DE69935296T2

DE69935296T2 - IP3 bindendes Polypeptid mit hoher Affinität

Info

Publication number: DE69935296T2
Application number: DE69935296T
Authority: DE
Inventors: Katsuhiko Mitaka-shi Mikoshiba; Teiichi Chiba-shi Furuichi; Fumio Yokohama-shi Yoshikawa; Tsuyoshi Shinagawa-ku Uchiyama
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1998-08-27
Filing date: 1999-08-27
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2019-08-28
Also published as: US7041440B2; EP0992587A2; ATE355372T1; DE69935296D1; US6465211B1; US20030096780A1; EP0992587A3; EP0992587B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein hoch affines Polypeptid mit einer Bindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat, ein Gen, das das Polypeptid codiert, einen rekombinanten Vektor, der das Gen umfasst, eine Transformante, die den Vektor einschließt, und ein Verfahren zur Herstellung des hoch affinen Polypeptids mit einer Bindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat.
STAND DER TECHNIK
Inositol-1,4,5-triphosphat (im Folgenden hier auch als "IP₃" bezeichnet) ist einer der Second Messenger, die durch den Inositol-Phospholipid-Metabolismus produziert werden, der als Reaktion auf extrazelluläre Stimuli, wie Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder dergleichen, aktiviert wird. IP₃ ist eine Substanz, die den Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration induziert. Der IP₃-induzierte Calciumanstieg ist ein essentieller und sehr universeller Signalübertragungsmechanismus, der an vielen Zellfunktionen bei einer breiten Vielzahl von Tieren beteiligt ist. Beispielsweise kontrolliert IP₃ viele physiologische Funktionen, wie Fertilisation, Blastogenese, Entwicklung und Differenzierung, Zellwachstum, Sekretion, Immunsystem, Muskelkontraktion und kraniale Nervenfunktionen (Geschmack, Sehen, Gedächtnis, Lernen, etc.), in verschiedenen Organismen, beispielsweise den Invertebraten, wie Nemathoden, Drosophila (Arthropoden) und Kopffüssler (Mollusken), und den Vertebraten, wie Maus und Mensch.
Auf molekularem Niveau wird dieser Mechanismus durch die Bindung zwischen einem IP₃ und seinem Ziel, einem IP₃-Rezeptor, ausgelöst. Insbesondere, wenn IP₃ an den IP₃-Rezeptor (ein gegenüber IP₃ empfindlicher Calciumkanal), der in einem intrazellulären Calciumspeicher (endoplasmatisches Retikulum etc.) vorhanden ist, bindet, öffnet sich der Kanal und setzt Calcium aus dem Calciumspeicher in das Zytoplasma frei, wodurch die Aktivität der Calciumabhängigen Proteine und Enzyme gesteuert wird.
Heparin, Adenophostin (eine Art von Pilzmetabolit) und Xestospongin (eine Art von Schwamm-Metabolit) sind Beispiele für Substanzen, die die Signalübertragung durch das IP₃-induzierte Calcium beeinflussen könnten. Obwohl Heparin die Bindung zwischen dem IP₃ und dem IP₃-Rezeptor hemmt, ist seine Spezifität jedoch gering, da es in der Zelle verschiedene Ziele gibt.
Adenophostin ist ein antagonistischer Agonist bei der Bindung zwischen dem IP₃ und dem IP₃-Rezeptor und ein sehr wirksamer Aktivator des IP₃-Rezeptorkanals. Seine Verwendung ist allerdings begrenzt, da seine Ausbeute aus Fungus gering ist und es nicht über die Membran transportieren kann. Xestospongin wurde unlängst als Inhibitor des IP₃-Rezeptorkanals beschrieben, welches die Bindung von IP₃ nicht beeinflusst. Wiederum ist seine Ausbeute gering, und es gibt immer noch Fragen hinsichtlich seiner Spezifität. Somit gibt es derzeit fast keine Substanz, von der die Meinung besteht, dass sie wirksam auf die IP₃-induzierte Calciumsignalübertragung wirkt. Insbesondere gibt es bisher keine Substanz oder kein System, welches die IP₃-induzierte Calciumsignalübertragung durch spezifisches Abfangen von IP₃ hemmt, welches auf Zellniveau zugenommen hat.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein hoch affines Polypeptid mit einer Bindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat, ein Gen, das das Polypeptid codiert, einen rekombinanten Vektor, der das Gen enthält, eine Transformante, die den Vektor enthält, und ein Verfahren zur Herstellung des hoch affinen Polypeptids mit einer Bindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat bereit.
Zur Lösung des oben beschriebenen Problems haben die vorliegenden Erfinder ausgiebige Untersuchungen vorgenommen und haben erfolgreich ein hoch affines Polypeptid mit einer extrem hohen Bindungsaktivität gegenüber IP₃ aus einem Protein, einschließlich eines Teils der N-terminalen Aminosäureregion eines IP₃-Rezeptors isoliert.
Die vorliegende Erfindung stellt aus Folgendem ein rekombinantes Polypeptid bereit:

(a) ein Polypeptid, bestehend aus GST und der Aminosäuresequenz von Position 224 bis 604 von SEQ ID NO:2; oder
(b) ein Polypeptid, bestehend aus GST und der Aminosäuresequenz von Position 224 bis 604 von SEQ ID NO:2, welches die Mutation R441Q umfasst.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Gen, das ein Polypeptid der obigen (a) oder (b) codiert, bereit.
Weiterhin beschreibt die vorliegende Anmeldung ein rekombinantes Polypeptid aus den folgenden (a), (b) oder (c):

(a) ein Polypeptid, das eine in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst;
(b) ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, mit Deletion, Substitution oder Addition von mindestens einer Aminosäure in der in SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenz und mit einer hohen Affinitätsbindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat; oder
(c) ein Polypeptid mit mindestens 70 % Homologie zu der in SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenz und mit einer hohen Affinitätsbindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat.

Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch ein Gen, das ein Polypeptid aus den obigen (a), (b) oder (c) codiert; oder ein Gen, das ein Polypeptid mit mindestens 70 % Homologie zu dem Gen codiert, und mit einer hohen Affinitätsbindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt weiterhin ein Gen, das DNA aus den folgenden (d) oder (e) umfasst:

(d) DNA einer in SEQ ID NO:1 gezeigten Nucleotidsequenz; oder
(e) DNA einer Nucleotidsequenz mit mindestens 70 % Homologie zu der DNA der in SEQ ID NO:1 gezeigten Nucleotidsequenz, und die ein Polypeptid mit einer hohen Affinitätsbindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat codiert.

Die vorliegende Anmeldung stellt einen rekombinanten Vektor bereit, der eines der oben beschriebenen Gene umfasst.
Die vorliegende Anmeldung stellt auch eine Transformante bereit, die den obigen rekombinanten Vektor umfasst.
Die vorliegende Anmeldung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines der oben erwähnten Polypeptide bereit, wobei das Verfahren umfasst: Kultivieren der oben erwähnten Transformante; und Gewinnen eines Polypeptids mit einer hohen Affinitätsbindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat aus der erhaltenen Kultur.
Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten beim Lesen und Verstehen der folgenden ausführlichen Beschreibung unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren klar.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Struktur von IP₃-Schwämmen;
die 2A-2C zeigen die hohe Expression und IP₃-Bindungsaktivität von T604;
die 3A-3C sind Graphen, die die IP₃-Bindungsaktivitäten der IP₃-Schwämme zeigen;
4 ist ein Graph, der eine Kurve der Hemmung der IP₃-Bindung in Abhängigkeit von der IP₃-Schwamm-Konzentration zeigt;
die 5A-5F sind Graphen, die die Auswirkungen von niedrig affinen G224-m30 und GST auf die IP₃-induzierte Ca²⁺-Freisetzung zeigen;
die 6A-6G sind Graphen, die die Auswirkung des hoch affinen IP₃-Schwamms G224 auf die Hemmung der IP₃-induzierten Ca²⁺-Freisetzung zeigen; und
7 ist ein Plot-Diagramm, das eine IP₃-induzierte Ca²⁺-Freisetzung in Abhängigkeit von der Konzentration des hoch affinen IP₃-Schwamms G224 zeigt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlicher beschrieben.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid bindet mit sehr hoher Affinität spezifisch an IP₃ und umfasst einen Teil (einen Abschnitt) der N-terminalen Aminosäureregion des natürlichen IP₃-Rezeptors (somit auch als Polypeptid-Abschnittstyp bezeichnet). Das erfindungsgemäße Polypeptid wird oft als hoch affines IP₃-bindendes Polypeptid bezeichnet.
1. Klonieren eines Gens, das den IP₃-Rezeptor codiert
Um ein erfindungsgemäßes hoch affines IP₃-bindendes Polypeptid zu erhalten, wird ein Gen, das das natürliche IP₃-Rezeptorprotein codiert, kloniert. Die Nucleotidsequenz des IP₃-Rezeptorgens ist bereits bekannt (Nucleic Acid Res. 17:5385-5386, 1989; Nature 342:32-38, 1989). Das Gen kann beispielsweise nach dem folgenden gentechnischen Verfahren hergestellt werden:
(i) Herstellung und Screening einer cDNA-Bibliothek, die den IP₃-Rezeptor codiert
Ein bekanntes Verfahren kann zur Herstellung von mRNA des IP₃-Rezeptors eingesetzt werden. Beispielsweise wird die Gesamt-RNA durch Behandeln eines Gewebes oder einer Zelle aus einem Mäusegehirn mit einem Guanidinreagenz, einem Phenolreagenz oder dergleichen erhalten. Dann wird poly(A)+RNA(mRNA) durch ein Affinitätssäulen-Verfahren oder ein Batch-Verfahren unter Verwendung von Poly-(U)-Sepharose etc. erhalten. Unter Verwendung der erhaltenen mRNA als Templat sowie von Oligo-dT-Primer und reverser Transcriptase wird eine einzelsträngige cDNA synthetisiert. Auf der Grundlage der einzelsträngigen cDNA wird eine doppelstängige cDNA synthetisiert und in einen geeigneten Klonierungsvektor eingebracht, um einen rekombinanten Vektor zur Transformation von E. coli oder dergleichen herzustellen. Die Transformante wird auf der Grundlage von Indizien, wie Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz, selektiert, wodurch eine cDNA-Bibliothek erhalten wird.
Die Transformation von E. coli kann nach dem Verfahren von Hanahan [Hanahan, D., Mol. Biol. 166:557-580 (1983)] durchgeführt werden. Insbesondere wird der rekombinante Vektor einer präparierten kompetenten Zelle in Gegenwart von Calciumchlorid, Magnesiumchlorid oder Rubidiumchlorid zugesetzt. Wird ein Plasmid als Vektor verwendet, sollte es ein Gen enthalten, das gegenüber Arzneimitteln, wie Tetracyclin und Ampicillin, resistent ist. Neben Plasmiden kann auch ein Klonierungsvektor, wie der λ-Phage, verwendet werden. Die so erhaltene Transformante wird auf Stämme mit der DNA von Interesse gescreent, beispielsweise durch "Expressionsklonieren" über Immunscreening unter Verwendung eines Antikörpers oder durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines aus einer bekannten Sequenz synthetisierten Primers.
Das so erhaltene DNA-Fragment oder DNA-amplifizierte Fragment, das das Antikörperepitop codiert, wird mit ³²P ³⁵S, Biotin oder dergleichen markiert, um als Sonde zur Hybridisierung mit der Transformanten-DNA verwendet zu werden, die denaturiert und auf ein Nitrocellulosefilter gebunden ist. Anschließend werden die erhaltenen positiven Stämme auf die Ziel-DNA-Fragmente gescreent.
(ii) Bestimmung der Nucleotidsequenz
Der erhaltene Klon wird nach seiner Nucleotidsequenz bestimmt. Die Nucleotidsequenz kann nach einem bekannten Verfahren, wie das Verfahren der chemischen Maxam-Gilbert-Modifikation, das Verfahren der Dideoxynucleotid-Kettentermination unter Verwendung des M13-Phagen, bestimmt werden. Im Allgemeinen wird die Sequenz unter Verwendung eines automatischen DNA-Sequenzierers (z. B. Perkin Elmer 373A-DNA-Sequenzierer) bestimmt.
Die Nucleotidsequenz des natürlichen (Volllängen) Gens, das den IP₃-Rezeptor codiert, und die Volllängen-Aminosäuresequenz des IP₃-Rezeptors sind in SEQ ID NOS. 3 bzw. 4 gezeigt.
2. Aufbau und Synthese eines Gens, das ein erfindungsgemäßes hoch affines IP₃-bindendes Polypeptid codiert.
(i) Aufbau und Synthese eines Gens, das ein hoch affines IP₃-bindendes Polypeptid codiert.
Ein erfindungsgemäßes hoch affines IP₃-bindendes Polypeptid umfasst einen Abschnitt der N-terminalen Aminosäureregion, d.h. die Aminosäuren 579 bis mindestens 800, vorzugsweise die Aminosäuren 579 bis mindestens 737, der Aminosäuresequenz des Volllängen-IP₃-Rezeptorproteins (SEQ ID NO:4). Erfindungsgemäß wird dieser Polypeptid-Abschnittstyp auch als IP₃-Schwamm (1) bezeichnet. Auf Grund dieses Abschnitts gewinnt das erfindungsgemäße Polypeptid (IP₃-Schwamm) ein sehr starkes spezifisches Bindungsvermögen gegenüber IP₃ (hohe IP₃-Affinitätsbindungsaktivität).
Hier wird der Begriff "hohe Affinität" in der Situation verwendet, wobei der IP₃-Schwamm eine IP₃-Affinität aufweist, die etwa 100- bis 1000-fach (vorzugsweise 500- bis 1000-fach) höher ist als diejenige des natürlichen IP₃-Rezeptors.
Erfindungsgemäß umfasst der IP₃-Schwamm auch mindestens die in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz, die den Aminosäuren 226 bis 578 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 entspricht. Hier wird diese Region als "Kern"-Region bezeichnet.
Auf der Grundlage der oben beschriebenen Tatsachen können die Länge des Fragmentes und die Länge der DNA, die das Fragment codiert, diskret bestimmt werden, mit der Maßgabe, dass die hohe IP₃-Affinitätsbindungsaktivität beibehalten wird. Das Fragment kann beispielsweise die Aminosäuren 224 bis 604 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 (codiert durch die Nucleotide 670 bis 1812 der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO:3); die Aminosäuren 1-604 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 (codiert durch die Nucleotide 1-1812 der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:3) oder die Aminosäuren 1-734 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4), codiert von den Nucleotiden 1-2200 der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:3), umfassen.
Diese Fragmente werden durch PCR unter Verwendung von Primem, die auf der Grundlage von Nucleotidregionen der Nucleotide, die in SEQ ID NO:3 gezeigt sind, außerhalb der Regionen der entsprechenden Fragmente, sowie der DNA, die den natürlichen IP₃-Rezeptor (SEQ ID NO:3, Nucleic Acid Res. 17:5385-5386, 1989; Nature 342: 32-38, 1989) codiert, als Templat erhalten.
(ii) Herstellung eines Gens, das einen erfindungsgemäßen IP₃-Schwamm des mutierten Typs codiert (mutiertes IP₃-Gen)
Erfindungsgemäß kann in die Aminosäuresequenz des IP₃-Schwammes zumindest teilweise eine Mutation eingebaut werden. Ein solcher IP₃-Schwamm des mutierten Typs wird ebenfalls als erfindungsgemäßer IP₃-Schwamm betrachtet. Eine Mutation wird in die Aminosäuresequenz eingebracht, indem die Nucleotidsequenz des Gens, das die Aminosäuresequenz des IP₃-Schwammes codiert, mutiert wird.
Die Mutation wird in das Gen durch ein bekanntes Verfahren eingebracht, wie Kunkel-Verfahren, "Gapped-Duplex-Methode" oder jedes gleichwertige Verfahren davon. Beispielsweise kann die ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt werden, wobei ein mutantes Oligonucleotid als Primer verwendet wird (Yoshikawa, F. et al., J. Biol. Chem. 271: 18277-18284, 1996). Alternativ kann eine Mutation unter Verwendung eines Mutagenese-Kits, wie Mutant-K (Takara), Mutant-G (Takara) und eine Reihe von LA-PCR in vitro Mutagenese-Kits (Takara), eingebracht werden.
Zuerst wird auf der Grundlage der Nucleotide des Gens, das den erfindungsgemäßen IP₃-Schwamm codiert (auch als "IP₃-Schwamm-Gen" bezeichnet), ein Primer so synthetisiert, dass der Primer ein mutiertes Nucleotid oder eine mutierte Stelle und etwa 10 Nucleotide einschließt, die das mutierte Nucleotid oder die mutierte Stelle flankieren. Unter Verwendung dieses Primers sowie des IP₃-Schwamm-Gens als Templat wird die PCR-Reaktion durchgeführt. Das Resultat wird gereinigt und anschließend mit einem geeigneten Restriktionsenzym behandelt, wodurch das IP₃-Schwamm-Gen von Interesse des mutierten Typs erhalten wird.
(iii) Bestimmung der Nucleotidsequenzen
Die Nucleotidsequenz der Gene, die durch (i) und (ii) erhalten wurde, wird bestimmt. Die Bestimmung wird durch ein bekanntes Verfahren durchgeführt, wie Verfahren der chemischen Modifikation nach Maxam-Gilbert, Verfahren der Dideoxynucleotid-Kettentermination unter Verwendung des M13-Phagen oder jedes andere Verfahren. Im Allgemeinen wird ein automatischer Sequenzierer (z. B. DNA-Sequenzierer 373A, hergestellt von Perkin-Elmer) verwendet.
Eine Nucleotidsequenz eines erfindungsgemäßen IP₃-Schwamm-Gens, eine Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen IP₃-Schwamms sind in SEQ ID NOS: 1 bzw. 2 gezeigt. Das Polypeptid dieser Aminosäuresequenz kann mindestens eine Deletion, Substitution, Addition oder dergleichen einschließen, solange es eine hohe Affinität gegenüber IP₃ aufweist und eine Aktivität der spezifischen Bindung an IP₃ besitzt.
Beispielsweise können mindestens eine, vorzugsweise etwa 1-10, stärker bevorzugt 1-5 der Aminosäuren in der Kernregion (die in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz) deletiert sein; mindestens eine, vorzugsweise etwa 1-10, stärker bevorzugt 1-5 Aminosäuren können an die Aminosäuresequenz der Kemregion addiert sein; oder mindestens eine, vorzugsweise 1-10, stärker bevorzugt 1-5 der Aminosäuren in der Kernregion können durch andere Aminosäuren ersetzt sein.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist nicht durch die Länge der Aminosäuresequenz eingeschränkt, solange die Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz der Kernregion und einen Abschnitt der N-terminalen Aminosäuren 579 bis mindestens 800, vorzugsweise der N-terminalen Aminosäuren 579 bis mindestens 734 des IP₃-Rezeptors vom natürlichen Typ (SEQ ID NO:4) enthält. Die Aminosäuren 224 bis 604 (Polypeptid "G224") der in SEQ ID NO:4 gezeigten Aminosäuresequenz und das Gen, das G224 codiert, werden als der erfindungsgemäße IP₃-Schwamm bzw. als das erfindungsgemäße IP₃-Schwamm-Gen betrachtet.
Das Polypeptid G224 kann eine Mutation von mindestens einer, vorzugsweise von etwa 1-10, stärker bevorzugt von 1-5 Aminosäuren aufweisen. Somit kann der erfindungsgemäße IP₃-Schwamm eine Aminosäuresequenz einschließen, wobei Lysin an Position 508 der Aminosäuresequenz G224 durch Alanin ersetzt ist (Mutation "m30") oder wobei Arginin an Position 441 der Aminosäuresequenz G244 durch Glutamin ersetzt ist (Mutation (m49") (1). Hier beziehen sich die Ziffern, die die Positionen der Aminosäuren angeben, auf die in SEQ ID NO:4 gezeigte Aminosäuresequenz (z. B. ist Position 1 die erste Aminosäure der SEQ ID NO:4).
Ebenfalls als erfindungsgemäß betrachtet wird ein Gen, das das Polypeptid mit der oben beschriebenen Mutation in seiner Aminosäuresequenz und mit einer hohen Bindungsaffinität gegenüber dem IP₃-Rezeptor codiert. Zusätzlich werden eine Nucleotidsequenz, die die Aminosäuren codiert, die in dem erfindungsgemäßen IP₃-Schwamm eingeschlossen sind, und ein degeneriertes Isomer, das das gleiche Polypeptid mit verschiedenen degenerierten Kodons codiert, ebenfalls als die erfindungsgemäßen Gene betrachtet.
Nach Bestimmen der Nucleotidsequenz des erfindungsgemäßen Gens kann das Gen durch PCR unter Verwendung eines Primers erhalten werden, der chemisch synthetisiert wird oder der aus der bestimmten Nucleotidsequenz synthetisiert wird.
3. Herstellung eines rekombinanten Vektors und einer Transformanten, die das erfindungsgemäße IP₃-Schwamm-Gen enthalten
(i) Herstellung des rekombinanten Vektors
Ein rekombinanter erfindungsgemäßer Vektor kann durch Ligation (Insertion) des erfindungsgemäßen IP₃-Schwamm-Gens an (in) einen geeigneten Vektor erhalten werden. Der Vektor zur Insertion des erfindungsgemäßen Gens ist nicht auf einen speziellen begrenzt, solange er in einer Wirtszelle replizierbar ist. Beispiele für einen solchen Vektor umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Plasmid-DNA und Phagen-DNA.
Die Plasmid-DNA ist beispielsweise ein Plasmid aus E. coli (z. B. pET-3a, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), ein Plasmid aus Bacillus (z. B. pUB110, pTP5, etc.) oder ein Plasmid aus Hefe (z. B. YEp13, YEp24, YCp50, etc.). Die Phagen-DNA ist beispielsweise der λ-Phage. Gleichermaßen kann auch ein tierischer Virusvektor, wie ein Retrovirus-, Adenovirus- oder Vacciniavirus-Vektor oder ein Insektenvirus-Vektor, wie Baculovirus-Vektor, verwendet werden. Ein Fusionsplasmid, in dem GST, GFP, His-tag, Myc-tag oder dergleichen miteinander verknüpft sind, können ebenfalls verwendet werden (z. B. pGEX-2T, pEGFP-N3).
Zur Insertion des erfindungsgemäßen Gens in den Vektor wird zunächst die gereinigte DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten. Anschließend wird das gespaltene Fragment in eine Restriktionsstelle oder eine Multiklonierungsstelle der geeigneten Vektor-DNA inseriert.
Das erfindungsgemäße Gen sollte in den Vektor so integriert werden, dass das Gen funktionieren kann. Falls gewünscht, kann der erfindungsgemäße Vektor außer dem erfindungsgemäßen Gen und dem Promotor beispielsweise ein cis-Element (z. B. ein Enhancer), ein Splice-Signal, ein Poly(A)-Schwanz-Signal, einen selektiven Marker und eine Ribosomen-bindende Sequenz (SD-Sequenz) einschließen. Beispiele für den selektiven Marker umfassen ein Dihydrofolat-Reduktasegen, ein Ampicillin-Resistenzgen und ein Neomycin-Resistenzgen.
(ii) Herstellung der Transformante
Eine erfindungsgemäße Transformante kann erhalten werden, indem der erfindungsgemäße rekombinante Vektor in eine Wirtszelle auf eine solche Weise eingebracht wird, dass das Gen von Interesse zur Expression in der Lage ist. Die Wirtszelle ist nicht beschränkt auf eine spezielle Zelle, solange sie das erfindungsgemäße Gen exprimieren kann. Bakterien, wie die Gattung Escherichia (z. B. Escherichia coli), die Gattung Bacillus (z. B. Bacillus subtilis), die Gattung Pseudomonas (z. B. Pseudomonas putida), Hefe wie Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe, tierische Zellen (z. B. COS-, CHO-, HEK293-, PC12-Zellen) und Insektenzellen (z. B. Sf9 und Sf21) werden als Beispiele genannt.
Wenn ein Bakterium, wie E. coli, als Wirt verwendet wird, ist es bevorzugt, dass der erfindungsgemäße rekombinante Vektor zur autonomen Replikation in dem Wirt in der Lage ist und dass er einen Promotor, eine Ribosomen-bindende Sequenz, das erfindungsgemäße Gen und eine Transcriptions-Terminationssequenz umfasst. Der rekombinante Vektor kann auch ein Gen zur Kontrolle des Promotors einschließen.
Als E. coli werden E. coli BL21, JM109 und HB101 als Beispiel angeführt, und als Bacillus werden Bacillus subtilis MI 114 und 207-21 als Beispiel angeführt.
Jeder Promotor kann verwendet werden, solange er in einer Wirtszelle, wie E. coli, exprimiert werden kann. Beispielsweise kann ein Promotor, der aus E. coli oder einem Phage stammt, z. B. der trp-Promotor, lac-Promotor, p_L-Promotor oder p_R-Promotor, verwendet werden. Ein künstlich konstruierter und modifizierter Promotor, wie der tac-Promotor, kann ebenfalls verwendet werden.
Der rekombinante Vektor kann in das Wirtsbakterium durch jedes Verfahren zum Einbringen von DNA in ein Bakterium eingebracht werden. Beispielsweise können das Calcium-lonen-Verfahren (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69:2110-2114 (1972)) und ein Elektroporationsverfahren verwendet werden.
Auch eine Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe oder Pichia pastoris, kann als Wirt verwendet werden. In diesem Fall kann der Promotor jeder Promotor sein, der in der Hefe exprimiert werden kann. Beispiele für einen solchen Promotor umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, den gal1-Promotor, gal10-Promotor, den Hitzeschock-Protein-Promotor, den MF 1-Promotor, den PH05-Promotor, den PGK-Promotor, den GAP-Promotor, den ADH-Promotor und den AOX1-Promotor.
Der rekombinante Vektor kann in die Hefe durch jedes Verfahren zum Einbringen von DNA in Hefe eingebracht werden. Beispielsweise können das Elektroporationsverfahren (Becker, D.M. et al., Methods Enzymol., 194, 182-187 (1990)), Spheroplast-Verfahren (Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929-1933 (1978)), oder das Lithium-Acetat-Verfahren (Itoh, H., J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)) verwendet werden.
Eine tierische Zelle, wie eine Affenzelle (z. B. COS-7, Vera), eine chinesische Hamster-Eierstockzelle (CHO-Zelle), eine Maus-L-Zelle, eine Rattenzelle (z. B. GH3, PC12 oder NG108-15), oder eine menschliche Zelle (z. B. FL, HEK293, HeLa oder Jurkat) können ebenfalls als Wirt verwendet werden. Als Promotor können beispielsweise der SR-Promotor, der SV40-Promotor, der LTR-Promotor, oder der β-Actin-Promotor verwendet werden. Abgesehen von diesen Promotoren kann auch ein früher Gen-Promotor des menschlichen Cytomegalovirus verwendet werden.
Der rekombinante Vektor kann beispielsweise durch ein Elektroporationsverfahren, ein Calcium-Phosphat-Verfahren oder ein Lipofectin-Verfahren in die tierische Wirtszelle eingebracht werden.
Auch eine Insektenzelle, wie eine Sf9-Zelle, Sf21-Zelle oder dergleichen, kann als Wirt verwendet werden. Der rekombinante Vektor kann in die Insektenzelle beispielsweise durch ein Calcium-Phosphat-Verfahren, ein Lipofectin-Verfahren oder ein Elektroporationsverfahren eingebracht werden.
4. Herstellung des IP₃-Schwamms
Der erfindungsgemäße IP₃-Schwamm kann durch Kultivieren der oben beschriebenen Transformante und Gewinnen des IP₃-Schwamms aus dem Kulturprodukt erhalten werden. Der Begriff "Kultur", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Kulturüberstand, eine Kulturzelle oder eine mikrobielle Zelle oder mikrobielle Zelltrümmer.
Die erfindungsgemäße Transformante wird nach einem allgemeinen Verfahren, das zum Kultivieren des Wirts eingesetzt wird, kultiviert.
Ein Medium zum Kultivieren der Transformante, die aus einem Mikroorganismus-Wirt erhalten wurde, wie E. coli oder Hefe, kann entweder ein natürliches oder ein synthetisches Medium sein, mit der Maßgabe, dass es Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und dergleichen, die durch den Mikroorganismus assimilierbar sind, enthält, und mit der Maßgabe, dass es die Transformante wirksam kultivieren kann.
Als Kohlenstoffquellen können Kohlehydrat, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Stärke, organische Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure; und Alkohole, wie Ethanol und Propanol, verwendet werden.
Als Stickstoffquellen können Ammoniak, Ammoniumsalze von anorganischen oder organischen Säuren, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat, und Ammoniumphosphat; weitere Stickstoff-enthaltende Verbindungen, Peptone, Fleischextrakt, Maisquellwasser und dergleichen verwendet werden.
Als anorganische Substanzen können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumcarbonat und dergleichen verwendet werden.
Die Kultivierung wird im Allgemeinen unter aeroben Bedingungen, wie Schüttel- oder Belüftungs-Rühr-Bedingungen bei 37 °C für 6-24 h durchgeführt werden. Während des Kultivierens wird der pH bei 7,0 bis 7,5 gehalten. Der pH wird mit einer anorganischen oder organischen Säure, einer alkalischen Lösung oder dergleichen reguliert. Falls notwendig, kann dem Medium während des Kultivierens ein Antibiotikum, wie Ampicillin, Tetracyclin oder dergleichen, zugesetzt werden.
Beim Kultivieren eines Mikroorganismus, der mit einem Expressionsvektor unter Verwendung eines induzierbaren Promotors transformiert wurde, kann dem Medium bei Bedarf ein Inducer zugesetzt werden. Beispielsweise kann dem Medium Isopropyl-1-thio-β-D-Galactosid (IPTG) zugesetzt werden, wenn ein Mikroorganismus, der mit einem Expressionsvektor pET-3a mit einem T7-Promotor (der mit IPTG induzierbar ist) transformiert wurde, kultiviert wird. Wenn ein Mikroorganismus kultiviert wird, der mit einem Expressionsvektor unter Verwendung des trp-Promotors (der mit Indolessigsäure (IAA) induzierbar ist) transformiert wurde, kann dem Medium IAA zugesetzt werden.
Eine mit einer tierischen Wirtszelle erhaltene Transformante kann in einem allgemein verwendeten Medium kultiviert werden, wie RPMI1640-Medium oder DMEM-Medium oder ein Medium, das durch Anreicherung des allgemein verwendeten Mediums mit fetalem Rinderserum und dergleichen erhalten wird.
Die Kultivierung wird im Allgemeinen unter 5 % CO₂ 1-30 Tage bei 37 °C durchgeführt. Falls notwendig, kann dem Medium während des Kultivierens ein Antibiotikum, wie Kanamycin, Penicillin oder dergleichen, zugesetzt werden.
Nach dem Kultivieren, im Falle, wobei eine mikrobielle Zelle oder eine Zelle, die intrazellulär den erfindungsgemäßen IP₃-Schwamm produziert, wird der IP₃-Schwamm durch Aufbrechen der mikrobiellen Zelle oder der Zelle durch Ultrabeschallung, durch das Gefrier-Tau-Verfahren oder durch Homogenisieren gesammelt. Im Falle einer mikrobiellen Zelle oder einer Zelle, die den erfindungsgemäßen IP₃-Schwamm extrazellulär produziert, wird die mikrobielle Zelle oder die Zelle aus der Kultur durch Zentrifugation oder dergleichen davor entfernt, oder die Kulturlösung wird direkt dem Isolier/Reinigungs-Verfahren unterzogen. Der erfindungsgemäße IP₃-Schwamm wird isoliert und aus der Kultur durch ein allgemeines biochemisches Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines Proteins, wie Ammoniumsulfatfällung, Gelchromatographie, Ionen-Austauscherchromatographie, Affinitätschromatographie, oder eine Kombination davon, isoliert und gereinigt.
5. Therapeutisches Mittel und Mittel zur Gentherapie
Da das erfindungsgemäße Protein und Gen IP₃-neutralisierende Aktivität aufweisen, sind sie als Antagonisten für IP₃-induziertes Calcium geeignet, ein therapeutisches Mittel und ein Mittel zur Gentherapie für mit Calciumproduktion einhergehende Erkrankungen. Das erfindungsgemäße therapeutische Mittel oder Mittel zur Gentherapie kann oral oder parenteral und systemisch oder lokal verabreicht werden.
Wird das erfindungsgemäße Protein oder Gen als ein therapeutisches Mittel oder ein Mittel zur Gentherapie für eine mit Calciumproduktion einhergehende Erkrankung verwendet, ist die zu behandelnde Erkrankung nicht besonders eingeschränkt. Beispielsweise kann das Protein oder das Gen für Erkrankungen im Nervensystem, im Blutgefäßsystem, im Atemsystem, im Verdauungssystem, im lymphatischen System, im Urinsystem, im Reproduktionssystem oder dergleichen für den speziellen Zweck der Behandlung oder Prävention eingesetzt werden. Diese Erkrankungen können in Form einer einzigen Erkrankung vorliegen oder können durch eine dieser Erkrankungen oder durch eine Erkrankung, anders als diejenigen, die oben erwähnt sind, verschlimmert werden; jede von solchen Formen kann mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Gen behandelt werden.
Wird das erfindungsgemäße therapeutische Mittel oral verabreicht, kann das Mittel zu einer Tablette, Kapsel, einem Granulatkorn, einem Pulver, einer Pille, einer Lutschpastille, einem internen flüssigen Mittel, zu einer Suspension, Emulsion, zu einem Sirup oder dergleichen formuliert werden. Alternativ kann das therapeutische Mittel als Trockenprodukt hergestellt werden, das unmittelbar vor Gebrauch wieder aufgelöst wird. Wenn das erfindungsgemäße therapeutische Mittel parenteral verabreicht wird, kann das Mittel zu einer intravenösen Injektion (einschließlich Tropfen), intramuskulären Injektion, intraperitonealen Injektion, subkutanen Injektion, zu Suppositorien oder dergleichen formuliert werden. Injektionen werden in Form von Einzeldosis-Ampullen oder Mehrdosis-Behältern geliefert.
Diese Formulierungen können durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung entsprechender Exzipienten, Füllstoffe, Bindemittel, Netzmittel, Sprengmittel, Gleitmittel, Tenside, Dispergiermittel, Puffer, Konservierungsstoffe, Auflösungshilfen, Antiseptika, Aroma/Duftstoffe, Analgetika, Stabilisatoren, Isotonizitäts-induzierender Mittel etc., die herkömmlicherweise in pharmazeutischen Präparaten verwendet werden, hergestellt werden.
Die oben beschriebenen Formulierungen können jeweils pharmazeutisch verträgliche Träger oder Hilfsstoffe enthalten. Spezielle Beispiele für solche Träger oder Hilfsstoffe umfassen Wasser, pharmazeutisch verträgliche organische Lösungsmittel, Collagen, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Carboxyvinylpolymere, Natriumalginat, wasserlösliches Dextran, Natriumcarboxymethylamylose, Pectin, Xanthangummi, Gummi arabicum, Casein, Gelatine, Agar, Glycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol, Vaseline, Paraffin, Stearinalkohol, Stearinsäure, Humanserumalbumin, Mannitol, Sorbitol, und Lactose. Eines oder eine Vielzahl von diesen Hilfsstoffen werden, in Abhängigkeit von der Form des Präparats, ausgewählt oder entsprechend kombiniert.
Die Dosierungsniveaus des erfindungsgemäßen therapeutischen Mittels variieren in Abhängigkeit des Alters des Individuums, des Verabreichungsweges und der Anzahl der Verabreichung und können in einem breiten Bereich variiert werden. Wenn eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteins in Kombination mit einem entsprechenden Verdünnungsmittel und einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht wird, kann die wirksame Menge des Proteins im Bereich von 0,0001 bis 1000 mg pro kg pro Verabreichung liegen. Das therapeutische Mittel wird einmal am Tag oder in mehreren Dosen pro Tag für mindestens einen Tag verabreicht.
Wird das erfindungsgemäße Gen als Mittel zur Gentherapie für Erkrankungen für mit einer Calciumproduktion einhergehende Erkrankungen verwendet, kann das erfindungsgemäße Gen direkt durch Injektion verabreicht werden. Alternativ kann ein Vektor, der das erfindungsgemäße Gen einschließt, verabreicht werden. Spezielle Beispiele für einen für diesen Zweck geeigneten Vektor umfassen einen Adenovirusvektor, einen Adeno-assoziierten Virusvektor, einen Herpesvirusvektor, einen Vacciniavirusvektor und einen Retrovirusvektor. Das erfindungsgemäße Gen kann unter Verwendung eines solchen Virusvektors wirksam verabreicht werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Gen in Phospholipidvesikeln, wie Liposome, eingeschlossen sein, und die resultierenden Liposome können dem Individuum verabreicht werden. Kurz gesagt wird, da Liposome biologisch abbaubares Material enthaltende, geschlossene Bläschen sind, das erfindungsgemäße Gen durch Mischen des Gens mit den Liposomen (ein Liposomen-Gen-Komplex) in der inneren wässrigen Schicht und der Lipiddoppelschicht der Liposomen zurück gehalten. Wenn dieser Komplex folglich mit Zellen kultiviert wird, wird das Gen in dem Komplex in die Zellen aufgenommen (Lipofektion). Anschließend können die resultierenden Zellen durch die nachstehend beschriebenen Verfahren verabreicht werden.
Als ein Verfahren zur Verabreichung des Mittels zur erfindungsgemäßen Gentherapie kann die lokale Verabreichung an Gewebe des Zentralnervensystems (Gehirn, Rückenmark), an das Blutgefäßsystem (Arterie, Vene, Herz), an das Atemsystem (Trachea, Lunge), an das Verdauungssystem (Speicheldrüsen, Magen, Darm, Leber, Pankreas), an das lymphatische System (Lymphknoten, Milz, Thymus), an das Urinsystem (Nieren), an das Reproduktionssystem (Hoden, Eierstock, Uterus), oder dergleichen, zusätzlich zur herkömmlichen systemischen Verabreichung, wie intravenöse oder intraarterielle Verabreichung, durchgeführt werden. Weiterhin kann auch ein Verabreichungsverfahren in Kombination mit Kathetertechniken und chirurgischen Operationen eingesetzt werden.
Die Dosierungsniveaus des Mittels zur erfindungsgemäßen Gentherapie variieren in Abhängigkeit des Alters, Geschlechts und der Zustände des Individuums, des Verabreichungsweges, der Anzahl der Verabreichungen und des Typs der Formulierung. In der Regel ist eine Verabreichung des erfindungsgemäßen Gens in einer Menge von 0,01-100 mg/erwachsener Körper/Tag angemessen.
BEISPIELE
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung an Hand von Beispielen, die den technischen Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken, ausführlich beschrieben.
Beispiel 1: Konstruktion eines Expressionsolasmids für ein hoch affines IP₃-bindendes Polvoeptid (IP₃-Schwamm)
Die N-terminalen Aminosäuren (734 Aminosäuren)(Polypeptid T734) eines Maus-Typ-1-IP₃-Rezeptors (mIP₃R1) besitzen eine spezifische IP₃-Bindungsaktivität. Der cDNA-Teil, der das Polypeptid T734 codiert, wurde in den E. coli-Expressionsvektor pET-3a (dessen Expression durch den T7-Promotor kontrolliert wird, der bei Addition von IPTG induziert wird) kloniert, um das Plasmid pET-T734 zu erhalten (Yoshikawa F. et al., J. Biol. Chem. 271:18277-18284, 1996). Unter Verwendung dieses Plasmids (pET-T734) als Elternplasmid wurden die folgenden Expressionsplasmide für IP₃-bindende Polypeptide konstruiert. Hier wird ein IP₃-bindendes Polypeptid mit hoher Affinität auch als ein "IP₃-Schwamm" bezeichnet.
(1-1) Expressionsplasmid für den hoch affinen IP₃-Schwamm "T604"
Ein Gen, das das Plasmid T604 codiert, welches dem ersten Methionin (M-1) bis zu dem Lysin an Position 604 (K-604) von Polypeptid T734 entspricht, wurde hergestellt. Insbesondere wurde die ortsgerichtete Mutagenese durch PCR unter Verwendung eines komplementären Oligonucleotids durchgeführt (Yoshikawa F. et al., J. Biol. Chem, 271:18277-18284, 1996), um ein Stopp-Kodon (TAA) und eine anschließende BamHI-Erkennungsstelle (GGATCC) an Position 605 von T734 einzuführen.
Der Sense-Primer wurde mit einer Ndel-Erkennungsschnittsequenz (CATATG) (unterstrichen) einschließlich des ersten Methionin-Kodons (ATG) eingebracht.
Insgesamt wurden 100 μl PCR-Reaktionslösung verwendet. Die PCR-Reaktionslösung enthielt 100 ng Templat-DNA, 10 mM KCl, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl (pH 8,2), 2 mM MgCl₂, 0,1 % TritonX-100, 10 μg/ml BSA, 200 μM dNTPs, 1 μM Sense-Primer, 1 μM Anti-Sense-Primer und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase. Die PCR-Reaktion wurde 1 min bei 95 °C und dann über 30 Zyklen von 1 min bei 95 °C, 3 min bei 57 °C und 3 min bei 72 °C durchgeführt.
Das 5'-Ende des erhaltenen amplifizierten Fragments wurde mit NdeI und das 3'-Ende mit BamHI behandelt, wodurch die Deletionsmutante pET-T604 erzeugt wurde, die DNA enthält, die eine Aminosäuresequenz codiert, die der Aminosäuresequenz von T734 entspricht, allerdings mit C-terminaler Deletion bis zu Position 605.
(1-2) Expressionsplasmid für den hoch affinen IP₃-Schwamm "G224"
Zuerst wurde ein Gen, das das Polypeptid T604 codiert, welches den ersten Methionin (M-1) bis zu dem Lysin in Position 604 (K-604) von Polypeptid T734 entspricht, hergestellt. Insbesondere wurde die ortsgerichtete Mutagenese durch PCR unter Verwendung eines komplementären Oligonucleotids durchgeführt (Yoshikawa F. et al., J. Biol. Chem., 271:18277-18284, 1996), um ein Stopp-Kodon (TAA) und eine anschließende EcoRI-Erkennungsstelle (GAATCC) an Position 605 von T734 einzubringen.
Die PCR wurde unter den gleichen Bedingungen wie in (1-1) vorstehend beschrieben, durchgeführt.
Das 5'-Ende des so erhaltenen amplifizierten Fragments wurde mit Ndel und das 3'-Ende mit EcoRI behandelt, wodurch die Deletionsmutante pET-T604e erzeugt wurde, die DNA enthält, die eine Aminosäuresequenz codiert, die der Aminosäuresequenz von T734 entspricht, allerdings mit C-terminaler Deletion bis zu Position 605.
Anschließend wurde unter Verwendung der Deletionsmutante pET-T604e als ein Templat eine ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt, um eine BamHI-Erkennungsstelle (GGATCC) unmittelbar vor dem Methionin an Position 224 des Polypeptids T604 einzuführen.
Die PCR wurde unter den gleichen Bedingungen wie in (1-1) vorstehend durchgeführt.
Das so erhaltene amplifizierte Fragment (Plasmid mit eingebrachter Mutation) wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten, wodurch ein cDNA-Fragment erhalten wurde, das die Aminosäuren 224 bis 604 codiert. Dieses cDNA-Fragment wurde an die BamHI-EcoRI-Schnittstelle des GST-Fusionsplasmids (pGEX-2T) ohne eine Rasterveschiebung (im Raster) ligiert, wodurch Plasmid pGEX-G224 erhalten wurde. Plasmid pGEX-G224 exprimiert das Fusionspolypeptid G224 (1), das das Polypeptid GST und im Anschluss Polypetid M-224 bis K-604 einschließt.
(1-3) Expressionsplasmid für das nieder affine IP₃-bindende Polypeptid
Eine ortsgerichtete Mutagenese wurde durch sequentielle PCR unter Verwendung von pGEX-G224 als Templat durchgeführt.
Die folgenden fehlgepaarten Oligonucleotide wurden synthetisiert, um eine Mutation (K508A) an Position 508 von T604 einzubringen, wo Lysin durch Alanin (K-508) ersetzt wurde:
5'-GAGAGCGGCAGGCACTGATGAGGG-3' (SEQ ID NO: 9)
5'-CCCTCATCAGTGCCTGCCGCTCTC-3' (SEQ ID NO: 10)
Unter Verwendung der obigen Primer wurde die ortsgerichtete Mutagenese durch sequentielle PCR durchgeführt. Die PCR-Bedingungen und die Zusammensetzung der Reaktionslösung waren wie folgt: Primärreaktion 1
Die PCR wurde unter den gleichen Bedingungen wie in (1-1) vorstehend beschrieben durchgeführt. Primärreaktion 2
Die PCR wurde unter den gleichen Bedingungen wie in (1-1) vorstehend beschrieben durchgeführt.
Sekundärreaktion
10 μl des PCR-Reaktionsprodukts, das bei den Primärreaktionen 1 und 2 entstand, und 1 μM von jedem der Primer (SEQ ID NOS:7 und 8) wurden zur Durchführung der PCR unter den gleichen Bedingungen wie die Primärreaktionen durchgeführt.
Das erhaltene amplifizierte Fragment wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten. Das geschnittene Fragment wurde an die BamHI-EcoRI-Schnittstelle des GST-Fusionsplasmids pGEX-2T ohne eine Rasterverschiebung (im Raster) ligiert, wodurch Plasmid pGEX-G224-m30 erhalten wurde. Dieses mutierte Plasmid exprimiert Polypeptid G224-m30 mit der Punktmutation K508A (1, m30).
(1-4) Expressionsplasmid für den hoch affinen IP₃-Schwamm "G224-m49"
Unter Verwendung von pGEX-G224 als ein Templat wurde eine ortsgerichtete Mutagenese durch sequenzielle PCR durchgeführt.
Die folgenden 2 fehlgepaarten Oligonucleotide wurden synthetisiert, um eine Mutation (R441 Q) an Position 441 von T604 einzubringen, wo Glutamin für Alginin (R-441) ersetzt wurde:
5'-GCTGAGGTTCAAGACCTGGACTTTG-3' (SEQ ID NO: 11)
5'-AAAGTCCAGGTCTTGAACCTCAGC-3' (SEQ ID NO: 12) Primärreaktion 1
Die PCR wurde unter den gleichen Bedingungen wie in (1-3) vorstehend beschrieben durchgeführt. Primärreaktion 2
Die PCR wurde unter den gleichen Bedingungen wie in (1-3) vorstehend beschrieben durchgeführt.
Sekundärreaktion
10 μl des PCR-Reaktionsprodukts, das bei den Primärreaktionen 1 und 2 entstand, und jeweils 1 μl der Primer (SEQ ID NOS: 6 und 8) wurden zur Durchführung der PCR unter den gleichen Bedingungen wie diejenigen der Primärreaktionen verwendet.
Das erhaltene amplifizierte Fragment wurde an einer BamHI-EcoRI-Schnittstelle geschnitten. Das geschnittene Fragment wurde an die BamHI-EcoRI-Schnittstelle des GST-Fusionsplasmids pGEX-2T ohne eine Rasterverschiebung (im Raster) ligiert, wodurch Plasmid pGEX-G224-m49 erhalten wurde. Dieses mutierte Plasmid exprimiert Polypeptid G224-m49 mit der Punktmutation R441Q (1, m49).
Beispiel 2: Expression und Herstellung des hoch affinen IP₃-bindenden Polypeptids mit E. coli
Da der IP₃-bindende Kern meistens zu unlöslichen Einschlusskörpern führt, ist die Expressionsmenge gering. Somit haben die vorliegenden Erfinder die IP₃-bindende Region gentechnisch modifiziert, um ein hoch affines IP₃-bindendes Polypeptid zu erzeugen, das ein kleineres Molekül ist, das zur stabilen Massenexpression in der Lage ist, welche als ein lösliches Protein gewonnen werden kann, welches eine höhere Affinität besitzt und welches eine höhere Spezifität als ein konventioneller IP₃-Rezeptor besitzt.
Durch Niedertemperatur-Kultivierung (16-22 °C) kann das Polypeptid T734 in Masse stabil unter Gewinnung einer relativ hohen löslichen Fraktion (Kd = 50 ± 2,4 nM, B_max = 46 pmol/mg Protein, 1,85 mg/l E. coli-Kultur (entsprechend etwa 0,5 g nasser E. coli)) exprimiert werden. Allerdings machen die Einschlusskörper mehr als das 10-Fache der Menge der löslichen Fraktion aus (Yoshikawa F. et al., J. Biol. Chem. 271:18277-18284, 1996).
Zunächst wurden kleinere Peptide, die die oben beschriebenen Merkmale besaßen, hergestellt.
Die Expressionsplasmide vom pET- und pGEX-Typ, die in Beispiel 1 erhalten wurden, wurden in E. coli BL21 (DE3) bzw. JM109 durch ein Transformationsverfahren eingebracht. Die Expressionsinduktion mit IPTG und Herstellung von Expressionsproteinen aus E. coli wurde hauptsächlich durch Modifizieren des Verfahrens von Yoshikawa et al. (Yoshikawa F. et al., J. Biol. Chem. 271:18277-18284, 1996) durchgeführt.
Insbesondere wurde E. coli, in das entsprechende Plasmide eingebaut wurden, in L-Nährlösungen (enthaltend 100 μg/ml Ampicillin) bei 22 °C schüttelkultiviert. Wenn die Absorption OD₆₀₀ zu etwa 1,5 wurde, wurde IPTG bis auf 0,5 mM zugesetzt. Nach einigen Stunden in Schüttelkultur bei 16 °C wurde E. coli jeweils durch Zentrifugation gewonnen und in PBS, enthaltend Proteaseinhibitoren (1 mM PMSF, 10 μM Leupeptin, 1 μM Pepstatin A, 2 μg/ml Aprotinin), suspendiert. E. coli wurde jeweils durch Ultrabeschallung aufgebrochen. Anschließend wurde jeder Überstand, der das Expressionspolypeptid (lösliche Fraktion) enthielt, durch Ultrazentrifugation (Beckman Ti35 Rotor, 25.000 U/min, 1 h, 4 °C) gesammelt.
Die GST-Fusionspolypeptide wurden aus den löslichen Fraktionen durch Affinitätsreinigung unter Verwendung einer Glutathion-Sepharose-Säule (Pharmacia LKB) gereinigt. Insbesondere wurde jedes der GST-Fusionspolypeptide mit 10 mM Glutathion/50 mM Tris-HCl (pH 8,0) von der Säule eluiert, indem hauptsächlich das vom Hersteller bereitgestellte Handbuch befolgt wurde. Die Polypeptidlösungen wurden mit 10 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 88 mM NaCl und 1 mM KCl unter Verwendung einer Entsalzungssäule PD10 (Pharmacia LKB) äquilibriert und anschließend abgegeben, wodurch die IP₃-Schwämme erhalten wurden (1: G224, m30, m49 und GST). Die IP₃-Schwämme wurden bei –80 °C gelagert, bis sie verwendet wurden.
Eine Serie von Deletionsmutanten auf der Grundlage von Polypeptid T734 wurde durch serielles Verkürzen der Länge des Polypeptids T734 vom C-Terminus hergestellt. Die Auswertung der Deletionsmutanten zeigte an, dass T705 und T699 keinen ausgeprägten Merkmalsunterschied zu T734 aufwiesen. In den Fällen der Polypeptide T569, T572 und T576 waren die Expressionsmengen der löslichen Proteine geringer als für T734. Die stabile Massenexpression von löslichem Protein war mit Polypeptid T604 erfolgreich, welches durch Deletion des C-Terminus von T734 bis zu Aminosäure 605 (1) erhalten wurde.
Unter Bezugnahme auf 1 ist das Oberste (IP₃R1) die N-terminale Aminosäure des IP₃-Rezeptors, einschließlich der IP₃-bindenden Kernregion (Kern: Aminosäuren 226-578). T604 (Aminosäuren 1-604), G224 (GST + Aminosäuren 224-604), G224m30 (G224, in das eine K580A-Mutation eingebracht wurde), G224m49 (G224, in das eine R441Q-Mutation eingebracht wurde) und GST (stammt von pGEX-2T)) sind ebenfalls in 1 gezeigt.
T 604 besitzt eine [³H]IP₃-Bindungsaktivität, die im Wesentlichen derjenigen von T734 entspricht (Kd = 45 nM), und eine höhere Ausbeute an löslichem Protein (B_max = 690 pmol/mg Protein). Insbesondere betrug die Ausbeute 19 mg/l E. coli-Kultur (2B und 2C, Tabelle 1). Tabelle 1 Expression von IP₃-bindender Stelle in E. coli

a. Maeda et al., EMBO J. 9, 51-67, 1990
b. Yoshikawa et al., J. Biol. Chem., 271, 18277-18284, 1996
c. Die Werte in Klammern stellen Kd dar, erhalten aus rohen Zell-Lysaten
ND. nicht bestimmt

Die gesamte Expressionsmenge von Polypeptid T604 entsprach im Wesentlichen derjenigen von Polypeptid T734, allerdings wies T604 eine deutlich verbesserte lösliche Proteinausbeute auf. Die Ausbeute von löslichem Protein von Polypeptid T604 war im Wesentlichen bei 30 und 37 °C gleich und erreichte innerhalb von 2 h nach dem Start der Expressionsinduktion das Maximum.
2a zeigt das Ergebnis der Western-Blot-Analyse des Proteins (0,1 μg), erhalten aus einer E. coli-Extraktlösung (lösliche Fraktion), die das Polypeptid T604 (66 kDa) exprimiert. Als Kontrolle wurde eine Zellextraktlösung, erhalten durch Transformieren eines Vektors, der kein T604 (pET-3a) enthält, verwendet. 2B zeigt einen Vergleich der Gesamtmengen der spezifischen IP₃-Bindung für T734, T604 und den Kontrollvektor, die in 0,7 μl löslichen Fraktionen enthalten waren. 2C zeigt das Ergebnis der Schatchard-Blot-Analyse, wobei die Bindung von 3 μg T604-löslicher Fraktion mit 9,6 nM [³H]IP₃ mit nicht markiertem IP₃ (kaltes IP₃) bei verschiedenen Konzentrationen kompetitiv gehemmt wurde. Die Ergebnisse waren Kd = 45 ± 7,6, B_max = 690 ± 64 pmol/mg Protein.
Wenn T734 seriell aus dem N-Terminus deletiert war, verursachte eine sehr kurze N-terminale Deletion von T734 (z. B. eine Deletion von 31 Aminosäuren) einen Mangel an IP₃-Bindungsaktivität, auch wenn die Deletion außerhalb der Kernregion lag. Allerdings erreichte das Polypeptid wieder die IP₃-Bindungsaktivität, wenn der N-Terminus bis zur Aminosäure 220-225 nahe des N-Terminus der Kernregion deletiert war (Yoshikawa et al., 1996). Die Theorie hierzu ist unbekannt, allerdings ist vermutlich die Bildung der dreidimensionalen Struktur der aktiven Kernregion in Abhängigkeit von dem Deletionsgrad irgendwie unterbrochen. Obwohl das aktive Polypeptid mit der N-terminalen Deletion bis zur Aminosäure 220-225 eine relativ hohe Affinität aufwies, war die Menge an löslichem exprimiertem Protein geringer.
Wie vorstehend beschrieben, besaß ein Protein, das durch Deletion der Aminosäuren 1-223 von Polypeptid T604 (N4-T604: Aminosäuren 224-604) erhalten wurde, eine höhere Aktivität (etwa dreimal höher), allerdings eine niedrigere Produktion als diejenigen des ursprünglichen T604. Demnach ist anscheinend das Polypeptid T604 als ein lösliches Protein das besonders geeignete Polypeptid zur stabilen Massenexpression der hoch affinen IP₃-bindenden Region alleine.
Beispiel 3: Expression des IP₃-Schwamms
(i) Experiment zur Hemmung der [³H]-IP₃-Bindung
Auf der Grundlage der in Beispiel 2 erhaltenen Ergebnisse wurde ein IP₃-bindendes Polypeptid mit einer höheren Affinität erzeugt. Wie vorstehend beschrieben wurden, wenn die Aminoterminalen Aminosäuren 1-223 der Polypeptide T604 und T734 deletiert wurden, hohe [³H]-IP₃-Bindungsaktivitäten erhalten. Auch die Aminosäureregion 224-579 (ein Polypeptid, das fast der Kernregion entspricht), die aus nur 356 Aminosäureresten besteht, besaß eine Affinität von so hoch wie Kd = 2,3 nM (Yoshikawa et al., 1996, supra). Allerdings besitzen, wie vorstehend beschrieben, diese Polypeptide geringere lösliche Protein-Expressionsniveaus. Mit anderen Worten kann die längere Amino-terminale Deletion zu einer höheren Affinität auf der einen Seite führen, allerdings setzt sie auch die Expressionsmenge und Expressionsstabilität der löslichen Proteinen herab, indem sie die meisten der Proteine als unlösliche Einschlusskörper abgibt.
Im Allgemeinen werden bekanntlich Stabilität, Solubilität und ein Expressionsniveau eines Fremdpolypeptids verbessert, wenn es zu einem GST-Fusionskörper gemacht wird. In diesem Beispiel wurden die Fusionsproteine G224, G224-m30 und G224-m49, bestehend aus GST und einer IP₃-bindenden Stelle (Aminosäureregion 224-604), durch Ligation von GST unter Ersatz der N-terminalen Region (Aminosäuren 1-223) des IP₃-Rezeptors (1) hergestellt.
Die IP₃-bindenden Aktivitäten dieser Fusionsproteine wurden hauptsächlich durch das Verfahren von Yoshikawa et al., 1996, gemessen.
Jedes Fusionsprotein (IP₃-Schwamm) (0,2 μg) wurde mit 100 μl Bindungspuffer-α (50 mM Tris-HCl (pH 8,0 bei 4 °C), 1 mM EDTA, 1 mM β-Mercaptoethanol), der 9,6 nM D-myo-[³H](1,4,5)IP₃ (777 GBq/mmol; DuPont NEN) (im Folgenden als "[³H]-IP₃" abgekürzt) und verschiedene Konzentrationen von nicht markiertem D-myo-(1,4,5)IP₃ (Dojindo) (im Folgenden als "kaltes IP₃" abgekürzt) enthielt, vermischt. Das Gemisch wurde 10 min auf Eis stehen gelassen. Dem Gemisch wurden 4 μl 50 mg/ml γ-Globulin (Sigma) (Endkonzentration 1 mg/ml) und 100 μl 30 PEG 6000 (Sigma)/Bindungspufffer-α Lösung (Endkonzentration 15 %) zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde 5 min auf Eis stehen gelassen und anschließend bei 10000 × g 5 min bei 2 °C zentrifugiert, um Polypeptid/PEG-Komplex zu sammeln. PEG-präzipitiertes [³H]-IP₃-bindendes Protein wurde mit 180 μl des Solubilisierers Solvable (DuPont NEN) gut solubilisiert. Das Resultierende wurde mit 18 μl Eisessig neutralisiert, und sodann wurden 5 μl flüssiger Scintillationszähler (Atomlight [DuPont NEN]) zugesetzt, um die Radioaktivität (erste Radioaktivität) zu messen. Die nicht spezifische Bindung eines jeden Proteins wurde durch Messen der zweiten Radioaktivität in Gegenwart von 2 μM oder 10 μM kaltem IP₃ bestimmt. Anschließend wurde ein spezifischer Bindungswert für jedes Protein durch Subtraktion der zweiten Radioaktivität (nicht spezifischer Bindungswert) von den ersten Radioaktivitätswerten erhalten.
Die Scatchard-Plot-Analyse wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: für niedrig affine Polypeptide (G224-m30 und Kontroll-GST) wurde das Bindungsexperiment in 100 μl Bindungspuffer-α durch Zugabe von 9,6 nM [³H]-IP₃ (DuPont NEN) und 10-20 nM kaltem IP₃ zu 2 μg IP₃-bindendem Polypeptid und durch Zugabe von 9,6 nM [³H]-IP₃ (DuPont NEN) und 50 nM-2 μM kaltem IP₃ zu 0,01 μg IP₃-bindendem Polypeptid durchgeführt. Für hoch affine IP₃-Schwämme (G224 und G224-m49) wurde das Bindungsexperiment mit 0,02 μg IP₃-Schwämmen bei [³H]-IP₃-Konzentrationen von 0,15, 0,3, 0,6, 1,2, 2,4, 4,8 und 9,6 nM ohne Zugabe von kaltem IP₃ durchgeführt.
Die Hemmwirkungen der IP₃-bindenden Polypeptide (IP₃-Schwämme) auf die [³H]-IP₃-Bindungsaktivität von cerebellaren Mikrosomen wurde wie folgt analysiert.
Eine Mikrosomenfraktion wurde aus dem Cerebellum von ddY-Mäusen (Nippon SLC) hauptsächlich durch Befolgen des Verfahrens von Nakada et al. (Nakada S. et al., Biochem. J. 277:125-131, 1991) hergestellt. In 100 μl Bindungspuffer-α wurden verschiedene Konzentrationen der IP₃-Schwämme zugesetzt, um die Änderungen bei der Bindung zwischen dem cerebellären Mikrosom (40 μg) und 9,6 nM [³H]-IP₃ nach dem obigen Verfahren (siehe Scatchard-Plot-Analyse) festzustellen.
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Affinität von Polypeptid G224 500-mal höher war als diejenige von Polypeptid T734 (Kd = 83 pM, B_max = 1,6 pmol/μg Protein) (3A). Polypeptid G224 bindet gut an (1,4,5)IP₃ und (2,4,5)IP₃, und die Ausbeute an IP₃-bindendem Protein betrug etwa 30 mg/l E. coli-Kultur (Tabelle 1). Nach Reinigung des Proteins über eine Glutathionsäule und eine anschließende PD10-Säule betrug die Ausbeute etwa 24 mg pro I. Die Bindungsaktivität wurde gesteigert, wenn in Polypeptid T734 eine R441Q-Mutation eingebracht wurde (Yoshikawa et al., 1996, supra). Die Affinität von Polypeptid G224-m49 (G224, in das eine R441 Q-Mutation eingebracht wurde) verdoppelte sich und wurde etwa 1000 Mal höher als diejenige des Polypeptids T734 (Kd = etwa 43 pM, B_max = 1,7 pmol/μg Protein) (3B, Tabelle 1). Die Bindungsaktivität nahm ab, wenn in das Polypeptid T734 eine K508A-Mutation eingebracht wurde (Yoshikawa et al., 1996, (supra)). Gleichermaßen nahm die Bindungsaktivität des Polypeptids G224-m30 ab, wenn in G224 eine K508A-Mutation eingebracht wurde, und sie wurde so niedrig wie etwa 1/4000 von Polypeptid G224 und etwa 1/7700 von Polypeptid G224-m49 (Kd = etwa 330 nM, B_max = 3,0 pmol/μg Protein)(3C, Tabelle 1).
(ii) Hemmung der IP₃-Bindung durch Absorption durch den neuen IP₃-Schwamm
Die IP₃-bindenden Polypeptide G224 und G224-m49 weisen starke IP₃-Bindungsaktivitäten auf, die 500-1000-fach höher sind als diejenigen des ursprünglichen IP₃-Rezeptors. Die Polypeptide G224 und G224-m49 wurden hinsichtlich ihrer Verwendung als ein IP₃-spezifischer Absorptionskörper (Schwamm)(IP₃-Schwamm) getestet, d.h. ob sie die Menge des IP₃-Bindens durch die IP₃-Rezeptoren in einer Lösung durch kompetitives Absorbieren von IP₃ in der Lösung herabsetzen können (4).
Maus-Cerebellum ist ein Gewebe, das reich ist an IP₃-Rezeptor und dessen mikrosomale Fraktion eine [³H]-IP₃-Bindungsaktivität aufweist, die mindestens 50 Mal größer ist als diejenige in anderen Geweben (Maeda et al., 1990 (supra)). Die Bindung zwischen 40 μg cerebellärem Mikrosom (Kd = 21 nM, B_max = 23 pmol/mg Protein) und 9,6 nM [³H]-IP₃ in 100 μl Lösung wurde als prozentualer Gehalt (%) an kompetitiver Hemmung bei verschiedenen Konzentrationen von IP₃-Schwämmen analysiert, wobei die Aktivität in Abwesenheit von IP₃-Schwamm als 100 % betrachtet wurde. Es wurde berechnet, dass etwa 0,92 pmol IP₃-Bindungsstellen von Cerebellum-IP₃-Rezeptor und 0,96 pmol [³H]-IP₃ in der 100 μl-Lösung vorhanden waren.
Als Ergebnis wurde eine Hemmwirkung für Kontroll-GST festgestellt, auch wenn die IP₃-Schwamm-Konzentration 100 μg/ml betrug (4). Andererseits wurden für die hoch affinen Polypeptide G224 und G224-m49 starke Hemmaktivitäten der IP₃-Bindung festgestellt, und die IC₅₀ betrug etwa 10 μg/ml (4). Das Polypeptid G224-m30 mit niedriger Affinität wies eine niedrige Hemmaktivität auf, mit IC₅₀ von 100 μg/ml. Gemäß diesem in vitro Experimentsystem neigte der IP₃-Schwamm zum Präzipitieren mit der Mikrosomen-Membran, wenn die IP₃-Schwamm-Konzentration etwa 25 μg/ml überschritt, und so fluktuierten wahrscheinlich die konzentrationsabhängigen Kurven (4). Somit könnte die offensichtliche Hemmung von G224-m30, die bei einer IP₃-Schwamm-Konzentration über 25 μg/ml festgestellt wurde, auf Präzipitation unter hoher Konzentration beruhen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das [³H]-IP₃-Binden des IP₃-Rezeptors je nach Bindungsaffinität und Konzentration des verwendeten IP₃-Schwamms wirksam gehemmt werden kann. Das erfindungsgemäße hoch affine IP₃-bindende Polypeptid ist ein neuer IP₃-Schwamm, der als IP₃-neutralisierendes Mittel oder als Antagonist für IP₃-induziertes Calcium verwendet werden kann.
Beispiel 4: Test der Hemmung der IP₃-induzierten Ca²⁺-Freisetzung (IICR)
Zur Durchführung eines Tests der Hemmung der IP₃-induzierten Ca²⁺-Freisetzung wurde eine Mikrosomenfraktion aus Maus-Cerebellum, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt. Die Fraktion wurde in Puffer B suspendiert, dispensiert und bei –80 °C bis zur Verwendung gelagert.
Die Zusammensetzung von Puffer B war 110 mM KCl, 10 mM NaCl, 5 mM KH₂PO₄, 1 mM DDT und 50 mM HEPES-KOH (pH 7,2) (enthaltend einen Cocktail von Protease-Inhibitoren [0,1 mM PMSF, 10 μM Leupeptin, 10 μM Pepstatin A, 10 μM E-64] und 2 mM MgCl₂).
Eine IP₃-induzierte Ca²⁺-Freisetzungsaktivität von cerebellärem Mikrosom wurde durch Verwendung von fura-2 (Molekularsonde) als Ca²-Fluoreszenzindikator bestimmt. Insbesondere wurden die Anregungen bei Zugabe von IP₃ bei zwei Wellenlängen (340 nm und 380 nm) mit dem Fluoreszenzspektralphotometer CAF110 (Nihon Bunko) gemessen, um die Änderung des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses (F340/F380) bei 500 nm festzustellen.
Die IP₃-induzierte Ca²⁺-Freisetzung aus dem cerebellären Mikrosom beträgt im Allgemeinen EC₅₀ = 100-200 nM IP₃. Cerebelläres Mikrosom (100 μg) wurde mit 500 μl eines Freisetzungspuffers (Puffer B enthaltend 1 mM MgCl₂, 2 μM fura-2, 1 mM DTT, 10 mM Creatinphosphat, 40 U/ml Creatinkinase, 1 μg/ml Oligomycin, und den Cocktail von Protease-Inhibitoren) in einer Messküvette mit einem Rührstäbchen vermischt. Die folgende Reaktion wurde bei 30 °C unter konstantem Rühren mit dem Rührstäbchen durchgeführt: 1 mM ATP wurde dem Gemisch in der Küvette zugesetzt, um die Ca²-Pumpe (Ca²⁺-ATPase) zu aktivieren, wodurch Ca²⁺ in den Mikrosomen-Innenraum eingebracht wurde (Ca²⁺-Beladung). Das Ca²⁺-Beladen wurde durch Überwachen bestätigt, bis die Abnahme des fura-2-Fluoreszenzniveaus konstant wurde. Die Änderung in dem fura-2-Fluoreszenzintensitätsverhältnis wurde auf einem Niveau unter Schwellenwert gemessen (F340/F380).
Die Wirkung des IP₃-Schwammes auf die Hemmung der IP₃-induzierten Ca²⁺-Freisetzungsaktivität von cerebellärem Mikrosom wurde wie folgt ausgewertet: nach der Zugabe von ATP wurde die Kunre der fura-2-Fluoreszenzintensität aufgezeichnet, bis die Abnahme konstant wurde. Anschließend wurden verschiedene Konzentrationen an IP₃-Schwämmen zugesetzt. Nach 1 min wurden dem Reaktionsgemisch 50 nM bis 1 μM IP₃ zugesetzt, um die durch den IP₃ ausgelöste Änderung der fura-2-Fluoreszenzintensität festzustellen.
Die IP₃-Schwamm-Konzentrationsabhängigkeit wurde wie folgt bestimmt: 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200 μg/ml hoch affines Polypeptide G224 wurde jeweils dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Nach etwa 1 min wurden 100 nM IP₃ zugesetzt, um die durch den IP₃ ausgelöste Ca²⁺-Freisetzungsaktivität zu messen. Die Konzentrationsabhängigkeit des niedrig affinen Polypeptids G224-m30 wurde durch Zugabe von 200, 400 und 500 μg/ml G224-m30 gemessen. Nach etwa 1 min wurden 100 nM IP₃ zugesetzt, um die durch den IP₃ ausgelöste Ca²⁺-Freisetzungsaktivität zu messen. Zusätzlich wurden auch 500 μg/ml G224-m30 zugesetzt, und nach etwa 1 min wurden 50 nM IP₃ zugesetzt, um die durch den IP₃ ausgelöste Ca²⁺-Freisetzungsaktivität zu messen.
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die IP₃-Schwämme das IP₃-Binden durch den IP₃-Rezeptor von cerebellärem Mikrosom durch Absorbieren des IP₃ spezifisch und kompetitiv hemmten (5A-5F, 6A-6G und 7). In den 5A-F und 6A-G stellt die vertikale Achse die Änderung des fura-2-Fluoreszenzintensitätsverhältnisses dar (F340/F380)(d.h. die Änderung in der Menge an Ca²⁺), die horizontale Achse stellt die Zeit (s) dar.
Wie in den 5A, 5B und 5C gezeigt, waren in Abwesenheit des IP₃-Schwamms (Kontrollen) die IP₃-induzierten Ca²⁺-Freisetzungsaktivitäten von der IP₃-Konzentration abhängig. Das niedrig affine Polypeptid G224-m30 besaß bei einer Konzentration von 500 μg/ml keine Hemmwirkung auf die Ca²⁺-Freisetzung mit 100 nM IP₃ (5E). Wenig Unterschied wurde zwischen G224-m30 und der Kontrolle für die Wirkungen der Hemmung von 50 nM IP₃ festgestellt (5E). Mit GST allein wurde auch bei einer hohen Konzentration von 632 μg/ml keine Änderung in der Ca²⁺-Freisetzungsaktivität, die mit 50 nM IP₃ ausgelöst wurde, festgestellt (5F). Somit wurde in jedem Fall kein deutlicher Unterschied zur Kontrolle verzeichnet.
Im Gegensatz zu den obigen Ergebnissen besaß das hoch affine Polypeptid G224 eine signifikante Hemmwirkung auf die IP₃-induzierte Ca²⁺-Freisetzung in Abhängigkeit von seiner Konzentration (6A-6G). Das hoch affine Polypeptid G224 besaß die größte Hemmwirkung bei 100 μg/ml und hemmte die IP₃-induzierte Ca²⁺-Freisetzung fast vollständig (6F).
Die Peakwerte der Ca²⁺-Freisetzung, die durch Zugabe von G224 bei jeder Konzentration erhalten wurden, die in den 6A-6G gezeigt ist, wurden aufgetragen, wobei der Peak, der in Abwesenheit von G224 erhalten wurde, als 100 % angesehen wurde (7). Die horizontale Achse stellt jeweils die Konzentration des Polypeptids G224 dar und die vertikale Achse den Peakwert der Ca²⁺-Freisetzung. Wie aus 7 entnommen werden kann, betrug die Konzentration an Polypeptid G224, die für 50 % Hemmung der IP₃-induzierten Ca²⁺-Freisetzung erforderlich ist, etwa 20 μg/ml.
Demnach wurde festgestellt, dass das hoch affine IP₃-bindende Polypeptid als IP₃-Schwamm wirkte und die durch den IP₃-Rezeptor auf dem cerebellären Mikrosom induzierte Ca²⁺-Freisetzung spezifisch und konzentrationsabhängig hemmte.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid mit einer hohen Affinitätsbindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat, ein Gen, das das Polypeptid codiert, einen rekombinanten Vektor, der das Gen umfasst, eine Transformante, die den Vektor umfasst, und ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids bereit.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann zur Kontrolle der Hemmung einer spezifischen Zellfunktion, die von einer IP₃-induzierten Calciumsignalübertragung (IP₃-neutralisierendes Mittel, Antagonist für IP₃-induziertes Calcium, etc.) abhängt, verwendet werden. Außerdem sind das erfindungsgemäße Polypeptid und Gen als IP₃-Signalnachweismittel zur Hemmung der Aktivierung der IP₃-induzierten Calciumsignalübertragung geeignet. Das erfindungsgemäße Gen ist auch als therapeutisches Mittel zur Behandlung einer mit der Calciumproduktion einhergehenden Erkrankung geeignet.
Das Folgende sind Informationen über die hier beschriebenen Sequenzen: SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, welches: (a) ein Polypeptid ist, bestehend aus GST und der Aminosäuresequenz von Position 224 bis 604 von SEQ ID NO:2, oder (b) ein Polypeptid ist, bestehend aus GST und der Aminosäuresequenz von Position 224 bis 604 von SEQ ID NO:2, welches die Mutation R441Q umfaßt.
Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert, welches: (a) ein Polypeptid ist, bestehend aus GST und der Aminosäuresequenz von Position 224 bis 604 von SEQ ID NO:2, oder (b) ein Polypeptid ist, bestehend aus GST und der Aminosäuresequenz von Position 224 bis 604 von SEQ ID NO:2, welches die Mutation R441Q umfaßt.
Rekombinanter Vektor, welcher das Polynukleotid nach Anspruch 2 umfaßt.
Isolierte transformierte Wirtszelle, welche den rekombinanten Vektor nach Anspruch 3 umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 1, welches folgendes umfaßt: Kultivieren der Transformante nach Anspruch 4 und Gewinnen eines Polypeptids mit einer hohen Affinitätsbindungsaktivität für Inositol-1,4,5-triphosphat aus der erhaltenen Kultur.
Antagonist für die IP3-induzierte Calciumproduktion, welcher das Polypeptid nach Anspruch 1 umfaßt.
Therapeutisches Mittel, welches ein Polypeptid nach Anspruch 1 umfaßt, zur Verwendung bei der Behandlung einer mit Calciumproduktion einhergehenden Erkrankung.
Therapeutisches Mittel, welches ein Polynukleotid nach Anspruch 2 umfaßt, zur Verwendung in der Gentherapie zur Behandlung einer mit Calciumproduktion einhergehenden Erkrankung.
Therapeutisches Mittel nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Erkrankung wenigstens eine Erkrankung ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Erkrankungen des Nervensystems, des Blutgefäßsystems, des Atmungssystems, des Verdauungssystems, des lymphatischen Systems, des Harnsystems und des Fortpflanzungssystems.