JP4604524B2 - 変異型アルドラーゼ、並びにこれを用いた光学活性ihog及び光学活性モナティンの製造方法 - Google Patents
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Description
(a) インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)のアルドール縮合により前駆体ケト酸(4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸:IHOG)を合成する反応工程
(b) IHOGの2位をアミノ化する反応工程
前記タンパク質のアミノ酸配列のうち、配列番号2記載のアミノ酸配列を有するシュードモナス タエトロレンス由来アルドラーゼをテンプレートタンパク質として、スレッディング法により3次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質の37番目のアルギニン残基および99番目のロイシン残基に対応するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基が、前記テンプレートタンパク質のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基に置換されており、かつ、
前記タンパク質のアミノ酸配列のホモロジースコアが前記テンプレートタンパク質との比較時にSeqFold Total Score(bit)値として100以上であることを特徴とするタンパク質。
前記テンプレートタンパク質の基質結合部位を構成する37、67、71、97、98、99、100、119、120、139、141、189、192、193、および209番目に位置するアミノ酸残基と、
当該タンパク質において、前記テンプレートタンパク質の前記基質結合部位を構成するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基と、
の間の主鎖Cα原子の位置のずれが、根二乗平均誤差値として4Å以下となることを特徴とするタンパク質。
当該タンパク質のアミノ酸配列のうち、前記テンプレートタンパク質を用いてスレッディング法により3次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質の67、71、97、98、100、119、139、141、189、192、193および209番目に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において、少なくとも1つのアミノ酸残基が、前記テンプレートタンパク質のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基に置換されていることを特徴とするタンパク質。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列において、下記(a)および(b)から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
(a)37番目のアルギニン残基から他のアミノ酸残基への置換
(b)99番目のロイシン残基から他のアミノ酸残基への置換
(B)(A)のアミノ酸配列において、37、67、71、97、98、99、100、119、120、139、141、189、192、193および209番目に位置するアミノ酸残基以外の箇所に、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を有するアミノ酸配列
(a')37番目のアルギニン残基からチロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基またはプロリン残基への置換
(b')99番目のロイシン残基からアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基またはグリシン残基への置換
前記第1の工程によって得られた4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を、アミノ化することにより4R−モナティンを生成させ、生成した4R−モナティンを採取する第2の工程
を含むことを特徴とする4R−モナティンの製造方法。
前記第1の工程によって得られた前記反応液に含まれる4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を、中性又はアルカリ性条件下において下記一般式(1)
で表されるアミン化合物又はその塩と反応せしめ、4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸を生成させ、生成した4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸又はその塩の4R体を晶析する第2の工程、および、
得られた4R体の4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸又はその塩を還元し、生成した4R−モナティン又はその塩を採取する第3の工程を含むことを特徴とする4R−モナティンの製造方法。
前記第1の工程によって得られた4S体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を、アミノ化することにより4S−モナティンを生成させ、生成した4S−モナティンを採取する第2の工程
を含むことを特徴とする4S−モナティンの製造方法。
前記アルドラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列のうち、配列番号2記載のアミノ酸配列を有するシュードモナス タエトロレンス由来アルドラーゼをテンプレートタンパク質として、スレッディング法により3次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質中の37、67、71、97、98、99、100、119、139、141、189、192、193、209番目に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、少なくとも1箇所のアミノ酸残基において、アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を導入することを特徴とする変異型アルドラーゼの作成方法。
〔I〕野生型PtALDの立体構造
〔II〕変異型アルドラーゼ
(A)変異型アルドラーゼのアミノ酸配列
(B)変異型アルドラーゼの製造方法
〔III〕光学活性IHOGの製造方法
〔IV〕光学活性モナティンの製造方法
X線結晶構造解析によるタンパク質立体構造の決定は、以下の(1)〜(3)の手順で行う。
本発明の変異型アルドラーゼは、IHOGを光学選択的に生成できるように、野生型アルドラーゼの特定のアミノ酸残基に変異を導入したものである。
上述のように、PtALDの立体構造情報を解析した結果、PtALDの基質結合部位は、Arg37、Asn67、Tyr71、Gly97、Glu98、Leu99、Ile100、Arg119、Asp120、Pro139、Lys141、His189、His192、Glu193、Trp209の15個のアミノ酸残基によって囲まれた空間で構成されていることが分かった。すなわち、これらの15個のアミノ酸残基によって囲まれた空間が基質(インドールピルビン酸およびピルビン酸)が結合するために好適な環境を構成している。
光学活性を有する変異型アルドラーゼを得るためには、野生型アルドラーゼのアミノ酸配列において、生成物の4位のキラリティーに関与する部位を特定し、該当部分のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換すればよい。変異を導入する対象となる野生型アルドラーゼとしては、PtALDのほか、PtALDと類似する立体構造を有する他のアルドラーゼを用いることができる。以下、変異型アルドラーゼのアミノ酸配列について、野生型アルドラーゼとして、(i)PtALDを用いる場合と、(ii)PtALD以外の他のアルドラーゼを用いる場合に分けて説明する。
PtALDは、配列表配列番号2に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。PtALDの光学選択性を改変させる場合は、配列表配列番号2に記載された221個のアミノ酸残基のうち、Arg37およびLeu99の少なくとも一方のアミノ酸残基に変異を導入すればよい。すなわち、配列番号2に示すアミノ酸配列において、37番目のアルギニン残基および99番目のロイシン残基のうち、少なくとも1箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、光学選択性を有する変異型アルドラーゼが得られる。
以下、図8を参照しながら、PtALD以外の他のアルドラーゼに対して、X線結晶構造解析によって得られたPtALDの構造情報をもとに、PtALDと同様のアミノ酸変異を施す方法について説明する。他のアルドラーゼとしては、アルドラーゼ活性が確認されているアミノ酸配列が既知のタンパク質を用いることが好ましい。特に、インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させてIHOGを生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させてPHOGを生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性が確認されているタンパク質を用いることが好ましい。
本発明の変異型アルドラーゼは、野生型アルドラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子に変異を導入することによって、変異型アルドラーゼをコードする変異型遺伝子を作製し、当該変異型遺伝子を適当な宿主を用いて発現させることによって製造することができる。
PtALDを用いて変異型アルドラーゼを作成する場合、野生型アルドラーゼ遺伝子は、Pseudomonas taetrolens ATCC4683の細胞からクローニングすることができる。
(a)受託番号 FERM BP−8246(平成14年6月10日に寄託されたFERM P−18881より平成14年11月22日に国際寄託へ移管)
(b)受託日 2002年6月10日
(c)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(a)文献 Eaton,R.W., Plasmid-encoded phthalate catabolic pathway in Arthrobacter keyseri 12B, J. Bacteriol. 183 (12), 3689-3703 (2001)
(b)Genebank Accession Number: AF331043
(a)文献 Maruyama,K., Miwa,M., Tsujii,N., Nagai,T., Tomita,N., Harada,T.,Sobajima,H. and Sugisaki,H., Cloning, sequencing, and expression of the gene encoding
4-hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase from Pseudomonas ochraceae NGJ1, Biosci. Biotechnol. Biochem. 65 (12), 2701-2709 (2001)
(b)Genebank Accession Number: AB050935
上記のアルドラーゼ産生菌から得られる野生型アルドラーゼ遺伝子に対し、所定の部位に人為的に変異を起こさせ、変異型アルドラーゼ遺伝子を調製する。野生型PtALD遺伝子を用いて、光学選択性を有する変異型アルドラーゼ遺伝子を作製する場合、Arg37およびLeu99の少なくとも一方のアミノ酸残基を置換するように野生型PtALD遺伝子に対して人為的に変異を起こさせる。また、PtALD以外の野生型アルドラーゼ遺伝子を用いて光学選択性を有する変異型アルドラーゼ遺伝子を作製する場合は、PtALDのArg37に対応するアミノ酸残基、および、PtALDのLeu99に対応するアミノ酸残基の少なくとも一方のアミノ酸残基が置換されるように、人為的に変異を起こさせる。
(2) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、37番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からトリプトファン残基へ置換したアミノ酸配列
(3) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、37番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からヒスチジン残基へ置換したアミノ酸配列
(4) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、37番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からフェニルアラニン残基へ置換したアミノ酸配列
(5) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、37番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からプロリン残基へ置換したアミノ酸配列
(6) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、99番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からアスパラギン酸残基へ置換したアミノ酸配列
(7) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、99番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からグルタミン酸残基へ置換したアミノ酸配列
(8) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、99番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からリジン残基へ置換したアミノ酸配列
(9) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、99番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からトリプトファン残基へ置換したアミノ酸配列
(10) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、99番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からチロシン残基へ置換したアミノ酸配列
(11)配列番号2に示すアミノ酸配列において、99番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からグリシン残基へ置換したアミノ酸配列
(12)配列番号2に示すアミノ酸配列において、37番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からフェニルアラニン残基へ置換し、かつ、99番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からリジン残基へ置換したアミノ酸配列
(13)配列番号2に示すアミノ酸配列において、37番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からチロシン残基へ置換し、かつ、99番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からリジン残基へ置換したアミノ酸配列
(14)配列番号2に示すアミノ酸配列において、37番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からトリプトファン残基へ置換し、かつ、99番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からリジン残基へ置換したアミノ酸配列
上記のようにして得られる変異型アルドラーゼをコードする遺伝子を含むDNA断片は、適当なベクターに再度組換えて宿主細胞に導入させることにより、変異型アルドラーゼを発現した組換え菌を得ることができる。
本発明の光学活性IHOGの製造方法は、光学選択性が改変された本発明の変異型アルドラーゼを用いて、インドールピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)のアルドール縮合によりIHOGを製造する方法である。本発明の変異型アルドラーゼを用いることにより、光学活性IHOGを生成でき、また、生成した光学活性IHOGをアミノ化することにより光学活性モナティンを生成できる。
本発明の光学活性モナティンの製造方法は、本発明の変異型アルドラーゼを用いて光学活性IHOGを製造した後、当該光学活性IHOGをモナティンに変換する方法である。4R−IHOGは、(2R,4R)−モナティンおよび(2S,4R)−モナティンを生成し、4S−IHOGは、(2R,4S)−モナティンおよび(2S,4S)−モナティンを生成する。
化学反応法によってIHOGからモナティンを製造する方法としては、IHOGをオキシム化し、このIHOG−oximeまたはその塩を化学的に還元してモナティンを生成する方法を挙げることができる。
に表されるアミン化合物又はその塩とを反応せしめることによって行う。ここに、Rがアルキル基、アリール基又はアラルキル基である場合、Rは炭素原子を1〜3有するアルキル基、又は、側鎖に置換基を有していてもよいアリール基またはアラルキル基が好ましく、結晶化の観点からより好ましくは、Rはメチル基、エチル基、ベンジル基から選択される。
酵素法によってIHOGからモナティンを製造する場合、IHOGの2位をアミノ化する反応を触媒する酵素の存在下でIHOGをアミノ化すればよい。当該反応を触媒する酵素としては、例えばIHOGに対してアミノ基転移反応を触媒するアミノトランスフェラーゼ、また、IHOGの還元的アミノ化反応を触媒するデヒドロゲナーゼ等を例示することができるが、アミノトランスフェラーゼを用いることがより好ましい。
移動相:40%(v/v) アセトニトリル/5 mM リン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速:1 ml/min
カラム温度:40℃
検出:UV210nm
移動相B:50%(v/v) アセトニトリル20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.8)
0〜90分まで移動相Aで溶出し、90分〜120分まで移動相Bで溶出・洗浄
流速:0.4 ml/min
カラム温度:17℃
検出:UV210nm
(1)trpプロモーター及びrrnBターミネーター搭載プラスミドpTrp4の構築
E.coli W3110染色体DNA上のtrpオペロンのプロモーター領域を表2に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR(配列番号3および4の組み合わせ)により目的遺伝子領域を増幅し、得られたDNA断片をpGEM−Teasyベクター(プロメガ製)にライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からtrpプロモーターの方向がlacプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをEcoO109i/EcoRIにて処理して得られるtrpプロモーターを含むDNA断片と、pUC19(Takara製)のEcoO109i/EcoRI処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをpTrp1と命名した。次にpKK223−3(Amersham Pharmacia製)をHindIII/HincIIにて処理し、得られたrrnBターミネーターを含むDNA断片とpTrp1のHindIII/PvuII処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをpTrp2と命名した。次にpTrp2を鋳型として表2に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR(配列番号3および5の組み合わせ)によりtrpプロモーター領域を増幅した。このDNA断片をEcoO109i/NdeIにより処理し、pTrp2のEcoO109i/NdeI処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをpTrp4と命名した。
表3に示すプライマー(配列番号6および7)を用いてP. taetrolens ATCC4683染色体DNAより増幅した断片をNdeI/HINDIII消化し、pTrp4のNdeI /HindIIIサイトに挿入したプラスミドptrpPtALDを構築した。このプラスミドは配列番号1に記載の塩基配列のうち456番目のATGを翻訳開始コドンとして配列番号2記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。構築した発現プラスミドをE.coli JM109に導入し、形質転換体を100 μg/mlアンピシリンを含むLB培地50 mlに1白金耳接種し、37℃で16時間振盪させた。培養終了後、集菌、洗浄を行い、1mlの20mM Tris−HCl (pH7.6)に懸濁し、マルチビーズショッカー(安井器械社製)を用いて菌体を破砕した。破砕液を15000rpmで10分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
(1)変異導入プラスミドpKFPtALDの構築
PtALDへの部位特異的変異の導入は、Mutan−Super Express Km (TaKaRa製)を用いて、キット添付のプロトコール通りに行った。まず、変異導入用プラスミドpKFPtALDを構築した。表4に示すプライマー(配列番号6および8)を用いてptrpPtALDを鋳型としてtrpプロモーターからPtALDの構造遺伝子全長を含む断片をPCRにて増幅した。増幅した断片をXbaI/ HindIII消化し、pKF18−2のXbaI/ HindIIIサイトに挿入したプラスミドpKFPtALDを構築した。
PtALDのX線結晶構造情報より、PtALDのピルビン酸結合部位と推定される部位と、基質(インドールピルビン酸、フェニルピルビン酸など)結合部位の間を向いており、酵素反応生成物の4位の不斉に影響を与えると考えられた、R37およびL99について部位特異的変異を導入した。まず、目的とする塩基置換を導入するように設計した合成オリゴDNAプライマーをそれぞれ合成した。作製した変異型酵素と変異導入に使用した合成オリゴDNAプライマーの配列を表5に示す。変異型酵素の名称についてであるが、「野生型酵素でのアミノ酸残基→残基番号→置換したアミノ酸残基」の順に表記する。例えばR37Y変異型酵素は野生型酵素の37番目のArg(R)残基をTyr(Y)残基に置換した変異型酵素であることを意味する。なお、触媒反応に必須な残基を特定するために、活性中心近傍に位置するAsp120についても変異型酵素を作製した。
合成オリゴDNAプライマー(100 pmol/L) 1μl
10mM ATP 2μl
T4 polynucleotide kinase 1μl
DW 14μl
55℃ 1分
72℃ 3分 ×30サイクル
各種変異型PtALD遺伝子塔載プラスミドあるいはpKFPtALDを持つE.coli形質転換体を0.1 mg/ml アンピシリン、0.1 mMイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を含む3mlのLB培地(バクトトリプトン 1g/dl、酵母エキス 0.5g/dl、及びNaCl 1g/dl)に接種し、37℃、16時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、PtALD発現E.coliを調製した。各種変異型PtALDの発現の確認は、SDS−PAGEにて行った。培養液250μlより遠心分離により集菌して得られる菌体を500μlのSDS−PAGEサンプルバッファーに懸濁して10分間煮沸させ、溶菌・変性させた。遠心分離(10,000×g、10min)により得られる上清5〜10μlをSDS−PAGEに供したところ、野生型およびすべての変異型PtALD発現プラスミド導入株にて約25kDa付近の位置に特異的に出現するバンドを認め、野生型および変異型PtALDの発現を確認した。
実施例2にて調製した各種変異型PtALD発現E.coliを用いてIHOGおよびPHOGの生産を実施した。400μl培養液より遠心分離にて調整した菌体を以下の組成の反応液200μlにそれぞれ懸濁した。
PHOG合成反応溶液:100 mM Hepes−KOH (pH 8.5), 50 mM フェニルピルビン酸ナトリウム, 200 mM ピルビン酸ナトリウム, 1 mM MgCl2, 5 mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.5)
(1)変異型ptrpPtALDの構築と変異型PtALD発現E.coliの作製
pKFPtALDを鋳型として作製した変異型PtALD遺伝子をpTrp4に連結してpTrp4系での高発現プラスミドを作製し、これを導入した変異型PtALD高発現E.coliを用いて初発インドールピルビン酸あるいはフェニルピルビン酸濃度を300 mMに上げた条件にてIHOG合成反応を実施し、4位の不斉を解析した。
(1)にて調製した各種変異型ptrpPtALD導入E.coliの培養液1mlより遠心分離にて調製した菌体を、以下の組成の反応液500 μlにそれぞれ懸濁した。
LB−amp平板培地で37℃、16時間培養したE.coli JM109 / ptrpR37Y/L99K菌体を一白金耳かきとり、50 mlのLB−amp培地を含む500ml容フラスコ20本に接種し、37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーA(20mM Hepes-KOH(pH7.6))に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。遠心分離にて調製した菌体(湿菌体重量で約5g)を、以下の組成の反応液500mlに懸濁した。
実施例5で取得したアルドール反応液に、8N水酸化ナトリウム水溶液にてpH値を9に保ちながら、ヒドロキシルアミン塩酸塩27.1g(391mmol)を加え、5℃にて20時間攪拌した。得られた反応液中のIHOG−oxime量をHPLC分析にて定量した。その結果、反応液中に26mmolの4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸(IHOG−oxime)が生成した。4位の不斉について分析を行ったところ、4R−IHOG−oximeが21.3mmol、4S−IHOG−oximeが4.7mmol生成しており、e.e.=64.2%で4R体が優先的に生成していることを確認した。
実施例6で得た(4R)−4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩4.39 g(12.9mmol)を28%アンモニア水45 mlに溶解し、5%ロジウム炭素(50%含水品)2.31 gを加えて25℃にて1MPaの水素圧で反応を行った。24時間後に触媒を濾過し(0.2ミクロンフィルター)、その濾過液に炭酸カリウムを溶解した。その溶解液を濃縮し、得られた濃縮物10.9 gに水6.7 ml及びエタノール15 mlを加え25℃で撹拌し、更にエタノール20 mlを3時間かけて滴下した後。25℃で20時間攪拌した。
P. taetrolens ATCC4683由来アルドラーゼ(以下、PtALD)を高発現させたE.coliの可溶性画分から組換えPtALDの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、PHOGを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
LB−amp平板培地で37℃、16時間培養したE.coli JM109 / ptrpALDに菌体を一白金耳かきとり、3mlのLB−amp培地を含む試験管に接種し、37℃で16時間振とう培養した。該培養液0.5mlをLB−amp培地50mlを含む500ml容フラスコ10本に接種し、37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーA(20mM Hepes-KOH(pH7.6))に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を25mlのバッファーAに懸濁し、4℃で30分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離(x8000rpm、10分間×2回)により菌体残渣を除き、得られた上清を粗抽出画分とした。
上記の粗抽出画分23mlをバッファーAで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムQ-Sepharose FF 26/10(ファルマシア社製、CV=20ml)に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質(非吸着タンパク質)をバッファーAを用いて洗い流した後、KCl濃度を0Mから0.7Mまで直線的に変化させて(total 140ml)吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてPHOGアルドラーゼ活性を検出したところ約0.5M相当の画分にPHOGアルドラーゼ活性のピークを検出した。
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーB(20mM Hepes−KOH(pH7.6)、1M硫酸アンモニウム、pH7.6)に対して4℃で一晩透析し、10000rpmで10分間遠心分離した上清を0.45μmのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーBで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムPhenyl Sepharose HP HR 16/10(ファルマシア社製)に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
実施例8で得られたPtALDの精製酵素溶液を、限外ろ過セントリプレップ10(分画分子量10kDa)を用いて4℃で濃縮した。得られた濃縮酵素溶液(20.3 mg/ml)を用いて、ハンプトンリサーチ社のcrystal screenキットを使用して、結晶化条件を探索した。各種沈殿剤溶液2LとPtALD溶液2Lとを混合し、sitting drop蒸気拡散法により結晶化を試みた。その結果、1M ammomium phosphate, 0.1M sodium citrate (pH 5.6)を沈殿剤として4℃の条件で、2〜3日で0.1 mm×0.1 mm×1 mmの柱状晶を取得した。
PtALDの結晶は、常温測定では、X線損傷により結晶が劣化し、徐々に分解能が下がるため、低温条件下でのX線回折強度測定を行った。結晶を、25%のグリセロール及び1.5M リン酸アンモニウムを含む0.15Mクエン酸-ナトリウム緩衝液(pH5.6)に移した後、−173℃の窒素ガスを吹き付け、急速冷却した。文部科学省高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設のビームライン6Bに設置された(株)リガク製のX線回折装置R−AXIS V++を用いて、PtALDネイティヴ結晶のX線回折データを収集した。X線の波長は1.0Åに設定し、結晶からイメージングプレート検出器までの距離は180mmとした。1フレームのイメージングプレートに対しては振動角0.8°で120秒間露光し、150フレーム分のデータを集めた。結晶学的パラメータは、空間群がP6322、格子定数がa=94.38Å、c=111.49Åとなった。非対称単位には1個のアルドラーゼ分子が含まれており、結晶の水分含有率は60%である。結晶は1.5Å程度まで回折した。(株)リガク製のプログラムCrystalClearを用いて、データを処理した。データの質の指標であるRmergeの値は,40.0〜1.5Å分解能で0.097、最外郭シェルの1.55〜1.50Å分解能で0.260となった。データの完全率は、40.0〜1.5Å分解能で99.2%、最外郭シェルの1.55〜1.50Å分解能で99.9%となった。
PtALDとPHOGの共結晶化によって得られた結晶を、10 mM PHOG、25% グリセロール及び1.5M リン酸アンモニウムを含む0.15 M クエン酸−ナトリウム緩衝液(pH5.6)に移した後、−173℃の窒素ガスを吹き付け、急速冷却した。文部科学省高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設のビームライン6Bに設置された(株)リガク製のX線回折装置R−AXIS V++を用いて、結晶のX線回折データを収集した。X線の波長は1.0Åに設定し、結晶からイメージングプレート検出器までの距離は180mmとした。1フレームのイメージングプレートに対しては振動角0.8°で120秒間露光し、60フレーム分のデータを集めた。結晶学的パラメータは、空間群がP6322、格子定数がa=94.37Å、c=111.67Åとなり、ネイティヴ結晶とほぼ同型な結晶が得られた。結晶は1.8Å程度まで回折した。(株)リガク製のプログラムCrystalClearを用いて、データを処理した。データの質の指標であるRmergeの値は、40.0〜1.8Å分解能で0.097、最外郭シェルの1.86〜1.80Å分解能で0.201となった。データの完全率は、40.0〜1.8Å分解能で99.2%、最外郭シェルの1.86〜1.80Å分解能で99.5%となった。
PtALDとIHOG−oximeの共結晶化によって得られた結晶を、10 mM IHOG−oxime・2NH3,25% グリセロール及び1.5 M リン酸アンモニウムを含む0.15 M クエン酸−ナトリウム緩衝液(pH5.6)に移した後、−173℃の窒素ガスを吹き付け、急速冷却した。文部科学省高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設のビームライン6Bに設置された(株)リガク製のX線回折装置R−AXIS V++を用いて、結晶のX線回折データを収集した。X線の波長は1.0Åに設定し、結晶からイメージングプレート検出器までの距離は180mmとした。1フレームのイメージングプレートに対しては振動角0.8°で120秒間露光し、100フレーム分のデータを集めた。結晶学的パラメータは、空間群がP6322、格子定数がa=94.75Å、c=111.84Åとなり、ネイティヴ結晶とほぼ同型な結晶が得られた。結晶は2.2Å程度まで回折した。(株)リガク製のプログラムCrystalClearを用いて、データを処理した。データの質の指標であるRmergeの値は、40.0〜2.15Å分解能で0.097、最外郭シェルの2.25〜2.15Å分解能で0.203となった。データの完全率は、40.0〜2.15Å分解能で98.7%、最外郭シェルの2.25〜2.15Å分解能で98.7%となった。
以下の4種の配列に関して、Accelrys社製のソフトウェアInsight IIのヴァージョン2000.1に含まれる、スレッディング法のプログラムSeqFoldを用いて、各タンパク質のPtALDに対する立体構造類似性を解析した。
Pseudomonas coronafaciens由来アルドラーゼ(PcALD): PtALDに対する相同性40.6%
Arthrobacter keyseri由来アルドラーゼ(PcmE): PtALDに対する相同性28.0%
Pseudomonas ochraceae由来アルドラーゼ(ProA): PtALDに対する相同性29.3%
Score_Parameters: on
Substitution_Matrix: Gonnet
Seq_Weight: 1.00
Sec_Weight: 0.6
Align_Parameters: on
Align_Type: Global_Local
Max_Top_Scores: 50
Max_Top_Alignments: 25
Change_Fold_Lib: on
Fold_Library: pdb95+9ald.1d_prf
Change_Fold_Path: off
Quick_Z_Score: off
Random_Alignments: 500
Gap_Parameters: on
Struct_Gap_Open: 10.8
Struct_Gap_Extend: 0.6
Struct_Gap_Terminal: 0.6
Seq_Gap_Open: 10.8
Seq_Gap_Extend: 0.6
Seq_Gap_Terminal: 0.00
水酸化カリウム(純度85%)13.8gを溶解した水25mlに対し、フェニルピルビン酸5.0g(30.5mmol)、オキサル酢酸12.1g(91.4mmol)を加えて室温にて72時間反応させた。濃塩酸を用いて反応液のpH値を2.2に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥を行った後に、濃縮して残渣を得た。残渣を酢酸エチルとトルエンから再結晶を行い、4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸2.8g(11.3mmol)を結晶として得た。
(NMR測定)
1H NMR (D2O) δ:2.48(d, J=14.4 Hz, 0.18H), 2.60 (d, J= 14.4 Hz, 0.18H) , 2.85 − 3.30 (m, 3.64H) , 7.17 − 7.36 (m, 5H)
(分子量測定)
ESI-MS 計算値 C12H12O6 = 252.23, 分析値 251.22 (MH-)
1.6 wt%水酸化ナトリウム水溶液917gに、インドール−3−ピルビン酸73.8g(352mmol)を加えて溶解した。反応溶液を35℃とし、30%水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH値を11.1に保ちながら、50%ピルビン酸水溶液310.2g(1761mmol)を2時間かけて滴下した。更に4.5時間反応させて、4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ケトグルタル酸を含有する反応溶液を得た。これに、30%水酸化ナトリウム水溶液にてpH値を7に保ちながら、40%ヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液367.2g(2114mmol)を加え、5℃にて17.5時間攪拌した。濃塩酸を用いて反応液のpH値を2にし、有機物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、濃縮して残渣を得た。残渣に28%アンモニア水60mlと2−プロパノール1350mlから再結晶を行い、4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸の2アンモニウム塩43.4g(142mmol:収率40% 対インドール−3−ピルビン酸)を結晶として得た。
配列番号2:Pseudomonas taetrolens由来アルドラーゼ
配列番号3:プライマー
配列番号4:プライマー
配列番号5:プライマー
配列番号6:プライマー
配列番号7:プライマー
配列番号8:プライマー
配列番号9:R37Y作製用プライマー
配列番号10:R37W作製用プライマー
配列番号11:R37H作製用プライマー
配列番号12:R37P作製用プライマー
配列番号13:R37F作製用プライマー
配列番号14:L99D作製用プライマー
配列番号15:L99W作製用プライマー
配列番号16:L99Y作製用プライマー
配列番号17:L99G作製用プライマー
配列番号18:L99K作製用プライマー
配列番号19:D120A作製用プライマー
配列番号20:L99E作製用プライマー
配列番号21:L99H作製用プライマー
配列番号22:L99V作製用プライマー
配列番号23:Pseudomonas coronafaciens由来アルドラーゼ
配列番号24:Arthrobacter keyseri由来アルドラーゼ
配列番号25:Pseudomonas ochraceae由来アルドラーゼ
Claims (21)
- インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有するタンパク質であって、
下記(A)または(B)のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列において、下記(a)および(b)から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
(a)37番目のアルギニン残基から他のアミノ酸残基への置換
(b)99番目のロイシン残基から他のアミノ酸残基への置換
(B)(A)のアミノ酸配列において、37、67、71、97、98、99、100、119、120、139、141、189、192、193および209番目に位置するアミノ酸残基以外の箇所に、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を有するアミノ酸配列 - 前記(a)の置換は、下記(a')の置換であることを特徴とする、請求項1記載のタンパク質。
(a')37番目のアルギニン残基からチロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基またはプロリン残基への置換 - 前記(b)の置換は、下記(b')の置換であることを特徴とする、請求項1記載のタンパク質。
(b')99番目のロイシン残基からアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基またはグリシン残基への置換 - インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を優先的に生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を優先的に生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む組換えDNA。
- 請求項6に記載の組換えDNAを保有する微生物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−3−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成させ、生成された4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を採取することを特徴とする4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸の製造方法。
- 請求項4に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−3−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を優先的に生成させ、生成された4R−4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を採取することを特徴とする4R−4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸の製造方法。
- 請求項4に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−3−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を優先的に生成させる第1の工程、および、
前記第1の工程によって得られた4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を、アミノ化することにより4R−モナティンを生成させ、生成した4R−モナティンを採取する第2の工程
を含むことを特徴とする4R−モナティンの製造方法。 - 前記第2の工程において、(2R,4R)−モナティンを優先的に生成させることを特徴とする請求項10に記載の4R−モナティンの製造方法。
- 前記第2の工程において、4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸に酵素を作用せしめてアミノ化することを特徴とする請求項10または11に記載の4R−モナティンの製造方法。
- 請求項4に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−3−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を優先的に生成させることにより4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を含有する反応液を取得する第1の工程、
前記第1の工程によって得られた前記反応液に含まれる4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を、中性又はアルカリ性条件下において下記一般式(1)
(上記一般式(1)において、Rは水素原子、アルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。)
で表されるアミン化合物又はその塩と反応せしめ、4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸を生成させ、生成した4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸又はその塩の4R体を晶析する第2の工程、および、
得られた4R体の4−ヒドロキシ−4−(3−インドリルメチル)−2−ヒドロキシイミノグルタル酸又はその塩を還元し、生成した4R−モナティン又はその塩を採取する第3の工程を含むことを特徴とする4R−モナティンの製造方法。 - 前記一般式(1)で表されるアミン化合物が、ヒドロキシルアミン、メトキシアミン、ベンジルオキシアミンからなる群より選ばれる少なくとも一種のアミン化合物である、請求項13に記載の4R−モナティンの製造方法。
- 前記第3の工程において、水素及び水素添加触媒の存在下で、還元を実施することを特徴とする請求項13または14に記載の4R−モナティンの製造方法。
- 前記第3の工程において、晶析により(2R,4R)−モナティンを採取することを特徴とする請求項13〜15のいずれか一項に記載の4R−モナティンの製造方法。
- 前記第2の工程において、晶析溶媒として水、アルコール溶媒又は含水アルコール溶媒を用いることを特徴とする請求項13〜16のいずれか一項に記載の4R−モナティンの製造方法。
- インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有するタンパク質のスクリーニング方法であって、
下記(a)〜(e)の工程を含む、スクリーニング方法:
(a)任意のアルドラーゼの立体構造を、配列番号2記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼの立体構造と比較する工程;
(b)任意のアルドラーゼのなかから、配列番号2記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼと立体構造の類似性を有するアルドラーゼを、スレッディング法により3次構造をアライメントすることにより選択する工程;
(c)選択されたアルドラーゼのアミノ酸配列のうち、配列番号2記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼをテンプレートタンパク質として、前記テンプレートタンパク質の37番目のアルギニン残基および99番目のロイシン残基に対応するアミノ酸残基を特定する工程;
(d)選択されたアルドラーゼにおいて、前記テンプレートタンパク質の37番目のアルギニン残基および99番目のロイシン残基に対応するアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換する工程;および
(e)(d)で得られたアミノ酸残基の置換を有するアルドラーゼの活性を測定する工程であって、該活性が、インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性である、工程。 - インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有するタンパク質のスクリーニング方法であって、
下記(a1)および(b1)の工程を含む、スクリーニング方法:
(a1)Pseudomonas taetrolens、Pseudomonas Coronafaciens、Arthrobacter keyseriまたはPseudomonas ochraceaeに由来する、アルドラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列のうち、配列番号2記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼをテンプレートタンパク質として、スレッディング法により3次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質の37番目のアルギニン残基および99番目のロイシン残基に対応するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基を、前記テンプレートタンパク質のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基に置換する工程;および
(b1)で得られたアミノ酸残基の置換を有するアルドラーゼの活性を測定する工程であって、該活性が、インドール−3−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて4R体の4−フェニルメチル−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性である、工程。 - Pseudomonas taetrolens、Pseudomonas Coronafaciens、Arthrobacter keyseriまたはPseudomonas ochraceaeに由来する、アルドラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号2、配列番号23、配列番号24または配列番号25記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼであり、かつ
配列番号2記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼをテンプレートタンパク質として、スレッディング法により3次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質の37番目のアルギニン残基および99番目のロイシン残基に対応するアミノ酸残基が、37番目のアルギニン残基および99番目のロイシン残基または99番目のメチオニン残基である、請求項19に記載のスクリーニング方法。 - さらに以下の工程(a2)を含む、請求項19記載のスクリーニング方法:
(a2)Pseudomonas taetrolens、Pseudomonas Coronafaciens、Arthrobacter keyseriまたはPseudomonas ochraceaeに由来する、アルドラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列のうち、前記テンプレートタンパク質を用いてスレッディング法により3次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質の67、71、97、98、100、119、139、141、189、192、193および209番目に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において、少なくとも1つのアミノ酸残基を、前記テンプレートタンパク質のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基に置換する工程。
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