JP2000333682A - ヒト由来シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents
ヒト由来シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト由来の、ラクトシルセラミドのガラクト
ース残基にシアル酸を転移してガングリオシドＧM3を合
成する酵素及びその酵素をコードするＤＮＡを提供す
る。 【解決手段】 癌細胞を分化誘導剤で処理することによ
り分化させ、分化した癌細胞からｃＤＮＡライブラリー
を作成して宿主細胞に導入し、ガングリオシドを細胞膜
上に発現した宿主細胞を検出し、上記で検出された宿主
細胞をソーティングしてライブラリーを濃縮して、濃縮
したライブラリーから導入した遺伝子を切り出す。
ース残基にシアル酸を転移してガングリオシドＧM3を合
成する酵素及びその酵素をコードするＤＮＡを提供す
る。 【解決手段】 癌細胞を分化誘導剤で処理することによ
り分化させ、分化した癌細胞からｃＤＮＡライブラリー
を作成して宿主細胞に導入し、ガングリオシドを細胞膜
上に発現した宿主細胞を検出し、上記で検出された宿主
細胞をソーティングしてライブラリーを濃縮して、濃縮
したライブラリーから導入した遺伝子を切り出す。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シアル酸転移酵素
及びそれをコードするＤＮＡに関する。より詳細にはラ
クトシルセラミドのガラクトース残基にシアル酸を転移
してガングリオシドＧM3を合成する酵素及びその酵素を
コードするＤＮＡに関する。
及びそれをコードするＤＮＡに関する。より詳細にはラ
クトシルセラミドのガラクトース残基にシアル酸を転移
してガングリオシドＧM3を合成する酵素及びその酵素を
コードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０は悪
性転換により無限増殖能を獲得した細胞株であり、白血
病細胞のモデルとして一般的に広く用いられている（Co
llins,S.J., Gallo, R.C., and Gallagher, R.E., Natu
re (London), 270, 347-349(1977); Collins, S.J., Bl
ood, 70, 1223(1987)）。上記細胞株は、培養を続けた
際にも分化することはなく未分化な細胞のまま増殖を続
けるが、上記細胞株の培養培地に分化誘導剤として広く
用いられているホルボールエステルを添加して培養を続
けると、細胞増殖を停止し、単球或いはマクロファージ
と同様な形態を示すようになり、分化が誘導される。そ
の過程でガングリオシドの一種であるＧM3量が顕著に増
大すること（Nojiri, H., Takaku, F., Tetsuka, T., a
nd Saito,M., Blood, 64, 534-541(1984)）、及び上記
ガングリオシドＧM3を外来性に添加した際もホルボール
エステルを添加した際と同様の変化、すなわち単球系分
化が細胞に起こることが報告されている（Saito, M., T
erui, Y., and Nojiri, H.,Biochem. Biophys. Res. Co
mmun., 132, 223-231(1985)）。また、この分化の過程
において、ＧM3そのものが分化誘導活性を有しているこ
と（Nojiri, H., Takaku., F., Miura, Y., and Saito,
M., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 782-786(19
86)）、さらに化学合成ＧM3によっても分化が誘導され
ることが証明されている（Sugimoto,M. and Ogawa,T.,
Glycoconj. J., 2, 5-9(1985); Saito,M., Nojiri, H.,
Ogino, H., Yuo, A., Ogura, H., Itoh, M., Tomita,
K., Ogawa, T., Nagai, Y., and Kitagawa, S., FEBS L
ett., 271, 85-88(1990)）。
性転換により無限増殖能を獲得した細胞株であり、白血
病細胞のモデルとして一般的に広く用いられている（Co
llins,S.J., Gallo, R.C., and Gallagher, R.E., Natu
re (London), 270, 347-349(1977); Collins, S.J., Bl
ood, 70, 1223(1987)）。上記細胞株は、培養を続けた
際にも分化することはなく未分化な細胞のまま増殖を続
けるが、上記細胞株の培養培地に分化誘導剤として広く
用いられているホルボールエステルを添加して培養を続
けると、細胞増殖を停止し、単球或いはマクロファージ
と同様な形態を示すようになり、分化が誘導される。そ
の過程でガングリオシドの一種であるＧM3量が顕著に増
大すること（Nojiri, H., Takaku, F., Tetsuka, T., a
nd Saito,M., Blood, 64, 534-541(1984)）、及び上記
ガングリオシドＧM3を外来性に添加した際もホルボール
エステルを添加した際と同様の変化、すなわち単球系分
化が細胞に起こることが報告されている（Saito, M., T
erui, Y., and Nojiri, H.,Biochem. Biophys. Res. Co
mmun., 132, 223-231(1985)）。また、この分化の過程
において、ＧM3そのものが分化誘導活性を有しているこ
と（Nojiri, H., Takaku., F., Miura, Y., and Saito,
M., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 782-786(19
86)）、さらに化学合成ＧM3によっても分化が誘導され
ることが証明されている（Sugimoto,M. and Ogawa,T.,
Glycoconj. J., 2, 5-9(1985); Saito,M., Nojiri, H.,
Ogino, H., Yuo, A., Ogura, H., Itoh, M., Tomita,
K., Ogawa, T., Nagai, Y., and Kitagawa, S., FEBS L
ett., 271, 85-88(1990)）。
【０００３】一方、シアル酸含有糖脂質、その中でも特
にガングリオシドが様々な生物現象において重要な機能
を担っていることが明らかとなり、その機能のみならず
生合成が解明されつつある。脊椎動物において、多くの
ガングリオシド（ガングリオ系ガングリオシド）は主要
ガングリオシドのうちで最も単純な構造を持つＧM3を共
通の前駆体としており、主要な機能を持つガングリオシ
ドの生合成の根幹をＧ M3の合成がなしている。
にガングリオシドが様々な生物現象において重要な機能
を担っていることが明らかとなり、その機能のみならず
生合成が解明されつつある。脊椎動物において、多くの
ガングリオシド（ガングリオ系ガングリオシド）は主要
ガングリオシドのうちで最も単純な構造を持つＧM3を共
通の前駆体としており、主要な機能を持つガングリオシ
ドの生合成の根幹をＧ M3の合成がなしている。
【０００４】上述のようにガングリオシドＧM3はそれ自
体が細胞・組織の増殖・分化に関与するとともに脊椎動
物においては様々な機能を有するより高級なガングリオ
シド群の前駆体となっていることが示唆されている。
体が細胞・組織の増殖・分化に関与するとともに脊椎動
物においては様々な機能を有するより高級なガングリオ
シド群の前駆体となっていることが示唆されている。
【０００５】ＧM3は、ＣＭＰ−シアル酸：ラクトシルセ
ラミドシアル酸転移酵素（CMP-NeuAc;Galβ1-4Glcβ1-
1'Cerα2,3-sialyltransferase:SAT-1）によってラクト
シルセラミド中のガラクトース残基にシアル酸が転移す
ることによってラクトシルセラミドから合成されると考
えられているが、ヒト由来の当該酵素は単離されておら
ず、またその遺伝子も特定されていない。
ラミドシアル酸転移酵素（CMP-NeuAc;Galβ1-4Glcβ1-
1'Cerα2,3-sialyltransferase:SAT-1）によってラクト
シルセラミド中のガラクトース残基にシアル酸が転移す
ることによってラクトシルセラミドから合成されると考
えられているが、ヒト由来の当該酵素は単離されておら
ず、またその遺伝子も特定されていない。
【０００６】ガラクトシド構造にシアル酸をα２−３ケ
トシド結合を介して転移する酵素としては、Wienstein
et al., J. Biol. Chem., 257, 13835(1982)、Gillespi
e etal., Glycoconj., 7, 469(1990)、Gillespie,W., K
elm,S. and Paulson,JC., J. Biol. Chem., 267, p2100
1-21010(1992)、Lee,YC., Kojima,N., Wada,E., Kurosa
wa,N., Nakaoka,T., Hashimoto,T. and Tsuji,S., J. B
iol. Chem., 269, p10028-10033(1994)、Kim,YJ., Kim,
KS., Kim,SH., Kim,CH., Ko,JH., Choe,IS.,Tsuji,S. a
nd Lee,YC., Biochem. Biophys. Res. Commun., 228, p
324-327(1996)、特開平５−３３６９６３号公報などが
知られているが、いずれの酵素もＧM3の合成への関与は
知られておらず、ラクトシルセラミドにシアル酸をα２
−３ケトシド結合で転移する酵素活性を示してはいな
い。Sandhoff,K.らは、α２−８シアル酸転移酵素（Ｓ
ＡＴ４）と、ＧM3を合成する酵素が同一であると推定し
ている（J. Biol. Chem., 268, 5341(1993)）が、それ
は間接的な方法に基づく推定であり、物質として同一で
あることを裏付けているものではない。
トシド結合を介して転移する酵素としては、Wienstein
et al., J. Biol. Chem., 257, 13835(1982)、Gillespi
e etal., Glycoconj., 7, 469(1990)、Gillespie,W., K
elm,S. and Paulson,JC., J. Biol. Chem., 267, p2100
1-21010(1992)、Lee,YC., Kojima,N., Wada,E., Kurosa
wa,N., Nakaoka,T., Hashimoto,T. and Tsuji,S., J. B
iol. Chem., 269, p10028-10033(1994)、Kim,YJ., Kim,
KS., Kim,SH., Kim,CH., Ko,JH., Choe,IS.,Tsuji,S. a
nd Lee,YC., Biochem. Biophys. Res. Commun., 228, p
324-327(1996)、特開平５−３３６９６３号公報などが
知られているが、いずれの酵素もＧM3の合成への関与は
知られておらず、ラクトシルセラミドにシアル酸をα２
−３ケトシド結合で転移する酵素活性を示してはいな
い。Sandhoff,K.らは、α２−８シアル酸転移酵素（Ｓ
ＡＴ４）と、ＧM3を合成する酵素が同一であると推定し
ている（J. Biol. Chem., 268, 5341(1993)）が、それ
は間接的な方法に基づく推定であり、物質として同一で
あることを裏付けているものではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ガングリオシドＧM3の
重要性が明らかになるにつれてその生合成を解明、制御
する試みがなされてきたが、ＧM3の合成に深く関わる上
記シアル酸転移酵素はその酵素タンパク質精製の困難性
のため未だヒトからは単離されておらず、遺伝子発現調
節機構はもとより、タンパク質化学的解析及び酵素学的
解析でさえ未だなされていない。
重要性が明らかになるにつれてその生合成を解明、制御
する試みがなされてきたが、ＧM3の合成に深く関わる上
記シアル酸転移酵素はその酵素タンパク質精製の困難性
のため未だヒトからは単離されておらず、遺伝子発現調
節機構はもとより、タンパク質化学的解析及び酵素学的
解析でさえ未だなされていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記シアル
酸転移酵素の遺伝子発現調節機構、タンパク質化学的解
析及び酵素学的解析を進めることにより、細胞分化の制
御を解明すべく鋭意検討を重ねた結果、発現クローニン
グ法により上記ＧM3の合成に関与するシアル酸転移酵素
をコードする塩基配列を有するヒト由来のｃＤＮＡの単
離に成功し、当該ｃＤＮＡの塩基配列をもとに上記シア
ル酸転移酵素の構造を明らかにした。その結果、当該酵
素が既知のシアル酸転移酵素と相同性が低く、また前記
Sandhoff,K.らが同一と推定したα２−８シアル酸転移
酵素とも別の新規酵素であることが明らかとなった。
酸転移酵素の遺伝子発現調節機構、タンパク質化学的解
析及び酵素学的解析を進めることにより、細胞分化の制
御を解明すべく鋭意検討を重ねた結果、発現クローニン
グ法により上記ＧM3の合成に関与するシアル酸転移酵素
をコードする塩基配列を有するヒト由来のｃＤＮＡの単
離に成功し、当該ｃＤＮＡの塩基配列をもとに上記シア
ル酸転移酵素の構造を明らかにした。その結果、当該酵
素が既知のシアル酸転移酵素と相同性が低く、また前記
Sandhoff,K.らが同一と推定したα２−８シアル酸転移
酵素とも別の新規酵素であることが明らかとなった。
【０００９】すなわち、本発明は、配列番号２記載のア
ミノ酸配列におけるアミノ酸番号４１〜３６２のアミノ
酸配列を少なくとも含むポリペプチドを含み、ガラクト
ース残基の３位水酸基にシアル酸を転移する作用を有す
るシアル酸転移酵素を提供する。
ミノ酸配列におけるアミノ酸番号４１〜３６２のアミノ
酸配列を少なくとも含むポリペプチドを含み、ガラクト
ース残基の３位水酸基にシアル酸を転移する作用を有す
るシアル酸転移酵素を提供する。
【００１０】本発明のシアル酸合成酵素は、好ましく
は、配列番号２記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番
号１〜３６２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含
む。
は、配列番号２記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番
号１〜３６２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含
む。
【００１１】本発明のシアル酸合成酵素は、好ましく
は、ラクトシルセラミドのガラクトース残基にシアル酸
を転移してα２→３結合を形成し、ガングリオシドＧM3
を生成する活性を有する。
は、ラクトシルセラミドのガラクトース残基にシアル酸
を転移してα２→３結合を形成し、ガングリオシドＧM3
を生成する活性を有する。
【００１２】本発明は、また、配列番号５記載のアミノ
酸配列を少なくとも含むポリペプチドを含み、ガラクト
ース残基の３位水酸基にシアル酸を転移する作用を有す
るシアル酸転移酵素を提供する。
酸配列を少なくとも含むポリペプチドを含み、ガラクト
ース残基の３位水酸基にシアル酸を転移する作用を有す
るシアル酸転移酵素を提供する。
【００１３】また、本発明は、配列番号２記載のアミノ
酸配列におけるアミノ酸番号４１〜３６２のアミノ酸配
列を少なくとも含みポリペプチド及びそれをコードする
ＤＮＡを提供する。このポリペプチドは、好ましくは、
配列番号２記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１
〜３６２のアミノ酸配列を有する。上記ＤＮＡとして
は、配列番号１記載の塩基配列を有するものが挙げられ
る。
酸配列におけるアミノ酸番号４１〜３６２のアミノ酸配
列を少なくとも含みポリペプチド及びそれをコードする
ＤＮＡを提供する。このポリペプチドは、好ましくは、
配列番号２記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１
〜３６２のアミノ酸配列を有する。上記ＤＮＡとして
は、配列番号１記載の塩基配列を有するものが挙げられ
る。
【００１４】さらに、本発明は、上記ＤＮＡを含む組換
えベクター、上記ＤＮＡが導入され、かつ該ＤＮＡが発
現可能な形質転換体、および、この形質転換体を、好適
な培地で培養し、上記ＤＮＡがコードするシアル酸転移
酵素又はそのポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、
その培養物からシアル酸転移酵素又はそのポリペプチド
を採取することを特徴とする、シアル酸転移酵素又はそ
のポリペプチドの製造方法を提供する。
えベクター、上記ＤＮＡが導入され、かつ該ＤＮＡが発
現可能な形質転換体、および、この形質転換体を、好適
な培地で培養し、上記ＤＮＡがコードするシアル酸転移
酵素又はそのポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、
その培養物からシアル酸転移酵素又はそのポリペプチド
を採取することを特徴とする、シアル酸転移酵素又はそ
のポリペプチドの製造方法を提供する。
【００１５】なお、本明細書において「酵素をコードす
る」とは、当該酵素のポリペプチドをコードすることを
意味する。また、本明細書中では、以下、シアル酸供与
体からシアル酸受容体であるラクトシルセラミドに含ま
れるガラクトース残基の３位水酸基へ選択的にシアル酸
を転移してα２→３結合を形成しガングリオシドＧM3を
生成する活性を有する本発明のシアル酸転移酵素を便宜
的にシアル酸転移酵素−１又はＳＡＴ−１とも記載す
る。
る」とは、当該酵素のポリペプチドをコードすることを
意味する。また、本明細書中では、以下、シアル酸供与
体からシアル酸受容体であるラクトシルセラミドに含ま
れるガラクトース残基の３位水酸基へ選択的にシアル酸
を転移してα２→３結合を形成しガングリオシドＧM3を
生成する活性を有する本発明のシアル酸転移酵素を便宜
的にシアル酸転移酵素−１又はＳＡＴ−１とも記載す
る。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。
明する。
【００１７】＜１＞本発明のシアル酸転移酵素−１（本
発明酵素）及びそれをコードするＤＮＡ（本発明ＤＮ
Ａ） 本発明酵素は、配列番号２のアミノ酸配列におけるアミ
ノ酸番号４１〜３６２のアミノ酸配列を少なくとも含む
ポリペプチドを含み、ガラクトース残基の３位水酸基に
シアル酸を転移する作用を有する。
発明酵素）及びそれをコードするＤＮＡ（本発明ＤＮ
Ａ） 本発明酵素は、配列番号２のアミノ酸配列におけるアミ
ノ酸番号４１〜３６２のアミノ酸配列を少なくとも含む
ポリペプチドを含み、ガラクトース残基の３位水酸基に
シアル酸を転移する作用を有する。
【００１８】本発明酵素は、通常には、以下のような理
化学的性質を有する。 作用：シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラ
クトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水
酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧM3
を生成する。すなわち、上記シアル酸受容体のガラクト
ース残基の３位の水酸基以外には実質的にシアル酸を転
移しない。シアル酸供与体としてはＣＭＰ−シアル酸が
好適には挙げられる。
化学的性質を有する。 作用：シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラ
クトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水
酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧM3
を生成する。すなわち、上記シアル酸受容体のガラクト
ース残基の３位の水酸基以外には実質的にシアル酸を転
移しない。シアル酸供与体としてはＣＭＰ−シアル酸が
好適には挙げられる。
【００１９】好ましくは、さらに、以下のような理化学
的性質を有する。 至適反応ｐＨ：本酵素は、実施例中に記載の酵素活性
測定方法において、酵素反応液のｐＨ６．０〜７．０の
範囲、特にｐＨ６．５付近で高いシアル酸転移活性を有
する。 阻害及び活性化：１０ｍＭ Ｍｎ2+存在下で、非存在
下と比して１．５倍以上に活性が上がる。
的性質を有する。 至適反応ｐＨ：本酵素は、実施例中に記載の酵素活性
測定方法において、酵素反応液のｐＨ６．０〜７．０の
範囲、特にｐＨ６．５付近で高いシアル酸転移活性を有
する。 阻害及び活性化：１０ｍＭ Ｍｎ2+存在下で、非存在
下と比して１．５倍以上に活性が上がる。
【００２０】また、本発明酵素には、ガラクトース残基
の３位水酸基にシアル酸を転移する作用（好ましくは上
記の作用）を有し、配列番号５のアミノ酸配列を少な
くとも含むポリペプチドを含むものも包含される。配列
番号５のアミノ酸配列は一般的にシアル酸転位酵素に存
在するいわゆるシアリルモチーフに相当する配列であ
り、通常には、シアル酸転移酵素−１のポリペプチドの
アミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列にお
けるアミノ酸番号１３６〜１８３の部分に相当する部分
に存在する。
の３位水酸基にシアル酸を転移する作用（好ましくは上
記の作用）を有し、配列番号５のアミノ酸配列を少な
くとも含むポリペプチドを含むものも包含される。配列
番号５のアミノ酸配列は一般的にシアル酸転位酵素に存
在するいわゆるシアリルモチーフに相当する配列であ
り、通常には、シアル酸転移酵素−１のポリペプチドの
アミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列にお
けるアミノ酸番号１３６〜１８３の部分に相当する部分
に存在する。
【００２１】本発明ＤＮＡには、上記のポリペプチドを
コードしているものが包含され、これらのポリペプチド
をコードしているのであればその塩基配列は特に限定さ
れない。
コードしているものが包含され、これらのポリペプチド
をコードしているのであればその塩基配列は特に限定さ
れない。
【００２２】すなわち、配列番号２のアミノ酸配列は、
ガラクトース残基の３位水酸基へシアル酸を転移する活
性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の
置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよく、そのよ
うなアミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は転位を有する
ポリペプチドをコードする、塩基配列の置換、欠失、挿
入及び転位を有するＤＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに
包含される。本明細書における「アミノ酸の数個」とは
当該酵素の活性が失われない程度の、変異を起こしても
よいアミノ酸の数を示し、例えば３６０アミノ酸残基か
らなるポリペプチドの場合、２０程度以下、好ましくは
１０程度以下の数を示す。当該酵素の活性の測定法は公
知の方法（特開平７−３２７６７８号公報）において宿
主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質を変更すること
によって容易に行うことが可能であり、例えば本明細書
中において具体的に示した方法により当業者であれば容
易に実施可能であるため、目的とする酵素活性の有無を
指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミ
ノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択する
ことができる。ＤＮＡの塩基配列の置換、欠失、挿入又
は転位は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の
両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配
列の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡに導
入することができる。また、部位特異的変異法（Krame
r,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350
(1987); Kunkel,T.A. et al., Meth. in Enzymol., 15
4, 367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡに置換、
欠失、挿入又は転位を導入することができる。
ガラクトース残基の３位水酸基へシアル酸を転移する活
性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の
置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよく、そのよ
うなアミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は転位を有する
ポリペプチドをコードする、塩基配列の置換、欠失、挿
入及び転位を有するＤＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに
包含される。本明細書における「アミノ酸の数個」とは
当該酵素の活性が失われない程度の、変異を起こしても
よいアミノ酸の数を示し、例えば３６０アミノ酸残基か
らなるポリペプチドの場合、２０程度以下、好ましくは
１０程度以下の数を示す。当該酵素の活性の測定法は公
知の方法（特開平７−３２７６７８号公報）において宿
主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質を変更すること
によって容易に行うことが可能であり、例えば本明細書
中において具体的に示した方法により当業者であれば容
易に実施可能であるため、目的とする酵素活性の有無を
指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミ
ノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択する
ことができる。ＤＮＡの塩基配列の置換、欠失、挿入又
は転位は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の
両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配
列の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡに導
入することができる。また、部位特異的変異法（Krame
r,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350
(1987); Kunkel,T.A. et al., Meth. in Enzymol., 15
4, 367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡに置換、
欠失、挿入又は転位を導入することができる。
【００２３】また、配列番号２のアミノ酸配列は、ヒト
由来のものであるが、個体間においてアミノ酸配列に活
性に影響を与えない相違があり得ること（同等の活性の
変異体が存在し得ること）が当然に予想される。従って
上記のガラクトース残基の３位水酸基へシアル酸を転移
する活性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸
残基の置換、欠失、挿入又は転位は、個体間変異程度の
範囲内であることが好ましい。
由来のものであるが、個体間においてアミノ酸配列に活
性に影響を与えない相違があり得ること（同等の活性の
変異体が存在し得ること）が当然に予想される。従って
上記のガラクトース残基の３位水酸基へシアル酸を転移
する活性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸
残基の置換、欠失、挿入又は転位は、個体間変異程度の
範囲内であることが好ましい。
【００２４】本発明ＤＮＡとして具体的には配列番号２
のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部
分塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましいが
これに限定はされない。上記の「部分塩基配列を有する
ＤＮＡ」とは、例えばシアル酸転移酵素−１のポリペプ
チド（特に、配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ
酸番号３０〜３６２、３８〜３６２、４１〜３６２又は
１３６〜１８３のアミノ酸配列の部分）をコードするＤ
ＮＡとハイブリダイズしシアル酸転移酵素−１のＤＮＡ
を検出するためのプローブとして使用することができる
又はそれによってコードされるポリペプチドがシアル酸
転移酵素−１活性を有するあるいはシアル酸転移酵素−
１と同様の抗原性を有するＤＮＡ又はそれに相補的なＤ
ＮＡもしくはＲＮＡを示す。上記ハイブリダイズは、一
般にスクリーニング等のＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡをハ
イブリダイズさせる際に用いられている方法によって行
えばよく、例えば、ＤＮＡのスクリーニングなどに使用
される条件としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰ
Ｅ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ緩衝
液）、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、
０．５％ＳＤＳと５０μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子
ＤＮＡを含む溶液中で目的ＤＮＡをプレハイブリダイズ
し、32Ｐラベルした本発明ＤＮＡ（例えば配列番号１記
載の塩基配列を有するＤＮＡ）を添加し、４２℃で１６
時間ハイブリダイズさせた後、５５℃で１×ＳＳＰＥ、
１％ＳＤＳ、さらに０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ
により洗浄することが挙げられる。一般的なハイブリダ
イズは上述のような条件下で行われることが多いが、当
業者であれば同様のハイブリダイズを目的として各溶液
の組成や詳細な条件を変更することにより同様のハイブ
リダイズを行うことが可能であるため、同様な効果を得
ることが可能な条件であれば上述の条件に特に限定はさ
れない。
のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部
分塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましいが
これに限定はされない。上記の「部分塩基配列を有する
ＤＮＡ」とは、例えばシアル酸転移酵素−１のポリペプ
チド（特に、配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ
酸番号３０〜３６２、３８〜３６２、４１〜３６２又は
１３６〜１８３のアミノ酸配列の部分）をコードするＤ
ＮＡとハイブリダイズしシアル酸転移酵素−１のＤＮＡ
を検出するためのプローブとして使用することができる
又はそれによってコードされるポリペプチドがシアル酸
転移酵素−１活性を有するあるいはシアル酸転移酵素−
１と同様の抗原性を有するＤＮＡ又はそれに相補的なＤ
ＮＡもしくはＲＮＡを示す。上記ハイブリダイズは、一
般にスクリーニング等のＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡをハ
イブリダイズさせる際に用いられている方法によって行
えばよく、例えば、ＤＮＡのスクリーニングなどに使用
される条件としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰ
Ｅ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ緩衝
液）、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、
０．５％ＳＤＳと５０μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子
ＤＮＡを含む溶液中で目的ＤＮＡをプレハイブリダイズ
し、32Ｐラベルした本発明ＤＮＡ（例えば配列番号１記
載の塩基配列を有するＤＮＡ）を添加し、４２℃で１６
時間ハイブリダイズさせた後、５５℃で１×ＳＳＰＥ、
１％ＳＤＳ、さらに０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ
により洗浄することが挙げられる。一般的なハイブリダ
イズは上述のような条件下で行われることが多いが、当
業者であれば同様のハイブリダイズを目的として各溶液
の組成や詳細な条件を変更することにより同様のハイブ
リダイズを行うことが可能であるため、同様な効果を得
ることが可能な条件であれば上述の条件に特に限定はさ
れない。
【００２５】本発明ＤＮＡが有する塩基配列としてより
具体的には、配列番号１に示す全塩基配列又はその部分
配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。このよ
うなＤＮＡとして具体的には、配列番号１における塩基
番号２７８〜１３６３、３６５〜１３６３、３８９〜１
３６３、３９８〜１３６３又は６８２〜８２６の塩基配
列からなるＤＮＡが挙げられる。
具体的には、配列番号１に示す全塩基配列又はその部分
配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。このよ
うなＤＮＡとして具体的には、配列番号１における塩基
番号２７８〜１３６３、３６５〜１３６３、３８９〜１
３６３、３９８〜１３６３又は６８２〜８２６の塩基配
列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００２６】配列番号１に示す塩基配列においては、シ
アル酸転移酵素−１のｃＤＮＡのオープンリーディング
フレームの５'末端部に３つのイン・フレームのＡＴＧ
コドンが含まれている。３つのＡＴＧコドンの周囲の塩
基配列は、全て−３の位置のプリンが保存されている。
このことは効率的な翻訳に関するＫｏｚａｋの知見（Ko
zak, M. (1986) Cell, 44, 283-292）を満足しており、
いずれのＡＴＧコドンも開始コドンとして機能する可能
性がある。
アル酸転移酵素−１のｃＤＮＡのオープンリーディング
フレームの５'末端部に３つのイン・フレームのＡＴＧ
コドンが含まれている。３つのＡＴＧコドンの周囲の塩
基配列は、全て−３の位置のプリンが保存されている。
このことは効率的な翻訳に関するＫｏｚａｋの知見（Ko
zak, M. (1986) Cell, 44, 283-292）を満足しており、
いずれのＡＴＧコドンも開始コドンとして機能する可能
性がある。
【００２７】ところで、β−１，４−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを
含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988)
J.Biochem, 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988)
J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaper
らは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ
は、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いもの
との両方の形態が合成されることを示している。さら
に、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に
標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在
することを示唆する証拠を示している（Lopez, L. et a
l. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15591）。同様
に、シアル酸転移酵素−１についても、複数のＡＴＧコ
ドンが開始コドンとして機能する可能性はあるが、定か
ではない。しかし、いずれのＡＴＧコドンが開始コドン
であっても、上記のシアル酸転移酵素−１のポリペプチ
ドをコードする点では同じであり、第２番目、第３番目
のＡＴＧコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本
発明に包含されるものである。従って、シアル酸転移酵
素−１のポリペプチドは配列番号２記載のアミノ酸配列
において少なくともアミノ酸番号４１〜３６２に相当す
る領域を有するものである。
ンスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを
含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988)
J.Biochem, 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988)
J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaper
らは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ
は、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いもの
との両方の形態が合成されることを示している。さら
に、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に
標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在
することを示唆する証拠を示している（Lopez, L. et a
l. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15591）。同様
に、シアル酸転移酵素−１についても、複数のＡＴＧコ
ドンが開始コドンとして機能する可能性はあるが、定か
ではない。しかし、いずれのＡＴＧコドンが開始コドン
であっても、上記のシアル酸転移酵素−１のポリペプチ
ドをコードする点では同じであり、第２番目、第３番目
のＡＴＧコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本
発明に包含されるものである。従って、シアル酸転移酵
素−１のポリペプチドは配列番号２記載のアミノ酸配列
において少なくともアミノ酸番号４１〜３６２に相当す
る領域を有するものである。
【００２８】配列番号１の最初のＡＴＧコドンで始まる
単一のオープンリーディングフレームからは、３６２ア
ミノ酸残基からなり、分子量４１，７５４Ｄａ、Ｎ−結
合グリコシレーション部位である可能性がある２カ所の
部位を有するタンパク質が予測される。このアミノ酸配
列から作成したハイドロパシープロット（図１）から、
Ｎ末端から１６〜２９番目のアミノ酸残基に渡る長さ１
４残基の連続した１つの顕著な疎水性部分が認められ、
トランスメンブレンドメイン（膜貫通領域）を有するこ
とが予想される。
単一のオープンリーディングフレームからは、３６２ア
ミノ酸残基からなり、分子量４１，７５４Ｄａ、Ｎ−結
合グリコシレーション部位である可能性がある２カ所の
部位を有するタンパク質が予測される。このアミノ酸配
列から作成したハイドロパシープロット（図１）から、
Ｎ末端から１６〜２９番目のアミノ酸残基に渡る長さ１
４残基の連続した１つの顕著な疎水性部分が認められ、
トランスメンブレンドメイン（膜貫通領域）を有するこ
とが予想される。
【００２９】尚、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配
列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、
当業者であれば容易に理解されるところである。
列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、
当業者であれば容易に理解されるところである。
【００３０】また、本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに
相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明
ＤＮＡは、ＳＡＴ−１をコードするコード鎖のみの一本
鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な配
列を有するＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖からなる二本鎖であっ
てもよい。
相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明
ＤＮＡは、ＳＡＴ−１をコードするコード鎖のみの一本
鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な配
列を有するＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖からなる二本鎖であっ
てもよい。
【００３１】また、本発明ＤＮＡは、ＳＡＴ−１のポリ
ペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配列を
有していてもよく、またＳＡＴ−１のポリペプチドの一
部分をコードする塩基配列を有するものであってもよ
い。
ペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配列を
有していてもよく、またＳＡＴ−１のポリペプチドの一
部分をコードする塩基配列を有するものであってもよ
い。
【００３２】上述のようにＳＡＴ−１のポリペプチドは
膜貫通領域を有するが、膜内の末端にあたるＮ末端部か
ら当該膜貫通領域を含む領域を欠失したＳＡＴ−１のポ
リペプチドの部分もまた本発明のポリペプチドに包含さ
れる。また、このようなポリペプチドがＳＡＴ−１とし
ての活性を有する限り、本発明のシアル酸転移酵素に含
まれるポリペプチドの範疇である。このようなポリペプ
チドを具体的に例示すると、例えば配列番号２に示すア
ミノ酸配列におけるアミノ酸番号３０〜３６２、３８〜
３６２又は４１〜３６２などが挙げられる。
膜貫通領域を有するが、膜内の末端にあたるＮ末端部か
ら当該膜貫通領域を含む領域を欠失したＳＡＴ−１のポ
リペプチドの部分もまた本発明のポリペプチドに包含さ
れる。また、このようなポリペプチドがＳＡＴ−１とし
ての活性を有する限り、本発明のシアル酸転移酵素に含
まれるポリペプチドの範疇である。このようなポリペプ
チドを具体的に例示すると、例えば配列番号２に示すア
ミノ酸配列におけるアミノ酸番号３０〜３６２、３８〜
３６２又は４１〜３６２などが挙げられる。
【００３３】＜２＞本発明ＤＮＡの製造方法 以下、本発明ＤＮＡを得る方法について説明する。本発
明によりＳＡＴ−１のポリペプチドのアミノ酸配列が明
らかにされたので、その配列に基づいて作成したオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラー
ゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡ
あるいはｍＲＮＡから本発明ＤＮＡを増幅することによ
って取得することも可能である。また、特に以下の各工
程からなる発現クローニング法により製造することが可
能である。 （１）ヒト由来の癌細胞を分化誘導剤で処理することに
より分化させる。 （２）分化した癌細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成
し、宿主細胞に導入する。 （３）ガングリオシドを細胞膜上に発現した宿主細胞を
検出する。 （４）上記で検出された宿主細胞をソーティングして、
ライブラリーを濃縮する。 （５）濃縮したライブラリーから導入した遺伝子を切り
出す。
明によりＳＡＴ−１のポリペプチドのアミノ酸配列が明
らかにされたので、その配列に基づいて作成したオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラー
ゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡ
あるいはｍＲＮＡから本発明ＤＮＡを増幅することによ
って取得することも可能である。また、特に以下の各工
程からなる発現クローニング法により製造することが可
能である。 （１）ヒト由来の癌細胞を分化誘導剤で処理することに
より分化させる。 （２）分化した癌細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成
し、宿主細胞に導入する。 （３）ガングリオシドを細胞膜上に発現した宿主細胞を
検出する。 （４）上記で検出された宿主細胞をソーティングして、
ライブラリーを濃縮する。 （５）濃縮したライブラリーから導入した遺伝子を切り
出す。
【００３４】スクリーニングによって、通常には上記Ｓ
ＡＴ−１の完全長ｃＤＮＡを選択する。
ＡＴ−１の完全長ｃＤＮＡを選択する。
【００３５】以下に、本発明ＤＮＡを製造する方法の一
例を具体的に説明する。 （１）癌細胞の分化誘導 癌細胞としては、ヒト由来の浮遊系細胞が好ましく、そ
のような癌細胞として血球系のリンパ種及び白血病のヒ
ト由来の細胞が挙げられ好ましい。そのような細胞とし
て、例えばヒト由来のＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２
４０）、ＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８２）、
Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）等の細胞が好ま
しく、新鮮骨髄性白血病細胞なども用いることが可能で
ある。そのような癌細胞の中でも、特にＨＬ−６０が分
化誘導を行いやすいため好ましい。培養したこの癌細胞
株に分化誘導剤を添加して２０時間以上、好ましくは２
４〜４８時間程度培養することによって分化を誘導す
る。培養法としては使用する細胞によって適した条件下
で行えばよいが、通常、一般的な細胞培養条件として５
〜７vol％ＣＯ2、９５〜９３vol％空気条件下で３７〜３
８℃が挙げられる。分化誘導剤としては例えばホルボー
ルエステル（12-O-テトラデカノイルホルボールエステ
ル(TPA)など）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、
レチノイン酸（ＲＡ）及び1α,25-ジヒドロキシビタミ
ンD3（1α,25(OH2)D3）等が挙げられ、特に限定はされ
ないが、その中でもＴＰＡが多くの白血病細胞株に対し
て比較的同様な分化誘導活性を有するため好ましい。例
えば癌細胞としてＨＬ−６０、分化誘導剤としてＴＰＡ
を使用する場合は、２４ｎＭ程度のＴＰＡ存在下で４８
時間培養することにより、ＨＬ−６０は単球・マクロフ
ァージ様に分化し、形態の変化が観察される。
例を具体的に説明する。 （１）癌細胞の分化誘導 癌細胞としては、ヒト由来の浮遊系細胞が好ましく、そ
のような癌細胞として血球系のリンパ種及び白血病のヒ
ト由来の細胞が挙げられ好ましい。そのような細胞とし
て、例えばヒト由来のＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２
４０）、ＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８２）、
Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）等の細胞が好ま
しく、新鮮骨髄性白血病細胞なども用いることが可能で
ある。そのような癌細胞の中でも、特にＨＬ−６０が分
化誘導を行いやすいため好ましい。培養したこの癌細胞
株に分化誘導剤を添加して２０時間以上、好ましくは２
４〜４８時間程度培養することによって分化を誘導す
る。培養法としては使用する細胞によって適した条件下
で行えばよいが、通常、一般的な細胞培養条件として５
〜７vol％ＣＯ2、９５〜９３vol％空気条件下で３７〜３
８℃が挙げられる。分化誘導剤としては例えばホルボー
ルエステル（12-O-テトラデカノイルホルボールエステ
ル(TPA)など）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、
レチノイン酸（ＲＡ）及び1α,25-ジヒドロキシビタミ
ンD3（1α,25(OH2)D3）等が挙げられ、特に限定はされ
ないが、その中でもＴＰＡが多くの白血病細胞株に対し
て比較的同様な分化誘導活性を有するため好ましい。例
えば癌細胞としてＨＬ−６０、分化誘導剤としてＴＰＡ
を使用する場合は、２４ｎＭ程度のＴＰＡ存在下で４８
時間培養することにより、ＨＬ−６０は単球・マクロフ
ァージ様に分化し、形態の変化が観察される。
【００３６】（２）分化した癌細胞からのｃＤＮＡの構
築 分化した癌細胞からのＲＮＡの調製 上記（１）で分化を誘導した癌細胞を好ましくは５００
〜２０００×ｇで遠心処理により回収し、細胞から例え
ばグアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Kingston,
R. E.,(1991) in Current Protocols in Molecular Bio
logy, Suppl. 14, Unit 4.2, Green Publishing Associ
ates and Wiley Interscience, New York）等の公知の
方法により全ＲＮＡを調製する。このようにして得られ
る全ＲＮＡから、オリゴｄＴ（oligo-(dT)）セルロース
カラムクロマトグラフィー等によってポリ(A)+ＲＮＡを
精製する。
築 分化した癌細胞からのＲＮＡの調製 上記（１）で分化を誘導した癌細胞を好ましくは５００
〜２０００×ｇで遠心処理により回収し、細胞から例え
ばグアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Kingston,
R. E.,(1991) in Current Protocols in Molecular Bio
logy, Suppl. 14, Unit 4.2, Green Publishing Associ
ates and Wiley Interscience, New York）等の公知の
方法により全ＲＮＡを調製する。このようにして得られ
る全ＲＮＡから、オリゴｄＴ（oligo-(dT)）セルロース
カラムクロマトグラフィー等によってポリ(A)+ＲＮＡを
精製する。
【００３７】ポリ(A)+ＲＮＡからのｃＤＮＡの構築 上記ポリ(A)+ＲＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いた逆転写ＰＣＲにより、癌細胞由来のｃ
ＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、通常の方法
と同様にして行えばよいが、具体的方法を示すならば以
下の通りである。１μｌのポリ(A)+ＲＮＡ、それぞれ１
００ｐｍｏｌのオリゴｄＴとランダムオリゴヌクレオチ
ドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシ
ヌクレオシド三リン酸、２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写
酵素（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）、１ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）、１２０単位のＲＮａｓｅ（リボヌ
クレアーゼ）インヒビター（宝酒造（株）製）を含む緩
衝液（終体積２０μｌ）を５０℃で６０分間インキュベ
ートし、ｃＤＮＡ一次鎖を合成する。次に、上記の逆転
写反応混合液５μｌ、各１００ｐｍｏｌのランダムオリ
ゴヌクレオチドプライマー、それぞれ２５０μＭの４種
類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位のＴ
ａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積５０μｌ）に対
し、９５℃１分、４６〜６２℃１分、７２℃２分を３５
サイクル繰り返して行う。
ライマーを用いた逆転写ＰＣＲにより、癌細胞由来のｃ
ＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、通常の方法
と同様にして行えばよいが、具体的方法を示すならば以
下の通りである。１μｌのポリ(A)+ＲＮＡ、それぞれ１
００ｐｍｏｌのオリゴｄＴとランダムオリゴヌクレオチ
ドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシ
ヌクレオシド三リン酸、２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写
酵素（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）、１ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）、１２０単位のＲＮａｓｅ（リボヌ
クレアーゼ）インヒビター（宝酒造（株）製）を含む緩
衝液（終体積２０μｌ）を５０℃で６０分間インキュベ
ートし、ｃＤＮＡ一次鎖を合成する。次に、上記の逆転
写反応混合液５μｌ、各１００ｐｍｏｌのランダムオリ
ゴヌクレオチドプライマー、それぞれ２５０μＭの４種
類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位のＴ
ａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積５０μｌ）に対
し、９５℃１分、４６〜６２℃１分、７２℃２分を３５
サイクル繰り返して行う。
【００３８】このようにして得られた癌細胞のｃＤＮＡ
は、発現ベクターに保持させた後、宿主細胞に導入して
宿主細胞をスクリーニングするために使用される。宿主
細胞としては、哺乳類由来の細胞株で、ラクトシルセラ
ミド陽性である細胞であれば用いることができる。その
ような細胞株としては例えばヒトナマルバ（Namalwa）
細胞（細井ら：Cytotechnology, 1, 151(1988)）、チャ
イニーズハムスター由来のＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ６１等）、サル由来のＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１
６５０等）、マウス由来の３ＬＬ細胞（Taniguchi,S.
（信州大学加齢適応研究センター））などが挙げられ
る。しかし、本発明においてＳＡＴ−１の酵素活性の検
出をより容易にすることが可能であるため、更にＧM3陰
性の培養細胞が好ましい。そのような細胞としては３Ｌ
Ｌ細胞の突然変異株である３ＬＬ−ＨＫ４６細胞（Inok
uchi,J.（生化学工業（株）））が挙げられ、好まし
い。発現ベクターとしてはｐＣＥＶ１８（Maruyama,K.
（東京大学医科学研究所、現東京医科歯科大学）より恵
与）、ｐＣＸＮ２（Niwa, H., Yamamura, K. and Miyaz
aki, J. (Gene, 108, p193-200(1991)）、ｐＦＬＡＧ−
ＣＭＶ−２（Eastman Kodak製）、ｐＡＧＥ１０７（Miy
ajiら, Cytotechnology, 3, 133(1990)）、ｐＡＳ３−
３（特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＡＭｏＥＲＣ
３Ｓｃ（特開平５−３３６９６３号公報）、ｐｃＤ２
（Chen,C.ら, Mol. Cell. Biol., 7, 2745-2452(198
7)）などが挙げられ、使用する宿主細胞に合わせて適宜
選択される。例えば宿主細胞として３ＬＬ−ＨＫ４６を
使用した場合は、ｐＣＥＶ１８を発現ベクターとして使
用することが好ましい。上記で癌細胞のポリ(A)+ＲＮＡ
を基に調製されたＰＣＲ産物のベクターへの導入は、公
知の方法から使用するベクターに適した方法が選択され
る。
は、発現ベクターに保持させた後、宿主細胞に導入して
宿主細胞をスクリーニングするために使用される。宿主
細胞としては、哺乳類由来の細胞株で、ラクトシルセラ
ミド陽性である細胞であれば用いることができる。その
ような細胞株としては例えばヒトナマルバ（Namalwa）
細胞（細井ら：Cytotechnology, 1, 151(1988)）、チャ
イニーズハムスター由来のＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ６１等）、サル由来のＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１
６５０等）、マウス由来の３ＬＬ細胞（Taniguchi,S.
（信州大学加齢適応研究センター））などが挙げられ
る。しかし、本発明においてＳＡＴ−１の酵素活性の検
出をより容易にすることが可能であるため、更にＧM3陰
性の培養細胞が好ましい。そのような細胞としては３Ｌ
Ｌ細胞の突然変異株である３ＬＬ−ＨＫ４６細胞（Inok
uchi,J.（生化学工業（株）））が挙げられ、好まし
い。発現ベクターとしてはｐＣＥＶ１８（Maruyama,K.
（東京大学医科学研究所、現東京医科歯科大学）より恵
与）、ｐＣＸＮ２（Niwa, H., Yamamura, K. and Miyaz
aki, J. (Gene, 108, p193-200(1991)）、ｐＦＬＡＧ−
ＣＭＶ−２（Eastman Kodak製）、ｐＡＧＥ１０７（Miy
ajiら, Cytotechnology, 3, 133(1990)）、ｐＡＳ３−
３（特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＡＭｏＥＲＣ
３Ｓｃ（特開平５−３３６９６３号公報）、ｐｃＤ２
（Chen,C.ら, Mol. Cell. Biol., 7, 2745-2452(198
7)）などが挙げられ、使用する宿主細胞に合わせて適宜
選択される。例えば宿主細胞として３ＬＬ−ＨＫ４６を
使用した場合は、ｐＣＥＶ１８を発現ベクターとして使
用することが好ましい。上記で癌細胞のポリ(A)+ＲＮＡ
を基に調製されたＰＣＲ産物のベクターへの導入は、公
知の方法から使用するベクターに適した方法が選択され
る。
【００３９】ｃＤＮＡライブラリーの宿主細胞への導
入 上記の方法により構築したｃＤＮＡライブラリーを公知
の手法を用いて宿主細胞へトランスフェクションする。
具体的には、例えばエレクトロポレーション法（Miyaji
ら,Cytotechnology, 3, 133(1990)）、リン酸カルシウ
ム法（特開平２−２２７０７５号公報）及びリポフェク
ション法（Philip, L.F. et al., Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA, 84, 7413(1987)）などが挙げられ適宜選択され
るが、エレクトロポレーション法が好ましい。また、ヒ
トα２−８シアル酸転移酵素は、ＧM3からＧD3を合成す
る酵素であり、該酵素をコードするＤＮＡを導入した細
胞はＧM3合成が可能になると細胞膜上にＧD3を発現し、
このＧD3の検出は容易であるので、ＳＡＴ−１をコード
するｃＤＮＡを検出する際に、より正確な酵素活性の検
出を行うため、ヒトα２−８シアル酸転移酵素をコード
するＤＮＡ（特開平７−３２７６７８号公報など）を宿
主細胞に前もってトランスフェクションしておくこと、
及び、同時にトランスフェクションすることも可能であ
り、また、好ましい。従って、例えばベクターとしてｐ
ＣＥＶ１８を使用して構築したｃＤＮＡライブラリー
を、宿主細胞としてのＧD3合成経路を持たない３ＬＬ−
ＨＫ４６細胞に導入する際には、ライブラリーのｃＤＮ
Ａを保持したｐＣＥＶ１８を、通常の３ＬＬ−ＨＫ４６
細胞に直接トランスフェクションしてもよいし、また、
α２−８シアル酸転移酵素のｃＤＮＡ導入したベクター
と同時に３ＬＬ−ＨＫ４６細胞にトランスフェクション
してもよい。また更に、予めα２−８シアル酸転移酵素
を発現する３ＬＬ−ＳＴ２８細胞に上記ライブラリーの
ｃＤＮＡを保持したｐＣＥＶ１８等の真核生物発現ベク
ターを用いてトランスフェクションしてもよい。なお、
３ＬＬ−ＳＴ２８は、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞にα２−８
シアル酸転移酵素のｃＤＮＡを、ｐＣＥＶ１８を用いて
導入して作成したものである。
入 上記の方法により構築したｃＤＮＡライブラリーを公知
の手法を用いて宿主細胞へトランスフェクションする。
具体的には、例えばエレクトロポレーション法（Miyaji
ら,Cytotechnology, 3, 133(1990)）、リン酸カルシウ
ム法（特開平２−２２７０７５号公報）及びリポフェク
ション法（Philip, L.F. et al., Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA, 84, 7413(1987)）などが挙げられ適宜選択され
るが、エレクトロポレーション法が好ましい。また、ヒ
トα２−８シアル酸転移酵素は、ＧM3からＧD3を合成す
る酵素であり、該酵素をコードするＤＮＡを導入した細
胞はＧM3合成が可能になると細胞膜上にＧD3を発現し、
このＧD3の検出は容易であるので、ＳＡＴ−１をコード
するｃＤＮＡを検出する際に、より正確な酵素活性の検
出を行うため、ヒトα２−８シアル酸転移酵素をコード
するＤＮＡ（特開平７−３２７６７８号公報など）を宿
主細胞に前もってトランスフェクションしておくこと、
及び、同時にトランスフェクションすることも可能であ
り、また、好ましい。従って、例えばベクターとしてｐ
ＣＥＶ１８を使用して構築したｃＤＮＡライブラリー
を、宿主細胞としてのＧD3合成経路を持たない３ＬＬ−
ＨＫ４６細胞に導入する際には、ライブラリーのｃＤＮ
Ａを保持したｐＣＥＶ１８を、通常の３ＬＬ−ＨＫ４６
細胞に直接トランスフェクションしてもよいし、また、
α２−８シアル酸転移酵素のｃＤＮＡ導入したベクター
と同時に３ＬＬ−ＨＫ４６細胞にトランスフェクション
してもよい。また更に、予めα２−８シアル酸転移酵素
を発現する３ＬＬ−ＳＴ２８細胞に上記ライブラリーの
ｃＤＮＡを保持したｐＣＥＶ１８等の真核生物発現ベク
ターを用いてトランスフェクションしてもよい。なお、
３ＬＬ−ＳＴ２８は、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞にα２−８
シアル酸転移酵素のｃＤＮＡを、ｐＣＥＶ１８を用いて
導入して作成したものである。
【００４０】（３）ガングリオシドを発現した宿主細胞
の検出 ｃＤＮＡライブラリーを導入した宿主細胞は、一般的な
細胞培養条件下で培養される。ｃＤＮＡを導入して２４
時間後以降、好ましくは３６〜４８時間後に宿主細胞を
抗ガングリオシド抗体あるいはガングリオシドに結合す
るレクチンを用いた免疫染色により染色するが、抗体を
用いる染色法がより正確であり好ましい。例えば、宿主
細胞として３ＬＬ−ＨＫ４６を用いた場合には、細胞膜
上に発現したＧM3を認識する例えば抗ＧM3モノクローナ
ル抗体 Ｍ２５９０〔Ｌ６１２(ATCC CRL10724)が産生
するモノクローナル抗体：J. Biol. Chem., 260, 13328
-13333(1985)〕を用いて検出する。免疫染色は一般的な
方法に従って行えばよい。また、宿主細胞として例えば
上記の３ＬＬ−ＳＴ２８を用いた場合には、本発明ＤＮ
Ａが導入された際に生成されるＧD3を検出する。ＧD3を
検出するための免疫染色法としては通常用いられる一般
的な方法（特開平２−３２７６７８号公報）によって行
うことができる。その際に、使用する一次抗体としては
ＧD3を認識する抗体であれば特に限定はされないが、モ
ノクローナル抗体が好ましく、そのような抗体としては
例えば抗ＧD3モノクローナル抗体 Ｒ２４〔ハイブリド
ーマ(ATCC HB8445)が産生するモノクローナル抗体：Can
cer Res., 49, p191-196(1989)〕などが挙げられ、好ま
しい。上記の一般的な抗体を用いる免疫染色法が具体例
として挙げられる。すなわち、上記培養後の宿主細胞
（１×１０5個）をＢＳＡ溶液（０．１％ＢＳＡ ＰＢ
Ｓ（＋））で２〜３回程度遠心洗浄し、一次抗体を含む
１００μｌの前記ＢＳＡ溶液に懸濁する。３０分間氷冷
下で反応させた後、上記ＢＳＡ溶液で２回程度洗浄す
る。さらに一次抗体に対するＦＩＴＣ標識二次抗体１μ
ｌを含むＢＳＡ溶液１００μｌ中で、氷冷条件下で３０
分間反応させる。ＢＳＡ溶液で１回洗浄し、フローサイ
トメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ：ベクトン・デッ
キンソン(Becton Dickinson)製）で、蛍光が強い細胞を
検出する。蛍光の強い、例えば全体の５％の細胞をセル
ソーターで選別し、これからプラスミドＤＮＡを抽出す
る。プラスミドＤＮＡの宿主細胞からの抽出は一般的な
公知の方法によって行われる。
の検出 ｃＤＮＡライブラリーを導入した宿主細胞は、一般的な
細胞培養条件下で培養される。ｃＤＮＡを導入して２４
時間後以降、好ましくは３６〜４８時間後に宿主細胞を
抗ガングリオシド抗体あるいはガングリオシドに結合す
るレクチンを用いた免疫染色により染色するが、抗体を
用いる染色法がより正確であり好ましい。例えば、宿主
細胞として３ＬＬ−ＨＫ４６を用いた場合には、細胞膜
上に発現したＧM3を認識する例えば抗ＧM3モノクローナ
ル抗体 Ｍ２５９０〔Ｌ６１２(ATCC CRL10724)が産生
するモノクローナル抗体：J. Biol. Chem., 260, 13328
-13333(1985)〕を用いて検出する。免疫染色は一般的な
方法に従って行えばよい。また、宿主細胞として例えば
上記の３ＬＬ−ＳＴ２８を用いた場合には、本発明ＤＮ
Ａが導入された際に生成されるＧD3を検出する。ＧD3を
検出するための免疫染色法としては通常用いられる一般
的な方法（特開平２−３２７６７８号公報）によって行
うことができる。その際に、使用する一次抗体としては
ＧD3を認識する抗体であれば特に限定はされないが、モ
ノクローナル抗体が好ましく、そのような抗体としては
例えば抗ＧD3モノクローナル抗体 Ｒ２４〔ハイブリド
ーマ(ATCC HB8445)が産生するモノクローナル抗体：Can
cer Res., 49, p191-196(1989)〕などが挙げられ、好ま
しい。上記の一般的な抗体を用いる免疫染色法が具体例
として挙げられる。すなわち、上記培養後の宿主細胞
（１×１０5個）をＢＳＡ溶液（０．１％ＢＳＡ ＰＢ
Ｓ（＋））で２〜３回程度遠心洗浄し、一次抗体を含む
１００μｌの前記ＢＳＡ溶液に懸濁する。３０分間氷冷
下で反応させた後、上記ＢＳＡ溶液で２回程度洗浄す
る。さらに一次抗体に対するＦＩＴＣ標識二次抗体１μ
ｌを含むＢＳＡ溶液１００μｌ中で、氷冷条件下で３０
分間反応させる。ＢＳＡ溶液で１回洗浄し、フローサイ
トメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ：ベクトン・デッ
キンソン(Becton Dickinson)製）で、蛍光が強い細胞を
検出する。蛍光の強い、例えば全体の５％の細胞をセル
ソーターで選別し、これからプラスミドＤＮＡを抽出す
る。プラスミドＤＮＡの宿主細胞からの抽出は一般的な
公知の方法によって行われる。
【００４１】（４）ＳＡＴ−１のｃＤＮＡのソーティン
グとｃＤＮＡの取得 上記の操作により得られたプラスミドＤＮＡを、適当な
宿主細胞株にトランスフェクションし、例えば上記抗Ｇ
M3抗体を用いる免疫染色とフローサイトメーターによる
全体の５％の強い蛍光を発する細胞の回収の操作を２回
以上繰り返し、目的のｃＤＮＡをソーティングにより濃
縮する。前記ソーティングに用いる宿主細胞としては、
哺乳類の培養細胞が好ましく、特に３ＬＬ−ＨＫ４６が
好ましい。また、使用するベクターとしては哺乳類細胞
用の発現ベクターであれば特に限定はされないが、ｐＣ
ＥＶ１８が好ましい。ソーティングによって濃縮した目
的のｃＤＮＡを保持した前記ベクターを、ｐＢＫＣＭＶ
（ストラタジーン社製）などの哺乳類細胞用の発現ベク
ターにヒトα２−８シアル酸転移酵素のｃＤＮＡを導入
して作成した発現ベクターと同時に、３ＬＬ−ＨＫ４６
細胞等のＧD3合成経路を有さない哺乳類由来の培養細胞
にトランスフェクションし、上記と同様に免疫染色及び
フローサイトメーターによる検出を行い、強蛍光を発す
る全体の５％の細胞を得る。この細胞から公知の方法に
よりプラスミドＤＮＡを抽出する。このプラスミドＤＮ
Ａから一般的な方法によってｃＤＮＡを切り出して得ら
れたｃＤＮＡにより、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（E. coli DH10
B：ギブコ社製）を形質転換し、これらを一穴あたり１
００コロニーを形成するよう植菌し、シブセレクション
を行うことにより、最終的に約２．１Ｋｂｐのインサー
ト（４Ｃ７）を含む単一のクローン、ｐＣＥＶ４Ｃ７を
得ることができる。
グとｃＤＮＡの取得 上記の操作により得られたプラスミドＤＮＡを、適当な
宿主細胞株にトランスフェクションし、例えば上記抗Ｇ
M3抗体を用いる免疫染色とフローサイトメーターによる
全体の５％の強い蛍光を発する細胞の回収の操作を２回
以上繰り返し、目的のｃＤＮＡをソーティングにより濃
縮する。前記ソーティングに用いる宿主細胞としては、
哺乳類の培養細胞が好ましく、特に３ＬＬ−ＨＫ４６が
好ましい。また、使用するベクターとしては哺乳類細胞
用の発現ベクターであれば特に限定はされないが、ｐＣ
ＥＶ１８が好ましい。ソーティングによって濃縮した目
的のｃＤＮＡを保持した前記ベクターを、ｐＢＫＣＭＶ
（ストラタジーン社製）などの哺乳類細胞用の発現ベク
ターにヒトα２−８シアル酸転移酵素のｃＤＮＡを導入
して作成した発現ベクターと同時に、３ＬＬ−ＨＫ４６
細胞等のＧD3合成経路を有さない哺乳類由来の培養細胞
にトランスフェクションし、上記と同様に免疫染色及び
フローサイトメーターによる検出を行い、強蛍光を発す
る全体の５％の細胞を得る。この細胞から公知の方法に
よりプラスミドＤＮＡを抽出する。このプラスミドＤＮ
Ａから一般的な方法によってｃＤＮＡを切り出して得ら
れたｃＤＮＡにより、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（E. coli DH10
B：ギブコ社製）を形質転換し、これらを一穴あたり１
００コロニーを形成するよう植菌し、シブセレクション
を行うことにより、最終的に約２．１Ｋｂｐのインサー
ト（４Ｃ７）を含む単一のクローン、ｐＣＥＶ４Ｃ７を
得ることができる。
【００４２】（５）ＳＡＴ−１をコードするｃＤＮＡ
４Ｃ７の塩基配列の決定 上記のようにして得られたｃＤＮＡはそのままあるいは
ｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクレーニングし
て、既知の一般的な方法により塩基配列を決定すること
ができる。
４Ｃ７の塩基配列の決定 上記のようにして得られたｃＤＮＡはそのままあるいは
ｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクレーニングし
て、既知の一般的な方法により塩基配列を決定すること
ができる。
【００４３】上記のようにして決定されたＳＡＴ−１を
コードするｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予
想されるアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列の
みを配列番号２に示す。
コードするｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予
想されるアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列の
みを配列番号２に示す。
【００４４】また、膜貫通領域を欠失した、すなわち可
溶化タンパク質形態のＳＡＴ−１のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡは以下のようにして取得することが可能で
ある。すなわち、まず配列番号１に示す塩基配列に基づ
き、当該酵素のポリペプチドのＮ−末端側で適当な短縮
化形態となるように選択したプライマーを合成し、クロ
ーン化したＳＡＴ−１のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法
により増幅する。例えば、Ｎ−末端の３７アミノ酸残基
が欠失した短縮化形態のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを得る場合には、例えば目的とする塩基配列の３'及
び５'末端部に存在する塩基配列を基にオリゴヌクレオ
チドプライマーを合成する。例えば配列番号３及び４に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを
それぞれ５'プライマー及び３'プライマーとして用いて
ＰＣＲを行えばよい。次いで、増幅して得られたＰＣＲ
産物を必要により精製して目的ＤＮＡを得ることが可能
である。
溶化タンパク質形態のＳＡＴ−１のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡは以下のようにして取得することが可能で
ある。すなわち、まず配列番号１に示す塩基配列に基づ
き、当該酵素のポリペプチドのＮ−末端側で適当な短縮
化形態となるように選択したプライマーを合成し、クロ
ーン化したＳＡＴ−１のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法
により増幅する。例えば、Ｎ−末端の３７アミノ酸残基
が欠失した短縮化形態のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを得る場合には、例えば目的とする塩基配列の３'及
び５'末端部に存在する塩基配列を基にオリゴヌクレオ
チドプライマーを合成する。例えば配列番号３及び４に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを
それぞれ５'プライマー及び３'プライマーとして用いて
ＰＣＲを行えばよい。次いで、増幅して得られたＰＣＲ
産物を必要により精製して目的ＤＮＡを得ることが可能
である。
【００４５】＜３＞本発明ＤＮＡの塩基配列によってコ
ードされるＳＡＴ−１のポリペプチド 本発明は、上記の本発明ＤＮＡによってコードされるＳ
ＡＴ−１のポリペプチドも提供する。本ポリペプチドは
単独であってもよいし、他のポリペプチドと融合してい
てもよい。また、膜貫通領域を欠失していてもよい。
ードされるＳＡＴ−１のポリペプチド 本発明は、上記の本発明ＤＮＡによってコードされるＳ
ＡＴ−１のポリペプチドも提供する。本ポリペプチドは
単独であってもよいし、他のポリペプチドと融合してい
てもよい。また、膜貫通領域を欠失していてもよい。
【００４６】本ポリペプチドは、糖鎖を有していても有
していなくてもよい。また、糖鎖の種類にも特に限定は
ない。
していなくてもよい。また、糖鎖の種類にも特に限定は
ない。
【００４７】このようなポリペプチドは、例えば、後記
のポリペプチドの製造方法によって得ることができ、ま
た、上記の活性ないし機能の有無を判定することは、特
開平７−３２７６７８号公報記載の酵素活性測定法にお
いて、宿主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質を変更
することにより実施することが可能であり、例えば本明
細書中に具体的に記載されている方法により、当業者で
あれば容易に行うことができる。
のポリペプチドの製造方法によって得ることができ、ま
た、上記の活性ないし機能の有無を判定することは、特
開平７−３２７６７８号公報記載の酵素活性測定法にお
いて、宿主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質を変更
することにより実施することが可能であり、例えば本明
細書中に具体的に記載されている方法により、当業者で
あれば容易に行うことができる。
【００４８】＜４＞本発明ＤＮＡを利用したＳＡＴ−１
又はそのポリペプチドの製造方法 上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地
で培養し、本発明ＤＮＡがコードするＳＡＴ−１又はそ
のポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物
からＳＡＴ−１又はそのポリペプチドを採取することに
よって、ＳＡＴ−１又はそのポリペプチドを製造するこ
とができる。
又はそのポリペプチドの製造方法 上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地
で培養し、本発明ＤＮＡがコードするＳＡＴ−１又はそ
のポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物
からＳＡＴ−１又はそのポリペプチドを採取することに
よって、ＳＡＴ−１又はそのポリペプチドを製造するこ
とができる。
【００４９】本発明ＤＮＡで形質転換された細胞は、公
知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換
えプラスミドを構築し、この組換えプラスミドを用いて
形質転換を行うことによって得ることができる。なお、
本発明は、本発明酵素の製造に使用できる、本発明ＤＮ
Ａを含む組換えプラスミドすなわち組換えベクター及び
本発明ＤＮＡが導入されており、かつ該ＤＮＡが発現可
能な形質転換体（例えば、上記組換えベクターを含む形
質転換体）も提供するものである。細胞としては大腸菌
等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が例示され
る。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡ
の発現によって生じるＳＡＴ−１のポリペプチドに糖鎖
の付加が起こらないため、純粋にＳＡＴ−１のポリペプ
チドのみを得ることが可能であり、また、哺乳類細胞等
の真核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって
生じるＳＡＴ−１のポリペプチドに糖鎖が付加される。
そのため、糖鎖も含む通常のＳＡＴ−１と同様の形態で
得ることが可能である。
知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換
えプラスミドを構築し、この組換えプラスミドを用いて
形質転換を行うことによって得ることができる。なお、
本発明は、本発明酵素の製造に使用できる、本発明ＤＮ
Ａを含む組換えプラスミドすなわち組換えベクター及び
本発明ＤＮＡが導入されており、かつ該ＤＮＡが発現可
能な形質転換体（例えば、上記組換えベクターを含む形
質転換体）も提供するものである。細胞としては大腸菌
等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が例示され
る。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡ
の発現によって生じるＳＡＴ−１のポリペプチドに糖鎖
の付加が起こらないため、純粋にＳＡＴ−１のポリペプ
チドのみを得ることが可能であり、また、哺乳類細胞等
の真核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって
生じるＳＡＴ−１のポリペプチドに糖鎖が付加される。
そのため、糖鎖も含む通常のＳＡＴ−１と同様の形態で
得ることが可能である。
【００５０】本製造方法においては、タンパク質の製造
に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することがで
きる。３ＬＬ−ＨＫ４６細胞、３ＬＬ−ＳＴ２８細胞又
はＣＯＳ−１細胞等の哺乳類由来の培養細胞とｐＣＥＶ
１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら,Med. Immunol., 20, 27(1
990)）等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせを
採用することが好ましいが、特に限定はされない。培地
や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜
選択される。
に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することがで
きる。３ＬＬ−ＨＫ４６細胞、３ＬＬ−ＳＴ２８細胞又
はＣＯＳ−１細胞等の哺乳類由来の培養細胞とｐＣＥＶ
１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら,Med. Immunol., 20, 27(1
990)）等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせを
採用することが好ましいが、特に限定はされない。培地
や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜
選択される。
【００５１】本発明ＤＮＡは全長を直接発現させてもよ
いが、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発
現させてもよい。また、本発明ＤＮＡの一部を部分ペプ
チドとして発現させてもよい。
いが、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発
現させてもよい。また、本発明ＤＮＡの一部を部分ペプ
チドとして発現させてもよい。
【００５２】上記融合ポリペプチドを発現する組み換え
プラスミドの構築の具体例としては以下の方法が挙げら
れる。すなわち、ｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagaw
a,H.and Paulson,J.C., J. Biol. Chem., 269, 1394-14
01(1994)）等のプラスミドに導入した遺伝子を融合タン
パクとして発現させるように構築されたベクターに通常
の方法により本発明のＤＮＡを組み込み、複数のタンパ
ク質の遺伝子を同一読み出し領域に有するベクターを構
築する。ついで、このベクターから融合タンパク質をコ
ードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上記と同様の操作に
よりｐＣＥＶ１８等の適当なベクターに連結させる。
プラスミドの構築の具体例としては以下の方法が挙げら
れる。すなわち、ｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagaw
a,H.and Paulson,J.C., J. Biol. Chem., 269, 1394-14
01(1994)）等のプラスミドに導入した遺伝子を融合タン
パクとして発現させるように構築されたベクターに通常
の方法により本発明のＤＮＡを組み込み、複数のタンパ
ク質の遺伝子を同一読み出し領域に有するベクターを構
築する。ついで、このベクターから融合タンパク質をコ
ードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上記と同様の操作に
よりｐＣＥＶ１８等の適当なベクターに連結させる。
【００５３】培養物からのＳＡＴ−１又はそのポリペプ
チドの採取は、公知のポリペプチドの精製方法によって
行うことができる。具体的には例えば、ラクトシルセラ
ミドあるいはＣＭＰ−シアル酸などを結合したセファロ
ースカラムを用いたアフィニティ−クロマトグラフィー
が挙げられる。また融合ポリペプチドとして発現させた
場合は、宿主細胞の培養物を、ＳＡＴ−１と融合したポ
リペプチドに対し親和性の高い物質（例えば抗体など）
を結合したアフィニティークロマトグラフィーに付する
ことによって融合ポリペプチドを精製することが可能で
ある。さらに、ＳＡＴ−１と他のポリペプチドとの間に
リンカー、例えば特定のタンパク分解酵素が認識して切
断するアミノ酸配列を有するリンカーを予め組み込んで
おくことにより、融合ポリペプチドを精製した後にリン
カー部位で融合ポリペプチドを切断することにより、Ｓ
ＡＴ−１を得ることが可能である。上記特定のタンパク
質分解酵素とそれが認識する特定の配列の組合せとして
は例えばプロインスリンの合成時に働くシグナルペプチ
ダーゼとインスリンのシグナルペプチドの組合せが挙げ
られる。なお上記の培養物には、培地および当該培地中
の細胞が包含される。
チドの採取は、公知のポリペプチドの精製方法によって
行うことができる。具体的には例えば、ラクトシルセラ
ミドあるいはＣＭＰ−シアル酸などを結合したセファロ
ースカラムを用いたアフィニティ−クロマトグラフィー
が挙げられる。また融合ポリペプチドとして発現させた
場合は、宿主細胞の培養物を、ＳＡＴ−１と融合したポ
リペプチドに対し親和性の高い物質（例えば抗体など）
を結合したアフィニティークロマトグラフィーに付する
ことによって融合ポリペプチドを精製することが可能で
ある。さらに、ＳＡＴ−１と他のポリペプチドとの間に
リンカー、例えば特定のタンパク分解酵素が認識して切
断するアミノ酸配列を有するリンカーを予め組み込んで
おくことにより、融合ポリペプチドを精製した後にリン
カー部位で融合ポリペプチドを切断することにより、Ｓ
ＡＴ−１を得ることが可能である。上記特定のタンパク
質分解酵素とそれが認識する特定の配列の組合せとして
は例えばプロインスリンの合成時に働くシグナルペプチ
ダーゼとインスリンのシグナルペプチドの組合せが挙げ
られる。なお上記の培養物には、培地および当該培地中
の細胞が包含される。
【００５４】シアル酸転移酵素の活性の測定方法として
は、一般的なガングリオシド合成の測定法（特開平７−
３２７６７８号公報など）において酵素の基質を変更す
ることにより実施することが可能である。例えば上記培
養物又は上記方法によって精製した酵素適量を、１００
ｍＭ カコジル酸ナトリウム、１０ｍＭ 塩化マンガ
ン、０．２ｍＭ ＣＭＰ−放射性物質標識シアル酸、
０．４ｍＭ ラクトシルセラミド、０．３％Ｔｒｉｔｏ
ｎ ＣＦ−５４を含む反応液をｐＨ６．５に調整し、３
７℃で２時間保温した後、一般的な薄層クロマトグラフ
ィーにより反応産物を展開し、フジックスＢＡＳ２００
０バイオ・イメージング・アナライザー（富士写真フィ
ルム（株）製）により活性の測定を行うことができる。
は、一般的なガングリオシド合成の測定法（特開平７−
３２７６７８号公報など）において酵素の基質を変更す
ることにより実施することが可能である。例えば上記培
養物又は上記方法によって精製した酵素適量を、１００
ｍＭ カコジル酸ナトリウム、１０ｍＭ 塩化マンガ
ン、０．２ｍＭ ＣＭＰ−放射性物質標識シアル酸、
０．４ｍＭ ラクトシルセラミド、０．３％Ｔｒｉｔｏ
ｎ ＣＦ−５４を含む反応液をｐＨ６．５に調整し、３
７℃で２時間保温した後、一般的な薄層クロマトグラフ
ィーにより反応産物を展開し、フジックスＢＡＳ２００
０バイオ・イメージング・アナライザー（富士写真フィ
ルム（株）製）により活性の測定を行うことができる。
【００５５】
【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳説する
が、本発明の目的を超えない限りこれに限定されるもの
ではない。
が、本発明の目的を超えない限りこれに限定されるもの
ではない。
【００５６】（１）ＨＬ−６０細胞の分化誘導とｃＤＮ
Ａの構築 ２〜３×１０5個／ｍｌＨＬ−６０をＴＰＡ ２４ｎ
Ｍ、及１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０（ニ
ッスイ製）中で５vol％ＣＯ2、９５vol％空気、３７℃の
条件下で４８時間培養し、分化を誘導した。上記細胞か
ら、インビトロゲン社製のFast Track mRNA単離キット
を用いてポリ(A)+シグナルを有するRNAを単離した。
Ａの構築 ２〜３×１０5個／ｍｌＨＬ−６０をＴＰＡ ２４ｎ
Ｍ、及１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０（ニ
ッスイ製）中で５vol％ＣＯ2、９５vol％空気、３７℃の
条件下で４８時間培養し、分化を誘導した。上記細胞か
ら、インビトロゲン社製のFast Track mRNA単離キット
を用いてポリ(A)+シグナルを有するRNAを単離した。
【００５７】このポリ(A)+ＲＮＡを逆転写反応の鋳型と
し、ＤＮＡの一次鎖を構築し、更にこのＤＮＡを用いて
２本鎖ｃＤＮＡを合成した（Gubber, V. and Hoffman,
B.J., Gene, 25, 283(1983)）。
し、ＤＮＡの一次鎖を構築し、更にこのＤＮＡを用いて
２本鎖ｃＤＮＡを合成した（Gubber, V. and Hoffman,
B.J., Gene, 25, 283(1983)）。
【００５８】このようにして得られた２本鎖ｃＤＮＡ
に、制限酵素ＢｓｔＸ１アダプター（インビトロゲン社
製）を連結し、ｐＣＥＶ１８のＢＳＴＸ１部位に導入し
てｃＤＮＡライブラリーを構築した。このｃＤＮＡライ
ブラリーを８つに分け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ（ラ
イフテクノロジー社製）に導入して増幅した。増幅した
ｃＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製のＱｉａｇｅｎ Ｔｉｐ
を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
に、制限酵素ＢｓｔＸ１アダプター（インビトロゲン社
製）を連結し、ｐＣＥＶ１８のＢＳＴＸ１部位に導入し
てｃＤＮＡライブラリーを構築した。このｃＤＮＡライ
ブラリーを８つに分け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ（ラ
イフテクノロジー社製）に導入して増幅した。増幅した
ｃＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製のＱｉａｇｅｎ Ｔｉｐ
を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
【００５９】（２）ｃＤＮＡの３ＬＬ−ＨＫ４６細胞へ
のトランスフェクション 上記のｃＤＮＡライブラリーを含むプラスミドＤＮＡ10
0μgを、5×106個の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞にエレクトロ
ポレーション法（180 V、600μＦ）を用いて導入し、３
８〜４８時間、５vol％ＣＯ2、９５vol％空気、３７℃条
件下で培養をした。
のトランスフェクション 上記のｃＤＮＡライブラリーを含むプラスミドＤＮＡ10
0μgを、5×106個の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞にエレクトロ
ポレーション法（180 V、600μＦ）を用いて導入し、３
８〜４８時間、５vol％ＣＯ2、９５vol％空気、３７℃条
件下で培養をした。
【００６０】（３）ガングリオシドを発現した宿主細胞
の検出とｃＤＮＡの調製 培養後の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞を回収してＰＢＳ(-)で
洗浄した後、抗ＧM3抗体であるＭ２５９０と３０分間、
氷冷下で反応させ、さらに氷冷下で３０分間、ＦＩＴＣ
標識ウサギ抗マウスＩｇＭモノクローナル抗体により免
疫染色を行った。この染色した細胞をフローサイトメー
ター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）で蛍光が陽性の細胞を
検出し、陽性側の５％の細胞をコウルター社製のEPICS
EliteESP セルソーターで回収し、プラスミドＤＮＡを
調製した後、さらに２回、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞へのエ
レクトロポレーション法による導入と４８時間培養、免
疫染色及びフローサイトメーターによる検出、回収を繰
り返した。
の検出とｃＤＮＡの調製 培養後の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞を回収してＰＢＳ(-)で
洗浄した後、抗ＧM3抗体であるＭ２５９０と３０分間、
氷冷下で反応させ、さらに氷冷下で３０分間、ＦＩＴＣ
標識ウサギ抗マウスＩｇＭモノクローナル抗体により免
疫染色を行った。この染色した細胞をフローサイトメー
ター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）で蛍光が陽性の細胞を
検出し、陽性側の５％の細胞をコウルター社製のEPICS
EliteESP セルソーターで回収し、プラスミドＤＮＡを
調製した後、さらに２回、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞へのエ
レクトロポレーション法による導入と４８時間培養、免
疫染色及びフローサイトメーターによる検出、回収を繰
り返した。
【００６１】この方法で最終的に得られたプラスミド
を、ｐＢＫＣＭＶＧＤ３（ストラタジーン社製のｐＢＫ
ＣＭＶプラスミドベクターにヒトα２−８シアル酸転移
酵素（ＧD3合成酵素）を導入したプラスミド）と共に5
×106個の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に導入した。この細胞
を４８時間培養した後、抗ＧD3抗体であるＲ２４とＦＩ
ＴＣ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で免疫染色して、フ
ローサイトメーターにより蛍光の強い細胞を検出し、蛍
光が強い側の0.6％の細胞を、ベクトンディッキンソン
社製のFACS Vantageセルソーターを用いて回収した。
を、ｐＢＫＣＭＶＧＤ３（ストラタジーン社製のｐＢＫ
ＣＭＶプラスミドベクターにヒトα２−８シアル酸転移
酵素（ＧD3合成酵素）を導入したプラスミド）と共に5
×106個の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に導入した。この細胞
を４８時間培養した後、抗ＧD3抗体であるＲ２４とＦＩ
ＴＣ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で免疫染色して、フ
ローサイトメーターにより蛍光の強い細胞を検出し、蛍
光が強い側の0.6％の細胞を、ベクトンディッキンソン
社製のFACS Vantageセルソーターを用いて回収した。
【００６２】この細胞から、プラスミドＤＮＡを調製
し、エレクトロポレーション法によりこのプラスミドＤ
ＮＡで大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ライフテクノロジー社製）を
形質転換した。トランスフェクションとアンピシリンに
よる選別とを２回繰り返した後、陽性コロニー群を９６
穴マイクロプレート１穴あたり１００コロニーの割合で
小分けした。９枚のマイクロプレートに植菌し、シブセ
レクション法を行い１穴に絞り込み、この１穴に由来す
る２，４００コロニーを１穴あたり１コロニーの割合
で、９６穴マルチプレート２５枚に広げ、更にシブセレ
クションを行い陽性クローン（ｐＣＥＶ４Ｃ７）を得
た。
し、エレクトロポレーション法によりこのプラスミドＤ
ＮＡで大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ライフテクノロジー社製）を
形質転換した。トランスフェクションとアンピシリンに
よる選別とを２回繰り返した後、陽性コロニー群を９６
穴マイクロプレート１穴あたり１００コロニーの割合で
小分けした。９枚のマイクロプレートに植菌し、シブセ
レクション法を行い１穴に絞り込み、この１穴に由来す
る２，４００コロニーを１穴あたり１コロニーの割合
で、９６穴マルチプレート２５枚に広げ、更にシブセレ
クションを行い陽性クローン（ｐＣＥＶ４Ｃ７）を得
た。
【００６３】特に３ＬＬ−ＳＴ２８細胞を宿主細胞とし
て使用すると、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に本発明ＤＮＡを
含むプラスミドＤＮＡとｐＢＫＣＭＶＧＤ３を共導入す
る方法と比較してフローサイトメトリー上で３倍以上の
蛍光強度が得られたので、上述のシブセレクションにお
いては共導入法ではなく、宿主細胞として３ＬＬ−ＳＴ
２８細胞を用いた。
て使用すると、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に本発明ＤＮＡを
含むプラスミドＤＮＡとｐＢＫＣＭＶＧＤ３を共導入す
る方法と比較してフローサイトメトリー上で３倍以上の
蛍光強度が得られたので、上述のシブセレクションにお
いては共導入法ではなく、宿主細胞として３ＬＬ−ＳＴ
２８細胞を用いた。
【００６４】（４）塩基配列の決定 ｐＣＥＶ４Ｃ７の二本鎖ＤＮＡの塩基配列を、オートサ
イクルシークエンシングキット（ファルマシア社製）
と、ファルマシア A.L.F. ＤＮＡシークエンサー（フ
ァルマシア社製）を用いたデオキシチェーンターミネー
ション法により決定した。このように決定された塩基配
列とその塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番
号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。ｐＣＥ
Ｖ４Ｃ７が有するｃＤＮＡインサート４Ｃ７は２，３５
９ｋｂｐであり、２７８番目の塩基を翻訳開始点とする
３６２アミノ酸残基を有するタンパク質（分子量４１，
７５４Ｄａ）をコードすることが明かとなった。アミノ
酸配列から予測される構造の模式図を図１に示す。ハイ
ドロパシープロットによる解析の結果、Ｎ末端部１５番
目から３３番目のアミノ酸残基の領域に膜貫通領域が存
在する２型膜タンパク質であることが判明した。この配
列をGenBankに登録されている遺伝子データベースで検
索した結果、高度に相同性を示す配列は認められなかっ
た。しかし、シアル酸転移酵素の配列の中央部及びＣ末
端側領域に存在するシアル酸転移酵素相同領域のシアリ
ルモチーフ（Ｌ及びＳ）については、多少の置換が見ら
れたものの、比較的高い相同性が認められた（図２）。
比較に用いたシアル酸転移酵素は、ST3N-1; Biochem. B
iophys. Res. Commun., 194, 375-382, 1993、ST3N-2;
J.Biol. Chem., 268, 22782-22787, 1993、ST30-1; J.
Biol. Chem., 269, 17872-17878, 1994、ST30-2; Eur.
J. Biochem., 247, 558-566, 1997、SThM; GenBankTMデ
ータベース、受入番号U14550、ST6N; J. Exp. Med., 17
2, 641-643, 1990、SAT-II; Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 91, 7952-7956, 1994、 STX; J. Biol. Chem.,
270, 22685-22688, 1995、ST8SiaIII; GenBankTMデー
タベース、受入番号AF004668、 PST-1; Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A., 92, 7031-7035, 1995、ST8SiaV; Bio
chem. Biophys. Res. Commun., 235, 327-330, 1997の
それぞれに記載の１１種である。この結果から、ｐＣＥ
Ｖ４Ｃ７のインサート４Ｃ７がコードするＳＡＴ−１は
シアル酸転移酵素ファミリーに属すると裏付けられた。
本発明ＤＮＡがコードするＳＡＴ−１には、シアリルモ
チーフＬ中に存在する１７７番目のアミノ酸において、
他のシアル酸転移酵素と比較して特徴的なアミノ酸の置
換が存在し（アスパラギン酸からヒスチジンへの置
換）、またアミノ酸配列からＮ−グリコシレーションサ
イトにコンセンサスな配列が２つ存在することが示され
た（図１中、△で示す）。
イクルシークエンシングキット（ファルマシア社製）
と、ファルマシア A.L.F. ＤＮＡシークエンサー（フ
ァルマシア社製）を用いたデオキシチェーンターミネー
ション法により決定した。このように決定された塩基配
列とその塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番
号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。ｐＣＥ
Ｖ４Ｃ７が有するｃＤＮＡインサート４Ｃ７は２，３５
９ｋｂｐであり、２７８番目の塩基を翻訳開始点とする
３６２アミノ酸残基を有するタンパク質（分子量４１，
７５４Ｄａ）をコードすることが明かとなった。アミノ
酸配列から予測される構造の模式図を図１に示す。ハイ
ドロパシープロットによる解析の結果、Ｎ末端部１５番
目から３３番目のアミノ酸残基の領域に膜貫通領域が存
在する２型膜タンパク質であることが判明した。この配
列をGenBankに登録されている遺伝子データベースで検
索した結果、高度に相同性を示す配列は認められなかっ
た。しかし、シアル酸転移酵素の配列の中央部及びＣ末
端側領域に存在するシアル酸転移酵素相同領域のシアリ
ルモチーフ（Ｌ及びＳ）については、多少の置換が見ら
れたものの、比較的高い相同性が認められた（図２）。
比較に用いたシアル酸転移酵素は、ST3N-1; Biochem. B
iophys. Res. Commun., 194, 375-382, 1993、ST3N-2;
J.Biol. Chem., 268, 22782-22787, 1993、ST30-1; J.
Biol. Chem., 269, 17872-17878, 1994、ST30-2; Eur.
J. Biochem., 247, 558-566, 1997、SThM; GenBankTMデ
ータベース、受入番号U14550、ST6N; J. Exp. Med., 17
2, 641-643, 1990、SAT-II; Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 91, 7952-7956, 1994、 STX; J. Biol. Chem.,
270, 22685-22688, 1995、ST8SiaIII; GenBankTMデー
タベース、受入番号AF004668、 PST-1; Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A., 92, 7031-7035, 1995、ST8SiaV; Bio
chem. Biophys. Res. Commun., 235, 327-330, 1997の
それぞれに記載の１１種である。この結果から、ｐＣＥ
Ｖ４Ｃ７のインサート４Ｃ７がコードするＳＡＴ−１は
シアル酸転移酵素ファミリーに属すると裏付けられた。
本発明ＤＮＡがコードするＳＡＴ−１には、シアリルモ
チーフＬ中に存在する１７７番目のアミノ酸において、
他のシアル酸転移酵素と比較して特徴的なアミノ酸の置
換が存在し（アスパラギン酸からヒスチジンへの置
換）、またアミノ酸配列からＮ−グリコシレーションサ
イトにコンセンサスな配列が２つ存在することが示され
た（図１中、△で示す）。
【００６５】（５）ＳＡＴ−１のｃＤＮＡを発現した細
胞のＧM3合成 上記ＳＡＴ−１をコードするｃＤＮＡ（４Ｃ７）を発現
ベクターｐＣＥＶ１８に導入したｐＣＥＶ４Ｃ７を、エ
レクトロポレーション法により３ＬＬ−ＨＫ４６及び３
ＬＬ−ＳＴ２８に導入し、４８時間培養後のこの細胞の
ＧM3合成活性を以下の方法により測定した。対照として
は、ｐＣＥＶ１８を上記と同様に３ＬＬ−ＨＫ４６及び
３ＬＬ−ＳＴ２８に導入した。０．１ｍＭ ＣＭＰ−[
14C]−シアル酸（２×１０3ＣＰＭ）、０．４ｍＭラク
トシルセラミド、０．３％(W/V)Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ−
５４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ カコジル酸
ナトリウム、１５０μｇのｐＣＥＶ４Ｃ７（又は対照ベ
クター）を導入した宿主細胞のホモジナイズ液及び１ｍ
Ｍのシアリダーゼ阻害剤（2,3−デヒドロ-2-デオキシ-N
-アセチルシアル酸(2,3-dehydro-2-deoxy-NeuAc)：ベー
リンガー・マンハイム社製）を含むｐＨ６．５の２０μ
ｌの反応液を、３７℃で２時間インキュベートした後、
SepPak C18カラム（メルク社製）で脂質成分を精製し
た。精製物を乾固後、シリカゲル薄層クロマトグラフィ
ー ６０ＨＰＴＬＣプレート（メルク社製）に供した。
クロロホルム−メタノール−０．５％ＣａＣｌ2水溶液
（55:45:10, V/V/V）にて展開後、オルシノール硫酸に
より発色すると共に、ガングリオシドに取り込まれた放
射活性をフジックスＢＡＳ２０００バイオ・イメージン
グ・アナライザー（富士写真フィルム（株）製）で測定
した。その結果、ｐＣＥＶ４Ｃ７導入細胞において、14
ＣのガングリオシドＧM3への取り込みが検出され、ＳＡ
Ｔ−１によるＧM3合成が起こっていることが明らかにな
った。
胞のＧM3合成 上記ＳＡＴ−１をコードするｃＤＮＡ（４Ｃ７）を発現
ベクターｐＣＥＶ１８に導入したｐＣＥＶ４Ｃ７を、エ
レクトロポレーション法により３ＬＬ−ＨＫ４６及び３
ＬＬ−ＳＴ２８に導入し、４８時間培養後のこの細胞の
ＧM3合成活性を以下の方法により測定した。対照として
は、ｐＣＥＶ１８を上記と同様に３ＬＬ−ＨＫ４６及び
３ＬＬ−ＳＴ２８に導入した。０．１ｍＭ ＣＭＰ−[
14C]−シアル酸（２×１０3ＣＰＭ）、０．４ｍＭラク
トシルセラミド、０．３％(W/V)Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ−
５４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ カコジル酸
ナトリウム、１５０μｇのｐＣＥＶ４Ｃ７（又は対照ベ
クター）を導入した宿主細胞のホモジナイズ液及び１ｍ
Ｍのシアリダーゼ阻害剤（2,3−デヒドロ-2-デオキシ-N
-アセチルシアル酸(2,3-dehydro-2-deoxy-NeuAc)：ベー
リンガー・マンハイム社製）を含むｐＨ６．５の２０μ
ｌの反応液を、３７℃で２時間インキュベートした後、
SepPak C18カラム（メルク社製）で脂質成分を精製し
た。精製物を乾固後、シリカゲル薄層クロマトグラフィ
ー ６０ＨＰＴＬＣプレート（メルク社製）に供した。
クロロホルム−メタノール−０．５％ＣａＣｌ2水溶液
（55:45:10, V/V/V）にて展開後、オルシノール硫酸に
より発色すると共に、ガングリオシドに取り込まれた放
射活性をフジックスＢＡＳ２０００バイオ・イメージン
グ・アナライザー（富士写真フィルム（株）製）で測定
した。その結果、ｐＣＥＶ４Ｃ７導入細胞において、14
ＣのガングリオシドＧM3への取り込みが検出され、ＳＡ
Ｔ−１によるＧM3合成が起こっていることが明らかにな
った。
【００６６】ＧM3合成活性は、ｐＨ６．０〜７．０、特
にｐＨ６．５付近で高く、また、１０ｍＭ Ｍｎ2+存在
下で１．５倍以上上昇した。
にｐＨ６．５付近で高く、また、１０ｍＭ Ｍｎ2+存在
下で１．５倍以上上昇した。
【００６７】また、上述のｐＣＥＶ４Ｃ７を導入した３
ＬＬ−ＨＫ４６細胞及び３ＬＬ−ＳＴ２８細胞を、導入
２４時間後に免疫蛍光染色（3LL-HK46細胞については抗
ＧM3抗体M2590、3LL-ST28細胞については抗ＧM3抗体R24
をそれぞれ一次抗体として使用し、FITCを結合した抗マ
ウスIgM抗体又はIgG抗体を二次抗体として使用した）
し、フローサイトメトリーを用いて、染色された細胞の
分布を測定した。対照としてｐＣＥＶ１８を導入したそ
れぞれの宿主細胞を免疫染色した細胞を使用した。結果
を図４に示す。ａ及びｂは３ＬＬ−ＳＴ２８細胞、ｃ及
びｄは３ＬＬ−ＨＫ４６細胞であり、ａ及びｃはｐＣＥ
Ｖ１８を導入したもの（対照）、ｂ及びｄはｐＣＥＶ４
Ｃ７を導入したものである。本発明ＤＮＡを保持したプ
ラスミドＤＮＡを導入した３ＬＬ−ＳＴ２８が顕著な染
色性を示していることが明らかである。３ＬＬ−ＨＫ４
６細胞においてこの方法によるＧM3の検出が難しかった
ことは、細胞系により、細胞表面でのＧM3の局在性等が
異なることを示唆している。
ＬＬ−ＨＫ４６細胞及び３ＬＬ−ＳＴ２８細胞を、導入
２４時間後に免疫蛍光染色（3LL-HK46細胞については抗
ＧM3抗体M2590、3LL-ST28細胞については抗ＧM3抗体R24
をそれぞれ一次抗体として使用し、FITCを結合した抗マ
ウスIgM抗体又はIgG抗体を二次抗体として使用した）
し、フローサイトメトリーを用いて、染色された細胞の
分布を測定した。対照としてｐＣＥＶ１８を導入したそ
れぞれの宿主細胞を免疫染色した細胞を使用した。結果
を図４に示す。ａ及びｂは３ＬＬ−ＳＴ２８細胞、ｃ及
びｄは３ＬＬ−ＨＫ４６細胞であり、ａ及びｃはｐＣＥ
Ｖ１８を導入したもの（対照）、ｂ及びｄはｐＣＥＶ４
Ｃ７を導入したものである。本発明ＤＮＡを保持したプ
ラスミドＤＮＡを導入した３ＬＬ−ＳＴ２８が顕著な染
色性を示していることが明らかである。３ＬＬ−ＨＫ４
６細胞においてこの方法によるＧM3の検出が難しかった
ことは、細胞系により、細胞表面でのＧM3の局在性等が
異なることを示唆している。
【００６８】（６）組織等におけるＳＡＴ−１の発現 組織等におけるＳＡＴ−１の発現をノザンブロッティン
グ法により確認した。すなわち、クロンテック社製のＭ
ＴＮブロットを使用し、ｐＣＥＶ４Ｃ７からＥｃｏＲＩ
で切り出した2,066 bpのｃＤＮＡをアガロースゲル電気
泳動で調製し、常法に従って[α32Ｐ]ｄＣＴＰを用いて
放射能ラベルを行って、放射能ラベルプローブを調製し
た。サンプル中のＲＮＡ量の標準化を行うために、内部
標準としては放射能ラベルをしたヒトグリセルアルデヒ
ド−３リン酸デヒドロゲナーゼのプローブを使用した。
その結果、脳、胎盤、骨格筋、及び精巣において特にＳ
ＡＴ−１が強く発現していることが明らかとなり、肝
臓、腎臓、膵臓、及び大腸においては発現量が特に少な
いことが明らかとなった。また、脳、胎盤、肺、骨格
筋、脾臓、及び末梢血において、約7 kbの薄いバンドが
現れた。
グ法により確認した。すなわち、クロンテック社製のＭ
ＴＮブロットを使用し、ｐＣＥＶ４Ｃ７からＥｃｏＲＩ
で切り出した2,066 bpのｃＤＮＡをアガロースゲル電気
泳動で調製し、常法に従って[α32Ｐ]ｄＣＴＰを用いて
放射能ラベルを行って、放射能ラベルプローブを調製し
た。サンプル中のＲＮＡ量の標準化を行うために、内部
標準としては放射能ラベルをしたヒトグリセルアルデヒ
ド−３リン酸デヒドロゲナーゼのプローブを使用した。
その結果、脳、胎盤、骨格筋、及び精巣において特にＳ
ＡＴ−１が強く発現していることが明らかとなり、肝
臓、腎臓、膵臓、及び大腸においては発現量が特に少な
いことが明らかとなった。また、脳、胎盤、肺、骨格
筋、脾臓、及び末梢血において、約7 kbの薄いバンドが
現れた。
【００６９】脳におけるＳＡＴ−１の発現を詳細に調べ
るために、同じプローブを用いて小脳、大脳皮質、髄
質、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、脊髄のノザンブロ
ッティングも行った結果、大脳皮質、前頭葉、及び被殻
において若干強く発現していたが、全体に渡って比較的
強く発現していることが判明した。
るために、同じプローブを用いて小脳、大脳皮質、髄
質、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、脊髄のノザンブロ
ッティングも行った結果、大脳皮質、前頭葉、及び被殻
において若干強く発現していたが、全体に渡って比較的
強く発現していることが判明した。
【００７０】
【発明の効果】本発明によりラクトシルセラミドから細
胞分化を誘導するガングリオシドＧM3を合成するα２−
３シアル酸転移酵素（ＳＡＴ−１）のＤＮＡが提供され
る。また、本発明により、ＧM3合成酵素であるα２−３
シアル酸転移酵素が、上記ＤＮＡを使用することで容易
に得られる。
胞分化を誘導するガングリオシドＧM3を合成するα２−
３シアル酸転移酵素（ＳＡＴ−１）のＤＮＡが提供され
る。また、本発明により、ＧM3合成酵素であるα２−３
シアル酸転移酵素が、上記ＤＮＡを使用することで容易
に得られる。
【００７１】本発明により、ＳＡＴ−１をコードするＤ
ＮＡが得られたので、その発現機構を解明することによ
る細胞分化のメカニズムの解明が期待される。
ＮＡが得られたので、その発現機構を解明することによ
る細胞分化のメカニズムの解明が期待される。
【００７２】
【配列表】 <110> 生化学工業株式会社 <120> ヒト由来シアル酸転移酵素及びそれをコードするＤＮＡ <130> P-6547 <160> 5 <210> 1 <211> 2359 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (278)..(1363) <400> 1 ctgagcgggg gagcggcggc ccccagctga atgggcgcga gagcggcgct gggggcgggt 60 gggggcgcgg ggtaccgggc tggcggccgg ccggcgcccc ctcattagta tgcggacgaa 120 ggcggcgggc tgcgcggagc ggcgtcccct gcagccgcgg accgaggcag cggcggcacc 180 tgccggccga gcaatgccaa gtgagtacac ctatgtgaaa ctgagaagtg attgctcgag 240 gccttccctg caatggtaca cccgagctca aagcaag atg aga agg ccc agc ttg 295 Met Arg Arg Pro Ser Leu 1 5 tta tta aaa gac atc ctc aaa tgt aca ttg ctt gtg ttt gga gtg tgg 343 Leu Leu Lys Asp Ile Leu Lys Cys Thr Leu Leu Val Phe Gly Val Trp 10 15 20 atc ctt tat atc ctc aag tta aat tat act act gaa gaa tgt gac atg 391 Ile Leu Tyr Ile Leu Lys Leu Asn Tyr Thr Thr Glu Glu Cys Asp Met 25 30 35 aaa aaa atg cat tat gtg gac cct gac cgt gta aag aga gct cag aaa 439 Lys Lys Met His Tyr Val Asp Pro Asp Arg Val Lys Arg Ala Gln Lys 40 45 50 tat gct cag caa gtc ttg cag aag gaa tgt cgt ccc aag ttt gcc aag 487 Tyr Ala Gln Gln Val Leu Gln Lys Glu Cys Arg Pro Lys Phe Ala Lys 55 60 65 70 aca tca atg gcg ctg tta ttt gag cac agg tat agc gtg gac tta ctc 535 Thr Ser Met Ala Leu Leu Phe Glu His Arg Tyr Ser Val Asp Leu Leu 75 80 85 cct ttt gtg cag aag gcc ccc aaa gac agt gaa gct gag tcc aag tac 583 Pro Phe Val Gln Lys Ala Pro Lys Asp Ser Glu Ala Glu Ser Lys Tyr 90 95 100 gat cct cct ttt ggg ttc cgg aag ttc tcc agt aaa gtc cag acc ctc 631 Asp Pro Pro Phe Gly Phe Arg Lys Phe Ser Ser Lys Val Gln Thr Leu 105 110 115 ttg gaa ctc ttg cca gag cac gac ctc cct gaa cac ttg aaa gcc aag 679 Leu Glu Leu Leu Pro Glu His Asp Leu Pro Glu His Leu Lys Ala Lys 120 125 130 acc tgt cgg cgc tgt gtg gtt att gga agc gga gga ata ctg cac gga 727 Thr Cys Arg Arg Cys Val Val Ile Gly Ser Gly Gly Ile Leu His Gly 135 140 145 150 tta gaa ctg ggc cac acc ctg aac cag ttc gat gtt gtg ata agg tta 775 Leu Glu Leu Gly His Thr Leu Asn Gln Phe Asp Val Val Ile Arg Leu 155 160 165 aac agt gca cca gtt gag gga tat tca gaa cat gtt gga aat aaa act 823 Asn Ser Ala Pro Val Glu Gly Tyr Ser Glu His Val Gly Asn Lys Thr 170 175 180 act ata agg atg act tat cca gag ggc gca cca ctg tct gac ctt gaa 871 Thr Ile Arg Met Thr Tyr Pro Glu Gly Ala Pro Leu Ser Asp Leu Glu 185 190 195 tat tat tcc aat gac tta ttt gtt gct gtt tta ttt aag agt gtt gat 919 Tyr Tyr Ser Asn Asp Leu Phe Val Ala Val Leu Phe Lys Ser Val Asp 200 205 210 ttc aac tgg ctt caa gca atg gta aaa aag gaa acc ctg cca ttc tgg 967 Phe Asn Trp Leu Gln Ala Met Val Lys Lys Glu Thr Leu Pro Phe Trp 215 220 225 230 gta cga ctc ttc ttt tgg aag cag gtg gca gaa aaa atc cca ctg cag 1015 Val Arg Leu Phe Phe Trp Lys Gln Val Ala Glu Lys Ile Pro Leu Gln 235 240 245 cca aaa cat ttc agg att ttg aat cca gtt atc atc aaa gag act gcc 1063 Pro Lys His Phe Arg Ile Leu Asn Pro Val Ile Ile Lys Glu Thr Ala 250 255 260 ttt gac atc ctt cag tac tca gag cct cag tca agg ttc tgg ggc cga 1111 Phe Asp Ile Leu Gln Tyr Ser Glu Pro Gln Ser Arg Phe Trp Gly Arg 265 270 275 gat aag aac gtc ccc aca atc ggt gtc att gcc gtt gtc tta gcc aca 1159 Asp Lys Asn Val Pro Thr Ile Gly Val Ile Ala Val Val Leu Ala Thr 280 285 290 cat ctg tgc gat gaa gtc agt ttg gcg ggt ttt gga tat gac ctc aat 1207 His Leu Cys Asp Glu Val Ser Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Asp Leu Asn 295 300 305 310 caa ccc aga aca cct ttg cac tac ttc gac agt caa tgc atg gct gct 1255 Gln Pro Arg Thr Pro Leu His Tyr Phe Asp Ser Gln Cys Met Ala Ala 315 320 325 atg aac ttt cag acc atg cat aat gtg aca acg gaa acc aag ttc ctc 1303 Met Asn Phe Gln Thr Met His Asn Val Thr Thr Glu Thr Lys Phe Leu 330 335 340 tta aag ctg gtc aaa gag gga gtg gtg aaa gat ctc agt gga ggc att 1351 Leu Lys Leu Val Lys Glu Gly Val Val Lys Asp Leu Ser Gly Gly Ile 345 350 355 gat cgt gaa ttt tgaacacaga aaacctcagt tgaaaatgca actctaactc 1403 Asp Arg Glu Phe 360 tgagagctgt ttttgacagc cttcttgatg tatttctcca tcctgcagat actttgaagt 1463 gcagctcatg tttttaactt ttaatttaaa aacacaaaaa aaattttagc tcttcccact 1523 ttttttttcc tatttatttg aggtcagtgt ttgtttttgc acaccatttt gtaaatgaaa 1583 cttaagaatt gaattggaaa gacttctcaa agagaattgt atgtaacgat gttgtattga 1643 tttttaagaa agtaatttaa tttgtaaaac ttctgctcgt ttacactgca cattgaatac 1703 aggtaactaa ttggaaggag aggggaggtc actcttttga tggtggccct gaacctcatt 1763 ctggttccct gctgcgctgc ttggtgtgac ccacggagga tccactccca ggatgacgtg 1823 ctccgtagct ctgctgctga tactgggtct gcgatgcagc ggcgtgaggc ctgggctggt 1883 tggagaaggt cacaaccctt ctctgttggt ctgccttctg ctgaaagact cgagaaccaa 1943 ccagggaagc tgtcctggag gtccctggtc ggagagggac atagaatctg tgacctctga 2003 caactgtgaa gccaccctgg gctacagaaa ccacagtctt cccagcaatt attacaattc 2063 ttgaattcct tggggatttt ttactgccct ttcaaagcac ttaagtgtta gatctaacgt 2123 gttccagtgt ctgtctgagg tgacttaaaa aatcagaaca aaacttctat tatccagagt 2183 catgggagag tacacccttt ccaggaataa tgttttggga aacactgaaa tgaaatcttc 2243 ccagtattat aaattgtgta tttaaaaaaa agaaactttt ctgaatgcct acctggcggt 2303 gtataccagg cagtgtgcca gtttaaaaag atgaaaaaga ataaaaactt ttgagg 2359 <210> 2 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Arg Pro Ser Leu Leu Leu Lys Asp Ile Leu Lys Cys Thr Leu 1 5 10 15 Leu Val Phe Gly Val Trp Ile Leu Tyr Ile Leu Lys Leu Asn Tyr Thr 20 25 30 Thr Glu Glu Cys Asp Met Lys Lys Met His Tyr Val Asp Pro Asp Arg 35 40 45 Val Lys Arg Ala Gln Lys Tyr Ala Gln Gln Val Leu Gln Lys Glu Cys 50 55 60 Arg Pro Lys Phe Ala Lys Thr Ser Met Ala Leu Leu Phe Glu His Arg 65 70 75 80 Tyr Ser Val Asp Leu Leu Pro Phe Val Gln Lys Ala Pro Lys Asp Ser 85 90 95 Glu Ala Glu Ser Lys Tyr Asp Pro Pro Phe Gly Phe Arg Lys Phe Ser 100 105 110 Ser Lys Val Gln Thr Leu Leu Glu Leu Leu Pro Glu His Asp Leu Pro 115 120 125 Glu His Leu Lys Ala Lys Thr Cys Arg Arg Cys Val Val Ile Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Ile Leu His Gly Leu Glu Leu Gly His Thr Leu Asn Gln Phe 145 150 155 160 Asp Val Val Ile Arg Leu Asn Ser Ala Pro Val Glu Gly Tyr Ser Glu 165 170 175 His Val Gly Asn Lys Thr Thr Ile Arg Met Thr Tyr Pro Glu Gly Ala 180 185 190 Pro Leu Ser Asp Leu Glu Tyr Tyr Ser Asn Asp Leu Phe Val Ala Val 195 200 205 Leu Phe Lys Ser Val Asp Phe Asn Trp Leu Gln Ala Met Val Lys Lys 210 215 220 Glu Thr Leu Pro Phe Trp Val Arg Leu Phe Phe Trp Lys Gln Val Ala 225 230 235 240 Glu Lys Ile Pro Leu Gln Pro Lys His Phe Arg Ile Leu Asn Pro Val 245 250 255 Ile Ile Lys Glu Thr Ala Phe Asp Ile Leu Gln Tyr Ser Glu Pro Gln 260 265 270 Ser Arg Phe Trp Gly Arg Asp Lys Asn Val Pro Thr Ile Gly Val Ile 275 280 285 Ala Val Val Leu Ala Thr His Leu Cys Asp Glu Val Ser Leu Ala Gly 290 295 300 Phe Gly Tyr Asp Leu Asn Gln Pro Arg Thr Pro Leu His Tyr Phe Asp 305 310 315 320 Ser Gln Cys Met Ala Ala Met Asn Phe Gln Thr Met His Asn Val Thr 325 330 335 Thr Glu Thr Lys Phe Leu Leu Lys Leu Val Lys Glu Gly Val Val Lys 340 345 350 Asp Leu Ser Gly Gly Ile Asp Arg Glu Phe 355 360 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 atgaaaagaa tgcacta 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 tcagtggatg ccgctga 17 <210> 5 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Cys Arg Arg Cys Val Val Ile Gly Ser Gly Gly Ile Leu His Gly Leu 1 5 10 15 Glu Leu Gly His Thr Leu Asn Gln Phe Asp Val Val Ile Arg Leu Asn 20 25 30 Ser Ala Pro Val Gln Gly Tyr Ser Glu His Val Gly Asn Lys Thr Thr 35 40 45
【図１】 本発明のα２−３シアル酸転移酵素（ＳＡＴ
−１）の構造の模式図。△は、アミノ酸配列から推定さ
れるＮ−グリコシレーション部位である。ＴＭはアミノ
酸配列から推定される膜貫通領域である。
−１）の構造の模式図。△は、アミノ酸配列から推定さ
れるＮ−グリコシレーション部位である。ＴＭはアミノ
酸配列から推定される膜貫通領域である。
【図２】 ＳＡＴ−１のシアリルモチーフ（Ｌ及びＳ）
領域のアミノ酸配列と、他のシアル酸転移酵素のシアリ
ルモチーフ領域との対比を示す図。白抜き文字は１種類
のシアル酸転移酵素のみが他と異なったアミノ酸残基を
示す部位である。
領域のアミノ酸配列と、他のシアル酸転移酵素のシアリ
ルモチーフ領域との対比を示す図。白抜き文字は１種類
のシアル酸転移酵素のみが他と異なったアミノ酸残基を
示す部位である。
【図３】 本発明ＤＮＡから推定したＳＡＴ−１のアミ
ノ酸配列のハイドロパシープロット。
ノ酸配列のハイドロパシープロット。
【図４】 形質転換細胞におけるガングリオシドＧM3の
発現の、フローサイトメトリーによる分析結果。縦軸は
細胞数、横軸は蛍光強度を示す。
発現の、フローサイトメトリーによる分析結果。縦軸は
細胞数、横軸は蛍光強度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 CA09 DA02 DA06 EA04 GA14 GA27 HA13 HA14 HA15 4B050 CC01 CC03 DD11 EE01 LL01 LL03 LL05 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 AC16 BA03 BA21 BA30 BC01 BD01 BD25 CA29 CA44 CA46
Claims (11)
- 【請求項１】 配列番号２記載のアミノ酸配列における
アミノ酸番号４１〜３６２のアミノ酸配列を少なくとも
含むポリペプチドを含み、ガラクトース残基の３位水酸
基にシアル酸を転移する作用を有するシアル酸転移酵
素。 - 【請求項２】 配列番号２記載のアミノ酸配列における
アミノ酸番号１〜３６２のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを含む請求項１記載のシアル酸転移酵素。 - 【請求項３】 ラクトシルセラミドのガラクトース残基
にシアル酸を転移してα２→３結合を形成し、ガングリ
オシドＧM3を生成する活性を有する請求項１又は２記載
のシアル酸転移酵素。 - 【請求項４】 配列番号５記載のアミノ酸配列を少なく
とも含むポリペプチドを含み、ガラクトース残基の３位
水酸基にシアル酸を転移する作用を有するシアル酸転移
酵素。 - 【請求項５】 配列番号２記載のアミノ酸配列における
アミノ酸番号４１〜３６２のアミノ酸配列を少なくとも
含むポリペプチド。 - 【請求項６】 配列番号２記載のアミノ酸配列における
アミノ酸番号１〜３６２のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド。 - 【請求項７】 請求項５又は６記載のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ。 - 【請求項８】 配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａ。 - 【請求項９】 請求項７又は８記載のＤＮＡを含む組換
えベクター。 - 【請求項１０】 請求項７又は８記載のＤＮＡが導入さ
れ、かつ該ＤＮＡが発現可能な形質転換体。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の形質転換体を、好適
な培地で培養し、前記ＤＮＡがコードするシアル酸転移
酵素又はそのポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、
その培養物からシアル酸転移酵素又はそのポリペプチド
を採取することを特徴とする、シアル酸転移酵素又はそ
のポリペプチドの製造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14860399A JP4101976B2 (ja) | 1999-05-27 | 1999-05-27 | ヒト由来シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａ |
| US09/425,488 US6555371B1 (en) | 1997-07-09 | 1999-10-22 | Sialyltransferase and DNA encoding the same |
| US10/309,389 US7256278B2 (en) | 1997-07-09 | 2002-12-03 | Sialyltransferase and DNA encoding the same |
| US11/771,606 US20080227172A1 (en) | 1997-07-09 | 2007-06-29 | Sialyltransferase and dna encoding the same |
| US12/841,909 US8202705B2 (en) | 1997-07-09 | 2010-07-22 | Sialyltransferase and DNA encoding the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14860399A JP4101976B2 (ja) | 1999-05-27 | 1999-05-27 | ヒト由来シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａ |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000333682A true JP2000333682A (ja) | 2000-12-05 |
| JP2000333682A5 JP2000333682A5 (ja) | 2004-10-28 |
| JP4101976B2 JP4101976B2 (ja) | 2008-06-18 |
Family
ID=15456476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14860399A Expired - Fee Related JP4101976B2 (ja) | 1997-07-09 | 1999-05-27 | ヒト由来シアル酸転移酵素及びそれをコードするｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4101976B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003027297A1 (fr) * | 2001-09-26 | 2003-04-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de production de $g(a)2,3/$g(a)2,8-sialyltransferase et sucre complexe contenant de l'acide sialique |
| WO2005067971A1 (ja) * | 2004-01-16 | 2005-07-28 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 動脈硬化の予防・治療用医薬 |
-
1999
- 1999-05-27 JP JP14860399A patent/JP4101976B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003027297A1 (fr) * | 2001-09-26 | 2003-04-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de production de $g(a)2,3/$g(a)2,8-sialyltransferase et sucre complexe contenant de l'acide sialique |
| WO2005067971A1 (ja) * | 2004-01-16 | 2005-07-28 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 動脈硬化の予防・治療用医薬 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4101976B2 (ja) | 2008-06-18 |
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