KR20020002400A

KR20020002400A - 히스티딘 단백질 인산가수분해효소

Info

Publication number: KR20020002400A
Application number: KR1020017011279A
Authority: KR
Inventors: 클룸프수쟌; 켈너로란트
Original assignee: 플레믹 크리스티안; 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 2000-03-02
Publication date: 2002-01-09
Also published as: CA2364495A1; CZ20013172A3; MXPA01008941A; DE60038731D1; EP1159430B1; ES2303813T3; NO20014261L; RU2281973C2; PL350323A1; NO20014261D0; US6812015B1; AR022836A1; AU3808000A; HK1042729A1; HUP0200241A2; WO2000052175A1; JP2002537814A; DE60038731T2; SK12242001A3; BR0008607A

Abstract

본 발명은 포유동물원으로부터 얻은 신규한 효소, 히스티딘 단백질 인산가수분해효소 및 그의 상동 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 이를 제조하는 방법, 및 상기 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 신규한 인산가수분해효소는 세포 조절 및 세포 성장의 병리 상태를 진단하는데 이용되고, 상기 효소의 기능이상에 관련된 병적 장애와 관련하여 투여될 수 있는 약학적 약물로서 이용될 수 있다.

Description

히스티딘 단백질 인산가수분해효소{HISTIDINE PROTEIN PHOSPHATASE}

단백질 인산화는 신호 트랜스덕션(signal transduction) 및 단백질 활성의 조절에서 종종 중요한 역할을 하는 기본적인 생물학적 과정이다. 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화는 통상적으로 진핵세포의 신호 트랜스덕션 경로에서 나타난다. 비공지된 단백질에 대한 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화를 검출하는 생화학적방법에 관한 광범위한 문헌이 있다. 예를 들어, 포유동물 배양 세포가 성장 인자, 사이토킨, 약물, 펩티드, 또는 PDGF, NGF, IL-2 등과 같은 기타 자극 분자로 처리되는 경우, 세린, 트레오닌 및 티로신에서의 단백질의 인산화는, 방사성동위원소표지된 포스페이트와 함께 세포를 배양하고, 성장 인자 등으로 처리한 후 단백질을 단리하고, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 단백질을 분리하고, 겔을 고정시키고, 오토라디오그래피(autoradiography)를 실시하여 표지된 포스페이트를 함유한 단백질 밴드를 확인함으로써 용이하게 검출될 수 있다. 또한, 2차원 시스템을 이용하여 처리 및 미치리된 세포로부터 단백질을 분리할 수 있고, 단백질 스팟의 위치를 비교할 수 있다. 스팟이 분명하게 이동한 것은, 처리로 인한 변형 상태에서의 변화를 확인할 수 있다. 또다른 방법에서는 단백질을 산성 가수분해하여 아미노산을 수득하고, 이어서 박층 크로마토그래피하여 방사성동위원소표지된 인의 존재를 관찰할 수 있다.

그러나, 이들 단백질 화학 방법은, 인산화된 히스티딘, 리신 또는 아르기닌이 불안정한 조건을 사용한다. 특히, 포스포히스티딘은 낮은 pH에서는 약 5 내지 100 분의 반감기를 가지고 자발적으로 파괴되지만, 중성 pH에서는 수일 내지 수주의 반감기를 갖는다(문헌[Mattews, H. R. (1995) Pharmac. Ther. 67, 323-350]). 예를 들어, 전기영동법 이후에, 단백질 분리를 위한 폴리아크릴아미드 겔은 일반적으로 산성 조건에서 고정된다. 유사하게, 아미노산 가수분해를 위한 산성 조건도 포스포히스티딘을 분해시킨다.

인산화된 히스티딘은 박테리아의 신호 트랜스덕션에서 중요한 역할을 하는것이 증명되었다. 상기 경로는 박테리아 대사의 많은 양태를 조절한다. 예를 들어, ArcA/ArcB 시스템은 대장균에서 호기성 및 혐기성 대사를 조절한다(문헌[Iuchi S, Weiner L. J Biochem (Tokyo) (1996), 120: 1055-63]). OmpR 및 OmpF는 상이한 삼투 조건에 대한 반응을 조절한다(문헌[Pratt LA, Hsing W, Gibson KE, Silhavy TJ. Mol Microbiol (1996), 20:911-7]). CheA 및 CheZ는 화학주성과 연관된다(문헌[Alon U. Nature (1999), 397:168-171]). 이러한 모든 단백질은 일단 유전학적 방법에 의해 확인되었다. 상응하는 유전자에서의 돌연변이는 흥미있는 표현형을 일으키고, 생성된 단백질은 관련된 유전자를 클로닝한 후 확인될 수 있다.

유사하게, 진핵세포인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces. cerevisiae) 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)는, 히스티딘의 인산화를 포함하는 단백질을 갖는 신호 트랜스덕션 시스템을 갖는다(문헌[Loomis et al., (1997) J. Cell Science 110: 1141-1145]). 예를 들어, Sln1 단백질은 세포외 감응 영역, 세포질 히스티딘 키나아제 영역, 및 아스파테이트 중계 영역을 갖는다. 머스타드 식물 아라비돕시스 탈리아나의 ETR1은 또한 에틸렌에 반응하지 않는 돌연변이체에 의해 확인되었다. 이어서, ETR1 유전자를 클로닝하고, 단백질을 조사하여, 상기 단백질이 히스티딘 키나아제임이 밝혀졌다. 사카로마이세스 세레비지애 및 아리비돕시스 탈리아나는 유전학적으로 다루기 쉬운 유기체이고, 히스티딘 인산화와 관련된 단백질, 예를 들어 Sln1 및 Etr1은 일반적으로 유전학적 방법에 의해 확인된다.

현존 기법으로는 일반적으로 단백질 또는 포스포아미드산의 크기별 분리법을들 수 있다.

포유동물의 N-인산화는 에너지 대사에서 중요하고, 다양한 유형의 암에서 변화한다. 예를 들어, Nm23 단백질은 당분해 및 산화 인산화에 의해 생성된 ATP를 사용하여 뉴클레오시드 및 데옥시뉴클레오시드 디포스페이트를 트리포스페이트로 전환시킬 수 있는 뉴클레오시드 디포스페이트 키나아제이다. Nm23은 핑-퐁(ping-pong) 반응 메카니즘의 일부분으로서 히스티딘 118에서 일시적으로 인산화된다. 또한, Nm23은 그의 포스페이트기를 ATP-시트레이트 분해효소 및 숙시닐 CoA 신테타제의 히스티딘 잔기 상에 전달할 수 있다. 따라서, 히스티딘 인산화는 세포의 에너지 대사에서 중요한 역할을 한다.

인간에게는 여러 가지 Nm23 단백질이 있다. 전이가 높은 암에서, 이러한 Nm23 단백질은 종종 낮은 수치로 나타난다. 이러한 결과를 기초로 하여, Nm23은 항-종양유전자인 것으로 생각된다. 또한, 특정 암에서 특정 Nm23 단백질의 돌연변이가 발견되었다. 이러한 돌연변이는 종종 Nm23의 인산화 또는 탈인산화의 속도에 영향을 미친다.

또한, 이러한 결과는 N-인산화가 에너지 대사 및 암에서 중요한 역할을 하는 것임을 나타낸다. 따라서, N-인산화 또는 탈인산화를 조절하는 단백질 또는 약물은 암 또는 대사장애, 예를 들어 비만증; 거식증; 암, HIV 또는 기타 질환으로 인한 소모병 등을 치료하는데 중요할 수 있다. 또한, N-인산화는 그밖의 유기체에서 매우 다양한 생물학적 현상에서 일정한 역할을 하므로, N-인산화는 기타 포유동물 질환 및 장애, 예를 들어 면역장애, 바이러스성 감염, 유전적 장애, 심장 질환 등에서 일정한 역할을 할 수 있다.

불행하게도, 포유동물은 박테리아, 사카로마이세스 세레비지애 및 아라비돕시스 탈리아나 보다 훨씬 느리게 성장하므로, 이러한 간단한 유기체에 대해서 사용된 동일한 유전학적 접근법에 의해서는 히스티딘, 리신 또는 아르기닌 인산화와 연관된 단백질을 확인하기가 어렵다. 또한, 세린, 트레오닌 및 티로신 상에서 인산화되는 단백질을 확인하기 위한 생화학적 기법은, 일반적으로 히스티딘, 리신 및 아르기닌 상에서 인산화된 단백질을 확인하는데 적용할 수 없다. 따라서, N-인산화를 연구하는데 사용하기 위한 기법 및 생화학적 시약이 당해 기술분야에서 필요하다.

히스티딘 인산가수분해효소 및 히스티딘 키나아제는 반대방향으로 작용하는 효소이다. 히스티딘 키나아제는 단백질내 특정 히스티딘 잔기의 인산화에 영향을 미치는 반면, 히스티딘 인산가수분해효소는 상기 인산화를 역전시킨다. 상기 효소 둘다는 아마도 신호 트랜스덕션, 세포자살, 세포 성장의 조절 및 세포 분화에서 중요한 역할을 할 것이다. 이들은 이러한 세포 기능의 장애에 기초한 질환으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 병리생리학적 장애의 원인을 연구하고, 적합하다면 이들을 치료하는데 이용될 수 있는 약제를 제공하는데 목적을 둔다.

호르몬 또는 펩티드는 세포 상의 세포 표면 수용체를 자극하고, 신호 트랜스덕션 경로를 통해 세포에 영향을 미친다. 조절 단백질인 키나아제 및 인산가수분해효소에 의한 특정 단백질 기질의 가역적 인산화는 세포내 신호 전달에서 중요한 역할을 한다. 수용체-결합된 단백질 키나아제 및 인산가수분해효소, 막-결합된 단백질 키나아제 및 인산가수분해효소, 및 가역적 세포내 단백질 키나아제 및 인산가수분해효소는 세포증식, 세포분화 및 면역계의 과정을 조절한다. 이러한 조절자 또는 이들의 활성의 기능이상은, 수많은 병리생리학적 결과에 있어서 매우 결정적이다. 따라서, 단백질 키나아제 및 인산가수분해효소 및 이들이 관련된 신호 트랜스덕션 경로는 약제 발견 과정을 위한 잠재적 목표를 제시한다.

포유동물에서 신호 트랜스덕션은 Ser/Thr/Yyr의 가역적 인산화를 포함한다. 히스티딘 포스페이트는 포유동물에 존재하는 것으로 알려져 있지만(문헌[Crovello CS, Furie BC, Furie B (1995) Cell 82:279-286]), 상응하는 키나아제 또는 관련된 인산가수분해효소를 확인할 수 있는 결과는 없었다. 특히, 히스티딘 포스페이트가 가수분해에 불안정하고 표준 포스포 아미노산 분석에서 검출되지 않는다는 난점이 있다.

박테리아내 히스티딘 키나아제 및 히스티딘 인산가수분해효소의 기능은 매우 폭넓게 연구되어 있다. 화학주성 및 적응에서 이러한 히스티딘 키나아제 및 히스티딘 인산가수분해효소가 연관된다는 것은, 히스티딘 키나아제 및 히스티딘 인산가수분해효소가 세균성 질환에 대한 가능한 공격 지점이 되도록 한다.

본 발명은 포유동물 공급원으로부터 수득한 신규한 효소인, 히스티딘 단백질 인산가수분해효소 및 그의 상동 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 이를 수득하는 방법, 및 상기 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 신규한 인산가수분해효소는 세포 조절 및 세포 성장의 병리 상태를 진단하는데 이용되고, 상기 효소의 기능이상과 관련된 병리학적 장애와 관련되어 투여될 수 있는 약학적 약물로서 이용될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명은 진단 및 질환의 치료에 있어서 상기 효소의 용도, 히스티딘 인산화에 작용하는 인자를 확인하는데 있어서의 작용물질 및 길항물질 뿐만 아니라 치료에 잠재적으로 유용한 작용물질 및 길항물질에 관한 것이다.

도 1은 히스티딘 인산가수분해효소의 단리를 위해 이용된 정제 방법에 관한 도면이다.

도 2는 히스티딘 인산가수분해효소 분해의 반응 생성물로서 무기 포스페이트를 확인한 도면이다. 플레이트는 박층 크로마토그래피(PEI 셀룰로오스, 0.8M LiCl)를 나타낸다. 좌측 패널: 암모늄 몰리브데이트 처리, 우측 패널: 오토라디오그래피 처리(1: [³²P]his-cheA, 2: 반응 생성물, 3; ATP, 1,3: 포스페이트(NaH₂PO₄)).

도 3은 기질 cheA의 시간 및 단백질 의존성 탈인산화를 나타낸다. 좌측 패널: 0, 20 및 40 분 후의 분해량(단백질 ng), 우측 패널: 상이한 양의 기질의 방사성동위원소표지된 포스페이트의 방출률(좌측 y축: %, 우측 y축: 방사성 활성도).

도 4는 활성 히스티딘 인산가수분해효소(SDS-PAGE)를 갖는 부분의 분석을 나타낸다. AF: 활성 부분; 1,2: BSA(1㎍, 0.5㎍), 3: AF; 4,5: 분자량 마커.

도 5는 히스티딘 인산가수분해효소의 질량 분석을 나타낸다. y축: 수, x축: 질량(m/z).

도 6은 효소작용 분절화 후 히스티딘 인산가수분해효소의 역상 크로마토그래피 분리를 나타낸다(용리액 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산, 용리액 B: 물 중 20 % 트리플루오로아세트산, 80 % 아세토니트릴; 214 nm에서의 UV 측정).

도 7a는 래빗 히스티딘 단백질 인산가수분해효소의 (부분적인) 뉴클레이티드 서열을 나타낸다.

도 7b는 래빗 히스티딘 단백질 인산가수분해효소의 해독된 완전한 아미노산 서열을 나타낸다.

도 8a는 히스티딘 단백질 인산가수분해효소의 종양 세포주 분포를 나타낸다.

도 8b는 종양 조직의 히스티딘 단백질 인산가수분해효소의 조직 분포를 나타낸다.

도 8c는 정상 조직의 히스티딘 인산가수분해효소의 조직 분포를 나타낸다.

본 발명은, 히스티딘 단백질 인산가수분해효소, 특히 히스티딘 단백질 인산가수분해효소 폴리펩티드 및 히스티딘 단백질 인산가수분해효소 폴리뉴클레오티드, 재조합 물질 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 암 및 대사장애, 심혈관질환 및 중추신경계 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 질환(이후부터는 "본 발명의 질환"으로 언급됨)의 치료법과 관련해서 관심의 대상이다. 추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 물질을 사용하여 작용물질 및 길항물질(예: 억제제)을 확인하는 방법 및 확인된 화합물과 N-인산화 불균형과 관련된 증상을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 또다른 태양에서, 본 발명은 부적합한 히스티딘 단백질 인산가수분해효소 활성 또는 수치와 관련된 질환을 검출하기 위한 진단법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 생물학적 활성을 기본적으로 유지하면서, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 불규칙적으로 또는 조절하면서 치환하거나, 상이하게 스플라이싱(splicing)하거나, 제거하거나 첨가하여 제조된 상응하는 변이체 및 돌연변이체를 포함한다.

따라서, 본 발명의 목적은 포스포히스티딘에 대한 높은 특이성 및 13,000 내지 15,000의 분자량을 가지고, 포유동물의 조직으로부터 한 단계 이상의 음이온 교환 크로마토그래피, 한 단계의 겔 투과 및 한 단계의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하여 수득가능한, 히스티딘 인산가수분해효소의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 바람직한 포유동물 조직은 심장, 신장, 간, 췌장, 골격근 및 고환으로부터 수득된다. 바람직한 포유동물은 인간, 래빗, 래트이다. 본 발명의 폴리펩티드는 서열목록 서열번호 3의 아미노산 서열 특정부를 적어도 포함한다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 서열목록 서열번호 4의 아미노산 서열 특정부를 적어도 포함한다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 서열목록 서열번호 5의 아미노산 서열 특정부를 적어도 포함한다.

모든 이러한 부분적인 서열은 효소 아미노산의 완전한 서열 내에서 매우 잘 보존되고, 상기 효소의 활성 부위와 관련되거나 포유동물에서 다른 생물학적 또는 약학적 관련성을 갖게 된다.

본 발명의 바람직한 실시태양으로서, 포스포히스티딘에 대한 높은 특이성 및 13,000 내지 15,000의 분자량을 가지고, 서열목록 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 히스티딘 인산가수분해효소의 생물학적 활성을 갖는다.

서열의 N-말단에 있는 메티오닌 잔기가 필수적인 것은 아니다. 전술한 서열목록 서열번호 2의 아미노산 서열은 인간의 것이다.

그러나, 본 발명은 또한 상기 서열의 상동 변이체를 특별히 개시하고 있다.따라서, 본 발명의 또다른 목적은, 포스포히스티딘에 대한 높은 특이성 및 13,000 내지 15,000의 분자량을 가지고, 그의 아미노산 서열이 전술한 서열과 비교해서 64 내지 99%, 바람직하게는 75 내지 99%의 상동성을 갖는 히스티딘 인산가수분해효소의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 본 발명은, 히스티딘 단백질 인산가수분해효소의 생물학적 활성을 모두 갖는 수많은 다른 상동 폴리펩티드를 개시한다.

본 발명의 또다른 목적은, 전술 및 후술할 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명은 서열목록 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 DNA에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드와 관련된 항체, 바람직하게는 단일클론성 항체에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명의 목적은 상기 및 하기 정의된 폴리펩티드, 및 적합하다면, 적합한 부형제, 담체 및 기타 활성 성분을 포함하는 약학 제제를 제공하는 것이다.

(A) 단리 및 정제

히스티딘 단백질 인산가수분해효소를 래빗 간으로부터 단리시켰다.

간은 먼저 약 110g의 물질을 작은 단편으로 절단하여 준비한다. 균질화 완충용액(30 mM 트리에탄올아민/pH 7.5 염산, 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 300mM 수크로스, 0.1 mM 벤즈아미딘, 0.1% 2-머캅토에탄올 220 ml,)과 혼합하고, 얼음에서 냉각시키면서 균질화기에서 분쇄한다. 1차 원심분리(3800g, 4℃에서 10분) 후, 상청액을 재원심분리한다(48,000g, 4℃에서 1시간). 상기 상청액을 가제를 통해 여과하고, 약 20 ml의 분획을 -80℃로 냉동시킨다.

컬럼 크로마토그래피 분리 방법

히스티딘 인산가수분해효소를 3 단계의 정제법에 의해 단리시켰다(도 1).

1. 음이온 교환 크로마토그래피

간의 원추출물은 일단 다시 원심분리한다(48000g에서 30분). 상청액은, 완충용액 A(20 mM 트리에탄올아민/pH 8.0 염산, 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 0.1% 2-머캅토에탄올, 0.02% 아질산나트륨)으로 평형화된 소스 Q30(프라이부르크 소재의 파마시아(Pharmacia)로부터 구입가능함) 컬럼 위에 로딩한다. 완충용액 A 중 200 mM 염화나트륨을 사용하여 1 ml/분의 흐름 속도로 용리시킨다.

2. 겔 여과

고체 황산암모늄(17 ml에 11.2g)을 첨가하면서 활성 분획(활성 측정법 참조)을 교반하고 냉각시킨다. 원심분리(48,000g, 4℃에서 20분)에 의해 수득된 펠렛을 완충용액 A 중에서 재현탁하고, 수퍼덱스(Superdex) 75 26/60 1.6x60 cm(프라이부르크 소재의 파마시아로부터 구입가능함) 컬럼 위에 로딩한다. 50 mM 염화나트륨을 완충용액 A에 1 ml/분으로 첨가하면서 겔 여과한다.

3. 친화성 크로마토그래피

겔 여과로부터 수득한 활성 분획을 완충용액 B(20 mM 트리에탄올아민/pH 8.0염산, 0.1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 0.1% 2-머캅토에탄올, 0.02% 아질산나트륨)를 사용하여 1:3의 비로 희석시키고, 상기 활성 분획이 염화마그네슘 중에서 10 mM가 될때까지 조절한다. 샘플을 블루 세파로스 6 25x510 ㎜(프라이부르크 소재의 파마시아로부터 구입가능함) 컬럼 위에 로딩한다. 200 mM 염화나트륨을 함유한 완충용액 B를 사용하여 1 ml/분의 흐름 속도로 용리시킨다.

(B) 특이적 활성 검출

가용성 히스티딘 인산가수분해효소의 활성은, 기질로서³²P-표지 히스티딘-인산화된 단백질(CheA)의 탈인산화의 의해 측정된다. CheA는 재조합 박테리아 히스티딘 오토키나아제(문헌[Bilwes AM, Alex LA, Crane BR, Simon MI (1999) Cell 96:131-141])이다. C-말단 키나아제 영역은 N-말단 His48을 인산화한다. 유리 포스페이트가 반응에서 생성되고 박층 크로마토그래피에 의해 확인된다(폴리에틸렌이민 셀룰로오스 플레이트, 이동상으로서 0.5 M 염화리튬 사용함). 한쪽은 암모늄 몰리브데이트에 의해 검출하고, 다른 한쪽은 오토라디오그래피에 의해 검출한다(도 2). 다른 단백질로의 포스페이트 전달도 없었고, 펩티드 분절로 기질이 분해되지도 않았다. 생성물은 포스페이트로이다. 즉, 포스포히스티딘 단백질 인산가수분해효소가 관련된다.

정제된 단백질은 시간-, 온도-, pH- 및 단백질-의존성³²P-인산화된 CheA의 히스티딘 인산화를 나타낸다(도 3).

안정성

정제된 단백질은 조질의 호머지네이트 및 부분적으로 정제된 분획에서 저장 안정성을 나타낸다.

효소 측정

기질 준비:(CheA의³²P-표지화)

재조합 CheA(5㎕)는, 디메틸 설폭사이드 중 100 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 0.5㎕ 및 500 mM HEPES pH 8.0, 1 mM 염화마그네슘 5 ml와 혼합한다.³²P-g-아데노신 트리포스페이트 108 μ큐리, 10 μM 아데노신 트리포스페이트 5㎕ 및 물 50㎕를 첨가하고, 37℃에서 3 시간동안 배양한다.

활성도 측정

기질(³²P-CheA 10㎕)을 분석용 완충용액(100 mM 트리에탄올아민/pH 8.0 염산, 0.1% 2-머캅토에탄올, 0.02% 아질산나트륨) 10㎕ 및 효소 용액과 혼합한다. 반응은 37℃에서 30 분동안 수행된다. 이어서, 500 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 2㎕ 및 1:1 메탄올/아세톤 126㎕를 첨가한다. 원심분리(15,800g에서 5분) 후 상청액을 제거하고 섬광 계수기에서 측정한다.

따라서, 기술된 인산가수분해효소는, 1) 포스포히스티딘에 대한 특이성(표 1) 즉, 히스티딘 인산가수분해효소가, 예를 들어, p-니트로페닐 포스페이트를 가수분해하지 않았다는 점; 2) 활성이 아카다산 또는 바나데이트에 의해 억제되었다는 점(표 2); 3) 분자량이 상당히 작다는 점에서, 다른 단백질의 인산가수분해효소와 구별된다.

하기 표 1은 신규한 히스티딘 단백질 인산가수분해효소에 의한 가수분해를 나타낸다.

아조콜	-
[γ-³²P]ATP	-
p-니트로페닐 포스페이트	-
[γ-³²P] Ser/Thr-카세인	-
Tyr-xxx	-
[γ-³²P]히스티딘-뉴클레오시드 디포스페이트 키나아제	-
[γ-³²P]히스티딘-CheA	+

하기 표 2는 히스티딘 인산가수분해효소 활성에 영향을 미치는 시약이다.

시약	농도	활성도(%)
포스페이트	10 mM	0
오카다산	10 μM	108
마이크로시스틴	5 nM	110
타우토마이신	0.5 nM	90
억제 단백질 I₁	1 nM	120
몰리브데이트	10 μM	71
바나데이트	10 μM	62
플루오라이드	5 mM	105
EDTA	5 mM	108
EGTA	5 mM	91
Mg²⁺	1 mM	142
Mg²⁺	10 mM	226
Ca²⁺	1 mM	165
Ca²⁺	10 mM	240
100% = xxx nmol/분 x mg^-1

(C) 히스티딘 단백질 인산가수분해효소의 특성

정제된 단백질 분획은 SDS 겔 전기영동법에 의한 분석에 따라 14,000의 분자량을 갖는 특징적인 밴드를 함유하였다(도 4). 질량 분석법으로 분자량이 13,768인 단백질을 확인하였다(도 5). 히스티딘 단백질 인산가수분해효소는 아세틸 기에 의해 N-말단이 차단된다. 따라서, 서열 정보는 에드만(Edman) 서열분석법에 의해 얻을 수 없고, 단백질 특성화를 위한 단백질 분해 절단법(proteolytic cleavage)이 필요하다.

(D) 단백질 분석

활성 분획(도 4)을 효소작용 분해하여 아미노산 서열을 결정하고, 생성된 펩티드 분절은 문헌[Kellner R, Lottspeich F, Meyer HE (1999) Microcharacterization of Proteins, Wiley-VCH]에 기술된 바와 같이 표준 기법을 적용하는 에드만 서열분석법 및 질량 분석법에 의해 서열화하였다.

효소작용 분절화

스캘펠(scalpel)을 사용하여 겔 밴드를 절단하고 에펜도르프(Eppendorf) 튜브로 옮겼다. 프로테아제로서 트립신(트립신 1㎍, 0.5 M 중탄산암모늄 100㎕, 37℃, 12 시간)을 첨가하자, 효소작용 분절화가 일어났다. 생성된 펩티드 분절을 추출하였다(50% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴). 추출물을 진공 원심분리로 농축시켰다.

펩티드 분절의 크로마토그래피 분리

펩티드 분절을 용리액 A(물 중 0.1% 트리플루오로아세트산)에 용해시키고 역상 크로마토그래피(용리액 B: 물 중 20% 트리플루오로아세트산, 80% 아세토니트릴)에 의해 분리하였다. 214 nm에서의 UV 검출을 기준으로 분류한 후(도 6), 용해된 형태의 분리된 펩티드 분절을 에드만 서열분석법 및 질량 분석법에 의해 측정하였다.

에드만 서열분석법 및 질량 분석법에 의한 결정

크로마토그래피 분리 후, 액체 분획 90%를 에드만 서열분석을 위해 사용하였다(표준 조건, 장치: 모델 494, 바이터슈타트 소재의 PE-어플라이드 비오시스템스(PE-Applied Biosystems)로부터 구입가능함). 질량 분석(MALDI-MS)(장치: Voyager STR, 비스바덴 소재의 펄셉티브 비오시스템스(Perseptive Biosystems)로부터 구입가능함)을 위해 분획 중 잔여 부분을 사용하였다.

확인된 펩티드 서열

하기 펩티드 서열을 결정하였다(래빗):

상기 펩티드로부터 래빗의 서열목록 서열번호 6의 효소 펩티드가 유도된다.

(E) 뉴클레오티드 서열분석

히스티딘 단백질 인산가수분해효소 뉴클레오티드 서열에 대해서 수득된 아미노산 서열로부터 선택된 프라이머를 사용하여 래빗 DNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 클로닝 및 서열분석법으로 도 7a에 주어진 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 327 베이스는 위치 11에서 시작해서 119에 이르는 히스티딘 단백질 인산가수분해효소 단백질 서열로 해독된다.

데이터베이스 분석

데이터베이스 검색은 BLAST 알고리즘을 이용하여 수행되었다. 상동 단백질은 단백질 데이터베이스 중 씨 엘레간스(C. elegans), 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster), 드로소필라 수도오브스쿠라(Drosophila pseudoobscura)로부터 확인할 수 있었다.

뉴클레오티드 데이터베이스에서, EST는 인간, 래트 및 마우스에서 확인되었다. 인간 상동물은 아직 발표된 적이 없었다. 이러한 EST 어셈블리에 따라, 인간 히스티딘 단백질 인산가수분해효소 단백질은 메티오닌 잔기가 없는 서열목록 서열번호 2의 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.

래트 상동물은 아직 발표된 적이 없었다. 이러한 EST 어셈블리에 따라, 래트 히스티딘 단백질 인산가수분해효소 단백질은 서열목록 서열번호 7의 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.

마우스 상동물은 아직 발표된 적이 없었다. 이러한 EST 어셈블리에 따라, 마우스 히스티딘 단백질 인산가수분해효소 단백질은 서열목록 서열번호 8의 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.

하기 표 3은 다양한 종으로부터 얻은 단백질 히스티딘 인산가수분해효소에 대한 서열 상동성(동일성이 %로 표시됨)을 나타낸다.

	1	2	3	4	5	6	7
1 인간	100	84.0	65.3	64.3	68.2	38.0	40.3
2 래빗		100	72.4	71.4	71.0	36.0	42.0
3 마우스			100	67.3	52.7	32.7	33.3
4 래트				100	51.6	30.8	29.5
5 제브라 피시					100	33.7	42.1
6 씨 엘레간스						100	39.7
7 드로소필라							100

(E) 단백질 배치 및 조직 분포

인간 히스티딘 단백질 인산가수분해효소 유전자는 염색체 9에 배치된다(9q33-Tel, 표지 sts-N90764, 간격 D9S159-qTEL).

cDNA의 발현을 위한 공급원으로는 뇌, 유방, CNS, 결장, 포피, 생식세포, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 이자, 부갑상선, 혼주, 전립샘, 비장, 고환, 갑상선, 편도선, 자궁, 전체 배아를 사용하였다.

히스티딘 단백질 인산가수분해효소 mRNA의 분포를 분석하면, 심장, 신장, 간, 이자, 골격근 및 고환과 같은 정상 조직에서 증가된 수치를 보여주었다(도 8a, 8b).

(F) 항-히스티딘 인산가수분해효소 항체

항-히스티딘 인산가수분해효소 항체는 단백질의 3개의 뚜렷한 영역, 즉, 분자의 N-말단 부분, 중간 부분 및 C-말단 부분에 대해서 생성되었다. 이러한 목적을 위해서, 3개의 펩티디 서열이 선택되었다:

펩티드 1-서열목록 서열번호 9;

펩티드 2-서열목록 서열번호 10;

펩티드 3-서열목록 서열번호 11.

펩티드는 표준 FMOC-화학법을 이용하여 합성되었다. 면역화를 위해서, 펩티드를 2마리 래빗에 각각 주사하고, 4개의 혈액 샘플을 만들었다. 최종 채혈은 약 3개월 후에 실시하였다. 생성된 항체는 히스티딘 인산가수분해효소의 검출 및 배치에 유용하다.

또한, 분자내의 상이한 영역들을 각각 분석할 수 있다. 특히, 가장 잘 보존되는 서열목록 서열번호 3의 아미노산 서열을 함유한 히스티딘 인산가수분해효소의 중심 부분은, 생체내에서 단백질 작용에 대해 반응할 수 있는 활성 부위를 함유하는 것으로 추정된다. 상기 영역에 대한 항-펩티드 항체는 억제용 또는 중화용이다.

히스티딘 단백질 인산가수분해효소의 특성은 다음과 같이 요약될 수 있다:

1. 인간 히스티딘 단백질 인산가수분해효소의 아미노산 서열은 약 124개의 아미노산을 포함한다.

2. 히스티딘 단백질 인산가수분해효소의 아미노산 서열은 C-말단 부분에서는 상동성이 높지만, N-말단 부분에서는 상동성이 적다.

3. 분자량은 13,800±100이다(도 5).

4. 히스티딘 단백질 인산가수분해효소는 아세틸화에 의해 N-말단이 차단된다.

약학 제제

천연 단백질뿐만 아니라 재조합 단백질은 환자에게 직접 투여될 수 있는 약제로서 또는 약학 조성물내에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 태양은상기 및 하기 정의된 바와 같은 재조합 또는 천연 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 그의 부형제를 포함하는 약제, 개별적인 약학 조성물로서 사용가능한 상기의 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 약학 조성물은 매우 다양한 활성 약학적 화합물을 추가로 함유할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "약학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는 활성 화합물 또는 환자와 역으로 반응하지 않는 불활성, 비독성 고형물 또는 액체 충전재, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 적합하고 바람직한 액체 담체는 당해 기술분야에 잘 알려진, 예를 들어 석유, 동물, 식물 또는 합성 물질의 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 대두유 및 광유를 포함하는 살균수, 염수, 수성 덱스트로스, 당 용액, 에탄올, 글리콜 및 오일이다.

비경구 투여용으로 전형적인, 통상적인 비독성 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 애주번트 및 비이클을 함유한 본 발명에 따른 제제는 단위 투여량으로 투여될 수 있다.

"비경구"라는 용어는 본원에서 피하, 정맥내, 관절내 및 기관내 주사 및 주입법을 포함한다. 또한, 경구 투여 및 국부 투여와 같은 다른 투여도 적합하다. 비경구 조성물 및 조합은 가장 바람직하게는 공지된 방법에 따라, 거환제 형태 또는 일정한 융해물로 정맥내로 투여된다. 경구 투여용 정제 및 캡슐은 통상적인 부형제, 예를 들어 결합제, 충전재, 희석제, 정제화제, 윤활제, 붕해제 및 습윤제를 함유한다. 정제는 당해 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다. 경구용 액체 제제는 수성 또는 오일성 현탁액, 용액, 유액, 시럽 또는 엘릭시르 형태일 수 있거나, 사용 이전에 물 또는 또다른 적합한 비이클과 함께 재구성되는 건조 제품으로서 존재할 수 있다. 상기 액체 제제는 통상적인 첨가제, 예를 들어 현탁화제, 유화제, 비수성 비이클 및 방부제를 함유할 수 있다. 국소 적용은 수성 또는 오일성 현탁액, 용액, 유액, 젤리 또는 바람직하게는 유액 연고 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 단위 투여량은 본 발명에 따른 단백질의 1일 요구량 또는 목적하는 투여량을 구성하는 그의 보조 복합물(sub-multiple)을 함유할 수 있다. 특정 환자(인간을 포함하는 포유동물)에 대한 최적의 치료상 허용가능한 투여량 및 투여 속도는 다양한 인자, 예를 들어 사용된 특정 활성 물질의 활성도, 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 식이요법, 투여시간 및 투여경로, 클리어런스 속도, 효소 활성도(단위/ 단백질 mg), 치료의 객체, 치료법 또는 예방법 및 치료될 질환의 특성에 좌우된다.

따라서, 치료된 환자(생체내)에서, 조성물 및 조합 중 본 발명의 단백질의 약학적으로 효과적인 1일 투여량은 약 0.01 내지 100mg/체중 1kg(100 kU/mg의 특정 활성도를 기준으로 함), 바람직하게는 0.1 내지 10mg/체중 1kg이다. 적용 형태에 따라, 1회 투여량은 히스티딘 단백질 인산가수분해단백질 0.5 내지 10 mg을 함유할 수 있다.

Claims

포스포히스티딘에 대한 높은 특이성 및 13,000 내지 15,000의 분자량을 가지고, 포유동물의 조직으로부터 한 단계 이상의 음이온 교환 크로마토그래피, 한 단계의 겔 투과 및 한 단계의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하여 수득가능한, 히스티딘 인산가수분해효소의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서,

서열목록 서열번호 3의 아미노산 서열 특정부를 적어도 포함하는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서,

서열목록 서열번호 4의 아미노산 서열 특정부를 적어도 포함하는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서,

서열목록 서열번호 5의 아미노산 서열 특정부를 적어도 포함하는 폴리펩티드.
포스포히스티딘에 대한 높은 특이성 및 13,000 내지 15,000의 분자량을 가지고, 서열목록 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 히스티딘 인산가수분해효소의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드.
포스포히스티딘에 대한 높은 특이성 및 13,000 내지 15,000의 분자량을 가지고, 그의 아미노산 서열이 서열목록 서열번호 4의 아미노산 서열과 비교하여 64 내지 99%의 상동성을 갖는, 히스티딘 인산가수분해효소의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드.
제 6 항에 있어서,

서열목록 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA.
제 8 항에 있어서,

서열목록 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
적합하다면, 적합한 부형제, 담체 및 기타 활성 성분과 함께, 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 약학 제제.
제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 대한 항체.