JP5056825B2 - 変異型d−アミノトランスフェラーゼおよびこれを用いた光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法 - Google Patents
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Description
〔1〕 下記(A)または(B)のアミノ酸配列を有し、かつ、D−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(A)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列
(B)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を有するアミノ酸配列
〔2〕 下記(A)または(B)のアミノ酸配列を有するとともに、D−アミノトランスフェラーゼ活性を有し、
配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸から生成する(2R、4R)−モナティンの生成量が向上することを特徴とするタンパク質。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列において、100位、180〜183位、243位、244位から選ばれる少なくとも一箇所にアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
(B)(A)のアミノ酸配列において、100位、180〜183位、243位、244位以外の箇所に、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を有するアミノ酸配列
〔3〕 下記(A)または(B)のアミノ酸配列を有し、かつ、4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸に対し、4R体選択的に作用して、(2R,4R)−モナティンを生成するD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列において、下記(a)〜(e)から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
(a)181位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
(b)182位のアラニン残基の他のアミノ酸残基への置換
(c)183位のアスパラギン残基の他のアミノ酸残基への置換
(d)243位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
(e)244位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
(B)(A)のアミノ酸配列において、181〜183位、243位、244位以外の箇所に、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を有するアミノ酸配列
〔4〕 前記(a)〜(e)の置換は、下記(a’)〜(e’)の置換であることを特徴とする、〔3〕記載のタンパク質。
(a’)181位のセリン残基のアスパラギン酸残基への置換
(b’)182位のアラニン残基のリシン残基、またはセリン残基への置換
(c’)183位のアスパラギン残基のセリン残基への置換
(d’)243位のセリン残基のグルタミン酸残基、ロイシン残基、リシン残基、アスパラギン残基、またはグルタミン残基への置換
(e’)244位のセリン残基のリシン残基への置換
〔5〕 下記(A)または(B)のアミノ酸配列を有するとともに、D−アミノトランスフェラーゼ活性を有し、
配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸から2R−モナティンを生成するD−アミノトランスフェラーゼ活性が高いことを特徴とするタンパク質。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列において、下記(a)〜(c)から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
(a)100位のアスパラギン残基の他のアミノ酸残基への置換
(b)181位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
(c)182位のアラニン残基の他のアミノ酸残基への置換
(B)(A)のアミノ酸配列において、100位、181位および182位以外の箇所に、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を有するアミノ酸配列
〔6〕 前記(a)〜(c)の置換は、下記(a’)〜(c’)の置換であることを特徴とする、〔5〕記載のタンパク質。
(a’)100位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換
(b’)181位のセリン残基のアラニン残基への置換
(c’)182位のアラニン残基のセリン残基への置換
〔7〕 配列番号2に示すアミノ酸配列において、下記(i)〜(vii)のいずれかから選ばれる置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質。
(i)243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換
(ii)244位のセリン残基のリシン残基への置換
(iii)180位のセリン残基のアラニン残基への置換および243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換
(iv)180位のセリン残基のアラニン残基への置換および244位のセリン残基のリシン残基への置換
(v)243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換および244位のセリン残基のリシン残基への置換
(vi)100位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換および243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換
(vii)182位のアラニン残基のセリン残基への置換および243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換
〔8〕 下記(A)または(B)のアミノ酸配列を有し、かつ、4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸に対し、4R体選択的に作用して、(2R,4R)−モナティンを生成するD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列において、下記(a)、(b)から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
(a)243位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
(b)244位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
(B)(A)のアミノ酸配列において、243位、244位以外の箇所に、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を有するアミノ酸配列
〔9〕 前記(a)、(b)の置換は、下記(a’)、(b’)の置換であることを特徴とする、〔8〕記載のタンパク質。
(a’)243位のセリン残基のリシン残基、またはアスパラギン残基への置換
(b’)244位のセリン残基のリシン残基への置換
〔10〕 〔2〕〜〔9〕のいずれか1項に記載のタンパク質、および、アミノ供与体の存在下で、下記一般式(1)
で示されるケト酸から、下記一般式(2)
で示される(2R、4R)体のグルタミン酸誘導体(塩の形態を含む)を生成することを特徴とする光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
〔11〕 前記Rは、フェニル基またはインドリル基であることを特徴とする〔10〕記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
〔12〕 前記アミノ供与体は、アミノ酸であることを特徴とする〔10〕または〔11〕記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
〔13〕 反応系にL−アミノ酸をD−アミノ酸に変換する反応を触媒する活性を有する酵素、又は、当該酵素活性を有する微生物を含有することを特徴とする、〔12〕記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
〔14〕 下記(A)または(B)の塩基配列を有し、かつ、D−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号1記載の塩基配列
(B)配列表の配列番号1記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
〔15〕 下記(A)または(B)のアミノ酸配列を有し、かつ、D−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列
(B)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を有するアミノ酸配列
〔16〕 下記(A)または(B)のアミノ酸配列を有するとともに、D−アミノトランスフェラーゼ活性を有し、
配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と比較して、4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸から(2R、4R)−モナティンを生成するD−アミノトランスフェラーゼ活性が高いタンパク質をコードするDNA。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列において、100位、180〜183位、243位、244位から選ばれる少なくとも一箇所にアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
(B)(A)のアミノ酸配列において、100位、180〜183位、243位、244位以外の箇所に、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を有するアミノ酸配列
〔17〕 下記(A)または(B)のアミノ酸配列を有し、かつ、4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸に対し、4R体選択的に作用して、(2R,4R)−モナティンを生成するD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列において、下記(a)、(b)から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
(a)243位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
(b)244位のセリン残基の他のアミノ酸残基への置換
(B)(A)のアミノ酸配列において、243位、244位以外の箇所に、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位を有するアミノ酸配列
〔18〕 〔14〕〜〔17〕のいずれか1項に記載のDNAとベクターDNAとを接続して得られることを特徴とする組換えDNA。
〔19〕 〔18〕記載の組換えDNAによって形質転換された細胞。
〔20〕 〔19〕記載の細胞を培地中で培養し、培地および/または細胞中にD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
〔A〕変異型D−アミノトランスフェラーゼ
〔I〕変異型D−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
(i)変異型Bacillus macerans由来D−アミノトランスフェラーゼ
(ii)変異型Bacillus sphaericus由来D−アミノトランスフェラーゼ
〔II〕変異型D−アミノトランスフェラーゼの製造方法
(i)野生型D−アミノトランスフェラーゼ遺伝子の取得
(ii)変異型D−アミノトランスフェラーゼ遺伝子の調製
(iii)変異型D−アミノトランスフェラーゼ産生菌の作製・培養
〔B〕変異型D−アミノトランスフェラーゼを用いた(2R,4R)−グルタミン酸誘導体の製造方法
〔I〕D−アミノトランスフェラーゼ
〔II〕基質ケト酸
〔III〕アミノ供与体
〔IV〕反応条件
の順に詳細に説明する。
本発明の変異型D−アミノトランスフェラーゼは、下記式(5)に示すIHOGから2R−モナティンを生成する反応を触媒するBacillus属由来のD−アミノトランスフェラーゼのアミノ酸残基の一部を置換したD−アミノトランスフェラーゼである。本発明の変異型D−アミノトランスフェラーゼは、(2R,4R)−モナティンを効率的に生成できるよう野生型D−アミノトランスフェラーゼの一部のアミノ酸残基を置換した点に特徴を有する。
本発明の変異型D−アミノトランスフェラーゼのもととなる野生型D−アミノトランスフェラーゼとしては、IHOGから2R−モナティンを生成する反応を触媒するBacillus属由来のD−アミノトランスフェラーゼを使用できる。このようなD−アミノトランスフェラーゼとしては、Bacillus macerans由来D−アミノトランスフェラーゼや、Bacillus sphaericus由来D−アミノトランスフェラーゼを例示できる。
野生型のBacillus maceransAJ1617由来D−アミノトランスフェラーゼは、配列表配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する。
配列表配列番号2記載のアミノ酸配列のうち、181〜183位の領域と243〜244位の領域がIHOGの4位の立体認識に関与しうる部位である。
配列表配列番号2記載のアミノ酸配列のうち、100位、181位および182位がD−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位である。
本発明においては、上記(1)で説明した4R体選択性にかかわる部位、(2)で説明したD−アミノトランスフェラーゼ活性の向上に関与する部位の少なくとも一方の部位のアミノ酸残基を置換することによって、IHOGから生成する(2R,4R)−モナティンの生成量が向上するD−アミノトランスフェラーゼを調整することが好ましい。
野生型のBacillus sphaericusATCC10208由来D−アミノトランスフェラーゼは、配列表配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する。Bacillus sphaericus由来D−アミノトランスフェラーゼ遺伝子については、特許文献2、及び、非特許文献5に報告がある。前述のように、Bacillus sphaericusATCC10208由来D−アミノトランスフェラーゼは、Bacillus macerans由来D−アミノトランスフェラーゼと共通する243位、244位に4R体選択性にかかわる部位を有すると予測されている。
本発明の変異型D−アミノトランスフェラーゼは、IHOGから2R−モナティンを生成する反応を触媒する野生型のD−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子に、(2R,4R)−モナティンを効率的に生成するために関与する部位のアミノ酸残基がアミノ酸置換されるような変異を導入した変異型D−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を作製し、同変異型遺伝子を適当な宿主を用いて発現させることによって製造することができる。
IHOGから2R−モナティンを生成する反応を触媒するD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする構造遺伝子を含むDNA断片は、当該酵素活性を有する微生物等の細胞からクローニングすることができる。
バチルス マセランス Bacillus macerans AJ1617;
バチルス スフェリカス Bacillus sphaericus ATCC10208;
バチルス プルビファシエンス Bacillus pulvifaciens AJ1327;
バチルス レンタス Bacillus lentus AJ12699;
バチルス レンタス Bacillus lentus ATCC 10840
(i)寄託機関の名称・あて名
名称:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、
(ii)寄託日:平成13年12月13日
(iii)寄託番号:FERM BP−8243(平成13年12月13日に寄託されたFERM P−18653より平成14年11月22日に国際寄託へ移管)
上記のD−アミノトランスフェラーゼ産生菌から得られる野生型D−アミノトランスフェラーゼは、モナティン前駆体であるIHOGの光学異性を区別できず、4S体、4R体のいずれのIHOGにも作用して、(2R,4R)−モナティンおよび(2R,4S)−モナティンをほぼ等量の割合で生成させてしまい、また、IHOGの分解反応、環化反応の反応速度に対してアミノ化反応速度が必ずしも十分でないので、(2R,4R)−モナティンを効率的に生成するために関与する部位に人為的に変異を起こさせ、IHOGから(2R,4R)−モナティンを効率的に生成するように改変する。
(1)配列番号2に示すアミノ酸配列において、100位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換を有するアミノ酸配列
(2)配列番号2に示すアミノ酸配列において、181位のセリン残基のアスパラギン酸残基への置換を有するアミノ酸配列
(3)配列番号2に示すアミノ酸配列において、182位のアラニン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
(4)配列番号2に示すアミノ酸配列において、182位のアラニン残基のセリン残基への置換を有するアミノ酸配列
(5)配列番号2に示すアミノ酸配列において、183位のアスパラギン残基のセリン残基への置換を有するアミノ酸配列
(6)配列番号2に示すアミノ酸配列において、243位のセリン残基のグルタミン酸残基への置換を有するアミノ酸配列
(7)配列番号2に示すアミノ酸配列において、243位のセリン残基のロイシン残基への置換を有するアミノ酸配列
(8)配列番号2に示すアミノ酸配列において、243位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
(9)配列番号2に示すアミノ酸配列において、243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換を有するアミノ酸配列
(10)配列番号2に示すアミノ酸配列において、243位のセリン残基のグルタミン残基への置換を有するアミノ酸配列
(11)配列番号2に示すアミノ酸配列において、244位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
(12)配列番号2に示すアミノ酸配列において、180位のセリン残基のアラニン残基への置換および243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換を有するアミノ酸配列
(13)配列番号2に示すアミノ酸配列において、180位のセリン残基のアラニン残基への置換および244位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
(14)配列番号2に示すアミノ酸配列において、243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換および244位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
(15)100位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換および181位のセリン残基のアラニン残基への置換
(16)100位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換および182位のアラニン残基のセリン残基への置換
(17)181位のセリン残基のアラニン残基への置換および182位のアラニン残基のセリン残基への置換
(18)配列番号2に示すアミノ酸配列において、100位のアスパラギン残基のアラニン残基への置換および243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換を有するアミノ酸配列
(19)配列番号2に示すアミノ酸配列において、182位のアラニン残基のセリン残基への置換および243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換を有するアミノ酸配列
(20)配列番号4に示すアミノ酸配列において、243位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
(21)配列番号4に示すアミノ酸配列において、243位のセリン残基のアスパラギン残基への置換を有するアミノ酸配列
(22)配列番号4に示すアミノ酸配列において、244位のセリン残基のリシン残基への置換を有するアミノ酸配列
上記のようにして得られる変異型D−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むDNA断片は、適当なベクターに再度組換えて宿主細胞に導入させることにより、変異型D−アミノトランスフェラーゼを発現した組換え菌を得ることができる。
本発明の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法は、IHOGに作用して(2R,4R)−モナティンを生成するD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、および、アミノ供与体の存在下で、下記一般式(1)
で示されるケト酸から、下記一般式(2)
で示されるグルタミン酸誘導体(塩の形態を含む)の(2R、4R)体を生成することを特徴とする。
本発明の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法において、「IHOGに作用して(2R,4R)−モナティンを生成するD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」としては、〔A〕変異型D−アミノトランスフェラーゼの項で説明した本発明の変異型D−アミノトランスフェラーゼを用いる。
本発明においては、基質として一般式(1)のケト酸を用いる。
化学反応系を利用して一般式(1)の基質ケト酸を合成する場合は、以下に示す方法や後述の参考例を利用して容易に実施することができる。
酵素系を利用して一般式(1)の基質ケト酸を製造する場合は、上記一般式(6)で示される置換ピルビン酸とピルビン酸(ないしオキサロ酢酸)から一般式(1)で示されるケト酸を生成する反応を触媒する酵素(アルドラーゼ)を用いることにより、特に困難なく、一般式(1)で示されるケト酸を生成できる。
(i)受託番号 FERM BP−8246(平成14年6月10日に寄託されたFERM P−18881より平成14年11月22日に国際寄託へ移管)
(ii)受託日 2002年6月10日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(2)Pseudomonas desmolytica AJ1582株
(i)受託番号 FERM BP−8247(平成14年6月10日に寄託されたFERM P−18882より平成14年11月22日に国際寄託へ移管)
(ii)受託日 2002年6月10日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(3)Erwinia sp. AJ2917株
(i)受託番号 FERM BP−8245(平成14年6月10日に寄託されたFERM P−18880より平成14年11月22日に国際寄託へ移管)
(ii)受託日 2002年6月10日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(4)Flavobacterium rhenanum AJ2468株
(i)受託番号 FERM BP−1862
(ii)受託日 1985年9月30日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
(5)Xanthomonas citri AJ2797株
(i)受託番号 FERM BP−8250(昭和60年9月30日に寄託されたFERM P−8462より平成14年11月27日に国際寄託へ移管)
(ii)受託日 1985年9月30日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)
本発明においては、D−アミノトランスフェラーゼを用いるため、アミノ供与体としてD−アミノ酸を用いる。ここでいうアミノ供与体には、天然及び非天然D−アミノ酸等のアミノ化合物が含まれる。即ち、D−グルタミン酸、D−アスパラギン酸、D−アラニン、D−トリプトファン、D−フェニルアラニン、D−イソロイシン、D−ロイシン、D−チロシン、D−バリン、D−アルギニン、D−アスパラギン、D−グルタミン、D−メチオニン、D−オルニチン、D−セリン、D−システイン、D−ヒスチジン、D−リジン等がアミノ酸の例として挙げられる。反応に添加するアミノ供与体は1種類でもよいし、複数の供与体の混合物でもよい。また、安価なDL−アミノ酸を用いることもできる。
本発明の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法は、D−アミノトランスフェラーゼ、および、アミノ供与体の存在下で、一般式(1)の基質ケト酸から、(2R、4R)体のグルタミン酸誘導体を効率的に生成するものである。
移動相:12%(v/v)アセトニトリル/0.05%(v/v)トリフルオロ酢酸水溶液
流速:1.5ml/min
カラム温度:30℃
検出:UV210nm
移動相:過塩素酸水溶液(pH1.5)/10%(v/v)メタノール
流速:0.5ml/min
カラム温度:30℃
検出:UV210nm
移動相:過塩素酸水溶液(pH1.5)
流速:1ml/min
カラム温度:30℃
検出:UV210nm
ブイヨン平板培地(栄研化学)に試験する微生物菌株を接種し、30℃で24時間培養した。ここから菌体をかきとり、これを100mM Tris−HCl(pH7.6)、50mM PHOG、100mM D−グルタミン酸、100mM D−アラニン、1mM ピリドキサール−5’−リン酸、及び0.5%(v/v)トルエンからなる反応液1mlに約5重量%湿菌体となるように接種し、30℃で16時間インキュベートした。反応終了後に、生成したPHGを定量した。その結果、表2に示す微生物においてPHOGからの2R−PHG生成活性が見出され、PHOGから(2R,4S)−PHG及び(2R,4R)−PHGを生成せしめることができた。
(1)染色体DNAの調製
Bacillus macerans AJ1617株を50mlのブイヨン培地を用いて30℃で一晩培養した(前培養)。この培養液5mlを種菌として、50mlのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液50mlを遠心分離操作(12000xg、4℃、15分間)に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体DNAを調製した。
まず、Bacillus macerans AJ1617株の染色体DNA30μgに制限酵素EcoRIを1U添加し、37℃にて3時間反応させて部分消化した。次にこのDNAからアガロースゲル電気泳動にて3〜6kbpの断片を回収した。これをプラスミドpUC118のEcoRI切断物(BAP処理済み・宝酒造製)1μgにライゲーションし、E.coli JM109を形質転換して遺伝子ライブラリを作製した。これをアンピシリン 0.1mg/mlを含むLB培地(トリプトン1%、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウム1%、寒天2%、pH7.0)にプレーティングして、コロニーを形成させた。出現したコロニーをアンピシリン 0.1mg/mlとイソブチル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を0.1mM含むLB液体培地1mlに接種し、37℃で一晩培養した。培養液200〜400μlを遠心分離により集菌・洗浄し菌体を得た。得られた菌体を、100mM Tris−HCl(pH8.0)、50mM ピルビン酸ナトリウム、100mM D−グルタミン酸、1mM ピリドキサール−5’−リン酸、1%(v/v)トルエンからなる反応液200μlに接種し、30℃で30分間反応させた。反応終了後、反応液を遠心分離した上清5μlを200μlのピルビン酸定量反応液(100mM Tris−HCl(pH7.6)、1.5mM NADH、5mM MgCl2、16U/ml Lactate dehydrogenase(オリエンタル酵母製))を含む96ウェルプレートに加え、30℃で10分間反応させた後に340nmの吸光度をプレートリーダー(SPECTRA MAX190、Molecular Device社製)を用いて測定した。同様の反応を終濃度0.2mM〜1mMのピルビン酸ナトリウムを添加して実施し、これをスタンダードとしてピルビン酸の減少量を定量し、D−アミノトランスフェラーゼ(以下、DAT)活性を検出した。
プラスミドpUCBMDATの挿入断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定したところ、配列表1に示す配列のうち、630番から1481番に対応する約850bpからなるORFを見出した。本ORFについて既知配列との相同性検索を行ったところ、Bacillus sphaericus ATCC10208株由来のD−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において91%の相同性を、Bacillus sp.YM−1株由来のD−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において66%の相同性を、Bacillus licheniformis ATCC10716株由来のD−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において42%の相同性を示した。なお、ここでの相同性は、遺伝子解析ソフト「genetyx 6」(GENETYX社)を用い、各種パラメータは初期設定の通りとして算出した値である。この結果より、本ORFはD−アミノトランスフェラーゼ遺伝子をコードしていることが明らかとなった。
(1)BMDAT発現E.coliの調製
pUCBMDATを持つE.coli形質転換体を0.1mg/ml アンピシリン、0.1mM イソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を含む3mlのLB培地(バクトトリプトン 1g/dl、酵母エキス 0.5g/dl、及びNaCl 1g/dl)に接種し、37℃、16時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、BMDAT発現E.coliを調製した。
上記(1)で調製した菌体を100mM Tris‐HCl(pH8.0)、50mM IHOG、200mM D−アラニン、1mM ピリドキサール−5’−リン酸、及び0.5%(v/v)トルエンからなる反応液1mlに、湿菌体重量で2%となるように懸濁した後に、33℃で16時間振とう反応した。反応終了後に生成した2R−モナチンを定量した。その結果、16.4mMの(2R,4S)−モナティンと17.0mMの(2R,4R)−モナティンが生成した。
(1)変異型プラスミドの作製
部位特異的変異(Site−Directed mutagenesis)による変異型BMDAT発現プラスミドの作製には、STRATAGENE社製QuikChange Site−Directed Mutagenesis Kitを使用した。まず、目的とする塩基置換を導入し、かつ2本鎖DNAのそれぞれ鎖に相補的になるように設計した合成オリゴDNAプライマーをそれぞれ(2本1組)合成した。作製した変異型酵素と変異導入に使用した合成オリゴDNAプライマーの配列を表3に示す。
95℃ 30秒
55℃ 1分
68℃ 8分 ×18サイクル
各種変異型BMDAT遺伝子塔載プラスミドあるいはpUCBMDATを持つE.coli形質転換体を0.1mg/ml アンピシリン、0.1mM イソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を含む3mlのLB培地(バクトトリプトン 1g/dl、酵母エキス 0.5g/dl、及びNaCl 1g/dl)に接種し、37℃、16時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、BMDAT発現E.coliを調製した。各種変異型BMDATの発現の確認は、SDS−PAGEにて行った。培養液250μlより遠心分離により集菌して得られる菌体を500μlのSDS−PAGEサンプルバッファーに懸濁して10分間煮沸させ、溶菌・変性させた。遠心分離(10,000×g,10min)により得られる上清5〜10μlをSDS−PAGEに供したところ、野生型およびすべての変異型BMDAT発現プラスミド導入株にて約32kDa付近の位置に特異的に出現するバンドを認め、野生型および変異型BMDATの発現を確認した。
実施例4にて調製した各種変異型BMDAT発現E.coliを用いて4R,S−IHOGからの2R−モナティンの生産と4R,S−PHOGからの2R−PHGの生産を実施した。400μl培養液より遠心分離にて調整した菌体を以下の組成の反応液にそれぞれ懸濁した。
(1)発現プラスミドの構築
バチルス スフェリカス(Bacillus sphaericus)由来D−トランスアミナーゼ遺伝子(以下「bsdat」と略記する。)をE.coliで発現させるために、pUC18のlacプロモーターの下流にbsdat遺伝子を連結したプラスミドpUCBSDATを以下のようにして構築した。先ず、バチルス スフェリカス(Bacillus sphaericus)ATCC10208株の染色体DNAを鋳型とし、下記表5に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRにより当該遺伝子を増幅した。これにより、欧州公開特許EP0736604本文中、配列番号2記載のdat塩基配列において、8番目から1275番目までに相当するDNA断片が増幅される。この断片をBamHI、PstIにて処理し、pUC18のBamHI、PstI切断物とライゲーションした後、E.coli JM109に導入した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを持った株を選択し、発現プラスミドpUCBSDATを構築した。
pUCBSDATを持つE.coli形質転換体0.1mg/ml アンピシリンを含むLB培地(バクトトリプトン 1g/dl、酵母エキス 0.5g/dl、及びNaCl 1g/dl)で37℃、16時間シード培養した。LB培地50mlを張り込んだ500ml容坂口フラスコにこのシード培養液を1ml添加し、37℃にて本培養を行った。培養開始2.5時間後に、終濃度1mMとなるようにイソプロピル1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、更に4時間培養を行った。得られた培養液より集菌、洗浄し、BSDAT発現E.coliを調製した。
上記(2)で調製した菌体を100mM Tris−HCl(pH7.6)、50mM IHOG、200mM D−Ala、1mM ピリドキサール−5’−リン酸、及び0.5%(v/v)トルエンからなる反応液1mlに、湿菌体重量で5%となるように懸濁した後に、10ml容試験管に移し、30℃で18時間振とう反応した。反応終了後に生成した2R−モナティンを定量した。その結果IHOGから13.8mMの(2R,4R)−モナティンおよび12.7mMの(2R,4S)−モナティンを生成せしめることができた。
(1)変異型プラスミドの作製
部位特異的変異 (Site−Directed mutagenesis)による変異型BSDAT発現プラスミドの作製には、STRATAGENE社製QuikChange Site−Directed Mutagenesis Kitを使用した。まず、目的とする塩基置換を導入し、かつ2本鎖DNAのそれぞれ鎖に相補的になるように設計した合成オリゴDNAプライマーをそれぞれ(2本1組)合成した。作製した変異型酵素と変異導入に使用した合成オリゴDNAプライマーの配列を表6に示す。変異型酵素の名称についてであるが、「野生型酵素でのアミノ酸残基→残基番号→置換したアミノ酸残基」の順に表記する。例えばS243N変異型酵素は野生型酵素の243番目のSer(S)残基をAsn(N)残基に置換した変異型酵素であることを意味する。
95℃ 30秒
55℃ 1分
68℃ 8分 ×18サイクル
各種変異型BSDAT遺伝子塔載プラスミドあるいはpUCBSDATを持つE.coli形質転換体を0.1mg/ml アンピシリン、0.1mM イソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を含む3mlのLB培地(バクトトリプトン 1g/dl、酵母エキス 0.5g/dl、及びNaCl 1g/dl)に接種し、37℃、16時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、BSDAT発現E.coliを調製した。各種変異型BSDATの発現の確認は、SDS−PAGEにて行った。培養液250μlより遠心分離により集菌して得られる菌体を500μlのSDS−PAGEサンプルバッファーに懸濁して10分間煮沸させ、溶菌・変性させた。遠心分離(10,000×g,10min)により得られる上清5〜10μlをSDS−PAGEに供したところ、野生型およびすべての変異型BSDAT発現プラスミド導入株にて約32kDa付近の位置に特異的に出現するバンドを認め、野生型および変異型BSDATの発現を確認した。
実施例7にて調製した各種変異型BSDAT発現E.coliを用いて4R,S−IHOGからの2R−モナティンの生産を実施した。400μL培養液より遠心分離にて調整した菌体を以下の組成の反応液にそれぞれ懸濁した。
IHOG反応溶液:100mM Tris−HCl(pH8.0)、50mM 4R、S−IHOG,200mM D−Ala、1mMピリドキサール−5’−リン酸、0.5%(v/v)トルエン
実施例4と同様の方法で、変異型BMDAT発現プラスミドを作製し、BMDAT発現E.coliを調製した。変異導入に使用した合成オリゴDNAプライマーの配列を表8に示す。
実施例9にて調製した各種変異型BMDAT発現E.coliを用いて4R,S−IHOGからの2R−モナティンの生産と、4R,S−PHOGからの2R−PHGの生産を実施した。400μl培養液より遠心分離にて調製した菌体を以下の組成の反応液にそれぞれ懸濁した。
各種変異型BMDAT遺伝子搭載プラスミドあるいはpUCBMDATを持つE.coli形質転換体を0.1mg/mlアンピシリン、0.1mM IPTGを含む3mlのカザミノ酸培地(0.5g/dl 硫酸アンモニウム、0.14g/dl KH2PO4、0.23g/dl クエン酸・2Na・3H2O、0.1g/dl MgSO4・7H2O、2mg/dl FeSO4、2mg/dl MnSO4、2mg/dl 塩酸ピリドキシン、0.1mg/dl thiamine、1g/dl カザミノ酸、0.3g/dl グリセロール、pH7.5)に接種し、37℃、16時間振とう培養した。得られた培養液1mlより集菌、洗浄し、1mlの20mM Tris−HCl(pH7.6)に懸濁し、4℃にて30分間超音波破砕した。超音波破砕液を15000rpmで5分間遠心分離した上清を酵素源とした。D−アミノトランスフェラーゼ活性(以下、DAT活性)の測定は、D−Alaをアミノドナーとしたα−ケトグルタル酸へのアミノ基転移活性を、反応の進行に従ってD−Alaより生成するピルビン酸を酵素的に定量することにより行った。結果を表10に示す。
(1)菌体の調製
pS243N/A182Sを持つE.coli形質転換体を0.1mg/ml アンピシリンを含む3mlのLB培地(バクトペプトン 1g/dl、酵母エキス 0.5g/dl、NaCl 1g/dl)に接種し、37℃、16時間シード培養した。この培養液2.5mlを、0.1mg/ml アンピシリン、0.1mM IPTGを含むカザミノ酸培地(0.5g/dl 硫酸アンモニウム、0.14g/dl KH2PO4、0.23g/dl クエン酸・2Na・3H2O、0.1g/dl MgSO4・7H2O、2mg/dl FeSO4、2mg/dl MnSO4、2mg/dl 塩酸ピリドキシン、0.1mg/dl thiamine、1g/dl カザミノ酸、0.3g/dl グリセロール、pH7.5)50mlを張り込んだ500ml容坂口フラスコに添加し、37℃、18時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、S243N/A182S変異型BMDAT発現E.coliを調製した。
上記(1)にて、240ml培養液より集菌・洗浄して調製した菌体を、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.3)、244mM 4R,S−IHOG、600mM DL−Ala、1mM ピリドキサール−5’−リン酸からなる反応液120mlに懸濁し、37℃で24時間攪拌し、反応を実施した。反応中のpHの低下を防ぐため、1N KOHにてpHをpH8.4±0.1に制御した。その結果、24時間で79.2mMの(2R,4R)−IHOGが反応液中に蓄積した(対4R−IHOGモル収率65%)。得られた反応液を5000rpmで10分間遠心分離して上清を取得した。
酵素反応液121.84g((2R,4R)−モナティン 2.72wt%)を合成吸着剤(三菱化学製DIAION−SP207)が600ml充填された樹脂塔(直径4cm)に通し、流速7.5/分で純水を3時間通液し、更に流速7.5/分で15%2−プロパノール水溶液を3時間通液し、2.6〜3.5〔溶出液量/樹脂用量(L/L−R)〕を収集することにより、(2R,4R)−モナティンをほぼ定量的に分取した。
水酸化カリウム18.91g(286.5mmol、含量85重量%)を溶解した水64.45mlに、インドール−3−ピルビン酸7.50g(35.8mmol、含量97.0重量%)とオキサロ酸14.18g(107.4mmol)を加えて溶解させた。この混合溶液を35℃にて24時間攪拌した。
1H−NMR(400MHz,D2O):3.03(d,1H,J=14.6Hz),3.11(d,1H,J=14.6Hz),3.21(d,1H,J=18.1Hz),3.40(d,1H,J=18.1Hz),7.06−7.15(m,3H),7.39(d,1H,J=7.8Hz),7.66(d,1H,J=7.8Hz).
13C−NMR(100MHz,D2O):35.43,47.91,77.28,109.49,112.05,119.44,119.67,121.91,125.42,128.41,136.21,169.78,181.43,203.58
水酸化カリウム(純度85%)13.8gを溶解した水25mlに対し、フェニルピルビン酸5.0g(30.5mmol)、オキサロ酢酸12.1g(91.4mmol)を加えて室温にて72時間反応させた。濃塩酸を用いて反応液のpH値を2.2に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥を行った後に、濃縮して残渣を得た。残渣を酢酸エチルとトルエンから再結晶を行い、PHOG2.8g(11.3mmol)を結晶として得た。
1H−NMR(D2O)δ:2.48(d,J=14.4Hz,0.18H),2.60(d,J=14.4Hz,0.18H),2.85−3.30(m,3.64H),7.17−7.36(m,5H)
ESI−MS 計算値 C12H12O6=252.23,分析値251.22(MH−)
Claims (9)
- 下記(A)または(B)のアミノ酸配列を有し、かつ、4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸に対し、4R体選択的に作用して、(2R,4R)−モナティンを生成するD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列において、下記(a)、(b)から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
(a)243位のセリン残基のリシン残基、またはアスパラギン残基への置換
(b)244位のセリン残基のリシン残基への置換
(B)(A)のアミノ酸配列において、243位、244位以外の箇所に、1〜30個のアミノ酸残基の変異を有し、当該変異が置換、欠失、挿入、付加および逆位から選ばれるものである、アミノ酸配列 - 前記Rは、フェニル基またはインドリル基であることを特徴とする請求項2記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
- 前記アミノ供与体は、アミノ酸であることを特徴とする請求項2または3記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
- 反応系にL−アミノ酸をD−アミノ酸に変換する反応を触媒する活性を有する酵素、又は、当該酵素活性を有する微生物を含有することを特徴とする、請求項4記載の光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法。
- 下記(A)または(B)のアミノ酸配列を有し、かつ、4−(インドール−3−イルメチル)−4−ヒドロキシ−2−オキソグルタル酸に対し、4R体選択的に作用して、(2R,4R)−モナティンを生成するD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(A)配列番号4に示すアミノ酸配列において、下記(a)、(b)から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
(a)243位のセリン残基のリシン残基、またはアスパラギン残基への置換
(b)244位のセリン残基のリシン残基への置換
(B)(A)のアミノ酸配列において、243位、244位以外の箇所に、1〜30個のアミノ酸残基の変異を有し、当該変異が置換、欠失、挿入、付加および逆位から選ばれるものである、アミノ酸配列 - 請求項6記載のDNAとベクターDNAとを接続して得られることを特徴とする組換えDNA。
- 請求項7記載の組換えDNAによって形質転換された細胞。
- 請求項8記載の細胞を培地中で培養し、培地および/または細胞中にD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするD−アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
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AU2003289264A1 (en) | 2002-12-09 | 2004-06-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Mutant d-aminotransferase and process for producing optically active glutamic acid derivative using the same |
WO2005001105A1 (ja) * | 2003-06-26 | 2005-01-06 | Ajinomoto Co., Inc. | モナティンの製造方法 |
WO2005014839A2 (en) * | 2003-08-01 | 2005-02-17 | Cargill, Incorporated | Monatin tabletop sweetener compositions and methods of making same |
DE602004006141T2 (de) * | 2003-08-14 | 2007-12-27 | Cargill, Inc., Wayzata | Monatinhaltige kaugummizusammensetzungen und verfahren zu ihrer herstellung |
CA2536528A1 (en) * | 2003-08-25 | 2005-03-10 | Cargill, Incorporated | Beverage compositions comprising monatin and methods of making same |
CN1890377B (zh) | 2003-10-21 | 2013-06-05 | 嘉吉有限公司 | 生产莫纳甜和莫纳甜前体 |
US7935377B2 (en) * | 2004-06-04 | 2011-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Crystals of free (2R, 4R)-monatin and use thereof |
CA2506247C (en) * | 2004-06-07 | 2012-02-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel aldolase, and method for producing optically active ihog and monatin |
US7180370B2 (en) * | 2004-09-01 | 2007-02-20 | Micron Technology, Inc. | CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors |
EP1806408B1 (en) * | 2004-10-05 | 2012-04-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing amino acid derivatives from hydroxyimino acids |
CN101035442B (zh) | 2004-10-15 | 2012-04-11 | 味之素株式会社 | 甜味剂组合物 |
WO2006113897A2 (en) | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Cargill, Incorporated | Products and methods for in vivo secretion of monatin |
US8158389B2 (en) | 2005-04-20 | 2012-04-17 | Cargill, Incorporated | Products and methods for in vivo secretion of monatin |
US7582455B2 (en) | 2005-04-26 | 2009-09-01 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors |
US8076108B2 (en) | 2005-04-26 | 2011-12-13 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors |
JP5441417B2 (ja) | 2006-03-07 | 2014-03-12 | カーギル・インコーポレイテッド | アルドース、それをコードする核酸、ならびにそれを生成および使用する方法 |
US20090198072A1 (en) * | 2006-05-24 | 2009-08-06 | Cargill, Incorporated | Methods and systems for increasing production of equilibrium reactions |
WO2007140195A2 (en) | 2006-05-24 | 2007-12-06 | Cargill, Incorporated | Methods and systems for increasing production of equilibrium reactions |
CN101239941B (zh) | 2007-02-08 | 2012-02-29 | 味之素株式会社 | 光学活性化合物的制造方法 |
US8367847B2 (en) | 2007-10-01 | 2013-02-05 | Cargill, Incorporated | Production of monatin enantiomers |
US8076107B2 (en) * | 2007-10-01 | 2011-12-13 | Cargill, Incorporated | Production of monatin stereoisomers |
US8003361B2 (en) | 2007-10-01 | 2011-08-23 | Cargill Incorporated | Production of monatin enantiomers |
AU2008347234B2 (en) * | 2008-01-03 | 2015-05-28 | Basf Enzymes Llc | Transferases and oxidoreductases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
EP2107053A1 (en) * | 2008-03-11 | 2009-10-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Hydrate crystals of (2R,4R)-Monatin monosodium salt |
EP2623595B1 (en) * | 2010-09-28 | 2016-11-02 | Kaneka Corporation | Novel transaminase showing high activity for glutamic acid, gene encoding same, and method for utilization thereof |
RU2505606C2 (ru) * | 2010-10-14 | 2014-01-27 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения монатина |
JP5800491B2 (ja) * | 2010-11-08 | 2015-10-28 | 日清食品ホールディングス株式会社 | 標準菌の使用方法 |
US9029113B2 (en) * | 2011-03-11 | 2015-05-12 | Kaneka Corporation | Modified aminotransferase, gene thereof, and method for producing optically active amino compound using same |
US8771997B2 (en) | 2011-04-20 | 2014-07-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing monatin using an L-amino acid aminotransferase |
WO2012147674A1 (ja) * | 2011-04-25 | 2012-11-01 | 味の素株式会社 | モナティンの製造方法 |
WO2013073679A1 (ja) * | 2011-11-17 | 2013-05-23 | 味の素株式会社 | (2r,4r)モナティン多価金属塩結晶の製造方法 |
WO2014060571A1 (en) * | 2012-10-18 | 2014-04-24 | Sandoz Ag | A process for preparing indoline derivatives |
CN103194501B (zh) * | 2013-03-29 | 2015-05-27 | 凯莱英医药集团(天津)股份有限公司 | 利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法 |
KR20170004510A (ko) * | 2015-07-02 | 2017-01-11 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 트랜스아미나제 및 이를 이용한 아미노 화합물의 탈아민 방법 |
EP3630798B1 (en) * | 2017-05-27 | 2022-11-23 | Enzymaster (Ningbo) Bio-Engineering Co., Ltd. | Engineered aldolase polypeptides and their applications in synthesis of beta-hydroxy-alpha-amino acids |
Family Cites Families (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US376935A (en) * | 1888-01-24 | John a | ||
US375367A (en) * | 1887-12-27 | Abraham levy | ||
US356146A (en) * | 1887-01-18 | Hot-air | ||
US3036958A (en) | 1959-03-17 | 1962-05-29 | Ajinomoto Kk | Process for producing l-tryptophan from 3-indolepyruvic acid |
US3751458A (en) | 1972-03-02 | 1973-08-07 | Miles Lab | Citroylformic acid and its production |
JPS58149677A (ja) | 1982-03-02 | 1983-09-06 | Toyo Jozo Co Ltd | L−グルタミン酸オキシダ−ゼ(h↓2o↓2・ジエネレイテイング)およびその製造法、ならびに分析方法 |
IT1148618B (it) | 1982-10-11 | 1986-12-03 | Polifarma Spa | Procedimento enzimatico per la produzione di acido 3-indolpiruvico e utilizzazione farmaceutica di questo |
US4518692A (en) | 1983-09-01 | 1985-05-21 | Genetics Institute, Inc. | Production of L-amino acids by transamination |
DE3447023A1 (de) * | 1984-12-22 | 1986-06-26 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue d-aminosaeure-transaminase und ihre verwendung |
IT1184282B (it) | 1985-06-28 | 1987-10-22 | Polifarma Spa | Procedimento per la produzione di alfa-chetoacidi indolici a partire da un rispettivo alfa-ammino-acido,particolarmente per produrre acido indolpiruvico |
GB2205834B (en) | 1987-06-15 | 1990-10-31 | South African Inventions | 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indole compounds |
ZA885709B (en) | 1987-08-19 | 1989-04-26 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Novel crystalline 7-(2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-hydroxyiminoacetamido)-3-vinyl-3-cephem-4-carboxylic acid(syn isomer) |
GB2240105B (en) | 1990-01-19 | 1993-06-09 | Technology Finance Corp | Process for the production of 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl) indole |
DE4008179A1 (de) | 1990-03-12 | 1991-09-19 | Schering Ag | Fluorbenzolsulfonamide |
TW284788B (ja) | 1991-05-28 | 1996-09-01 | L Air Liquide Soliete And Nyme Dour L Expl Des Proce | |
JPH0672246A (ja) * | 1992-08-31 | 1994-03-15 | Aisin Seiki Co Ltd | 車両用アンダーミラー装置の駆動制御装置 |
DE69512329T2 (de) | 1994-07-11 | 2000-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver Gamma-hydroxy-L-Glutaminsäure |
US6358714B1 (en) | 1995-04-03 | 2002-03-19 | The Nutrasweet Company | Materials and methods for the production of D-phenylalanine |
US5948886A (en) | 1996-11-20 | 1999-09-07 | Hoechst Marion Roussel, Inc. | Acylated enol derivatives of α-ketoesters and α-ketoamides |
US5728555A (en) | 1996-09-30 | 1998-03-17 | Monsanto Company | Preparation of d-amino acids by direct fermentative means |
CA2234412C (en) | 1997-06-09 | 2008-09-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing optically active compound |
US6099848A (en) * | 1997-11-18 | 2000-08-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Immunogenic compositions comprising DAL/DAT double-mutant, auxotrophic, attenuated strains of Listeria and their methods of use |
US5994559A (en) | 1998-08-06 | 1999-11-30 | The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantations | Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetener |
US6777388B1 (en) | 1998-08-21 | 2004-08-17 | Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. | Leptin-related peptides |
HUP0104996A2 (hu) | 1998-09-03 | 2002-04-29 | Bristol-Myers Squibb Co. | Enzimes oxidatív dezaminálási eljárás |
US6337190B1 (en) * | 1999-12-17 | 2002-01-08 | Development Center For Biotechnology | D-amino acid aminotransferase for simultaneously producing glutaryl-7-aminocephalosporanic acid and D-amino acid |
JP2002060382A (ja) | 2000-08-22 | 2002-02-26 | Ajinomoto Co Inc | モナティンの立体異性体及びその使用、並びにモナティン類の製造方法及びそのための中間体 |
KR100966035B1 (ko) * | 2001-11-30 | 2010-06-25 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 모나틴의 비천연형 입체이성체 염의 결정 및 이의 사용 |
ES2383518T3 (es) * | 2001-12-27 | 2012-06-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Procedimientos para la preparación de compuestos de ácido glutámico e intermedios de los mismos y nuevos intermedios usados en los procedimientos |
US7297800B2 (en) * | 2001-12-27 | 2007-11-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Process of producing glutamate derivatives |
EP2460884A3 (en) * | 2001-12-27 | 2013-03-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for preparing monatin |
JP2003292484A (ja) | 2002-04-01 | 2003-10-15 | Ajinomoto Co Inc | γ−ヒドロキシアミノ酸誘導体及びモナティン類の製造方法 |
US7572607B2 (en) | 2002-04-23 | 2009-08-11 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors |
US8372989B2 (en) | 2002-04-23 | 2013-02-12 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors |
CN100516043C (zh) | 2002-04-23 | 2009-07-22 | 嘉吉有限公司 | 多肽和生物合成途径 |
EP2280068A1 (en) | 2002-08-26 | 2011-02-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel aldolase and production process of substituted alpha-keto acids |
AU2003289264A1 (en) | 2002-12-09 | 2004-06-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Mutant d-aminotransferase and process for producing optically active glutamic acid derivative using the same |
EP1582514B1 (en) | 2003-01-09 | 2011-08-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Processes for producing glutamic acid derivative, a pyroglutamic acid derivative and a novel intermediate for production |
JP2004331650A (ja) | 2003-04-14 | 2004-11-25 | Kanazawa Univ Tlo Inc | モナチン類の製造法 |
WO2005001105A1 (ja) * | 2003-06-26 | 2005-01-06 | Ajinomoto Co., Inc. | モナティンの製造方法 |
WO2005014839A2 (en) | 2003-08-01 | 2005-02-17 | Cargill, Incorporated | Monatin tabletop sweetener compositions and methods of making same |
DE602004006141T2 (de) | 2003-08-14 | 2007-12-27 | Cargill, Inc., Wayzata | Monatinhaltige kaugummizusammensetzungen und verfahren zu ihrer herstellung |
CA2536528A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-10 | Cargill, Incorporated | Beverage compositions comprising monatin and methods of making same |
EP1675865B1 (en) | 2003-10-21 | 2016-10-19 | Cargill, Incorporated | Process for preparing solidified maltitol and its use in food and pharma products |
CN1890377B (zh) | 2003-10-21 | 2013-06-05 | 嘉吉有限公司 | 生产莫纳甜和莫纳甜前体 |
JP4500977B2 (ja) | 2003-11-05 | 2010-07-14 | 味の素株式会社 | 新規アミノ酸誘導体及び甘味剤 |
JP5113978B2 (ja) * | 2003-11-21 | 2013-01-09 | 味の素株式会社 | グルタミン酸誘導体の有機アミン塩及びその利用 |
CA2557274C (en) | 2004-02-27 | 2012-12-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing monatin |
JP4604524B2 (ja) * | 2004-03-16 | 2011-01-05 | 味の素株式会社 | 変異型アルドラーゼ、並びにこれを用いた光学活性ihog及び光学活性モナティンの製造方法 |
US7935377B2 (en) * | 2004-06-04 | 2011-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Crystals of free (2R, 4R)-monatin and use thereof |
CA2506247C (en) | 2004-06-07 | 2012-02-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel aldolase, and method for producing optically active ihog and monatin |
CN100519756C (zh) | 2004-06-07 | 2009-07-29 | 味之素株式会社 | 新的醛缩酶及光学活性ihog及莫那亭的制备方法 |
KR101216575B1 (ko) | 2004-07-14 | 2012-12-31 | 아지노모토 가부시키가이샤 | (2r,4r)-모나틴 칼륨 염 결정 및 이를 함유하는 감미료조성물 |
JP2007284349A (ja) | 2004-07-27 | 2007-11-01 | Ajinomoto Co Inc | モナティンまたはその塩の製造方法 |
EP1806408B1 (en) * | 2004-10-05 | 2012-04-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing amino acid derivatives from hydroxyimino acids |
CN101035442B (zh) | 2004-10-15 | 2012-04-11 | 味之素株式会社 | 甜味剂组合物 |
WO2006113897A2 (en) | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Cargill, Incorporated | Products and methods for in vivo secretion of monatin |
US8158389B2 (en) | 2005-04-20 | 2012-04-17 | Cargill, Incorporated | Products and methods for in vivo secretion of monatin |
US8076108B2 (en) | 2005-04-26 | 2011-12-13 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors |
US7582455B2 (en) | 2005-04-26 | 2009-09-01 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors |
CA2613716A1 (en) | 2005-06-27 | 2007-01-04 | Cargill, Incorporated | Sugar substitute compositions and use thereof in foods and beverages |
JP5441417B2 (ja) | 2006-03-07 | 2014-03-12 | カーギル・インコーポレイテッド | アルドース、それをコードする核酸、ならびにそれを生成および使用する方法 |
JP5126059B2 (ja) | 2006-03-24 | 2013-01-23 | 味の素株式会社 | 新規エステル誘導体およびその用途 |
WO2007140195A2 (en) | 2006-05-24 | 2007-12-06 | Cargill, Incorporated | Methods and systems for increasing production of equilibrium reactions |
US20090198072A1 (en) | 2006-05-24 | 2009-08-06 | Cargill, Incorporated | Methods and systems for increasing production of equilibrium reactions |
JP5262714B2 (ja) | 2006-06-29 | 2013-08-14 | 味の素株式会社 | 置換ベンジルエステル誘導体およびその用途 |
US7354746B1 (en) | 2006-12-11 | 2008-04-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing optically active IHOG and monatin |
CA2673773A1 (en) | 2006-12-28 | 2008-07-10 | Cargill, Incorporated | Low calorie sweetener compositions |
CN101239941B (zh) * | 2007-02-08 | 2012-02-29 | 味之素株式会社 | 光学活性化合物的制造方法 |
CN102027117B (zh) | 2007-08-24 | 2012-11-07 | 味之素株式会社 | 新的氧化酶基因及使用该基因生产3-吲哚-丙酮酸的方法 |
US8076107B2 (en) | 2007-10-01 | 2011-12-13 | Cargill, Incorporated | Production of monatin stereoisomers |
US8003361B2 (en) | 2007-10-01 | 2011-08-23 | Cargill Incorporated | Production of monatin enantiomers |
EP2107053A1 (en) | 2008-03-11 | 2009-10-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Hydrate crystals of (2R,4R)-Monatin monosodium salt |
US20090238940A1 (en) | 2008-03-20 | 2009-09-24 | Cargill, Incorporated | Color-imparting chocolate compositions and food articles made therefrom |
MX2010012248A (es) | 2008-05-09 | 2010-11-30 | Cargill Inc | Edulcorante, metodos de preparacion y aplicaciones del mismo. |
WO2010009419A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Cargill, Incorporated | Frozen pellets made with juice |
ES2680352T3 (es) | 2009-02-15 | 2018-09-06 | Cargill, Incorporated | Sistemas de fibra de pulpa de cítrico y sistemas de postre basado en gel |
US20110293781A1 (en) | 2010-05-31 | 2011-12-01 | Cargill, Incorporated | Crumb, e.g., chocolate crumb, having enhanced caramel flavor |
-
2003
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