JPH10262685A - 硫酸基転移酵素遺伝子 - Google Patents
硫酸基転移酵素遺伝子Info
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- JPH10262685A JPH10262685A JP9238744A JP23874497A JPH10262685A JP H10262685 A JPH10262685 A JP H10262685A JP 9238744 A JP9238744 A JP 9238744A JP 23874497 A JP23874497 A JP 23874497A JP H10262685 A JPH10262685 A JP H10262685A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】腎細胞に特徴的であり、特に腎癌細胞で高発現
している、糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素遺伝子、該
遺伝子を含む発現ベクターを導入した形質転換体を用い
る遺伝子工学的に高純度の硫酸基転移酵素を製造する方
法、該遺伝子がコードするポリペプチド、該遺伝子又は
その一部に相補的なアンチセンスＤＮＡ及びアンチセン
スＲＮＡ、該遺伝子に特異的にハイブリダイズする合成
オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー及び該ポリ
ペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片を提供す
ること。 【解決手段】Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、
Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作
用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転
移する硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコー
ドする単離された遺伝子。
している、糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素遺伝子、該
遺伝子を含む発現ベクターを導入した形質転換体を用い
る遺伝子工学的に高純度の硫酸基転移酵素を製造する方
法、該遺伝子がコードするポリペプチド、該遺伝子又は
その一部に相補的なアンチセンスＤＮＡ及びアンチセン
スＲＮＡ、該遺伝子に特異的にハイブリダイズする合成
オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー及び該ポリ
ペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片を提供す
ること。 【解決手段】Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、
Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作
用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転
移する硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコー
ドする単離された遺伝子。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖脂質糖鎖に働く
硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡおよび発現ベクタ
ー、該発現ベクターを導入した形質転換体、該形質転換
体を用いるポリペプチドの製造方法およびポリペプチ
ド、前記遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡまたはアン
チセンスＲＮＡ、前記遺伝子にハイブリダイズする合成
オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーならびに
前記ポリペプチドに結合する抗体またはその断片に関す
る。
硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡおよび発現ベクタ
ー、該発現ベクターを導入した形質転換体、該形質転換
体を用いるポリペプチドの製造方法およびポリペプチ
ド、前記遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡまたはアン
チセンスＲＮＡ、前記遺伝子にハイブリダイズする合成
オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーならびに
前記ポリペプチドに結合する抗体またはその断片に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞の膜に存在する糖タンパク質
や糖脂質等の、いわゆる複合糖質と呼ばれる分子の糖鎖
部分が持つ様々な生理機能が注目されている。糖鎖に結
合した硫酸基は、種々の生物学的機能に関連して興味が
もたれている。硫酸基は、ウイルス糖タンパク質、糖タ
ンパク質性ホルモン、基底膜糖タンパク質、粘菌のリソ
ソーム酵素などの糖鎖にエステル結合している他に、ム
チンやムコ多糖、糖脂質の糖鎖にも種々の結合様式で結
合している。しかし、その生物学的意義は今後の解明す
べき問題として残されている。
や糖脂質等の、いわゆる複合糖質と呼ばれる分子の糖鎖
部分が持つ様々な生理機能が注目されている。糖鎖に結
合した硫酸基は、種々の生物学的機能に関連して興味が
もたれている。硫酸基は、ウイルス糖タンパク質、糖タ
ンパク質性ホルモン、基底膜糖タンパク質、粘菌のリソ
ソーム酵素などの糖鎖にエステル結合している他に、ム
チンやムコ多糖、糖脂質の糖鎖にも種々の結合様式で結
合している。しかし、その生物学的意義は今後の解明す
べき問題として残されている。
【０００３】これまでに基質特異性の異なる種々の硫酸
基転移酵素の存在が知られている。例えば、糖タンパク
質に働く硫酸基転移酵素としては、Ｎ−グリコシド型糖
鎖のガラクトースの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移
酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（Journal of Biological Chemistry)、第２６４巻、
第６号、第３３６４−３３７１頁（１９８９）〕、Ｎ−
グリコシド型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位に
硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔バイオケミカル ジ
ャーナル(Biochemical Journal) 、第３１９巻、第２０
９−２１６頁（１９９６）〕、ムチン糖鎖のＮ−アセチ
ルガラクトサミンの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移
酵素〔グライコバイオロジー（Glycobiology) 、第５
巻、第７号、第６８９−６９７頁（１９９５）〕、ムチ
ン糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの３位に硫酸基を付
加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジ
カルケミストリー、第２７０巻、第４６号、第２７５４
４−２７５５０頁（１９９５）〕、および脳下垂体で産
生される糖タンパク質性ホルモン糖鎖のＮ−アセチルグ
ルコサミンの４位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素
〔ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー、第
２６６巻、第２６号、第１７１４２−１７１５０頁（１
９９１）〕等が知られている。
基転移酵素の存在が知られている。例えば、糖タンパク
質に働く硫酸基転移酵素としては、Ｎ−グリコシド型糖
鎖のガラクトースの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移
酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（Journal of Biological Chemistry)、第２６４巻、
第６号、第３３６４−３３７１頁（１９８９）〕、Ｎ−
グリコシド型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位に
硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔バイオケミカル ジ
ャーナル(Biochemical Journal) 、第３１９巻、第２０
９−２１６頁（１９９６）〕、ムチン糖鎖のＮ−アセチ
ルガラクトサミンの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移
酵素〔グライコバイオロジー（Glycobiology) 、第５
巻、第７号、第６８９−６９７頁（１９９５）〕、ムチ
ン糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの３位に硫酸基を付
加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジ
カルケミストリー、第２７０巻、第４６号、第２７５４
４−２７５５０頁（１９９５）〕、および脳下垂体で産
生される糖タンパク質性ホルモン糖鎖のＮ−アセチルグ
ルコサミンの４位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素
〔ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー、第
２６６巻、第２６号、第１７１４２−１７１５０頁（１
９９１）〕等が知られている。
【０００４】また、グリコサミノグリカン（ムコ多糖）
に働く硫酸基転移酵素としては、ヘパラン硫酸のイズロ
ン酸の２位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャー
ナルオブ バイオロジカル ケミストリー、第２７１
巻、第１３号、第７６４５−７６５３頁（１９９
６）〕、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸化グルコサミンの６位
に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー、第２７０巻、第８
号、第４１７２−４１７９頁（１９９５）〕、ヘパリン
のイズロン酸の２位とＮ−硫酸化グルコサミンの６位に
硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー、第２６９巻、第４０
号、第２４５３８−２４５４１頁（１９９４）〕、ヘパ
ラン硫酸のＮ−硫酸化グルコサミンの３位に硫酸基を付
加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブバイオロジカ
ル ケミストリー、第２７１巻、第４３号、第２７０７
２−２７０８２頁（１９９６）〕、ヘパラン硫酸のＮ−
硫酸化に働く硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー、第２６３巻、第５号、第２
４１７−２４２２頁（１９８８）〕、ヘパリンのＮ−硫
酸化に働く硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー、第２６６巻、第１３号、第８
０４４−８０４９頁（１９９１）〕、コンドロイチン硫
酸のＮ−アセチルガラクトサミンとケラタン硫酸のガラ
クトースの６位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素およ
びコンドロイチン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミンの
４位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６８巻、第
２９号、第２１９６８−２１９７４頁（１９９３）〕、
角膜に存在するケラタン硫酸にのみ働く硫酸基転移酵素
〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、
第２５９巻、第１９号、第１１７７１−１１７７６頁
（１９８４）〕等が知られている。
に働く硫酸基転移酵素としては、ヘパラン硫酸のイズロ
ン酸の２位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャー
ナルオブ バイオロジカル ケミストリー、第２７１
巻、第１３号、第７６４５−７６５３頁（１９９
６）〕、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸化グルコサミンの６位
に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー、第２７０巻、第８
号、第４１７２−４１７９頁（１９９５）〕、ヘパリン
のイズロン酸の２位とＮ−硫酸化グルコサミンの６位に
硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー、第２６９巻、第４０
号、第２４５３８−２４５４１頁（１９９４）〕、ヘパ
ラン硫酸のＮ−硫酸化グルコサミンの３位に硫酸基を付
加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブバイオロジカ
ル ケミストリー、第２７１巻、第４３号、第２７０７
２−２７０８２頁（１９９６）〕、ヘパラン硫酸のＮ−
硫酸化に働く硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー、第２６３巻、第５号、第２
４１７−２４２２頁（１９８８）〕、ヘパリンのＮ−硫
酸化に働く硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー、第２６６巻、第１３号、第８
０４４−８０４９頁（１９９１）〕、コンドロイチン硫
酸のＮ−アセチルガラクトサミンとケラタン硫酸のガラ
クトースの６位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素およ
びコンドロイチン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミンの
４位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６８巻、第
２９号、第２１９６８−２１９７４頁（１９９３）〕、
角膜に存在するケラタン硫酸にのみ働く硫酸基転移酵素
〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、
第２５９巻、第１９号、第１１７７１−１１７７６頁
（１９８４）〕等が知られている。
【０００５】さらに、糖脂質に働く硫酸基転移酵素とし
ては、本発明の硫酸基転移酵素以外に、単クローン抗体
ＨＮＫ−１で認識される糖鎖を合成する、グルクロン酸
の３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６８巻、
第１号、第３３０−３３６頁（１９９３）〕が知られて
いる。
ては、本発明の硫酸基転移酵素以外に、単クローン抗体
ＨＮＫ−１で認識される糖鎖を合成する、グルクロン酸
の３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６８巻、
第１号、第３３０−３３６頁（１９９３）〕が知られて
いる。
【０００６】これらの中でクローニングされている複合
糖質に働く硫酸基転移酵素としては、ラット肝由来のヘ
パリン糖鎖の合成にかかわるＮ−硫酸基転移酵素［Ｎ−
ヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼ、ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、
第２２号、第１５７４４−１５７５０頁（１９９
２）］、ＭＳＴ細胞由来のヘパリン糖鎖の合成にかかわ
るＮ−硫酸基転移酵素［Ｎ−デアシラーゼ／Ｎ−スルホ
トランスフェラーゼ、ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー、第２６９巻、第３号、第２２７０−
２２７６頁（１９９４）］、ニワトリ胎児軟骨細胞（ch
ick embryo chondrocytes)由来のコンドロイチン糖鎖の
合成にかかわるＮ−アセチルガラクトサミンのＣ−６位
に硫酸基を転移する酵素［コンドロイチン６−スルホト
ランスフェラーゼ、ジャーナル オブバイオロジカル
ケミストリー、第２７０巻、第３１号、第１８５７５−
１８５８０頁（１９９５）］が知られている。
糖質に働く硫酸基転移酵素としては、ラット肝由来のヘ
パリン糖鎖の合成にかかわるＮ−硫酸基転移酵素［Ｎ−
ヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼ、ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、
第２２号、第１５７４４−１５７５０頁（１９９
２）］、ＭＳＴ細胞由来のヘパリン糖鎖の合成にかかわ
るＮ−硫酸基転移酵素［Ｎ−デアシラーゼ／Ｎ−スルホ
トランスフェラーゼ、ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー、第２６９巻、第３号、第２２７０−
２２７６頁（１９９４）］、ニワトリ胎児軟骨細胞（ch
ick embryo chondrocytes)由来のコンドロイチン糖鎖の
合成にかかわるＮ−アセチルガラクトサミンのＣ−６位
に硫酸基を転移する酵素［コンドロイチン６−スルホト
ランスフェラーゼ、ジャーナル オブバイオロジカル
ケミストリー、第２７０巻、第３１号、第１８５７５−
１８５８０頁（１９９５）］が知られている。
【０００７】本発明者らは、ガラクトースの３位の水酸
基に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素である３’−ホス
ホアデノシン−５’−ホスホスルフェート：ＧａｌＣｅ
ｒスルホトランスフェラーゼ〔ＥＣ２．８．２．１１〕
をヒト腎癌細胞株（ＳＭＫＴ−Ｒ３）より精製した〔ジ
ャーナル オブ バイオケミストリー(Journal of Bioc
hemistry) 、第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁
（１９９６）〕。該硫酸基転移酵素は、ヒト腎癌組織又
はその細胞株で高発現しており、腎癌における硫酸化糖
脂質の蓄積と相関しており、癌との関連が示唆される
が、そのアミノ酸配列は決定されておらず、その遺伝子
もクローニングされていない。
基に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素である３’−ホス
ホアデノシン−５’−ホスホスルフェート：ＧａｌＣｅ
ｒスルホトランスフェラーゼ〔ＥＣ２．８．２．１１〕
をヒト腎癌細胞株（ＳＭＫＴ−Ｒ３）より精製した〔ジ
ャーナル オブ バイオケミストリー(Journal of Bioc
hemistry) 、第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁
（１９９６）〕。該硫酸基転移酵素は、ヒト腎癌組織又
はその細胞株で高発現しており、腎癌における硫酸化糖
脂質の蓄積と相関しており、癌との関連が示唆される
が、そのアミノ酸配列は決定されておらず、その遺伝子
もクローニングされていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】これまでに知られてい
る硫酸基転移酵素を工業的に有利に製造しようとする場
合、天然に存在する該酵素の量が少なかったり、プロテ
アーゼやスルファターゼ等の他の酵素の混在の為、目的
の硫酸基転移酵素を純粋な形で、簡便かつ大量に単離す
ることは非常に困難であった。
る硫酸基転移酵素を工業的に有利に製造しようとする場
合、天然に存在する該酵素の量が少なかったり、プロテ
アーゼやスルファターゼ等の他の酵素の混在の為、目的
の硫酸基転移酵素を純粋な形で、簡便かつ大量に単離す
ることは非常に困難であった。
【０００９】従って、硫酸基転移酵素遺伝子をクローニ
ングし、遺伝子工学的手法を用いて、安価に高純度な硫
酸基転移酵素を製造する方法が求められている。従来、
硫酸基転移酵素遺伝子のクローニングについて前述のよ
うな報告があるが、その数は著しく少ない。また、基質
特異性の異なる硫酸基転移酵素が多数存在するため、前
述の報告の硫酸基転移酵素遺伝子配列を用いて他の基質
特異性の異なる硫酸基転移酵素遺伝子を得ようとして
も、基質特異性が異なる酵素間の遺伝子のホモロジーが
低く、目的の硫酸基転移酵素遺伝子を得ることは困難で
ある。ましてや、糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素のア
ミノ酸配列や遺伝子構造は全く不明であるため、該硫酸
基転移酵素をクローニングし、遺伝子工学的に製造する
ことは困難である。
ングし、遺伝子工学的手法を用いて、安価に高純度な硫
酸基転移酵素を製造する方法が求められている。従来、
硫酸基転移酵素遺伝子のクローニングについて前述のよ
うな報告があるが、その数は著しく少ない。また、基質
特異性の異なる硫酸基転移酵素が多数存在するため、前
述の報告の硫酸基転移酵素遺伝子配列を用いて他の基質
特異性の異なる硫酸基転移酵素遺伝子を得ようとして
も、基質特異性が異なる酵素間の遺伝子のホモロジーが
低く、目的の硫酸基転移酵素遺伝子を得ることは困難で
ある。ましてや、糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素のア
ミノ酸配列や遺伝子構造は全く不明であるため、該硫酸
基転移酵素をクローニングし、遺伝子工学的に製造する
ことは困難である。
【００１０】よって、本発明の第１の目的は、腎細胞に
特徴的であり、特に腎癌細胞で高発現している、糖脂質
糖鎖に働く硫酸基転移酵素遺伝子を提供することにあ
る。本発明の第２の目的は、前記遺伝子を含む発現ベク
ターを導入した形質転換体を用いる遺伝子工学的に高純
度の硫酸基転移酵素を製造する方法を提供することにあ
る。本発明の第３の目的は、前記遺伝子がコードするポ
リペプチドを提供することにある。本発明の第４の目的
は、本発明の遺伝子又はその一部に相補的なアンチセン
スＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを提供することにあ
る。本発明の第５の目的は、本発明の遺伝子に特異的に
ハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又
はプライマーを提供することにある。本発明の第６の目
的は、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその
断片を提供することにある。
特徴的であり、特に腎癌細胞で高発現している、糖脂質
糖鎖に働く硫酸基転移酵素遺伝子を提供することにあ
る。本発明の第２の目的は、前記遺伝子を含む発現ベク
ターを導入した形質転換体を用いる遺伝子工学的に高純
度の硫酸基転移酵素を製造する方法を提供することにあ
る。本発明の第３の目的は、前記遺伝子がコードするポ
リペプチドを提供することにある。本発明の第４の目的
は、本発明の遺伝子又はその一部に相補的なアンチセン
スＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを提供することにあ
る。本発明の第５の目的は、本発明の遺伝子に特異的に
ハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又
はプライマーを提供することにある。本発明の第６の目
的は、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその
断片を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、以上の状況に
鑑みてなされたものである。糖脂質糖鎖に働く硫酸基転
移酵素の塩基配列及びアミノ酸配列を明らかにする為、
該硫酸基転移酵素を高発現するヒト腎癌細胞株ＳＭＫＴ
−Ｒ３由来の硫酸基転移酵素について鋭意検討を重ねた
結果、遂に該硫酸基転移酵素遺伝子の完全解明に成功し
た。更に該硫酸基転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子工学
的手法により工業的に有利で高純度な硫酸基転移酵素を
簡便に製造することにも成功し、本発明を完成するに至
った。
鑑みてなされたものである。糖脂質糖鎖に働く硫酸基転
移酵素の塩基配列及びアミノ酸配列を明らかにする為、
該硫酸基転移酵素を高発現するヒト腎癌細胞株ＳＭＫＴ
−Ｒ３由来の硫酸基転移酵素について鋭意検討を重ねた
結果、遂に該硫酸基転移酵素遺伝子の完全解明に成功し
た。更に該硫酸基転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子工学
的手法により工業的に有利で高純度な硫酸基転移酵素を
簡便に製造することにも成功し、本発明を完成するに至
った。
【００１２】即ち、本発明の要旨は、（１） Ｇａｌβ
１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合
脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３
位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素
活性を有するポリペプチドをコードする単離された遺伝
子、（２） 配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配
列又はその一部からなるポリペプチドをコードする前記
（１）記載の遺伝子、（３） 配列表の配列番号：２に
記載の塩基配列又はその一部である前記（１）記載の遺
伝子、（４） 配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸
配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付
加、挿入又は置換されているポリペプチドであって、硫
酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする前
記（１）記載の遺伝子、（５） 前記（２）〜（４）い
ずれか１項に記載の遺伝子とストリンジェントな条件下
においてハイブリダイズすることができ、かつ硫酸基転
移酵素活性を有するポリペプチドをコードする前記
（１）記載の遺伝子、（６） 前記（１）〜（５）いず
れか１項に記載の遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡ、
（７） 前記（６）記載の組換えＤＮＡを挿入されてな
る、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発
現ベクター、（８） 前記（７）記載の発現ベクターを
導入されてなる形質転換体、（９） 前記（８）記載の
形質転換体を培養し、該培養物より硫酸基転移酵素活性
を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、硫
酸基転移酵素活性を有するポリペプチドの製造方法、
（１０） 前記（１）〜（５）いずれか１項に記載の遺
伝子によりコードされる、硫酸基転移酵素活性を有する
ポリペプチド、（１１） 前記（１）〜（５）いずれか
１項に記載の遺伝子又はその一部に相補的なアンチセン
スＤＮＡ、（１２） 前記（１）〜（５）いずれか１項
に記載の遺伝子又はその一部に相補的なアンチセンスＲ
ＮＡ、（１３） 前記（１１）記載のアンチセンスＤＮ
Ａを挿入されてなる発現ベクター、（１４） 前記
（１）〜（５）いずれか１項に記載の遺伝子に特異的に
ハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又
はプライマー、（１５） 前記（１０）記載のポリペプ
チドに特異的に結合する抗体又はその断片、に関する。
１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合
脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３
位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素
活性を有するポリペプチドをコードする単離された遺伝
子、（２） 配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配
列又はその一部からなるポリペプチドをコードする前記
（１）記載の遺伝子、（３） 配列表の配列番号：２に
記載の塩基配列又はその一部である前記（１）記載の遺
伝子、（４） 配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸
配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付
加、挿入又は置換されているポリペプチドであって、硫
酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする前
記（１）記載の遺伝子、（５） 前記（２）〜（４）い
ずれか１項に記載の遺伝子とストリンジェントな条件下
においてハイブリダイズすることができ、かつ硫酸基転
移酵素活性を有するポリペプチドをコードする前記
（１）記載の遺伝子、（６） 前記（１）〜（５）いず
れか１項に記載の遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡ、
（７） 前記（６）記載の組換えＤＮＡを挿入されてな
る、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発
現ベクター、（８） 前記（７）記載の発現ベクターを
導入されてなる形質転換体、（９） 前記（８）記載の
形質転換体を培養し、該培養物より硫酸基転移酵素活性
を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、硫
酸基転移酵素活性を有するポリペプチドの製造方法、
（１０） 前記（１）〜（５）いずれか１項に記載の遺
伝子によりコードされる、硫酸基転移酵素活性を有する
ポリペプチド、（１１） 前記（１）〜（５）いずれか
１項に記載の遺伝子又はその一部に相補的なアンチセン
スＤＮＡ、（１２） 前記（１）〜（５）いずれか１項
に記載の遺伝子又はその一部に相補的なアンチセンスＲ
ＮＡ、（１３） 前記（１１）記載のアンチセンスＤＮ
Ａを挿入されてなる発現ベクター、（１４） 前記
（１）〜（５）いずれか１項に記載の遺伝子に特異的に
ハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又
はプライマー、（１５） 前記（１０）記載のポリペプ
チドに特異的に結合する抗体又はその断片、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本明細書において、「Ｇａｌβ１
−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂
質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位
の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素活
性を有する」（以下、硫酸基転移酵素活性を有すると略
す場合がある）とは、下記に示すような作用および基質
特異性を有する性質をいい、このような硫酸基転移酵素
活性を有するポリペプチドとしては、下記の物理化学的
性質を有するものが挙げられ、その一例がジャーナルオ
ブ バイオケミストリー、 第１１９巻、第３号、第４
２１−４２７頁（１９９６）に記載されている。
−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂
質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位
の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素活
性を有する」（以下、硫酸基転移酵素活性を有すると略
す場合がある）とは、下記に示すような作用および基質
特異性を有する性質をいい、このような硫酸基転移酵素
活性を有するポリペプチドとしては、下記の物理化学的
性質を有するものが挙げられ、その一例がジャーナルオ
ブ バイオケミストリー、 第１１９巻、第３号、第４
２１−４２７頁（１９９６）に記載されている。
【００１４】１．作用 Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質
又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌ
のＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する。
又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌ
のＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する。
【００１５】２．基質特異性 ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）、ラクトシルセ
ラミド（ＬａｃＣｅｒ）、ガラクトシル １−アルキル
−２−アシルグリセロール（ＧａｌＡＡＧ）、ガラクト
シルジアシルグリセロール（ＧａｌＤＧ）、グルコシル
セラミド（ＧｌｃＣｅｒ）、グロボテトラオシルセラミ
ド（Ｇｂ４Ｃｅｒ）、ガングリオトリアオシルセラミド
（Ｇｇ３Ｃｅｒ）、ガングリオテトラオシルセラミド
（Ｇｇ４Ｃｅｒ）、ネオラクトテトラオシルセラミド
（ｎＬｃ４Ｃｅｒ）に反応し、グロボトリアオシルセラ
ミド（Ｇｂ３Ｃｅｒ）、ガラクトース、ラクトースに反
応しない。
ラミド（ＬａｃＣｅｒ）、ガラクトシル １−アルキル
−２−アシルグリセロール（ＧａｌＡＡＧ）、ガラクト
シルジアシルグリセロール（ＧａｌＤＧ）、グルコシル
セラミド（ＧｌｃＣｅｒ）、グロボテトラオシルセラミ
ド（Ｇｂ４Ｃｅｒ）、ガングリオトリアオシルセラミド
（Ｇｇ３Ｃｅｒ）、ガングリオテトラオシルセラミド
（Ｇｇ４Ｃｅｒ）、ネオラクトテトラオシルセラミド
（ｎＬｃ４Ｃｅｒ）に反応し、グロボトリアオシルセラ
ミド（Ｇｂ３Ｃｅｒ）、ガラクトース、ラクトースに反
応しない。
【００１６】３．至適ｐＨ及び安定ｐＨ 至適ｐＨは約７．０、安定ｐＨは６．０〜８．０。 ４．至適温度及び安定温度 至適温度は約３７℃であり、８０℃まで安定である。 ５．分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）により約５４ｋＤａで
ある。
ある。
【００１７】また、硫酸基転移酵素活性の測定方法とし
ては、アナリティカル バイオケミストリー(Analytica
l Biochemistry) 、第１８２巻、第９−１５頁（１９８
９）に記載の方法を若干修正した方法が挙げられる。す
なわち、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒ、０．５μｍｏｌの
ＭｎＣｌ2 、１ｎｍｏｌの〔35Ｓ〕ＰＡＰＳ（１００ｃ
ｐｍ／ｐｍｏｌ）、０．５ｍｇのＬｕｂｒｏｌ ＰＸ、
１２．５ｎｍｏｌのジチオスレイトール、０．２５μｍ
ｏｌのＮａＦ、０．１μｍｏｌのＡＴＰ、２０μｇのＢ
ＳＡ、および２５ｍＭのカコジル酸Ｎａ−ＨＣｌ、ｐＨ
６．５中の２０ｎｇの酵素タンパク質を含む反応混合液
を、全量５０μｌに調製する。該混合液を３７℃で３０
分間インキュベートした後、１ｍｌのクロロホルム／メ
タノール／水（３０：６０：８）で反応を停止する。Ｄ
ＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を用いて反応生成物を
単離し、液体シンチレーションカウンターを使用して放
射活性を測定する。１ユニットの活性は、前記測定条件
下で、１分間に１μｍｏｌの硫酸基を転移する酵素の量
として定義する。該方法により測定した場合、１×１０
-7ミリユニット以上の活性を示すものを、硫酸基転移酵
素活性を有するものと判定する。
ては、アナリティカル バイオケミストリー(Analytica
l Biochemistry) 、第１８２巻、第９−１５頁（１９８
９）に記載の方法を若干修正した方法が挙げられる。す
なわち、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒ、０．５μｍｏｌの
ＭｎＣｌ2 、１ｎｍｏｌの〔35Ｓ〕ＰＡＰＳ（１００ｃ
ｐｍ／ｐｍｏｌ）、０．５ｍｇのＬｕｂｒｏｌ ＰＸ、
１２．５ｎｍｏｌのジチオスレイトール、０．２５μｍ
ｏｌのＮａＦ、０．１μｍｏｌのＡＴＰ、２０μｇのＢ
ＳＡ、および２５ｍＭのカコジル酸Ｎａ−ＨＣｌ、ｐＨ
６．５中の２０ｎｇの酵素タンパク質を含む反応混合液
を、全量５０μｌに調製する。該混合液を３７℃で３０
分間インキュベートした後、１ｍｌのクロロホルム／メ
タノール／水（３０：６０：８）で反応を停止する。Ｄ
ＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を用いて反応生成物を
単離し、液体シンチレーションカウンターを使用して放
射活性を測定する。１ユニットの活性は、前記測定条件
下で、１分間に１μｍｏｌの硫酸基を転移する酵素の量
として定義する。該方法により測定した場合、１×１０
-7ミリユニット以上の活性を示すものを、硫酸基転移酵
素活性を有するものと判定する。
【００１８】本発明において遺伝子とは、前記硫酸基転
移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子又
は該遺伝子を含む遺伝子である。具体的には配列表の配
列番号：１に記載のアミノ酸配列又はその一部からなる
ポリペプチドをコードする遺伝子または配列表の配列番
号：２に記載の塩基配列又はその一部からなる遺伝子が
挙げられる。このように、配列番号：１に記載のアミノ
酸配列の一部からなるポリペプチドをコードする遺伝子
または配列番号：２に記載の塩基配列の一部からなる遺
伝子であっても、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子であるかぎり本発明の範囲内で
ある。これらは、ヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３由来の
３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート：
ＧａｌＣｅｒスルホトランスフェラーゼ〔ＥＣ２．８．
２．１１〕の遺伝子であるが、本発明においてはこれら
に限定されるものではなく、同様の硫酸基転移酵素活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかぎり
その他のヒト組織由来の遺伝子はもちろん、細菌類、酵
母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来の
遺伝子、あるいは植物、動物由来の遺伝子も含まれる。
さらに、機能的に同様の硫酸基転移酵素活性を有するポ
リペプチドをコードする、前記遺伝子の変異体が挙げら
れる。例えば、配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸
配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付
加、挿入又は置換されているポリペプチドをコードする
遺伝子であっても、硫酸基転移酵素活性を有するポリペ
プチドをコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。
このように天然から単離された遺伝子のみならず人為的
に調製された遺伝子であっても硫酸基転移酵素活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子であるかぎり本発
明に含まれる。
移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子又
は該遺伝子を含む遺伝子である。具体的には配列表の配
列番号：１に記載のアミノ酸配列又はその一部からなる
ポリペプチドをコードする遺伝子または配列表の配列番
号：２に記載の塩基配列又はその一部からなる遺伝子が
挙げられる。このように、配列番号：１に記載のアミノ
酸配列の一部からなるポリペプチドをコードする遺伝子
または配列番号：２に記載の塩基配列の一部からなる遺
伝子であっても、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子であるかぎり本発明の範囲内で
ある。これらは、ヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３由来の
３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート：
ＧａｌＣｅｒスルホトランスフェラーゼ〔ＥＣ２．８．
２．１１〕の遺伝子であるが、本発明においてはこれら
に限定されるものではなく、同様の硫酸基転移酵素活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかぎり
その他のヒト組織由来の遺伝子はもちろん、細菌類、酵
母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来の
遺伝子、あるいは植物、動物由来の遺伝子も含まれる。
さらに、機能的に同様の硫酸基転移酵素活性を有するポ
リペプチドをコードする、前記遺伝子の変異体が挙げら
れる。例えば、配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸
配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付
加、挿入又は置換されているポリペプチドをコードする
遺伝子であっても、硫酸基転移酵素活性を有するポリペ
プチドをコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。
このように天然から単離された遺伝子のみならず人為的
に調製された遺伝子であっても硫酸基転移酵素活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子であるかぎり本発
明に含まれる。
【００１９】また、本発明の遺伝子とストリンジェント
な条件下でハイブリダイズすることができ、かつ硫酸基
転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
も本発明の遺伝子に含まれる。
な条件下でハイブリダイズすることができ、かつ硫酸基
転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
も本発明の遺伝子に含まれる。
【００２０】ここで、「ストリンジェントな条件下」と
は、例えば以下の条件を言う。すなわち、０．５％ＳＤ
Ｓ、５×デンハルツ［Denhardt's、０．１％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、
０．１％フィコール４００］及び１００μｇ／ｍｌサケ
精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ
７．０）中で、５０℃で４時間〜一晩保温を行う条件を
言う。
は、例えば以下の条件を言う。すなわち、０．５％ＳＤ
Ｓ、５×デンハルツ［Denhardt's、０．１％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、
０．１％フィコール４００］及び１００μｇ／ｍｌサケ
精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ
７．０）中で、５０℃で４時間〜一晩保温を行う条件を
言う。
【００２１】本発明において、組換えＤＮＡとは、遺伝
子工学的手法により、本発明の遺伝子を含んで得られる
ＤＮＡである。
子工学的手法により、本発明の遺伝子を含んで得られる
ＤＮＡである。
【００２２】本発明において、発現ベクターとは、前記
組換えＤＮＡを挿入され、所望の宿主細胞で発現するよ
うに構築されたベクターである。また、後述のアンチセ
ンスＤＮＡを挿入したベクターも本発明の発現ベクター
に含まれる。挿入されるベクターとしては、プラスミド
ベクター、ファージベクターいずれでも構わない。プラ
スミドベクターとしてはｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＴ７などの市販品が好適に使用
でき、ファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ
１１等のラムダファージベクターなどの市販品が好適に
使用できるが、これらに限定されるものではない。宿主
細胞としては、微生物、動物細胞又は植物細胞が挙げら
れ、用いる発現ベクターに応じて、適宜選ばれる。
組換えＤＮＡを挿入され、所望の宿主細胞で発現するよ
うに構築されたベクターである。また、後述のアンチセ
ンスＤＮＡを挿入したベクターも本発明の発現ベクター
に含まれる。挿入されるベクターとしては、プラスミド
ベクター、ファージベクターいずれでも構わない。プラ
スミドベクターとしてはｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＴ７などの市販品が好適に使用
でき、ファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ
１１等のラムダファージベクターなどの市販品が好適に
使用できるが、これらに限定されるものではない。宿主
細胞としては、微生物、動物細胞又は植物細胞が挙げら
れ、用いる発現ベクターに応じて、適宜選ばれる。
【００２３】本発明において、形質転換体とは、前記発
現ベクターを前記宿主細胞に導入されて得られた、本発
明の遺伝子を発現する細胞である。発現ベクターを導入
する方法としては、例えば、モレキュラー クローニン
グア ラボラトリー マニュアル［Molecular Cloning,
A Laboratory Manual、Ｔ．マニアティス(T. Maniati
s) 他著、コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー(Cold Spring Harbor Laboratory) 、１９８２年発
行］、第２４９−２５４頁に記載の方法を用いることが
できる。次に、目的の遺伝子を発現する形質転換体を選
択するためには、発現ベクターの特性を利用する。例え
ばプラスミドベクターがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで、大
腸菌を宿主細胞とする場合、アンピシリンを含むプレー
ト上でアンピシリン耐性を有するコロニーを、あるいは
アンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）及びイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を
含むプレート上で、アンピシリン耐性を示し、かつ、白
色を呈するコロニーを選択することにより外来遺伝子を
導入されたコロニーを選別する。
現ベクターを前記宿主細胞に導入されて得られた、本発
明の遺伝子を発現する細胞である。発現ベクターを導入
する方法としては、例えば、モレキュラー クローニン
グア ラボラトリー マニュアル［Molecular Cloning,
A Laboratory Manual、Ｔ．マニアティス(T. Maniati
s) 他著、コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー(Cold Spring Harbor Laboratory) 、１９８２年発
行］、第２４９−２５４頁に記載の方法を用いることが
できる。次に、目的の遺伝子を発現する形質転換体を選
択するためには、発現ベクターの特性を利用する。例え
ばプラスミドベクターがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで、大
腸菌を宿主細胞とする場合、アンピシリンを含むプレー
ト上でアンピシリン耐性を有するコロニーを、あるいは
アンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）及びイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を
含むプレート上で、アンピシリン耐性を示し、かつ、白
色を呈するコロニーを選択することにより外来遺伝子を
導入されたコロニーを選別する。
【００２４】本発明は、本発明の遺伝子が発現され、該
遺伝子がコードするポリペプチドが生産されるような条
件下で前記形質転換体を培養することにより、該培養物
から硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造す
る方法を提供する。
遺伝子がコードするポリペプチドが生産されるような条
件下で前記形質転換体を培養することにより、該培養物
から硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造す
る方法を提供する。
【００２５】目的の硫酸基転移酵素の発現が認められた
場合は、その形質転換体の培養における培地組成、培地
のｐＨ、培養温度、インデューサーの使用量・使用時
期、培養時間等の条件が硫酸基転移酵素発現の最適条件
を満たすように決定することにより、効率よく硫酸基転
移酵素を生産させることができる。
場合は、その形質転換体の培養における培地組成、培地
のｐＨ、培養温度、インデューサーの使用量・使用時
期、培養時間等の条件が硫酸基転移酵素発現の最適条件
を満たすように決定することにより、効率よく硫酸基転
移酵素を生産させることができる。
【００２６】形質転換体の培養物から硫酸基転移酵素を
精製するには、公知の方法が用いられる。形質転換体が
大腸菌のように細胞内に発現産物を蓄積させる場合は、
培養終了後遠心分離によって該形質転換体を集め、これ
を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離等によ
り、無細胞抽出液を得る。塩析あるいは、イオン交換、
ゲル濾過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグ
ラフィー等の通常のタンパク質精製法により、該抽出液
から目的の硫酸基転移酵素を精製することができる。用
いる宿主−ベクター系によっては発現産物が形質転換体
外に分泌される場合がある。この場合は培養上清から同
様に精製を行えばよい。
精製するには、公知の方法が用いられる。形質転換体が
大腸菌のように細胞内に発現産物を蓄積させる場合は、
培養終了後遠心分離によって該形質転換体を集め、これ
を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離等によ
り、無細胞抽出液を得る。塩析あるいは、イオン交換、
ゲル濾過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグ
ラフィー等の通常のタンパク質精製法により、該抽出液
から目的の硫酸基転移酵素を精製することができる。用
いる宿主−ベクター系によっては発現産物が形質転換体
外に分泌される場合がある。この場合は培養上清から同
様に精製を行えばよい。
【００２７】用いる宿主−ベクター系によっては、形質
転換体中で発現されたポリペプチドが不溶物（封入体）
として蓄積される場合がある。この場合は、この不溶物
を回収し、穏和な条件、例えば、尿素等の変性剤で可溶
化した後に、変性剤を除くことによって活性を回復させ
ることができる。
転換体中で発現されたポリペプチドが不溶物（封入体）
として蓄積される場合がある。この場合は、この不溶物
を回収し、穏和な条件、例えば、尿素等の変性剤で可溶
化した後に、変性剤を除くことによって活性を回復させ
ることができる。
【００２８】形質転換体が産生する外因性の硫酸基転移
酵素は、宿主細胞内で内因性の種々の硫酸基転移酵素と
共存するが、その量が内因性の硫酸基転移酵素の量に比
べ過剰であるので、その精製は極めて容易である。ま
た、硫酸基転移酵素が形質転換体外に分泌される場合
は、培地成分等が共存するが、これらは通常硫酸基転移
酵素の精製の妨げとなるようなタンパク質成分をほとん
ど含まないため、その精製には、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞か
らの硫酸基転移酵素の精製と比べ、煩雑な分離操作を必
要としない利点がある。
酵素は、宿主細胞内で内因性の種々の硫酸基転移酵素と
共存するが、その量が内因性の硫酸基転移酵素の量に比
べ過剰であるので、その精製は極めて容易である。ま
た、硫酸基転移酵素が形質転換体外に分泌される場合
は、培地成分等が共存するが、これらは通常硫酸基転移
酵素の精製の妨げとなるようなタンパク質成分をほとん
ど含まないため、その精製には、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞か
らの硫酸基転移酵素の精製と比べ、煩雑な分離操作を必
要としない利点がある。
【００２９】また、真核生物由来の硫酸基転移酵素の場
合、酵素自身に糖鎖を有している可能性があり、宿主細
胞として糖鎖生合成能力を持たない細胞、例えば、大腸
菌、枯草菌、放線菌のような原核生物、あるいは酵母、
真菌、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞の糖鎖生合成能
力を失った変異細胞を用いることによって、糖鎖を持た
ない硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造す
ることができる。更に、酵素自身に糖鎖を付加させるこ
とも可能であり、この場合は、宿主細胞として、糖鎖生
合成能力を有する細胞、例えば、酵母、真菌、動物細
胞、昆虫細胞及び植物細胞を用いることによって、糖鎖
を持つ硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造
することができる。
合、酵素自身に糖鎖を有している可能性があり、宿主細
胞として糖鎖生合成能力を持たない細胞、例えば、大腸
菌、枯草菌、放線菌のような原核生物、あるいは酵母、
真菌、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞の糖鎖生合成能
力を失った変異細胞を用いることによって、糖鎖を持た
ない硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造す
ることができる。更に、酵素自身に糖鎖を付加させるこ
とも可能であり、この場合は、宿主細胞として、糖鎖生
合成能力を有する細胞、例えば、酵母、真菌、動物細
胞、昆虫細胞及び植物細胞を用いることによって、糖鎖
を持つ硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造
することができる。
【００３０】本発明のポリペプチドとは、前記の本発明
の遺伝子によりコードされ、かつ硫酸基転移酵素活性を
有するポリペプチドであり、前記のような各種の物理化
学的性質を有するものが挙げられる。具体的には、天然
型の硫酸基転移酵素である配列番号：１に記載のアミノ
酸配列を有するポリペプチド又はその一部からなるポリ
ペプチド、配列番号：１に記載のアミノ酸配列におい
て、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又
は置換されているポリペプチド等が挙げられる。
の遺伝子によりコードされ、かつ硫酸基転移酵素活性を
有するポリペプチドであり、前記のような各種の物理化
学的性質を有するものが挙げられる。具体的には、天然
型の硫酸基転移酵素である配列番号：１に記載のアミノ
酸配列を有するポリペプチド又はその一部からなるポリ
ペプチド、配列番号：１に記載のアミノ酸配列におい
て、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又
は置換されているポリペプチド等が挙げられる。
【００３１】本発明において、「アンチセンスＤＮＡ」
及び「アンチセンスＲＮＡ」とは、本発明の硫酸基転移
酵素遺伝子又はその一部と相補的な塩基配列を有し、内
因性の硫酸基転移酵素遺伝子（ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮ
Ａ）と２本鎖を形成することによって、該遺伝子からの
遺伝子情報の発現（転写、翻訳）を抑制又は制御するも
のを言う。アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ
の長さは、塩基配列の特異性や細胞内に導入する方法に
応じて変えることが可能である。アンチセンスＤＮＡ又
はアンチセンスＲＮＡは、合成機を用いて人工的に合成
したり、通常と逆の向き（アンチセンスの向き）に遺伝
子を発現させること等により、作製することが可能であ
る。例えば、ｔａｔ遺伝子［ヌクレイック アシドズ
リサーチ（Nucleic Acids Research) 、第１９巻、第３
３５９−３３６８頁（１９９１）］、あるいはｒｅｖ遺
伝子［プロシーディングス オブ ザ ナショナル ア
カデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ(P
roceedings of the National Academy of Sciences of
the USA)、第８６巻、第４２４４−４２４８頁（１９８
９）］のＨＩＶの増殖抑制に関するもの等、アンチセン
ス技術は数多く知られており、従って、これらの方法に
より、本発明のアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲ
ＮＡを用いて、内因性の硫酸基転移酵素遺伝子の発現を
抑制又は制御することが可能である。また、本発明のア
ンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、in situ
ハイブリダイゼーション等の研究試薬として利用可能で
ある。
及び「アンチセンスＲＮＡ」とは、本発明の硫酸基転移
酵素遺伝子又はその一部と相補的な塩基配列を有し、内
因性の硫酸基転移酵素遺伝子（ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮ
Ａ）と２本鎖を形成することによって、該遺伝子からの
遺伝子情報の発現（転写、翻訳）を抑制又は制御するも
のを言う。アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ
の長さは、塩基配列の特異性や細胞内に導入する方法に
応じて変えることが可能である。アンチセンスＤＮＡ又
はアンチセンスＲＮＡは、合成機を用いて人工的に合成
したり、通常と逆の向き（アンチセンスの向き）に遺伝
子を発現させること等により、作製することが可能であ
る。例えば、ｔａｔ遺伝子［ヌクレイック アシドズ
リサーチ（Nucleic Acids Research) 、第１９巻、第３
３５９−３３６８頁（１９９１）］、あるいはｒｅｖ遺
伝子［プロシーディングス オブ ザ ナショナル ア
カデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ(P
roceedings of the National Academy of Sciences of
the USA)、第８６巻、第４２４４−４２４８頁（１９８
９）］のＨＩＶの増殖抑制に関するもの等、アンチセン
ス技術は数多く知られており、従って、これらの方法に
より、本発明のアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲ
ＮＡを用いて、内因性の硫酸基転移酵素遺伝子の発現を
抑制又は制御することが可能である。また、本発明のア
ンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、in situ
ハイブリダイゼーション等の研究試薬として利用可能で
ある。
【００３２】本発明において、合成オリゴヌクレオチド
プローブ又はプライマーとは、前記遺伝子に特異的にハ
イブリダイズするものである。該オリゴヌクレオチドプ
ローブ又はプライマーは、通常、合成機を用いて人工的
に合成したり、ＰＣＲ法により作製することができる。
プローブ又はプライマーとは、前記遺伝子に特異的にハ
イブリダイズするものである。該オリゴヌクレオチドプ
ローブ又はプライマーは、通常、合成機を用いて人工的
に合成したり、ＰＣＲ法により作製することができる。
【００３３】本発明において、抗体又はその断片とは、
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその
断片であれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル
抗体のいずれでも構わない。本発明の抗体は、例えば、
カレント プロトコルズ イン イムノロジー〔Curren
t Protocols in Immunology 、ジョン Ｅ．コリガン
（John E.Coligan) 編集、ジョン ウィリー＆ソンズ
（John Wiley & Sons, Inc.)、１９９２年発行〕に記載
の方法により、本発明のポリペプチドの全部又は一部を
用いてウサギやマウス等を免疫することにより、容易に
作製され得る。これらの抗体を精製後、ペプチダーゼ等
により処理することにより、抗体の断片が得られる。得
られた抗体又はその断片の用途としては、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニング、医薬・診断薬・研究用試薬等が挙げられる。
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその
断片であれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル
抗体のいずれでも構わない。本発明の抗体は、例えば、
カレント プロトコルズ イン イムノロジー〔Curren
t Protocols in Immunology 、ジョン Ｅ．コリガン
（John E.Coligan) 編集、ジョン ウィリー＆ソンズ
（John Wiley & Sons, Inc.)、１９９２年発行〕に記載
の方法により、本発明のポリペプチドの全部又は一部を
用いてウサギやマウス等を免疫することにより、容易に
作製され得る。これらの抗体を精製後、ペプチダーゼ等
により処理することにより、抗体の断片が得られる。得
られた抗体又はその断片の用途としては、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニング、医薬・診断薬・研究用試薬等が挙げられる。
【００３４】次に、ウロロジカル リサーチ（Urologic
al Research ）、第１７巻、第３１７−３２４頁（１９
８９）記載のヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３を用い、該Ｓ
ＭＫＴ−Ｒ３細胞由来の硫酸基転移酵素を一例にして、
本発明について更に詳しく説明する。まず、本発明の硫
酸基転移酵素は、ジャーナル オブ バイオケミストリ
ー、第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９
６）に記載の方法に従って、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞を大量
に培養し、ついでその培養細胞から硫酸基転移酵素を単
離精製する。具体的には、以下の方法が挙げられる。
al Research ）、第１７巻、第３１７−３２４頁（１９
８９）記載のヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３を用い、該Ｓ
ＭＫＴ−Ｒ３細胞由来の硫酸基転移酵素を一例にして、
本発明について更に詳しく説明する。まず、本発明の硫
酸基転移酵素は、ジャーナル オブ バイオケミストリ
ー、第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９
６）に記載の方法に従って、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞を大量
に培養し、ついでその培養細胞から硫酸基転移酵素を単
離精製する。具体的には、以下の方法が挙げられる。
【００３５】ＥＧＦで処理したＳＭＫＴ−Ｒ３細胞（約
１×１０10個）を集め、ＰＢＳで洗浄後、使用するまで
−８０℃で保存する。約２．５×１０9 個の細胞を融解
し、細胞と等容量のＴＢＳに懸濁し、ポッター型ホモジ
ナイザーで短時間でホモジナイズする。ホモジネートに
等容量の２×溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２ｍＭβ−メ
ルカプトエタノール、２％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、４０％グ
リセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよび０．０２ｍＭ
Ｅ−６４）を加え、氷上で１０分間超音波処理する。
遠心分離後、得られる上清をバッファーＡ（１０ｍＭト
リエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリ
セロールおよび５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）に対して透析す
る。
１×１０10個）を集め、ＰＢＳで洗浄後、使用するまで
−８０℃で保存する。約２．５×１０9 個の細胞を融解
し、細胞と等容量のＴＢＳに懸濁し、ポッター型ホモジ
ナイザーで短時間でホモジナイズする。ホモジネートに
等容量の２×溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２ｍＭβ−メ
ルカプトエタノール、２％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、４０％グ
リセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよび０．０２ｍＭ
Ｅ−６４）を加え、氷上で１０分間超音波処理する。
遠心分離後、得られる上清をバッファーＡ（１０ｍＭト
リエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリ
セロールおよび５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）に対して透析す
る。
【００３６】透析した材料を遠心分離して、透析中に生
じた沈殿物を除去する。上清をＤＥ−５２カラムにアプ
ライし、バッファーＢ（１０ｍＭトリエタノールアミン
−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、
１０％グリセロールおよび５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）で予め
平衡化させておいたヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカ
ラムに、直接出口を接続させる。次いで、溶出液の２８
０ｎｍにおける吸光度が０．０２未満になるまで、バッ
ファーＢでカラムを洗浄する。ＤＥ−５２カラムの接続
を外した後、ヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム上
の酵素を、０．２ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣ（２
０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、
０．１％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、２０％グリセロールおよび
１０ｍＭＭｎＣｌ2 ）で溶出する。
じた沈殿物を除去する。上清をＤＥ−５２カラムにアプ
ライし、バッファーＢ（１０ｍＭトリエタノールアミン
−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、
１０％グリセロールおよび５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）で予め
平衡化させておいたヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカ
ラムに、直接出口を接続させる。次いで、溶出液の２８
０ｎｍにおける吸光度が０．０２未満になるまで、バッ
ファーＢでカラムを洗浄する。ＤＥ−５２カラムの接続
を外した後、ヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム上
の酵素を、０．２ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣ（２
０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、
０．１％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、２０％グリセロールおよび
１０ｍＭＭｎＣｌ2 ）で溶出する。
【００３７】ヘパリン−セファロースクロマトグラフィ
ーの酵素活性画分をプールし、バッファーＢに対して透
析する。透析液を、予めバッファーＢで平衡化させてお
いたガラクトシルスフィンゴシン（ＧａｌＳｐｈ）−セ
ファロースカラムにアプライする。次いで、溶出液が実
質的にタンパク質を含まなくなるまで、バッファーＢで
カラムを洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌを含むバッファー
Ｃで、硫酸基転移酵素を溶出させる。
ーの酵素活性画分をプールし、バッファーＢに対して透
析する。透析液を、予めバッファーＢで平衡化させてお
いたガラクトシルスフィンゴシン（ＧａｌＳｐｈ）−セ
ファロースカラムにアプライする。次いで、溶出液が実
質的にタンパク質を含まなくなるまで、バッファーＢで
カラムを洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌを含むバッファー
Ｃで、硫酸基転移酵素を溶出させる。
【００３８】ＧａｌＳｐｈ−セファロースカラムの溶出
画分をプールし、１０％グリセロールを含む１０ｍＭト
リエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して透
析する。予めバッファーＤ（１０ｍＭトリエタノールア
ミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰ
Ｘおよび１０％グリセロール）で平衡化させておいたＨ
ｉＴｒａｐ ３’，５’−ビスホスホアデノシン（ＰＡ
Ｐ）カラムに直接接続したピリドキサル５’−ホスフェ
ート（ＰＬＰ）−セファロースカラムに、透析液をアプ
ライする。溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなる
まで、バッファーＤとバッファーＢで連続してカラムを
洗浄し、バッファーＤ中０〜０．３ｍＭのＰＡＰの直線
グラジエントで、硫酸基転移酵素を溶出させる。
画分をプールし、１０％グリセロールを含む１０ｍＭト
リエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して透
析する。予めバッファーＤ（１０ｍＭトリエタノールア
ミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰ
Ｘおよび１０％グリセロール）で平衡化させておいたＨ
ｉＴｒａｐ ３’，５’−ビスホスホアデノシン（ＰＡ
Ｐ）カラムに直接接続したピリドキサル５’−ホスフェ
ート（ＰＬＰ）−セファロースカラムに、透析液をアプ
ライする。溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなる
まで、バッファーＤとバッファーＢで連続してカラムを
洗浄し、バッファーＤ中０〜０．３ｍＭのＰＡＰの直線
グラジエントで、硫酸基転移酵素を溶出させる。
【００３９】ＨｉＴｒａｐ ＰＡＰクロマトグラフィー
の酵素活性画分をプールし、予めバッファーＤで平衡化
させておいた第２のヘパリン−セファロースカラムクロ
マトグラフィーに直接供する。バッファーＤでカラムを
洗浄後、０．３ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで、
０．３ｍｌの画分で本発明の硫酸基転移酵素を溶出させ
る。この工程により、酵素調製品は初期体積の約１／５
に濃縮される。前記クロマトグラフィー由来の酵素調製
品に含まれるＰＡＰは、フロースルー画分に回収され
る。精製酵素活性画分をプールし、２０％のグリセロー
ルの存在下、−８０℃で保存される。
の酵素活性画分をプールし、予めバッファーＤで平衡化
させておいた第２のヘパリン−セファロースカラムクロ
マトグラフィーに直接供する。バッファーＤでカラムを
洗浄後、０．３ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで、
０．３ｍｌの画分で本発明の硫酸基転移酵素を溶出させ
る。この工程により、酵素調製品は初期体積の約１／５
に濃縮される。前記クロマトグラフィー由来の酵素調製
品に含まれるＰＡＰは、フロースルー画分に回収され
る。精製酵素活性画分をプールし、２０％のグリセロー
ルの存在下、−８０℃で保存される。
【００４０】次に、精製された硫酸基転移酵素につい
て、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分ア
ミノ酸配列を決定するには、例えば、精製硫酸基転移酵
素を直接常法に従ってエドマン分解法［ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー、第２５６巻、第７
９９０−７９９７頁（１９８１）］によるアミノ酸配列
分析［プロテインシーケンサ４７６Ａ、アプライド バ
イオシステムズ(AppliedBiosystems)社製］に供するこ
とにより、硫酸基転移酵素のＮ末端アミノ酸配列の１０
〜２０残基を決定する。あるいは特異性の高いタンパク
質加水分解酵素、例えば、アクロモバクター（Achromob
acter ）由来プロテアーゼＩ、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニ
ルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシ
ン等を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチ
ド断片を逆相ＨＰＬＣを用いて分離精製した後、精製ペ
プチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的
である。
て、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分ア
ミノ酸配列を決定するには、例えば、精製硫酸基転移酵
素を直接常法に従ってエドマン分解法［ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー、第２５６巻、第７
９９０−７９９７頁（１９８１）］によるアミノ酸配列
分析［プロテインシーケンサ４７６Ａ、アプライド バ
イオシステムズ(AppliedBiosystems)社製］に供するこ
とにより、硫酸基転移酵素のＮ末端アミノ酸配列の１０
〜２０残基を決定する。あるいは特異性の高いタンパク
質加水分解酵素、例えば、アクロモバクター（Achromob
acter ）由来プロテアーゼＩ、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニ
ルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシ
ン等を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチ
ド断片を逆相ＨＰＬＣを用いて分離精製した後、精製ペ
プチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的
である。
【００４１】本発明においては、Ｐ１（配列番号：
３）、Ｐ２（配列番号：４）、Ｐ３（配列番号：５）、
Ｐ４（配列番号：１１）、Ｐ５（配列番号：１２）、Ｐ
６（配列番号：１３）及びＰ７（配列番号：１４）の７
つのペプチド断片のアミノ酸配列が決定される。
３）、Ｐ２（配列番号：４）、Ｐ３（配列番号：５）、
Ｐ４（配列番号：１１）、Ｐ５（配列番号：１２）、Ｐ
６（配列番号：１３）及びＰ７（配列番号：１４）の７
つのペプチド断片のアミノ酸配列が決定される。
【００４２】こうして得られる部分アミノ酸配列に基づ
き、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子をクローニングす
る。そのためには、一般的に用いられるＰＣＲ法又はハ
イブリダイーゼーション法を利用する。ＰＣＲ法は、Ｐ
ＣＲテクノロジー［PCR Technology、エルリッヒ ＨＡ
(Erhich HA) 編集、ストックトン プレス(Stockton Pr
ess)社、１９８９年発行］に記載の方法に準じて行うこ
とができる。ハイブリダイーゼーション法は、例えばモ
レキュラー クローニング ア ラボラトリーマニュア
ル( 第２版、Ｔ．マニアティス他著、コールド スプリ
ング ハーバーラボラトリー プレス社、１９８９年発
行) に記載の方法に準じて行うことができる。
き、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子をクローニングす
る。そのためには、一般的に用いられるＰＣＲ法又はハ
イブリダイーゼーション法を利用する。ＰＣＲ法は、Ｐ
ＣＲテクノロジー［PCR Technology、エルリッヒ ＨＡ
(Erhich HA) 編集、ストックトン プレス(Stockton Pr
ess)社、１９８９年発行］に記載の方法に準じて行うこ
とができる。ハイブリダイーゼーション法は、例えばモ
レキュラー クローニング ア ラボラトリーマニュア
ル( 第２版、Ｔ．マニアティス他著、コールド スプリ
ング ハーバーラボラトリー プレス社、１９８９年発
行) に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４３】しかしながら、本発明の硫酸基転移酵素遺
伝子は、以下のような混合プライマー（配列番号：２２
〜２７）を用いるＰＣＲ法（ＭＯＰＡＣ法）、イノシン
を含む混合プライマー（配列番号：２８〜３３）を用い
るＭＯＰＡＣ法及び合成オリゴヌクレオチド（配列番
号：２２、２４）を用いるハイブリダイゼーション法を
試みたが、クローニングすることができなかった。
伝子は、以下のような混合プライマー（配列番号：２２
〜２７）を用いるＰＣＲ法（ＭＯＰＡＣ法）、イノシン
を含む混合プライマー（配列番号：２８〜３３）を用い
るＭＯＰＡＣ法及び合成オリゴヌクレオチド（配列番
号：２２、２４）を用いるハイブリダイゼーション法を
試みたが、クローニングすることができなかった。
【００４４】１）混合プライマーを用いるＰＣＲ法（Ｍ
ＯＰＡＣ法） この方法は、決定されたアミノ酸配列のうち縮重性の低
い領域を２カ所選択し、縮重コドンに対して可能性のあ
る全ての塩基配列の組み合わせを合成し、混合プライマ
ーとしＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片を増幅するクロ
ーニング方法である。この方法により、尿酸酸化酵素を
コードする遺伝子はクローニングされている〔サイエン
ス、第２３９巻、第１２８８−１２９１頁（１９８
８）〕。本発明者らもこの方法に従って、本発明の硫酸
基転移酵素の取得を試みた。
ＯＰＡＣ法） この方法は、決定されたアミノ酸配列のうち縮重性の低
い領域を２カ所選択し、縮重コドンに対して可能性のあ
る全ての塩基配列の組み合わせを合成し、混合プライマ
ーとしＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片を増幅するクロ
ーニング方法である。この方法により、尿酸酸化酵素を
コードする遺伝子はクローニングされている〔サイエン
ス、第２３９巻、第１２８８−１２９１頁（１９８
８）〕。本発明者らもこの方法に従って、本発明の硫酸
基転移酵素の取得を試みた。
【００４５】部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）か
ら合成オリゴヌクレオチドＳ１（配列番号：２２）と合
成オリゴヌクレオチドＡ１（配列番号：２３）を、部分
アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴヌク
レオチドＳ２（配列番号：２４）と合成オリゴヌクレオ
チドＡ２（配列番号：２５）を、部分アミノ酸配列Ｐ３
（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチドＳ３（配
列番号：２６）と合成オリゴヌクレオチドＡ３（配列番
号：２７）をそれぞれ合成し、これらを混合プライマー
として用い、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型とした
ＰＣＲを常法に従い行った。
ら合成オリゴヌクレオチドＳ１（配列番号：２２）と合
成オリゴヌクレオチドＡ１（配列番号：２３）を、部分
アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴヌク
レオチドＳ２（配列番号：２４）と合成オリゴヌクレオ
チドＡ２（配列番号：２５）を、部分アミノ酸配列Ｐ３
（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチドＳ３（配
列番号：２６）と合成オリゴヌクレオチドＡ３（配列番
号：２７）をそれぞれ合成し、これらを混合プライマー
として用い、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型とした
ＰＣＲを常法に従い行った。
【００４６】得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気
泳動で分離した結果、複数のＤＮＡ断片が増幅されたの
で、それぞれ別々にゲルから切り出し、抽出し、プラス
ミドベクターに組み込んだ後、塩基配列を常法（ジデオ
キシ チェーン ターミネーター法）に従い決定した
が、混合プライマーとして用いた合成オリゴヌクレオチ
ドの塩基配列以外に目的の硫酸基転移酵素遺伝子と考え
られる配列は見出すことができなかった。
泳動で分離した結果、複数のＤＮＡ断片が増幅されたの
で、それぞれ別々にゲルから切り出し、抽出し、プラス
ミドベクターに組み込んだ後、塩基配列を常法（ジデオ
キシ チェーン ターミネーター法）に従い決定した
が、混合プライマーとして用いた合成オリゴヌクレオチ
ドの塩基配列以外に目的の硫酸基転移酵素遺伝子と考え
られる配列は見出すことができなかった。
【００４７】２）イノシンを用いるＭＯＰＡＣ法 １）と方法はほぼ類似しているが、混合プライマーの組
み合わせ数を減少させるため、縮重性の高いコドンの３
番目をイノシンに置換したプライマーを用いる〔ヌクレ
イック アシドズ リサーチ、第１６巻、第２２号、第
１０９３２頁（１９８８）〕。
み合わせ数を減少させるため、縮重性の高いコドンの３
番目をイノシンに置換したプライマーを用いる〔ヌクレ
イック アシドズ リサーチ、第１６巻、第２２号、第
１０９３２頁（１９８８）〕。
【００４８】部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）か
ら合成オリゴヌクレオチドＳＩ１（配列番号：２８）と
合成オリゴヌクレオチドＡＩ１（配列番号：２９）を、
部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴ
ヌクレオチドＳＩ２（配列番号：３０）と合成オリゴヌ
クレオチドＡＩ２（配列番号：３１）を、部分アミノ酸
配列Ｐ３（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチド
ＳＩ３（配列番号：３２）と合成オリゴヌクレオチドＡ
Ｉ３（配列番号：３３）をそれぞれ合成し、これらをイ
ノシン含有混合プライマーとして用い、ＳＭＫＴ−Ｒ３
細胞ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを常法に従い行った。
ら合成オリゴヌクレオチドＳＩ１（配列番号：２８）と
合成オリゴヌクレオチドＡＩ１（配列番号：２９）を、
部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴ
ヌクレオチドＳＩ２（配列番号：３０）と合成オリゴヌ
クレオチドＡＩ２（配列番号：３１）を、部分アミノ酸
配列Ｐ３（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチド
ＳＩ３（配列番号：３２）と合成オリゴヌクレオチドＡ
Ｉ３（配列番号：３３）をそれぞれ合成し、これらをイ
ノシン含有混合プライマーとして用い、ＳＭＫＴ−Ｒ３
細胞ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを常法に従い行った。
【００４９】得られたＰＣＲ産物の塩基配列を上述の方
法と同様に決定したが、イノシン含有混合プライマーと
して用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列以外に目
的の遺伝子と考えられる配列は見出すことができなかっ
た。
法と同様に決定したが、イノシン含有混合プライマーと
して用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列以外に目
的の遺伝子と考えられる配列は見出すことができなかっ
た。
【００５０】３）合成オリゴヌクレオチドを用いたハイ
ブリダイゼーション法 アミノ酸配列の情報をもとに、常法に従って合成オリゴ
ヌクレオチドをデザインし、ハイブリダイゼーションに
よって目的のＤＮＡをクローニングする方法も一般的に
用いられる。本発明者らもこの方法に従って本発明の硫
酸基転移酵素遺伝子の検出を試みた。
ブリダイゼーション法 アミノ酸配列の情報をもとに、常法に従って合成オリゴ
ヌクレオチドをデザインし、ハイブリダイゼーションに
よって目的のＤＮＡをクローニングする方法も一般的に
用いられる。本発明者らもこの方法に従って本発明の硫
酸基転移酵素遺伝子の検出を試みた。
【００５１】部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）か
ら合成オリゴヌクレオチドＳ１（配列番号：２２）を、
部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴ
ヌクレオチドＳ２（配列番号：２４）を合成し、プラー
クハイブリダイゼーション用のプローブとして用いた。
ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを、常法に従いファージベ
クターに組み込んでｃＤＮＡライブラリーを作製した。
このｃＤＮＡライブラリーをプレートにまき、得られた
プラークをナイロン膜にブロッティングした。ハイブリ
ダイゼーションは一般的に用いられる条件で行った。
ら合成オリゴヌクレオチドＳ１（配列番号：２２）を、
部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴ
ヌクレオチドＳ２（配列番号：２４）を合成し、プラー
クハイブリダイゼーション用のプローブとして用いた。
ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを、常法に従いファージベ
クターに組み込んでｃＤＮＡライブラリーを作製した。
このｃＤＮＡライブラリーをプレートにまき、得られた
プラークをナイロン膜にブロッティングした。ハイブリ
ダイゼーションは一般的に用いられる条件で行った。
【００５２】その結果、プローブとして用いた合成オリ
ゴヌクレオチドＳ１及びＳ２のどちらの場合にも複数の
陽性プラークが検出されたが、これら陽性プラークのフ
ァージベクターに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を常
法に従い決定したところ、プローブとして用いた合成オ
リゴヌクレオチドの塩基配列にホモロジーを示す配列は
得られたが、ファージベクターに挿入されたＤＮＡ断片
の塩基配列から決定したアミノ酸配列は上記の部分アミ
ノ酸配列とのホモロジーはなく、目的の硫酸基転移酵素
遺伝子と考えられる配列を見出すことができなかった。
ゴヌクレオチドＳ１及びＳ２のどちらの場合にも複数の
陽性プラークが検出されたが、これら陽性プラークのフ
ァージベクターに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を常
法に従い決定したところ、プローブとして用いた合成オ
リゴヌクレオチドの塩基配列にホモロジーを示す配列は
得られたが、ファージベクターに挿入されたＤＮＡ断片
の塩基配列から決定したアミノ酸配列は上記の部分アミ
ノ酸配列とのホモロジーはなく、目的の硫酸基転移酵素
遺伝子と考えられる配列を見出すことができなかった。
【００５３】以上に述べたように、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞
ｃＤＮＡから本発明の硫酸基転移酵素遺伝子をクローニ
ングすることは非常に難しい。硫酸基転移酵素遺伝子は
Ｇ＋Ｃ含量が高いため二次構造を取りやすく、それゆえ
ポリメラーゼ反応の進行が阻害されたり非特異的なアニ
ーリングが起こるなどして、ＰＣＲ法において非特異的
ＤＮＡ断片の増幅が起こる可能性が考えられる。本発明
者らはこれらの点を考慮し鋭意検討を重ねた結果、アミ
ノ酸配列の判明している一つのペプチド断片に対応する
短い遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅することにした。
ｃＤＮＡから本発明の硫酸基転移酵素遺伝子をクローニ
ングすることは非常に難しい。硫酸基転移酵素遺伝子は
Ｇ＋Ｃ含量が高いため二次構造を取りやすく、それゆえ
ポリメラーゼ反応の進行が阻害されたり非特異的なアニ
ーリングが起こるなどして、ＰＣＲ法において非特異的
ＤＮＡ断片の増幅が起こる可能性が考えられる。本発明
者らはこれらの点を考慮し鋭意検討を重ねた結果、アミ
ノ酸配列の判明している一つのペプチド断片に対応する
短い遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅することにした。
【００５４】ＰＣＲ法のプライマーとしては、混合プラ
イマーの組合わせ数を減らすためにイノシンを用いると
ともに、アミノ酸のロイシンに対しては使用頻度の高い
コドンを採用し、セリンに対するコドンの組合わせを複
数用意することにより塩基配列の縮重性を減少させたも
のを合成するのが好ましい。これにより、初めて本発明
の硫酸基転移酵素遺伝子の一部を増幅することが可能と
なる。次に、この増幅されたＰＣＲ産物をプローブとし
て、サザンハイブリダイゼーションを行うことにより、
非特異的ＤＮＡ断片の中から目的の硫酸基転移酵素遺伝
子由来のＤＮＡ断片を見出すことに成功したのである。
イマーの組合わせ数を減らすためにイノシンを用いると
ともに、アミノ酸のロイシンに対しては使用頻度の高い
コドンを採用し、セリンに対するコドンの組合わせを複
数用意することにより塩基配列の縮重性を減少させたも
のを合成するのが好ましい。これにより、初めて本発明
の硫酸基転移酵素遺伝子の一部を増幅することが可能と
なる。次に、この増幅されたＰＣＲ産物をプローブとし
て、サザンハイブリダイゼーションを行うことにより、
非特異的ＤＮＡ断片の中から目的の硫酸基転移酵素遺伝
子由来のＤＮＡ断片を見出すことに成功したのである。
【００５５】以下、より詳細に説明すれば、ＰＣＲ法の
プライマーとして新たに部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番
号：３）から合成オリゴヌクレオチド１Ｓｄ（配列番
号：６）と合成オリゴヌクレオチド１Ａ（配列番号：
７）をそれぞれ合成し、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを
鋳型としてＰＣＲを行う。
プライマーとして新たに部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番
号：３）から合成オリゴヌクレオチド１Ｓｄ（配列番
号：６）と合成オリゴヌクレオチド１Ａ（配列番号：
７）をそれぞれ合成し、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを
鋳型としてＰＣＲを行う。
【００５６】得られたＰＣＲ産物の塩基配列を、例えば
ジデオキシ チェーン ターミネーター法［プロシーデ
ィングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第７４巻、第１２
号、第５４６３−５４６７頁（１９７７）］により決定
したところ、部分アミノ酸配列Ｐ１をコードする配列が
見出され、目的の硫酸基転移酵素遺伝子の一部が得られ
る。この塩基配列を基に合成オリゴヌクレオチドＯＰ１
（配列番号：８）を合成し、この合成オリゴヌクレオチ
ドＯＰ１を常法に従い３’−末端標識し、ハイブリダイ
ゼーション用のプローブとする。
ジデオキシ チェーン ターミネーター法［プロシーデ
ィングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第７４巻、第１２
号、第５４６３−５４６７頁（１９７７）］により決定
したところ、部分アミノ酸配列Ｐ１をコードする配列が
見出され、目的の硫酸基転移酵素遺伝子の一部が得られ
る。この塩基配列を基に合成オリゴヌクレオチドＯＰ１
（配列番号：８）を合成し、この合成オリゴヌクレオチ
ドＯＰ１を常法に従い３’−末端標識し、ハイブリダイ
ゼーション用のプローブとする。
【００５７】また、ＰＣＲ法のプライマーとして新たに
部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴ
ヌクレオチド２Ｓａ（配列番号：９）と部分アミノ酸配
列Ｐ３（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチド３
Ａ（配列番号：１０）をそれぞれ合成して、ＳＭＫＴ−
Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行う。
部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴ
ヌクレオチド２Ｓａ（配列番号：９）と部分アミノ酸配
列Ｐ３（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチド３
Ａ（配列番号：１０）をそれぞれ合成して、ＳＭＫＴ−
Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行う。
【００５８】得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気
泳動で分離後、常法に従いナイロン膜にブロッティング
し（モレキュラー クローニング ア ラボラトリー
マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー プレス社、１
９８９年発行）、３’−末端標識合成オリゴヌクレオチ
ドＯＰ１を用いたハイブリダイゼーションを行う。ハイ
ブリダイゼーションは、前記したように、ストリンジェ
ントな条件下で行い、標識に応じた検出法を用いて、該
プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。
泳動で分離後、常法に従いナイロン膜にブロッティング
し（モレキュラー クローニング ア ラボラトリー
マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー プレス社、１
９８９年発行）、３’−末端標識合成オリゴヌクレオチ
ドＯＰ１を用いたハイブリダイゼーションを行う。ハイ
ブリダイゼーションは、前記したように、ストリンジェ
ントな条件下で行い、標識に応じた検出法を用いて、該
プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。
【００５９】その結果、約６００ｂｐの位置に合成オリ
ゴヌクレオチドＯＰ１とハイブリダイズするバンドを得
る。この断片の塩基配列を前記したように決定したとこ
ろ、硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番
号：３）と部分アミノ酸配列Ｐ４（配列番号：１１）に
対応する配列が見出され、目的の硫酸基転移酵素遺伝子
の一部を取得したことを確認する。
ゴヌクレオチドＯＰ１とハイブリダイズするバンドを得
る。この断片の塩基配列を前記したように決定したとこ
ろ、硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番
号：３）と部分アミノ酸配列Ｐ４（配列番号：１１）に
対応する配列が見出され、目的の硫酸基転移酵素遺伝子
の一部を取得したことを確認する。
【００６０】一方、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のｃＤＮＡ
ライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製
法は、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー
マニュアル、第２版（Ｔ．マニアティス他著、コール
ド スプリング ハーバーラボラトリー プレス社、１
９８９年発行）、第８章に記載の方法を用いることがで
きる。
ライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製
法は、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー
マニュアル、第２版（Ｔ．マニアティス他著、コール
ド スプリング ハーバーラボラトリー プレス社、１
９８９年発行）、第８章に記載の方法を用いることがで
きる。
【００６１】更に、前記約６００ｂｐのＤＮＡ断片をプ
ローブにして、前記ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングすることにより、硫酸基
転移酵素全長をコードする遺伝子をクローニングするこ
とができる。また、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のゲノムＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本
発明の硫酸基転移酵素のゲノムＤＮＡを得ることも可能
である。
ローブにして、前記ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングすることにより、硫酸基
転移酵素全長をコードする遺伝子をクローニングするこ
とができる。また、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のゲノムＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本
発明の硫酸基転移酵素のゲノムＤＮＡを得ることも可能
である。
【００６２】以上のようにして得られる、ヒト腎癌細胞
ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞の産生する硫酸基転移酵素遺伝子の
全塩基配列は、配列表の配列番号：２に記載したもので
あり、これからコードされる全アミノ酸配列は配列表の
配列番号：１に記載したものである。また、このアミノ
酸配列及び塩基配列と公知の基質特異性の異なる硫酸基
転移酵素遺伝子とはホモロジーはなく、全く新しい配列
である。
ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞の産生する硫酸基転移酵素遺伝子の
全塩基配列は、配列表の配列番号：２に記載したもので
あり、これからコードされる全アミノ酸配列は配列表の
配列番号：１に記載したものである。また、このアミノ
酸配列及び塩基配列と公知の基質特異性の異なる硫酸基
転移酵素遺伝子とはホモロジーはなく、全く新しい配列
である。
【００６３】本発明により硫酸基転移酵素遺伝子の全塩
基配列が明らかになったことで、本発明の硫酸基転移酵
素遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーショ
ン用のプローブとして用いて、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞以外
の生物体由来のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、又はゲ
ノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることにより、本発明の硫酸基転移
酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡをクローニングするこ
とができる。
基配列が明らかになったことで、本発明の硫酸基転移酵
素遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーショ
ン用のプローブとして用いて、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞以外
の生物体由来のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、又はゲ
ノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることにより、本発明の硫酸基転移
酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡをクローニングするこ
とができる。
【００６４】また、本発明の硫酸基転移酵素の塩基配列
に基づき、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることが
できる。このプライマーを用いて、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞
以外の生物体由来のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、又
はゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラ
リーから、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子と相同性の高
いＤＮＡ断片を検出したり、さらにはその全長の遺伝子
を得ることもできる。
に基づき、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることが
できる。このプライマーを用いて、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞
以外の生物体由来のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、又
はゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラ
リーから、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子と相同性の高
いＤＮＡ断片を検出したり、さらにはその全長の遺伝子
を得ることもできる。
【００６５】得られた遺伝子が目的の硫酸基転移酵素活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかど
うかを確認するには、決定された塩基配列を本発明の硫
酸基転移酵素の塩基配列又はアミノ酸配列と比較してそ
の相同性から推定することもできる。さらに、前記の測
定方法により硫酸基転移酵素活性を測定し、１×１０ -7
ミリユニット以上の活性を示すものを本発明のポリペプ
チドをコードする遺伝子として判定する。
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかど
うかを確認するには、決定された塩基配列を本発明の硫
酸基転移酵素の塩基配列又はアミノ酸配列と比較してそ
の相同性から推定することもできる。さらに、前記の測
定方法により硫酸基転移酵素活性を測定し、１×１０ -7
ミリユニット以上の活性を示すものを本発明のポリペプ
チドをコードする遺伝子として判定する。
【００６６】同様の硫酸基転移酵素活性を有する機能的
同等物を製造するには、例えば、次の方法が挙げられ
る。本発明の硫酸基転移酵素遺伝子群を用いて、ランダ
ム変異あるいは部位特異的変異を導入することにより、
天然の硫酸基転移酵素のアミノ酸配列中に、１個又は数
個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換を生じさ
せる遺伝子が得られる。これにより、天然の硫酸基転移
酵素と同様の活性を有するが、至適温度、安定温度、至
適ｐＨ、安定ｐＨ等の性質が少し異なった硫酸基転移酵
素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子
工学的にこれらの硫酸基転移酵素を製造することが可能
である。
同等物を製造するには、例えば、次の方法が挙げられ
る。本発明の硫酸基転移酵素遺伝子群を用いて、ランダ
ム変異あるいは部位特異的変異を導入することにより、
天然の硫酸基転移酵素のアミノ酸配列中に、１個又は数
個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換を生じさ
せる遺伝子が得られる。これにより、天然の硫酸基転移
酵素と同様の活性を有するが、至適温度、安定温度、至
適ｐＨ、安定ｐＨ等の性質が少し異なった硫酸基転移酵
素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子
工学的にこれらの硫酸基転移酵素を製造することが可能
である。
【００６７】ランダム変異を導入する方法としては、例
えば、ＤＮＡを化学的に処理する方法として、亜硫酸水
素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に
変換するトランジション変異を起こさせる方法［プロシ
ーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第７９巻、第
１４０８−１４１２頁（１９８２）］、生化学的方法と
して、［α−Ｓ］ｄＮＴＰ存在下で２本鎖を合成する過
程で塩基置換を生じさせる方法［ジーン(Gene)、第６４
巻、第３１３−３１９頁（１９８８）］、ＰＣＲを用い
る方法として、反応系にマンガンを加えてＰＣＲを行
い、ヌクレオチドの取込の正確さを低くする方法［アナ
リティカル バイオケミストリー、第２２４巻、第３４
７−３５３頁（１９９５）］等が知られている。
えば、ＤＮＡを化学的に処理する方法として、亜硫酸水
素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に
変換するトランジション変異を起こさせる方法［プロシ
ーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第７９巻、第
１４０８−１４１２頁（１９８２）］、生化学的方法と
して、［α−Ｓ］ｄＮＴＰ存在下で２本鎖を合成する過
程で塩基置換を生じさせる方法［ジーン(Gene)、第６４
巻、第３１３−３１９頁（１９８８）］、ＰＣＲを用い
る方法として、反応系にマンガンを加えてＰＣＲを行
い、ヌクレオチドの取込の正確さを低くする方法［アナ
リティカル バイオケミストリー、第２２４巻、第３４
７−３５３頁（１９９５）］等が知られている。
【００６８】部位特異的変異を導入する方法としては、
例えば、アンバー変異を利用する方法［ギャップド デ
ュプレックス（gapped duplex)法、ヌクレイック アシ
ドズリサーチ、第１２巻、第２４号、第９４４１−９４
５６頁（１９８４）］、制限酵素部位を利用する方法
［アナリティカル バイオケミストリー、第２００巻、
第８１−８８頁（１９９２）、ジーン、第１０２巻、第
６７−７０頁（１９９１）］、ｄｕｔ（dUTPase ）とｕ
ｎｇ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）変異を利用する
方法［クンケル（Kunkel) 法、プロシーディングス オ
ブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシー
ズ オブ ザ ＵＳＡ、第８２巻、第４８８−４９２頁
（１９８５）］、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガー
ゼを用いたアンバー変異を利用する方法［オリゴヌクレ
オチド−ダイレクティッド デュアル アンバー（Olig
onucleotide-directed Dual Amber 、ＯＤＡ）法、ジー
ン、第１５２巻、第２７１−２７５頁（１９９５）］、
制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プラ
イマーを用いたＰＣＲによる方法（ＵＳＰ ５，５１
２，４６３）等が知られている。
例えば、アンバー変異を利用する方法［ギャップド デ
ュプレックス（gapped duplex)法、ヌクレイック アシ
ドズリサーチ、第１２巻、第２４号、第９４４１−９４
５６頁（１９８４）］、制限酵素部位を利用する方法
［アナリティカル バイオケミストリー、第２００巻、
第８１−８８頁（１９９２）、ジーン、第１０２巻、第
６７−７０頁（１９９１）］、ｄｕｔ（dUTPase ）とｕ
ｎｇ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）変異を利用する
方法［クンケル（Kunkel) 法、プロシーディングス オ
ブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシー
ズ オブ ザ ＵＳＡ、第８２巻、第４８８−４９２頁
（１９８５）］、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガー
ゼを用いたアンバー変異を利用する方法［オリゴヌクレ
オチド−ダイレクティッド デュアル アンバー（Olig
onucleotide-directed Dual Amber 、ＯＤＡ）法、ジー
ン、第１５２巻、第２７１−２７５頁（１９９５）］、
制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プラ
イマーを用いたＰＣＲによる方法（ＵＳＰ ５，５１
２，４６３）等が知られている。
【００６９】また、市販されているキットを使用するこ
とにより、部位特異的変異を容易に導入することができ
る。市販のキットとしては、例えば、ギャップド デュ
プレックス法を用いたミュータン−Ｇ（Mutan R -G、宝
酒造社製）、クンケル法を用いたミュータン−Ｋ（Muta
n R -K、宝酒造社製）、ＯＤＡ法を用いたミュータン−
エキスプレス Ｋｍ（Mutan R -Express Km 、宝酒造社
製）、変異導入用プライマーとピロコッカス フリオサ
ス（Pyrococcus furiosus ）由来ＤＮＡポリメラーゼを
用いたクイックチェンジ サイト−ダイレクティッド
ミュータジェネシス キット［QuikChangeTM Site-dire
cted Mutagenesis Kit、ストラタジーン（STRATAGENE）
社製］等があり、更に、ＰＣＲ法を利用する方法とし
て、ＴａＫａＲａ ＬＡ−ＰＣＲ イン ビトロ ミュ
ータジェネシス キット（TaKaRa LA-PCR in vitro Mut
agenesis Kit、宝酒造社製）、ミュータン−スーパー
エキスプレス Ｋｍ（Mutan R -Super Express Km 、宝
酒造社製）等が挙げられる。
とにより、部位特異的変異を容易に導入することができ
る。市販のキットとしては、例えば、ギャップド デュ
プレックス法を用いたミュータン−Ｇ（Mutan R -G、宝
酒造社製）、クンケル法を用いたミュータン−Ｋ（Muta
n R -K、宝酒造社製）、ＯＤＡ法を用いたミュータン−
エキスプレス Ｋｍ（Mutan R -Express Km 、宝酒造社
製）、変異導入用プライマーとピロコッカス フリオサ
ス（Pyrococcus furiosus ）由来ＤＮＡポリメラーゼを
用いたクイックチェンジ サイト−ダイレクティッド
ミュータジェネシス キット［QuikChangeTM Site-dire
cted Mutagenesis Kit、ストラタジーン（STRATAGENE）
社製］等があり、更に、ＰＣＲ法を利用する方法とし
て、ＴａＫａＲａ ＬＡ−ＰＣＲ イン ビトロ ミュ
ータジェネシス キット（TaKaRa LA-PCR in vitro Mut
agenesis Kit、宝酒造社製）、ミュータン−スーパー
エキスプレス Ｋｍ（Mutan R -Super Express Km 、宝
酒造社製）等が挙げられる。
【００７０】このように、本発明により、ヒト腎癌細胞
ＳＭＫＴ−Ｒ３由来の硫酸基転移酵素の一次構造及び遺
伝子構造が提供される。更に、硫酸基転移酵素活性を有
するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造
方法が可能となる。また、本発明の硫酸基転移酵素遺伝
子に特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチ
ドプローブ又はプライマーは、本発明の硫酸基転移酵素
遺伝子の検索、検出や増幅等に有用である。本発明のポ
リペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片は、本
発明の硫酸基転移酵素の検索、検出や精製等において有
用である。
ＳＭＫＴ−Ｒ３由来の硫酸基転移酵素の一次構造及び遺
伝子構造が提供される。更に、硫酸基転移酵素活性を有
するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造
方法が可能となる。また、本発明の硫酸基転移酵素遺伝
子に特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチ
ドプローブ又はプライマーは、本発明の硫酸基転移酵素
遺伝子の検索、検出や増幅等に有用である。本発明のポ
リペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片は、本
発明の硫酸基転移酵素の検索、検出や精製等において有
用である。
【００７１】なお、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子を用
いて遺伝子工学的に製造した本発明の組換え硫酸基転移
酵素の至適ｐＨ、至適温度、ｐＨ安定性、および熱安定
性は、以下に示すように天然の硫酸基転移酵素〔ジャー
ナル オブ バイオケミストリー、 第１１９巻、第３
号、第４２１−４２７頁（１９９６）〕とほぼ同様の結
果が得られている。
いて遺伝子工学的に製造した本発明の組換え硫酸基転移
酵素の至適ｐＨ、至適温度、ｐＨ安定性、および熱安定
性は、以下に示すように天然の硫酸基転移酵素〔ジャー
ナル オブ バイオケミストリー、 第１１９巻、第３
号、第４２１−４２７頁（１９９６）〕とほぼ同様の結
果が得られている。
【００７２】（１）至適ｐＨ 本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨは、図１に示
すように６〜８付近に高い活性を有している。 （２）至適温度 本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度は、図２に示
すように約４０℃付近で最大活性を示す。 （３）ｐＨ安定性 本発明の組換え硫酸基転移酵素のｐＨ安定性は、図３に
示すようにｐＨ６〜１０の範囲で安定である。 （４）熱安定性 本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性は、図４に示
すように３０℃では安定であるが、４０℃、３０分間の
処理で８５％の活性が失われる。
すように６〜８付近に高い活性を有している。 （２）至適温度 本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度は、図２に示
すように約４０℃付近で最大活性を示す。 （３）ｐＨ安定性 本発明の組換え硫酸基転移酵素のｐＨ安定性は、図３に
示すようにｐＨ６〜１０の範囲で安定である。 （４）熱安定性 本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性は、図４に示
すように３０℃では安定であるが、４０℃、３０分間の
処理で８５％の活性が失われる。
【００７３】
【実施例】以下、実験例、実施例を挙げて本発明を具体
的に示すが、本発明は以下の実施例等になんら限定され
るものではない。
的に示すが、本発明は以下の実施例等になんら限定され
るものではない。
【００７４】実験例１．ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞からの硫酸
基転移酵素の精製 ５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで１２〜２４時間処理したＳＭ
ＫＴ−Ｒ３細胞（約１×１０10個）を集め、ＰＢＳで洗
浄後、使用するまで−８０℃で保存した。２．５×１０
9 個の細胞を融解し、細胞と等容量のＴＢＳに懸濁し、
ポッター型ホモジナイザーで短時間でホモジナイズし
た。ホモジネートに等容量の２×溶解緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
2 、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、２％Ｌｕｂｒｏ
ｌＰＸ、４０％グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦお
よび０．０２ｍＭ Ｅ−６４）を加え、氷上で１０分間
超音波処理した。１００，０００×ｇで１時間遠心分離
後、得られる上清をバッファーＡ（１０ｍＭトリエタノ
ールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリセロール
および５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）に対して透析した。
基転移酵素の精製 ５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで１２〜２４時間処理したＳＭ
ＫＴ−Ｒ３細胞（約１×１０10個）を集め、ＰＢＳで洗
浄後、使用するまで−８０℃で保存した。２．５×１０
9 個の細胞を融解し、細胞と等容量のＴＢＳに懸濁し、
ポッター型ホモジナイザーで短時間でホモジナイズし
た。ホモジネートに等容量の２×溶解緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
2 、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、２％Ｌｕｂｒｏ
ｌＰＸ、４０％グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦお
よび０．０２ｍＭ Ｅ−６４）を加え、氷上で１０分間
超音波処理した。１００，０００×ｇで１時間遠心分離
後、得られる上清をバッファーＡ（１０ｍＭトリエタノ
ールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリセロール
および５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）に対して透析した。
【００７５】透析した材料を１０，０００×ｇで３０分
間遠心分離して、透析中に生じた沈殿物を除去した。上
清をＤＥ−５２カラム[ ３×２０ｃｍ、ワットマン(Wha
tman) 社製] にアプライし、バッファーＢ（１０ｍＭト
リエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％
ＬｕｂｒｏｌＰＸ、１０％グリセロールおよび５ｍＭＭ
ｎＣｌ2 ）で予め平衡化させておいたヘパリン−セファ
ロースＣＬ６Ｂカラム [２×１０ｃｍ、ファルマシア
バイオテク(Pharmacia Biotech) 社製] に、直接出口を
接続させた。次いで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光
度が０．０２未満になるまで、４０ｍｌ／ｈの流速でバ
ッファーＢでカラムを洗浄した。ＤＥ−５２カラムの接
続を外した後、ヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム
上の酵素を、０．２ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣ
（２０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．
０、０．１％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、２０％グリセロールお
よび１０ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）で溶出した。
間遠心分離して、透析中に生じた沈殿物を除去した。上
清をＤＥ−５２カラム[ ３×２０ｃｍ、ワットマン(Wha
tman) 社製] にアプライし、バッファーＢ（１０ｍＭト
リエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％
ＬｕｂｒｏｌＰＸ、１０％グリセロールおよび５ｍＭＭ
ｎＣｌ2 ）で予め平衡化させておいたヘパリン−セファ
ロースＣＬ６Ｂカラム [２×１０ｃｍ、ファルマシア
バイオテク(Pharmacia Biotech) 社製] に、直接出口を
接続させた。次いで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光
度が０．０２未満になるまで、４０ｍｌ／ｈの流速でバ
ッファーＢでカラムを洗浄した。ＤＥ−５２カラムの接
続を外した後、ヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム
上の酵素を、０．２ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣ
（２０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．
０、０．１％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、２０％グリセロールお
よび１０ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）で溶出した。
【００７６】ヘパリン−セファロースクロマトグラフィ
ーの酵素活性画分をプールし、バッファーＢに対して透
析した。透析液を、予めバッファーＢで平衡化させてお
いたガラクトシルスフィンゴシン（ＧａｌＳｐｈ）−セ
ファロースカラム（１×１０ｃｍ、ファルマシア バイ
オテク社製）に５ｍｌ／ｈの流速でアプライした。次い
で、溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなるまで、
バッファーＢでカラムを洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌを
含むバッファーＣで、硫酸基転移酵素を溶出させた。
ーの酵素活性画分をプールし、バッファーＢに対して透
析した。透析液を、予めバッファーＢで平衡化させてお
いたガラクトシルスフィンゴシン（ＧａｌＳｐｈ）−セ
ファロースカラム（１×１０ｃｍ、ファルマシア バイ
オテク社製）に５ｍｌ／ｈの流速でアプライした。次い
で、溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなるまで、
バッファーＢでカラムを洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌを
含むバッファーＣで、硫酸基転移酵素を溶出させた。
【００７７】ＧａｌＳｐｈ−セファロースカラムの溶出
画分をプールし、１０％グリセロールを含む１０ｍＭト
リエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して透
析した。予めバッファーＤ（１０ｍＭトリエタノールア
ミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰ
Ｘおよび１０％グリセロール）で平衡化させておいたＨ
ｉＴｒａｐ ３’，５’−ビスホスホアデノシン（ＰＡ
Ｐ）カラム（５ｍｌのベッド体積、ファルマシア バイ
オテク社製）に直接接続したピリドキサル５’−ホスフ
ェート（ＰＬＰ）−セファロースカラム（１×１０ｃ
ｍ、ファルマシアバイオテク社製）に、透析液を５ｍｌ
／ｈの流速でアプライした。溶出液が実質的にタンパク
質を含まなくなるまで、バッファーＤとバッファーＢで
連続してカラムを洗浄し、バッファーＤ中０〜０．３ｍ
ＭのＰＡＰの直線グラジエントで、硫酸基転移酵素を溶
出させた。
画分をプールし、１０％グリセロールを含む１０ｍＭト
リエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して透
析した。予めバッファーＤ（１０ｍＭトリエタノールア
ミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰ
Ｘおよび１０％グリセロール）で平衡化させておいたＨ
ｉＴｒａｐ ３’，５’−ビスホスホアデノシン（ＰＡ
Ｐ）カラム（５ｍｌのベッド体積、ファルマシア バイ
オテク社製）に直接接続したピリドキサル５’−ホスフ
ェート（ＰＬＰ）−セファロースカラム（１×１０ｃ
ｍ、ファルマシアバイオテク社製）に、透析液を５ｍｌ
／ｈの流速でアプライした。溶出液が実質的にタンパク
質を含まなくなるまで、バッファーＤとバッファーＢで
連続してカラムを洗浄し、バッファーＤ中０〜０．３ｍ
ＭのＰＡＰの直線グラジエントで、硫酸基転移酵素を溶
出させた。
【００７８】ＨｉＴｒａｐ ＰＡＰクロマトグラフィー
の酵素活性画分をプールし、予めバッファーＤで平衡化
させておいた第２のヘパリン−セファロースカラムクロ
マトグラフィー（０．３ｍｌのベッド体積）に直接供し
た。バッファーＤでカラムを洗浄後、０．３ＭのＮａＣ
ｌを含むバッファーＣで、０．３ｍｌの画分で本発明の
硫酸基転移酵素を溶出させた。この工程により、酵素調
製品は初期体積の約１／５に濃縮された。前記クロマト
グラフィー由来の酵素調製品に含まれるＰＡＰは、フロ
ースルー画分に回収された。精製酵素活性画分をプール
し、２０％のグリセロールの存在下、−８０℃で保存し
た。得られた精製酵素の活性を、実験例２に記載の方法
により測定したところ、１．２ユニット／ｍｇであっ
た。
の酵素活性画分をプールし、予めバッファーＤで平衡化
させておいた第２のヘパリン−セファロースカラムクロ
マトグラフィー（０．３ｍｌのベッド体積）に直接供し
た。バッファーＤでカラムを洗浄後、０．３ＭのＮａＣ
ｌを含むバッファーＣで、０．３ｍｌの画分で本発明の
硫酸基転移酵素を溶出させた。この工程により、酵素調
製品は初期体積の約１／５に濃縮された。前記クロマト
グラフィー由来の酵素調製品に含まれるＰＡＰは、フロ
ースルー画分に回収された。精製酵素活性画分をプール
し、２０％のグリセロールの存在下、−８０℃で保存し
た。得られた精製酵素の活性を、実験例２に記載の方法
により測定したところ、１．２ユニット／ｍｇであっ
た。
【００７９】実験例２．精製硫酸基転移酵素の作用、基
質特異性、物理化学的性質の検討 アナリティカル バイオケミストリー、第１８２巻、第
９−１５頁（１９８９）に記載の方法を若干修正して、
実験例１で得られた本発明の精製硫酸基転移酵素の活性
を測定した。すなわち、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒ、
０．５μｍｏｌのＭｎＣｌ2 、１ｎｍｏｌの〔35Ｓ〕Ｐ
ＡＰＳ（１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、０．５ｍｇのＬｕ
ｂｒｏｌ ＰＸ、１２．５ｎｍｏｌのジチオスレイトー
ル、０．２５μｍｏｌのＮａＦ、０．１μｍｏｌのＡＴ
Ｐ、２０μｇのＢＳＡ、および２５ｍＭのカコジル酸Ｎ
ａ−ＨＣｌ、ｐＨ６．５中の２０ｎｇの酵素タンパク質
を含む反応混合液を、全量５０μｌに調製した。また、
基質特異性を調べるために、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒ
の代わりに２５ｎｍｏｌの種々の基質を受容体として用
いた。３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍｌ
のクロロホルム／メタノール／水（３０：６０：８）で
反応を停止した。ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を
用いて反応生成物を単離し、液体シンチレーションカウ
ンターを使用して放射活性を測定した。受容体を欠いた
前記反応混合液を用いて得られたブランク値に対して、
測定値を補正した。１ユニットの活性は、前記測定条件
下で、１分間に１μｍｏｌの硫酸基を転移する酵素の量
として定義した。
質特異性、物理化学的性質の検討 アナリティカル バイオケミストリー、第１８２巻、第
９−１５頁（１９８９）に記載の方法を若干修正して、
実験例１で得られた本発明の精製硫酸基転移酵素の活性
を測定した。すなわち、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒ、
０．５μｍｏｌのＭｎＣｌ2 、１ｎｍｏｌの〔35Ｓ〕Ｐ
ＡＰＳ（１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、０．５ｍｇのＬｕ
ｂｒｏｌ ＰＸ、１２．５ｎｍｏｌのジチオスレイトー
ル、０．２５μｍｏｌのＮａＦ、０．１μｍｏｌのＡＴ
Ｐ、２０μｇのＢＳＡ、および２５ｍＭのカコジル酸Ｎ
ａ−ＨＣｌ、ｐＨ６．５中の２０ｎｇの酵素タンパク質
を含む反応混合液を、全量５０μｌに調製した。また、
基質特異性を調べるために、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒ
の代わりに２５ｎｍｏｌの種々の基質を受容体として用
いた。３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍｌ
のクロロホルム／メタノール／水（３０：６０：８）で
反応を停止した。ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を
用いて反応生成物を単離し、液体シンチレーションカウ
ンターを使用して放射活性を測定した。受容体を欠いた
前記反応混合液を用いて得られたブランク値に対して、
測定値を補正した。１ユニットの活性は、前記測定条件
下で、１分間に１μｍｏｌの硫酸基を転移する酵素の量
として定義した。
【００８０】
【表１】
【００８１】表１より、本発明の精製硫酸基転移酵素
は、ＧａｌＣｅｒを最良の基質とし、ＬａｃＣｅｒを第
２位の基質とした。ＧａｌＡＡＧおよびＧａｌＤＧも基
質として用いられる。また、本発明の精製硫酸基転移酵
素は、ＧａｌＣｅｒと比べて１０％未満の比活性である
けれども、ＧｌｃＣｅｒ、Ｇｂ４Ｃｅｒ、Ｇｇ３Ｃｅ
ｒ、Ｇｇ４ＣｅｒおよびｎＬｃ４Ｃｅｒに対しても作用
した。しかし、Ｇｂ３Ｃｅｒには、作用しなかった。
は、ＧａｌＣｅｒを最良の基質とし、ＬａｃＣｅｒを第
２位の基質とした。ＧａｌＡＡＧおよびＧａｌＤＧも基
質として用いられる。また、本発明の精製硫酸基転移酵
素は、ＧａｌＣｅｒと比べて１０％未満の比活性である
けれども、ＧｌｃＣｅｒ、Ｇｂ４Ｃｅｒ、Ｇｇ３Ｃｅ
ｒ、Ｇｇ４ＣｅｒおよびｎＬｃ４Ｃｅｒに対しても作用
した。しかし、Ｇｂ３Ｃｅｒには、作用しなかった。
【００８２】本発明の精製硫酸基転移酵素の他の性質と
しては、０．１Ｍまでの濃度のＮａＣｌにより、硫酸基
転移活性が増強されたが、０．１Ｍを越える濃度では活
性を阻害した。Ｋm 値は、ＧａｌＣｅｒおよびＰＡＰＳ
に対して、それぞれ、２７μＭ、２５μＭであった。ま
た、ｐＨ６．５〜７．０の間で、本発明の精製硫酸基転
移酵素は最大活性を示した。また、２０％グリセリンの
存在下で−８０℃で保存した場合、少なくとも３ヶ月間
は失活を認めなかった。
しては、０．１Ｍまでの濃度のＮａＣｌにより、硫酸基
転移活性が増強されたが、０．１Ｍを越える濃度では活
性を阻害した。Ｋm 値は、ＧａｌＣｅｒおよびＰＡＰＳ
に対して、それぞれ、２７μＭ、２５μＭであった。ま
た、ｐＨ６．５〜７．０の間で、本発明の精製硫酸基転
移酵素は最大活性を示した。また、２０％グリセリンの
存在下で−８０℃で保存した場合、少なくとも３ヶ月間
は失活を認めなかった。
【００８３】Laemmli の方法〔ネイチャー（Nature) 、
第２２７巻、第６８０−６８５頁（１９７０）〕によ
り、本発明の精製硫酸基転移酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
付した。５％β−メルカプトエタノールを含むサンプル
バッファー中で処理した場合に（還元条件下）、約５４
ｋＤａの分子量を有する単一のバンドが得られた。
第２２７巻、第６８０−６８５頁（１９７０）〕によ
り、本発明の精製硫酸基転移酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
付した。５％β−メルカプトエタノールを含むサンプル
バッファー中で処理した場合に（還元条件下）、約５４
ｋＤａの分子量を有する単一のバンドが得られた。
【００８４】実施例１．硫酸基転移酵素遺伝子のクロー
ニング （１）ｃＤＮＡライブラリーの作製 前記ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞株［ウロロジカル リサーチ、
第１７巻、第３１７−３２４頁（１９８９）］より全Ｒ
ＮＡを抽出［アナリティカル バイオケミストリー、第
１６２巻、第１５６−１５９頁（１９８７）］し、ポリ
（Ａ）+ ＲＮＡをオリゴテックス−ｄＴ３０（Oligotex
TM-dT30 、宝酒造社製）を用いて精製した。精製したポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡから、スーパースクリプト チョイス
システム［SUPERSCRIPT TM Choice System、ライフ
テクノロジーズ(Life Technologies) 社製］を用いて２
本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた２本鎖ｃＤＮＡにEc
oR I アダプター（ライフテクノロジーズ社製）を結合
させたｃＤＮＡ断片と、制限酵素Eco RIで消化したλｇ
ｔ１０ファージベクター（ファルマシア バイオテク社
製）とをライゲーションを行い、その後、レディ−トゥ
−ゴー ラムダ パッケージング キット［Ready-To-G
o TM Lambda Packaging Kit 、ファルマシアバイオテク
社製］ を用いてイン ビトロでパッケージングを行
い、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞株由来のλｇｔ１０ｃＤＮＡラ
イブラリーとした。
ニング （１）ｃＤＮＡライブラリーの作製 前記ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞株［ウロロジカル リサーチ、
第１７巻、第３１７−３２４頁（１９８９）］より全Ｒ
ＮＡを抽出［アナリティカル バイオケミストリー、第
１６２巻、第１５６−１５９頁（１９８７）］し、ポリ
（Ａ）+ ＲＮＡをオリゴテックス−ｄＴ３０（Oligotex
TM-dT30 、宝酒造社製）を用いて精製した。精製したポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡから、スーパースクリプト チョイス
システム［SUPERSCRIPT TM Choice System、ライフ
テクノロジーズ(Life Technologies) 社製］を用いて２
本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた２本鎖ｃＤＮＡにEc
oR I アダプター（ライフテクノロジーズ社製）を結合
させたｃＤＮＡ断片と、制限酵素Eco RIで消化したλｇ
ｔ１０ファージベクター（ファルマシア バイオテク社
製）とをライゲーションを行い、その後、レディ−トゥ
−ゴー ラムダ パッケージング キット［Ready-To-G
o TM Lambda Packaging Kit 、ファルマシアバイオテク
社製］ を用いてイン ビトロでパッケージングを行
い、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞株由来のλｇｔ１０ｃＤＮＡラ
イブラリーとした。
【００８５】（２）硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配列
の決定 実験例１で精製した硫酸基転移酵素１０μｇを６Ｍ塩酸
グアニジウムを含む１ｍＭＥＤＴＡ溶液（１ｍｌ）に溶
解させ、２−メルカプトエタノールを２μｌ加え、窒素
封入し、３７℃、２時間保温し還元した。その後、４−
ビニルピリジンを１０μｌ加え、窒素封入し、３７℃、
２時間保温することにより、Ｓ−ピリジルエチル化を行
った。
の決定 実験例１で精製した硫酸基転移酵素１０μｇを６Ｍ塩酸
グアニジウムを含む１ｍＭＥＤＴＡ溶液（１ｍｌ）に溶
解させ、２−メルカプトエタノールを２μｌ加え、窒素
封入し、３７℃、２時間保温し還元した。その後、４−
ビニルピリジンを１０μｌ加え、窒素封入し、３７℃、
２時間保温することにより、Ｓ−ピリジルエチル化を行
った。
【００８６】こうして得られたピリジルエチル化酵素タ
ンパク質を逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）［システ
ム：Ｗａｔｅｒｓ６２５ＬＣ、ミリポア(Millipore) 社
製、カラム：コスモシール(Cosmosil)５Ｃ４−ＡＲ−３
００、４．６×５０ｍｍ、ナカライテスク社製、流速：
０．４ｍｌ／分、溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸
溶液（ＴＦＡ）、溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む７０
％アセトニトリル、溶出：サンプルアプライ時は溶出液
Ｂの割合を０％に、その後、５５分間で溶出液の割合を
７０％にまで直線的に上げた］に供すことにより、精製
した。
ンパク質を逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）［システ
ム：Ｗａｔｅｒｓ６２５ＬＣ、ミリポア(Millipore) 社
製、カラム：コスモシール(Cosmosil)５Ｃ４−ＡＲ−３
００、４．６×５０ｍｍ、ナカライテスク社製、流速：
０．４ｍｌ／分、溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸
溶液（ＴＦＡ）、溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む７０
％アセトニトリル、溶出：サンプルアプライ時は溶出液
Ｂの割合を０％に、その後、５５分間で溶出液の割合を
７０％にまで直線的に上げた］に供すことにより、精製
した。
【００８７】精製したＳ−ピリジルエチル化酵素タンパ
ク質（約２μｇ／ｍｌ）を、３Ｍ尿素を含む０．１Ｍト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）４００μｌに溶解し、
０．３μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業
社製）で、３７℃、１２時間消化した。
ク質（約２μｇ／ｍｌ）を、３Ｍ尿素を含む０．１Ｍト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）４００μｌに溶解し、
０．３μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業
社製）で、３７℃、１２時間消化した。
【００８８】得られた消化物からペプチド断片をＲＰ−
ＨＰＬＣ［システム：モデル１３０Ａ、アプライド バ
イオシステムズ社製、カラム：ＯＤ−３００Ｃ，アクア
ポア(Aquapore)、７μｍ、１．０×２５０ｍｍ、アプラ
イド バイオシステムズ社製、流速：０．１ｍｌ／分、
溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡ溶液、溶出液Ｂ：０．１％Ｔ
ＦＡを含む７０％アセトニトリル、溶出：サンプルアプ
ライ時は溶出液Ｂの割合を０％に、その後、８５分間で
溶出液の割合を７０％にまで直線的に上げた］により、
分離精製した。
ＨＰＬＣ［システム：モデル１３０Ａ、アプライド バ
イオシステムズ社製、カラム：ＯＤ−３００Ｃ，アクア
ポア(Aquapore)、７μｍ、１．０×２５０ｍｍ、アプラ
イド バイオシステムズ社製、流速：０．１ｍｌ／分、
溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡ溶液、溶出液Ｂ：０．１％Ｔ
ＦＡを含む７０％アセトニトリル、溶出：サンプルアプ
ライ時は溶出液Ｂの割合を０％に、その後、８５分間で
溶出液の割合を７０％にまで直線的に上げた］により、
分離精製した。
【００８９】分離したペプチド断片を常法に従って気相
エドマン分解法によるアミノ酸配列分析（プロテイン
シークエンサー モデル４９２、アプライド バイオシ
ステムズ社製）に供して、部分アミノ酸配列Ｐ１（配列
番号：３）、Ｐ２（配列番号：４）、Ｐ３（配列番号：
５）、Ｐ４（配列番号：１１）、Ｐ５（配列番号：１
２）、Ｐ６（配列番号：１３）、Ｐ７（配列番号：１
４）を決定した。
エドマン分解法によるアミノ酸配列分析（プロテイン
シークエンサー モデル４９２、アプライド バイオシ
ステムズ社製）に供して、部分アミノ酸配列Ｐ１（配列
番号：３）、Ｐ２（配列番号：４）、Ｐ３（配列番号：
５）、Ｐ４（配列番号：１１）、Ｐ５（配列番号：１
２）、Ｐ６（配列番号：１３）、Ｐ７（配列番号：１
４）を決定した。
【００９０】（３）プライマーの合成 前記（２）で決定した部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番
号：３）から合成ヌクレオチド１Ｓａ（配列番号：１
５）、１Ｓｂ（配列番号：１６）、１Ｓｃ（配列番号：
１７）、１Ｓｄ（配列番号：６）、１Ａ（配列番号：
７）を、部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合
成ヌクレオチド２Ｓａ（配列番号：９）、２Ｓｂ（配列
番号：１８）、２Ａａ（配列番号：１９）、２Ａｂ（配
列番号：２０）を、部分アミノ酸配列Ｐ３（配列番号：
５）から合成ヌクレオチド３Ｓ（配列番号：２１）、３
Ａ（配列番号：１０）をそれぞれ合成し（ＤＮＡシンセ
サイザモデル３９２、アプライド バイオシステムズ社
製）、合成ヌクレオチドプライマーとした。
号：３）から合成ヌクレオチド１Ｓａ（配列番号：１
５）、１Ｓｂ（配列番号：１６）、１Ｓｃ（配列番号：
１７）、１Ｓｄ（配列番号：６）、１Ａ（配列番号：
７）を、部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合
成ヌクレオチド２Ｓａ（配列番号：９）、２Ｓｂ（配列
番号：１８）、２Ａａ（配列番号：１９）、２Ａｂ（配
列番号：２０）を、部分アミノ酸配列Ｐ３（配列番号：
５）から合成ヌクレオチド３Ｓ（配列番号：２１）、３
Ａ（配列番号：１０）をそれぞれ合成し（ＤＮＡシンセ
サイザモデル３９２、アプライド バイオシステムズ社
製）、合成ヌクレオチドプライマーとした。
【００９１】合成オリゴヌクレオチドプライマー１Ｓ
ａ、１Ｓｂ、１Ｓｃ、１Ｓｄ、２Ｓａ、２Ｓｂ、３Ｓは
センス方向のプライマーであり、合成オリゴヌクレオチ
ドプライマー１Ａ、２Ａａ、２Ａｂ、２Ａ、３Ａはアン
チセンス方向のプライマーである。
ａ、１Ｓｂ、１Ｓｃ、１Ｓｄ、２Ｓａ、２Ｓｂ、３Ｓは
センス方向のプライマーであり、合成オリゴヌクレオチ
ドプライマー１Ａ、２Ａａ、２Ａｂ、２Ａ、３Ａはアン
チセンス方向のプライマーである。
【００９２】ハイブリダイゼーションの際にプライマー
が相互結合をすることを防ぐ目的で、全てのオリゴヌク
レオチドの合成においてはデオキシイノシンによる塩基
置換を行った。デオキシイノシン置換はコドンの重なり
が２よりも多いアミノ酸残基部分について行った。ま
た、セリン残基をコードする部分についてはＴＣＸとＡ
Ｇ（Ｔ／Ｃ）の2 種のうちいずれかのコドンを有するオ
リゴヌクレオチドの組合せを用意した。
が相互結合をすることを防ぐ目的で、全てのオリゴヌク
レオチドの合成においてはデオキシイノシンによる塩基
置換を行った。デオキシイノシン置換はコドンの重なり
が２よりも多いアミノ酸残基部分について行った。ま
た、セリン残基をコードする部分についてはＴＣＸとＡ
Ｇ（Ｔ／Ｃ）の2 種のうちいずれかのコドンを有するオ
リゴヌクレオチドの組合せを用意した。
【００９３】（４）ＲＴ−ＰＣＲ法による硫酸化転移酵
素遺伝子の検索 全液量２０μｌ中、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞より抽出したポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡ２μｇ、４０ｐｍｏｌのオリゴ（ｄ
Ｔ）12-18 プライマー（ライフ テクノロジーズ社
製）、各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ塩化カリウム、３ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、モ
ロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素［スーパー
スクリプトＩＩＲＮａｓｅＨ- 逆転写酵素（SUPERSCRIP
T TMII RNase H- Reverse Transcriptase)、ライフ テ
クノロジーズ社製] ２００ユニットを含む反応系で、３
７℃、１時間、逆転写反応を行った。この反応液の内４
μｌを鋳型とし、前記各１００ｐｍｏｌの合成オリゴヌ
クレオチドプライマー（センス方向プライマーとアンチ
センス方向プライマー）と各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ混
合液、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５
０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ〔パーキン エルマー(Perki
n Elmer)社製〕１．２５ユニットを含む全液量５０μｌ
の反応系でＰＣＲ反応を行った（ＲＴ−ＰＣＲ）。反応
条件は、９４℃で３０秒間（変性）、４５〜５５℃で３
０秒間（プライマーのアニーリング）、７２℃で１〜２
分間（合成反応）のサイクルを３５サイクル行った。
素遺伝子の検索 全液量２０μｌ中、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞より抽出したポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡ２μｇ、４０ｐｍｏｌのオリゴ（ｄ
Ｔ）12-18 プライマー（ライフ テクノロジーズ社
製）、各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ塩化カリウム、３ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、モ
ロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素［スーパー
スクリプトＩＩＲＮａｓｅＨ- 逆転写酵素（SUPERSCRIP
T TMII RNase H- Reverse Transcriptase)、ライフ テ
クノロジーズ社製] ２００ユニットを含む反応系で、３
７℃、１時間、逆転写反応を行った。この反応液の内４
μｌを鋳型とし、前記各１００ｐｍｏｌの合成オリゴヌ
クレオチドプライマー（センス方向プライマーとアンチ
センス方向プライマー）と各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ混
合液、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５
０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ〔パーキン エルマー(Perki
n Elmer)社製〕１．２５ユニットを含む全液量５０μｌ
の反応系でＰＣＲ反応を行った（ＲＴ−ＰＣＲ）。反応
条件は、９４℃で３０秒間（変性）、４５〜５５℃で３
０秒間（プライマーのアニーリング）、７２℃で１〜２
分間（合成反応）のサイクルを３５サイクル行った。
【００９４】このＰＣＲ反応後の反応液全量を２％アガ
ロースゲル電気泳動を行った後、ゲルからＤＮＡ断片を
切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター[ ノバジェン(Novag
en)社製] を用いてサブクローニングを行った。これら
のＤＮＡ断片の塩基配列をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
を用いたジデオキシ チェーン ターミネーター法〔ダ
イ ターミネーター サイクル シークエンシング キ
ット(Dye TerminatorCycle Sequencing Kit) 、パーキ
ン エルマー社製、ＤＮＡシークエンサー モデル３７
３Ａ、アプライド バイオシステムズ社製〕で決定し
た。
ロースゲル電気泳動を行った後、ゲルからＤＮＡ断片を
切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター[ ノバジェン(Novag
en)社製] を用いてサブクローニングを行った。これら
のＤＮＡ断片の塩基配列をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
を用いたジデオキシ チェーン ターミネーター法〔ダ
イ ターミネーター サイクル シークエンシング キ
ット(Dye TerminatorCycle Sequencing Kit) 、パーキ
ン エルマー社製、ＤＮＡシークエンサー モデル３７
３Ａ、アプライド バイオシステムズ社製〕で決定し
た。
【００９５】初めに４種のセンス方向の合成オリゴヌク
レオチドプライマー１Ｓａ、１Ｓｂ、１Ｓｃ、１Ｓｄと
アンチセンス方向の合成オリゴヌクレオチドプライマー
１Ａを用いてＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、１Ｓｄと１
Ａの組合せで４７ｂｐのｃＤＮＡ断片と２Ｓａと３Ａの
組合せで約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅された。
レオチドプライマー１Ｓａ、１Ｓｂ、１Ｓｃ、１Ｓｄと
アンチセンス方向の合成オリゴヌクレオチドプライマー
１Ａを用いてＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、１Ｓｄと１
Ａの組合せで４７ｂｐのｃＤＮＡ断片と２Ｓａと３Ａの
組合せで約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅された。
【００９６】このｃＤＮＡ断片の内、４７ｂｐのｃＤＮ
Ａ断片をサブクローニンし塩基配列を決定した結果、そ
こから予想されるアミノ酸配列と部分アミノ酸配列Ｐ１
のアミノ酸配列が一致した。
Ａ断片をサブクローニンし塩基配列を決定した結果、そ
こから予想されるアミノ酸配列と部分アミノ酸配列Ｐ１
のアミノ酸配列が一致した。
【００９７】次に、この４７ｂｐのｃＤＮＡ断片の塩基
配列を基にして混合オリゴヌクレオチドＯＰ１（配列番
号：８）を合成し、その３’末端をジゴキシゲニン（Ｄ
ＩＧ）オリゴヌクレオチド テイリング キット[DIG o
ligonucleotide Tailing Kit、ベーリンガー マンハイ
ム(Boehringer Mannheim) 社製] を用いてターミナルト
ランスフェラーゼでＤＩＧ標識した。
配列を基にして混合オリゴヌクレオチドＯＰ１（配列番
号：８）を合成し、その３’末端をジゴキシゲニン（Ｄ
ＩＧ）オリゴヌクレオチド テイリング キット[DIG o
ligonucleotide Tailing Kit、ベーリンガー マンハイ
ム(Boehringer Mannheim) 社製] を用いてターミナルト
ランスフェラーゼでＤＩＧ標識した。
【００９８】ＤＩＧ標識混合オリゴヌクレオチドＯＰ１
をプローブとして、前記ＲＴ−ＰＣＲで増幅された約６
００ｂｐのｃＤＮＡ断片に対してサザンブロットハイブ
リダイゼーションを行った。
をプローブとして、前記ＲＴ−ＰＣＲで増幅された約６
００ｂｐのｃＤＮＡ断片に対してサザンブロットハイブ
リダイゼーションを行った。
【００９９】まず、ＲＴ−ＰＣＲで得られた約６００ｂ
ｐのｃＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動
を行った後、ナイロン膜（ベーリンガー マンハイム社
製）にＤＮＡを転写した。このナイロン膜を用いて、２
ｐｍｏｌ／ｍｌのＤＩＧ標識混合オリゴヌクレオチドＯ
Ｐ１、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬（ベーリンガ
ー マンハイム社製）、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシ
ン、０．０２％ＳＤＳを含む溶液中、５５℃、４時間、
ハイブリダイゼーションを行った。検出はＤＩＧ ルミ
ネッセント ディテクション キット（DIG Luminescen
t Detection Kit 、ベーリンガー マンハイム社製）を
用いて行った。
ｐのｃＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動
を行った後、ナイロン膜（ベーリンガー マンハイム社
製）にＤＮＡを転写した。このナイロン膜を用いて、２
ｐｍｏｌ／ｍｌのＤＩＧ標識混合オリゴヌクレオチドＯ
Ｐ１、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬（ベーリンガ
ー マンハイム社製）、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシ
ン、０．０２％ＳＤＳを含む溶液中、５５℃、４時間、
ハイブリダイゼーションを行った。検出はＤＩＧ ルミ
ネッセント ディテクション キット（DIG Luminescen
t Detection Kit 、ベーリンガー マンハイム社製）を
用いて行った。
【０１００】その結果、合成オリゴヌクレオチドプライ
マー２Ｓａと３Ａを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅された約
６００ｂｐのｃＤＮＡ断片に、ＯＰ１プローブがハイブ
リダイズした。
マー２Ｓａと３Ａを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅された約
６００ｂｐのｃＤＮＡ断片に、ＯＰ１プローブがハイブ
リダイズした。
【０１０１】この約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片をサブク
ローニングし、塩基配列を決定した結果、この約６００
ｂｐのｃＤＮＡ断片中に部分アミノ酸配列Ｐ１とＰ４を
コードする配列が見出された。
ローニングし、塩基配列を決定した結果、この約６００
ｂｐのｃＤＮＡ断片中に部分アミノ酸配列Ｐ１とＰ４を
コードする配列が見出された。
【０１０２】（５）硫酸基転移酵素遺伝子を含むｃＤＮ
Ａ断片のクローニング 実施例１の（１）で調製したＳＭＫＴ−３細胞株由来の
λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローン
を単離するために、プラークハイブリダイゼーションに
よるスクリーニングを行った。
Ａ断片のクローニング 実施例１の（１）で調製したＳＭＫＴ−３細胞株由来の
λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローン
を単離するために、プラークハイブリダイゼーションに
よるスクリーニングを行った。
【０１０３】実施例１の（４）で得られた約６００ｂｐ
のｃＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼ
を用いてＤＩＧ標識［ＤＩＧ ＲＮＡ ラベリング キ
ット(DIG RNA Labeling Kit)、ベーリンガー マンハイ
ム社製］されたＲＮＡプローブを合成した。
のｃＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼ
を用いてＤＩＧ標識［ＤＩＧ ＲＮＡ ラベリング キ
ット(DIG RNA Labeling Kit)、ベーリンガー マンハイ
ム社製］されたＲＮＡプローブを合成した。
【０１０４】約２×１０5 個のλｇｔ１０ｃＤＮＡライ
ブラリーと大腸菌ＬＥ３９２を混合し、９×１３ｃｍの
角シャーレ１０枚に、１枚当たり２×１０4 個のプラー
クを形成させた。次に、得られたプラークをナイロン膜
（ベーリンガー マンハイム社製）上に写し、４℃で１
時間保温した後、アルカリ変性（０．５ＮＮａＯＨ、
１．５ＭＮａＣｌ、５分間）、中和［１．５ＭＮａＣｌ
を含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３
分間を２回、その後、２×ＳＳＣで２分間を１回］を行
った。このフィルターを用いて、ナイロン膜１ｃｍ2 当
たり１ｎｇのプローブ、５０％ホルムアミド、５×ＳＳ
Ｃ、２％ブロッキング試薬（ベーリンガーマンハイム社
製）、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０２％Ｓ
ＤＳを含む溶液中、５０℃で一晩ハイブリダイゼーショ
ンを行った。検出はＤＩＧ ルミネッセント ディテク
ション キット（ベーリンガー マンハイム社製）を用
いて行った。その結果、６個の陽性ラムダファージクロ
ーンが得られた。これらのクローンからプラスミドを調
製し、その挿入ｃＤＮＡ断片を制限酵素Eco RI（宝酒造
社製）で切り出し、Eco RI消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩベクター（ストラタジーン社製）を用いてサブ
クローニングした。
ブラリーと大腸菌ＬＥ３９２を混合し、９×１３ｃｍの
角シャーレ１０枚に、１枚当たり２×１０4 個のプラー
クを形成させた。次に、得られたプラークをナイロン膜
（ベーリンガー マンハイム社製）上に写し、４℃で１
時間保温した後、アルカリ変性（０．５ＮＮａＯＨ、
１．５ＭＮａＣｌ、５分間）、中和［１．５ＭＮａＣｌ
を含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３
分間を２回、その後、２×ＳＳＣで２分間を１回］を行
った。このフィルターを用いて、ナイロン膜１ｃｍ2 当
たり１ｎｇのプローブ、５０％ホルムアミド、５×ＳＳ
Ｃ、２％ブロッキング試薬（ベーリンガーマンハイム社
製）、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０２％Ｓ
ＤＳを含む溶液中、５０℃で一晩ハイブリダイゼーショ
ンを行った。検出はＤＩＧ ルミネッセント ディテク
ション キット（ベーリンガー マンハイム社製）を用
いて行った。その結果、６個の陽性ラムダファージクロ
ーンが得られた。これらのクローンからプラスミドを調
製し、その挿入ｃＤＮＡ断片を制限酵素Eco RI（宝酒造
社製）で切り出し、Eco RI消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩベクター（ストラタジーン社製）を用いてサブ
クローニングした。
【０１０５】その結果、最長約１．８ｋｂｐのｃＤＮＡ
断片を有しているプラスミドが得られ、このプラスミド
をｐＢＳ−ｈＣＳＴ１と命名した。その塩基配列を決定
したところ、４３２個のアミノ酸からなるタンパク質を
コードする読みとり枠（ＯＲＦ）が見いだされた。この
ＯＲＦ中に、前記精製硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配
列分析により得られたアミノ酸配列が全て見いだされ
た。
断片を有しているプラスミドが得られ、このプラスミド
をｐＢＳ−ｈＣＳＴ１と命名した。その塩基配列を決定
したところ、４３２個のアミノ酸からなるタンパク質を
コードする読みとり枠（ＯＲＦ）が見いだされた。この
ＯＲＦ中に、前記精製硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配
列分析により得られたアミノ酸配列が全て見いだされ
た。
【０１０６】以上の結果より、硫酸基転移酵素遺伝子の
全塩基配列及び一次構造が決定された。硫酸基転移酵素
をコードする塩基配列を配列表の配列番号：２に、その
塩基配列からコードされるアミノ酸配列を配列表の配列
番号：１に示す。
全塩基配列及び一次構造が決定された。硫酸基転移酵素
をコードする塩基配列を配列表の配列番号：２に、その
塩基配列からコードされるアミノ酸配列を配列表の配列
番号：１に示す。
【０１０７】実施例２．硫酸基転移酵素ポリペプチドを
発現するプラスミドの構築 実施例１で得られたプラスミドｐＢＳ−ｈＣＳＴ１を制
限酵素Eco RIで消化し、得られたＤＮＡ断片を哺乳類発
現ベクターｐＳＶＫ３（ファルマシア バイオテク社
製）のEco RI部位に挿入した。挿入ＤＮＡ断片の方向は
制限酵素の切断地図を基に決定した。得られた挿入方向
が正の方向と逆の方向の互いに異なる発現プラスミド
を、それぞれ、ｐＳＶ−ｈＣＳＴとｐＳＶ−ｈＣＳＴＲ
と命名した。
発現するプラスミドの構築 実施例１で得られたプラスミドｐＢＳ−ｈＣＳＴ１を制
限酵素Eco RIで消化し、得られたＤＮＡ断片を哺乳類発
現ベクターｐＳＶＫ３（ファルマシア バイオテク社
製）のEco RI部位に挿入した。挿入ＤＮＡ断片の方向は
制限酵素の切断地図を基に決定した。得られた挿入方向
が正の方向と逆の方向の互いに異なる発現プラスミド
を、それぞれ、ｐＳＶ−ｈＣＳＴとｐＳＶ−ｈＣＳＴＲ
と命名した。
【０１０８】これらのプラスミドのうちｐＳＶ−ｈＣＳ
Ｔを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、形質転換体を得
た。該形質転換体は、Escherichia coli JM109／pSV-hC
STと命名され、Escherichia coli JM109／pSV-hcSTと表
示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−５８１１として寄託されている。
Ｔを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、形質転換体を得
た。該形質転換体は、Escherichia coli JM109／pSV-hC
STと命名され、Escherichia coli JM109／pSV-hcSTと表
示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−５８１１として寄託されている。
【０１０９】実施例３．組換え硫酸基転移酵素遺伝子の
ＣＯＳ−１細胞における発現 直径３５ｍｍのディッシュに、２×１０5 個のＣＯＳ−
１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）を蒔き、次の日
に実施例２で得られた発現プラスミドｐＳＶ−ｈＣＳＴ
又はｐＳＶ−ｈＣＳＴＲを１μｇとリポフェクトアミン
（LIPOFECTAMINE TM ライフ テクノロジーズ社製）５
μｌを加えることにより、ＣＯＳ−１細胞にトランスフ
ェクトした。その後、３７℃で７２時間培養後、得られ
た形質転換ＣＯＳ−１細胞を２ｍｌの冷ＴＢＳ（２０ｍ
Ｍトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で２回
洗浄し、０．２ｍｌの０．１％トリトン（TritonR ）Ｘ
−１００を含むＴＢＳを加え、シリコンスクレーパー
［silicon scraper 、ファルコン(Falcon)社製］を用い
て採集した。
ＣＯＳ−１細胞における発現 直径３５ｍｍのディッシュに、２×１０5 個のＣＯＳ−
１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）を蒔き、次の日
に実施例２で得られた発現プラスミドｐＳＶ−ｈＣＳＴ
又はｐＳＶ−ｈＣＳＴＲを１μｇとリポフェクトアミン
（LIPOFECTAMINE TM ライフ テクノロジーズ社製）５
μｌを加えることにより、ＣＯＳ−１細胞にトランスフ
ェクトした。その後、３７℃で７２時間培養後、得られ
た形質転換ＣＯＳ−１細胞を２ｍｌの冷ＴＢＳ（２０ｍ
Ｍトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で２回
洗浄し、０．２ｍｌの０．１％トリトン（TritonR ）Ｘ
−１００を含むＴＢＳを加え、シリコンスクレーパー
［silicon scraper 、ファルコン(Falcon)社製］を用い
て採集した。
【０１１０】次に、採集した形質転換ＣＯＳ−１細胞を
氷中で超音波処理を行い、細胞を破砕した。これを遠心
分離して上清を回収した。
氷中で超音波処理を行い、細胞を破砕した。これを遠心
分離して上清を回収した。
【０１１１】得られた上清を酵素溶液として、上清の硫
酸基転移酵素活性をジャーナル オブ バイオケミスト
リー、第１１９巻、第４２１−４２７頁（１９９６）に
記載の方法に従って測定し、また、同時にこの上清のタ
ンパク質濃度をＢＣＡ プロテイン アッセイ試薬[BCA
Protein Assay Reagent、ピアス(PIERCE)社製] を用い
て測定した。
酸基転移酵素活性をジャーナル オブ バイオケミスト
リー、第１１９巻、第４２１−４２７頁（１９９６）に
記載の方法に従って測定し、また、同時にこの上清のタ
ンパク質濃度をＢＣＡ プロテイン アッセイ試薬[BCA
Protein Assay Reagent、ピアス(PIERCE)社製] を用い
て測定した。
【０１１２】その結果、ｐＳＶ−ｈＣＳＴで形質転換し
たＣＯＳ−１細胞の細胞抽出画分中の比活性は１．８×
１０-5Ｕ／ｍｇ（蛋白質）であった。これはコントロー
ルとしてｐＳＶＫ３を導入したＣＯＳ−１細胞の細胞抽
出画分中の活性の約１６倍であり、また、ｐＳＶ−ｈＣ
ＳＴＲで形質転換したＣＯＳ−１細胞の細胞抽出画分中
の活性の約８倍であった。
たＣＯＳ−１細胞の細胞抽出画分中の比活性は１．８×
１０-5Ｕ／ｍｇ（蛋白質）であった。これはコントロー
ルとしてｐＳＶＫ３を導入したＣＯＳ−１細胞の細胞抽
出画分中の活性の約１６倍であり、また、ｐＳＶ−ｈＣ
ＳＴＲで形質転換したＣＯＳ−１細胞の細胞抽出画分中
の活性の約８倍であった。
【０１１３】次に、ｐＳＶ−ｈＣＳＴで形質転換したＣ
ＯＳ−１細胞が、硫酸化糖脂質を発現しているかどうか
を調べた。
ＯＳ−１細胞が、硫酸化糖脂質を発現しているかどうか
を調べた。
【０１１４】まず、１０4 個のＣＯＳ−１細胞をＬａｂ
−Ｔｅｋ チャンバー スライド[Lab-Tek chamber sli
de、ヌンク(Nunc)社製] に入れ、ｐＳＶ−ｈＣＳＴを１
μｇ、リポフェクトアミン（ライフ テクノロジーズ社
製）１μｌを加えて形質転換させた。その後、３７℃で
４８時間培養後、形質転換ＣＯＳ−１細胞をＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）で洗浄し、１％パラホルムアルテヒドを含む
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で固定し、１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．４）でブロックした。これに抗スルファチ
ドモノクローナル抗体Ｓｕｌｐｈ１［バイオケミカル
ジャーナル、第２５１巻、第１７−２２頁（１９８
８）］を加え、４５分間インキュベーションし、さらに
ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ［ザイムド ラボラト
リーズ(Zymed Laboratories)社製］を加え、４５分間イ
ンキュベーションした。
−Ｔｅｋ チャンバー スライド[Lab-Tek chamber sli
de、ヌンク(Nunc)社製] に入れ、ｐＳＶ−ｈＣＳＴを１
μｇ、リポフェクトアミン（ライフ テクノロジーズ社
製）１μｌを加えて形質転換させた。その後、３７℃で
４８時間培養後、形質転換ＣＯＳ−１細胞をＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）で洗浄し、１％パラホルムアルテヒドを含む
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で固定し、１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．４）でブロックした。これに抗スルファチ
ドモノクローナル抗体Ｓｕｌｐｈ１［バイオケミカル
ジャーナル、第２５１巻、第１７−２２頁（１９８
８）］を加え、４５分間インキュベーションし、さらに
ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ［ザイムド ラボラト
リーズ(Zymed Laboratories)社製］を加え、４５分間イ
ンキュベーションした。
【０１１５】このようにして処理した形質転換ＣＯＳ−
１細胞と形質転換していないＣＯＳ−１細胞をそれぞれ
ベクタシールド マウンティング メディウム［Vectas
hield mounting medium 、ベクターラボ(Vector Labo)
社製］中にマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。
１細胞と形質転換していないＣＯＳ−１細胞をそれぞれ
ベクタシールド マウンティング メディウム［Vectas
hield mounting medium 、ベクターラボ(Vector Labo)
社製］中にマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１６】その結果、形質転換していないＣＯＳ−１
細胞は全く染色されていないのに対し、ｐＳＶ−ｈＣＳ
Ｔで形質転換した細胞では細胞表面が免疫蛍光染色され
ていることが確認された。すなわち、形質転換したＣＯ
Ｓ−１細胞中で硫酸基転移酵素が活性を発現しスルファ
チドを合成していることが示された。
細胞は全く染色されていないのに対し、ｐＳＶ−ｈＣＳ
Ｔで形質転換した細胞では細胞表面が免疫蛍光染色され
ていることが確認された。すなわち、形質転換したＣＯ
Ｓ−１細胞中で硫酸基転移酵素が活性を発現しスルファ
チドを合成していることが示された。
【０１１７】実施例４．組換え硫酸基転移酵素の物理化
学的性質 実施例３で得られた形質転換ＣＯＳ−１細胞を氷中で超
音波処理を行い、細胞を破砕した。これを遠心分離して
得られた上清を組換え硫酸基転移酵素の酵素溶液とし、
ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１９巻、
第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）に記載の方法
に従って物理化学的性質を測定した。その結果を以下に
示す。
学的性質 実施例３で得られた形質転換ＣＯＳ−１細胞を氷中で超
音波処理を行い、細胞を破砕した。これを遠心分離して
得られた上清を組換え硫酸基転移酵素の酵素溶液とし、
ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１９巻、
第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）に記載の方法
に従って物理化学的性質を測定した。その結果を以下に
示す。
【０１１８】（１）至適ｐＨ 本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨは、図１に示
すように６〜８付近に高い活性を有していた。すなわ
ち、図１は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨを
示す図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示
す。ｐＨ３．０〜６．０においては５０ｍＭ酢酸緩衝
液、ｐＨ６．０〜７．０においては５０ｍＭカコジル酸
緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０においては５０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液、ｐＨ８．０〜１０．０において
は５０ｍＭトリス緩衝液を使用し、活性測定を行った。
図中、黒四角印は酢酸緩衝液を、黒丸印はカコジル酸緩
衝液を、黒三角印はトリエタノールアミン緩衝液を、×
印はトリス緩衝液を示す。
すように６〜８付近に高い活性を有していた。すなわ
ち、図１は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨを
示す図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示
す。ｐＨ３．０〜６．０においては５０ｍＭ酢酸緩衝
液、ｐＨ６．０〜７．０においては５０ｍＭカコジル酸
緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０においては５０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液、ｐＨ８．０〜１０．０において
は５０ｍＭトリス緩衝液を使用し、活性測定を行った。
図中、黒四角印は酢酸緩衝液を、黒丸印はカコジル酸緩
衝液を、黒三角印はトリエタノールアミン緩衝液を、×
印はトリス緩衝液を示す。
【０１１９】（２）至適温度 本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度は、図２に示
すように約４０℃付近で最大活性を示した。すなわち、
図２は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度を示す
図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸は反応温度
（℃）を示す。
すように約４０℃付近で最大活性を示した。すなわち、
図２は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度を示す
図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸は反応温度
（℃）を示す。
【０１２０】（３）ｐＨ安定性 本発明の組換え硫酸基転移酵素をそれぞれのｐＨにおい
て６℃で１６時間保持した後、ｐＨを７．０に戻して酵
素活性を測定してｐＨ安定性を調べた。緩衝液としてｐ
Ｈ３．０〜６．０においては５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ
６．０〜７．０においては５０ｍＭカコジル酸緩衝液、
ｐＨ７．０〜８．０においては５０ｍＭトリエタノール
アミン緩衝液、ｐＨ８．０〜１０．０においては５０ｍ
Ｍトリス緩衝液を使用した。図３に示すように本発明の
組換え硫酸基転移酵素は、ｐＨ６〜１０の範囲で安定で
ある。すなわち、図３は本発明の組換え硫酸基転移酵素
のｐＨ安定性を示す図であり、縦軸は残存活性（％）、
横軸はｐＨを示す。図中、黒四角印は酢酸緩衝液を、黒
丸印はカコジル酸緩衝液を、黒三角印はトリエタノール
アミン緩衝液を、×印はトリス緩衝液を示す。
て６℃で１６時間保持した後、ｐＨを７．０に戻して酵
素活性を測定してｐＨ安定性を調べた。緩衝液としてｐ
Ｈ３．０〜６．０においては５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ
６．０〜７．０においては５０ｍＭカコジル酸緩衝液、
ｐＨ７．０〜８．０においては５０ｍＭトリエタノール
アミン緩衝液、ｐＨ８．０〜１０．０においては５０ｍ
Ｍトリス緩衝液を使用した。図３に示すように本発明の
組換え硫酸基転移酵素は、ｐＨ６〜１０の範囲で安定で
ある。すなわち、図３は本発明の組換え硫酸基転移酵素
のｐＨ安定性を示す図であり、縦軸は残存活性（％）、
横軸はｐＨを示す。図中、黒四角印は酢酸緩衝液を、黒
丸印はカコジル酸緩衝液を、黒三角印はトリエタノール
アミン緩衝液を、×印はトリス緩衝液を示す。
【０１２１】（４）熱安定性 本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性を調べたとこ
ろ図４に示すように３０℃では安定であるが、４０℃、
３０分間の処理で８５％の活性が失われた。すなわち、
図４は本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性を示す
図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸は反応温度
（℃）を示す。
ろ図４に示すように３０℃では安定であるが、４０℃、
３０分間の処理で８５％の活性が失われた。すなわち、
図４は本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性を示す
図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸は反応温度
（℃）を示す。
【０１２２】
【発明の効果】本発明により、Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌ
はガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で
表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特
異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素遺伝子が提供さ
れる。また、該遺伝子を用いる硫酸基転移酵素活性を持
つポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方
法、該遺伝子からコードされるポリペプチド及び該ポリ
ペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片が提供さ
れる。
はガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で
表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特
異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素遺伝子が提供さ
れる。また、該遺伝子を用いる硫酸基転移酵素活性を持
つポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方
法、該遺伝子からコードされるポリペプチド及び該ポリ
ペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片が提供さ
れる。
【０１２３】
配列番号：1 配列の長さ：423 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Leu Pro Pro Gln Lys Lys Pro Trp Glu Ser Met Ala Lys Gly 1 5 10 15 Leu Val Leu Gly Ala Leu Phe Thr Ser Phe Leu Leu Leu Val Tyr 20 25 30 Ser Tyr Ala Val Pro Pro Leu His Ala Gly Leu Ala Ser Thr Thr 35 40 45 Pro Glu Ala Ala Ala Ser Cys Ser Pro Pro Ala Leu Glu Pro Glu 50 55 60 Ala Val Ile Arg Ala Asn Gly Ser Ala Gly Glu Cys Gln Pro Arg 65 70 75 Arg Asn Ile Val Phe Leu Lys Thr His Lys Thr Ala Ser Ser Thr 80 85 90 Leu Leu Asn Ile Leu Phe Arg Phe Gly Gln Lys His Arg Leu Lys 95 100 105 Phe Ala Phe Pro Asn Gly Arg Asn Asp Phe Asp Tyr Pro Thr Phe 110 115 120 Phe Ala Arg Ser Leu Val Gln Asp Tyr Arg Pro Gly Ala Cys Phe 125 130 135 Asn Ile Ile Cys Asn His Met Arg Phe His Tyr Asp Glu Val Arg 140 145 150 Gly Leu Val Pro Thr Asn Ala Ile Phe Ile Thr Val Leu Arg Asp 155 160 165 Pro Ala Arg Leu Phe Glu Ser Ser Phe His Tyr Phe Gly Pro Val 170 175 180 Val Pro Leu Thr Trp Lys Leu Ser Ala Gly Asp Lys Leu Thr Glu 185 190 195 Phe Leu Gln Asp Pro Asp Arg Tyr Tyr Asp Pro Asn Gly Phe Asn 200 205 210 Ala His Tyr Leu Arg Asn Leu Leu Phe Phe Asp Leu Gly Tyr Asp 215 220 225 Asn Ser Leu Asp Pro Ser Ser Pro Gln Val Gln Glu His Ile Leu 230 235 240 Glu Val Glu Arg Arg Phe His Leu Val Leu Leu Gln Glu Tyr Phe 245 250 255 Asp Glu Ser Leu Val Leu Leu Lys Asp Leu Leu Cys Trp Glu Leu 260 265 270 Glu Asp Val Leu Tyr Phe Lys Leu Asn Ala Arg Arg Asp Ser Pro 275 280 285 Val Pro Arg Leu Ser Gly Glu Leu Tyr Gly Arg Ala Thr Ala Trp 290 295 300 Asn Met Leu Asp Ser His Leu Tyr Arg His Phe Asn Ala Ser Phe 305 310 315 Trp Arg Lys Val Glu Ala Phe Gly Arg Glu Arg Met Ala Arg Glu 320 325 330 Val Ala Ala Leu Arg His Ala Asn Glu Arg Met Arg Thr Ile Cys 335 340 345 Ile Asp Gly Gly His Ala Val Asp Ala Ala Ala Ile Gln Asp Glu 350 355 360 Ala Met Gln Pro Trp Gln Pro Leu Gly Thr Lys Ser Ile Leu Gly 365 370 375 Tyr Asn Leu Lys Lys Ser Ile Gly Gln Arg His Ala Gln Leu Cys 380 385 390 Arg Arg Met Leu Thr Pro Glu Ile Gln Tyr Leu Met Asp Leu Gly 395 400 405 Ala Asn Leu Trp Val Thr Lys Leu Trp Lys Phe Ile Arg Asp Phe 410 415 420 Leu Arg Trp
【０１２４】配列番号：2 配列の長さ：1269 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： ATGCTGCCAC CGCAGAAGAA GCCCTGGGAG TCCATGGCTA AGGGGCTGGT GCTGGGCGCG 60 CTCTTCACTA GTTTCCTGCT GCTGGTGTAC TCCTATGCCG TGCCCCCGCT GCATGCCGGC 120 CTGGCCTCCA CGACCCCGGA GGCCGCAGCG TCCTGCTCTC CACCTGCACT CGAGCCAGAG 180 GCAGTGATCC GGGCCAACGG CTCGGCGGGG GAGTGCCAGC CGCGGCGCAA CATCGTGTTC 240 TTGAAGACGC ACAAGACGGC CAGCAGCACC CTGCTCAACA TCCTGTTCCG CTTCGGCCAG 300 AAGCACCGGC TCAAGTTCGC CTTCCCTAAC GGCCGCAATG ACTTCGACTA CCCGACCTTC 360 TTCGCCCGCA GCCTGGTGCA GGACTATCGG CCCGGGGCCT GCTTCAACAT CATCTGCAAC 420 CACATGCGCT TCCACTACGA CGAGGTGCGC GGCCTGGTGC CGACCAACGC CATCTTCATC 480 ACGGTGCTCC GCGACCCCGC CCGCTTGTTC GAGTCCTCCT TCCACTACTT CGGGCCGGTG 540 GTGCCCCTCA CGTGGAAGCT CTCGGCCGGC GACAAGCTGA CCGAGTTCCT GCAAGACCCG 600 GATCGCTACT ACGACCCCAA CGGCTTCAAT GCCCACTACC TCCGAAACCT GCTCTTCTTC 660 GACCTGGGCT ATGACAACAG CCTGGACCCC AGCAGCCCGC AGGTGCAGGA GCACATCCTG 720 GAGGTGGAGC GTCGCTTCCA CCTGGTGCTC CTTCAAGAGT ACTTCGACGA GTCGCTGGTG 780 CTGCTGAAGG ACCTGCTGTG CTGGGAGCTG GAGGACGTGC TCTACTTCAA GCTCAACGCC 840 CGCCGCGACT CGCCCGTGCC GCGGCTCTCG GGGGAGCTGT ATGGGCGCGC CACCGCCTGG 900 AACATGCTGG ACTCCCACCT CTACCGCCAC TTCAACGCCA GCTTCTGGCG CAAGGTGGAG 960 GCCTTCGGGC GGGAGCGCAT GGCCCGCGAG GTGGCCGCCC TGCGCCATGC CAACGAGCGC 1020 ATGCGGACCA TCTGCATCGA CGGGGGCCAC GCCGTGGACG CCGCCGCCAT CCAGGACGAG 1080 GCCATGCAGC CCTGGCAGCC GCTGGGCACC AAGTCCATCC TGGGCTACAA CCTCAAGAAG 1140 AGCATCGGGC AGCGGCACGC GCAGCTCTGC CGGCGCATGC TCACGCCCGA GATCCAGTAC 1200 CTGATGGACC TCGGCGCCAA CCTGTGGGTC ACCAAGCTCT GGAAGTTCAT TCGCGATTTC 1260 CTGCGGTGG 1269
【０１２５】配列番号：3 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Thr Ala Ser Ser Thr Leu Leu Asn Ile Leu Phe Arg Phe Gly Gln 1 5 10 15 Lys
【０１２６】配列番号：4 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Lys Pro Trp Glu Ser Met Ala Lys 1 5
【０１２７】配列番号：5 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ser Ile Leu Gly Tyr Asn Leu Lys 1 5
【０１２８】配列番号：6 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：３番目、６番目及び１５番目のＮはイノシ
ンである。 配列： ACNGCNAGYA GYACNCT 17
ンである。 配列： ACNGCNAGYA GYACNCT 17
【０１２９】配列番号：7 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：６番目及び１２番目のＮはイノシンであ
る。 配列： TTYTGNCCRA ANCGRAA 17
る。 配列： TTYTGNCCRA ANCGRAA 17
【０１３０】配列番号：8 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTCTGGCCRA AGCGGAACAG GATGTTGAGC AGCGTRCTRC TCGCCGT 47
【０１３１】配列番号：9 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：６番目、９番目及び１５番目のＮはイノシ
ンである。 配列： AARCCNTGNG ARTCNATGG 19
ンである。 配列： AARCCNTGNG ARTCNATGG 19
【０１３２】配列番号：10 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：６番目、１５番目及び１８番目のＮはイノ
シンである。 配列： TTRTANAGRT TRTANCCNAG RAT 23
シンである。 配列： TTRTANAGRT TRTANCCNAG RAT 23
【０１３３】配列番号：11 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Leu Ser Ala Gly Asp Lys 1 5
【０１３４】配列番号：12 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Leu Asn Ala Leu Asn Asp Xaa Pro Val 1 5
【０１３５】配列番号：13 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： His Arg Leu Lys 1
【０１３６】配列番号：14 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Phe Ile Leu Asp Phe Leu Glu Xaa 1 5
【０１３７】配列番号：15 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：３番目、６番目、９番目、１２番目及び１
５番目のＮはイノシンである。 配列： ACNGCNTCNT CNACNCT 17
５番目のＮはイノシンである。 配列： ACNGCNTCNT CNACNCT 17
【０１３８】配列番号：16 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：３番目、６番目、１２番目及び１５番目の
Ｎはイノシンである。 配列： ACNGCNAGYT CNACNCT 17
Ｎはイノシンである。 配列： ACNGCNAGYT CNACNCT 17
【０１３９】配列番号：17 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：３番目、６番目、９番目及び１５番目のＮ
はイノシンである。 配列： ACNGCNTCNA GYACNCT 17
はイノシンである。 配列： ACNGCNTCNA GYACNCT 17
【０１４０】配列番号：18 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：６番目及び９番目のＮはイノシンである。 配列： AARCCNTGNG ARAGYATGG 19
【０１４１】配列番号：19 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：２番目、８番目、１４番目及び１７番目の
Ｎはイノシンである。 配列： TNGCCATNGA YTCNCANGG 19
Ｎはイノシンである。 配列： TNGCCATNGA YTCNCANGG 19
【０１４２】配列番号：20 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：２番目、１４番目及び１７番目のＮはイノ
シンである。 配列： TNGCCATRCT YTCNCANGG 19
シンである。 配列： TNGCCATRCT YTCNCANGG 19
【０１４３】配列番号：21 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：６番目、１５番目及び１８番目のＮはイノ
シンである。 配列： TTRTANAGRT TRTANCCNAG RAT 23
シンである。 配列： TTRTANAGRT TRTANCCNAG RAT 23
【０１４４】配列番号：22 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AAYATYYTNT TYCGNTTYGG 20
【０１４５】配列番号：23 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTYTGNCCRA ANCGRAA 17
【０１４６】配列番号：24 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AARCCNTGGG ARWSNATGGC 20
【０１４７】配列番号：25 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTNGCCATNS WYTCCCANGG 20
【０１４８】配列番号：26 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATYYTNGGNT AYAAYYTNAA 20
【０１４９】配列番号：27 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTNARRTTRT ANCCNARRAT 20
【０１５０】配列番号：28 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：９番目及び１５番目のＮはイノシンであ
る。 配列： AAYATYYTNT TYCGNTTYGG 20
る。 配列： AAYATYYTNT TYCGNTTYGG 20
【０１５１】配列番号：29 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：６番目及び１２番目のＮはイノシンであ
る。 配列： TTYTGNCCRA ANCGRAA 17
る。 配列： TTYTGNCCRA ANCGRAA 17
【０１５２】配列番号：30 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：６番目及び１５番目のＮはイノシンであ
る。 配列： AARCCNTGGG ARWSNATGGC 20
る。 配列： AARCCNTGGG ARWSNATGGC 20
【０１５３】配列番号：31 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：３番目、６番目及び１８番目のＮはイノシ
ンである。 配列： TTNGCCATNS WYTCCCANGG 20
ンである。 配列： TTNGCCATNS WYTCCCANGG 20
【０１５４】配列番号：32 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：６番目、９番目及び１８番目のＮはイノシ
ンである。 配列： ATYYTNGGNT AYAAYYTNAA 20
ンである。 配列： ATYYTNGGNT AYAAYYTNAA 20
【０１５５】配列番号：33 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：３番目、１２番目及び１５番目のＮはイノ
シンである。 配列： TTNARRTTRT ANCCNARRAT 20
シンである。 配列： TTNARRTTRT ANCCNARRAT 20
【図１】図１は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐ
Ｈを示す図である。
Ｈを示す図である。
【図２】図２は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温
度を示す図である。
度を示す図である。
【図３】図３は本発明の組換え硫酸基転移酵素のｐＨ安
定性を示す図である。
定性を示す図である。
【図４】図４は本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定
性を示す図である。
性を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (15)
- 【請求項１】 Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトー
ス、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖
に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基
を転移する硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを
コードする単離された遺伝子。 - 【請求項２】 配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸
配列又はその一部からなるポリペプチドをコードする請
求項１記載の遺伝子。 - 【請求項３】 配列表の配列番号：２に記載の塩基配列
又はその一部である請求項１記載の遺伝子。 - 【請求項４】 配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸
配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付
加、挿入又は置換されているポリペプチドであって、硫
酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする請
求項１記載の遺伝子。 - 【請求項５】 請求項２〜４いずれか１項に記載の遺伝
子とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ
することができ、かつ硫酸基転移酵素活性を有するポリ
ペプチドをコードする請求項１記載の遺伝子。 - 【請求項６】 請求項１〜５いずれか１項に記載の遺伝
子を含んでなる組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項６記載の組換えＤＮＡを挿入され
てなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とす
る発現ベクター。 - 【請求項８】 請求項７記載の発現ベクターを導入され
てなる形質転換体。 - 【請求項９】 請求項８記載の形質転換体を培養し、該
培養物より硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを
採取することを特徴とする、硫酸基転移酵素活性を有す
るポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜５いずれか１項に記載の遺
伝子によりコードされる、硫酸基転移酵素活性を有する
ポリペプチド。 - 【請求項１１】 請求項１〜５いずれか１項に記載の遺
伝子又はその一部に相補的なアンチセンスＤＮＡ。 - 【請求項１２】 請求項１〜５いずれか１項に記載の遺
伝子又はその一部に相補的なアンチセンスＲＮＡ。 - 【請求項１３】 請求項１１記載のアンチセンスＤＮＡ
を挿入されてなる発現ベクター。 - 【請求項１４】 請求項１〜５いずれか１項に記載の遺
伝子に特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオ
チドプローブ又はプライマー。 - 【請求項１５】 請求項１０記載のポリペプチドに特異
的に結合する抗体又はその断片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23874497A JP4063359B2 (ja) | 1997-01-23 | 1997-09-03 | 硫酸基転移酵素遺伝子 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2577697 | 1997-01-23 | ||
| JP9-25776 | 1997-01-23 | ||
| JP23874497A JP4063359B2 (ja) | 1997-01-23 | 1997-09-03 | 硫酸基転移酵素遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10262685A true JPH10262685A (ja) | 1998-10-06 |
| JP4063359B2 JP4063359B2 (ja) | 2008-03-19 |
Family
ID=26363466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23874497A Expired - Fee Related JP4063359B2 (ja) | 1997-01-23 | 1997-09-03 | 硫酸基転移酵素遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4063359B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016074693A (ja) * | 2007-07-27 | 2016-05-12 | イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー | 免疫療法用の新規免疫原性エピトープ |
-
1997
- 1997-09-03 JP JP23874497A patent/JP4063359B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016074693A (ja) * | 2007-07-27 | 2016-05-12 | イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー | 免疫療法用の新規免疫原性エピトープ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4063359B2 (ja) | 2008-03-19 |
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