルペプチドをコードする領域を含んでいる。なお、配列番号21に示した配列は、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子をコードする領域の5'末端の配列を含んでいる。次にプロテイングルタミナーゼがクローン化されているプラスミドを鋳型として、配列番号20(5’-GATTCCAACGGCAACCAGGA-3’)と配列番号18の配列を有するプライマーを用いたPCRにより、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子をコードする領域を増幅した。さらに、配列番号14、配列番号21の配列を有するプライマーを用いて得られたPCR産物と、配列番号20および配列番号18の配列を有するプライマーを用いて得られたPCR産物とを1:1で混合し、これらを鋳型とし、配列番号14と配列番号18に示した配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーPCRを実施することにより、PS2プロモーター領域およびIMDシグナル配列と、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼをコードする遺伝子との融合遺伝子を増幅した。このクロスオーバーPCR産物を制限酵素ScaIおよびBamHIにて消化した後、アガロースゲル電気泳動により約1.6kbpのDNA断片を検出した。このDNA断片をアガロースゲルより切り出し、EasyTrapVer.2(宝酒造社製)を用いて回収し、特開平9−322774記載のプラスミドpPK4のScaI-BamHI部位に挿入してプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ発現プラスミドpPKI-PPGを構築した。構築したプラスミドに挿入されている遺伝子配列の塩基配列を決定した結果、予想される融合遺伝子が構築されていることを確認した。
構築したプラスミドpPKI-PPGを用いてC.glutamicum由来の変異株YSr株より取得したYDK010株(国際公開パンフレットWO01/23591記載)に形質転換し、実施例1(1−3)と同様に25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地(で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地で30℃にて48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを4-20%のグラジエントゲル(第一化薬製)を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク質染色を実施した。その結果、予想される分子量である約35kDa付近にバンドを検出した。培養上清100μlを逆相HPLCにより分析した結果、タンパク質の濃度は約20mg/lであった。逆相HPLCの条件は、以下に記載したとおりである。
カラムCAPCELL PAK C18 SG300 4.6x150mm(SISEIDO製)
溶出条件:32-48% アセトニトリル リニアグラジエント/0.1%Tトリフルオロ酢酸(15min)、流速:1.0ml/min
さらに、培養上清をウルトラフリー(ミリポア製)により脱塩濃縮処理を行った後、放線菌由来プロテアーゼSAM-P45(国際公開パンフレットWO 01/23591に記載)により酵素消化してプロテイングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタンパク質の活性を特開2000-50887記載の方法により測定し、分泌されたタンパク質が実際にプロテイングルタミナーゼ活性を有していることを確認した。
C.ammoniagenesの細胞表層タンパク質SlpAに由来するシグナル配列を用いたChryseobacterium proteolyticum由来プロテイングルタミナーゼの分泌発現
(B−1)Chryseobacterium proteolyticum由来プロテイングルタミナーゼ遺伝子の取得
Chryseobacterium proteolyticum株由来プロテイングルタミナーゼ(EC.3.5.1)遺伝子の配列[Eur.J.Biochem. 268. 1410-1421(2001)]を参考にして、Corynebacterium glutamicumにおいて使用頻度の高いコドンへの変換を行い、配列番号3に示した配列を導いた。この配列はプロテイングルタミナーゼのシグナル配列領域(プレ部分)、プロ領域および成熟型プロテイングルタミナーゼをコードする領域を含んでいる。この全遺伝子配列を含む核酸分子を合成により作製した。
作製した配列番号3の遺伝子配列の情報をもとに配列番号17と配列番号18の配列を有するプライマーを合成した。配列番号17の配列を有するプライマーはプロテイングルタミナーゼのシグナル配列のN末端配列を含んでおり、配列番号18の配列を有するプライマーは成熟型プロテイングルタミナーゼのC末端とBamHIの認識配列を含んでいる。配列番号3に示した配列を有するDNAを鋳型として配列番号17と配列番号18に示した配列のプライマーを用いてPCRを行い、プロテイングルタミナーゼのプロ部分と成熟型プロテイングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。このPCR断片を特開平9-070291記載のpVC7のSmaI部位に挿入した後、E.coli JM109のコンピテントセル(宝酒造社製)に導入した。プロテイングルタミナーゼ遺伝子がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、これよりプラスミドを回収した。プラスミドにクローン化されている断片の塩基配列を決定し、配列番号3に示した配列と一致することを確認した。
特許WO01―23591記載のプラスミドpPKSPTG1を鋳型として、プロモーターおよびシグナルペプチドをコードする領域を、配列番号14、配列番号19(5’-TCCTGGTTGCCGTTGGAATCTGCCGTTGCCACAGGTGCGG-3’)を用いてPCRを行うことにより増幅した。増幅した領域はPS2プロモーターおよびSlpAシグナルペプチドをコードする領域を含んでいる。なお、配列番号19に示した配列は、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子をコードする領域の5'末端の配列を含んでいる。
構築したプラスミドpPKS-PPGを用いてC.glutamicum由来の変異株より取得したYDK010株(特許WO01/23591記載)を形質転換し、実施例1(1-3)と同様に25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地で30℃にて48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを12.5%のゲル(第一化薬製)を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色および蛍光色素SYPRO Orange(Molecular Probes社)によりタンパク染色を実施した。その結果、いずれの染色方法においても、予想される分子量付近にバンドを検出することはできなかった。
(3−1)大腸菌に由来するTorAシグナルペプチドをコードする遺伝子の取得
大腸菌に由来するTorAシグナルペプチドを含むTorA遺伝子の配列は既に決定されている(Mol. Microbiol. 11:1169-1179 (1994))。この配列を参考にして、配列番号22(5’-ATGAACAATAACGATCTCTTTCAGG-3’)と配列番号23(5’-CCGGATCCTGGTCATGATTTCACCTG-3’)に示したプライマーを合成し、常法に従って(斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)])調製した大腸菌W3110株の染色体DNAを鋳型として、TorAをコードする領域およびその上流にあるシグナル配列を含む領域をPCR法にて増幅した。PCR反応はPyrobest DNA polymerase(宝酒造社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従って行った。なお、配列番号23の配列は制限酵素BamHIの認識配列を含んでいる。TorAのシグナル配列をコードするDNA配列を配列番号7に示す。
国際公開パンフレットWO01/23591記載のプラスミドpPKSPTG1を鋳型としてプロモーターおよびシグナルペプチドをコードする領域を、配列番号14、配列番号24(5’-AAGAGATCGTTATTGTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAG-3’)に示す配列を有するプライマーを用いてPCRを行うことにより増幅した。配列番号24の配列は、TorAシグナルペプチドをコードする遺伝子の5'末端の配列を含んでいる。次にこのPCR産物、並びに、実施例3-1で得た、配列番号22と配列番号23に示す配列を有するプライマーにより増幅されたTorAをコードする遺伝子配列およびその上流にあるシグナル配列を含む領域を含むPCR産物とを1:1で混合し、これらを鋳型とし、配列番号14と配列番号23に示した配列を有するプライマーによりクロスオーバーPCRを実施した。これによりPS2プロモーター領域を含む配列、TorAシグナル配列、およびTorAをコードする配列を含む融合遺伝子が増幅された。このクロスオーバーPCR産物を制限酵素ScaIおよびBamHIにて消化した後、アガロースゲル電気泳動により約3.1kbpのDNA断片を検出した。このDNA断片をアガロースゲルより切り出し、EasyTrapVer.2(宝酒造社製)を用いて回収し、特開平9-322774記載のプラスミドpPK4のScaI-BamHI部位に挿入してプラスミドpPKT-TorAを得た。このプラスミドに挿入された遺伝子配列の塩基配列を決定した結果、予想される融合遺伝子が構築されていることが確認された。このプラスミドを鋳型とし、配列番号14と配列番号25(5’-GATTTCCTGGTTGCCGTTGGAATCCGCAGTCGCACGTCGCGGCG- 3’)に示す配列を有すプライマーを用いて、PS2のプロモーター領域およびTorAシグナルペプチドをコードする領域を含む部分をPCRにより増幅した。このPCR産物と実施例2(2-2)と同様に、配列番号20と配列番号18に示す配列を有するプライマーを用いたPCRにより、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。これらのPCR産物を1:1で混合し、それらを鋳型とし、配列番号14と配列番号18に示す配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーPCRを実施した。
このPCR産物を制限酵素ScaIおよびBamHIにて消化した後、アガロースゲル電気泳動を実施し、約3.1kbpのDNA断片を検出した。このDNA断片をアガロースゲルより切り出し、EasyTrapVer.2(宝酒造社製)を用いて回収し、特開平9−322774記載のプラスミドpPK4のScaI-BamHI部位に挿入してプラスミドpPKT-PPGを得た。プラスミド中の挿入配列の塩基配列を決定し、予想される融合遺伝子ができていることが確認された。
構築したプラスミドpPKT-PPGを用いてC.glutamicum由来の変異株C. glutamicum ATCC13869のストレプトマイシン(Sm)耐性株AJ12036株より取得したYDK010株(特許WO 01/23591記載)を形質転換し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地において30℃、48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを4-20%のグラジエントゲル(第一化薬製)を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク染色を実施した。その結果、予想される分子量付近、約35kDa付近にバンドを検出した。培養上清100μlを逆相HPLCにより分析した結果、タンパク質の濃度は約20mg/lであった。
さらに、同様に実施例2(2-2)と同様に培養上清をウルトラフリー(ミリポア製)により処理した後、放線菌由来プロテアーゼSAM-P45により酵素消化してプロテイングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタンパク質の活性を特許開2000-50887記載の方法を用いて測定し、分泌されたタンパク質が実際にプロテイングルタミナーゼ活性を有していることが確認された。
なお、プロ構造付きのプロテイングルタミナーゼのアミノ酸配列を配列番号4に示す。
(4−1)コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036由来tatC遺伝子破壊株の作製
上述のIMDのシグナル配列を連結したイソマルトデキストラナーゼ、および、TorAのシグナル配列を連結したプロテイングルタミナーゼがそれぞれTat系によって分泌されているかどうかを検討した。
これまでにコリネ型細菌のtat系遺伝子ホモログとして、tatA(GENEBANK cg103060 1571065-1571382)、tatB(GENEBANK cg103060 1167110-1167580)、tatC(GENEBANK cg103060 1569929-1570873)、tatE(gi 41223046 emb CAF18991.1)が存在することが明らかになっているがこれらの機能は明らかになっていない。
従ってtat遺伝子を破壊することによって、上述の実施例で分泌を確認した酵素がtat系で分泌されているかどうかを確認することとした。
斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta., 72, 619(1963)]に従って調製したCorynebacterium glutamicum ATCC13869の染色体DNAを鋳型として、配列番号26(5’-ggcggtaccgttaagcgccctcggcgagttatct-3’)と配列番号27(5’-gcctctagactagagcacgtcaccgaagtcggcg-3’)に示す配列を有するプライマーの組み合わせを用いてPCRを行なった。
この断片をKpnIとXbaIで消化し、プラスミドpHM1519由来の温度感受性プラスミドベクターであるpHS4(米国特許第5,616,480号)のKpnI-XbaI部位に挿入し、pHStatCを構築した。プラスミドpHS4で形質転換された大腸菌AJ12570はFERM BP-3523として、平成2年10月11日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所(現、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東1−1−1中央第6、郵便番号305-8566)に寄託されている。
次にpHStatCをNdeIとScaIで消化し、約70bpのDNA断片を除去してtatC遺伝子内部領域を欠損させ、再環状化させプラスミドpHSΔtatCを構築した。このプラスミドをYDK010株にエレクトロポレーションにより導入し、日本国特許第2763054号に記載した相同組換え法によりtatC遺伝子欠損株、YDK011株を取得した。
(4−2−1)SlpAに由来するシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼ(IMD)分泌発現プラスミドpPKS-IMDおよび、IMDシグナル配列を用いたIMD分泌発現プラスミドpPKI-IMDによる形質転換株におけるIMD分泌の比較
参考例Aにおいて作製C.ammoniagenesの細胞表層タンパク質SlpAに由来するシグナル配列を有するイソマルトデキストラナーゼ分泌発現プラスミドpPKS-IMDで上述のTatC欠損株を転換形質し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択することによりYDK011/pPKS-IMD株を取得した。また、同様にして、実施例1で作製したIMDシグナル配列を有するIMD分泌発現プラスミドpPKI-IMDを用いて、TatC欠損株YDK011株を形質転換し、YDK011/pPKI-IMD株を取得した。取得した両株を各々MM培地中、30℃にて48時間培養し、培養上清中のIMD分泌量の比較を行った。両株の各々の培養上清10μlをSDS-PAGEにかけて分析し、SYPRO Orange(Molecular Probes社)を用いてタンパク染色した。その結果、YDK011/pPKS-IMD株の培養上清についてはIMDの分子量付近に非常に弱いバンドが検出されたが、YDK011/pPKI-IMD株の培養上清については、IMDの分子量付近にバンドが検出されなかった。
実施例2で作製したIMDシグナル配列を含むIMD分泌発現プラスミドpPKI-PPGでTatC欠損株YDK011株を形質転換し、YDK011/pPKI-PPG株を取得した。さらに、大腸菌由来Tat系シグナルであるTorAシグナルを含むプロテイングルタミナーゼ(PPG)発現プラスミドpPKT-PPG(実施例3)でTatC欠損株であるYDK011株を形質転換してYDK011/pPKT-PPG株を取得した。取得した形質転換株を最少液体培地中、30℃にて48時間培養し、培養上清中のPPG分泌量を分析した。
次に、プロテイングルタミナーゼをウサギに免疫して抗プロテイングルタミナーゼポリクローナル抗体を作製した。このポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、実施例2及び3で作製したYDK010/pPKI-PPG株およびYDK010/pPKT-PPG株のどちらの培養上清中にもバンドが検出されたが、一方、YDK011/pPKI-PPG株、およびYDK011/pPKT-PPG株のどちらの培養上清中にもPPGのバンドは検出されなかった。さらに培養後のそれぞれの菌体を超音波で破砕し、菌体内のタンパクについてSDS-PAGE分析を実施した。培養上清について行ったように、各形質転換菌株の菌体内のタンパクについてもウエスタンブロッティングを実施した結果、YDK011/pPKI-PPG株およびYDK011/pPKT-PPG株由来の菌体破砕物に関して、いずれも分子量35kDa付近にPPGのバンドが検出された。
(5−1)TorAシグナル配列を用いた、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼのC.glutamicumからの分泌
実施例3(3−2)で構築したプラスミドpPKT-PPGを用いてC. glutamicum ATCC13869、およびC. glutamicum ATCC13869のストレプトマイシン(Sm)耐性変異株AJ12036株より取得したYDK010株(WO 01―23591記載)を形質転換し、実施例1(1−3)と同様に25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した両菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地において30℃にて48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを4-20%のグラジエントゲル(第一化薬製)を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク染色を実施した。その結果、どちらの菌株の培養上清中にも、予想される分子量約35kDaの位置にバンドが検出された。それぞれの培養上清100μlを逆相HPLCによりタンパク質濃度を分析した結果、pPKT-PPGを保持するC. glutamicum YDK010株の培養上清中のタンパク質濃度は約20mg/lであり、同じpPKT-PPGを保持するC. glutamicum ATCC13869株の培養上清中のタンパク質濃度は約70mg/lであった。
さらに、同様に実施例2(2-2)と同様に培養上清をウルトラフリー(ミリポア製)により処理した後、放線菌由来プロテアーゼSAM-P45により酵素消化してプロテイングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したプロテイングルタミナーゼの活性を特許開2000-50887記載の方法によって測定し、分泌されたタンパク質が実際にプロテイングルタミナーゼ活性を有していることを確認した。
(1)TatC発現プラスミドの構築
C.glutamicumのTatCをコードする遺伝子配列の5'上流域にTatAをコードする遺伝子が存在する。そのtatA遺伝子の上流のプロモーター領域を含む遺伝子配列をPCR法において増幅した。斎藤、三浦らの方法により調整したC.glutamicumATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号33(5’-GCTTGATCATTCCTTTAAGG- 3)と配列番号34(5’-ATGTGCTCAACAATGGACATGTGGTCTACTCCAAATTCAC- 3’)に示した配列のプライマーを用いた。配列番号34はtatCの5’末端の配列を含んでいる。またTatCをコードする遺伝子を増幅するためC.glutamicumATCC13032におけるtatCの遺伝子配列(配列番号35)を参考に、プライマー配列番号36(5’-ATGTCCATTGTTGAGCACATC- 3’)と配列番号37(5’-CTAGAGCACGTCACCGAAGT- 3’)を作成しPCR法にて増幅した。さらに、配列番号33と配列番号34により増幅したPCR産物と、配列番号36と配列番号37を用いて増幅したPCR 産物を1:1で混合して鋳型とし配列番号33と配列番号37によりクロスオーバーPCRを行なってtatAのプロモーター領域とTatCをコードする遺伝子の融合遺伝子を増幅させた。このPCR産物をアガロースゲル電気泳動により、約1.8kbのDNA断片を回収した、回収したDNA断片を特開平9−070291記載のプラスミドpVC7のSmaI部位に挿入することによって、TatC発現プラスミドpVtatCを構築した。構築したプラスミドは実施例1と同様の方法で挿入部分の塩基配列を確認した。
C.glutamicumATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号33と配列番号37に示した配列のプライマーを用いてTatAをコードする遺伝子配列とその5‘上流域、さらにTatCをコードする遺伝子配列を含んだ領域をPCR法により増幅した。このPCR産物をアガロースゲル電気泳動により、約2.4kbのDNA断片を回収した。回収したDNA断片を特開平9-070291記載のプラスミドpVC7のSmaI部位に挿入することによって、TatAおよびTatC発現プラスミドpVtatACを構築した。構築したプラスミドは実施例1と同様の方法で挿入した遺伝子の塩基配列を確認した。その結果、tatAの塩基配列はC.glutamicumATCC13032におけるtatAの予測配列と若干異なっていることが判明した。このTatAをコードする遺伝子配列とその5‘上流域、さらにTatCをコードする遺伝子配列を配列番号38に記載した。
C.glutamicumATCC13032で予想されているTatBをコードする遺伝子配列を含む領域とさらにその5’上流域を、下記の配列番号39(5’-GAGGCGCTGCCTGAAGATTA- 3’)と配列番号40(5’-GACAGGTGAAGAGGTCAAGG- 3’)に示した配列のプライマーを用いたPCR法により増幅した。増幅したPCR産物をアガロースゲル電気泳動により、約1.7kbのDNA断片を回収した。回収したDNA断片を特開平9−070291記載のプラスミドpVC7のSmaI部位に挿入することによって、TatB発現プラスミドpVtatBを構築した。構築したプラスミドは実施例1と同様の方法で挿入したDNA断片の塩基配列を確認した。TatBをコードする遺伝子配列とさらにその5’上流域の遺伝子配列を配列番号41に記載した。このTatB発現プラスミドpVtatBを制限酵素KpnIで消化し、アガロースゲル電気泳動により約1.5kbのDNA断片を回収した。このDNA 断片はtatBのプロモーター領域とTatBをコードする遺伝子配列を含んでいる。この断片を実施例6(2)で作製したプラスミドpVtatACのKpnI部位に挿入することによりTatA、TatBおよびTatCを発現するプラスミドpVtatABCを構築した。
C.glutamicumATCC13869に実施例3(3−2)で作製したプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ発現プラスミドpPKT-PPGにより形質転換した菌株13869/pPKT-PPGを作製した。さらに上記のプラスミドpVtatC、pVtatAC、pVtatABC各々により形質転換し、カナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むCM2G寒天培地において生育する菌株を選択し、13869/pPKT-PPG/pVtatC、13869/pPKT-PPG /pVtatAC、13869/pPKT-PPG /pVtatABCを得た。これらの株をカナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むMM培地において30℃48時間培養した。培養終了後の培養上清10μlを実施例2(2−3)に記載した方法でSDS-PAGEによる分析を実施した結果、Tat系分泌装置を増幅した13869/pPKT-PPG/pVtatC、13869/pPKT-PPG/pVtatAC、13869/pPKT-PPG/pVtatABCは、Tat系分泌装置増幅前の菌株13869/pPKT-PPGに比較し著しい分泌量の増加を認めた。それぞれの上清を逆相HPLCにおいて実施例2に記載した条件により分析した結果、13869/pPKT-PPGに対し13869/pPKT-PPG/pVtatC、および13869/pPKT-PPG/pVtatACで約3倍、13869/pPKT-PPG/pVtatABCで約10倍の分泌量向上が認められた。
(1)Arthrobactor globiformisに由来するIMDシグナルを用いたトランスグルタミナーゼの分泌発現プラスミドの作製
実施例1により作製したIMDシグナルを用いたイソマルトデキストラナーゼ分泌発現プラスミドpPKI-IMDを鋳型とし、配列番号14と配列番号42(5’-GTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGGCCTGGGCGGAGCCTGC- 3’)に示した配列のプライマーにより、IMDシグナル配列とその5'上流域のCspBプロモーターを含んだ領域を増幅した。配列番号42はIMDシグナル配列のC末端側をコードする遺伝子配列とトランスグルタミナーゼのプロ配列のN末端側をコードする配列を含んでいる。またpPKSPTG1(WO-01/23591記載)を鋳型とし配列番号43(5'-GACAATGGCGCGGGGGAAG- 3' )と配列番号44(5'-GACAATGGCGCGGGGGAAG- 3’)に示した配列のプライマーを用いてPCRを行ない、プロ構造付きトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子配列を増幅した。配列番号14と配列番号42に示した配列のプライマーにより増幅されたPCR産物と、配列番号43と配列番号44に示した配列のプライマーにより増幅されたPCR産物を1:1で混合して鋳型とし、配列番号14と配列番号44に示した配列のプライマーを用いたクロスオーバーPCRを行ない、CspBプロモーターとIMDシグナルとプロ構造付きトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子の融合遺伝子を増幅した。このPCR産物を制限酵素ScaIおよびEcoO65Iにおいて切断し、アガロースゲル電気泳動において約700bpの遺伝子断片を回収した。この回収したDNA断片をpPKSPTG1(WO-01/23591記載)のScaI-EcoO65I領域に挿入することによりプロ構造付きトランスグルタミナーゼ発現プラスミドpPKI-PTG1を作製した。作製したプラスミドの塩基配列は実施例1に記載の方法により決定し、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
(1)で作製したプラスミドpPKI-PTG1によりC.glutamicumATCC13869を形質転換した菌株13869/pPKIPTG1を作製した。この菌株をさらに実施例6(3)で作製したTat分泌装置TatA、TatBおよびTatC発現プラスミpVtatABCにより形質転換後、カナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むCM2G寒天培地において生育する菌株を選択し、Tat系分泌装置増幅株13869/pPKI-PTG1/pVtatABCを得た。
13869/pPKI-PTG1と13869/pPKI-PTG1/pVtatABCをカナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むMM培地において30℃にて48時間培養した。培養終了後、培養上清を実施例2(2−3)に記載した方法でSDS-PAGEを実施した結果、2256/pPKI-PTG1に比較し2256/pPKI-PTG1/pVtatABCでプロ構造付きトランスグルタミナーゼの分泌量の増加が確認された。さらに培養上清を参考例A-3に記載した条件において逆相HPLCで定量した結果、Tat系分泌装置増幅株において分泌量は約7倍であった。
(1)E.coliに由来するTorAシグナルを用いたトランスグルタミナーゼの分泌発現プラスミドの構築
実施例3(3−2)により作製したTorAシグナルを用いたプロテイングルタミナーゼ分泌発現プラスミドpPKT-PPGを鋳型とし、配列番号14と配列番号45(5’-CTTCCCCCGCGCCATTGTCCGCAGTCGCACGTCGCGGCG- 3' )に示した配列のプライマーにより、TorAシグナル配列とその5'上流域のCspBプロモーターを含んだ領域を増幅した。配列番号45に記載の配列はTorAシグナル配列のC末端側をコードする遺伝子配列とトランスグルタミナーゼのプロ配列のN末端側をコードする配列を含んでいる。またpPKSPTG1(WO-01/23591記載)を鋳型とし、配列番号43と配列番号44に示した配列のプライマーを用いてPCRを行い、プロ構造付きトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子配列を増幅した。配列番号14と配列番号45に示した配列のプライマーで増幅されたPCR産物と、配列番号43と配列番号44に示した配列のプライマーで増幅されたPCR産物を1:1で混合して鋳型とし、配列番号14と配列番号44に示した配列のプライマーによりクロスオーバーPCRを行ない、CspBプロモーターとTorAシグナルとプロ構造付きトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子の融合遺伝子を増幅した。このPCR産物をScaIおよびEcoO65Iにおいて切断し、アガロースゲル電気泳動において約700bpの遺伝子断片を回収した。この回収したDNA断片をpPKSPTG1(WO-01/23591記載)のScaI-EcoO65I領域に挿入することによりプロ構造付きトランスグルタミナーゼ発現プラスミドpPKT-PTG1を作製した。作製したプラスミドの塩基配列は前述の方法により決定し、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
実施例8(1)で作製したプラスミドpPKT-PTG1によりC.glutamicumATCC13869を形質転換した菌株13869/pPKTPTG1を作製した。この菌株をさらに実施例8で作製したTat分泌装置TatA、TatBおよびTatC発現プラスミドpVtatABCにより形質転換後、カナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むCM2G寒天培地において生育する菌株を選択し、Tat系分泌装置増幅株13869/pPKTPTG1/pVtatABCを得た。
13869/pPKT-PTG1と13869/pPKT-PTG1/pVtatABCをカナマイシン25mg/lおよびクロラムフェニコール5mg/lを含むMM培地において30℃で48時間培養した。培養終了後、培養上清10μlを実施例2(2−3)に記載した方法でSDS-PAGEを実施した結果、13869/pPKT-PTG1に比較し13869/pPKT-PTG1/pVtatABCでプロ構造付きトランスグルタミナーゼの増加が確認された。また、培養上清を参考例A-3に記載したのと同条件の逆相HPLCで定量した結果、Tat系分泌装置増幅株において分泌量は約40倍であった。
(1)プロテイングルタミナーゼのプロ配列C末端の変更
実施例3及び5において活性が確認されたプロテイングルタミナーゼのN末端アミノ酸配列を解析したところ、天然型プロテイングルタミナーゼと比較して2アミノ酸が付加した配列(NKLASV)であった。そこで、天然型プロテイングルタミナーゼのN末端配列と同じ配列にもつようにプロ配列の切断が行われるよう、プロ配列のC末端配列の変更を行った。天然型プロテイングルタミナーゼのプロ配列のC末端は“QTNK”であるが、SAM-P45で切断されやすいと予想される“FGPK”、subtilisinを主成分とするアルカラーゼ(Novozymes)で切断されやすいと予想される“FGPF”、“FAPF”、“FAPY”、“AHAY”、“AHAL”、“AAPF”、“AAPY”、“AAPM”に変更した。“FGPK”への変更は、配列番号50(CTT GGG GCC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG)と配列番号51(TTC GGC CCC AAG TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT)に示す配列を有するプライマーを用いた。配列番号50の配列は、プロ配列部分を増幅するためのプライマー、配列番号51の配列は、成熟体部分を増幅するためのプライマーである。実施例3(3−2)にて構築したプラスミドpPKT-PPGを鋳型として、配列番号20と配列番号50に示す配列を有するプライマーを用いてプロテイングルタミナーゼのプロ配列部分を、配列番号51と配列番号18に示す配列を有するプライマーを用いてプロテイングルタミナーゼの成熟体部分をそれぞれ増幅した。さらに、これらのPCR産物を1:1で混合し、これらを鋳型として配列番号20と配列番号18に示す配列を有するプライマーを用いてクロスオーバーPCRを実施することにより、プロ配列C末端がFGPKに変更されたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ遺伝子を増幅した。
構築したプラスミドpPKT-PPG(FGPK)を用いて、C. glutamicum ATCC13869を形質転換し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地において30℃、48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを4-20%のグラジエントゲル(第一化薬製)を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク染色を実施した。その結果、予想される分子量付近、約35kDa付近にバンドを検出した。培養上清100μlを逆相HPLCにより分析した結果、タンパク質の濃度は約20mg/lであった。
さらに、同様に実施例2(2-2)と同様に培養上清をウルトラフリー(ミリポア製)により処理した後、放線菌由来プロテアーゼSAM-P45により酵素消化してプロテイングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタンパク質の活性を特許開2000-50887記載の方法を用いて測定し、分泌されたタンパク質が実際にプロテイングルタミナーゼ活性を有していることが確認された。また、成熟化したタンパク質のN末端アミノ酸配列を解析した結果、天然型と同じLASVであることが確認された。更に、成熟化を行う際の酵素として、trypsinやプロテアーゼM(天野エンザイム)を用いた場合にも、天然型と同じN末端を生じることが確認された。
構築したプラスミドpPKT-PPG(FGPF)、pPKT-PPG(FAPF)、pPKT-PPG(FAPY)、pPKT-PPG(AHAY)、pPKT-PPG(AHAL)、pPKT-PPG(AAPF)、pPKT-PPG(AAPY)、pPKT-PPG(AAPM) を用いて、それぞれC. glutamicum ATCC13869を形質転換し、25mg/lのカナマイシンを含むCM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した各菌株を25mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地において30℃、48時間培養した。培養終了後10μlの培養上清をSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEを4-20%のグラジエントゲル(第一化薬製)を用いて行い、クマシーブリリアントブルー染色によりタンパク染色を実施した。その結果、予想される分子量付近、約35kDa付近にバンドを検出した。培養上清100μlを逆相HPLCにより分析した結果、タンパク質の濃度は約20mg/lであった。
さらに、同様に実施例2(2-2)と同様に培養上清をウルトラフリー(ミリポア製)により処理した後、subtilisin(Sigma)またはアルカラーゼ(Novozymes)により酵素消化してプロテイングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタンパク質の活性を特許開2000-50887記載の方法を用いて測定し、分泌されたタンパク質が実際にプロテイングルタミナーゼ活性を有していることが確認された。また、成熟化したタンパク質のN末端アミノ酸配列を解析した結果、天然型と同じLASVであることが確認された。
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配列番号11〜27、33、34、36、37、39、40、42〜45、50〜67:合成オリゴヌクレオチド
Claims (7)
- 5’から3’方向に、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列、Tat系依存シグナルペプチド領域をコードする核酸配列であって配列番号32記載の配列を含む前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、前記異種タンパク質を前記コリネ型細菌に産生およびTat系により分泌させることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法であって、前記シグナルペプチド領域が配列番号28〜30記載のいずれかの配列、または、前記配列において1〜2個のアミノ酸の置換を含みコリネ型細菌においてTat系依存シグナルペプチドとして機能するアミノ配列、を含む、前記方法。
- 5’から3’方向に、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列、Tat系依存シグナルペプチド領域をコードする核酸配列であって配列番号32記載の配列を含む前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、前記異種タンパク質を前記コリネ型細菌に産生およびTat系により分泌させることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法であって、前記シグナルペプチド領域が配列番号6記載のアミノ酸配列または前記配列において1〜2個のアミノ酸の置換を含みコリネ型細菌においてTat系依存シグナルペプチドとして機能するアミノ配列、を含む、前記方法。
- 5’から3’方向に、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列、Tat系依存シグナルペプチド領域をコードする核酸配列であって配列番号32記載の配列を含む前記シグナルペプチド領域をコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、前記異種タンパク質を前記コリネ型細菌に産生およびTat系により分泌させることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法であって、前記シグナルペプチド領域が配列番号8記載のアミノ酸配列または前記配列において1〜2個のアミノ酸の置換を含みコリネ型細菌においてTat系依存シグナルペプチドとして機能するアミノ配列、を含む、前記方法。
- 異種タンパク質がプロテイングルタミナーゼである請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 異種タンパク質がイソマルトデキストラナーゼである請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- コリネ型細菌が、tat系分泌装置をコードする1以上の遺伝子が増幅された株である請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- tat系分泌装置をコードする遺伝子が、tatA、tatB、tatC及びtatEからなる群より選ばれる、請求項6記載の方法。
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