JP2010284170A - 新規アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】天然の甘味アミノ酸であり、ショ糖の数十倍以上に相当する強い甘味を有するモナティンの合成における中間体として有用なIHOGの合成に好適に利用できるアルドラーゼ、および、置換α−ケト酸の製造方法を提供する。
【解決手段】Pseudomonas属、Erwinia属、Flavobacterium属、Xanthomonas属に由来する新規アルドラーゼを用いることにより、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)から、モナティン合成における中間体として有用な4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)を合成する方法。
【選択図】なし
【解決手段】Pseudomonas属、Erwinia属、Flavobacterium属、Xanthomonas属に由来する新規アルドラーゼを用いることにより、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)から、モナティン合成における中間体として有用な4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)を合成する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法に関し、より詳細には、モナティン合成における中間体として有用な4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(4−(Indol−3−ylmethyl)−4−hydroxy−2−oxoglutarate;以下、IHOG)の合成に好適に利用できるアルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法に関する。
下記式(5)に示す構造を有するモナティンは、南アフリカの潅木の根から単離・抽出された天然の甘味アミノ酸であり、ショ糖の数十倍〜数千倍に相当する強い甘味を有し、甘味剤として利用が期待されている。しかし、まだモナティンの有用性に関しては発見されたばかりであり、工業的生産レベルでのモナティンの合成方法に関しては確立されていない。
かかる状況下、本発明者らは、試薬として購入可能であるインドールピルビン酸とピルビン酸とを用いて、下記の反応(1)および(2)からなる新たなモナティンの合成方法を開発した。
(1)インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)のアルドール縮合により前駆体ケト酸(IHOG)を合成する反応工程
(2)IHOGの2位をアミノ化する反応工程
(1)インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)のアルドール縮合により前駆体ケト酸(IHOG)を合成する反応工程
(2)IHOGの2位をアミノ化する反応工程
上記モナティンの合成ルートにおける(1)のアルドール縮合反応について、微生物酵素系を用いてインドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)から前駆体ケト酸(IHOG)を合成させた例は、これまでに報告されていない。
2分子のα−ケト酸(ないしは置換α−ケト酸)を基質としたアルドール縮合を触媒する微生物酵素としては、これまでに、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌由来の4−Hydroxy−4−methyl−2−oxoglutarate aldolase、および、E.coli、B.subtilisなどに存在する4−Hydroxy−2−oxoglutarate aldolaseの2例が報告されている。
前者の4−Hydroxy−4−methyl−2−oxoglutarate aldolaseは、ピルビン酸2分子から4−ヒドロキシ−4−メチル−2−オキソグルタル酸(4−Hydroxy−4−methyl−2−oxoglutarate:4−HMG)を生成する反応、および、4−oxalocitramalateからオキサロ酢酸1分子とピルビン酸1分子を生成する反応を触媒することが報告されている(非特許文献1)。また、後者の4−Hydroxy−2−oxoglutarate aldolaseは、グリオキシル酸1分子とピルビン酸1分子から4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(4−Hydroxy−2−oxoglutarate:4HG)を生成する反応を触媒することが知られている。
しかし、これらのいずれの菌株からも、4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(以下、PHOG)分解活性や、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)からモナティンの前駆体ケト酸(IHOG)を合成する活性についての報告・知見は全く無く、これらの菌株が産生するアルドラーゼを上述のモナティンの合成ルートに使用できるかについては不明であった。
Kiyofumi Maruyama、Journal of Biochemistry,108,327−333(1990)
本発明は、モナティン合成における中間体として有用なIHOGの合成に好適に利用できるアルドラーゼ、および、置換α−ケト酸の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記問題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ある種の微生物に、目的とするIHOGの合成に好適に利用できるアルドラーゼが存在することを見出し、本発明に想到した。
即ち、本発明は以下の通りである。
〔1〕 下記(a)または(b)のDNA。
(a)配列表の配列番号1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列からなるDNA
(b)配列表の配列番号1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
〔2〕 下記(c)または(d)のDNA。
(c)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
〔3〕 下記(e)または(f)のDNA。
(e)配列表の配列番号15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号398〜1141の塩基配列からなるDNA
(f)配列表の配列番号15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号398〜1141の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
〔4〕 下記(g)または(h)のDNA。
(g)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(h)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
〔5〕 〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のDNAとベクターDNAとを接続して得られることを特徴とする組換えDNA。
〔6〕 〔5〕記載の組換えDNAによって形質転換された細胞。
〔7〕 〔6〕記載の細胞を培地中で培養し、培地および/または細胞中にアルドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするアルドラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
〔8〕 下記(i)または(j)のタンパク質。
(i)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質
(j)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔9〕 下記(k)または(l)のタンパク質。
(k)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(l)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔10〕 (A)インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性、および/または、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有し、
(B)(A)記載の活性の至適pHが33℃において約9であり、かつ、
(C)ゲルろ過法により測定した分子量が約146kDaであり、SDS−PAGE法により測定したサブユニットあたりの分子量が約25kDaである
ことを特徴とするタンパク質。
〔11〕 (A)アルドラーゼ活性を有するタンパク質であって、
(B)シュードモナス(Pseudomonas)属に由来し、
(C)pH6以上でpH安定性を有し、
(D)70℃以下で温度安定性を有し、かつ、
(E)ゲルろ過法により測定した分子量が約146kDaであり、SDS−PAGE法により測定したサブユニットあたりの分子量が約25kDaである
ことを特徴とするタンパク質。
〔12〕 酵素反応系に無機リン酸を含有させることによって、前記アルドラーゼ活性が向上することを特徴とする〔11〕記載のタンパク質。
〔13〕 シュードモナス(Pseudomonas)属細菌を培地中で培養し、培地および/または細胞中に下記(i)〜(l)のうちいずれかのタンパク質を蓄積させ、前記培地および/または細胞を精製処理することにより得られるアルドラーゼ活性を有する組成物。
(i)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質
(j)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
(k)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(l)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔14〕 下記一般式(1)
〔1〕 下記(a)または(b)のDNA。
(a)配列表の配列番号1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列からなるDNA
(b)配列表の配列番号1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
〔2〕 下記(c)または(d)のDNA。
(c)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
〔3〕 下記(e)または(f)のDNA。
(e)配列表の配列番号15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号398〜1141の塩基配列からなるDNA
(f)配列表の配列番号15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号398〜1141の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
〔4〕 下記(g)または(h)のDNA。
(g)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(h)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
〔5〕 〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のDNAとベクターDNAとを接続して得られることを特徴とする組換えDNA。
〔6〕 〔5〕記載の組換えDNAによって形質転換された細胞。
〔7〕 〔6〕記載の細胞を培地中で培養し、培地および/または細胞中にアルドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするアルドラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
〔8〕 下記(i)または(j)のタンパク質。
(i)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質
(j)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔9〕 下記(k)または(l)のタンパク質。
(k)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(l)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔10〕 (A)インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性、および/または、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有し、
(B)(A)記載の活性の至適pHが33℃において約9であり、かつ、
(C)ゲルろ過法により測定した分子量が約146kDaであり、SDS−PAGE法により測定したサブユニットあたりの分子量が約25kDaである
ことを特徴とするタンパク質。
〔11〕 (A)アルドラーゼ活性を有するタンパク質であって、
(B)シュードモナス(Pseudomonas)属に由来し、
(C)pH6以上でpH安定性を有し、
(D)70℃以下で温度安定性を有し、かつ、
(E)ゲルろ過法により測定した分子量が約146kDaであり、SDS−PAGE法により測定したサブユニットあたりの分子量が約25kDaである
ことを特徴とするタンパク質。
〔12〕 酵素反応系に無機リン酸を含有させることによって、前記アルドラーゼ活性が向上することを特徴とする〔11〕記載のタンパク質。
〔13〕 シュードモナス(Pseudomonas)属細菌を培地中で培養し、培地および/または細胞中に下記(i)〜(l)のうちいずれかのタンパク質を蓄積させ、前記培地および/または細胞を精製処理することにより得られるアルドラーゼ活性を有する組成物。
(i)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質
(j)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
(k)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(l)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔14〕 下記一般式(1)
(一般式(1)において、R1は、水素、炭素数1〜8のアルキル基、炭素数1〜8のアルコキシル基、炭素数2〜9のカルボキシアルキル基、炭素数20までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数11までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。R1は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数3までのアルキル基、炭素数3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換基により置換されていてもよい。)
で表される置換α−ケト酸と、
下記一般式(2)
で表される置換α−ケト酸と、
下記一般式(2)
(一般式(2)において、R2は、水素、炭素数1〜8のアルキル基、炭素数1〜8のアルコキシル基、炭素数2〜9のカルボキシアルキル基、炭素数20までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数11までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。R2は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数3までのアルキル基、炭素数3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換基により置換されていてもよい。ただし、一般式(1)において、R1が水素、メチル基またはカルボキシメチル基である場合は、R2は水素ではない。)で表される置換α−ケト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式(3)
下記一般式(3)
(一般式(3)におけるR1およびR2は、一般式(1)および(2)におけるR1およびR2と同義である。)
で表される置換α−ケト酸を製造する方法であって、
当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
〔15〕 前記R2は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、〔14〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔16〕 前記R2は、水素であることを特徴とする、〔15〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔17〕 前記R1は、ベンジル基または3−インドリルメチル基であり、前記R2は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、〔14〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔18〕 インドール−3−ピルビン酸と、オキサロ酢酸またはピルビン酸とから、下記式(4)
で表される置換α−ケト酸を製造する方法であって、
当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
〔15〕 前記R2は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、〔14〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔16〕 前記R2は、水素であることを特徴とする、〔15〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔17〕 前記R1は、ベンジル基または3−インドリルメチル基であり、前記R2は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、〔14〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔18〕 インドール−3−ピルビン酸と、オキサロ酢酸またはピルビン酸とから、下記式(4)
に表す置換α−ケト酸を製造する方法であって、当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
〔19〕 前記反応を触媒するタンパク質は、シュードモナス(Pseudomonas)属、エルウィニア(Erwinia)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、キサントモナス(Xanthomonas)属からなる群から選ばれる微生物に由来することを特徴とする、〔14〕〜〔18〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔20〕 前記微生物は、シュードモナス タエトロレンス(Pseudomonas taetrolens)、シュードモナス コロナファシエンス(Pseudomonas coronafaciens)、シュードモナス デスモリティカ(Pseudomonas desmolytica)、エルウィニア エスピー(Erwinia sp.)、フラボバクテリウム レナム(Flavobacterium rhenanum)、またはキサントモナス シトリ(Xanthomonas citri)であることを特徴とする〔19〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔21〕 前記微生物は、シュードモナス タエトロレンス(Pseudomonas taetrolens) ATCC4683、またはシュードモナス コロナファシエンス(Pseudomonas coronafaciens) AJ2791であることを特徴とする〔20〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔22〕 前記反応を触媒するタンパク質は、下記(i)〜(l)のうちいずれかのタンパク質であることを特徴とする〔14〕〜〔21〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
(i)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質
(j)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
(k)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(l)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔23〕 下記一般式(1’)
〔19〕 前記反応を触媒するタンパク質は、シュードモナス(Pseudomonas)属、エルウィニア(Erwinia)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、キサントモナス(Xanthomonas)属からなる群から選ばれる微生物に由来することを特徴とする、〔14〕〜〔18〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔20〕 前記微生物は、シュードモナス タエトロレンス(Pseudomonas taetrolens)、シュードモナス コロナファシエンス(Pseudomonas coronafaciens)、シュードモナス デスモリティカ(Pseudomonas desmolytica)、エルウィニア エスピー(Erwinia sp.)、フラボバクテリウム レナム(Flavobacterium rhenanum)、またはキサントモナス シトリ(Xanthomonas citri)であることを特徴とする〔19〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔21〕 前記微生物は、シュードモナス タエトロレンス(Pseudomonas taetrolens) ATCC4683、またはシュードモナス コロナファシエンス(Pseudomonas coronafaciens) AJ2791であることを特徴とする〔20〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
〔22〕 前記反応を触媒するタンパク質は、下記(i)〜(l)のうちいずれかのタンパク質であることを特徴とする〔14〕〜〔21〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
(i)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質
(j)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
(k)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(l)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔23〕 下記一般式(1’)
(一般式(1’)において、R1は、水素、炭素数1〜8のアルキル基、炭素数1〜8のアルコキシル基、炭素数2〜9のカルボキシアルキル基、炭素数20までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数11までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体であり、R3は、水素またはカルボキシル基である。R1は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数3までのアルキル基、炭素数3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。)
で表される化合物と、
下記一般式(2’)
で表される化合物と、
下記一般式(2’)
(一般式(2’)において、R4は、水素、炭素数1〜8のアルキル基、炭素数1〜8のアルコキシル基、炭素数2〜9のカルボキシアルキル基、炭素数20までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数11までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。R4は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数3までのアルキル基、炭素数3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。)で表される置換α−ケト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式(3’)
下記一般式(3’)
(一般式(3’)におけるR1、R3およびR4は、一般式(1’)および(2’)におけるR1、R3およびR4と同義である。)
で表される置換α−ケト酸を製造する方法であって、
〔8〕または〔9〕のいずれかに記載のタンパク質の存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
〔24〕 前記R4は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、〔23〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
で表される置換α−ケト酸を製造する方法であって、
〔8〕または〔9〕のいずれかに記載のタンパク質の存在下で反応を実施することを特徴とする、置換α−ケト酸の製造方法。
〔24〕 前記R4は、水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、〔23〕記載の置換α−ケト酸の製造方法。
以下、本発明について、
[I]アルドラーゼ
[II]アルドラーゼを用いた置換α−ケト酸の製造方法
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
[I]アルドラーゼ
[II]アルドラーゼを用いた置換α−ケト酸の製造方法
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
[I]アルドラーゼ
本発明者らの研究により、Pseudomonas属、Erwinia属、Flavobacterium属、Xanthomonas属に、4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(PHOG)の分解活性を有するアルドラーゼを生成する菌株が存在することが確認された。
本発明者らの研究により、Pseudomonas属、Erwinia属、Flavobacterium属、Xanthomonas属に、4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(PHOG)の分解活性を有するアルドラーゼを生成する菌株が存在することが確認された。
これらの微生物が産生するアルドラーゼは、PHOG1分子を分解して、フェニルピルビン酸1分子およびピルビン酸1分子を生成する反応を触媒することから、本発明者らは、当該アルドラーゼが、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)から4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)を合成する反応を触媒しうると考えた。この考えに基づき、本発明者らは、新規アルドラーゼの存在を明らかにすべく、当該菌株の培養菌体からアルドラーゼを精製単離するとともに、この酵素がインドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)のアルドール縮合によりIHOGを合成することを発見した。
また、本発明者らは、Pseudomonas taetrolens ATCC4683由来のアルドラーゼ(以下、PtALDと略す場合がある)を精製し、該アルドラーゼのアミノ酸配列を決定した。さらに、該アルドラーゼのアミノ酸配列から演繹した30塩基対程度のDNA分子を合成し、これを用いてPCR法により当該アルドラーゼをコードするDNAの一部を単離・取得し、さらに該DNA断片をプローブとして利用し、PtALDをコードするDNA全長をこの微生物の染色体ライブラリーから単離することに成功した。
上記方法によって特定された本発明のPtALDをコードするDNAを配列表の配列番号1に示す。また、配列表の配列番号2および3に、配列表の配列番号1の塩基配列がコードするPtALDのアミノ酸配列を示す。配列表の配列番号2は、配列表の配列番号1記載の塩基配列のうち、塩基番号456〜1118の塩基配列がコードするPtALDのアミノ酸配列である。また、配列表の配列番号3は、配列表の配列番号1記載の塩基配列のうち、塩基番号444〜1118の塩基配列がコードするPtALDのアミノ酸配列であり、配列番号2記載のアミノ酸配列中、残基番号5〜225のアミノ酸配列に相当する。配列表の配列番号2および3記載のいずれのPtALDも、アルドラーゼ活性を有し、インドールピルビン酸1分子とオキサロ酢酸(ないしピルビン酸)1分子から、下記式(4)に示す4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)を合成する反応を触媒する。
さらに、本発明者らは、取得したPtALDをコードするDNA断片をプローブとして利用し、Pseudomonas coronafaciens ATCC4683由来のアルドラーゼ(以下、PcALDと略す場合がある)をコードするDNA全長を、該微生物の染色体遺伝子ライブラリーから単離することに成功した。上記方法によって特定された本発明のPcALDをコードするDNAを配列表の配列番号15に示す。また、配列表の配列番号16に、配列表の配列番号15の塩基配列がコードするPcALDのアミノ酸配列を示す。配列表の配列番号16は、配列表の配列番号15記載の塩基配列のうち、塩基番号398〜1141の塩基配列がコードするPcALDのアミノ酸配列である。配列表の配列番号16記載のPcALDもまたアルドラーゼ活性を有し、インドールピルビン酸1分子とオキサロ酢酸(ないしピルビン酸)1分子から、下記式(4)に示す4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)を合成する反応を触媒する。
次に、本発明のアルドラーゼについて、
(1)アルドラーゼをコードするDNA、
(2)アルドラーゼの性質、
(3)アルドラーゼの製造方法
の順に詳細に説明する。
(1)アルドラーゼをコードするDNA、
(2)アルドラーゼの性質、
(3)アルドラーゼの製造方法
の順に詳細に説明する。
(1)アルドラーゼをコードするDNA
配列表の配列番号1の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子は、前述したようにPseudomonas taetrolens ATCC4683株の染色体DNAから単離されたものである。配列表の配列番号1の塩基配列は、既知のPseudomonas ochraceae細菌由来の4−Hydroxy−4−methyl−2−oxoglutarate aldolase(遺伝子名proA)(Biosci.Biotechnol.Biochem.,65(12),2701−2709(2001)Maruyama K.,et.al.,)とアミノ酸配列において、29%の相同性を示す。
配列表の配列番号1の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子は、前述したようにPseudomonas taetrolens ATCC4683株の染色体DNAから単離されたものである。配列表の配列番号1の塩基配列は、既知のPseudomonas ochraceae細菌由来の4−Hydroxy−4−methyl−2−oxoglutarate aldolase(遺伝子名proA)(Biosci.Biotechnol.Biochem.,65(12),2701−2709(2001)Maruyama K.,et.al.,)とアミノ酸配列において、29%の相同性を示す。
また、配列表の配列番号15の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子は、前述したようにPseudomonas coronafaciens AJ2791株の染色体DNAから単離されたものである。配列表の配列番号15の塩基配列は、既知のPseudomonas ochraceae細菌由来の4−Hydroxy−4−methyl−2−oxoglutarate aldolase (遺伝子名proA)(Biosci.Biotechnol.Biochem.,65(12),2701−2709(2001)Maruyama K.,et.al.,)とアミノ酸配列において、28%の相同性を示し、また、上述の本発明のPseudomonas taetrolens ATCC4683株由来のアルドラーゼと41%の相同性を示す。
なお、ここでの相同性の解析は、遺伝子解析ソフト「Genetyx ver.6」(ゲネティクス社)を用い、パラメータを初期設定値として算出した値である。
アルドラーゼ産生菌からアルドラーゼをコードするDNAを取得する方法について説明する。
はじめに、精製されたアルドラーゼのアミノ酸配列を決定する。この際、エドマン法(Edman,P.,Acta Chem.Scand.4,227(1950))を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またApplied Biosystems社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。本発明のPseudomonas taetrolens ATCC4683株由来アルドラーゼについて、プロテアーゼで限定分解した後に逆相HPLCにてペプチド断片を分取し、それら断片のうち2つについて内部アミノ酸配列を決定したところ、配列表配列番号4および5に示される配列が明らかとなった。
明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするDNAの塩基配列を演繹できる。DNAの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
演繹された塩基配列に基づいて、30塩基対程度のDNA分子を合成する。該DNA分子を合成する方法はTetrahedron Letters,22,1859(1981)に開示されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサイザーを用いて該DNA分子を合成できる。該DNA分子は、アルドラーゼをコードするDNA全長を、アルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、本発明のアルドラーゼをコードするDNAをPCR法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、PCR法を用いて増幅されるDNAはアルドラーゼをコードするDNA全長を含んでいないので、PCR法を用いて増幅されるDNAをプローブとして用いて、アルドラーゼをコードするDNA全長をアルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
PCR法の操作については、White,T.J.et al.,Trends Genet.5,185(1989)等に記載されている。染色体DNAを調製する方法、さらにDNA分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするDNA分子を単離する方法については、Molecular Cloning,2nd edition,Cold Spring Harbor press(1989)等に記載されている。
単離されたアルドラーゼをコードするDNAの塩基配列を決定する方法は、APractical Guide to Molecular Cloning,John Wiley & Sons,Inc.(1985)に記載されている。また、Applied Biosystems社製のDNAシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。Pseudomonas taetrolens ATCC4683株由来アルドラーゼをコードするDNAを配列表配列番号1に示し、Pseudomonas coronafaciens AJ2791株由来アルドラーゼをコードするDNAを配列表配列番号15に示す。
なお、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)からIHOGを合成する反応を触媒するアルドラーゼをコードするDNAは、配列表の配列番号1および15に示されるDNAだけではない。すなわち、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)からIHOGを合成する反応を触媒するアルドラーゼを生成するPseudomonas属のうち、種および株ごとに、塩基配列の違いが観察されるはずだからである。
また、本発明のDNAは単離されたアルドラーゼをコードするDNAのみではなく、当然ながら、アルドラーゼ産生菌の染色体DNAから単離されたアルドラーゼをコードするDNAに人工的に変異を加えたDNAであっても、アルドラーゼをコードする場合には、本発明のDNAである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Method. in Enzymol.,154(1987)に記載されている部位特異的変異導入法がある。
また、配列表配列番号1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明のDNAである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば50%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である37℃、0.1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは65℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。また、「アルドラーゼ活性」とは、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)からIHOGを合成する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、33℃、pH9の条件下で配列表の配列番号2または3に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の10%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは70%以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
また、配列表配列番号15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明のDNAである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば50%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である37℃、0.1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは65℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。また、「アルドラーゼ活性」とは、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)からIHOGを合成する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、33℃、pH9の条件下で配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の10%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは70%以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
さらに、配列表の配列番号1または15に記載のDNAがコードするアルドラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするDNAも本発明のDNAである。すなわち、
(a)配列表の配列番号1記載の塩基配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列からなるDNA
(b)配列表の配列番号1記載の塩基配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(e)配列表の配列番号15記載の塩基配列中塩基番号398〜1141の塩基配列からなるDNA
(f)配列表の配列番号15記載の塩基配列中塩基番号398〜1141の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(g)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(h)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
も本発明のDNAである。ここで、「1若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、アルドラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、1〜50個、好ましくは1〜30個、さらに好ましくは1〜10個である。また、「アルドラーゼ活性」とは、前述のとおり、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)からIHOGを合成する活性を意味する。ただし、配列表の配列番号2、3または16に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、33℃、pH9の条件下で33℃、pH9の条件下で配列表の配列番号2、3または16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の10%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは70%以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
(a)配列表の配列番号1記載の塩基配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列からなるDNA
(b)配列表の配列番号1記載の塩基配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(e)配列表の配列番号15記載の塩基配列中塩基番号398〜1141の塩基配列からなるDNA
(f)配列表の配列番号15記載の塩基配列中塩基番号398〜1141の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(g)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(h)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
も本発明のDNAである。ここで、「1若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、アルドラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、1〜50個、好ましくは1〜30個、さらに好ましくは1〜10個である。また、「アルドラーゼ活性」とは、前述のとおり、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)からIHOGを合成する活性を意味する。ただし、配列表の配列番号2、3または16に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、33℃、pH9の条件下で33℃、pH9の条件下で配列表の配列番号2、3または16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の10%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは70%以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
(2)アルドラーゼの性質
つぎに、精製されたPseudomonas taetrolens ATCC4683株由来アルドラーゼ(PtALD)およびPseudomonas coronafaciens AJ2791株由来アルドラーゼ(PcALD)の性質について説明する。
つぎに、精製されたPseudomonas taetrolens ATCC4683株由来アルドラーゼ(PtALD)およびPseudomonas coronafaciens AJ2791株由来アルドラーゼ(PcALD)の性質について説明する。
本発明のPtALDは前述した遺伝子の単離と解析より明らかにされるように、配列表配列番号2または3に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配列表の配列番号2および3に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をも含むものである。
また、本発明のPcALDは前述した遺伝子の単離と解析より明らかにされるように、配列表配列番号16に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配列表の配列番号16に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をも含むものである。
すなわち、本発明のアルドラーゼは、下記(i)〜(l)のタンパク質である。
(i)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中、残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質
(j)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中、残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
(k)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(l)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
(i)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中、残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質
(j)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中、残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
(k)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(l)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
ここで、「数個」および「アルドラーゼ活性」の定義は(1)アルドラーゼをコードするDNAの項の説明と同義である。
本発明のアルドラーゼは、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)からアルドール縮合により4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)を合成する反応を触媒する。
本発明のアルドラーゼのアルドラーゼ活性の測定は、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)から生成するIHOG量を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定することにより行うことが可能である。
具体的には、100mM バッファー、50mM インドール−3−ピルビン酸、250mM ピルビン酸、1mM MgCl2、1%(v/v) トルエンからなる反応液にアルドラーゼを添加し、33℃で4時間振とう反応させ、HPLCにて生成したIHOG量を定量することにより、アルドラーゼ活性を見積もることができる。
IHOGの定量は、例えば、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS−2 」(5μm,4.6×250mm)を利用したHPLC分析にて定量できる。分析条件の一例を以下に示す。
移動相:40%(v/v) アセトニトリル/5mM リン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速:1ml/min
カラム温度:40℃
検出:UV210nm
流速:1ml/min
カラム温度:40℃
検出:UV210nm
本発明のアルドラーゼは、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)のアルドール縮合によりIHOGを合成する反応を触媒できる。2分子のα−ケト酸(ないしは置換α−ケト酸)を基質としたアルドール縮合を触媒する微生物酵素としては、これまでに、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌由来の4−Hydroxy−4−methyl−2−oxoglutarate aldolase、および、E. coli、B.subtilisなどに存在する4−Hydroxy−2−oxoglutarate aldolaseの2例が報告されているが、前者についてはPHOGあるいはIHOGに作用するといった知見・報告は全く無く、この酵素をもちいてPHOG(およびIHOG)を合成することが可能であるかについては全く不明であった。また、後者についてはPHOG分解活性が認められず、この酵素を用いてもPHOG(およびIHOG)の合成は不可能であった。すなわち、本発明のアルドラーゼは、今まで報告されていたアルドラーゼと異なり、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)のアルドール縮合によりIHOGを合成する反応を触媒できる点に特徴を有するものである。
つぎに、精製されたPtALDについて調べた酵素化学的性質を以下に述べる。
PtALDは、下記一般式(1’)
(一般式(1’)において、R1は、水素、炭素数1〜8のアルキル基、炭素数1〜8のアルコキシル基、炭素数2〜9のカルボキシアルキル基、炭素数20までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数11までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体であり、R3は、水素またはカルボキシル基である。R1は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数3までのアルキル基、炭素数3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。)
で表される化合物と、
下記一般式(2’)
で表される化合物と、
下記一般式(2’)
(一般式(2’)において、R4は、水素、炭素数1〜8のアルキル基、炭素数1〜8のアルコキシル基、炭素数2〜9のカルボキシアルキル基、炭素数20までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数11までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。R4は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数3までのアルキル基、炭素数3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。)で表される置換α−ケト酸とから、
下記一般式(3’)
下記一般式(3’)
(一般式(3’)におけるR1、R3およびR4は、一般式(1’)および(2’)におけるR1、R3およびR4と同義である。)
で表される置換α−ケト酸を生成する反応を触媒する。したがって、本発明のPtALDを用いて一般式(1’)および一般式(2’)から一般式(3’)を製造する方法も本発明に属する。ここで、前記R4は、水素またはカルボキシル基であることが好ましい。
で表される置換α−ケト酸を生成する反応を触媒する。したがって、本発明のPtALDを用いて一般式(1’)および一般式(2’)から一般式(3’)を製造する方法も本発明に属する。ここで、前記R4は、水素またはカルボキシル基であることが好ましい。
PtALDの至適pHは、33℃において、約9付近にある。また、pH6以上でpH安定性を有し、特にpH6〜11の範囲で高いpH安定性を有する。また、70℃以下で温度安定性を有し、特に20〜60℃の範囲内で高い温度安定性を有する。また、PtALDは、酵素反応系にKPi等の無機リン酸を添加することにより、アルドラーゼ活性が向上する性質を有する。
PtALDの分子量をゲル濾過法により測定したところ約146kDaであり、SDS−PAGE法により測定したところ約25kDaであったことから、PtALDは、分子量約25kDaのサブユニット6量体構造をとると推察される。
(3)アルドラーゼの製造方法
次に本発明のアルドラーゼの製造方法について説明する。本発明のアルドラーゼの製造方法としては、(i)アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法と、(ii)組み換えDNA技術によりアルドラーゼを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法の2つがある。
次に本発明のアルドラーゼの製造方法について説明する。本発明のアルドラーゼの製造方法としては、(i)アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法と、(ii)組み換えDNA技術によりアルドラーゼを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法の2つがある。
(i)微生物培養により生成蓄積する方法
アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法において、アルドラーゼの取得源となる微生物としてはPseudomonas属、Erwinia属、Flavobacterium属、Xanthomonas属に属する微生物があげられる。
アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法において、アルドラーゼの取得源となる微生物としてはPseudomonas属、Erwinia属、Flavobacterium属、Xanthomonas属に属する微生物があげられる。
Pseudomonas属、Erwinia属、Flavobacterium属、Xanthomonas属のうち、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)から前駆体ケト酸(IHOG)を合成する反応を触媒するアルドラーゼを生成する微生物であれば、いかなるものも本発明に使用可能であるが、Pseudomonas taetrolens ATCC4683、Pseudomonas coronafaciens AJ2791、Pseudomonas desmolytica AJ1582、Erwinia sp. AJ2917、Xanthomonas citri AJ2797、Flavobacterium rhenanum AJ2468がより好ましい。このうち、特にPseudomonas taetrolens ATCC4683、Pseudomonas coronafaciens AJ2791が好ましい。これらの微生物の寄託先を下記に示す。
(1)Pseudomonas coronafaciens AJ2791株
(i)受託番号 FERM BP−8246(FERM P−18881より移管)
(ii)受託日 2002年6月10日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(i)受託番号 FERM BP−8246(FERM P−18881より移管)
(ii)受託日 2002年6月10日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(2)Pseudomonas desmolytica AJ1582株
(i)受託番号 FERM BP−8247(FERM P−18882より移管)
(ii)受託日 2002年6月10日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(i)受託番号 FERM BP−8247(FERM P−18882より移管)
(ii)受託日 2002年6月10日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(3)Erwinia sp. AJ2917株
(i)受託番号 FERM BP−8245(FERM P−18880より移管)
(ii)受託日 2002年6月10日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(i)受託番号 FERM BP−8245(FERM P−18880より移管)
(ii)受託日 2002年6月10日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(4)Flavobacterium rhenanum AJ2468株
(i)受託番号 FERM BP−1862
(ii)受託日 1985年9月30日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(i)受託番号 FERM BP−1862
(ii)受託日 1985年9月30日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(5)Xanthomonas citri AJ2797株
(i)受託番号 FERM BP−8250(FERM P−8462より移管)
(ii)受託日 1985年9月30日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(i)受託番号 FERM BP−8250(FERM P−8462より移管)
(ii)受託日 1985年9月30日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
アルドラーゼの取得源となる微生物の培養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養培地の栄養源としては、微生物培養に通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用できる。使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを使用できる。
通気条件としては、好気条件を採用する。培養温度としては、菌が発育し、アルドラーゼが生産される範囲であれば良い。従って、厳密な条件は無いが、通常10〜50℃、好ましくは30〜40℃である。培養時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、アルドラーゼが最も生産される時間まで培養すれば良く、通常5時間〜7日間、好ましくは10時間〜3日間程度である。
培養後、菌体を遠心分離(たとえば、10,000xg、10分)により集菌する。アルドラーゼの大部分は菌体中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させることにより、アルドラーゼの可溶化を行う。菌体破砕には、超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
アルドラーゼ産生菌由来のアルドラーゼを精製する場合、酵素可溶化液を出発材料として精製することになるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在するようであれば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈殿する残査を除いた方が、精製に有利である。
アルドラーゼの精製には、通常酵素の精製を行うために用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等を採用することができる。その結果、より比活性が高いアルドラーゼ含有画分を得ることができる。
(ii)組み換えDNA技術による製法
次に、組み換えDNA技術によってアルドラーゼを製造する方法について説明する。組み換えDNA技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えDNA技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
次に、組み換えDNA技術によってアルドラーゼを製造する方法について説明する。組み換えDNA技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えDNA技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
図1は、本発明のアルドラーゼの製造工程のフローチャートである。
先ず、本発明のアルドラーゼをコードするDNAを調製する(ステップS1)。
次に、調製したDNAをベクターDNAと接続して組み換えDNAを作製し(ステップS2)、該組み換えDNAによって細胞を形質転換して形質転換体を作製する(ステップS3)。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中および/または細胞中にアルドラーゼを生成蓄積させる(ステップS4)。
その後、ステップS5に進み、該酵素を回収・精製することによって精製アルドラーゼを製造する。
また、ステップS5で生産した精製アルドラーゼまたはステップS4のアルドラーゼが蓄積された培地および/または細胞をアルドール反応に用いることで、目的とする置換α−ケト酸を大量に製造することができる(ステップS6)。
なお、ベクターDNAと接続されるDNAは、本発明のアルドラーゼが発現可能であればよい。
ここで、ベクターDNAに接続されるアルドラーゼ遺伝子としては、上述の
(a)配列表の配列番号1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列からなるDNA
(b)配列表の配列番号1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(e)配列表の配列番号15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号398〜1141の塩基配列からなるDNA
(f)配列表の配列番号15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号398〜1141の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(g)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(h)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
などを使用できる。
(a)配列表の配列番号1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列からなるDNA
(b)配列表の配列番号1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号444〜1118若しくは塩基番号456〜1118の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列又は同配列中残基番号5〜225のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(e)配列表の配列番号15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号398〜1141の塩基配列からなるDNA
(f)配列表の配列番号15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号398〜1141の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(g)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(h)配列表の配列番号16記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
などを使用できる。
タンパクを組み換えDNA技術を用いて大量生産する場合、該タンパクを生産する形質転換体内で該タンパクが会合し、タンパクの封入体(inclusion body)を形成させることが好ましい。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク封入体は、タンパク変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパクに変換される。例えば、ヒトインターロイキン−2の活性再生(特開昭61−257931号公報)等多くの例がある。
タンパク封入体から活性型タンパクを得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパクを生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパクを菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパクを封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパクを単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパクとの融合タンパクとして発現させる方法がある。
さらに、融合タンパクとして発現させた後に、目的のタンパクを切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
タンパクを組み換えDNA技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。宿主−ベクター系が開発されている細菌細胞としてはエシェリヒア属細菌、シュードモナス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、バチルス属細菌などが挙げられるが、好ましくはエシェリヒア・コリが用いられる。エシェリヒア・コリを用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてアルドラーゼを製造する方法を説明する。
アルドラーゼをコードするDNAを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、T7プロモータ、trpプロモータ、lacプロモータ、tacプロモータ、PLプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
アルドラーゼを融合タンパク封入体として生産させるためには、アルドラーゼ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク遺伝子とする。このような他のタンパクをコードする遺伝子としては、融合タンパクの蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパクの溶解性を高めるものであればよく、例えば、T7gene 10、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−2遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
これらの遺伝子とアルドラーゼをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成DNAを利用すればよい。
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネータとしては、T7ターミネータ、fdファージターミネータ、T4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌trpA遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、Col E1由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やUV照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている(pUC系(宝酒造(株)製)、pPROK系(クローンテック製)、pKK233−2(クローンテック製)ほか)。
プロモータ、アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子、ターミネータの順に連結したDNA断片と、ベクターDNAとを連結して組み換えDNAを得る。
該組み換えDNAを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクが発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、特にエシェリヒア・コリ JM109(DE3)株、JM109株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はMolecular Cloning,2nd edition,Cold Spring Harbor press(1989)等に記載されている。
融合タンパクとして発現させた場合、血液凝固因子Xa、カリクレインなどの、アルドラーゼ内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてアルドラーゼを切り出せるようにしてもよい。
生産培地としては、M9−カザミノ酸培地、LB培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクを回収するには、以下の方法などがある。アルドラーゼあるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりアルドラーゼあるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、アルドラーゼあるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
タンパク封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパクとともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸(例えば、6M、pH5〜8)や尿素(例えば8M)などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパクとして再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては20mM〜0.5M、pHとしては5〜8が挙げられる。
再生工程時のタンパク濃度は、500μg/ml程度以下に抑えるのが好ましい。再生したアルドラーゼが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は5℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
また、当該アルドラーゼ遺伝子がシュードモーナス属細菌に由来するものである場合、好ましい一つの様態として、シュードモーナス属細菌を宿主として該アルドラーゼを発現・生産せしめることもできる。この場合の宿主細胞としては、例えばShi−En LuらはPseudomonas syringaeでの組み換え発現法を報告している(FEMS Microbiology Letters 210(2002)p115−121)。また、Olsen,R.H.らはPseudomonas aeruginosaでの組換え発現法について報告している(Journal of Bacteriology,(1982)150,p60−69)。またGrapner,S.らはPseudomonas stutzeriでの組換え発現法について報告している(Biomol. Eng.,(2000),17,p11−16)。ただし、アルドラーゼ発現のための宿主細胞としてのシュードモナス属細菌はこれらに限定されるわけではない。
次にアルドラーゼ遺伝子をシュードモナス属細菌に導入するためのベクターについてであるが、シュードモナス属細菌細胞内で機能する複製開始点を有するプラスミドを用いることが出来る。例を挙げるとEza KalyaevaらはPseudomonas aeruginosaで機能するレプリコンTFKを有するプラスミドpKLH4.05を報告している。また、グラム陰性細菌の形質転換に用いられる、いわゆる広宿主域ベクターを用いることも出来る。これらのベクターとしてはRK404(Ditta,G.ら、Plasmid 13(1985)p149−153)やRSF1010(Frey,J.ら、Gene 24(1982)p289−296)などがシュードモナス属細菌でも機能することが知られている。
アルドラーゼをコードするDNAとして、配列表配列番号1に示されるDNAを用いた場合には配列番号2または3に記載のアミノ酸配列を有するアルドラーゼが生産され、配列表配列番号15に示されるDNAを用いた場合には配列番号16に記載のアミノ酸配列を有するアルドラーゼが生産される。
[II]アルドラーゼを用いた置換α−ケト酸の製造方法
次に、本発明の置換α−ケト酸の製造方法について述べる。本発明の置換α−ケト酸の製造方法は、下記一般式(1)
次に、本発明の置換α−ケト酸の製造方法について述べる。本発明の置換α−ケト酸の製造方法は、下記一般式(1)
で表される置換α−ケト酸と、
下記一般式(2)
下記一般式(2)
で表される置換α−ケト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式(3)
下記一般式(3)
で示される置換α−ケト酸を製造する方法であって、
当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施する点に特徴を有する。
当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施する点に特徴を有する。
一般式(1)において、R1は、炭素数1〜8のアルキル基、炭素数1〜8のアルコキシル基、炭素数2〜9のカルボキシアルキル基、炭素数20までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数11までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。R1は、更にハロゲン原子、水酸基、炭素数3までのアルキル基、炭素数3までのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。R1は、炭素数4以上、好ましくは炭素数6以上の置換基であることが好ましく、中でも、炭素数20までのアリール基もしくはアラルキル基(フェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基等のアリール基;ベンジル基、ベンズヒドリル基、スチリル基、フェネチル基、トリチル基、シンナミル基等のアラルキル基)、炭素数11までの複素環含有炭化水素基(フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基等の複素環基;これらの複素環基によって置換されたアルキル基)であることが好ましい。R1は、ベンジル基または3−インドリルメチル基であることが特に好ましく、3−インドリルメチル基であることが最も好ましい。すなわち、一般式(1)の置換α−ケト酸としては、フェニルピルビン酸またはインドールピルビン酸が好ましく、特にインドールピルビン酸が好ましい。
一般式(2)において、R2は、炭素数1〜8のアルキル基、炭素数1〜8のアルコキシル基、炭素数2〜9のカルボキシアルキル基、炭素数20までのアリール基もしくはアラルキル基、炭素数11までの複素環含有炭化水素基、水酸基、またはそのエステル誘導体である。R2が芳香環または複素環を含む場合、当該芳香環または複素環は、ハロゲン原子、水酸基、炭素数3までのアルキル基、炭素数3までのアルコキシ基およびアミノ基から選ばれる少なくとも一種の置換基により置換されていてもよい。ただし、一般式(1)において、R1が水素、メチル基またはカルボキシメチル基である場合は、R2は水素ではない。R2は、水素またはカルボキシル基であることが好ましく、特に水素であることが好ましい。すなわち、一般式(2)の置換α−ケト酸としては、オキサロ酢酸またはピルビン酸が好ましく、特にピルビン酸が好ましい。
一般式(3)において、R1およびR2は、一般式(1)および(2)におけるR1およびR2と同義である。
本発明の置換α−ケト酸の製造方法においては、一般式(1)の置換α−ケト酸としてインドールピルビン酸を用い、一般式(2)の置換α−ケト酸としてピルビン酸を用いて、下記式(4)に示すIHOGを合成することが最も好ましい。
当該反応を触媒するタンパク質とは、前記一般式(1)で表される置換α−ケト酸と、前記一般式(2)で表される置換α−ケト酸とのアルドール縮合により、前記一般式(3)で示される置換α−ケト酸を合成する反応を触媒できるタンパク質であれば、特に限定なく使用できる。すなわち、当該反応を触媒するタンパク質であれば、微生物由来のタンパク質であってもよいし、化学合成法によって合成されたタンパク質であってもよい。
このようなタンパク質としては、[I]アルドラーゼの項で説明したアルドラーゼが好ましい。この場合、Pseudomonas属、Erwinia属、Flavobacterium属、Xanthomonas属のうち、当該反応を触媒するタンパク質(アルドラーゼ)を生成する菌体を培養して得たアルドラーゼを用いても良いし、(2)組み換えDNA技術により当該反応を触媒するタンパク質を生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養して得たアルドラーゼを用いても良い。
当該反応を触媒するタンパク質は、前記一般式(3)で示される置換α−ケト酸を合成する反応を触媒可能な限り、いかなる形態で反応系に添加してもよい。すなわち、当該反応を触媒するタンパク質を単体で反応系に添加してもよいし、当該反応を触媒するタンパク質(アルドラーゼ)を含むアルドラーゼ活性を有する組成物の形態で反応系に添加してもよい。
ここで「アルドラーゼ活性を有する組成物」とは、当該反応を触媒するタンパク質(アルドラーゼ)を含むものであればよく、具体的には培養物、培地(培養物から菌体を除去したもの)、菌体(培養菌体、洗浄菌体のいずれも含む)、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、前記培地および/または細胞を精製処理することにより得られるアルドラーゼ活性を有する組成物(粗酵素液、精製酵素)などを含む。例えば、アルドラーゼ産生菌または組み換えDNAによって形質転換された細胞を用いて、置換α−ケト酸を製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からアルドラーゼを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。すなわち、アルドラーゼ活性を有する画分であれば、どのような形態であっても本発明の置換α−ケト酸の製造方法に使用することが可能である。
アルドラーゼまたはアルドラーゼ活性を有する組成物を用いてアルドール反応を進行させるには、前記一般式(1)で表される置換α−ケト酸、前記一般式(2)で表される置換α−ケト酸、当該反応を触媒するタンパク質またはアルドラーゼ含有物を含む反応液を20〜50℃の適当な温度に調整し、pH6〜12に保ちつつ、30分〜5日静置、振とう、または攪拌すればよい。
当該反応液にMg2+、Mn2+、Ni2+、Co2+などの2価のカチオンを添加することによって反応速度を向上させることもできる。コスト等の面から、好ましくはMg2+を用いることがある。
これら2価カチオンを反応液に添加する際は、反応を阻害しない限りにおいてはいずれの塩を用いてもよいが、好ましくはMgCl2、MgSO4、MnSO4等を用いることがある。これら2価カチオンの添加濃度は当該業者であれば簡単な予備検討によって決定することができるが、0.01mM〜10mM、好ましくは0.1mM〜5mM、さらに好ましくは0.1mM〜1mMの範囲で添加することができる。
以下、本発明の置換α−ケト酸の製造方法を実施する際の好ましい反応条件の一例を挙げれば、100mM バッファー、50mM インドール−3−ピルビン酸、250mM ピルビン酸、1mM MgCl2、1%(v/v) トルエンからなる反応液に、酵素源としてアルドラーゼ発現E.coliの洗浄菌体を10% (w/v)となるように添加し、33℃で4時間振とう反応させることにより、4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)が得られる。
生成した一般式(3)の置換α−ケト酸は、公知の手法により分離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。
本発明の置換α−ケト酸の製造方法を用いることにより、インドールピルビン酸と、オキサロ酢酸(ないしピルビン酸)とから、モナティンの前駆体ケト酸(IHOG)を生成できる。IHOGは、2位をアミノ化することによりモナティンを導出できるため、モナティン合成における中間体として有用である。
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例において、基質として用いたIHOGおよびPHOGは、参考例1および2に記載の方法により合成したものである。
実施例1
〔I〕PHOGアルドラーゼ活性菌の採取
4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(PHOG)を基質としたアルドラーゼ活性菌株の採取を実施した。
〔I〕PHOGアルドラーゼ活性菌の採取
4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(PHOG)を基質としたアルドラーゼ活性菌株の採取を実施した。
ブイヨン平板培地(栄研化学)に供試微生物(細菌・酵母)を接種し、30℃で24時間培養した。これをグリセロール0.5g/dl、フマル酸0.5g/dl、酵母エキス0.3g/dl、ペプトン0.2g/dl、硫安0.3g/dl、K2HPO4 0.3g/dl、KH2PO4 0.1g/dl、MgSO4・7H2O 0.05g/dl、フタル酸ナトリウム 0.25g/dl、寒天末2g/dl(pH6.5)を含むプレートに接種し、30℃で24時間培養した。得られた菌体を湿菌体重量で約1%(w/v)となるように、100mM Tris−HCl(pH8.0)、50mM PHOG、1mM MgCl2、5mM リン酸カリウム溶液(KPi)、1%(v/v) トルエンからなる反応液に接種し、30℃で24時間反応させた。該反応液中の遊離ピルビン酸濃度はlactate dehydrogenae(LDH)を用いた酵素法にて定量した。100mM Tris−HCl(pH8.0)、1.5mM NADH、5mM MgCl2、25U/ml LDHからなる反応液200μLにサンプル10μLを添加し、30℃で10分間インキュベートした。反応後の340nmの吸光度を測定し、NADHの減少量からサンプル中のピルビン酸量を定量した。
また生成フェニルピルビン酸量はジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS−2」(5μm,4.6×250mm)を利用したHPLC分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相:20%(v/v) アセトニトリル/0.05%(v/v) トリフルオロ酢酸水溶液
流速:1ml/min
カラム温度:40℃
検出:UV 210nm
移動相:20%(v/v) アセトニトリル/0.05%(v/v) トリフルオロ酢酸水溶液
流速:1ml/min
カラム温度:40℃
検出:UV 210nm
本条件により、PHOGは約9.8分に、フェニルピルビン酸は約12分の保持時間に溶出され、それぞれ分別、定量できた。
供試菌体添加区においてPHOGより生成したピルビン酸ないしフェニルピルビン酸量より対照区(菌体無添加区)の生成量を差し引いた値をアルドラーゼによる生成量とした。その結果、表1に掲げる菌株においてPHOGを基質としたアルドラーゼ活性を見出した。
Pseudomonas taetrolens ATCC4683を選抜し、フェニルピルビン酸とオキサロ酢酸ないしピルビン酸からのPHOGの合成反応を検討した。100mM Tris−HCl(pH8.0)、50mM フェニルピルビン酸、1mM MgCl2、5mM KPi、100mM オキサロ酢酸ないしピルビン酸、1%(w/w)トルエンからなる反応液に、P.taetrolens ATCC4683(AJ2212)菌体を終濃度で約1%(w/v)となるように接種し、30℃で16時間反応させた。反応終了後、生成PHOG量をHPLCにて定量した。フェニルピルビン酸とオキザロ酢酸ないしピルビン酸からのPHOGの生成量を表2に示す。
表2より、菌体添加区においてPHOGの生成量の増加が認められ、フェニルピルビン酸+オキサロ酢酸およびフェニルピルビン酸+ピルビン酸のいずれの組み合わせにおいても、該アルドラーゼの作用によりPHOGを生成せしめることが明らかとなった。
〔II〕Pseudomonas taetrolens ATCC4683株由来IHOGアルドラーゼの精製
P.taetrolens ATCC4683株の可溶性画分からIHOGアルドラーゼの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、PHOGを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
P.taetrolens ATCC4683株の可溶性画分からIHOGアルドラーゼの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、PHOGを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件:50mM Tris−HCl(pH8.0)、2mM PHOG、0.2mM NADH、0.2mMKPi、1mM MgCl2、16U/ml lactate dehydrogenase、3μL酵素/600μL反応液、30℃、340nmの吸光度を測定
(1)可溶性画分の調製
ブイヨン平板培地で30℃、24時間培養したP.taetrolens ATCC4683菌体を一白金耳かきとり、50mlの酵素生産培地(0.5g/dl グリセロール、0.5g/dl フマル酸、0.5g/dl硫酸アンモニウム、0.3g/dl K2HPO4 0.1g/dl、KH2PO4 0.05g/dl、MgSO4・7H2O 0.3g/dl、酵母エキス、0.2g/dl ペプトン、0.25g/dl フタル酸ナトリウム、0.005% Antifoam A(Sigma社製)、pH6.5にKOHで調整)を含む500ml容フラスコに接種し、30℃で24時間振とう培養した。該培養液0.5mlを酵素生産培地50mlを含む500ml容フラスコ40本に接種し、30℃で24時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーA(20mM Tris−HCl(pH7.6))に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を200mlのバッファーAに懸濁し、4℃で30分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離(x8000rpm、10分間×2回)により菌体残渣を除き、さらに超遠心分離(x50000rpm、30分間)し、得られた上清を可溶性画分とした。
ブイヨン平板培地で30℃、24時間培養したP.taetrolens ATCC4683菌体を一白金耳かきとり、50mlの酵素生産培地(0.5g/dl グリセロール、0.5g/dl フマル酸、0.5g/dl硫酸アンモニウム、0.3g/dl K2HPO4 0.1g/dl、KH2PO4 0.05g/dl、MgSO4・7H2O 0.3g/dl、酵母エキス、0.2g/dl ペプトン、0.25g/dl フタル酸ナトリウム、0.005% Antifoam A(Sigma社製)、pH6.5にKOHで調整)を含む500ml容フラスコに接種し、30℃で24時間振とう培養した。該培養液0.5mlを酵素生産培地50mlを含む500ml容フラスコ40本に接種し、30℃で24時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーA(20mM Tris−HCl(pH7.6))に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を200mlのバッファーAに懸濁し、4℃で30分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離(x8000rpm、10分間×2回)により菌体残渣を除き、さらに超遠心分離(x50000rpm、30分間)し、得られた上清を可溶性画分とした。
(2)陰イオン交換クロマトグラフィー:Q−Sepharose FF
上記の可溶性画分80mlをバッファーAで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムQ−Sepharose FF 26/10(ファルマシア社製、CV=20ml)に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質(非吸着タンパク質)をバッファーAを用いて洗い流した後、KCl濃度を0Mから0.7Mまで直線的に変化させて(total 140ml)吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてPHOGアルドラーゼ活性を検出したところ、約0.5M相当の画分にPHOGアルドラーゼ活性のピークを検出した。同様のクロマト操作を2度繰り返して実施した。
上記の可溶性画分80mlをバッファーAで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムQ−Sepharose FF 26/10(ファルマシア社製、CV=20ml)に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質(非吸着タンパク質)をバッファーAを用いて洗い流した後、KCl濃度を0Mから0.7Mまで直線的に変化させて(total 140ml)吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてPHOGアルドラーゼ活性を検出したところ、約0.5M相当の画分にPHOGアルドラーゼ活性のピークを検出した。同様のクロマト操作を2度繰り返して実施した。
(3)疎水性クロマトグラフィー:Phenyl Sepharose HP HR 16/10
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーB(50mM Tris−HCl(pH7.6)、1M硫酸アンモニウム、pH7.6)に対して4℃で一晩透析し0.45μmのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーBで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムPhenyl Sepharose HP HR 16/10(ファルマシア社製)に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーB(50mM Tris−HCl(pH7.6)、1M硫酸アンモニウム、pH7.6)に対して4℃で一晩透析し0.45μmのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーBで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムPhenyl Sepharose HP HR 16/10(ファルマシア社製)に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーBを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を1Mから0Mまで直線的変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られた各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ0.2Mの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
(4)ゲルろ過クロマトグラフィー:Sephadex 200 HP 16/60
アルドラーゼを含む画分をそれぞれ集めて、バッファーAに対して透析し、0.45μmのフィルターで濾過した。得られた濾液を、限外ろ過膜centriprep 10を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、バッファーC(20mM Tris−HCl(pH7.6),0.1M KCl)で平衡化されたゲルろ過Sephadex 200 HP 16/60(ファルマシア社製)に供し、1ml/mimの流速で溶出した。この操作によりアルドラーゼは66−71mlの画分に溶出された。活性のピークの溶出位置より、該アルドラーゼの分子量は約146kDaと見積もられた。
アルドラーゼを含む画分をそれぞれ集めて、バッファーAに対して透析し、0.45μmのフィルターで濾過した。得られた濾液を、限外ろ過膜centriprep 10を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、バッファーC(20mM Tris−HCl(pH7.6),0.1M KCl)で平衡化されたゲルろ過Sephadex 200 HP 16/60(ファルマシア社製)に供し、1ml/mimの流速で溶出した。この操作によりアルドラーゼは66−71mlの画分に溶出された。活性のピークの溶出位置より、該アルドラーゼの分子量は約146kDaと見積もられた。
(5)陰イオン交換クロマトグラフィー:Mono Q HR5/5
得られた画分を0.45μmのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーAで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム Mono−Q HR 5/5(ファルマシア社製)に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着した。バッファーAにより非吸着タンパク質を洗い流した後、KCl濃度を直線的に0mMから700mMへ変化させてタンパク質の溶出をおこなった(Total 24ml)。各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、KCl濃度が約0.4Mの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
得られた画分を0.45μmのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーAで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム Mono−Q HR 5/5(ファルマシア社製)に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着した。バッファーAにより非吸着タンパク質を洗い流した後、KCl濃度を直線的に0mMから700mMへ変化させてタンパク質の溶出をおこなった(Total 24ml)。各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、KCl濃度が約0.4Mの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
(6)ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー:CHT−II
得られた画分をバッファーD(10mM リン酸カリウムバッファー(pH7.0))に4℃で一晩透析し、0.45μmのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーDで平衡化されたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラム CHT−II 5ml(BioRad社製)に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着せず、吸着タンパクと分離することができた。
得られた画分をバッファーD(10mM リン酸カリウムバッファー(pH7.0))に4℃で一晩透析し、0.45μmのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーDで平衡化されたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラム CHT−II 5ml(BioRad社製)に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着せず、吸着タンパクと分離することができた。
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をSDS−PAGEに供したところ、約25kDaに相当する位置にほぼ単一なバンドとして検出された。ゲルろ過クロマトグラフィーでの推定分子量が約146kDaであることから、該アルドラーゼは6量体を形成していると推定された。精製表を表3に示す。
〔III〕IHOG aldolaseの内部アミノ酸配列の決定
精製したアルドラーゼ約2μg分をSDS−PAGEに供した後、SDS−PAGEゲル中の試料をトリプシン処理し(pH8.5、35℃、20時間)、逆相HPLCに供して断片ペプチドを分離した。分取したフラクションのうち、2つのフラクションについてそれぞれ20残基、12残基分のアミノ酸配列(配列番号4、5)を下記の通り決定した。
精製したアルドラーゼ約2μg分をSDS−PAGEに供した後、SDS−PAGEゲル中の試料をトリプシン処理し(pH8.5、35℃、20時間)、逆相HPLCに供して断片ペプチドを分離した。分取したフラクションのうち、2つのフラクションについてそれぞれ20残基、12残基分のアミノ酸配列(配列番号4、5)を下記の通り決定した。
〔IV〕P.taetrolens ATCC4683株由来IHOG aldolase遺伝子のクローニング
(1)染色体DNAの調製
P.taetrolens ATCC4683株を50mlのブイヨン培地を用いて30℃で一晩培養した(前培養)。この培養液5mlを種菌として、50mlのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液50mlを遠心分離操作(12000xg、4℃、15分間)に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体DNAを調製した。
(1)染色体DNAの調製
P.taetrolens ATCC4683株を50mlのブイヨン培地を用いて30℃で一晩培養した(前培養)。この培養液5mlを種菌として、50mlのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液50mlを遠心分離操作(12000xg、4℃、15分間)に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体DNAを調製した。
(2)PCRによる内部配列の取得
決定したIHOGアルドラーゼの内部アミノ酸配列をもとに、以下のミックスプライマー(配列番号6、7)を合成した。
決定したIHOGアルドラーゼの内部アミノ酸配列をもとに、以下のミックスプライマー(配列番号6、7)を合成した。
作製したミックスプライマーを用いて、P.taetrolens ATCC4683の染色体DNAを鋳型としてPCRによる増幅を行った。PCR反応は、PCR Thermal PERSONEL(TaKaRa社製)を用いて行い、以下の条件で30サイクル行った。
94℃ 30秒
55℃ 30秒
72℃ 1分
94℃ 30秒
55℃ 30秒
72℃ 1分
PCR産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約500bpの断片の増幅が認められた。該DNA断片をpUC18にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したDNA断片から推定されるアミノ酸配列が、IHOGアルドラーゼの内部アミノ酸配列と一致しており、目的のアルドラーゼ遺伝子が取得されたことが確認された。
(3)コロニーハイブリダイゼーションによる全長遺伝子の取得
PCRで増幅したDNA断片を用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。DNAプローブの作製はDIGHigh Prime(ロシュダイアグノスティック社製)を使用して、説明書通りに37℃でO/Nインキュベートしてプローブの標識を行った。サザン解析は染色体DNA1μgを各種制限酵素で完全に消化し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下マニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hyb(ロシュダイアグノスティック社製)を用いて行い、50℃で1時間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、O/Nでハイブリダイゼーションさせた。バンドの検出はDIG Nucleotide Detection Kitを用いて行った。その結果、該PCR断片をプローブとして強くハイブリダイゼーションする約4kbpのPstI断片を検出した。次に、このPstI断片をコロニーハイブリダイゼーションにて取得した。染色体DNA 20μgをPstIで処理後アガロースゲル電気泳動に供し約4kbp大きさの断片を回収した。これをpUC118に連結し、E.coli JM109にてライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター(Hybond−N、アマシャム社製)にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行った。フィルターをバッファー中に浸し、42℃で1時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、42℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。SSCでの洗浄後、プローブとハイブリダイズするコロニーの検出をDIG Nucleotide Detection Kit(ロシュダイアグノスティック社製)を用いて行った。その結果、プローブと強くハイブリダイゼーションするクローンを取得した。
PCRで増幅したDNA断片を用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。DNAプローブの作製はDIGHigh Prime(ロシュダイアグノスティック社製)を使用して、説明書通りに37℃でO/Nインキュベートしてプローブの標識を行った。サザン解析は染色体DNA1μgを各種制限酵素で完全に消化し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下マニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hyb(ロシュダイアグノスティック社製)を用いて行い、50℃で1時間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、O/Nでハイブリダイゼーションさせた。バンドの検出はDIG Nucleotide Detection Kitを用いて行った。その結果、該PCR断片をプローブとして強くハイブリダイゼーションする約4kbpのPstI断片を検出した。次に、このPstI断片をコロニーハイブリダイゼーションにて取得した。染色体DNA 20μgをPstIで処理後アガロースゲル電気泳動に供し約4kbp大きさの断片を回収した。これをpUC118に連結し、E.coli JM109にてライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター(Hybond−N、アマシャム社製)にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行った。フィルターをバッファー中に浸し、42℃で1時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、42℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。SSCでの洗浄後、プローブとハイブリダイズするコロニーの検出をDIG Nucleotide Detection Kit(ロシュダイアグノスティック社製)を用いて行った。その結果、プローブと強くハイブリダイゼーションするクローンを取得した。
取得したクローンより回収したプラスミドDNAの塩基配列を決定したところ、配列番号1に記載の塩基配列を有することが明らかになった。決定した内部アミノ酸配列に対応する塩基配列(配列番号1にて507〜566番目、および、1046〜1082番目)を含む678bpのorfを見出し、目的とするアルドラーゼの全長を取得した。
(4) E. coliでのIHOGアルドラーゼの発現(その1)
表6に示すプライマー(配列番号8および9)を用いてP.taetrolens ATCC4683染色体DNAより増幅した断片をBamHI/HindIII消化し、pUC18のBamHI/HindIIIサイトに挿入したプラスミドpUCALDを構築した。構築した発現プラスミドをE.coli JM109に導入し、形質転換体を50μg/ml アンピシリンを含むLB培地で一昼夜37℃で振盪させた(前培養)。前培養液を50mlのLB培地に1%シードし、37℃にて本培養を行った。培養開始約2時間後に終濃度1mMとなるようにIPTGを添加し、さらに3時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、1mlの20mM Tris−HCl(pH7.6)に懸濁し、マルチビーズショッカー(安井器械社製)を用いて菌体を破砕した。破砕液を15000rpmで10分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
表6に示すプライマー(配列番号8および9)を用いてP.taetrolens ATCC4683染色体DNAより増幅した断片をBamHI/HindIII消化し、pUC18のBamHI/HindIIIサイトに挿入したプラスミドpUCALDを構築した。構築した発現プラスミドをE.coli JM109に導入し、形質転換体を50μg/ml アンピシリンを含むLB培地で一昼夜37℃で振盪させた(前培養)。前培養液を50mlのLB培地に1%シードし、37℃にて本培養を行った。培養開始約2時間後に終濃度1mMとなるようにIPTGを添加し、さらに3時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、1mlの20mM Tris−HCl(pH7.6)に懸濁し、マルチビーズショッカー(安井器械社製)を用いて菌体を破砕した。破砕液を15000rpmで10分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
該粗酵素液を用いてPHOGを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、pUC18を導入したE.coli(コントロール)においてはPHOGアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、pUCADL導入株においては0.81U/mg proteinのPHOGアルドラーゼ活性が検出された。このことより、該遺伝子が目的とするアルドラーゼをコードしていることが示された。
〔V〕アルドラーゼ発現株を用いたインドール−3−ピルビン酸とピルビン酸からの4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)の合成
〔IV〕にて作製したアルドラーゼ発現E.coliの洗浄菌体を酵素源として用いて、インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸からの4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)の合成を実施した。IHOGの定量はジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS−2」(5μm,4.6×250mm)を利用したHPLC分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
〔IV〕にて作製したアルドラーゼ発現E.coliの洗浄菌体を酵素源として用いて、インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸からの4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)の合成を実施した。IHOGの定量はジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS−2」(5μm,4.6×250mm)を利用したHPLC分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相:40%(v/v) アセトニトリル/5mM リン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速:1ml/min
カラム温度:40℃
検出:UV210nm
流速:1ml/min
カラム温度:40℃
検出:UV210nm
100mM バッファー(Tris−HCl 8.0,9.0ないしGlycine−NaOH 10.0)、50mM インドール−3−ピルビン酸、250mM ピルビン酸、1mM MgCl2、1%(v/v) トルエンからなる反応液にアルドラーゼ発現E.coliの洗浄菌体を10%(w/v)となるように添加し、33℃で4時間振とう反応させた。酵素反応液を適宜希釈し、生成したIHOGを定量した。
その結果、アルドラーゼ発現E.coli添加区において、IHOG生成量が増加しており、該アルドラーゼによりIHOGを生成せしめることができた。
実施例2 E.coliでのIHOGアルドラーゼの大量発現(その2)
(1)trpプロモーター及びrrnBターミネーター搭載プラスミドpTrp4の構築
E.coli W3110染色体DNA上のtrpオペロンのプロモーター領域を表8に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR(配列番号10および11の組み合わせ)により目的遺伝子領域を増幅し、得られたDNA断片をpGEM−Teasyベクター(プロメガ製)にライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からtrpプロモーターの方向がlacプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをEcoO109I/EcoRIにて処理して得られるtrpプロモーターを含むDNA断片と、pUC19(Takara製)のEcoO109I/EcoRI処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをpTrp1と命名した。次にpKK223−3(Amersham Pharmacia製)をHindIII/HincIIにて処理し、得られたrrnBターミネーターを含むDNA断片とpTrp1のHindIII/PvuII処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをpTrp2と命名した。次にpTrp2を鋳型として表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR(配列番号10および12の組み合わせ)によりtrpプロモーター領域を増幅した。このDNA断片をEcoO109I/NdeIにより処理し、pTrp2のEcoO109I/NdeI処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをpTrp4と命名した。
(1)trpプロモーター及びrrnBターミネーター搭載プラスミドpTrp4の構築
E.coli W3110染色体DNA上のtrpオペロンのプロモーター領域を表8に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR(配列番号10および11の組み合わせ)により目的遺伝子領域を増幅し、得られたDNA断片をpGEM−Teasyベクター(プロメガ製)にライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からtrpプロモーターの方向がlacプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをEcoO109I/EcoRIにて処理して得られるtrpプロモーターを含むDNA断片と、pUC19(Takara製)のEcoO109I/EcoRI処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをpTrp1と命名した。次にpKK223−3(Amersham Pharmacia製)をHindIII/HincIIにて処理し、得られたrrnBターミネーターを含むDNA断片とpTrp1のHindIII/PvuII処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをpTrp2と命名した。次にpTrp2を鋳型として表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR(配列番号10および12の組み合わせ)によりtrpプロモーター領域を増幅した。このDNA断片をEcoO109I/NdeIにより処理し、pTrp2のEcoO109I/NdeI処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをpTrp4と命名した。
(2)アルドラーゼ遺伝子発現プラスミドptrpALD1、ptrpALD2の構築とE.coliでの発現
表9に示すプライマー(配列番号9および13)を用いてP.taetrolens ATCC4683染色体DNAより増幅した断片をNdeI/HindIII消化し、pTrp4のNdeI/HindIIIサイトに挿入したプラスミドptrpALD1を構築した。このプラスミドは配列番号1に記載の塩基配列のうち444番目のATGを翻訳開始コドンとして配列番号3記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。また、プライマー(配列番号9および14)を用いてP.taetrolens ATCC4683染色体DNAより増幅した断片をNdeI/HindIII消化し、pTrp4のNdeI/HindIIIサイトに挿入したプラスミドptrpALD2を構築した。このプラスミドは配列番号1に記載の塩基配列のうち456番目のATGを翻訳開始コドンとして配列番号2記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。それぞれ構築した発現プラスミドをE.coli JM109に導入し、形質転換体を50μg/ml アンピシリンを含むLB培地で一昼夜37℃で振盪させた(前培養)。前培養液を50mlのLB培地に1%シードし、37℃にて本培養を行った。培養開始約2時間後に終濃度1mMとなるよにIPTGを添加し、さらに3時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、1mlの20mM Tris−HCl(pH7.6)に懸濁し、マルチビーズショッカー(安井器械社製)を用いて菌体を破砕した。破砕液を15000rpmで10分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
表9に示すプライマー(配列番号9および13)を用いてP.taetrolens ATCC4683染色体DNAより増幅した断片をNdeI/HindIII消化し、pTrp4のNdeI/HindIIIサイトに挿入したプラスミドptrpALD1を構築した。このプラスミドは配列番号1に記載の塩基配列のうち444番目のATGを翻訳開始コドンとして配列番号3記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。また、プライマー(配列番号9および14)を用いてP.taetrolens ATCC4683染色体DNAより増幅した断片をNdeI/HindIII消化し、pTrp4のNdeI/HindIIIサイトに挿入したプラスミドptrpALD2を構築した。このプラスミドは配列番号1に記載の塩基配列のうち456番目のATGを翻訳開始コドンとして配列番号2記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。それぞれ構築した発現プラスミドをE.coli JM109に導入し、形質転換体を50μg/ml アンピシリンを含むLB培地で一昼夜37℃で振盪させた(前培養)。前培養液を50mlのLB培地に1%シードし、37℃にて本培養を行った。培養開始約2時間後に終濃度1mMとなるよにIPTGを添加し、さらに3時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、1mlの20mM Tris−HCl(pH7.6)に懸濁し、マルチビーズショッカー(安井器械社製)を用いて菌体を破砕した。破砕液を15000rpmで10分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
該粗酵素液を用いてPHOGを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、pTrp4を導入したE.coli(コントロール)においてはPHOGアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、ptrpADL1導入株においては16.1U/mg proteinのPHOGアルドラーゼ活性が、ptrpADL2導入株においては36.0U/mg proteinのPHOGアルドラーゼ活性が検出された。このことより、配列番号2ないし3記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼのいずれを用いても、アルドラーゼ活性を有していることが明らかとなった。
実施例3 Pseudomonas coronafaciens AJ2791株由来IHOGアルドラーゼのクローニング
(1)染色体DNAの調製
P.coronafaciens AJ2791株を50mlのブイヨン培地を用いて30℃で一晩培養した(前培養)。この培養液5mlを種菌として、50mlのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液50mlを遠心分離操作(12000xg、4℃、15分間)に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体DNAを調製した。
(1)染色体DNAの調製
P.coronafaciens AJ2791株を50mlのブイヨン培地を用いて30℃で一晩培養した(前培養)。この培養液5mlを種菌として、50mlのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液50mlを遠心分離操作(12000xg、4℃、15分間)に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体DNAを調製した。
(2)サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによる全長遺伝子の取得
P.coronafaciens AJ2791株由来IHOGのアルドラーゼ(以下、PcALD)遺伝子のクローニングは、P.taetrolens ATCC4683株由来IHOGアルドラーゼ遺伝子をプローブとしたサザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションにより実施した。表9に示すプライマーALD−5’Nde−1(配列番号13)およびALD−3’Hind(配列番号9)を用いて、P.taetrolens ATCC4683染色体DNAよりIHOGアルドラーゼ遺伝子全長をPCRで増幅した。増幅したDNA断片をプローブとして用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。DNAプローブの作製はDIGHigh Prime(ロシュダイアグノスティック社製)を使用して、説明書通りに37℃でO/Nインキュベートしてプローブの標識を行った。サザン解析はP.coronafaciens AJ2791株染色体DNA1μgを各種制限酵素で完全に消化し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下マニュアルに従って行った。ハイブリはDIG Easy Hyb(ロシュダイアグノスティック社製)を用いて行い、37℃で1時間プレハイブリを行った後にプローブを添加して、37℃でO/N、ハイブリさせた。メンブレンの洗浄は、2×SSCを用いて室温で5分間の洗浄を2回行ったのち、0.1×SSCを用いて37℃で15分間の洗浄を2回行った。バンドの検出はDIG Nucleotide Detection Kitを用いて行った。その結果、プローブとハイブリする約2.2kbpのPstI/HindIII断片を検出した。次に、このPstI/HindIII断片をコロニーハイブリダイゼーションにて取得した。染色体DNA 20μgをPstI/HindIIIで処理後アガロースゲル電気泳動に供し約2.2kbp大きさの断片を回収した。これをPstI/HindIIIで処理したpUC18に連結し、E.coli JM109にてライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター(Hybond−N、アマシャム社製)にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行った。ナイロンメンブレンフィルターをバッファー中に浸し、37℃で1時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、37℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンフィルターの洗浄は、2×SSCを用いて室温で5分間の洗浄を2回行ったのち、0.1×SSCを用いて37℃で15分間の洗浄を2回行った。プローブとハイブリダイズするコロニーの検出をDIG Nucleotide Detection Kit(ロシュダイアグノスティック社製)を用いて行った。その結果、プローブとハイブリするクローンを取得した。
P.coronafaciens AJ2791株由来IHOGのアルドラーゼ(以下、PcALD)遺伝子のクローニングは、P.taetrolens ATCC4683株由来IHOGアルドラーゼ遺伝子をプローブとしたサザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションにより実施した。表9に示すプライマーALD−5’Nde−1(配列番号13)およびALD−3’Hind(配列番号9)を用いて、P.taetrolens ATCC4683染色体DNAよりIHOGアルドラーゼ遺伝子全長をPCRで増幅した。増幅したDNA断片をプローブとして用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。DNAプローブの作製はDIGHigh Prime(ロシュダイアグノスティック社製)を使用して、説明書通りに37℃でO/Nインキュベートしてプローブの標識を行った。サザン解析はP.coronafaciens AJ2791株染色体DNA1μgを各種制限酵素で完全に消化し、0.8%アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下マニュアルに従って行った。ハイブリはDIG Easy Hyb(ロシュダイアグノスティック社製)を用いて行い、37℃で1時間プレハイブリを行った後にプローブを添加して、37℃でO/N、ハイブリさせた。メンブレンの洗浄は、2×SSCを用いて室温で5分間の洗浄を2回行ったのち、0.1×SSCを用いて37℃で15分間の洗浄を2回行った。バンドの検出はDIG Nucleotide Detection Kitを用いて行った。その結果、プローブとハイブリする約2.2kbpのPstI/HindIII断片を検出した。次に、このPstI/HindIII断片をコロニーハイブリダイゼーションにて取得した。染色体DNA 20μgをPstI/HindIIIで処理後アガロースゲル電気泳動に供し約2.2kbp大きさの断片を回収した。これをPstI/HindIIIで処理したpUC18に連結し、E.coli JM109にてライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター(Hybond−N、アマシャム社製)にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行った。ナイロンメンブレンフィルターをバッファー中に浸し、37℃で1時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、37℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンフィルターの洗浄は、2×SSCを用いて室温で5分間の洗浄を2回行ったのち、0.1×SSCを用いて37℃で15分間の洗浄を2回行った。プローブとハイブリダイズするコロニーの検出をDIG Nucleotide Detection Kit(ロシュダイアグノスティック社製)を用いて行った。その結果、プローブとハイブリするクローンを取得した。
取得したクローンより回収したプラスミドDNAの塩基配列を決定したところ744bpのorfを見出し、目的とするアルドラーゼの全長を取得した。構築したPcALD遺伝子挿入プラスミドをpUCPcALDと命名した。
pUCPcALDをE.coli JM109に導入し、形質転換体を50μg/mlアンピシリンを含むLB培地(LB−amp培地)で一昼夜37℃で振盪させた(前培養)。前培養液を50mlのLB培地に1%シードし、37℃にて本培養を行った。培養開始約2時間後に終濃度1mMとなるよにIPTGを添加し、さらに3時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、1mlの20mM Tris−HCl(pH7.6)に懸濁し、マルチビーズショッカー(安井器械社製)を用いて菌体を破砕した。破砕液を15000rpmで10分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
該粗酵素液を用いてPHOGを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、pUC18を導入したE.coli(コントロール)においてはPHOGアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、pUCADL導入株においては39.3U/mg proteinのPHOG アルドラーゼ活性が検出された。このことより、該遺伝子が目的とするアルドラーゼをコードしていることが示された。
実施例4 Pseudomonas taetrolens ATCC4683株由来アルドラーゼの組み換え酵素の精製
P.taetrolens ATCC4683由来アルドラーゼ(以下、PtALD)を高発現させたE.coliの可溶性画分から組み換えPtALDの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、PHOGを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
P.taetrolens ATCC4683由来アルドラーゼ(以下、PtALD)を高発現させたE.coliの可溶性画分から組み換えPtALDの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、PHOGを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件:50mM Tris−HCl(pH8.0)、2mM PHOG、0.2mM NAD、0.2mM Kpi、1mM MgCl2、16U/ml lactate dehydrogenase、3μl酵素/600μl反応液、30℃、340nmの吸光度を測定
(1)可溶性画分の調製:
LB−amp平板培地で37℃、16時間培養したE.coli JM109/ptrpALD2菌体を一白金耳かきとり、3mlのLB−amp培地を含む試験管に接種し、37℃で16時間振とう培養した。該培養液0.5mlをLB−amp培地50mlを含む500ml容フラスコ10本に接種し、37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーA(20mM Hepes−KOH(pH7.6))に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を25mlのバッファーAに懸濁し、4℃で30分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離(x8000rpm、10分間×2回)により菌体残渣を除き、得られた上清を粗抽出画分とした。
LB−amp平板培地で37℃、16時間培養したE.coli JM109/ptrpALD2菌体を一白金耳かきとり、3mlのLB−amp培地を含む試験管に接種し、37℃で16時間振とう培養した。該培養液0.5mlをLB−amp培地50mlを含む500ml容フラスコ10本に接種し、37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーA(20mM Hepes−KOH(pH7.6))に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を25mlのバッファーAに懸濁し、4℃で30分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離(x8000rpm、10分間×2回)により菌体残渣を除き、得られた上清を粗抽出画分とした。
(2)陰イオン交換クロマトグラフィー:Q−Sepharose FF
上記の粗抽出画分23mlをバッファーAで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムQ−Sepharose FF 26/10(ファルマシア社製、CV=20ml)に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質(非吸着タンパク質)をバッファーAを用いて洗い流した後、KCl濃度を0Mから0.7Mまで直線的に変化させて(total 140ml)吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてPHOGアルドラーゼ活性を検出したところ約0.5M相当の画分にPHOGアルドラーゼ活性のピークを検出した。
上記の粗抽出画分23mlをバッファーAで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムQ−Sepharose FF 26/10(ファルマシア社製、CV=20ml)に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質(非吸着タンパク質)をバッファーAを用いて洗い流した後、KCl濃度を0Mから0.7Mまで直線的に変化させて(total 140ml)吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてPHOGアルドラーゼ活性を検出したところ約0.5M相当の画分にPHOGアルドラーゼ活性のピークを検出した。
(3)疎水性クロマトグラフィー:Phenyl Sepharose HP HR 16/10
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーB(20mM Hepes−KOH(pH7.6)、1M硫酸アンモニウム、pH7.6)に対して4℃で一晩透析し、10000rpmで10分間遠心分離した上清を0.45μmのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーBで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムPhenyl Sepharose HP HR 16/10(ファルマシア社製)に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーB(20mM Hepes−KOH(pH7.6)、1M硫酸アンモニウム、pH7.6)に対して4℃で一晩透析し、10000rpmで10分間遠心分離した上清を0.45μmのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーBで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムPhenyl Sepharose HP HR 16/10(ファルマシア社製)に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーBを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を1Mから0Mまで直線的変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られた各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ0.2Mの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をSDS−PAGEに供したところ、約25kDaに相当する位置にCBB染色で単一なバンドとして検出された。取得した組み換えPtALD溶液はバッファーAに対して4℃で一晩透析した。上記の操作により、350U/mlのPtALD溶液を17ml取得した。
実施例5 Pseudomonas coronafaciens AJ2791株由来アルドラーゼの組み換え酵素の精製
Pseudomonas coronafaciens AJ2791由来アルドラーゼ(PcALD)を高発現させたE.coliの可溶性画分から組み換えPcALDの精製を行った。
Pseudomonas coronafaciens AJ2791由来アルドラーゼ(PcALD)を高発現させたE.coliの可溶性画分から組み換えPcALDの精製を行った。
LB−amp平板培地で37℃、16時間培養したE.coli JM109/pUCPcALD菌体を一白金耳かきとり、3mlのLB−amp培地を含む試験管に接種し、37℃で16時間振とう培養した。該培養液0.5mlをLB−amp培地(+0.1mM IPTG) 50mlを含む500ml容フラスコ7本に接種し、37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーA(20mM Hepes−KOH(pH7.6))に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を30mlのバッファーAに懸濁し、4℃で30分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離(x8000rpm、10分間×2回)により菌体残渣を除き、得られた上清を粗抽出画分とした。
得られた粗抽出画分を、実施例4記載の組み換えPtALDの精製と同様の方法にてカラムクロマト精製を行った。Q−Sepharose、Phenyl Superoseの2段階のカラムクロマト操作により精製した画分をSDS−PAGEに供したところ、約25kDaに相当する位置にCBB染色で単一なバンドとして検出された。取得した組み換えPcALD溶液はバッファーAに対して4℃で一晩透析した。上記の操作により、108U/mlのPcALD溶液を10ml取得した。
実施例6 PtALD,PcALDを用いたインドール−3−ピルビン酸とピルビン酸からの4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)の合成
実施例4および5にて作製したPtALD、PcALDを酵素源として用いて、インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸からの4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)の合成を実施した。IHOGの定量はジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS−2」(5μm,4.6×250mm)を利用したHPLC分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
実施例4および5にて作製したPtALD、PcALDを酵素源として用いて、インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸からの4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(IHOG)の合成を実施した。IHOGの定量はジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS−2」(5μm,4.6×250mm)を利用したHPLC分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相:40%(v/v) アセトニトリル/5mM リン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速:1ml/min
カラム温度:40℃
検出:UV210nm
流速:1ml/min
カラム温度:40℃
検出:UV210nm
100mM Hepes−KOH(pH8.5)、50mM インドール−3−ピルビン酸、250mM ピルビン酸、1mMないし5mM MgCl2からなる反応液にPtALD、PcALDを1.8U/ml、0.8U/mlとなるように添加し、33℃で4時間反応させた。酵素反応液を適宜希釈し、生成したIHOGを定量した。その結果、該アルドラーゼによりIHOGを生成せしめることができた。
実施例7 PtALDを用いた種々の置換α−ケト酸の生成
実施例4にて調製したPtALDを用いて、表11に掲げた種々の基質に対するピルビン酸のアルドール縮合活性を測定した。100mM Glycine−NaOH(pH9)、50mM 基質、250mM ピルビン酸ナトリウム、1mM MgCl2、0.1mg/ml PtALDからなる反応液を調製し、33℃で2時間インキュベートした。得られた反応液を分画分子量10000の限外ろ過膜Microcon 10(アミコン社製)を用いて限外ろ過した。ろ液2μlを200μlの50%アセトニトリル/0.1%アンモニア水溶液に希釈し、ESI−MS分析を実施した。
実施例4にて調製したPtALDを用いて、表11に掲げた種々の基質に対するピルビン酸のアルドール縮合活性を測定した。100mM Glycine−NaOH(pH9)、50mM 基質、250mM ピルビン酸ナトリウム、1mM MgCl2、0.1mg/ml PtALDからなる反応液を調製し、33℃で2時間インキュベートした。得られた反応液を分画分子量10000の限外ろ過膜Microcon 10(アミコン社製)を用いて限外ろ過した。ろ液2μlを200μlの50%アセトニトリル/0.1%アンモニア水溶液に希釈し、ESI−MS分析を実施した。
結果、表12に示した基質に対して、相当するm/z値のピークを検出し、目的とするピルビン酸のアルドール縮合物が生成していることが示された。
実施例8 PtALDの酵素学的諸性質
実施例4で調製したPtALDを用いて、以下に掲げる項目について検討した。
基本測定条件:50mM Hepes−KOH(pH8.0)、2mM PHOG、5mM MgCl2、3mM KPB(pH8)、16U/ml Lactate dehydrogenase、30℃にて340nmの吸光度の減少を測定。
実施例4で調製したPtALDを用いて、以下に掲げる項目について検討した。
基本測定条件:50mM Hepes−KOH(pH8.0)、2mM PHOG、5mM MgCl2、3mM KPB(pH8)、16U/ml Lactate dehydrogenase、30℃にて340nmの吸光度の減少を測定。
(1)PHOGを基質とした速度論定数
図2〜4示す結果から、Vmax(for PHOG)=91.7μmol/min/mg、Km(for PHOG)=0.10mM、Km(for MgCl2)=0.019mM、Ka(for Kpi)=0.95mMとそれぞれ決定した。また、1mMのMgCl2添加により無添加区と比較して2.7倍に、5mM KPB添加により無添加区の2倍にそれぞれ活性が上昇した。
図2〜4示す結果から、Vmax(for PHOG)=91.7μmol/min/mg、Km(for PHOG)=0.10mM、Km(for MgCl2)=0.019mM、Ka(for Kpi)=0.95mMとそれぞれ決定した。また、1mMのMgCl2添加により無添加区と比較して2.7倍に、5mM KPB添加により無添加区の2倍にそれぞれ活性が上昇した。
(2)pH安定性
pH3〜11の範囲におけるpH安定性を測定した。測定に用いた緩衝液は以下の通り。酢酸ナトリウムバッファー(pH3、4、5、6)、リン酸カリウムバッファー(pH6、6.5、7、7.5)、Tris−HClバッファー(pH7、7.5、8、8.5)、Glycine−NaOHバッファー(pH9、9.5、10)、CAPS−NaOHバッファー(pH10、10.5、11)。PtALDを100mMのそれぞれの緩衝溶液中で37℃で30分間インキュベートした残存活性を基本測定条件にて測定した。結果を図5に示す。
pH3〜11の範囲におけるpH安定性を測定した。測定に用いた緩衝液は以下の通り。酢酸ナトリウムバッファー(pH3、4、5、6)、リン酸カリウムバッファー(pH6、6.5、7、7.5)、Tris−HClバッファー(pH7、7.5、8、8.5)、Glycine−NaOHバッファー(pH9、9.5、10)、CAPS−NaOHバッファー(pH10、10.5、11)。PtALDを100mMのそれぞれの緩衝溶液中で37℃で30分間インキュベートした残存活性を基本測定条件にて測定した。結果を図5に示す。
(3)温度安定性
25℃〜70℃にて100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.0)および100mM Glycine−NaOHバッファー(pH9.0)中でPtALDを30分間インキュベートした後、残存活性を基本測定条件にて測定した。結果を図6に示す。
25℃〜70℃にて100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.0)および100mM Glycine−NaOHバッファー(pH9.0)中でPtALDを30分間インキュベートした後、残存活性を基本測定条件にて測定した。結果を図6に示す。
実施例9 PtALDを用いた置換α−ケト酸の生成
実施例4にて調製したPtALDを用いて、アセトアルデヒドとα−ketobutyrateとのアルドール縮合活性を測定した。100mM Glycine−NaOH(pH9)、50mM アセトアルデヒド、250mM α−ketobutyrate、1mM MgCl2、0.1mg/ml PtALDからなる反応液を調製し、33℃で16時間インキュベートした。得られた反応液を分画分子量10000の限外ろ過膜Microcon 10(アミコン社製)を用いて限外ろ過した。ろ液10μlを200μlの50%アセトニトリル/0.1%アンモニア水溶液に希釈し、ESI−MS分析を実施した。
実施例4にて調製したPtALDを用いて、アセトアルデヒドとα−ketobutyrateとのアルドール縮合活性を測定した。100mM Glycine−NaOH(pH9)、50mM アセトアルデヒド、250mM α−ketobutyrate、1mM MgCl2、0.1mg/ml PtALDからなる反応液を調製し、33℃で16時間インキュベートした。得られた反応液を分画分子量10000の限外ろ過膜Microcon 10(アミコン社製)を用いて限外ろ過した。ろ液10μlを200μlの50%アセトニトリル/0.1%アンモニア水溶液に希釈し、ESI−MS分析を実施した。
結果、予想される生成物のExact mass(計算値)が146.06であるのに対して、〔M+H〕に相当するm/z値のピーク(m/z=+146.8)を検出し、下記の反応により目的とするアルドール縮合物が生成していることが確認された。
参考例1 4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ケトグルタル酸(IHOG)の合成
水酸化カリウム18.91g(286.5mmol、含量85重量%)を溶解した水64.45mlに、インドール−3−ピルビン酸7.50g(35.8mmol、含量97.0重量%)とオキサロ酸14.18g(107.4mmol)を加えて溶解させた。この混合溶液を35℃にて24時間攪拌した。
水酸化カリウム18.91g(286.5mmol、含量85重量%)を溶解した水64.45mlに、インドール−3−ピルビン酸7.50g(35.8mmol、含量97.0重量%)とオキサロ酸14.18g(107.4mmol)を加えて溶解させた。この混合溶液を35℃にて24時間攪拌した。
更に、3N−塩酸40.0mlを加えて中和(pH=7.0)し、153.5gの反応中和液を得た。この反応中和液には、4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ケトグルタル酸が5.55g含まれており、収率53.3%(対インドールピルビン酸)であった。
この反応中和液に水を加え、168mlとし、合成吸着剤(三菱化学製 DIAION−SP207)840mlにて充填された樹脂塔(直径4.8cm)に通液した。更に、流速23.5ml毎分にて純水を通液し、1.73〜2.55(L/L−R)を収集することにより、高純度の4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ケトグルタル酸を3.04g含む水溶液を、収率54.7%(樹脂への投入量に対して)にて得た。
(NMR測定)
1H−NMR(400MHz,D2O):3.03(d,1H,J=14.6Hz),3.11(d,1H,J=14.6Hz),3.21(d,1H,J=18.1 Hz),3.40(d,1H,J=18.1Hz),7.06−7.15(m,3H),7.39(d,1H,J=7.8Hz),7.66(d,1H,J=7.8Hz).
13C−NMR(100MHz,D2O):35.43,47.91,77.28,109.49,112.05,119.44,119.67,121.91,125.42,128.41,136.21,169.78,181.43,203.58
1H−NMR(400MHz,D2O):3.03(d,1H,J=14.6Hz),3.11(d,1H,J=14.6Hz),3.21(d,1H,J=18.1 Hz),3.40(d,1H,J=18.1Hz),7.06−7.15(m,3H),7.39(d,1H,J=7.8Hz),7.66(d,1H,J=7.8Hz).
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参考例2 4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸(PHOG)の合成
水酸化カリウム(純度85%)13.8gを溶解した水25mlに対し、フェニルピルビン酸5.0g(30.5mmol)、オキサル酢酸12.1g(91.4mmol)を加えて室温にて72時間反応させた。濃塩酸を用いて反応液のpH値を2.2に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥を行った後に、濃縮して残渣を得た。残渣を酢酸エチルとトルエンから再結晶を行い、4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸2.8g(11.3mmol)を結晶として得た。
水酸化カリウム(純度85%)13.8gを溶解した水25mlに対し、フェニルピルビン酸5.0g(30.5mmol)、オキサル酢酸12.1g(91.4mmol)を加えて室温にて72時間反応させた。濃塩酸を用いて反応液のpH値を2.2に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥を行った後に、濃縮して残渣を得た。残渣を酢酸エチルとトルエンから再結晶を行い、4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸2.8g(11.3mmol)を結晶として得た。
(NMR測定)
1H NMR(D2O)δ:2.48(d,J=14.4Hz,0.18H),2.60(d,J=14.4Hz,0.18H),2.85−3.30(m,3.64H),7.17−7.36(m,5H)
(分子量測定)
ESI−MS 計算値 C12H12O6=252.23,分析値 251.22(MH−)
1H NMR(D2O)δ:2.48(d,J=14.4Hz,0.18H),2.60(d,J=14.4Hz,0.18H),2.85−3.30(m,3.64H),7.17−7.36(m,5H)
(分子量測定)
ESI−MS 計算値 C12H12O6=252.23,分析値 251.22(MH−)
本発明のアルドラーゼは、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)とのアルドール縮合反応を触媒する新規アルドラーゼであり、モナティン合成における中間体として有用な4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸(4−(Indol−3−ylmethyl)−4−hydroxy−2−oxoglutarate;IHOG)の合成に好適に利用できる。
Claims (5)
- 前記アルドラーゼは、シュードモナス(Pseudomonas)属、エルウィニア(Erwinia)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、キサントモナス(Xanthomonas)属からなる群から選ばれる微生物に由来することを特徴とする、請求項1または2に記載の置換α−ケト酸の製造方法。
- 前記微生物は、シュードモナス タエトロレンス(Pseudomonas taetrolens)、シュードモナス コロナファシエンス(Pseudomonas coronafaciens)、シュードモナス デスモリティカ(Pseudomonas desmolytica)、エルウィニア エスピー(Erwinia sp.)、フラボバクテリウム レナム(Flavobacterium rhenanum)、またはキサントモナス シトリ(Xanthomonas citri)であることを特徴とする請求項3に記載の置換α−ケト酸の製造方法。
- 前記微生物は、シュードモナス タエトロレンス(Pseudomonas taetrolens)ATCC4683、またはシュードモナス コロナファシエンス(Pseudomonas coronafaciens)AJ2791であることを特徴とする請求項4に記載の置換α−ケト酸の製造方法。
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