MXPA01008941A - Proteina-histidina fosfatasa. - Google Patents

Abstract

El invento se refiere a una nueva enzima, la protein-histidina fosfatasa que se obtiene a partir de mamiferos, y a sus variantes homologas. El invento tambien se refiere a las secuencias de ADN que codifican dichas proteinas, a un procedimiento para preparar estas ultimas, y a los anticuerpos dirigidos contra ellas. La nueva fosfatasa puede ser empleada para el diagnostico de estados patologicos de regulacion celular y crecimiento celular, y como droga farmaceutica que puede ser administrada simultaneamente junto con desordenes patologicos relacionados con el malfuncionamiento de dicha enzima.

Description

PROTEIN-HISTIDINA FOSFATASA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El invento se refiere a una nueva enzima, la proteina histidina fosfatasa que se obtiene a partir de mamiferos, y a sus variantes homologas. El invento también se refiere a las secuencias de ADN que codifican dichas proteínas, a un procedimiento para preparar estas últimas, y a los anticuerpos dirigidos contra ellas. La nueva fosfatasa puede ser empleada para el diagnóstico de estados patológicos de regulación celular y crecimiento celular, y como droga farmacéutica que puede ser administrada simultáneamente junto con desórdenes patológicos relacionados con el malfuncionamiento de dicha enzima. En particular, el presente invento se refiere a la aplicación de dicha enzima para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades, a los agonistas y antagonistas que identifican factores que intervienen en la fosforilación de la histidina, y también a los agonistas y antagonistas que son potencialmente útiles en la terapia.

Fundamentos del invento La fosforilación de proteínas es un proceso biológico muy importante que suele tener un papel REF : 131698 j í A •& *: ttt?>* fundamental en la transducción de señales y en la regulación de la actividad proteica. La fosforilación de serina, treonina y tirosina es un hecho común en los caminos de la transducción de señales en eucariotas. Existe una vasta literatura sobre los métodos bioquímicos para la detección de la fosforilación de serina, .treonina y tirosina sobre proteínas desconocidas. Asi, por ejemplo, cuando los cultivos de células de mamífero son tratados con 10 factores de crecimiento, citoquinas, drogas, péptidos u otras moléculas estimulantes tales como FDGF, NGF, IL-2, etc., la fosforilación de proteínas en la serina, treonina y tirosina puede ser detectada fácilmente por incubación de las células con fosfato marcado en forma 15 radioactiva, aislamiento de las proteínas después del tratamiento con un factor de crecimiento, etc., separación de las proteínas por electroforesis en gel de SDS y poliacrilamida, fijación del gel y realización de una autoradiografia para identificar las bandas 20 proteicas que contienen el fosfato marcado. Las proteínas de células tratadas o sin tratar pueden ser separadas alternativamente por medio de un sistema bidimensional, y luego se puede comparar la posición de las manchas de proteina. El movimiento 25 aparente de una mancha puede indicar un cambio en el estado de modificación que resulta de un tratamiento. En otro método, las proteínas se someten a hidrólisis acida para obtener los aminoácidos, los cuales pueden ser sometidos luego a una cromatografía en capa delgada y examinados para comprobar la presencia de fósforo radioactivo . Sin embargo, estos métodos químicos para proteínas emplean condiciones en las cuales la histidina, lisina o arginina fosforilada es inestable. En particular, la fosfohistidina se degrada espontáneamente a pH bajo con una vida media de aproximadamente 5 a 100 minutos, mientras que a pH neutro la fosfohistidina tiene una vida media de dias a semanas (Matthe s, H.R.

[1995] Pharmac. Ther. 67: páginas 323-350) . Por ejemplo, en el caso de la electroforesis, los geles de poliacrilamida que se utilizan para la separación de proteínas se fijan generalmente en condiciones acidas. De manera similar, las condiciones acidas de la hidrólisis a aminoácidos también produce la ruptura de la fosfohistidina . Se ha demostrado que la histidina fosfoplada juega un papel fundamental en la transducción de señales en bacterias. Tales caminos regulan diversos aspectos del metabolismo bacteriano. Por ejemplo, el sistema ArcA/ArcB controla el metabolismo aeróbico y anaeróbico en E. coli (luchi S, Weiner L.J Biochem (Tokio)

[1996] 120: páginas 1055-63). OmpR y OmpF controlan la respuesta a diferentes condiciones osmóticas (Pratt LA, Hsing W. Gibson KE, Silhavy TJ. Mol Microbiol

[1996] 20: páginas 911-7) . CheA y CheZ participan en la quimiotaxis (Alón U. Nature

[1999] 397: páginas 168-171) . Todas estas proteínas se identificaron primero con medios genéticos: las mutaciones en los genes correspondientes originan los fenotipos de interés, y las proteínas resultantes pueden ser identificadas después de clonar los genes relevantes. Asimismo, se ha descubierto recientemente que los eucariotas S. cerevisiae y Arabidopsis thaliana tienen sistemas de transducción de señales con proteínas que incluyen la fosforilación de histidina (Loo is y col.,

[1997] J Cell science 110: páginas 1141-1145). Por ejemplo, la proteina Slnl tiene un dominio sensor extracelular, un dominio citoplasmático de histidina cinasa, y un dominio regular de aspartato. La ETR1 de la mostaza Arabidopsis thaliana también fue identificada en mutantes que no respondían al etileno. Luego se clonó el gen de ETR1 y se estudió la proteina, lo cual llevó a descubrir que esta proteina es una histidina cinasa. S. cerevisiae y Arabidopsis thaliana son I - -? x?X. organismos genéticamente manejables, y sus proteínas que se encuentran involucradas en la fosforilación de histidina, tales como la Slnl y Etrl, suelen ser identificadas por medios genéticos. Las técnicas existentes suelen incluir la separación por tamaño tanto de proteínas como de fosfoaminoácidos . La N-fosforilación en mamiferos es importante en el metabolismo de la energia y se encuentra alterada en diversos tipos de cáncer. Por ejemplo, la proteina Nm23 es una nucleósidodifosfatocinasa que puede emplear el ATP generado por glicólisis y fosforilación oxidativa para transformar los difosfatos de nucleósido y deoxinucleósido en trifosfatos. La Nm23 es temporalmente fosforilada en la histidina 118 como parte de un mecanismo de reacción "ping-pong". La Nm23 también es capaz de transferir su grupo fosfato a los residuos de histidina en la ATP-citrato-liasa y la succinil CoA sintetasa. De esta manera, la fosforilación de histidina juega un papel importante en el metabolismo de la energia en las células. Existen varias proteínas Nm23 en seres humanos. En los cánceres altamente expandidos por metástasis, la expresión de estas proteínas Nm23 suele alcanzar niveles bajos. En base a estos resultados se considera que la . - - , k?k X Nm23 es un antioncogen. Además, en ciertos cánceres, se han encontrado mutaciones en proteínas Nm23 particulares. Estas mutaciones suelen afectar la velocidad de fosforilación o desfosforilación de la Nm23. Estos resultados indican, en resumen, que la N-fosforilación juega un papel importante en el metabolismo de la energia y en el cáncer. De esta manera, las proteínas y las drogas que modulan la N-fosforilación o desfosfoplación pueden ser importantes para el tratamiento del cáncer o de los trastornos metabólicos tales como la obesidad, la anorexia, la debilidad y el agotamiento debidos al cáncer, el virus HIV u otras enfermedades, etc. Además, dado que la N-fosforilación intervenga en otras enfermedades y trastornos de mamiferos tales como las inmunodeficiencias, las infecciones virales, los trastornos genéticos, las enfermedades cardiacas, etc. Desafortunadamente los mamiferos crecen mucho más lentamente que las bacterias, S. cerevisiae y Arabidopsis thaliana, por lo que resulta muy dificil identificar las proteínas involucradas en la fosforilación de histidina, lisina o arginina empleando las mismas aproximaciones genéticas que las utilizadas para estos organismos más simples. Además, las técnicas * • - - bioquímicas para identificar proteínas que son fosforiladas en la serina, treonina y tirosina no suelen ser aplicables para identificar proteínas que son fosforiladas en la histidina, lisina y arginina. Por consiguiente, el estado actual de la técnica necesita de nuevas técnicas y reactivos bioquímicos que puedan ser empleados para estudiar la N-fosforilación. Las histidina fosfatases e histidina cinasas son enzimas que actúan en direcciones opuestas. La 10 histidina cinasa afecta la fosforilación de ciertos residuos de histidina en proteínas, mientras que las histidina fosfatasas invierten esta fosforilación. Es probable que ambas enzimas tengan un papel importarte en la transducción de señales, la apoptosis, el control del 15 crecimiento celular y en la diferenciación celular. Se conocen enfermedades que se basan en las alteraciones de estas funciones celulares. Por lo tanto, el objetivo del presente invento se basa en proporcionar un agente que pueda ser empleado para investigar el origen de las 20 alteraciones patológicas y eventualmente tratarlas. Las hormonas o los péptidos estimulan los receptores de la superficie celular de una célula e inducen efectos celulares a través de un camino de transducción con señales. La fosforilación reversible 25 de sustratos proteicos específicos por medio de proteínas cinasas y fosfatasas reguladoras juega un papel esencial en la transmisión intracelular de señales. Las proteínas cinasas y fosfatasas unidas a receptores, unidas a membranas e intracelulares regulan los procesos de la proliferación celular, de la diferenciación celular y del sistema inmunológico. El funcionamiento defectuoso de estos reguladores o de sus actividades es crucial para un gran número de efectos patofisiológicos . Por consiguiente, las proteínas cinasas y fosfatasas y el camino de transducción con señales en el cual éstas se encuentran involucradas constituyen objetivos potenciales para el proceso de descubrimiento de drogas. La transducción con señales en mamiferos incluye la fosforilación reversible de Ser/Tr/Tir. Si bien se sabe que el fosfato de histidina se encuentra presente en los mamiferos (Crovello CS, Furie BC, Furie B (1995) Cell 82: páginas 279-286), no se ha podido identificar hasta el momento las cinasas correspondientes ni las fosfatasas relevantes. La dificultad radica, entre otras cosas, en que el fosfato de histidina es inestable a la hidrólisis y no puede ser detectado en los análisis estándar de fosfoaminoácidos . Las funciones de His cinasas e His fosfatasas en bacterias han sido investigadas intensivamente. Su participación en la quimiotaxis y adaptación las convierte en puntos estratégicos para atacar con éxito las enfermedades bacterianas.

Breve descripción del invento El presente invento se refiere a la protein- histidina fosfatasa, en particular a los polipéptidos de protein-histidina fosfatasa y polinucleótidos de protein-histidina fosfatasa, a los materiales recombinantes y a los métodos para su elaboración. El interés en tales polipéptidos y polinucleótidos está relacionado con los métodos para tratar ciertas enfermedades, incluyendo entre ellas, pero sin limitar el invento a ellas, el cáncer y los trastornos metabólicos, las enfermedades cardiovasculares y los trastornos del sistema nervioso central, enfermedades que de aqui en más se denominarán "las enfermedades del inventor". En otro aspecto, el invento se refiere a los métodos para identificar agonistas y antagonistas (por ejemplo, inhibidores) empleando los materiales que provee el invento, y tratar las condiciones asociadas a una desproporción en la N-fosforilación con los compuestos identificados. Otro aspecto del invento se refiere a los ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con una actividad inadecuada o con niveles inapropiados de protein-histidina fosfatasa. El invento también abarca las variantes y mutantes correspondientes que se producen, por ejemplo, por sustitución controlada o al azar, diferentes formas de unión, eliminación o adición de uno o más nucleótidos o aminoácidos, manteniendo esencialmente la actividad biológica . Por lo tanto, un objetivo del presente invento es proporcionar un polipéptido con la actividad biológica de una histidina fosfatasa que tiene una gran especificidad por la fosfohistidina y un peso molecular de 13.000 a 15.000, que puede ser obtenida por purificación a partir de tejido de mamífero llevando a cabo al menos un paso de cromatografía de intercambio aniónico, un paso de filtración en gel y un paso de cromatografía de afinidad. Los tejidos de mamífero preferidos provienen del corazón, los riñones, el higado, el páncreas, los músculos esqueléticos y de los testículos. Los mamíferos preferidos son los humanos, los conejos y las ratas El polipéptido del invento comprende al menos la secuencia de aminoácidos YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM.

Esta secuencia permanece muy bien conservada a lo largo de la secuencia completa de aminoácidos de la enzima . En una realización preferida del invento, el polipéptido tiene la actividad biológica de una histidina fosfatasa que tiene una gran especificidad por la fosfohistidina y un peso molecular de 13.000 a 15.000, y comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : (M) AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYH ADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKI KAKYPDYEVTWANDGY .

El residuo de metionina en el N-terminal de la secuencia no es obligatorio. La secuencia de aminoácidos indicada más arriba es de origen humano. Sin embargo, el invento también muestra variantes homologas especiales de dichas secuencias. Por lo tanto, el invento también tiene como objetivo proporcionar un polipéptido con la actividad biológica de una histidina fosfatasa que tiene una gran especificidad por la fosfohistidina y un peso molecular de 13.000 a 15.000, y cuya secuencia de aminoácidos tiene un 64 a 99% de homologia, preferentemente un 75 a 99%, en comparación con la secuencia representada más arriba. Tal como se muestra más abajo, el invento exhibe un gran número de polipéptidos homólogos que tienen todos la actividad biológica de una protein-histidina fosfatasa. Otro objetivo del invento es proporcionar secuencias de ADN que codifican para un polipéptido como el indicado más arriba y más abajo. En particular, el invento se refiere a dicho ADN que contiene la siguiente secuencia de nucleótidos: (ATG) GCGGTGGCGGACCTCGCTCTCATTCCTGATGTGGACATCGACTCCGACGGC GTCTTCAAGTATGTGCTGATCCGAGTCCACTCGGCTCCCCGCTCCGGGGCTCCGGC TGCAGAGAGCAAGGAGATCGTGCGCGGCTACAAGTGGGCTGAGTACCATGCGGACA TCTACGACAAAGTGTCGGGCGACATGCAGAAGCAAGGCTGCGACTGTGAGTGTCTG GGCGGCGGGCGCATCTCCCACCAGAGTCAGGACAAGAAGATTCACGTGTACGGCTA TTCCATGGCCTATGGTCCTGCCCAGCACGCCATTTCAACTGAGAAAATCAAAGCCA AGTACCCCGACTACGAGGTCACCTGGGCTAACGACGGCTACTGA El invento también se refiere a los anticuerpos, preferentemente los anticuerpos monoclonales, que se dirigen contra los polipéptidos del invento. Finalmente, el invento también tiene el objetivo de proporcionar una preparación farmacéutica que contiene los polipéptidos definidos más arriba y más abajo, y en caso apropiado, también contiene excipientes adecuados, vehículos y otros ingredientes activos.

Descripción detallada « (A) AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN La proteín-histidina fosfatasa se aisló del higado de conejo. Para la preparación del hígado se parte de aproximadamente 110 g del material cortado en pequeños pedazos. Se mezclan con el tampón de homogeinización (220 ml de trietanolamina/ácido clorhídrico 30 M pH 7.5, ácido etilendiaminotetraacático 1 mM, sacarosa 300 mM, benzamidina 0.1 mM, 0,1% 2-mercaptoentanol ) y se trituran en un homogeneizador mientras se enfría en baño de hielo. Después de una primera centrifugación (10 minutos a 3800 g, 4°C) se vuelve a centrifugar el sobrenadante (1 h a 48,000 g, 4°C). Este sobrenadante se filtra a través de una gasa y se congela en alícuotas de aproximadamente 20 ml a -80°C.

Métodos de separación por cromatografía en columna La histidina fosfatasa se aisló empleando tres pasos de purificación (figura 1) . 1. Cromatografía de intercambio aniónico El extracto crudo de higado se centrifuga una vez más (30 min. a 48,000 g) . Se carga el sobrenadante sobre una columna Source Q30 (Pharmacia, Freiburg, equilibrada con el tampón A ( trietanolamina/ácido clorhídrico 20 M pH 8,0, ácido etilendiaminotetraacético 1 mM, 0.1% 2-mercaptoetanol, 0,02% nitrito de sodio) . Se eluye con cloruro de sodio 200 mM en el tampón A, a una velocidad de flujo de 1 ml/min. 2. Filtración en gel La fracción activa (véase la determinación de la actividad) se agita y enfria mientras se agrega sulfato de amonio sólido (11,2 g a 17 ml) . El pellet obtenido por centrifugación (20 min. a 48,000 g, 4°C) se resuspende en el tampón A y se carga sobre una columna de Superdex 75 26/60 1.6x60 cm (Pharmacia, Freiburg) . La filtración en gel se lleva a cabo con el agregado de cloruro de sodio 50 mM al tampón A y a 1 ml/min. 3. Cromatografía de afinidad Se diluye la fracción activa que proviene de la filtración en gel en una proporción de 1:3 con tampón B ( trietanolamina/ácido clorhídrico 20 mM pH 8.0, ácido etilendiaminotetraacético 0.1 mM, 0,1% 2-mercaptoetanol, 0.02% nitrito de sodio) y se ajusta a cloruro de magnesio 10 mM. Se carga la muestra sobre una columna de Blue Sepharose 6 25x510 mm (Pharmacia, Freiburg) . Se eluye con el tampón B al cual se le agrega cloruro de sodio 200 mM, a una velocidad de flujo de 1 ml/min.

(B) DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA La actividad de la histidina fosfatasa soluble se determina a partir de la desfosforilación de la proteina fosforilada en la histidina y marcada con 3 P (CheA) que se emplea como sustrato. CheA es una histidina autocinasa bacteriana recombinante (Bilwes AM, Alex LA, Crane BR, Simón MI (1999) Cell 96: páginas 131- 141); el dominio C-terminal de la cinasa fosforila la His48 N-terminal. En la reacción se produce fosfato libre que se identifica por cromatografía en capa fina (placas de polietilenimina y celulosa, cloruro de litio 0,5 M como fase móvil) . La detección se lleva a cabo, por un lado, con molibdato de amonio, y por otro lado, por autoradiografia (figura 2). No hubo transferencia de fosfato a otras proteínas, ni se detectó fragmentación alguna del sustrato en fragmentos peptidicos. El producto es el fosfato, por lo cual hay una protein-fosfohistidina fosfatasa involucrada en el proceso . En la proteina purificada, la desfosfoplación de histidma de la CheA 3'P-fosforilada depende del tiempo, la temperatura, el pH y la proteína (figura 3) . ? .l 'J. íi i- .,£,. J.,.y i st. t¿k¿-b&*.

Estabilidad El homogenato crudo y las fracciones parcialmente purificadas son estables al almacenamiento.

Ensayo enzimático Preparación del sustrato: (marcación de CheA con 32P) Se mezcla la CheA recombinante (5 µl) con 0.5 µl de fluoruro de fenilmetilsulfonilo 100 mM en dimetiisulfóxido y 5 µl de HEPES 500 mM pH 8,0, cloruro de magnesio 1 mM. Después de agregar 108 µCurie de 32P- g-trifosfato de adenosina, 5 µl de trifosfato de adenosina 10 µM y 50 µl de agua se incuba a 37°C durante 3 horas .

Determinación de la actividad Se mezcla el sustrato (10 µl de 3:P-CheA) con 10 µl del tampón de ensayo ( trietanolamma/ácido clorhídrico 100 mM pH 8.0, 0,1% 2-mercaptoetanol , 0,02% nitrito de sodio) y la solución enzimática. La reacción se produce a 37°C en 30 minutos. Luego se agregan 2 µl de ácido etilendiaminotetraácetico 500 mM y 126 µl de metanol/acetona 1:1. Después de centrifugar (5 min. a 15,800 g) se remueve el sobrenadarte, el cual se mide en un contador de centelleo.

La fosfatasa descrita se diferencia de otras proteínas en base a las características siguientes: 1. la especificidad por la fosfohistidina (tabla 1), la histidma fosfatasa no hidroliza, por ejemplo, el fosfato de p-nitrofenilo; 2. la actividad no es inhibida por ácido ocadaico o por vanadato (tabla 2) 3. el peso molecular es considerablemente menor.

Tabla 1. Hidrólisis con la nueva protein-histidina fosfatasa Tabla 2. Reactivos que afectan las actividades de la histidina fosfatasa 100 % = xxx nmol / min x mg_i (C) CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍN-HISTIDINA FOSFATASA Según el análisis por electroforesis en gel de SDS, la fracción de proteína purificada contenia una banda definida con un peso molecular aparente de 14.000 (figura 4) .

Por medio del análisis de masa se identificó un peso molecular de la proteina de 13.768 (figura 5) . La protein-histidina fosfatasa se encuentra bloqueada en su N-terminal con un grupo acetilo. Por esta razón la degradación de Edman no aporta información alguna sobre la secuencia, y se requiere de una ruptura proteolítica para caracterizar la proteina.

(D) ENSAYO ANALÍTICO DE LA PROTEÍNA Para determinar la secuencia de aminoácidos se sometió la fracción activa (Figura 4) a una ruptura enzimática, y los fragmentos peptídicos resultantes se secuenciaron por medio de la degradación de Edman y aplicando las técnicas usuales de la espectrometría de masa, tal como se describe en la literatura (Kellner R, Lottspeich F. Meyer HE (1999) Microcharacterization of Proteins (Microcaracterización de Proteínas), Wiley- VCH) .

Fragmentación enzimática Se corto y separó la banda del gel con un escalpelo y luego se transfirió a un tubo Eppendorf. La fragmentación enzimática se produjo después de agregar tripsina como proteasa (1 µg de triosina, 100 µl de bicarbonato de amonio 0,5 M, 37°C, 12 horas S e extrajeron los fragmentos peptidicos resultantes (50% ácido trifluoroacético, 50% acetonitrilo) . El extracto se concentró en una centrifugadora al vacio. 5 Separación cromatográfica de los fragmentos peptídicos Se disolvieron los fragmentos peptidicos en el eluyente A (0,1% ácido trifluoroacético en agua) y se sometieron a una separación por cromatografía en fase reversa (eluyente B: 20% de ácido trifluoroacético al 10 0,1% en agua, 80% acetonitrilo) . Después del fraccionamiento y la detección UV a 214 nm (ver figura 6) , los fragmentos peptídicos se encontraban forma disuelta y se analizaron por medio de la secuenciación de Edman y la espectrometría de masa. 15 Secuenciación de Edman y espectrometría de masa Para la secuenciación de Edman (condiciones estándar, aparato: modelo 494, PE-Applied Biosystems, eiterstadt) se empleó el 90% de las fracciones liquidas 20 que provenían de la separación cromatográfica. La parte restante de la fracción se empleó para el análisis de masa (MALDI-MS) , (aparato: Voyager STR, Perseptive Biosystems, Wiesbaden) . a?áíái y - .. .j!j.ii,¿. a J»?..¿ Jt *AÍ?.. í l á 3-i í-il Secuencias peptídicas identificadas Se determinaron las secuencias peptídicas siguientes (conejo) : xxAALAQIPD VDIDSDGVFK YVLIR VHAAPPSEAPGGESK DIVR WAEYHADIYDK VSGELQK ISHQSQDR KIHVYGYSMGYGR YPDYEVTWADDGY (E) Secuenciación de nucleótidos Se sondeó una biblioteca de ADN de conejo con promotores seleccionados de la secuencia archivada de aminoácidos para nucleótidos de la proteín-histidina fosfatasa. Por clonación y secuenciación se identificó la secuencia de nucleótidos indicada en la figura 7a. Las 327 bases traducen para la secuencia proteica de la protein-histidina fosfatasa comenzando en la posición 11 a 119 (figura 7b) .

Análisis de base de datos Se llevó a cabo una búsqueda de base de datos empleando el algoritmo BLAST. Se pudieron identificar proteínas homologas a partir de C. elegans, Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura, en las bases de datos para proteínas: C. elegans CAB03070.1 Drosophila jara_drops anb_drops j ana_drome j anb drome En base de datos de nucleótidos se identificaron ESTs en el ser humano, la rata, el ratón y el pez cebra.

Ser humano Hasta el momento no se ha publicado un homólogo humano. Cubriendo ORF se han identificado los siguientes ESTs (140 ESTs se encuentran indicados en Unigene hs . 131857): AA993684, AI161130, AI689667, AI796608, R43849, R45994, AI015589, AI139948, AI183285, AI189890, AI740906, AI742747, AI887278; R89481, AI560530 Í??L? >HS_PROTEÍNA-HISTIDINA FOSFATASA ADNc AF131857: CTGATTCGCYARGCTTYTGMAAWTAASCCTCAYTWARGKGAACAM AKMTGRAGCK YCACCGCSGTGSMGGYMGCTCKAGWCYGGRATYCCCSGGKCTGCASSMAYKCGKCA CGAGGGAACATGGCGGTGGCGGACCTCGCTCTCATTCCTGATGTGGACATCGACTC CGACGGCGTCTTCAAGTATGTGCTGATCCGAGTCCACTCGGCTCCCCGCTCCGGGG CTCCGGCTGCAGAGAGCAAGGAGATCGTGCGCGGCTACAAGTGGGCTGAGTACCAT GCGGACATCTACGACAAAGTGTCGGGCGACATGCAGAAGCAAGGCTGCGACTGTGA GTGTCTGGGCGGCGGGCGCATCTCCCACCAGAGTCAGGACAAGAAGATTCACGTGT ACGGCTATTCCATGGCCTATGGTCCTGCCCAGCACGCCATTTCAACTGAGAAAATC AAAGCCAAGTACCCCGACTACGAGGTCACCTGGGCTAACGACGGCTACTGAGCACT CCCAGCCCGGGGCCTGCTGCCTCCAGCAGCCACTTCAGAGCCCCCGCCTTTGCCTG CACTCCTCTTGCAGGGCTGGCCCTGCCTGCTCCTGCGGCAGCCTCTGGTGACGTGC TGTCCACCAGGCCTTGGAGACAGGCTAGCCTGGCCACAGAATTAAACGTGTTGCCC CCCCMAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGACCCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAAT TCGCCCTATAGTAGTCGTATTCAATTC >HS_PROTEÍN-HISTIDINA FOSFATASA proteina humana de protein-histidina fosfatasa AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYK AEYHADIY DKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKIKAKY PDYEVT ANDGY Rata Hasta el momento no se ha publicado un homólogo de rata. Cubriendo ORF se han identificado los siguientes ESTs de rata: AA799759, AA875365, AA899959, AA899995, AI102252, AI710838, AI713783 Traducción conceptual: >RN_PROTEÍN-HISTIDINA FOSFATASA NGLNTTRGKGSSPLGKDHQELELLTPYPAVKFSVGPTRATRAYPEATLPTSADIYD KVSGELQKNGYDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIKAKYP DYEVTWADDY Ratón Hasta el momento no se ha publicado un homólogo de ratón. Cubriendo ORF se han identificado los siguientes ESTs de ratón: AA000868, AA004141, AA016563, AA027746, AA028450, AA036266, AA041720, AA049115, AA175891, AA212348, AA218242, AA220789, AA221790, AA267200, AA269392, AA274926, AA467239, AA475040, AA511432, AA575612, AA670635, AA674361, AA688909, AA832673, AA980797, AI021168, AI286661, AI326851, AI385791, W09538, W09652, 14215, 20615, W29543, 44107, W59394, 67078, 75845, W89302, W97611, W99959 Traducción conceptual: >MM_PROTEÍN-HISTIDINA FOSFATASA TRADUCIDA de: aa000868: MAADLGQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHLAEPSGDPAKECKEIVRGYKWAEYHADIY DKVSGELQRNGYDCECLGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGRAQHSVSTEKIKAKYPDY EVTWADDGY Pez cebra Hasta el momento no se ha publicado un homólogo de pez cebra Se identificó un EST: AI477131 Traducción conceptual: >DR PROTEÍN-HISTIDINA FOSFATASA MSAERLAXIPEDVLDPNGVFKYVLIRVHSKDDDSYVDIVRGYA AEYHADIYDRVS GELERAGGVDCECLGGGRIKHDQDAKKIHVYGYSMGFGRAKHSVSTEKIKTHY Las secuencias proteicas indicadas están alineadas en la figura 8. En la tabla 3 se muestra la homologia de secuencia calculada.

Tabla 3: homología de secuencia para la proteín-histidma fosfatasa de diversas especies, indicada en % de identidad S,& yí vk. ?ytb.JueX » .- (E) LOCALIZACIÓN DE PROTEÍNAS y distribución en el tej ido El gen de la proteín-hastidina fosfatasa humana está localizado en el cromosoma 9 (3q33-Tel, marcador sts-N90764, intervalo D9S159-qTEL) . Se emplearon las siguientes fuentes para la expresión de ADNcs: Cerebro, mama, SNC, colon, prepucio, célula germinativa, corazón, riñon, hígado, pulmón, músculo, páncreas, paratiroides, próstata, bazo, testículo, tiroides, amígdala, útero, embrión entero. Al analizar la distribución del mRNA de la protein-histidina fosfatasa se observó un nivel incrementado en tejidos normales tales como corazón, riñon, higado, páncreas, músculo esquelético y testículos (figura 9 a, b) .

(F) anticuerpos anti-histidina fosfatasa Los anticuerpos anti-histidina fosfatasa se generaron contra tres distintas regiones de la proteina, a saber, la parte n-terminal, la parte media y la parte 5 c-terminal de la molécula. Para este propósito se seleccionaron tres secuencias peptidicas: péptido 1 - QIPDVDIDSD GVFKYV (16aa); péptido 2 - CLGGGRISHQ SQDK (14aa); péptido 3 - CTEKIKAKYP DYEV (14aa) . 10 Los péptidos se sinterizaron empleando la química estándar con FMOC. Para la inmunización se inyectó cada uno de los péptidos (4 inyecciones) en dos conejos y se tomaron cuatro muestras de sangre. El último flujo de sangre se tomó después de 15 aproximadamente 3 meses. Los anticuerpos generados son útiles para detectar y localizar la histidina fosfatasa. También se pueden analizar las diferentes regiones dentro de la molécula en forma individual. En particular, se supone que la parte central, altamente 20 conservada, de la histidina fosfatasa que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos: YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM, contiene el sitio activo responsable de la función de la proteina en vivo. El anticuerpo antipeptídico dirigido contra esta región se emplea para fines de inhibición o neutralización. Las características de la protein-histidina fosfatasa pueden ser resumidas de la siguiente manera: 1. la secuencia de aminoácidos de la protein-histidina fosfatasa humana contiene aproximadamente 124 aminoácidos . 2. La secuencia de aminoácidos de la protein-histidina fosfatasa es altamente homologa en la parte C-terminal, pero sólo existe una homología débil para la parte N-terminal . 3. El peso molecular es de 13.800 ± 100 (figura 5) . 4. La protein-histidina fosfatasa se encuentra bloqueada en el N-terminal por una acetilación.

Preparaciones farmacéuticas Tanto la(s) proteína(s) nativa(s) como la(s) recombinante (s) puede (n) ser empleada (s) como un medicamento que puede ser aplicado directamente a los pacientes o dentro de una composición farmacéutica. Por lo tanto, otro objetivo del presente invento es proveer una proteína nativa o recombinante como la definida más arriba y más abajo que pueda ser aplicada como un « A medicamento, y una composición farmacéutica respectiva que contenga dicha proteína y un diluyente, vehiculo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico . Las composiciones farmacéuticas del invento pueden contener adicionalmente otros compuestos farmacéuticos activos de gran diversidad. Tal como se emplea en este texto, la expresión "vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico" se refiere a una carga, un diluyente o un material encapsulado líquido (a) o sólido (a), inerte y no tóxico (a), que no reacciona adversamente con el compuesto activo o con el paciente. Los vehículos apropiados y preferiblemente líquidos son conocidos en el arte previo y entre ellos se pueden nombrar el agua esterilizada, la solución salina, la dextrosa acuosa, las soluciones de azúcares, el etanol, los glicoles y aceites, incluyendo aquellos a base del petróleo o los de origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo, el aceite de man!, el aceite de soja y el aceite mineral. Las formulaciones del invento pueden ser administradas como dosis únicas que contienen vehículos, diluyentes o aditivos usuales no tóxicos y aceptables desde el punto te vista farmacéutico, y que se emplean usualmente para la administración parenteral. t.-^t- ? ¡. í.tt Sr ? El término "parenteral" se refiere en este texto a las técnicas de inyección e infusión subcutáneas, intravenosas, intra-articulares e intratraqueales . Otras vias de administración tales como la administración por vía oral o la aplicación tópica también son adecuadas para estos casos. Las composiciones y combinaciones parenterales se administran preferentemente por vía intravenosa, ya sea en forma de bolo o de fusión constante, y conforme a procedimientos conocidos. Las tabletas y cápsulas que se destinan a la administración por via oral contienen excipientes convencionales tales como aglutinantes, cargas, diluyentes, aditivos de tableteo, lubricantes, desintegrantes, y agentes humectantes. Las tabletas se pueden recubrir conforme a métodos conocidos en el arte previo. Las preparaciones liquidas destinadas a la administración por vía oral pueden presentarse en forma de suspensiones acuosas o aceitosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o en forma de producto seco a ser reconstituido con agua u otro vehiculo apropiado antes del uso. Tales preparaciones liquidas pueden contener aditivos convencionales tales como los agentes de dispersión, los emulsionantes, los vehículos no acuosos y los conservantes. La aplicación tópica se puede llevar a cabo con suspensiones acuosas o aceitosas, soluciones, emulsiones, jaleas o preferentemente con ungüentos emulsionados. Las unidades de dosificación del invento pueden contener las cantidades de la proteína del nuevo que se requieren diariamente, o submúltiplos de ellas como para llegar a la dosis deseada. La dosificación y proporción de la dosis óptimas y aceptables desde el punto de vista terapéutico que se administran a un paciente dado (mamífero, incluyendo los seres humanos) dependen de una gran variedad de factores como, por ejemplo, la actividad del material activo especifico que se emplea, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el momento y la via de administración, la velocidad de excreción, la actividad enzimática (unidades/mg de proteina) , la finalidad del tratamiento, o sea la terapia o profilaxis, y la naturaleza de la enfermedad a ser tratada. Por lo tanto, una dosis diaria y farmacéuticamente efectiva de la proteina del invento en las composiciones y combinaciones y en un paciente tratado (en vivo) se encuentra aproximadamente entre 0,01 y 100 ms/kg de peso corporal (tomando como base una actividad especifica de 100 kU/mg) , preferentemente entre 0,1 y 10 mg/kg de peso corporal. Según la forma de aplicación empleada, una dosis única puede contener entre 0,5 y 10 mg de protein-histidina fosfatasa.

Descripción breve de las figuras Fig. 1 : esquema de purificación que se emplea para aislar la histidina fosfatasa Fig. 2 : identificación de fosfato inorgánico como producto de la reacción de ruptura de la histidina fosfatasa. Las placas exhibidas corresponden a la cromatografía de capa fina (PEÍ celulosa, 0.8 M LiCl); panel izquierdo: tratamiento con molibdato de amonio; panel derecho: tratamiento por autoradiografia; 1:[3 P] His-CheA, 2: producto de reacción, 3: ATP, 1-3: fosfato (NaH2P04); Fig . 3 : desfosforilación del sustrato cheA dependiente del tiempo y de la proteina; panel izquierdo: degradación después de 0,20 y 40 min., panel derecho: liberación del fosfato marcado en forma radioactiva (eje y a la izquierda: %, eje x a la derecha: radioactividad) de diferentes cantidades de sustrato (eje x: ng de proteina) . Fig. 4: análisis de la fracción cor histidina fosfatasa activa (SDS-PAGE); FA: fracción activa; 1,2 BSA (1 µg, 0.5 µg) , 3: FA; 4,5: marcadores moleculares . Fig. 5 : análisis de masa de la histidma fosfatasa. Eje y: recuento, eje x: masa (m/z) Fig . 6 : separación por cromatografía en fase reversa de la histidina fosfatasa después de la fragmentación enzimática; eluyente A: 0,1' ácido trifluoroacético en agua y eluyente B: 20% de ácido trifluoroacético al 0,1% en agua, 80% acetonitrilo, detección UV a 214 nm Fig . 7a : secuencia de nucleótidos de la protein- histidina fosfatasa de conejo Fig. 7b: secuencia traducida de aminoácidos de la protein-histidina fosfatasa de conejo Fig.8a-8c : alineación de las proteín-histidina fosfatasas Fig. 9a: distribución de la linea de células tumorales de la protein-histidina fosfatasa Fig. 9b: distribución de tejido de la proteín-histidina fosfatasa en el tejido tumoral Fig. 9c: distribución de tejido de la histidma fosfatasa en el tejido normal. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere. k.tJL &n*¿- - «.»•-- * i. ,t ,. < l i LISTADO DE DECUE CIAS <110> Merck Patent GmbH <120> protein-histidina fosfatasas <160> 11 <170> Patentln Ver. 2.1 <213> 1 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (375) <223> protein-histidma fosfatasas Humana <400> 1 atg gcg gtg gcg gac etc gct etc att ect gat gtg gac act gac tec 4í Met Ala Val Ala Asp Leu Ala Leu lie Pro Asp Val Asp lie Asp Ser 1 5 10 15 _ ... gac ggc gtc ttc aag tat gtg ctg ate cga gtc cae teg gct ecc cgc 96 Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu lie Arg Val His Ser Ala Pro Arg 20 25 30 tec ggg gct ceg gct gca gag age aag gag ate gtg cgc ggc tac aag 144 Ser Gly Ala Pro Ala Ala Glu Ser Lys Glu lie Val Arg Gly Tyr Lys 35 40 45 tgg gct gag tac cat gcg gac ate tac gac aaa gtg teg ggc gac atg 192 Trp Ala Glu Tyr His Ala Asp lie Tyr Asp Lys Val Ser Gly Asp Met 50 55 60 cag aag caá ggc tgc gac tgt gag tgt ctg ggc ggc ggg cgc ate tec 240 Gln Lys Gln Gly Cys Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg lie Ser 65 70 75 80 cae cag agt cag gac aag aag att cae gtg tac ggc tat tec atg gcc 2Í His Gln Ser Gln Asp Lys Lys lie His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Ala 85 90 95 tat ggt ect gcc cag cae gcc att tea act gag aaa ate aaa gcc aag 336 Tyr Gly Pro Ala Gln His Ala lie Ser Thr Glu Lys lie Lys Ala Lys 100 105 110 tac ecc gca tac gag gtc acc tgg gct aac gac ggc tac 375 Tyr Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asn Asp Gly Tyr 115 120 125 5 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens 10 <400> 2 Met Ala Val Ala Asp Leu Ala Leu He Pro Asp Val Asp He Asp Ser 1 5 10 15 Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu He Arg Val His Ser Ala Pro Arg 15 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Ala Ala Glu Ser Lys Glu He Val Arg Gly Tyr Lys 35 40 45 20 Trp Ala Glu Tyr His Ala Asp He Tyr Asp Lys Val Ser Gly Asp Met 50 55 60 Gln Lys Gln Gly Cys Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg He Ser 65 70 75 80 25 His Gln Ser Gln Asp Lys Lys He His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Ala 85 90 95 Tyr Gly Pro Ala Gln His Ala He Ser Thr Glu Lys He Lys Ala Lys 100 105 110 Tyr Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asn Asp Gly Tyr 115 120 125 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> mamífero <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (16) <223> secuencia de mamífero conservada <400> 3 Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg He Ser His Gln Ser Gln Asp 1 5 10 15 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> mamífero <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (33) <223> secuencia 2 de mamífero conservada <220> <221> SITIO <222> (17) <223> X = K o R <220> <221> SITIO <222> (27) <223> X = A o G <220> <221> SITIO <222> (30) <223> X = P o R <400> 4 Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg He Ser His Gln Ser Gln Asp 1 5 10 15 Xaa Lys He His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Xaa Tyr Gly Xaa Ala Gln 20 25 30 His <210> 5 <211> 44 <212> PRT <213> mamífero <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (44) <223> secuencia 3 de mamífero conservada <4 00 > 5 Tyr His Ala Asp He Tyr Asp Lys Val Ser Gly Asp Met Gln Lys Gln 1 5 10 15 Gly Cys Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg He Ser His Gln Ser 20 25 30 »?#* Gln Asp Lys Lys He His Val Tyr Gly Tyr Ser Met 35 40 <210> 6 <211> 124 <212> PRT <213> conejo <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (124) <223> protein-histidma fosfatasa de conej o <400> 6 Ala Ala Ala Gly Leu Ala Gln He Pro Asp Val Asp He Asp Ser Asp 1 5 10 15 Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu He Arg Val His Ala Ala Pro Pro Ser 20 25 30 Glu Ala Pro Gly Gly Glu Ser Lys Asp He Val Arg Gly Tyr Lys Trp 35 40 45 Ala Glu Tyr His Ala Asp He Tyr Asp Lys Val Ser Gly Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Lys Gly His Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg He Ser His 65 70 75 80 Gln Ser Gln Asp Arg Lys He His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Tyr 85 90 95 Gly Arg Ala Gln His Ser Val Ser Thr Glu Lys He Arg Ala Lys Tyr 100 105 110 Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asp Asp Gly Tyr 115 120 <210> 7 <211> 123 <212> PRT <213> rata <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (123) <223> protein-histidina fosfatasa de rata <400> 7 Asn Gly Leu Asn Thr Thr Arg Gly Lys Gly Ser Ser Pro Leu Gly Lys 1 5 10 15 j«*.->.- Áy?..JUy...

Asp His Gln Glu Leu Glu Leu Leu Thr Pro Tyr Pro Ala Val Lys Phe 20 25 30 Ser Val Gly Pro Thr Arg Ala Thr Arg Ala Tyr Pro Glu Ala Thr Leu 35 40 45 Pro Thr Ser Ala Asp He Tyr Asp Lys Val Ser Gly Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asn Gly Tyr Asp Cys Gly Cys Leu Gly Gly Gly Arg He Ser His Gln 65 70 75 80 Ser Gln Asp Arg Lys He His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Gly 85 90 95 Arg Ala Gln His Ser Val Ser Thr Glu Lys He Lys Ala Lys Tyr Pro 100 105 110 Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asp Asp Gly Tyr 115 120 <210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> ratón *y&-íZß&SLy i. y.&Já . <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (124) <223> protein-histidina fosfatasa de ratón <400> 8 Met Ala Ala Asp Leu Gly Gln He Pro Asp Val Asp He Asp Ser Asp 1 5 10 15 Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu He Arg Val His Leu Ala Glu Pro Ser 20 25 30 Gly Asp Pro Ala Lys Glu Cys Lys Glu He Val Arg Gly Tyr Lys Trp 35 40 45 Ala Glu Tyr His Ala Asp He Tyr Asp Lys Val Ser Gly Glu Leu Gln 50 55 60 Arg Asn Gly Tyr Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg He Ser His 65 70 75 80 Gln Ser Gln Asp Arg Lys He His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Tyr 85 90 95 Gly Arg Ala Gln His Ser Val Ser Thr Glu Lys He Lys Ala Lys Tyr 100 105 110 Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asp Asp Gly Tyr 115 120 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido para generar un anticuerpo dirigido contra la protein- histidma fosfatasa <400> 9 Gln He Pro Asp Val Asp He Asp Ser Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val 1 5 10 15 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido para generar un anticuerpo dirigido contra la protein- histidma fosfatasa <400> 10 Cys Leu Gly Gly Gly Arg He Ser His Gln Ser Gln Asp Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido para generar un anticuerpo dirigido contra la protein- histidma fosfatasa <400> 11 Cys Thr Glu Lys He Lys Ala Lys Tyr Pro Asp Tyr Glu Val 1 5 10 •^ r^ f^^,.>^¿¿^.^>. * .,.--,

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un polipéptido que tiene la actividad biológica de la histidina fosfatasa, es altamente especifico para la fosfohistidina y tiene un peso molecular de 13.000 a 15.000, y puede ser obtenido por purificación de tejido de mamífero llevando a cabo al menos un paso de cromatografía de intercambio aniónico, un paso de filtración en gel y un paso de cromatografía de afinidad. 2. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque contiene al menos la secuencia de aminoácidos YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM.
3. 3. Un polipéptido con la actividad biológica de la histidina fosfatasa, caracterizado porque tiene una gran especificidad por la fosfohistidina y un peso molecular de 13.000 a 15.000, y que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos: (M) AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYK AEYH ADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKI KAKYPDYEVTWANDGY . ¡ á, -it^i-w j.
4. 4. Un polipéptido con la actividad biológica de la histidina fosfatasa, caracterizado porque tiene una gran especificidad por la fosfohistidina y un peso molecular de 13.000 a 1
5. 5.000, y que su secuencia de aminoácidos tiene un 64 a 99% de homologia, en comparación con la secuencia representada en la reivindicación 3. 5. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque contiene la siguiente secuencia de aminoácidos: AGAALAQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHAAPPSEAPGGESKDIVRGYKWAEYHADIY DKVSGELQKKGHDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIRAKY PDYEVTWADDGY.
6. 6. Un ADN que codifica para un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. 7. Un ADN de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque contiene la secuencia de nucleótidos : (ATG) GCGGTGGCGGACCTCGCTCTCATTCCTGATGTGGACATCGACTCCGACGGC GTCTTCAAGTATGTGCTGATCCGAGTCCACTCGGCTCCCCGCTCCGGGGCTCCGGC TGCAGAGAGCAAGGAGATCGTGCGCGGCTACAAGTGGGCTGAGTACCATGCGGACA TCTACGACAAAGTGTCGGGCGACATGCAGAAGCAAGGCTGCGACTGTGAGTGTCTG GGCGGCGGGCGCATCTCCCACCAGAGTCAGGACAAGAAGATTCACGTGTACGGCTA TTCCATGGCCTATGGTCCTGCCCAGCACGCCATTTCAACTGAGAAAATCAAAGCCA AGTACCCCGACTACGAGGTCACCTGGGCTAACGACGGCTACTGA
8. 8. Un ADN de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque contiene la secuencia de nucleótidos : GTGGACATCGACTCCGACGGCGTCTTCAAGTACGTGCTGATTCGAGTCCACGCGGC GCCGCCCTCCGAAGCCCCGGGCGGCGAGAGCAAGGACATCGTGCGTGGCTACAAGT GGGCCGAGTACCACGCCGACATCTACGACAAGGTGTCGGGCGAGCTGCAGAAGAAG GGCCATGACTGCGAGTGCCTGGGCGGCGGGCGCATCTCCCACCAGAGCCAGGACCG 10 GAAGATCCACGTGTACGGCTACTCCATGGGCTACGGCCGGGCCCAGCACTCCGTCT CCACCGAGAAGATCAGAGCCAAGTACCCCGACTACGAGGTCACCTGGG.
9. 9. Una preparación farmacéutica que contiene un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque y en caso 1 apropiado, también contiene excipientes, vehículos y otros ingredientes activos adecuados.
10. 10. Un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5. 20