BR112013004868B1 - Método para produzir ácido 2,4-dihidroxipentanoico e método para produzir um material polimérico ou produto contendo polímero - Google Patents

Método para produzir ácido 2,4-dihidroxipentanoico e método para produzir um material polimérico ou produto contendo polímero Download PDF

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Abstract

método para produzir um composto que é um éster ou cetoácido de c5, ou um éster ou hidroxiácido de c5, ou derivados cíclicos dos mesmos, método para produzir um material polimérico ou produto que contém polímero; e método para produzir um herbicida ou aditivo de combustível. a invenção fornece processos para a conversão de piruvato obtido a partir de açúcares ou outras fontes de carbono, para materiais de c5 valiosos, tais como ácido levulínico, levulinato de ésteres, valerolactona, e derivados dos mesmos.

Description

PRIORIDADE
Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório no. U.S. 61/378.199, depositado em 30 de agosto de 2010, o qual está incorporado ao presente documento por referência.
ANTECEDENTE
O ácido levulínico, ou o ácido 4-oxopentanoico, é um composto orgânico com a fórmula CH3C(O)CH2CH2CO2H. O mesmo é um cetoácido. O ácido levulínico é tipicamente preparado quimicamente, por exemplo, pelo aquecimento de sacarose com ácido clorídrico concentrado. O processo procede por meio da intermediação de glicose, o qual é isomerizado em frutose e, então, hidroximetilfurfural.
O ácido levulínico é um precursor em potencial para polímeros semelhantes a náilon, borrachas sintéticas, e plásticos. O ácido levulínico é um intermediário sintético versátil, por exemplo, na síntese de produtos farmacêuticos, e é um precursor na produção industrial de outras mercadorias químicas, tais como metiltetrahidrofurano, valerolactona, e levulinato de etila.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em certos aspectos e modalidades, a invenção fornece uma trajetória química para a conversão de piruvato obtido a partir de açúcares ou outras fontes de carbono, para materiais de C5 valiosos, tal como o ácido levulínico. Compostos de C5 exemplificativos são mostrados nas Figuras 1 e 2. Quando usado com açúcares como uma fonte de carbono, a chave para a trajetória é converter os açúcares de C6 (tais como, porém sem limitação, glicose, frutose, galactose) e/ou açúcares de C5 (tais como, porém sem limitação a, xilose, arabinose) em piruvato, e subsequentemente converter o piruvato em um ou diversos compostos de C5 valiosos através de reações de ciclização, desidratação, redução, oxidação e adição aldólica químicas ou bioquímicas. Quando usado com outra fonte de carbono, tal como, porém sem limitação a, ácidos graxos e glicerol, a fonte de carbono é primeiramente convertida em piruvato, e subsequentemente convertida em um ou diversos compostos de C5 valiosos, os quais incluem ésteres ou cetoácidos de C5 lineares ou derivados ciclizados dos mesmos da seguinte fórmula geral: C5C4(X)C3C2(Y)C1(=O)(Z), onde X é ou uma hidroxila ou cetona oxigênio, Y é ou um hidrogênio, uma hidroxila ou cetona oxigênio, a ligação entre os carbonos de C3 e C2 é ou única da dupla (por exemplo, saturada ou não saturada) e Z é um grupo de alcóxi, sulfeto ou fenóxi como para fazer ou um grupo funcional de ácido carboxílico, éster ou tioéster. Em algumas modalidades, o composto de C5 é C5C4(O1)C3C2(Y)C1(=O)(O1), em que o índice “O1” denota o mesmo átomo de oxigênio de tal modo que há um éster cíclico, ou lactona formado, e Y é ou um hidrogênio ou uma hidroxila ou cetona oxigênio. É assumido que todas as outras valências atômicas, ou ligações, são átomos de hidrogênio a menos que indicado de outro modo acima.
Em um aspecto, a invenção fornece um método para fazer um composto que é um éster ou cetoácido de C5, ou um éster ou hidroxiácido de C5, ou derivados cíclicos dos mesmos. O método compreende converter o piruvato em um intermediário de C5 por adição aldólica, e converter o intermediário de C5 ao dito composto através de etapas enzimáticas ou químicas ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o composto de C5 tem a fórmula geral C5C4(X)C3C2(Y)C1(=O)(Z) ou C5C4(O1)C3C2(Y)C1(=O)(O1), conforme descrito acima. Em certas modalidades, o composto é preparado a partir de açúcares de 5-carbono e/ou 6-carbono ou matéria- prima adequada como fonte de carbono para um hospedeiro microbiano. Nessas modalidades, o método compreende a formação de piruvato a partir do açúcar ou matéria-prima (por exemplo, pelo hospedeiro microbiano), e adição aldólica de acetilaldeído ao piruvato (por exemplo, no hospedeiro microbiano ou em um sistema livre de célula), para preparar, desse modo, um cetoácido de 5-carbono como um intermediário para a preparação do composto de C5 desejado. O acetilaldeído para adição aldólica pode ser preparado pela descarboxilação do piruvato no hospedeiro microbiano. O produto de adição aldólica pode ser sujeito ainda a uma ou mais reações de lactonização, redução, oxidação, desidratação, transferência de grupo e/ou hidrólise (por exemplo, cada uma de modo independente no hospedeiro microbiano ou sistema livre de célula) para preparar o produto de C5 desejado.
Tais produtos podem ser usados como blocos de construção para preparar combustíveis e produtos químicos comercialmente valiosos. Por exemplo, lactonas, tais como 2- oxo-valerolactona (composto L7 na Figura 2), 2-hidroxi- valerolactona (composto L6 na Figura 2), angelicas lactonas (composto L2, L3 e L10 na Figura 2) e 4-valerolactona (y- valerolactona, composto L1 na Figura 2) podem ser usados como solventes. Angelica lactona e 4-valerolactona também podem ser convertidos quimicamente em metil butirolactona de metileno (MeMBL) (ver, por exemplo, WO/2006/015023, WO/2006/015024 para métodos para catalisar essa conversão). Metil butirolactona de metileno pode ser usado como um monômero ou copolímero para aumentar a tolerância térmica de polímeros de polimetilcrilato (PMMA) usados amplamente em aplicações eletrônicas e automotivas, ou para fabricar polímeros completamente (tal como Poli(MeMBL), ver, por exemplo, WO/2005/028529). Adicionalmente, 4-valerolactona pode ser convertido com o uso de catálise química para ácido valérico e valerato de ésteres adicionais, assim como butanos isoméricos, butadieno e outros alcenos, o que inclui alcenos de oito carbonos ou mais, conforme revisado em Bozell J., Connecting Biomass and petroleum Processing with a chemical bridge, Science 329:522 a 523 (2010). O ácido levulínico (composto P1 na Figura 1) pode ser convertido em 1,4 pentanodiol e ácido difenólico, ambos dos quais podem ser usados para fabricar polímeros. O amminoácido ô-levulínico (um derivado de Ácido Levulínico) é um herbicida com um mercado estimado em excesso de 136,08 quiligramas (300 libras) por ano. Ainda adicionalmente, o Ácido Levulínico pode ser convertido em pirrolidonas (WO/2004/085048), pirrolidinona (WO/2010/065833,WO/2004/085390,WO/2004/085349,WO/2004/084633) , angelica lactona (WO/2005/097723), 4-valerolactona e 2- metil-THF, os quais são produtos finais ou podem ser transformados ainda em outros compostos com várias utilidades, tais como líquidos aniônicos (WO/2010/065833), biocombustíveis e aditivos de combustível. O ácido levulínico pode ser empregado ainda como um material para baterias (por exemplo, JP09190820), tintas (US 5.769.929), revestimentos (JP06280041), revestimentos anti-corrosão (EP496555) Ésteres levulínicos (ou levulinato de ésteres, compostos P9 na Figura 1) são blocos de construção de polímeros por si mesmos e após a transformação em cetais (US 2008/0242721) e também podem ser usados como aditivos de combustível (conforme descrito na Patente US 7.153.996, a qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade). Adicionalmente, os ésteres levulínicos podem ser usados em produtos de cuidados pessoais (por exemplo, Patente Japonesa JP 05320023), surfactantes e lubrificantes (EP882745), absorventes (ver, WO/1998/9843684). Todas as referências citadas nesse parágrafo são aqui incorporadas por referência.
Ambos o ácido levulínico, os ésteres levulínicos, e algumas das lactonas listradas na Figura 2 também podem ser usados na fabricação de ingredientes farmeceuticamente ativos, e aplicações farmacêuticas, sendo que alguns dos quais são listados em Bozell J., Production of levulinic acid and use as a platform chemical for derived products, Resources, Conservation and Recycling 28:227 a 239 (2000).
Por exemplo, o documento WO/1995/022524 relata o uso de levulinato de éster metílico para a síntese de novel derivados de indol usados como agentes anti-câncer. O ácido levulínico e o ácido 4-hidroxi-pentanoico também podem ser usados por um reagente quiral, com uma ampla matriz de aplicações em potencial (ver, por exemplo, Meyers et al., Stereoselective alkylations in rigid systems. Effect of remote substituents on p-facial additions to lactam enolates. Stereoelectronic and steric effects, J. Am. Chem. Soc. 120:7429 a 7438 (1998). As aplicações farmacêuticas do C5 produzido pela invenção podem incluir o uso de derivados de butiro- e valero-lactona como agentes antibióticos e anti- biofilmes, através disso, interferência com o mecanismo molecular de detecção de quórum em bactérias (ver, por exemplo, EP 1716131 e WO/2006/117113). Usos adicionais podem derivar a partir da proto-anemonina biologicamente ativa (composto L4 na Figura 2). Finalmente, ésteres e Ácido Levulínico têm sido usados para alimento, sabor e fragrâncias (EP1533364), assim como aditivos em numerosos produtos de consumo. Por exemplo, o Ácido Levulínico é usado como um aditivo em cigarros (WO/2010/051076). Todas as referências nesse parágrafo estão aqui incorporadas por referência.
Em certas modalidades da invenção, o método compreende converter piruvato em 4-valerolactona. Em outra modalidade, o método compreende converter o piruvato em ácido levulínico. Em outra modalidade, o método compreende converter o piruvato em ésteres levulínicos (levulinatos) tais como, porém sem limitação a, levulinato de etila e levulinato de propila. Em outra modalidade alternativa da invenção, o método compreende converter o piruvato em angelica lactona, alfa- e alfa’- angelica lactonas. Em ainda outras modalidades, o método compreende converter o piruvato em ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico ou sua forma ciclizada, 2- hidroxi-4-valerolactona. Ainda em outra modalidade, o método compreende converter o piruvato em ácido 2-oxo-4-hidroxi- pentanoico ou sua forma ciclizada, 2-oxo-4-valerolactona.
Em algumas modalidades da invenção, o método compreende múltiplas etapas enzimáticas integradas em uma única trajetória metabólica em um hospedeiro de fermentação eucariótico, procariótico ou arquebacteriano, o que inclui, porém sem limitação a, Saccharamyces sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp., Chrysosporium sp., e Escherichia coli. Nessas e em outras modalidades, o método envolve uma ou mais etapas enzimáticas postas em prática em um sistema livre de célula, ou etapas de catálise química, ou uma combinação dos mesmos, sendo que os vários intermediários na trajetória são opcionalmente separados e/ou purificados do caldo de fermentação conforme necessário para completar o processo.
Uma vantagem de certas modalidades da invenção é que a mesma baseia-se no topo do metabolismo central. Por exemplo, ambos os metabolismos de C5 e C6 em eucariotos, procariotos e archea podem empregar glicólise para produzir piruvato. O piruvato é um dos mais importantes intermediários do metabolismo central, e, em adição à glicólise, pode ser obtido a partir de metabolismo de lipídio, assim como metabolismo de aminoácido. O método da invenção toma o piruvato e converte duas moléculas do piruvato em uma molécula de C5, tal como ácido levulínico e 4-valerolactona.
No caso de açúcares de C6, o rendimento de carbono pode ser de até 80%. No caso de açúcares de C5, o rendimento de carbono pode ser teoricamente até 100%. Se o método emprega uma cepa microbiana capaz de fermentar simultaneamente o C5 e o C6, tal como, porém sem limitação a, Saccharomyces Cerevisae e Pichia Stipitis alterados, isso permite que a fermentação direta de açúcares em ácido levulínico, 4-valerolactona ou quaisquer dos compostos de C5 retratados na Figura 1 e na Figura 2. Esse alto rendimento alcançável apresenta uma vantagem industrial decisiva quando comparada a métodos termoquímicos alternativos de obter ácido levulínico ou gama-valerolactona, os quais produzem tipicamente rendimentos molares de 40% ou menos.
Em uma modalidade da invenção, o método converte um fluxo de açúcares em um ou diversos dentre os compostos de C5 listados nas Figuras 1 e 2. Em outra modalidade, amido é usado como matéria-prima para o processo. Em outra modalidade, o método converte a matéria-prima lignocelulósica (o que inclui, porém sem limitação a, palha de milho, aparas de madeira, refugos urbanos, sedimento de moinho de Polpa e Papel) em pelo menos um dos compostos de C5 listados nas Figuras 1 e 2.
Em uma modalidade da invenção, o método converte os açúcares de C6 em um ou diversos dos compostos de C5 listados nas Figuras 1 e 2, preferencialmente em linhagens de fermentação altamente eficientes em captação e fermentação de açúcares de C6, tal como, porém sem limitação a, Saccharomyces cerevisiae, cepa CB1 de Cargill (conforme descrito em WO/2007/106524), Pseudomonas, Chrysosporium e Escherichia coli (E.coli). Em outra modalidade da invenção, o método converte os açúcares de C5 em um ou diversos dos compostos de C5 listados nas Figuras 1 e 2, preferencialmente em linhagens de fermentação altamente eficientes em captação e fermentação de açúcares de C5, tais como, porém sem limitação a, Saccharomyces Cerevisiae e Pichia stipitis alterados. Em uma modalidade da invenção, o método converte simultaneamente C5 e açúcares de C6 ao composto de C5, preferencialmente em linhagens de fermentação altamente eficientes em captação e fermentação de ambos C5 e açúcares de C6 (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae). Em outra modalidade da invenção, as linhagens de fermentação mostram um alto nível de tolerância aos inibidores de hidrolisado de biomassa, tal como, porém sem limitação a, furanos, e a baixo pH ou altos meios de título de ácido orgânico.
Em certas modalidades, a matéria-prima compreende um ou mais açúcares de C6 selecionados a partir de alose, altrose, glicose, manose, gulose, idose, talose, galactose, frutose, psicose, sorbose e tagatose. Nesses ou em outras modalidades, a matéria-prima compreende um ou mais açúcares de C5 selecionados a partir de xilose, arabinose, ribose, lixose, xilulose e ribulose.
Quando o método da invenção é usado para converter C5 e açúcares de C6 em ácido 4-hidroxi-pentanoico ou 4-valerolactona, a trajetória é projetada para ser balanceada por redox (oxidação-redução): dois equivalentes redutores (formação de NAD(P)H) são produzidos durante a glicólise para render piruvato (uma molécula de glicose para duas moléculas de piruvato) e dois equivalentes redutores são consumidos (formação de NAD(P)) pelo processo a jusante a partir de piruvato em ácido 4-hidroxi-pentanoico ou 4-valerolactona (y- valerolactona). O fato de que essa trajetória é balanceada por redox para a produção dessas duas moléculas irá resultar em conversão otimizada no caso de processo de fermentação, e reduzir ou remover a necessidade para alterar ainda o hospedeiro de fermentação para combater desequilíbrio. Para a fermentação de açúcares diretamente para todos os outros compostos ou blocos de construção (Figura 1), o hospedeiro de fermentação irá contar com as reações colaterais separadas para balancear a trajetória, ou de uma fonte externa de equivalente a redox adequado para balancear a trajetória.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra as fórmulas moleculares para ácido levulínico (composto P1 na Figura 1), assim como derivados valiosos que podem ser produzidos em etapas diferentes na trajetória e em várias modalidades dos processos descritos no presente documento (compostos P1 a P16 na Figura 1).
A Figura 2 mostra as fórmulas moleculares para várias lactonas de C5 que podem ser produzidas em etapas diferentes na trajetória de acordo com as várias modalidades do método (compostos L1 a L10).
A Figura 3 fornece uma vista geral dos processos bioquímicos que converte o piruvato em quaisquer dos compostos de C5 da Figura 1 ou da Figura 2, com certas etapas destacadas. Algumas sub-rotas e intermediários químicos possíveis não são retratados aqui. Ver Figura 5 para uma retratação mais exaustiva das possibilidades de trajetória diferentes.
A Figura 4 fornece uma vista geral dos processos e trajetória bioquímica e de acordo com certas modalidades da invenção, onde a ordem das etapas de oxidação/redução (que correspondem às etapas 3 e 4 na Figura 3) é invertida. Como na Figura 3, alguns intermediários químicos possíveis e sub- rotas não são retratados aqui. Ver a Figura 6 para uma retratação mais íntegra das possibilidades de trajetória diferentes.
A Figura 5 fornece uma vista geral dos processos/trajetória bioquímica da Figura 3, onde a etapa 4 e a etapa 5 são colapsadas em uma etapa com o uso de uma desidratase oxidativa.
A Figura 6 fornece uma vista detalhada dos processos/trajetória bioquímica que convertem o piruvato em quaisquer dos compostos de C5 ou blocos de construção das Figuras 1 ou 2. Adicionalmente às etapas químicas retratadas nas Figuras 3, 4, e 5, intermediários cíclicos diferentes que podem ser obtidos a partir da reação de ciclização a partir dos intermediários da trajetória principal são retratados, assim como a transformação química que leva a partir dos intermediários de lactona cíclicos para os vários compostos de C5 ou blocos de construção. Adicionalmente, intermediários de CoA diferentes que podem ser obtidos a partir dos intermediários na trajetória principal também são representados. A trajetória pode ser usada para produzir levulinil-CoA, a partir do qual ou o ácido levulínico e 4-valerolactona, ou o levulinato e/ou outros pentanoato de ésteres, tal como 4-oxo-pentanoato de éster (composto P9) na Figura 1, podem ser obtidos prontamente.
A Figura 7 mostra o princípio de produção de ésteres levulínicos (levulinatos) e ácido levulínico a partir do intermediário de levulinil-CoA através da ação de ou um tioesterase ou de uma transferase. A cadeia lateral R pode ser qualquer grupo funcional, tais como, porém sem limitação a metila, etila, propila, arila, fenila, naftila e outros grupos aromáticos, assim como grupo de alquila com substituintes de oxigênio e nitrogênio, tais como cetonas, álcoois primários, secundários e terciários, aminas primárias, secundárias e terciárias, etc.
A Figura 8 mostra os traços cinéticos obtidos ao reagir duas enzimas de enoato redutase (números de aquisição da Genbank AAA64522 e AAD16106, identificados como 6001 e 6002 na Figura 8) com ácido 4-oxo-2-pentanoico do substrato (também conhecido como ácido acetilacrílico, ver composto P2 na Figura 1) e ciclohexenona do substrato como um controle. A curva identificada como “6001 aceto” e “6002 aceto” mostram a atividade das proteínas na presença de 100 uM de NADPH e do ácido 4-oxo-2-pentanoico do substrato. A curva identificada como “6001 ciclo” e “6002 ciclo” mostram a atividade das proteínas na presença de 100 uM de NADPH e da ciclohexenona do substrato. A diminuição da absorção em 340nm, que mede a conversão de NADPH para o oxidado a partir de NADP+, é monitorada. Essa curva mostra a conversão do ácido 4-oxo-2- pentanoico do substrato em ácido levulínico (composto P1 na Figura 1) por ambas as proteínas. As curvas de controle (identificadas como “tampão 6001” e “tampão 6002” e “tampão ciclo” e “tampão aceto”) mostram a diminuição na absorção com os substratos sozinhos no tampão, ou com as proteínas sozinhas no tampão. Nenhuma atividade significativa é detectada sob essas condições. Todas as curvas obtidas no tampão de Fosfato de Potássio de 100 mM, pH 7,0 e temperatura ambiente (25°C). A concentração de NADPH inicial em 100 uM, concentração inicial ácido 4-oxo-2-pentanoico em 100 mM, concentração inicial ciclohexenona em 50mM. Concentração de proteína variada.
A Figura 9 demonstra a atividade de uma enzima aldolase de classe II de Pseudomonas Putida, HpaI aldolase (número de aquisição da Genbank ADA63518) em piruvato e acetaldeído dos substratos. As condições de ensaio eram as seguintes: a proteína foi expressa e purificada por Ni de E.Coli e reagida com uma mistura de acetaldeído e piruvato em uma concentração inicial de 100mg/ml, em tampão de Tris, pH 8,0, suplementado com 100mM de MnCl2. A proteína e os substratos foram incubados à temperatura ambiente por 30 minutos antes de serem bruscamente arrefecidos com HCl e serem executados em um HPLC com uma coluna polar EPIC. A Figura 9 mostra os traços de HPLC obtidos, sendo que os picos correspondem aos substratos e produtos indicados na figura com a flecha preta. A identidade química do produto, 4- hidroxi, ácido 2-oxo pentanoico foi confirmada por LC/MS (dados não mostrados).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Em certos aspectos e modalidades, a invenção fornece uma trajetória química para a conversão de piruvato obtido de açúcares ou outras fontes de carbono, em materiais de C5 valiosos, tal como o ácido levulínico. Conceitualmente, o método da invenção fornece uma trajetória que é organizada em pelo menos duas etapas, e em algumas modalidades, de 4 a 8 etapas, tal como de 7 a 8 etapas (ver as 8 etapas principais retratadas na Figura 3), com até 4 etapas de ciclização adicionais de intermediários obtidos ao longo da trajetória. O anexo do intermediário em múltiplos etágios para uma metade química de Coenzima A (CoA) permite que a trajetória leve a intermediários de CoA, tal como levulinil-CoA (ver Figura 6).
Adicionalmente, quatro etapas opcionais podem velar às variantes ciclizadas dos intermediários chave na trajetória (ver novamente a Figura 6).
De acordo com várias modalidades, uma primeira etapa é a glicólise, a qual converte os açúcares (tal como a partir de biomassa) em piruvato, ou, alternativamente, qualquer conversão química de açúcares em piruvato. Uma segunda etapa converte duas moléculas de piruvato em uma molécula de ácido 4-hidroxi 2-oxo-pentanoico e CO2. Uma etapa de ciclização opcional produz a lactona correspondente, 2- oxo-4-valerolactona. Uma etapa de anexo de CoA opcional pode levar a 4-hidroxi-2-oxo pentanoil-CoA. Uma terceira etapa reduz o ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico em ácido 2,4- dihidroxi-pentanoico, ou 4-hidroxi-2-oxo pentanoil-CoA em 2,4-dihidroxi-pentanoil-CoA, ou 2-oxo-4-valerolactona em 2- hidroxi-4-valerolactona. Uma etapa de ciclização opcional produz a lactona correspondente, 2-hidroxi-4-valerolactona, a partir de ou ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico ou 2,4-dihidroxi- pentanoil-CoA. Uma etapa de anexo de CoA opcional leva a 2,4- dihidroxi pentanoil-CoA a partir de ácido 2,4-dihidroxi pentanoico. Uma quarta etapa oxida o ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico em ácido 2-hidroxi-4-oxo-pentanoico, ou 2,4- dihidroxi-pentanoil-CoA em 2-hidroxi-4-oxo-pentanoil-CoA. Uma etapa de anexo de CoA opcional converte o ácido 2-hidroxi-4- oxo-pentanoico em 2-hidroxi-4-oxo pentanoil-CoA. Uma quinta etapa desidrata o ácido 2-hidroxi-4-oxo-pentanoico em ácido 4-oxo-2-pentanoico, ou 2-hidroxi-4-oxo-pentanoil-CoA em 4- oxo-2-pentenoil-CoA. Uma etapa de anexo de CoA opcional converte o ácido 4-oxo-2-pentanoico em 4-oxo-2-pentenoil-CoA. Uma etapa opcional ainda reduz o ácido 4-oxo-2-pentanoico em ácido 4-hidroxi-2-pentanoico, ou ácido 4-oxo-2-pentanoico em 4-hidroxi-2-pentenoil-CoA, ambos os quais podem ser opcionalmente ciclizados para produzir angelica lactona. Outra etapa de anexo de CoA opcional leva a 4-hidroxi-2- pentenoil-CoA a partir de ácido 4-hidroxi-2-pentanoico, o qual novamente pode ser ciclizado opcionalmente para produzir angelica lactona. Uma modalidade alternativa da invenção “colapsa” a quarta e a quinta etapa em uma única etapa. Uma sexta etapa rende ácido levulínico (ácido 4-hidroxi- pentanoico) através da redução de ácido 4-oxo-2-pentanoico em uma maneira similar como acima. Uma etapa opcional anexa a coenzima A (CoA) ao ácido levulínico, o que leva a levulinil- CoA. O levulinil-CoA pode, então, ser transformado em uma variedade de ésteres levulínicos através do uso de uma transferase que reage com o álcool apropriado. Em algumas modalidades, uma sétima etapa reduz ainda o ácido levulínico para produzir o ácido 4-hidroxi-pentanoico. Uma oitava etapa cicliza o ácido 4-hidroxi-pentanoico para render 4-valerolactona.
Em certas modalidades, as etapas 4 e 5 podem ser postas em prática em uma única transformação, uma desidratação oxidativa. Em outra modalidade da invenção, as etapas 3 e 4 são revertidas em ordem de modo que o ácido 2- hidroxi-4-oxo-pentanoico seja primeiramente oxidado para ácido 2,4-dioxo-pentanoico, e ainda reduzido para 2-oxo-ácido 4-hidroxi-pentanoico, de modo que a trajetória da Figura 3 se torne aquela representada na Figura 4.
Em outra modalidade da invenção, as etapas 3, 5 e 6 (Figura 3) são postas em prática diretamente nas lactonas L1, L2, L6, L7, L8, L9 e L10 respectivas, onde a ramificação a partir dos intermediários lineares, produzidos inicialmente a partir de piruvato e acetaldeído, ocorre em qualquer uma das etapas de ciclização descritas na Figura 6. Essa modalidade da invenção pode ser usada ou para obter lactonas diretamente, ou, após a hidrólise, para obter de volta quaisquer dos compostos P1 a P16 (o que inclui o ácido levulínico).
Ainda em outro aspecto da invenção, as etapas 2, 3, 4, 5 e 6 (Figura 3) são postas em prática nos intermediários de CoA, onde a ramificação a partir dos intermediários lineares, produzida inicialmente a partir de piruvato e acetaldeído, ocorre em qualquer uma das etapas de anexo de CoA descritas no parágrafo da Figura 6. Essa modalidade da invenção pode ser usada para obter quaisquer dos compostos P1 a P16 (o que inclui o ácido levulínico) através do uso de tioesterases. Os ésteres levulínicos (P9) podem ser obtidos a partir de levulinil-CoA e o álcool apropriado pelo uso de uma transferase.
Etapa 1: conversão de açúcares em piruvato
A conversão de açúcares em piruvato é parte da trajetória metabólica bem estudada, glicólise. Na glicólise, a ação de múltiplas enzimas resulta na conversão de cada molécula de açúcar de C6, tal como glicose para duas moléculas de piruvato, duas moléculas de ATP e dois equivalentes de redução na forma de duas moléculas de NAD(P)H.
Em uma modalidade da invenção, o piruvato é obtido a partir de glicólise em um organismo de fermentação, e subsequentemente usado na trajetória a jusante no hospedeiro de fermentação. Em uma modalidade alternativa, o piruvato é separado do caldo de fermentação e subsequentemente processado, de acordo com a trajetória a jusante.
Etapa 2: conversão de piruvato em ácido 4-hidroxi- 2-oxo-pentanoico
O ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico pode ser produzido pela adição aldólica de acetaldeído (um aldeído) ao piruvato (um α ceto-ácido). A adição reage um equivalente de acetaldeído com um equivalente de piruvato. O acetilaldeído pode ser obtido de várias maneiras. Por exemplo, a piruvato descarboxilase catalisa a descarboxilação não oxidativa de piruvato em acetaldeído. A piruvato descarboxilase a partir de múltiplas fontes de eucariótico ou procariótico (por exemplo, Saccharomcyes cerevisiae) pode, portanto, ser usada. Em uma modalidade preferida da invenção, o acetilaldeído é produzido a partir de piruvato com a enzima piruvato descarboxilase.
A aldolase múltipla foi isolada, pois foi mostrado que catalisa a adição aldólica entre piruvato e acetaldeído. Uma aldolase de classe I, ácido 4-hidroxi-2-ceto-pentanoico aldolase (HKP aldolase) é uma aldolase que emprega uma lisina com base em Schiff e catalisa a reação direta e a reversa. Em uma modalidade da invenção, a adição aldólica entre piruvato e acetaldeído é catalisada por aldolase HKP de a partir de E. coli, descrito em Pollard, JR et al., Substrate selectivity and biochemical properties of 4-hydroxy-2-keto-pentanoic acid aldolase from E. Coli, Appl. E Environ. Microbiology, 64(10):4093 a 4094 (1998), ou um homólogo dos mesmos, ou mutantes dos mesmos (sendo que aqueles mutantes são opcionalmente obtidos por alteração de proteína com o uso de técnicas de evolução direcionada, projeto computacional ou mutagênese racional, ou uma combinação dos mesmos). As técnicas de projeto computacional são reveladas em US 2009-0191607 e WO 2010/077470, os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
Existem pelo menos duas aldolases de classe II conhecidas para catalisar a adição entre piruvato e acetaldeído, e as duas (BphI e HpaI) foram caracterizadas em algum nível de detalhe em Wang W et al., Comparison of two metal-dependent pyruvate aldolases related by convergent evolution: substrate specificity, kinetic mechanism and substrate channeling, Biochemistry, 49:3774 a 3782 (2010). Essas enzimas empregam um cofator de metal (ou Zn ou Mn são comuns). BphI e HpaI não compartilham similaridade de sequência detectável. Enquanto que a BphI é estereosseletiva e leva ao aduto de 4S, HpaI, devido ao seu local ativo muito aberto, produz uma mistura racêmica (adutos de 4R e de 4S). A BphI é aloestericamente acoplada à BphJ, uma desidrogenase de acetaldeído, e não é ativo e estável quando expresso em isolação. Entretanto, a HpaI pode ser expressa em E. coli por si mesmo, e mostra atividade. Em uma modalidade alternativa da invenção, a adição aldólica entre piruvato e acetaldeído é catalisada por HpaI ou BphI, ou mutantes das mesmas (sendo que aqueles mutantes são opcionalmente obtidos por alteração de proteína com o uso de técnicas de evolução direcionada, projeto computacional ou mutagênese racional, ou uma combinação dos três).
Como uma extensão, qualquer piruvato aldolase adequado e outros aldolases similares (por exemplo, KDPG aldolase) que catalisam a adição aldólica de um aldeído em uma cetona, podem concebivelmente serem realterados para catalisar a adição aldólica de acetaldeído em piruvato. O reprojeto por inclui, porém sem limitação a, alcançar a especificidade de substrato desejada para ambos o piruvato e o acetaldeído, controlando a estereosseletividade desejada para produzir ou adutos de enantiopuro ou racêmicos (ácido (R)4-hidroxi-2-oxo-pentanoico e ácido (S)4-hidroxi-3-oxo- pentanoico), o que estabiliza a enzima para obter a atividade catalítica desejada nas condições industriais, nas quais a invenção é praticada (por exemplo, termoestabilização ou estabilização em título orgânico maior), e/ou aprimorar a solubilidade e a possibilidade de expressão da enzima no contexto das condições industriais nas quais a invenção é prática (por exemplo, em uma trajetória metabólica em Saccharomyces cerevisiae). Em outra modalidade da invenção, a adição aldólica entre piruvato e acetaldeído é catalisada por piruvato aldolase, ou quaisquer homólogos e mutantes dos mesmos (sendo que aqueles mutantes são opcionalmente obtidos por alteração de proteína com o uso de técnicas de evolução direcionada, projeto computacional ou mutagênese racional, ou uma combinação dos três).
Finalmente, com o uso da técnica de projeto de enzima de novo, tal como aquela descrita em Zanghellini, A et al, New Algorithms and an in silico Benchmark for Computational Enzyme Design, Protein Science 15:2785 a 2794 (2006), é possível projetar novas enzimas de aldolase para os substratos que podem ou não existirem na natureza. Até 70 das tais aldolases foram projetadas por de novo, conforme descrito em US 2009-0191607, o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade. A aplicação dessa metodologia para o piruvato e o acetaldeído dos substratos pode levar a aldolases com a atividade desejada. Em outra modalidade da invenção, a adição aldólica entre piruvato e acetaldeído é catalisada por uma aldolase projetada por de novo.
Etapa 2’: ciclização de ácido 4-hidroxi-2-oxo- pentanoico em 2-oxo-4-valerolactona
O ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico é ciclizado em 2-hidroxi-4-valerolactona (composto L7 na Figura 1). Em soluções ácidas para neutras, o equilíbrio termodinâmico encontra-se na direção da ciclização para a lactona. A ciclização para a lactona pode ser cineticamente aperfeiçoada pelo uso de ou catálise química ou bioquímica. Catalisadores homogêneos e heterogêneos para a lactonização incluem condições ácidas fortes (por exemplo, ácido sulfúrico), catalisadores de metal (por exemplo, paládio, rubídio). A catálise bioquímica pode ser obtida pela ação de lipases, esterases, proteases e lactonases sob condições que favoreçam a reação de lactonização direta (pH baixo pra neutro / título de solvente altamente orgânico) conforme demonstrado, por exemplo, em Martin CH, et al, Integrated bioprocessing for pH-dependent of 4-valerolactone from levulinate in Pseudomonas Putida KT2440, Appl. e Environ, Microbiology 76(2):417 a 424.
Em uma modalidade da invenção, 2-oxo-4- valerolactona é produzido a partir de ácido 4-hidroxi-2-oxo- pentanoico, na presença de um catalisador, após a separação de ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico do caldo de fermentação ou da solução livre de célula. Em outra modalidade da invenção, a lactonização de ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico em 2-oxo-4-valerolactona é catalisada diretamente por uma lipase ou esterase ou protease ou lactonase, ou mutantes das mesmas (sendo que aqueles mutantes são opcionalmente obtidos pela alteração de proteína com o uso de técnicas de evolução direcionada, projeto computacional, mutagênese racional, ou uma combinação dos três).
Etapa 3: redução de ácido 4-hidroxi-2-oxo- pentanoico em ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico
Dentre a ampla variedade de desidrogenases naturais, a seleção experimental e/ou in silico pode selecionar as desidrogenases com especificidade de substrato que tolera o ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico e o ácido 2,4- dihidroxi-pentanoico. Adicionalmente, técnicas de evolução direcionada, projeto computacional ou mutagênese racional, ou uma combinação dos três, podem ser usadas para modificar ou aumentar a especificidade de substrato da desidrogenase existente na direção do ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico e do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico. Exemplos de pontos de partida de desidrogenase adequados incluem L- e D-lactato desidrogenases (dependente de NAD(P)H- ou Heme-, a partir de origem bacteriana ou eucariótica), malato, aspartato e glutamato desidrogenases (dependente de NAD(P)H- a partir de origem bacteriana ou eucariótica), assim como álcoois desidrogenases (tais como de álcool fenílico ou alquílico desidrogenases dependente de NAD(P)H-). Exemplos de tais desidrogenases são listados na seção de exemplo.
Em uma modalidade da invenção, o ácido 4-hidroxi-2- oxo-pentanoico é reduzido seletivamente em ácido 2,4- dihidroxi-pentanoico com o uso de catálise química homogênea ou heterogênea. O ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico pode ou não ser separado/purificado a partir da fermentação ou solução livre de célula para completar essa etapa. Preferencialmente, o ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico é separado da solução ou do caldo de fermentação antes de ser sujeito subsequentemente à dita redução.
Em uma modalidade da invenção, uma Desidrogenase dependente de NAD(P)H é usada para catalisar a redução da cetona na posição 2 no ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico. Em outra modalidade, a dita desidrogenase reduz a cetona com um alto grau de especificidade de substrato para ácido 4- hidroxi-2-oxo pentanoico e alta regiosseletivamente para a cetona na posição 2. Em uma modalidade da invenção, a dita desidrogenase não é estereosseletiva e pode aceitar ambos os enantiômeros de 4R e de 4S. Em outra modalidade da invenção, a dita desidrogenase reduz seletivamente a forma enantiomérica ou de 4R ou de 4S do ácido 4-hidroxi-2-oxo- pentanoico.
Em outra modalidade da invenção, uma desidrogenase dependente de FAD é usada ao invés de uma Desidrogenase dependente de NAD(P)H, preferencialmente com um alto grau de substrato e regiosseletividade. Em uma modalidade da invenção, a dita desidrogenase não é estereosseletiva e pode aceitar ambos os enantiômeros de 4R e de 4S. Em outra modalidade da invenção, a dita desidrogenase reduz seletivamente ou a forma enantiomérica de 4R ou de 4S do ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico.
Em outra modalidade da invenção, uma desidrogenase dependente de FMN é usada ao invés de uma aesidrogenase dependente de NAD(P)H, preferencialmente com um alto grau de substrato e regiosseletividade. Em uma modalidade da invenção, a dita desidrogenase não é estereosseletiva e pode aceitar ambos os enantiômeros de 4R e de 4S. Em outra modalidade da invenção, a dita desidrogenase reduz seletivamente ou a forma enantiomérica de 4R ou de 4S do ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico.
Ainda em outra modalidade da invenção, uma desidrogenase dependente de ferricitocromo é usada ao invés de uma desidrogenase dependente de NAD(P)H, preferencialmente com um alto grau de substrato e regiosseletividade. Em uma modalidade da invenção, a dita desidrogenase não é estereosseletiva e pode aceitar ambos os enantiômeros de 4R e de 4S. Em outra modalidade da invenção, a dita desidrogenase reduz seletivamente ou a forma enantiomérica de 4R ou de 4S do ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico.
Ainda em outra modalidade da invenção, uma desidrogenase dependente de quinona é usada ao invés de uma desidrogenase dependente de NAD(P)H, preferencialmente com um alto grau de substrato e regiosseletividade. Em uma modalidade da invenção, a dita desidrogenase não é estereosseletiva e pode aceitar ambos os enantiômeros de 4R e de 4S. Em outra modalidade da invenção, a dita desidrogenase reduz seletivamente ou a forma enantiomérica de 4R ou de 4S do ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico.
Etapa 3’: ciclização do ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico em 2-hidroxi 4-valerolactona
O ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico é ciclizado em 2- hidroxi-4-valerolactona (composto L6 na Figura 1). Em soluções ácidas para neutras, o equilíbrio termodinâmico encontra-se em direção da ciclização em 4-valerolactona. As mesmas observações sobre equilíbrio termodinâmico e catálise bioquímica e química se mantêm conforme descrito acima.
Em uma modalidade da invenção, o 2-hidroxi-4- valerolactona é produzido a partir de ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico, na presença de um catalisador, após a separação do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico a partir do caldo de fermentação ou da solução livre de célula. Em outra modalidade da invenção, a lactonização do ácido 2,4- dihidroxi-pentanoico em 2-hidroxi-4-valerolactona é catalisada diretamente por uma lipase ou esterase ou protease ou lactonase, ou mutantes das mesmas (sendo que esses mutantes são obtidos por alteração de proteína com o uso de técnicas de evolução direcionada, projeto computacional ou mutagênese racional, ou uma combinação dos três).
Etapa 4: oxidação do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico em ácido 4-oxo-2-hidroxi-pentanoico
Em uma modalidade da invenção, o ácido 2,4- dihidroxi-pentanoico é seletivamente oxidado para ácido 4- oxo-2-hidroxi-pentanoico com o uso de catálise química homogênea ou heterogênea. O ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico pode ou não ser separado/purificado a partir da fermentação ou da solução livre de célula para completar essa etapa. Preferencialmente, o ácido 4-oxo-2-hidroxi-pentanoico é separado da solução ou do caldo de fermentação antes de ser sujeito subsequentemente à dita oxidação.
Em uma modalidade preferida da invenção, uma desidrogenase dependente de NAD(P)H é usada para catalisar a oxidação da hidroxila na posição 4 no ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico. Em uma modalidade preferida, a dita desidrogenase oxida a hidroxila com um alto grau de especificidade de substrato para ácido 2,4-dihidroxi pentanoico e alta regiosseletivamente para a hidroxila na posição 4. Preferencialmente, a dita desidrogenase aceita os quatro enantiômeros diferentes (2R4R, 2R4S, 2S4R, 2S4S) do ácido 2,4-dihidroxi pentanoico. Em uma modalidade alternativa, a dita desidrogenase oxida seletivamente ou os enantiômeros de 2R (2R4R, 2R4S) ou de 2S (2S4R,2S4S) do ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico, seja qual for o enantiômero mais abundante que resulta da redução anterior do ácido 4-hidroxi-2-oxo- pentanoico. Exemplos de tais desidrogenases são listados na seção de exemplo.
Em outra modalidade da invenção, uma desidrogenase dependente de FAD é usada para catalisar a oxidação da hidroxila na posição 4 no ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico. Em uma modalidade preferida, a dita desidrogenase oxida a hidroxila com um a alto grau de especificidade de substrato para o ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico e alta regiosseletivamente para a hidroxila na posição 4. Preferencialmente, a dita desidrogenase aceita os quatro enantiômeros diferentes (2R4R, 2R4S, 2S4R, 2S4S) do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico. Em uma modalidade alternativa, a dita desidrogenase oxida seletivamente ou os enantiômeros de 2R (2R4R, 2R4S) ou de 2S (2S4R, 2S4S) do ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico, seja qual for o enantiômero mais abundante que resulta da redução de ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico.
Em outra modalidade da invenção, uma desidrogenase dependente de FMN é usada para catalisar a oxidação da hidroxila na posição 4 no ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico. Em uma modalidade preferida, a dita desidrogenase oxida a hidroxila com um alto grau de especificidade de substrato para o ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico e alta regiosseletivamente para a hidroxila na posição 4. Preferencialmente, a dita desidrogenase aceita os quatro enantiômeros diferentes (2R4R, 2R4S, 2S4R, 2S4S) do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico. Em uma modalidade alternativa, a dita desidrogenase oxida seletivamente ou os enantiômeros de 2R (2R4R, 2R4S) ou de 2S (2S4R,2S4S) do ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico, seja qual for o enantiômero mais abundante que resulta da redução do ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico.
Ainda em outra modalidade da invenção, uma desidrogenase dependente de ferricitocromo é usada para catalisar a oxidação da hidroxila na posição 4 no ácido 2,4- dihidroxi-pentanoico. Em uma modalidade preferida, a dita desidrogenase oxida a hidroxila com um alto grau de especificidade de substrato para o ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico e alta regiosseletivamente para a hidroxila na posição 4. Preferencialmente, a dita desidrogenase aceita os quatro enantiômeros diferentes (2R4R, 2R4S, 2S4R, 2S4S) do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico. Em uma modalidade alternativa, a dita desidrogenase oxida seletivamente ou os enantiômeros de 2R (2R4R, 2R4S) ou de 2S (2S4R, 2S4S) do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico, seja qual for o enantiômero mais abundante que resulta da redução do ácido 4-hidroxi-2- oxo-pentanoico.
Ainda em outra modalidade da invenção, uma desidrogenase dependente de quinona é usada para catalisar a oxidação da hidroxila na posição 4 no ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico. Em uma modalidade preferida, a dita desidrogenase oxida a hidroxila com um alto grau de especificidade de substrato para o ácido 2,4-dihidroxi pentanoico e alta regiosseletivamente para a hidroxila na posição 4. Preferencialmente, a dita desidrogenase aceita os quatro enantiômeros diferentes (2R4R, 2R4S, 2S4R, 2S4S) do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico. Em uma modalidade alternativa, a dita desidrogenase oxida seletivamente ou os enantiômeros de 2R (2R4R, 2R4S) ou de 2S (2S4R,2S4S) do ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico, seja qual for o enantiômero mais abundante que resulta da redução do ácido 4-hidroxi-2-oxo-pentanoico.
Etapa 5: desidratação do ácido 4-oxo-2-hidroxi- pentanoico em ácido 4-oxo-2-pentanoico
Classicamente, a desidratação química é alcançada com ou catálise homogênea ou heterogênea, tal como temperatura > 100°C, ácido concentrado (4,0M de ácido sulfúrico) e/ou catalisador de óxido de metal (óxidos de zinco ou de alumínio). Em uma modalidade da invenção, o ácido 4-oxo-2-hidroxi-pentanoico obtido após as etapas de redução e de oxidação é desidratado quimicamente em ácido 4-oxo-2- pentanoico por catálise homogênea ou heterogênea. O ácido 4- oxo-2-hidroxi-pentanoico pode ou não ser separado/purificado a partir da fermentação ou solução livre de célula para completar essa etapa. Preferencialmente, o ácido 4-oxo-2- hidroxi-pentanoico é separado da solução ou do caldo de fermentação antes de ser sujeito à dita desidratação.
A desidratação dos compostos orgânicos pode ser catalisado alternativamente por uma enzima de desidratase.
Diversas classes de desidratase foram caracterizadas e contam com mecanismos diferentes: mecanismo com base em radical, tal como e, desidratases dependentes de SAM ou dependentes de vitamina B12 (por exemplo, desidratase de diol, desidratase de glicerol), mecanismo ácido de Lewis tal como desidratases que contêm ferro e enxofre (por exemplo, desidratase de dihidroxi-ácido, aconitase) e mecanismo intermediário de íon de enolato, tal como desidratase de diácido (por exemplo, tartarato desidratase). Enquanto que todos os mecanismos são aplicáveis para a desidratação de ácido 4-oxo-2-hidroxi- pentanoico, os mecanismos que contam com um intermediário de enolato são preferidos, sendo pelo fato de que a formação de um ânion de enolato na carbonila β para a hidroxila é eliminado, diminui o pKa do a-próton, o que permite, desse modo, que o mesmo seja prontamente abstraído por um grupo de ácido/base em geral. Um grupo de ácido/base adicional em geral protona a deixar a molécula de água. Esse mecanismo é explorado por uma ampla variedade de desidratases naturais: Desidratases dependentes de magnésio a partir da superfamília de enolase, tais como tartarato desidratase, gluconato desidratase, usam esse mecanismo para a desidratação de diácidos estruturalmente diversos com alta especificidade de substrato, conforme descrito, por exemplo, em Gerlt et al., Divergent evolution in the enolase superfamily: the interplay of mechanism and specificity, Biochemistry, 433:59 a 70 (2005). A fumarase (também conhecida como fumarato hidratase) catalisa a hidratação reversível com base em enolato do malato em fumarato. A desidratase de enoil (também conhecida como crotonase) usa o ânion de enolato de um tioéster de CoA para catalisar a hidratação reversível de vários substratos de CoA (ver, por exemplo, Holden et al., The Crotonase Superfamily: divergently related enzymes that catalyze different reactions involving acyl Coenzyme A thioesters, Acc. Chem. Res. 34:145 a 157.(2001))
Em uma modalidade da invenção, a desidratação do ácido 4-oxo-2-hidroxi-pentanoico em ácido 4-oxo-2-pentanoico é catalisada por uma desidratase. Em uma modalidade preferida da invenção, a dita desidratase usa um intermediário de enolato para catalisar a desidratação. Preferencialmente, a dita desidratase é um membro da superfamília de enolase, superfamílias de desidratase de enoil-coA ou fumarase, ou mutantes dos mesmos obtidos pela alteração de proteína. Em uma modalidade preferida da invenção, a dita desidratase exibe um alto nível de especificidade de substrato para o ácido 4-oxo-2-hidroxi-pentanoico. Em outra modalidade preferida da invenção, a dita desidratase desidrata igualmente os enantiômeros 2R e 2S do ácido 4-oxo-2-hidroxi- pentanoico. Em uma modalidade alternativa da invenção, a dita desidratase desidrata seletivamente ou o enantiômero 2R ou o 2S do ácido 4-oxo-2-hidroxi-pentanoico.
Alternativa para Etapa 4 e 5: Alternativamente a uma conversão de 2 etapas do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico em ácido 4-oxo-2-pentanoico, uma conversão de 1 etapa pode ser alcançada com o uso de uma desidratação oxidativa. As desidratações oxidativas são comuns no metabolismo de açúcares. A assim chamada 4,6 enzimas de desidratase, tal como a 4,6-desidratase que inverte UDP-GlcNAc, sendo que os detalhes estruturais são descritos em Ishiyama et al., Structural studies of FlaA1 from helicobacter pylori reveal the mechanism for inverting 4,6-dehydratase activity, J. Bio. Chem. 281(34):24489 a 24495 (2006). Em uma modalidade da invenção, tal 4,6-desidratase é usada para catalisar a desidratação oxidativa do ácido 2,4- dihidroxi-pentanoico em ácido 4-oxo-2-pentanoico. Em um aspecto da invenção, a dita 4,6-desidratase é enantiosseletiva e desidrata preferencialmente um dos enantiômeros do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico (seja 2R4R, 2R4S, 2S4R ou 2S4S). Em outro aspecto da invenção, a dita 4,6-desidratase não é enantiosseletiva e desidrata, com eficiência catalítica similar, dois ou mais dos enantiômeros do ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico. Em uma modalidade preferida da invenção, a 4,6-desidratase é altamente ativa no ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico, é obtido a partir de uma 4,6- desidratase natural, por alteração de proteína com o uso de técnicas de evolução direcionada, projeto computacional ou mutagênese racional, ou uma combinação dos mesmos.
Etapa 6: redução de ácido 4-oxo-2-pentanoico em ácido 4-oxo-pentanoico (ácido levulínico)
As ligações duplas em alcenos substituídos podem ser reduzidas (hidrogenadas) para obter os alcanos saturados correspondentes. Os alcenos substituídos podem ser reduzidos com o uso de catálise química ou, geralmente de modo assimétrico, com o uso de biocatalisadores, tal como redutases de enoato, conforme revisado em Stuermer et al., Asymmetric bioreduction of activated C=C bonds using enoate redutases from the old yellow enzyme family, Curr. Opin. In Chem. Bio. 11:203 a 213 (2007). As redutases de enoato foram caracterizadas a partir de ambos os organismos eucarióticos, tais como Sacharomyces cerevisiae e Marchantia, e procarióticos, tal como Clostridium. A família de enzimas de enoato redutase é dependente de um cofator de flavina (FMN) que fica oxidado para cada renovação (turnover) da enzima. Exceto para um caso conhecido, o qual é independente de nicotinamida, o cofator de flavina é reduzido para turno por um cofator de nicotinamida, ou NADH ou NADPH, que também se liga no local ativo. Mediante a conclusão de uma renovação, o substrato foi reduzido enquanto que o cofator NAD(P)H foi oxidado para NAD(P)+. As redutases de enoato diferem em sua especificidade de substrato. Entretanto, diversas redutases de enoato, tal como redutases de enoato de levedura e Clostridium, têm uma ampla especificidade de substrato e podem acomodar alcenos substituídos lineares (com grupos funcionais de ácidos ou de cetona) assim como lactonas substituídas, tal como 4-valerolactona.
Em uma modalidade da invenção, o ácido 4-hidroxi-2- oxo-pentanoico é separado do caldo de separação ou da solução livre de célula, e a ligação dupla é seletivamente reduzida com o uso de catálise homogênea ou heterogênea.
Em outra modalidade da invenção, uma enzima de enoato redutase é usada para reduzir o ácido 4-hidroxi-2-oxo- pentanoico em ácido levulínico. Em uma modalidade preferida, a dita enoato redutase é dependente de ambos os cofatores de FMNH2 e de NAD(P)H, sendo que o dito Cofator de NAD(P)H é usado no local ativo para regenerar o FMNH2 para seu estado de oxirredução antes da catálise. Em uma modalidade preferida da invenção, a dita enoato redutase é clonada e expressa no hospedeiro de fermentação. Em uma modalidade alternativa, a dita enoato redutase é usada de modo extracelular, ou em um sistema livre de célula com um sistema de regeneração de cofator adequado. Em outra modalidade alternativa, a dita redução é catalisada por um catalisador de célula inteira que expressa uma ou diversas redutases de enoato, de tal modo que a dita célula seja diferente da(s) célula(s) do hospedeiro de fermentação, no qual parte ou a totalidade da trajetória é usada.
Etapa 7: redução de ácido 4-oxo-pentanoico (ácido levulínico) em ácido 4-hidroxi-pentanoico
De modo similar à etapa 3 (parágrafos [0037] a [0043]), a redução da cetona na posição 4 no ácido levulínico pode ser alcançada ou por meio de catálise química ou pelo uso de um biocatalisador de desidrogenase. No contexto de uma trajetória metabólica, essa última redução (e oxidação correspondente de um equivalente de redução) assegura que o balanço de redox da trajetória inteira a partir dos açúcares de C5 e/ou de C6.
Em uma modalidade da invenção, o ácido levulínico é separado do caldo ou da solução livre de célula, e a cetona nas posições 4 é seletivamente reduzida com o uso de catálise homogênea ou heterogênea para render o ácido 4-hidroxi- pentanoico.
Em uma modalidade alternativa da invenção, uma desidrogenase dependente de NAD(P) é usada para catalisar a redução da cetona na posição 4 no ácido levulínico para a hidroxila correspondente para render o ácido 4-hidroxi- pentanoico. Em uma modalidade preferida, a dita desidrogenase reduz a cetona com um alto grau de especificidade de substrato para o ácido levulínico e alta regiosseletivamente para a cetona na posição 4. Preferencialmente, a dita desidrogenase é a mesma enzima que para a oxidação da hidroxila na posição 4 do ácido 4-oxo-2-hidroxi-pentanoico, ou um mutante do mesmo (sendo que o mutante é obtido por projeto computacional ou mutagênese experimental, ou uma combinação dos dois). Em uma modalidade preferida da invenção, a dita desidrogenase produz seletivamente um dos enantiômeros (4R ou 4S) do ácido 4-hidroxi-pentanoico. Em uma modalidade alternativa, a dita desidrogenase produz uma mistura racêmica dos enantiômeros de 4R e de 4S do ácido 4- hidroxi-pentanoico.
Etapa 8: Ciclização do ácido 4-hidroxi-pentanoico em 4-valerolactona
O ácido 4-hidroxi-pentanoico é ciclizado em 4-valerolactona(também conhecido como y-valerolactona, composto L1 na Figura 1). Em soluções ácidas, o equilíbrio termodinâmico encontra-se em direção da ciclização em 4- valerolactona. As mesmas observações sobre o equilíbrio termodinâmico e catálise bioquímica e química se mantêm conforme no parágrafo [0035].
Em uma modalidade da invenção, a 4-valerolactona é produzida a partir do ácido 4-hidroxi-pentanoico, na presença de um catalisador, após a separação do ácido 4-hidroxi- pentanoico do caldo de fermentação ou da solução livre de célula. Em uma modalidade preferida da invenção, um ácido 4- hidroxi-pentanoico enantiopuro (seja o enantiômero de 4R ou de 4S) é convertido pelo dito catalisador na 4-valerolactona enantiopura. Em uma modalidade alternativa, uma mistura racêmica dos dois enantiômeros para o ácido 4-hidroxi- pentanoico (4R e 4S) é convertida pelo dito catalisador em uma mistura racêmica de 4-valerolactona.
Em outra modalidade da invenção, a lactonização de ácido 4-hidroxi-pentanoico em 4-valerolactona é catalisada diretamente por uma lipase ou esterase ou protease ou lactonase, ou mutantes das mesmas (sendo que esses mutantes são obtidos por alteração de proteína com o uso de técnicas de evolução direcionada, projeto computacional ou mutagênese racional, ou uma combinação dos três) dentro de uma célula ou do lado de fora de uma célula. Em uma modalidade preferida da invenção, a dita lipase ou esterase ou protease ou lactonase age no substrato de ácido 4-hidroxi-pentanoico enantiopuro para render uma 4-valerolactona enantiopura. Em uma modalidade alternativa, a dita lipase ou esterase de protease ou lactonase age em uma mistura racêmica dos enantiômeros de 4R e de 4S do ácido 4-hidroxi-pentanoico para render uma mistura racêmica do enantiômero de 4R e de 4S da 4- valeralactona.
EXEMPLOS
Exemplos de enzimas de piruvato descarboxilases: uma enzima da família de piruvato descarboxilase (EC número de EC 4.1.1.1), tal como a enzima de piruvato descarboxilase, pode ser usada para catalisar a primeira etapa da trajetória, a conversão de piruvato em acetaldeído. A Tabela 1 abaixo lista exemplos de tais enzimas (ao longo com seus organismos fonte), que foram estudados e caracterizados na literatura, com seu número de aquisição para o banco de dados público GenBank (NCBI) listado. As enzimas homólogas, por exemplo, sequências de DNA e proteína, obtidas a partir das sequências na tabela 1 (ou sua tradução inversa) com o uso de um software de alinhamento, tal como, porém sem limitação a, Blast, PSI-Blast ou HMMER3, e com um valor e de alinhamento < 0,1, também podem ser usadas. TABELA 1
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Exemplos de enzimas de aldolase que catalisam a produção de ácido 4-hidroxi-2-ceto-pentanoico: As enzimas homólogas, por exemplo, as sequências de DNA e proteína, obtidas a partir das sequências nas tabelas abaixo (ou sua 5 tradução inversa) com o uso de um software de alinhamento, tal como, porém sem limitação a, Blast, PSI-Blast ou HMMER3, e com um valor e de alinhamento < 0,1, também podem ser usadas. TABELA 2: aldolase de classe I: EC 4.1.3.39, nome 10 oficial: 4-hidroxi-2-oxovalerate aldolase
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TABELA 3: aldolases de classe II: EC 4.1.3.39, nome oficial: 4-hidroxi-2-oxovalerate aldolase
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TABELA 4: exemplos de piruvato aldolases adicionais suscetíveis para catalisar a reação, ou como WT ou após a 5 alteração de proteína:
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Exemplos de enzimas de desidrogenase capazes de reduzir a cetona na posição 4 de derivados de ácido pentanoico em um álcool secundário (hidroxila) / oxidar um álcool secundário (hidroxila) na posição 4 de derivados de 10 ácido pentanoico em uma cetona: As enzimas homólogas, por exemplo, sequências de DNA e proteína, obtidas a partir das sequências nas tabelas abaixo (ou sua tradução inversa) com o uso de um software de alinhamento, tal como, porém sem limitação a, Blast, PSI-Blast ou HMMER3, e com um valor e de alinhamento < 0,1, também podem ser usadas.
Uma ampla variedade de desidrogenases é capaz de oxidar/reduzir álcoois secundários/cetonas, com vários graus de especificidade de substrato. As sequências de desidrogenase listadas abaixo são alguns exemplos de desidrogenases relatadas na literatura como ativas em substituintes de álcoois secundários/cetonas em cadeias alquílicas de três carbonos ou mais. TABELA 5
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Números de EC temporários (não oficiais) atribuídos pelo banco de dados de enzima BRENDA
Exemplos de enzimas de desidrogenase para reduzir ácido 2,4-dioxo pentanoico em ácido 4-oxo-2-hidroxi- 5 pentanoico: As enzimas homólogas, por exemplo, as sequências de DNA e proteína, obtidas a partir das sequências nas tabelas abaixo (ou sua tradução inversa) com o uso de um software de alinhamento, tal como, porém sem limitação a, Blast, PSI-Blast ou HMMER3, e com um valor e de alinhamento < 10 0,1, também podem ser usadas.
Enzimas de lactato desidrogenase com ampla especificidade de substrato demonstrada na literatura para aceitar o ácido 2,4-dioxo pentanoico do substrato. As duas sequências abaixo têm estereosseletividades diferentes. TABELA 6
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Exemplo de enzimas de desidratase que catalisam a conversão de ácido 4-oxo-2-hidroxi-pentanoico em ácido 4-oxo- 2-pentanoico: As enzimas homólogas, por exemplo, as sequências de DNA e proteína, obtidas a partir das sequências nas tabelas abaixo (ou sua tradução inversa) com o uso de um software de alinhamento, tal como, porém sem limitação a, Blast, PSI-Blast ou HMMER3, e com um valor e de alinhamento <0,1, também pode ser usado. Desidratases da superfamília de enolato: essas enzimas de desidratase, que são estruturalmente relacionadas à família “enolase” de enzimas, estabilizam o íon de enolato formado após a abstração de um do hidrogênio α para o grupo funcional ácido. Pelo fato de que essas enzimas contam com a estabilização do ânion de enolato para diminuir a energia de ativação para a reação de desidratação, as mesmas podem ser ativas no substrato com a hidroxila a ser eliminado β seja com um grupo funcional de ácido carboxílico, de cetona ou de éster. Diversos exemplos dessa classe de desidratase são fornecidos na tabela abaixo: TABELA 7
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Desidratases da família enoil-coA hidratase, ou da “crotonase”: essas enzimas podem catalisar a eliminação/adição reversível de uma molécula de água para/a partir de um α, β tio-éster não saturado (derivados de coenzima A). Pelo fato de que a mesmas contam com a estabilização do ânion de enolato formado após a abstração do próton, as enzimas também são capazes de catalisar a hidratação (e desidratação reversível) de α,β ácidos carboxílicos não saturados e cetonas. Ao contrário da desidratase da superfamília de enolase, essas enzimas não exigem qualquer cofator. TABELA 8
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Desidratases da família fumarase C (enzimas da família fumarase A e B usam uma aglomeração de ferro e enxofre): Como para a família enoil-coA hidratases, essas enzimas estabilizam o enolato sem exigir qualquer cofator. A 5 aglutinação de substrato e a estabilização do estado de transição são alcançadas com os aminoácidos do local ativo. TABELA 9
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Outras desidratases: todas as outras desidratases conhecidas (Números de EC 4.2.1.*) também podem ser usadas 10 para catalisar a desidratação do ácido 4-oxo-2-hidroxi pentanoico em ácido 4-oxo-2-pentanoico, tais como umas enzimas de desidratase que contam com uma aglomeração de ferro e enxofre (por exemplo, dihidroxi-diol desidratase, fumarase A e C) ou desidratases dependentes de vitamina B12 e dependentes de SAM, tais como glicerol e propanodiol desidratase.
Exemplosdeenzimasdeoxidase/epimerasecapazesde catalisar a desidratação oxidativa/conversão de ácido 2,4- dihidroxi-pentanoico em ácido 4-oxo-2-pentanoico: As enzimas homólogas, por exemplo, as sequências de DNA e proteína, obtidas a partir das sequências nas tabelas abaixo (ou sua tradução inversa) com o uso de um software de alinhamento, tal como, porém sem limitação a, Blast, PSI-Blast ou HMMER3, e com um valor e de alinhamento < 0,1, também podem ser usadas. TABELA 10
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Exemplos de enzimas que catalisam a redução de ácido 4-oxo, 2-hydroxo pentanoico para ácido levulínico:As enzimas homólogas, por exemplo, as sequências de DNA e proteína, obtidas a partir das sequências nas tabelas abaixo (ou sua tradução inversa) com o uso de um software de alinhamento, tal como, porém sem limitação a, Blast, PSI- Blast ou HMMER3, e com um valor e de alinhamento < 0,1, também podem ser usadas.
A família das enzimas chamada de enoato-redutases, ou mais informalmente de Enzimas Amarelas Antigas, são enzima dependentes de NAD(P)H e de FMN que catalisam a redução reversível de α, β tioésteres não saturados, ácidos carboxílicos e cetonas. As mesmas exibem amplas especificidades de substrato e as seguintes sequências foram experimentalmente provadas com sucesso (ver os dados) para catalisar a redução de 4-oxo, 3-hidroxi ácido pentanoico em ácido levulínico. TABELA 11
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Múltiplos mutantes pontuais da enzima NCR a partir de Pseudomonas syringae também foram mostrados experimentalmente para exibir várias atividades catalíticas na direção de ácido 4-oxo, 2-hidroxo pentanoico como um substrato. Esses mutantes correspondem a Y178A, P242Q, D338Y e F315Y na numeração de aminoácido da sequência AAD16106.
Exemplos de enzimas capazes de catalisar a lactonização de 4-hidroxi ácidos em seus ésteres cíclicos correspondentes (lactonas): As enzimas homólogas, por exemplo, as sequências de DNA e proteína, obtidas a partir das sequências nas tabelas abaixo (ou sua tradução inversa) com o uso de um software de alinhamento, tal como, porém sem limitação a, Blast, PSI-Blast ou HMMER3, e com um valor e de alinhamento < 0,1, também podem ser usadas.
Muitos tipos de lactonases (por exemplo, lactanohidrolases) que podem ser usadas para catalisar a formação reversível de 1,4 ésteres cíclicos a partir de 4- hidroxi ácidos são conhecidos. Em particular, as 1,4 lactonases (EC 3.1.1.25) mostram alguma especificidade na direção de 4-hidroxi ácidos e são, portanto, sequências de escolha para catalisar as reações da etapa 8 nas Figuras 3, 4 e 5, e as múltiplas reações de lactonização na Figura 6. Particularmente, algumas 1,4-lactonases foram ensaiadas com ácido 4-hidroxi pentanoico e foi relatado que catalisam sua ciclização reversível em gama-valerolactona. A tabela abaixo lista algumas enzimas de lactonase que foram relatadas na literatura como que catalisam essa reação. TABELA 12
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Uma ampla variedade de outras lactonases caracterizadas é suscetível para catalisar a ciclização de 4- hidroxiácidos. Abaixo está uma tabela que lista os Números de EC que correspondem à lactonases existentes (uma subclasse de carboxiesterases). TABELA 13
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Finalmente, foi observado que esterases, lipases e peptidases/amidases catalisam a reação de lactonização sob condições experimentais apropriadas (pH não alcalino e normalmente em temperatura ambiente). Por exemplo, lipases são referenciadas em PCT/US2010/055524 para lactonização e amidase/peptidase foram usadas com sucesso para sintetizar lactonas em WO/2009/142489, ambos dos quais estão aqui incorporado por referência.
Exemplos de métodos não biocatalíticos para catalisar a lactonização de 4-hidroxi ácidos em seus ésteres cíclicos correspondentes (lactonas): existem múltiplos meios não biocatalíticos para catalisar a 1,4-lactonização de hidroxi ácidos. Por exemplo, é bem conhecido que tal lactonização é catalisada por ácido e, portanto, a redução do pH do meio (seja dentro ou fora das células vivas) aumenta a taxa da reação de lactonização. Adicionalmente, foi relatado em PCT/US2010/055524 (o qual é aqui incorporado por referência) que a ativação através da transferência de grupo no grupo funcional ácido do 4-hidroxi ácido é suficiente, 5 mediante a condições razoáveis, tal como pH 2,5 a 7,0 e temperatura ambiente, para render a forma de lactona de modo quantitativo. Por exemplo, PCT/US2010/055524 lista (1) ativação com um grupo de fosfato (por produzir nesse caso, o fosfato de 4-hidroxilbutiril) e (2) ativação com coenzima A 10 (por produzir 4-hidroxilbutiril-CoA). A síntese dos intermediários 4-hidroxilpentanoil-fosfato ou 4- hidroxilpentanoil-CoA, com o uso de uma enzima quinase natural ou alterada ou CoA sintetase, respectivamente, ou síntese química, é esperado que resulte em ativação similar e 15 lactonização espontânea mediante a condições apropriadas. Todas as referências citadas no presente documento estão aqui incorporadas por referência para todos os propósitos.

Claims (28)

1. Método para produzir ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico, caracterizadopelo fato de que o método compreende: converter o piruvato em um ácido 4-hidroxi 2-oxo- pentanoico por adição aldólica, e converter ácido 4-hidroxi 2-oxo-pentanoico no ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico através da redução enzimática ou química.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o piruvato é produzido a partir de uma fonte de carbono que compreende um ou mais açúcares de C6 e/ou C5.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o piruvato é produzido pelo menos em parte através de glicólise em um sistema microbiano.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que a adição aldólica para piruvato acontece em um hospedeiro de fermentação eucariótico, procariótico, ou arquebacteriano.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que o ácido 4-hidroxi 2-oxo- pentanoico é recuperado a partir do hospedeiro de fermentação e convertido no ácido 2,4-dihidroxi-pentanoico em um sistema livre de célula.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido 4-hidroxi 2-oxo- pentanoico é produzido a partir de piruvato pela adição aldólica de acetilaldeído.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico é oxidado para ácido 2-hidroxi 4-oxo-pentanoico.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o ácido 2-hidroxi 4-oxo pentanoico é convertido por reação de desidratase em ácido 4- oxo-2-pentanoico.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ácido 4-oxo-2-pentanoico é reduzido para ácido levulínico.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o ácido levulínico é reduzido a ácido 4-hidroxi pentanoico.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o ácido 4-hidroxi pentanoico é ciclizado em 4-valerolactona.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico é convertido por desidratação oxidativa para ácido 4-oxo-2-pentanoico.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o ácido 4-oxo-2-pentanoico é reduzido à ácido levulínico.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o ácido levulínico é reduzido a ácido 4-hidroxi pentanoico.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ácido 4-hidroxi pentanoico é ciclizado em 4-valerolactona.
16. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o acetilaldeído é preparado por descarboxilação de piruvato em um hospedeiro microbiano.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a adição aldólica é por uma aldolase de classe I ou classe II.
18. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ácido levulínico é convertido em 1,4 pentanodiol ou ácido difenólico, que pode ser opcionalmente polimerizado ou copolimerizado com outros blocos de construção de polímero.
19. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ácido levulínico é convertido em metiltetra-hidrofurano ou ácido δ- aminolevulínico, que pode opcionalmente ser incorporado em uma composição herbicida.
20. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ácido levulínico é adicionalmente polimerizado, opcionalmente como um copolímero com outros blocos de construção de polímeros.
21. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ácido levulínico é convertido em um cetal para ser usado como aditivo de combustível ou monômero/copolímero para a produção de plásticos e outros polímeros.
22. Método para produzir um material polimérico ou produto contendo polímero, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas do método, conforme definido na reivindicação 20.
23. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico é ciclizado a 2-hidroxi-4-valerolactona.
24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido 2,4-dihidroxi- pentanoico é convertido em 2,4-dihidroxi-pentanoil-CoA por meio de ligação de CoA.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o 2,4-dihidroxi-pentanoil-CoA é oxidado a 2-hidroxi-4-oxo-pentanoil-CoA.
26. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o ácido 2-hidroxi 4-oxo pentanoico é convertido em 2-hidroxi-4-oxo pentanoil-CoA por meio de ligação de CoA.
27. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ácido 4-oxo-2-pentenoico é reduzido a ácido 4-hidroxi-2-pentenóico.
28. Método, de acordo com a reivindicação 1, 5 caracterizado pelo fato de que o ácido 2,4-dihidroxi- pentanóico é convertido em angelicas lactonas.
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