CN1201009C - 组氨酸蛋白磷酸酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的来源于哺乳动物的酶，组氨酸蛋白磷酸酶，及其同系物变体。本发明还涉及编码所述蛋白的DNA序列、制备所述蛋白的方法和抗它们的抗体。这种新的磷酸酶可用于细胞调节和细胞生长的病理状态的诊断，并可用作治疗与所述酶障碍有关病理疾病的药物。

Description

组氨酸蛋白磷酸酶
                           技术领域
本发明涉及一种新的来源于哺乳动物的组氨酸蛋白磷酸酶以及它的同系物变体。本发明还涉及了编码所述蛋白质的DNA序列、制备所述蛋白质的方法以及抗它们的抗体。这种新的磷酸酶可用于细胞调控和细胞生长的病理状况的诊断，还可以用作治疗所述酶机能失常有关病理疾病的药物。详细的讲，本发明涉及所述酶在疾病的诊断和治疗上的应用、鉴定在组氨酸磷酸化中起作用的因子的激动剂和拮抗剂、以及在治疗上有潜在用途的激动剂和拮抗剂。
                           背景技术
蛋白的磷酸化是一种基本的生物学过程，该过程常常在信号转导和蛋白质活性的调控中起关键作用。
在真核的信号转导通路中，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化较常见。很多生化方法方面的文献描述了未知蛋白上的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化的检测。例如，当用生长因子、细胞因子、药物、肽或者其它刺激分子如PDGF、NGF、IL-2等处理哺乳动物培养细胞时，通过用放射性标记的磷酸培养细胞、在用生长因子等处理后分离出蛋白、再用SDS聚丙烯酰胺电泳分离蛋白、将胶固定、放射自显影以鉴定含有标记磷酸的蛋白条带，可很容易的检测到蛋白上丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸上的磷酸化。或者，可用双向系统分离来自处理细胞和未处理细胞的蛋白，并比较蛋白斑点的位置。斑点的表观运动可显示出由处理所致的修饰情况的变化。在另一种方法中，蛋白质经酸水解产生氨基酸，后者可作薄层层析，而后检测放射性标记磷的存在。然而，这些蛋白化学方法采用的组氨酸、赖氨酸或精氨酸的磷酸化条件是不稳定的。具体地说，磷酸组氨酸自发分解的半衰期在低pH值时大约是5-100分钟，但是在中性pH条件下其半衰期是几天到几周(Matthews，H.R.[1995]Pharmac.Ther.67：323-350)。例如，电泳后，用于蛋白质分离的聚丙烯酰胺胶通常都是在酸性条件下固定。同样，用于氨基酸水解的酸性条件也会导致磷酸组氨酸的分解。
已证实磷酸化的组氨酸在细菌中信号转导中起关键作用。这样的通路调节细菌代谢的许多方面。例如，在大肠杆菌(E.coli)中ArcA/ArcB系统控制了有氧和厌氧代谢(Luchi S，Weiner L。J Biochem(Tokyo)[1996]120：1055-63)。OmpR和OmpF控制了对不同的渗透条件的应答(Pratt LA，Hsing W，Gibson KE，Silhavy TJ.，Mol Microbiol[1996]20：911-7)。CheA和CheZ参与了趋化性(Alon U.，自然(Nature)[1999]397：168-171)。所有这些蛋白都是通过遗传方法被首次鉴定出来的：相关基因的突变引起感兴趣的表型，而克隆相关基因后可鉴定出相应蛋白。
类似地，最近已发现真核细胞酿酒酵母(S.cerevisiae)和鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)具有涉及组氨酸磷酸化的蛋白质的信号转导系统(Loomis等，[1997]细胞科学杂志(J.Cell Science)110：1141-1145)。例如，蛋白Sln1有一个细胞外传感域、一个胞质组氨酸激酶域和一个天门冬氨酸中间域。还有，通过不能对乙烯应答的突变体鉴定了芥菜植物鼠耳芥的ETR1。然后克隆ETR1的基因，研究蛋白质，发现这种蛋白是一种组氨酸激酶。酿酒酵母和鼠耳芥是遗传上易操作的生物，它们参与组氨酸磷酸化的蛋白如Sln1和Etr1通常是通过遗传手段鉴定的。
现有的技术一般包括蛋白或磷酸氨基酸的大小分离。
哺乳动物的N-磷酸化在能量代谢方面是很重要的，而且在不同类型中的癌症中是不同的。举例来说，Nm23蛋白是一种核苷二磷酸激酶，它能利用由糖酵解和氧化磷酸化产生的ATP来将核苷和脱氧核苷二磷酸转换为三磷酸。作为它的乒乓反应机制的一部分，Nm23还可瞬时性地将组氨酸118磷酸化。Nm23还能够将自身的磷酸基团转移到ATP-柠檬酸裂解酶和琥珀酰辅酶A合成酶的组氨酸残基上。因此，在细胞的能量代谢方面组氨酸的磷酸化起着重要的作用。
人类有几种Nm23蛋白。在高转移性癌症中，这些Nm23蛋白经常以低水平表达。基于以上结果，Nm23被认为是一种抗癌基因。此外，在某些癌症中，特定Nm23蛋白有突变。这些突变经常影响Nm23磷酸化和去磷酸化作用的速度。
综上所述，在能量代谢和癌症中N-磷酸化起着重要的作用。因此，调节N-磷酸化或去磷酸化的蛋白或者药物在癌症和由癌症、HIV或其它疾病引起的肥胖、厌食、消瘦等代谢失调的治疗上可能是很重要的。此外，因为在其它生物中N-磷酸化反应在十分广泛的生物现象中都起作用，所以N-磷酸化也许在其它哺乳动物的疾病和失调如免疫失调、病毒感染、遗传失调、心脏疾病等方面也起作用。
不幸的是，由于哺乳动物生长的比细菌、酿酒酵母和鼠耳芥慢得多，所以采用用于这些相对简单的生物相同的遗传方法来鉴定参与组氨酸、赖氨酸、精氨酸磷酸化的蛋白是困难的。此外，用于鉴定蛋白上丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸位点磷酸化的生物化学方法一般并不适于鉴定组氨酸、赖氨酸、精氨酸上磷酸化的蛋白质。因而本领域需要适于研究N-磷酸化的技术和生化试剂。
组氨酸磷酸酶和组氨酸激酶是作用方向相反的酶。组氨酸激酶影响蛋白质中某些组氨酸残基的磷酸化，而组氨酸磷酸酶逆转这种磷酸化。在信号转导、凋亡、细胞生长和细胞分化的调控中，这两种酶都起重要的作用。它们可导致这些细胞功能障碍造成的疾病。因此，本发明基于如下目的，即提供能够用于研究这些病理生理紊乱的起因、并能适当地治疗这些疾病的药剂。
激素和肽刺激细胞上的细胞表面受体并通过信号转导通路诱导细胞效应。由调节性蛋白激酶和磷酸酶引起的特异蛋白底物可逆磷酸化在细胞间的信号传导中起关键作用。与受体结合的、与膜结合的以及细胞内的蛋白激酶和磷酸酶调控了细胞增生、细胞分化和免疫系统的过程。这些调控者或它们活性上的功能紊乱对大量的病理生理效应是至关重要的。因此，蛋白激酶和磷酸酶以及它们参与的信号转导通路为药物发现方法提供了潜在目标。
哺乳动物的信号转导涉及丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸的可逆磷酸化。尽管已知组氨酸磷酸酶存在于哺乳动物中(Crovello CS，Furie BC，FurieB(1995)细胞(Cell)82：279-286)，但至今仍未能确定相关的激酶或相应的磷酸酶。和其它的相比，其困难在于组氨酸磷酸酶对水解不稳定，在标准的磷酸氨基酸分析中检测不到。
在细菌中，组氨酸激酶和组氨酸磷酸酶的功能已被深入研究过。它们参与趋化和适应现象，这使它们成为细菌类疾病有希望的攻击点。
                           发明内容
本发明涉及组氨酸蛋白磷酸酶，特别是组氨酸蛋白磷酸酶多肽以及生产它们的组氨酸蛋白磷酸酶的多核苷酸、重组材料和方法。这些多肽和多核苷酸对于某些疾病的治疗方法是有用的，这些疾病包括但并不限于如癌症、代谢紊乱、心血管疾病和中枢神经系统疾病，在下文中称为“本发明的疾病”。另一方面，本发明涉及采用本发明提供的材料鉴定激动剂和拮抗剂(如抑制剂)的方法，和用鉴定的化合物治疗与N-磷酸化失衡有关的疾病的方法。再另一方面，本发明还涉及检测与不当的组氨酸蛋白磷酸酶活性或水平相关的疾病的诊断方法。
本发明包括在基本保留生物活性的前提下通过一个或更多核苷酸或氨基酸随机或者有控制的替换、不同的剪接、删除或添加产生的相应变体和突变体。
因此，本发明的目的是提供具有对磷酸组氨酸高度特异的组氨酸磷酸酶生物学活性、分子量为13,000-15,000的多肽，该多肽可通过至少一步阴离子交换层析、一步凝胶过滤和一步亲和层析从哺乳动物组织纯化而得到。优选的哺乳动物组织来源于心脏、肾脏、肝、胰腺、骨骼肌和睾丸。优选的哺乳动物是人、兔子和大鼠。
本发明的多肽至少包含氨基酸序列基序(SEQ.No.3)DCECLGGGRISHQSQD。
在本发明另一实施方案中本发明多肽至少包含氨基酸序列基序(SEQ.No.4)
DCECLGGGRISHQSQDX1KIHVYGYSMX2YGX3AQH
其中X1＝K或者R，X2＝A或者G，X3＝P或者R。
在本发明另一实施方案中本发明多肽至少包含氨基酸序列基序(SEQ.No.5)
YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM.
所有这些部分序列在完整酶氨基酸序列中是高度保守的，它们被认为是所述酶的活性位点所涉及的，或者在哺乳动物中有其它生物学或药效学意义。
作为本发明优选的实施方案，本发明多肽具有对磷酸组氨酸高度特异的组氨酸磷酸酶生物学活性，分子量为13,000-15,000，并包含以下氨基酸序列(SEQ.No.2)：
(M)AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGD
MQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKIKAKYPDYEVTWANDGY
该序列N-末端的甲硫氨酸残基不是必须的。以上给出的氨基酸序列来自人。
然而，本发明还特别公开了所述序列的同系物变体。因此，本发明另一个主题是提供具有对磷酸组氨酸高度特异的组氨酸磷酸酶生物学活性、分子量为13,000-15,000的多肽，同上面描述的序列相比，该多肽的氨基酸序列具有64-99％，优选75-99％的同源性。如下文所示，本发明公开了很多其它的具有组氨酸蛋白磷酸酶生物学活性的同系物多肽。
本发明另一目的是提供编码上文和下文提到的多肽的DNA序列。尤其，本发明涉及含有下面核苷酸序列的所述DNA序列(SEQ.No.1)：
(ATG)GCGGTGGCGGACCTCGCTCTCATTCCTGATGTGGACATCGACTCCGACGGCGTCTTCAAG
TATGTGCTGATCCGAGTCCACTCGGCTCCCCGCTCCGGGGCTCCGGCTGCAGAGAGCAAGGAGAT
CGTGCGCGGCTACAAGTGGGCTGAGTACCATGCGGACATCTACGACAAAGTGTCGGGCGACATGC
AGAAGCAAGGCTGCGACTGTGAGTGTCTGGGCGGCGGGCGCATCTCCCACCAGAGTCAGGACAAG
AAGATTCACGTGTACGGCTATTCCATGGCCTATGGTCCTGCCCAGCACGCCATTTCAACTGAGAA
AATCAAAGCCAAGTACCCCGACTACGAGGTCACCTGGGCTAACGACGGCTAC
本发明还涉及抗本发明多肽的抗体，特别是单克隆抗体。
最后，本发明的一个目的是提供包含上文和下文定义的多肽和(如果适合的话)适当赋形剂、载体和其它活性成分的药物制品。
                        具体实施方式
(A)分离和纯化
组氨酸蛋白磷酸酶是从兔肝脏中分离。
将约110克兔肝脏样品切成小片，与匀浆缓冲液(220毫升30mM三乙醇胺/盐酸pH7.5，1mM乙二胺四乙酸，300mM蔗糖，0.1mM苯甲脒，0.1％2-巯基乙醇)混合，在置于冰上冷却的匀浆器中研碎。第一次离心(3800g 10分钟，4℃)后，将上清再离心(48000g一小时，4℃)。上清用纱布过滤，以约20ml的等分试样冻存于-80℃。
柱层析分离方法
用三步纯化步骤分离组氨酸蛋白酶(图1)。
1.阴离子交换层析
将肝脏粗提物再次离心(48000g 30分钟)。将上清加入已用缓冲液A(20mM三乙醇胺/盐酸pH8.0，1mM乙二胺四乙酸，0.1％2-巯基乙醇，0.02％亚硝酸钠)平衡过的Source Q30(Pharmacia，freiburg)柱子中，用缓冲液A中的200mm氯化钠以1毫升/分钟的流速洗脱。
2.凝胶过滤
在活性部分(见活性测定)中一边加入硫酸胺(向17ml中加入11.2克)，一边搅拌和冷却。离心(48000g 20分钟，4℃)所得沉淀用缓冲液A重悬，加到Superdex 75 26/60 1.6×60cm(Phamacia，Freiburg)柱子上。用加入了50mM氯化钠的缓冲液A以1毫升/分钟的流速来完成凝胶过滤。
3.亲和层析
从凝胶过滤得到的活性部分用缓冲液B(20mM三乙醇胺/盐酸pH8.0，0.1mM乙二胺四乙酸，0.1％2-巯基乙醇，0.02％亚硝酸钠)以1∶3的比例稀释，调整氯化镁至10mM。将样品加入Blue Sepharose 6 25×510mm(Phamacia，Freiburg)柱上。用含200mM氯化钠的缓冲液B以1毫升/分钟的流速洗脱。
(B)特殊活性的检测
以作为底物的32P标记的组氨酸磷酸化蛋白(CheA)的去磷酸化来测定可溶性组氨酸磷酸酶的活性。CheA是重组的细菌组氨酸自激酶(autokinase)(Bilwes AM，Alex LA，Crane BR，Simon MI(1999)细胞96：131-141)；它的C-末端激酶域可将N-末端48位组氨酸磷酸化。反应可产生自由磷酸并用薄层层析鉴定出来(聚乙烯亚胺纤维素板，0.5M氯化锂做移动相)。一方面用钼酸胺检测，另一方面由放射性自显影检测(图2)。没有磷酸转移到其它蛋白上，底物也不会剪切为肽段。产物就是磷酸，也就是说磷酸组氨酸蛋白磷酸酶参入了反应。
纯化蛋白表现出了32P-磷酸化CheA的依赖于时间、温度、pH和蛋白的组氨酸去磷酸化作用(图3)。
稳定性
在粗提的匀浆物和部分纯化的组分中，纯化的蛋白表现了储存的稳定性。
酶分析
底物的制备：(CheA的32P标记)
重组CheA(5μl)与0.5μl 100mM处于二甲基亚砜中的苯甲基磺酰氟和5μl 500mM HEPES pH8.0、1mM氯化镁混合。再加入108微居32P-g-腺苷三磷酸、5μl 10μM腺苷三磷酸和50μl水，37℃保温3小时。
活性测定
将底物(10μl 32P-CheA)和10μl分析缓冲液(100mM三乙醇胺/盐酸pH8.0，0.1％2-巯基乙醇，0.22％亚硝酸钠)及酶液混合。37℃反应30分，然后加入2μl 500mM乙二胺四乙酸和126μl 1∶1甲醇/丙酮。离心(15000g5分钟)，将上清转移至闪烁计数器中并测定。
由此，所描述的磷酸酶是基于以下特点与其它蛋白磷酸酶区别的：
1)对磷酸组氨酸的特异性(表1)，该组氨酸磷酸酶不水解例如对硝基苯磷酸；
2)其活性不被冈田酸或钒酸盐抑制(表2)；
3)分子量小得多。
表1.新的组氨酸蛋白磷酸酶引起的水解
Azocoll -
[γ-32P]ATP -
对硝基苯磷酸 -
[γ-32P]Ser/Thr-酪蛋白 -
Tyr-xxx -
[γ-32P]His-核苷二磷酸激酶 -
[γ-32P]His-cheA -
表2影响组氨酸磷酸酶活性的试剂
试剂 浓度 活性(％)
磷酸 10mM  0
冈田酸 10μM  108
微囊藻素 5nM  110
互变霉素 0.5nM  90
抑制蛋白I1 1nM  120
钼酸盐 10μM  71
钒酸盐 10μM  62
氟化物 5mM  105
EDTA 5mM  108
EGTA 5mM  91
Mg2+ 1mM  142
Mg2+ 10mM  226
Ca2+ 1mM  165
Ca2+ 10mM  240
        100％＝xxx nmol/min x mg-1
(C)组氨酸蛋白磷酸酶的特征分析
根据SDS凝胶电泳分析，纯化蛋白部分含有一条表观分子量14000的清晰条带(图4)。质量分析鉴定出蛋白分子量为13768(图5)。组氨酸蛋白磷酸酶的N-末端被乙酰基团所封。因此，Edman降解不能提供序列信息，为了蛋白特征分析需要蛋白水解的切点。
(D)蛋白分析测定
活性组分(图4)经酶切后测定氨基酸序列。按文献所述，采用标准技术通过Edman降解法和质谱分析对产生的肽段测序(Kellner R，Lottspeich F，Meyer HE(1999)Microcharacterization of Proteins，Wiley-VCH)。
酶解断裂
用解剖刀切下胶上条带转移至Eppendorf管中。加入胰蛋白酶(1μg胰蛋白酶，100μl 0.5M碳酸氢胺，37℃，12小时)进行酶解。将产生的肽片断抽提(50％三氟乙酸，50％乙腈)，在真空离心机浓缩抽提物。
肽片段的层析分离
用洗脱液A(水中的0.1％三氟乙酸)溶解肽段并通过反向层析(洗脱液B：20％溶于水中的0.1％三氟乙酸，80％乙腈)分离。在214nm波长下紫外检测分馏后(见图6)，分离的肽段为溶解形式，通过Edman测序和质谱分析测定。
Edman测序和质谱测定
层析分离后的液态组分90％用来做Edman测序(标准条件，仪器：型号494，PE-Applied Biosystem，Weiterstadt)。其余部分用来做质量分析(MALDI-MS)(仪器：Voyager STR，Perseptive Biosystems，Wiesbaden)。
测定的肽序列
测定了以下肽序列(兔)：
AAAGLAQIPD VDIDSDGVFK
YVLIR
VHAAPPSEAPGGESK
DIVR
WAEYHADIYDK
VSGELQK
ISHQSQDR
KIHVYGYSMGYGR
YPDYEVTWADDGY
由这些肽获得了兔酶肽(SEQ.NO.6)：
AAAGLAQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHAAPPSEAPGGESKDIVRGYKWAEYHADIYDKVSGELQK
KGHDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIRAKYPDYEVTWADDGY
(E)核苷酸测序
为得到组氨酸蛋白磷酸酶核苷酸序列，用从已得氨基酸序列选出的引物对兔DNA文库进行筛选。克隆并测出鉴定了图7a所示的核苷酸序列。327个碱基翻译成始于11位到119位的组氨酸蛋白磷酸酶序列(图7b)。
数据库分析
用BLAST算法进行数据库搜索。在蛋白数据库中能鉴定出C.elegans、黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)、Drosophilapseudoobscura的同源蛋白。
在核苷酸数据库中，鉴定了人、大鼠和小鼠的ESTs。但人同系物还没公开。根据这些EST集合可发现人组氨酸蛋白磷酸酶蛋白有以下序列(SEQ.No 2，没有甲硫氨酸残基)：
AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGDMQK
QGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKIKAKYPDYEVTWANDGY
大鼠同系物也还没有公开。根据这些EST集合可发现大鼠组氨酸蛋白磷酸酶蛋白有以下序列(SEQ.No.7)：
NGLNTTRGKGSSPLGKDHQELELLTPYPAVKFSVGPTRATRAYPEATLPTSADIYDKVSGELQKN
GYDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIKAKYPDYEVTWADDGY
小鼠同系物也还没有公开。根据这些EST集合可发现小鼠组氨酸蛋白磷酸酶蛋白有以下序列(SEQ.No.8)：
MAADLGQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHLAEPSGDPAKECKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGELQR
NGYDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIKAKYPDYEVTWADDGY
表3：来源于各物种的组氨酸蛋白磷酸酶的序列同源性，用％同一性表示。
  1   2   3   4   5   6   7
  1人   100   84.0   65.3   64.3   68.2   38.0   40.3
  2兔   100   72.4   71.4   71.0   36.0   42.0
  3小鼠   100   67.3   52.7   32.7   33.3
  4大鼠   100   51.6   30.8   29.5
  5斑马鱼   100   33.7   42.1
  6C.elegans   100   39.7
  7果蝇   100
(E)蛋白定位和组织分布
人组氨酸蛋白磷酸酶基因是位于9号染色体(9q33-Tel，标记sts-N90764，间隔D9S159-qTEL)
使用下列cDNA表达来源：
脑，乳房，CNS，结肠，包皮，生殖细胞，心脏，肾，肝，肺，肌肉，胰，甲状旁腺，pooled，前列腺，脾，睾丸，甲状腺，扁桃体，子宫，整个胚胎。
组氨酸蛋白磷酸酶mRNA的分布分析显示在心脏、肾、肝、胰腺、骨骼肌和睾丸等正常组织中有升高的水平(图9a，b)。
(F)抗组氨酸磷酸酶抗体
抗组氨酸磷酸酶抗体是相对于该蛋白的三个不同区域即分子的N-末端、中部和C-末端部分产生的。为此选择了三个肽序列：
肽1：-QIPDVDIDSD GVFKYV(16aa，SEQ.No.9)；
肽2：-CLGGGRISHQ SQDK(14aa，SEQ.No.10)；
肽3：-CTEKIKAKYP DYEV(14aa，SEQ.No.11)。
用标准的FMOC-化学法合成这些肽。将这些肽每个都注射两只(4次注射)兔子以产生免疫，得到四个血样。最后取血在大约三个月后。产生的抗体可用于组氨酸磷酸酶的检测和定位。
此外，该分子的不同区域可分开分析。特别是组氨酸磷酸酶包含以下氨基酸序列的高度保守的中心部分推测含有负责体内蛋白功能的活性位点：
DCECLGGGRISHQSQD(SEQ.No.3)。
针对于此区域的抗肽抗体可用作抑制或中和用途。
组氨酸蛋白磷酸酶的特点可概括如下：
1.人组氨酸蛋白磷酸酶的氨基酸序列含有约124个氨基酸。
2.组氨酸蛋白磷酸酶的氨基酸序列在C-末端部分高度同源，而N-末端部分仅表现出弱同源性。
3.分子量是13800+/-100(图5)。
4.组氨酸蛋白磷酸酶N-末端被乙酰化封闭。
药物制品
所述天然蛋白或重组蛋白可用作能直接或在药物组合物中施用给患者的药物。因此，本发明的另一方面是提供上下文定义的重组或天然蛋白，其可用作药物和含有所述蛋白和可药用稀释剂、载体或赋形剂的各自的药物组合物。
本发明的药物组合物可以含有额外的各种各样的活性药用化合物。
本文所用的术语“可药用的载体”是指一种惰性的、无毒的固体或液体填充物、稀释剂或封装材料，它们不和活性化合物或患者方式不利的反应。合适的优选液体载体是本领域熟知的，如无菌水，盐水，含水葡萄糖，糖溶液，乙醇，乙二醇和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油，大豆油或矿物油。
根据本发明的制剂可按单位计量给药，它们含有肠胃外给药典型的常规无毒可药用载体、稀释剂、辅药和赋形剂。
本文中“肠胃外”这个词包括皮下的、静脉内的、关节内的、气管内的注射和灌注技术。其它给药方式如口服和局部应用也是适合的。肠胃外组合物和联合使用的药剂最优选按已知程序以大剂量或者恒定输注的方式静脉内给药。口服用片剂和胶囊含有常规赋形剂如结合剂、填料、稀释剂、成片剂、润滑剂、崩解剂和润湿剂。片剂可根据本领域熟知方法包衣。口服液制剂可以为水或者油的悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂形式，也可以是服用前用水或其它适当赋形剂重处理的干制品。这种液体制剂可以含有常规添加剂如悬浮剂、乳化剂、非水载体和防腐剂。局部应用可以是水或者油的悬浮液、溶液、乳剂或胶状物形式，优选乳剂药膏形式。
根据本发明的单位剂量可含每日所需本发明蛋白的量或者其部分量以组成所需剂量。对给定患者(哺乳动物，包括人)而言，治疗上可接受的最佳剂量和给药速率由多种因素决定，例如，所用特殊活性材料的活性，年龄，体重，综合健康状态，性别，饮食，给药时间和途径，清除速度，酶活性(单位/毫克蛋白)，治疗目标即治疗还是预防，和所治疗疾病的性质。
因此，在治疗患者(体内)的组合物和联合使用的药剂中，本发明蛋白的日药物学有效剂量是大约在0.01和100mg/kg体重(基于比活100kU/mg)之间，优选在0.1和10mg/kg体重之间。根据应用形式，单个剂量可含0.5和10毫克之间的组氨酸蛋白磷酸酶。
                          附图说明
图1：用于分离组氨酸磷酸酶的纯化方案
图2：组氨酸磷酸酶酶切的反应产物无机磷酸盐的鉴定。图中的板表示薄层层析(PEI纤维素，0.8M氯化锂)；左图：钼酸胺处理；右侧：放射自显影处理；1：[32P]his-cheA，2：反应产物，3：ATP，1-3：磷酸盐(NaHPO4)。
图3：底物CheA的时间和蛋白依赖的去磷酸化。左图：0、20和40分钟后的降解。右图：不同量底物(x轴：纳克蛋白)的放射性标记磷酸盐的释放(左y轴：％，右y轴：放射活性)
图4：含活性组氨酸磷酸酶的组分的分析(SDS-PAGE)。AF：活性组分；1，2：BSA(1μg，0.5μg)；3：AF；4，5：分子量标记。
图5：组氨酸磷酸酶的质量分析。y轴：计数。X轴：质量(m/z)。
图6：酶解后组氨酸磷酸酶反向层析分离。洗脱液A：0.1％溶于水中的三氟乙酸，洗脱液B：20％0.1％溶于水中的三氟乙酸，80％乙腈；在214nm处紫外检测。
图7a：兔组氨酸蛋白磷酸酶(部分)核苷酸序列。
图7b：兔组氨酸蛋白磷酸酶的翻译的完整氨基酸序列。
图8a：组氨酸蛋白磷酸酶在肿瘤细胞系中的分布。
图8b：组氨酸蛋白磷酸酶在肿瘤组织中的组织分布。
图8c：组氨酸磷酸酶在正常组织中的组织分布。
                              序列表
<110>Merck Patent GmbH
<120>组氨酸蛋白磷酸酶
<160>11
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>375
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(375)
<223>人类组氨酸蛋白磷酸酶
<400>1
atg gcg gtg gcg gac ctc gct ctc att cct gat gtg gac atc gac tcc  48
Met Ala Val Ala Asp Leu Ala Leu Ile Pro Asp Val Asp Ile Asp Ser
  1               5                  10                  15
gac ggc gtc ttc aag tat gtg ctg atc cga gtc cac tcg gct ccc cgc  96
Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu Ile Arg Val His Ser Ala Pro Arg
             20                  25                  30
tcc ggg gct ccg gct gca gag agc aag gag atc gtg cgc ggc tac aag  144
Ser Gly Ala Pro Ala Ala Glu Ser Lys Glu Ile Val Arg Gly Tyr Lys
         35                  40                  45
tgg gct gag tac cat gcg gac atc tac gac aaa gtg tcg ggc gac atg  192
Trp Ala Glu Tyr His Ala Asp Ile Tyr Asp Lys Val Ser Gly Asp Met
     50                  55                  60
cag aag caa ggc tgc gac tgt gag tgt ctg ggc ggc ggg cgc atc tcc  240
Gln Lys Gln Gly Cys Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg Ile Ser
 65                  70                  75                  80
cac cag agt cag gac aag aag att cac gtg tac ggc tat tcc atg gcc  288
His Gln Ser Gln Asp Lys Lys Ile His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Ala
                 85                  90                  95
tat ggt cct gcc cag cac gcc att tca act gag aaa atc aaa gcc aag  336
Tyr Gly Pro Ala Gln His Ala Ile Ser Thr Glu Lys Ile Lys Ala Lys
            100                 105                 110
tac ccc gac tac gag gtc acc tgg gct aac gac ggc tac              375
Tyr Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asn Asp Gly Tyr
        115                 120                 125
<210>2
<211>125
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Ala Val Ala Asp Leu Ala Leu Ile Pro Asp Val Asp Ile Asp Ser
  1               5                  10                  15
Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu Ile Arg Val His Ser Ala Pro Arg
             20                  25                  30
Ser Gly Ala Pro Ala Ala Glu Ser Lys Glu Ile Val Arg Gly Tyr Lys
         35                  40                  45
Trp Ala Glu Tyr His Ala Asp Ile Tyr Asp Lys Val Ser Gly Asp Met
     50                  55                  60
Gln Lys Gln Gly Cys Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg Ile Ser
 65                  70                  75                  80
His Gln Ser Gln Asp Lys Lys Ile His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Ala
                 85                  90                  95
Tyr Gly Pro Ala Gln His Ala Ile Ser Thr Glu Lys Ile Lys Ala Lys
            100                 105                 110
Tyr Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asn Asp Gly Tyr
        115                 120                 125
<210>3
<211>16
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>肽
<222>(1)..(16)
<223>保守哺乳动物序列
<400>3
Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg Ile Ser His Gln Ser Gln Asp
  1               5                  10                  15
<210>4
<211>33
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>肽
<222>(1)..(33)
<223>保守哺乳动物序列2
<220>
<221>位点
<222>(17)
<223>X＝K or R
<220>
<221>位点
<222>(27)
<223>X＝A or G
<220>
<221>位点
<222>(30)
<223>X＝P or R
<400>4
Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg Ile Ser His Gln Ser Gln Asp
  1               5                  10                  15
Xaa Lys Ile His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Xaa Tyr Gly Xaa Ala Gln
             20                  25                  30
His
<210>5
<211>44
<212>PRT
<213>哺乳动物
<220>
<221>肽
<222>(1)..(44)
<223>保守哺乳动物序列3
<400>5
Tyr His Ala Asp Ile Tyr Asp Lys Val Ser Gly Asp Met Gln Lys Gln
  1               5                  10                  15
Gly Cys Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg Ile Ser His Gln Ser
             20                  25                  30
Gln Asp Lys Lys Ile His Val Tyr Gly Tyr Ser Met
         35                  40
<210>6
<211>124
<212>PRT
<213>兔
<220>
<221>肽
<222>(1)..(124)
<223>兔组氨酸蛋白磷酸酶
<400>6
Ala Ala Ala Gly Leu Ala Gln Ile Pro Asp Val Asp Ile Asp Ser Asp
  1               5                  10                  15
Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu Ile Arg Val His Ala Ala Pro Pro Ser
             20                  25                  30
Glu Ala Pro Gly Gly Glu Ser Lys Asp Ile Val Arg Gly Tyr Lys Trp
         35                  40                  45
Ala Glu Tyr His Ala Asp Ile Tyr Asp Lys Val Ser Gly Glu Leu Gln
     50                  55                  60
Lys Lys Gly His Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg Ile Ser His
  65                 70                  75                  80
Gln Ser Gln Asp Arg Lys Ile His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Tyr
                 85                  90                  95
Gly Arg Ala Gln His Ser Val Ser Thr Glu Lys Ile Arg Ala Lys Tyr
            100                 105                 110
Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asp Asp Gly Tyr
        115                 120
<210>7
<211>123
<212>PRT
<213>大鼠
<220>
<221>肽
<222>(1)..(123)
<223>大鼠组氨酸蛋白磷酸酶
<400>7
Asn Gly Leu Asn Thr Thr Arg Gly Lys Gly Ser Ser Pro Leu Gly Lys
  1               5                  10                  15
Asp His Gln Glu Leu Glu Leu Leu Thr Pro Tyr Pro Ala Val Lys Phe
             20                  25                  30
Ser Val Gly Pro Thr Arg Ala Thr Arg Ala Tyr Pro Glu Ala Thr Leu
         35                  40                  45
Pro Thr Ser Ala Asp Ile Tyr Asp Lys Val Ser Gly Glu Leu Gln Lys
     50                  55                  60
Asn Gly Tyr Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg Ile Ser His Gln
 65                  70                  75                  80
Ser Gln Asp Arg Lys Ile His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Gly
                 85                  90                  95
Arg Ala Gln His Ser Val Ser Thr Glu Lys Ile Lys Ala Lys Tyr Pro
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asp Asp Gly Tyr
        115                 120
<210>8
<211>124
<212>PRT
<213>小鼠
<221>肽
<222>(1)..(124)
<223>小鼠组氨酸蛋白磷酸酶
<400>8
Met Ala Ala Asp Leu Gly Gln Ile Pro Asp Val Asp Ile Asp Ser Asp
  1               5                  10                  15
Gly Val Phe Lys Tyr Val Leu Ile Arg Val His Leu Ala Glu Pro Ser
             20                  25                  30
Gly Asp Pro Ala Lys Glu Cys Lys Glu Ile Val Arg Gly Tyr Lys Trp
         35                  40                  45
Ala Glu Tyr His Ala Asp Ile Tyr Asp Lys Val Ser Gly Glu Leu Gln
     50                  55                  60
Arg Asn Gly Tyr Asp Cys Glu Cys Leu Gly Gly Gly Arg Ile Ser His
 65                  70                  75                  80
Gln Ser Gln Asp Arg Lys Ile His Val Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Tyr
                 85                  90                  95
Gly Arg Ala Gln His Ser Val Ser Thr Glu Lys Ile Lys Ala Lys Tyr
            100                 105                 110
Pro Asp Tyr Glu Val Thr Trp Ala Asp Asp Gly Tyr
        115                 120
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：产生抗组氨酸
     蛋白磷酸酶抗体的肽
<400>9
Gln Ile Pro Asp Val Asp Ile Asp Ser Asp Gly Val Phe Lys Tyr Val
  1               5                  10                  15
<210>10
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：产生抗组氨酸
     蛋白磷酸酶抗体的肽
<400>10
Cys Leu Gly Gly Gly Arg Ile Ser His Gln Ser Gln Asp Lys
  1               5                  10
<210>11
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：产生抗组氨酸
     蛋白磷酸酶抗体的肽
<400>11
Cys Thr Glu Lys Ile Lys Ala Lys Tyr Pro Asp Tyr Glu Val
  1               5                  10

Claims (6)

1.具有对磷酸组氨酸特异的组氨酸磷酸酶活性、分子量为13,000-15,000Da、来源于哺乳动物的多肽，其中酶活性中心包含如下序列基序：
       DCECLGGGRISHQSQDX1KIHVYGYSMX2GX3AQH
其中X1＝K或者R，X2＝A或者G，X3＝P或者R。
2.根据权利要求1的多肽，其含有氨基酸序列基序
YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM。
3.根据权利要求1的多肽，其具有人组氨酸磷酸酶氨基酸序列：
MAVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAE
YHADIYDKVSGDMQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKIK
AKYPDYEVTWANGDY。
4.根据权利要求1的多肽，其具有兔组氨酸磷酸酶氨基酸序列：
AAAGLAQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHAAPPSEAPGGESKDIVRGYKWAEYHADIYDKV
SGELQKKGHDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIRAKYPDYEVT
WADDGY。
5.含有根据权利要求1-4之任一项的多肽和合适赋形剂、载体和其它成分的药物制品。
6.抗具有如下氨基酸序列的表位的抗体，
QIPDVDIDSDGVFKYV  或
GLGGGRISHQSQDK    或
CTEKIKAKYPDYEV。
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