DE60038731T2

DE60038731T2 - Histidin protein-phosphatase

Info

Publication number: DE60038731T2
Application number: DE60038731T
Authority: DE
Inventors: Susanne Klumpp; Roland Kellner
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 2000-03-02
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2020-03-03
Also published as: CN1201009C; US6812015B1; SK12242001A3; PL350323A1; KR20020002400A; ATE393827T1; AU762809B2; HK1042729A1; ES2303813T3; HUP0200241A2; MXPA01008941A; WO2000052175A1; CZ20013172A3; ZA200108129B; AU3808000A; NO20014261L; RU2281973C2; DE60038731D1; CN1342205A; CA2364495A1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Enzym, Histidinproteinphosphatase, das aus Säugetierquellen stammt, sowie seine homologen Varianten. Die Erfindung betrifft des Weiteren DNA-Sequenzen, die für diese Proteine kodieren, ein Verfahren zur Herstellung derselben sowie gegen sie gerichtete Antikörper. Die neue Phosphatase kann für die Diagnose von pathologischen Zuständen der Zellregulierung und des Zellwachstums und als pharmazeutischer Wirkstoff verwendet werden, der in Verbindung mit pathologischen Störungen im Zusammenhang mit Fehlfunktionen dieses Enzyms verabreicht wird. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die Anwendung dieses Enzyms bei der Diagnose, Behandlung von Krankheiten, als Agonisten und Antagonisten bei der Identifizierung von Faktoren, die bei der Histidinphosphorylierung eine Funktion ausüben, sowie als Agonisten und Antagonisten, die möglicherweise bei der Therapie von Nutzen sind.
Hintergrund der Erfindung
Die Proteinphosphorylierung ist ein grundlegender biologischer Prozess, der oftmals bei der Signaltransduktion und bei der Regulierung der Proteinaktivität eine Schlüsselrolle spielt. Bei eukaryotischen Signaltransduktionswegen ist die Phosphorylierung von Serin, Threonin und Tyrosin üblich. Es gibt eine umfassende Literatur über biochemische Verfahren zum Nachweis der Phosphorylierung von Serin, Threonin und Tyrosin an unbekannten Proteinen. Wenn, zum Beispiel, kultivierte Säugetierzellen mit Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Wirkstoffen, Peptiden oder anderen stimulierenden Molekülen wie z. B. PDGF, NGF, IL-2, usw. behandelt werden, kann die Phosphorylierung von Proteinen an Serin, Threonin und Tyrosin einfach durch Inkubieren der Zellen mit radioaktiv markiertem Phosphat, Isolieren der Proteine nach der Behandlung mit einem Wachstumsfaktor usw., Abtrennen der Proteine mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Fixierung des Gels und Durchführen einer Autoradiographie zur Identifizierung von das markierte Phosphat enthaltenden Proteinbanden nachgewiesen werden. Alternativ können Proteine aus behandelten und unbehandelten Zellen unter Verwendung eines zweidimensionalen Systems getrennt werden und die Position der Proteinspots kann verglichen werden. Die scheinbare Bewegung eines Spots kann auf eine aus einer Behandlung folgenden Veränderung im Modifikationszustand hindeuten. In einem weiteren Verfahren, werden die Proteine einer sauren Hydrolyse unterzogen, um Aminosäuren zu ergeben, die dann einer Dünnschichtchromatographie unterzogen und auf die Gegenwart von radioaktiv markiertem Phosphor hin untersucht werden können.
Diese Verfahren der Proteinchemie verwenden jedoch Bedingungen, unter denen phosphoryliertes Histidin, Lysin oder Arginin instabil sind. Insbesondere baut sich Phosphohistidin bei geringen pH-Werten mit einer Halbwertszeit von etwa 5–100 Minuten spontan ab, bei neutralen pH-Werten hat Phosphohistidin jedoch eine Halbwertszeit von Tagen bis Wochen (Matthews, H. R. [1995] Pharmac. Ther. 67: 323–350). Zum Beispiel werden Polyacrylamidgele nach der Elektrophorese für eine Proteintrennung im Allgemeinen unter sauren Bedingungen fixiert. Ebenso führen auch die sauren Bedingungen für die Aminosäurehydrolyse zu einem Abbau von Phosphohistidin.
Es wurde nachgewiesen, dass phosphoryliertes Histidin eine Schlüsselrolle bei der Signaltransduktion in Bakterien spielt. Solche Wege regulieren viele Aspekt des bakteriellen Metabolismus. Zum Beispiel steuert das ArcA/ArcB-System den aeroben und anaeroben Metabolismus in E. coli (Iuchi S, Weiner L. J Biochem (Tokyo) [1996] 120: 1055–63). OmpR und OmpF steuern die Reaktion auf unterschiedliche osmotische Bedingungen (Pratt LA, Hsing W, Gibson KE, Silhavy TJ. Mol Microbiol [1996] 20: 911–7). CheA und CheZ sind an der Chemotaxis beteiligt (Alon U. Nature [1999] 397: 168–171). All diese Proteine wurden zuerst mittels genetischer Mittel identifiziert: Mutationen in den korrespondierenden Genen verursachen interessierende Phänotypen und die resultierenden Proteine können nach Klonen der relevanten Gene identifiziert werden.
Ebenso wurde kürzlich gefunden, dass die Eukaryoten S. cerevisiae und Arabidopsis thaliana Signaltransduktionssysteme mit Proteinen aufweisen, die die Phosphorylierung von Histidin beinhalten (Loomis et al., [1997] J. Cell Science 110: 1141–1145). Zum Beispiel hat das Sln1-Protein eine extrazelluläre Sensordomäne, eine cytoplasmatische Histidinkinasedomäne und eine Aspartat-Verbindungsdomäne. ETR1 der Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana wurde ebenfalls mittels Mutanten, denen eine Reaktion auf Ethylen fehlt, identifiziert. Das ETR1-Gen wurde dann kloniert und das Protein untersucht, was zu der Entdeckung führte, dass dieses Protein eine Histidinkinase ist. S. cerevisiae und Arabidopsis thaliana sind genetisch steuerbare Organismen und ihre an der Histidinphosphorylierung beteiligten Proteine wie z. B. Sln1 und Etr1 werden gewöhnlich mittels genetischer Mittel identifiziert.
Bestehende Techniken umfassen im Allgemeinen eine Größentrennung von entweder den Proteinen oder den Phosphoaminosäuren.
N-Phosphorylierung in Säugetieren ist im Energiemetabolismus von Bedeutung und ist bei verschiedenen Krebsarten verändert. Zum Beispiel ist das Nm23-Protein eine Nucleosid-Diphosphatkinase, die das durch Glykolyse und oxidative Phosphorylierung erzeugte ATP nutzen kann, um Nucleosid- und Desoxynucleosiddiphospate in Triphosphate umzuwandeln. Nm23 wird am Histidin118 als Teil seines Pingpong-Reaktionsmechanismus transient phosphoryliert. Nm23 ist auch in der Lage, seine Phosphatgruppe auf Histidinreste in ATP-Citratlyase und Succinyl-CoA-Synthetase zu übertragen. So spielt die Histidinphosphorylierung eine wichtige Rolle im Energiemetabolismus der Zellen.
Beim Menschen gibt es mehrere Nm23-Proteine. In hoch metastatischen Krebsarten werden diese Nm23-Proteine oftmals in geringen Spiegeln exprimiert. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird angenommen, dass Nm23 ein Anti-Onkogen ist. Außerdem werden bei bestimmten Krebsarten Mutationen an bestimmten Nm23-Proteinen gefunden. Diese Mutationen wirken sich oftmals auf die Phosphorylierungs- oder Dephosphorylierungsgeschwindigkeit von Nm23 aus.
Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die N-Phosphorylierung eine wichtige Rolle im Energiemetabolismus und bei Krebs spielt. Daher könnten Proteine oder Wirkstoffe, welche die N-Phosphorylierung oder Dephosphorylierung modulieren, bei der Behandlung von Krebs oder Metabolismusstörungen wie z. B. Fettsucht, Appetitlosigkeit, Auszehrung aufgrund von Krebs, HIV oder anderen Erkrankungen und so weiter von Bedeutung sein. Außerdem kann, da die N-Phosphorylierung bei einer breiten Vielfalt an biologischen Phänomenen bei anderen Organismen eine Rolle spielt, die N-Phosphorylierung vielleicht bei anderen Erkrankungen und Störungen bei Säugetieren, wie z. B. Immunstörungen, viralen Infektionen, genetischen Störungen, Herzerkrankungen und so weiter eine Rolle spielen.
Unglücklicherweise wachsen Säugetiere sehr viel langsamer als Bakterien, S. cerevisiae und Arabidopsis thaliana, und daher ist es schwierig, an der Histidin-, Lysin- oder Argininphosphorylierung beteiligte Proteine durch die gleichen genetischen Vorgehensweisen zu identifizieren, die für diese einfacheren Organismen verwendet werden. Außerdem sind biochemische Techniken zur Identifizierung von an Serin, Threonin und Tyrosin phosphorylierten Proteinen nicht allgemein anwendbar, um an Histidin, Lysin und Arginin phosphorylierte Proteine zu identifizieren. Es besteht daher ein Bedarf auf dem Fachgebiet an Techniken und biochemischen Reagenzien für die Verwendung bei der Untersuchung der N-Phosphorylierung.
Histidinphosphatasen und Histidinkinasen sind Enzyme die in entgegengesetzten Richtungen wirken. Die Histidinkinase wirkt auf die Phosphorylierung von bestimmten Histdinresten in Proteinen, während Histidinphosphatasen diese Phosphorylierung umkehren. Beide Enzyme spielen vermutlich bei der Signaltransduktion, Apoptose, der Kontrolle des Zellwachstums und bei der Zelldifferenzierung eine wichtige Rolle. Es ist bekannt, dass sie Erkrankungen sind, die auf Störungen dieser zellulären Funktionen beruhen. Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, das für die Untersuchung der Ursache der pathophysiologischen Störungen und, wo geeignet, für deren Behandlung verwendet werden kann.
Hormone oder Peptide stimulieren Zelloberflächenrezeptoren auf einer Zelle und induzieren zelluläre Effekte über einen Signaltransduktionsweg. Reversible Phosphorylierung von spezifischen Proteinsubstraten mittels regulatorischer Proteinkinasen und -phosphatasen spielt bei der intrazellulären Signalübermittlung eine wesentliche Rolle. Rezeptorgebundene, membrangebundene und intrazelluläre Proteinkinasen und -phosphatasen regulieren die Prozesse der zellulären Proliferation, Zelldifferenzierung und des Immunsystems. Funktionsstörungen dieser Regulatoren oder ihrer Aktivitäten sind für eine große Anzahl an pathophysiologischen Effekten entscheidend. Demzufolge stellen Proteinkinasen und -phosphatasen sowie der Signaltransduktionsweg, an dem sie beteiligt sind, mögliche Ziele für den Wirkstofffindungsprozess dar.
Signaltransduktion beinhaltet bei Säugetieren eine reversible Phosphorylierung von Ser/Thr/Tyr. Obwohl das Vorhandensein von Histidinphosphat in Säugetieren bekannt ist (Crovello CS, Furie BC, Furie B (1995) Cell 82: 279–286), war es bisher nicht möglich, entweder die entsprechenden Kinasen oder die relevanten Phosphatasen zu identifizieren. Die Schwierigkeit besteht, unter anderem, darin, dass Histidinphosphat gegenüber Hydrolyse instabil ist und bei der standardmäßigen Phosphoaminosäureanalyse nicht nachgewiesen wird.
Die Funktionen der His-Kinasen und His-Phosphatasen in Bakterien wurden sehr gründlich untersucht. Ihre Beteiligung an der Chemotaxis und ihre Anpassung machen sie zu vielversprechenden Angriffspunkten für bakterielle Erkrankungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Histidinproteinphosphatase, insbesondere Histidinproteinphosphatase-Polypeptide und Histidinproteinphosphatase-Polynucleotide, rekombinante Materialien und Verfahren zu deren Herstellung. Derartige Polypeptide und Polynucleotide sind in Bezug auf Verfahren zur Behandlung von bestimmten Erkrankungen von Interessen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Krebs und metabolische Störungen, kardiovaskuläre Erkrankungen sowie Erkrankungen des zentralen Nervensystems, die im Folgenden hierin als „erfindungsgemäße Erkrankungen" bezeichnet werden. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten (z. B. Inhibitoren) unter Verwendung von durch die Erfindung bereitgestellten Materialien und zur Behandlung von mit einem N-Phosphorylierungsungleichgewicht einhergehenden Zuständen mit den identifizierten Verbindungen. In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung diagnostische Assays zum Nachweis von Erkrankungen, die mit einer ungeeigneten Histidinproteinphosphatase-Aktivität oder ungeeigneten Histidinproteinphosphatase-Spiegeln einhergehen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch korrespondierende Varianten und Mutanten, die zum Beispiel durch zufällige oder kontrollierte Substitution, unterschiedliches Spleißen, Deletion oder Addition von einem oder mehreren Nucleotiden oder einer oder mehreren Aminosäuren hergestellt werden, wobei die biologische Aktivität im Wesentlichen beibehalten wird.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Histidinphosphatase bereitzustellen, das eine höhere Spezifizität für Phosphohistidin und ein Molekulargewicht von 13.000–15.000 aufweist und mittels Reinigung aus Säugetiergewebe durch mindestens einen Anionenaustauschchromatographie-, einen Gelfiltrations- und einen Affinitätschromatographieschritt erhalten werden kann. Bevorzugte Säugetiergewebe stammen aus Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Skelettmuskel und Testis. Bevorzugte Säugetiere sind Menschen, Kaninchen und Ratten. Das erfindungsgemäße Polypeptid umfasst zumindest das Aminosäuresequenzmotiv (SEQ. No. 3)
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält das Polypeptid zumindest das Aminosäuresequenzmotiv (SEQ. No. 5)
All diese Teilsequenzen sind innerhalb der vollständigen Aminosäuresequenz des Enzyms hoch konserviert und es wird angenommen, dass sie an der aktiven Stelle dieses Enzyms beteiligt sind oder andere biologische oder pharmazeutische Relevanz in den Säugetieren besitzen.
Als eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Polypeptid die biologische Aktivität einer Histidinphosphatase auf, die eine hohe Spezifizität für Phosphohistidin und ein Molekulargewicht von 13.000–15.000 aufweist und die folgende Aminosäuresequenz umfasst (SEQ. No. 2):
Der Methioninrest am N-Terminus der Sequenz ist nicht obligatorisch. Die oben angegebene Aminosäuresequenz ist humanen Ursprungs.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, DNA-Sequenzen, die für ein oben und unten angegebenes Polypeptid kodieren, bereitzustellen. Insbesondere betrifft die Erfindung diese DNA, welche die folgende Nucleotidsequenz enthält (SEQ. No. 1):
gegenstand der Erfindung sind auch Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide gerichtet sind.
Schließlich ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein pharmazeutisches Präparat bereitzustellen, das ein Polypeptide wie oben und unten definiert, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Hilfsstoffen, Trägern und anderen Wirkstoffen enthält.
Detaillierte Beschreibung
(A) ISOLIERUNG UND REINIGUNG
Die Histidinproteinphosphatase wurde aus Kaninchenleber isoliert. Die Leberpräparation beginnt mit etwa 110 g in kleine Stücke geschnittenes Material. Dies wird mit Homogenisierungspuffer (220 ml 30 mM Triethanolamin/Salzsäure pH 7,5,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 300 mM Saccharose, 0,1 mM Benzamidin, 0,1% 2-Mercaptoethanol) vermischt und in einem Homogenisator unter Eiskühlung zerkleinert. Nach einer ersten Zentrifugation (10 min bei 3800 g, 4°C) wurde der Überstand erneut zentrifugiert (1 h bei 48.000 g, 4°C). Dieser Überstand wird durch Gaze filtriert und in Aliquots von etwa 20 ml bei –80°C eingefroren.
Säulenchromatographische Trennungsverfahren
Die Histidinphosphatase wurde mittels dreier Reinigungsschritte isoliert (1).
1. Anionenaustauschchromatographie
Das rohe Leberextrakt wird ein weiteres Mal zentrifugiert (30 min bei 48.000 g). Der Überstand wird auf eine Source-Q30-Säule (Pharmacia, Freiburg) geladen, die mit Puffer A (20 mM Triethanolamin/Salzsäure pH 8,0, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,1% 2-Mercaptoethanol, 0,02% Natriumnitrit) äquilibriert wurde. Die Elution erfolgt mit 200 mM Natriumchlorid in Puffer A mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min.
2. Gelfiltration
Die aktive Fraktion (siehe Aktivitätsbestimmung) wird gerührt und gekühlt, während festes Ammoniumsulfat (11,2 g zu 17 ml) zugegeben wird. Der mittels Zentrifugation (20 min bei 48.000 g, 4°C) erhaltene Pellet wird in Puffer A resuspendiert und auf eine Superdez-75-Säule 26/60 1,6 × 60 cm (Pharmacia, Freiburg) geladen. Die Gelfiltration erfolgt unter Zugabe von 50 mM Natriumchlorid zu Puffer A mit 1 ml/min.
3. Affinitätschromatographie
Die aktive Fraktion aus der Gelfiltration wird im Verhältnis 1:3 mit Puffer B (20 mM Triethanolamin/Salzsäure pH 8,0, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,1% 2-Mercaptoethanol, 0,02% Natriumnitrit) verdünnt und auf 10 mM in Magnesiumchlorid eingestellt. Die Probe wird auf eine Blue-Sepharose-Säule 6 25 × 510 mm (Pharmacia, Freiburg) geladen. Die Elution erfolgt unter Verwendung von 200 mM Natriumchlorid enthaltendem Puffer B mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min.
(B) NACHWEIS DER SPEZIFISCHEN AKTIVITÄT
Die Aktivität der löslichen Histidinphosphatase wird aus der Dephosphorylierung von mit ³²P markiertem histidinphosphoryliertem Protein (CheA) als Substrat bestimmt. CheA ist eine rekombinante bakterielle Histidinautokinase (Bilwes AM, Alex LA, Crane BR, Simon MI (1999) Cell 96: 131–141); die C-terminale Kinasedomäne phoshoryliert das N-terminale His48. In der Reaktion wird freies Phosphat erzeugt und mittels Dünnschichtchromatographie (Polyethylenimin-Celluloseplatten, 0,5 M Lithiumchlorid als mobile Phase) identifiziert. Der Nachweis erfolgt einerseits mittels Ammoniummolybdat und andererseits mittels Autoradiographie (2). Es gab keinen Phosphattransfer auf andere Proteine und es gab auch keine Spaltung des Substrats in Peptidfragmente. Das Produkt ist Phosphat, d. h. es war eine Phosphohistidinproteinphosphatase beteiligt.
Das gereinigte Protein zeigt eine Zeit-, Temperatur-, pH-Wert- und proteinabhängige Histidindephosphorylierung des ³²P-phosphorylierten CheAs (3).
Stabilität
Das gereinigte Protein zeigt Lagerungsstabilität im rohen Homogenisat und in den teilweise gereinigten Fraktionen.
Enzymassay

Substratherstellung: (³²P-Markierung von CheA)

Rekombinantes CheA (5 μl) wird mit 0,5 μl 100 mM Phenylmethylsulfonylfluorid in Dimethylsulfoxid und 5 μl 500 mM HEPES pH 8, 0,1 mM Magnesiumchlorid vermischt. Auf die Zugabe von 108 μCurie ³²P-g-Adenosintriphosphat, 5 μl 10 μM Adenosintriphosphat und 50 μl Wasser folgt eine 3-stündige Inkubation bei 37°C.
Bestimmung der Aktivität
Das Substrat (10 μl ³²P-CheA) wird mit 10 μl Assaypuffer (100 mM Triethanolamin/Salzsäure pH 8,0, 0,1% 2-Mercaptoethanol, 0,02% Natriumnitrit) und der Enzymlösung vermischt. Die Reaktion erfolgt bei 37°C über 30 min. Dann werden 2 μl 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure und 126 μl 1:1 Methanol/Aceton zugegeben. Nach einer Zentrifugation (5 min bei 15.800 g) wird der Überstand entfernt und in einem Szintillationszähler gemessen.
Die beschriebene Phosphatase wird so auf der Grundlage

1) der Spezifizität für Phosphohistidin (Tabelle 1), wobei die Histidinphosphatase nicht hydrolysierte, z. B. p-Nitrophenylphosphat;
2) der Aktivität, die nicht mittels Okadasäure oder Vanadat inhibiert wurde (Tabelle 2);
3) des Molekulargewichts, das beträchtlich geringer ist,

Azocoll	–
[γ-³²P] ATP	–
p-Nitrophenylphosphat	–
[γ³²P] Ser/Thr-Casein	–
Tyr-xxx	–
[γ-³²P] His-Nucleosid-Diphosphatkinase	–
[γ-³²P] His-cheA	+

Reagenz	Konzentration	Aktivität (%)
Phosphat	10 mM	0
Okadasäure	10 μM	108
Microcystin	5 nM	110
Tautomycin	0,5 nM	90
Inhibitorprotein I₁	1 nM	120
Molybdat	10 μM	71
Vanadat	10 nM	62
Fluorid	5 mM	105
EDTA	5 mM	108
EGTA	5 mM	91
Mg²⁺	1 mM	142
Mg²⁺	10 mM	226
Ca²⁺	1 mM	165
Ca²⁺	10 mM	240

100% = xxx nmol/min × mg^–1

(C) CHARAKTERISIERUNG DER HISTIDINPROTEINPHOSPHATASE
Die gereinigte Proteinfraktion enthielt eine definierte Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 14.000 gemäß der Analyse mittels SDS-Gelelektrophorese (4). Die Massenanalyse identifizierte ein Molekulargewicht des Proteins von 13.768 (5). Die Histidinproteinphosphatase ist N-terminal durch eine Acetylgruppe blockiert. Daher ist keine Sequenzinformation mittels Edman-Abbau zugänglich und für eine Proteincharakterisierung ist eine proteolytische Spaltung erforderlich.
(D) ANALYTISCHE PROTEINBESTIMMUNG
Die aktive Fraktion (4) wurde einer enzymatischen Spaltung unterzogen, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen, und die resultierenden Peptidfragmente wurden mittels Edman-Abbau und Massenspektrometrie unter Anwendung von Standardtechniken wie in der Literatur (Kellner R, Lottspeich F, Meyer HE (1999) Microcharacterization of Proteins, Wiley-VCH) beschrieben sequenziert.
Enzymatische Fragmentierung
Die Gelbande wurde unter Verwendung eines Skalpells ausgeschnitten und in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Die enzymatische Fragmentierung fand nach Zugabe von Trypsin als Protease statt (1 μg Trypsin, 100 μl 0,5 M Ammoniumbicarbonat, 37°C, 12 h). Die resultierenden Peptidfragmente wurden extrahiert (50% Trifluoressigsäure, 50% Acetonitril). Das Extrakt wurde in einer Vakuumzentrifuge aufkonzentriert.
Chromatographische Trennung der Peptidfragmente
Die Peptidfragmente wurden in Elutionsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure in Wasser) gelöst und für Trennung mittels Umkehrphasenchromatographie (Elutionsmittel B: 20% 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, 80% Acetonitril) aufgebracht. Nach der Fraktionierung auf der Basis einer UV-Bestimmung bei 214 nm (siehe 6) lagen die getrennten Peptidfragmente in gelöster Form vor und wurden mittels Edman-Sequenzierung und Massenspektrometrie bestimmt.
Edman-Sequenzierung und Massenspektrometriebestimmungen
Die flüssigen Fraktionen wurden nach der chromatographischen Trennung zu 90% für eine Edman-Sequenzierung verwendet (Standardbedingungen, Gerät: Modell 494, PE-Applied Biosystems, Weiterstadt). Der verbleibenden Teil der Fraktion wurde für eine Massenanalyse verwendet (MALDI-MS), (Gerät: Voyager STR, Perseptive Biosystems, Wiesbaden).
Identifizierte Peptidsequenzen
Es wurden die folgenden Peptidsequenzen bestimmt (Kaninchen):
Diese Peptide führten zu dem Enzympeptid aus Kaninchen (SEQ. No. 6):
(E) Nucleotid-Sequenzierung
Es wurde eine Kaninchen-DNA-Bibliothek mit Primern gescreent, die aus der erhaltenen Aminosäuresequenz für die Histidinproteinphosphatase-Nucleotidsequenz ausgewählt wurden. Klonierung und Sequenzierung identifizierte die in 7A dargestellte Nucleotidsequenz.
Die 327 Basen translatieren zur Histidinproteinphosphatase-Proteinsequenz, beginnend an Position 11 bis 119 (7b).
Datenbankanalyse

Es wurde eine Datenbanksuche unter Verwendung des BLAST-Algorithmus ausgeführt. In den Proteindatenbanken konnten homologe Proteine aus C. elegans, Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura identifiziert werden. In Nucleotiddatenbanken wurden ESTs bei Menschen, Ratten und Mäusen identifiziert. Ein humanes Homolog wurde bisher noch nicht veröffentlicht. Gemäß dieser EST-Anordnungen wurde gefunden, dass die humane Histidinproteinphosphatase die folgende Sequenz aufweist (SEQ. No 2 ohne einen Methioninrest):

Tabelle 3: Sequenzhomologie für die Histidinproteinphosphatase aus verschiedenen Spezies, angegeben als % Identität.

	1	2	3	4	5	6	7
1 Mensch	100	84,0	65,3	64,3	68,2	33,0	40,3
2 Kaninchen		100	72,4	71,4	71,0	36,0	42,0
3 Maus			100	67,3	52,7	32,7	33,3
4 Ratte				100	51,6	30,8	29,5
5 Zebrafisch					100	33,7	42,1
6 C. elegans						100	39,7
7 Drosophila							100

(E) PROTEINLOKALISIERUNG und Gewebeverteilung
Das humane Histidinproteinphosphatase-Gen ist an Chromosom 9 lokalisiert (9q33-Tel, Marker sts-N90764, Interval D9S159-qTEL). Es wurden Quellen für die Expression von cDNAs verwendet: Hirn, Brust, ZNS, Dickdarm, Vorhaut, Keimzelle, Herz, Niere, Leber, Lunge, Muskel, Bauchspeicheldrüse, Nebenschilddrüse, Pool, Prostata, Milz, Testis, Schilddrüse, Mandeln, Gebärmutter, ganzer Embryo. Eine Analyse der Verteilung von mRNA der Histidinproteinphosphatase zeigte einen erhöhten Spiegel in normalen Geweben wie Herz, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Skelettmuskel und Testis (9a, b),
(F) Anti-Histidinphosphatase-Antikörper
Anti-Histidinphosphatase-Antikörper wurden gegen verschiedene Regionen des Proteins erzeugt. Zu diesem Zweck wurden zwei Peptidsequenzen ausgewählt:
Die Peptide wurden unter Verwendung von standardmäßiger FMOC-Chemie synthetisiert. Für eine Immunisierung wurden die Peptide jeweils zwei Kaninchen injiziert (4 Injektionen) und es wurden vier Blutproben genommen. Die letzte Blutentnahme fand nach etwa 3 Monaten statt. Die erzeugten Antikörper waren für den Nachweis und die Lokalisierung der Histidinphosphatase von Nutzen.
Darüber hinaus können die verschiedenen Regionen innerhalb des Moleküls individuell analysiert werden. Insbesondere wird vom hoch konservierten zentralen Teil der Histidinphosphatase, die die folgende Aminosäuresequenz enthält:
angenommen, dass er die für die Proteinfunktion in vivo verantwortliche aktive Stelle enthält. Der Anti-Peptid-Antikörper gegen diese Region ist für eine inhibitorische oder neutralisierende Verwendung.
Die Eigenschaften der Histidinproteinphosphatase können wie folgt zusammengefasst werden:

1. Die Aminosäuresequenz der humanen Histidinproteinphosphatase enthält etwa 124 Aminosäuren.
2. Die Aminosäuresequenz der Histidinproteinphosphatase ist im C-terminalen Teil hoch homolog, aber im N-terminalen Bereich ist nur eine schwache Homologie gegeben.
3. Das Molekulargewicht beträgt 13.800 +/– 100 (5).
4. Die Histidinproteinphosphatase ist N-terminal durch eine Acetylgruppe blockiert.

Pharmazeutische Präparate
Das oder die nativen sowie das oder die rekombinanten Proteine können als ein Arzneimittel verwendet werden, das Patienten direkt oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden kann. Daher ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein rekombinantes oder natives Protein wie oben und unten definiert bereitzustellen, das als ein Arzneimittel anwendbar ist, sowie eine entsprechende pharmazeutische Zusammensetzung, die dieses Protein und ein pharmazeutisch unbedenkliches Verdünnungsmittel, Träger oder Hilfsstoff dafür umfasst.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusätzliche eine breite Vielfalt an weiteren aktiven pharmazeutischen Verbindungen enthalten.
Wie hierin verwendet, meint der Begriff „pharmazeutisch unbedenklicher Träger" einen inerten, nicht toxischen, festen oder flüssigen Füllstoff oder ein solches Verdünnungsmittel oder Verkapselungsmaterial, das mit dem Wirkstoff oder mit dem Patienten nicht gegensätzlich reagiert. Geeignete, vorzugsweise flüssige Träger sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, wie z. B. steriles Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextrose, Zuckerlösungen, Ethanol, Glykole und Öle, einschließlich der aus Mineralöl, tierischer, pflanzlicher oder synthetischer Herkunft, zum Beispiel Erdnussöl, Sojaöl und Mineralöl.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können als Einzeldosen verabreicht werden, die herkömmliche, nicht toxische, pharmazeutisch zulässige Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und Vehikel enthalten, die für eine parenterale Verabreichung typisch sind.
Der Begriff „parenteral" umfasst hierin subkutane, intravenöse, intraartikuläre und intratracheale Injektions- und Infusionstechniken. Auch andere Verabreichungen wie z. B. orale Verabreichung und toxische Verabreichung sind geeignet. Parenterale Zusammensetzungen und Kombinationen werden am meisten bevorzugt intravenös verabreicht, entweder in einer Bolusform oder als eine konstante Fusion gemäß bekannter Verfahrensweisen. Tabletten und Kapseln für eine orale Verabreichung enthalten herkömmliche Hilfsstoffe wie z. B. Bindemittel, Füllstoffe, Verdünnungsmittel, Tablettierungsmittel, Gleitmittel, Zerfallshilfsmittel und Benetzungsmittel. Die Tabletten können gemäß auf dem Fachgebiet wohlbekannter Verfahren überzogen werden. Orale flüssige Präparate können in der Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirups oder Elixieren vorliegen oder sie können als ein trockenes Produkt für eine Rekonstituierung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor der Verwendung vorliegen. Solche flüssigen Präparate können herkömmliche Additive wie Suspensionsmittel, Emulgatoren, nichtwässrige Vehikel und Konservierungsmittel enthalten. Topische Anwendungen können in der Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Gelees oder vorzugsweise Emulsionssalben vorliegen. Einzeldosen gemäß der vorliegenden Erfindung können täglich benötigte Mengen an erfindungsgemäßem Protein oder Bruchteile davon enthalten, um die gewünschte Dosis herzustellen. Die optimale therapeutisch zulässige Dosierung und Dosis für einen gegebenen Patienten (Säugetiere, einschließlich Menschen) hängt von einer Vielzahl an Faktoren ab, wie z. B. der Aktivität des spezifischen eingesetzten Wirkstoffs, dem Alter, Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Diät, dem Zeitpunkt und Weg der Verabreichung, der Clearancerate, der Enzym aktivität (Einheiten/mg Protein), dem Gegenstand der Behandlung, d. h. Therapie oder Vorbeugung, und der Art der zu behandelnden Erkrankung.
Daher beträgt in Zusammensetzungen und Kombinationen in einem behandelten Patienten (in vivo) eine pharmazeutisch wirksame tägliche Dosis an erfindungsgemäßem Protein zwischen etwa 0,01 und 100 mg/kg Körpergewicht (basierend auf einer spezifischen Aktivität von 100 kU/mg), vorzugsweise zwischen 0,1 und 10 mg/kg Körpergewicht. Je nach der Anwendungsform kann eine Einzeldosis zwischen 0,5 und 10 mg Histidinproteinphosphatase enthalten.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Reinigungsschema, das zur Isolierung der Histidinphosphatase verwendet wurde
2: Identifizierung von anorganischem Phosphat als Reaktionsprodukt der Histidinphosphatasespaltung. Die Platten zeigen Dünnschichtchromatograpie (PEI-Cellulose, 0,8 M LiCl); linke Platte: Ammoniummolybdatbehandlung, rechte Platte: Autoradiographiebehandlung; 1: [³²P]his-cheA, 2: Reaktionsprodukt, 3: ATP, 1–3: Phosphat (NaH₂PO₄);
3: Zeit- und proteinabhängige Dephosphorylierung des Substrats cheA; linke Platte: Abbau nach 0, 20 und 40 min, rechte Platte: Freisetzung von radioaktiv markiertem Phosphat (linke y-Achse: %, rechte y-Achse: Radioaktivität) bei verschiedenen Mengen Substrat (x-Achse: ng Protein).
4: Analyse der Fraktion mit aktiver Histidinphosphatase (SDS-PAGE); AF: aktive Fraktion; 1,2: BSA (1 μg, 0,5 μg), 3: AF; 4,5: Molekulare Marker.
5: Massenanalyse der Histidinphosphatase. Y-Achse: Counts, x-Achse: Masse (m/z)
6: Trennung von Histidinphosphatase mittels Umkehrphasenchromatographie nach enzymatischer Fragmentierung; Elutionsmittel A: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser und Elutionsmittel B: 20% 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, 80% Acetonitril; UV-Bestimmung bei 214 nm
7a: Nucleotid(teil-)sequenz der Histidinproteinphosphatase vom Kaninchen
7b: translatierte, vollständige Aminosäuresequenz der Histidinproteinphosphatase vom Kaninchen
8a: Tumorzelllinienverteilung der Histidinproteinphosphatase
8b: Gewebeverteilung der Histidinproteinphosphatase in Tumorgewebe.
8c: Gewebeverteilung der Histidinproteinphosphatase in normalem Gewebe.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid, enthaltend die Aminosäuresequenz von humaner Histidin-Phosphatase
Isoliertes Polypeptid, enthaltend die Aminosäuresequenz der Histidin-Phosphatase vom Kaninchen
Polypeptid nach Anspruch 1, enthaltend die Aminosäuresequenzeinheit
Isolierte Histidin-Phosphatase, die eine Spezifizität für Phospho-Histidin aufweist und ein Molekulargewicht von 13.000–15.000 besitzt, bestimmt durch SDS-PAGE, erhältlich aus Säugetiergewebe mittels der folgenden Schritte: (1) lösliche Extraktion aus Gewebe (2) Anionenaustauschchromatographie auf Source Q30 (3) Ausfällung mit Ammoniumsulfat (4) Gelfiltration über Superdex 75 (5) Affinitätschromatographie auf Blauer Sepharose
DNA-Sequenz, kodierend für ein rekombinantes Polypeptid nach den Ansprüchen 1–3.
Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–4, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Hilfsstoff, Träger oder anderen Wirkstoff.
Antikörper, gerichtet auf die aktive Stelle der Histidin-Phosphatase, erhältlich durch Immunisieren mit einem Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus