KR20020073152A

KR20020073152A - 보체 활성화의 저해물질, 이들의 제조 및 용도

Info

Publication number: KR20020073152A
Application number: KR1020027008131A
Authority: KR
Inventors: 사라 핀네이; 리사 시알레; 로버츠브라이언 왈리스
Original assignee: 바이오-디스커버리 리미티드
Priority date: 1999-12-24
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2002-09-19
Also published as: CA2393529A1; WO2001047963A3; WO2001047963A2; AU2208401A; US20040038869A1; EP1240202A2; GB9930659D0; JP2003518934A

Abstract

외기생성 거머리로부터 분리할 수 있고 보체 활성화의 대체 경로를 저해하면서도 고전적 경로에 의한 보체 활성화에 별다른 영향을 주지 않는 폴리펩티드를 개시한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 다음의 서열[SEQ ID NO: 50]을 보유하고, 여기서 아미노산은 통상적인 단일 문자 코드로 표시한다:

X1-E-F-Q-D-X2-K-K-S-S-D-X3-E-T-L-E-L-R-X4-N-K-X5 [SEQ ID NO: 50];

여기서,

X1은 수소 원자(H), 임의의 자연-발생 아미노산, 특히 발린, 또는 아미노산 서열이고;

X2는 임의의 단일 아미노산, 특히 시스테인이고;

X3은 임의의 단일 아미노산, 특히 시스테인이고;

X4는 임의의 단일 아미노산, 특히 시스테인이고;

X5는 자연-발생 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열이고, 상기 서열중 적어도 한 개는 번역-후 수식, 예를 들면 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌에서 당화(glycosylation); 또는 거머리에서 유래된 폴리펩티드에서 공통적으로 발견되는 티로신에서 설파토- 혹은 포스포-군을 포함할 수 있다.

상기 폴리펩티드는 입술거머리(Rhychobdellida) 목의 거머리 종, 좀더 바람직하게는 플라코브델라(Placobdella) 속의 거머리 종, 특히 플라코브델라 파필리페라(Placobdella papillifera)로부터 만들 수 있다. 대안으로, 폴리펩티드는 화학적으로 합성하거나 또는 이들을 인코드하는 DNA 서열을 보유하는 외래유전자도입 미생물로 생산할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 핵산 서열; 이들 서열로 구성되는 벡터; 상기 벡터를 포함하는 숙주; 치료에서 상기 핵산과 폴리펩티드의 용도를 개시한다.

Description

보체 활성화의 저해물질, 이들의 제조 및 용도{INHIBITORS OF COMPLEMENT ACTIVATION, THEIR PREPARATION AND USE}

보체 시스템은 혈장 단백질의 일군으로, 이들의 주요 기능은 염증을 매개하고 외래 미생물을 제거하는 것이다. 이는 복합된 효소 캐스케이드를 형성하는데, 상기 캐스케이드는 활성화되면 화학주성 혈관운동성 아나필라톡신 C3a와 C5a; 옵소닌 C3b[이는 침입한 미생물을 둘러싸고 식세포에 의한 인식(다시 말하면, 면역 부착; 옵소닌은 세포를 둘러싸는 단백질이다)을 유발한다]; 세포분해성 "분자 공격 복합체"(이는 표적 세포를 직접적으로 분해시킨다)를 생성시킨다. 이는 국소적인 염증 반응을 유발하여, 혈관 투과, 혈관 수축, 백혈구 활성화와 이동, 평활근 수축을 초래한다.

모든 생리 기전과 마찬가지로 보체 역시 잘못 활성화될 수 있는데, 이런 경우 현저한 염증이 발생한다. 보체는 다양한 염증과 자가-면역 질환에 관여한다. 따라서, 이런 치료를 위한 보체 경로의 신규한 저해물질을 제공하고; 이식된 장기의 조직 거부반응을 감소시키고; 외래 표면, 예를 들면 혈액투석기와 심폐 이식 혈관 회로에서 보체 활성화를 저해하는 것이 바람직하다.

보체 활성화는 2가지 경로중 한 경로(고전적 경로와 대체 경로)를 통하여 일어날 수 있는데, 이들 경로는 C5라고 하는 단백질의 활성에서 합쳐지고 이후 공통루트를 따른다.

고전적 보체 경로의 제 1 파트는 다른 복잡한 효소 캐스케이드인 혈액 응고 캐스케이드와 유사하지만, 상기 혈액 응고 캐스케이드가 응혈 및 결과적으로 지혈을 유발한다는 점에서 상이하다. 고전적 경로의 활성화는 항체-피복된 표면 또는 다른 네거티브-하전된 표면에서 발생하는데, 여기에서 세린 프로테아제인 C1 에스테라제가 만들어진다. 이는 활성화된 보조인자(C4b)의 존재하에, 상기 캐스케이드에서 자이모겐(C2)을 특이적으로 절단한다(자이모겐은 세린 프로테아제에 대한 전구-효소다). 상기 캐스케이드는 결국 최종-산물에 이르게 되는데, 이 경우에는 표적 세포를 분해하는 막 공격 복합체다. 또한, 고전적 경로는 다양한 부산물을 파생시키는데, 이들 부산물 역시 생물학적 활성을 보이고 염증 반응을 증가시킨다.

대체 경로가 활성화되는 경우에, 자극은 일반적으로 박테리아 리포폴리사카라이드; 효모(자이모산) 또는 식물(이눌린) 폴리사카라이드; 다양한 다가음이온, 예를 들면 덱스트란 설페이트; 또는 IgA와 IgE를 비롯한 면역글로불린의 항체-결합 영역으로 제공한다. 이에 더하여, 대체 경로는 네거티브-하전된 인지질에 의해 활성화되는 것으로 보인다. 이들 인지질은 정상 상태에서는 세포막의 세포내면에서 발생하지만, 외상 혹은 활성화(혈소판의 경우)동안에는 외부 표면으로 이동한다.이들 표면은 건강한 개체에서도 낮은 농도로 순환하는 임의의 C3b와 결합할 수 있다. C3b는 순환 B 인자와 결합하고(하기 흐름도에서 도시함), 이후 상기 B 인자는 순환하는 세린 프로테아제인 D 인자에 의해 절단될 수 있는 형태로 존재하게 된다. 생성된 C3bBb 복합체는 강력한 C3 전환효소로, 이는 C3을 2개의 단편 C3a와 C3b로 절단한다. C3a는 강력한-염증 효과를 보인다. C3b는 활성화의 가속화를 초래하는 표면과 B 인자와의 복합화뿐만 아니라, C5 전환효소가 형성되는 C3bBb 복합체와의 결합에 가용하다. Bb와의 복합화에 필요한 양을 초과하여 활성화 초기 단계에 형성된 임의의 C3b는 외래 입자를 둘러쌈으로서 식세포에 의한 인식을 가능하게 한다. C3b-피복된 입자에 대한 식세포의 이런 증가된 친화도는 "면역 부착"이라 한다.

고전적 경로에 의한 보체의 활성화는 일반적으로 항원에 대한 항체 결합으로 개시되는 고성능 기전이다. 이런 기전에서, 예로써 감염을 제거하는데 충분한 활성화를 제공하기 위해서는 다수의 항체-항원 복합체가 형성되어야 한다. 이는 일반적으로 외래 물체에 대한 특이적 항체가 만들어지는 후기-단계 활성화와 연관한다. 반대로, 대체 경로의 활성화는 매우 낮은 농도의 항체에서 발생할 수 있고, 다양한 저해물질의 조절하에 낮은 비율로 자발적으로 발생한다. 따라서, 대체 경로는 고전적 경로와 달리 다량의 특이적 항체를 필요로 하지 않기 때문에, 활성화되는 제 1 보체 경로일 가능성이 높다.

정상적인 상태에서, 보체 활성화의 생리 역할은 침입한 미생물을 제거하여 감염을 방지하는 것이다. 하지만, 모든 생리학적 기전과 마찬가지로, 보체 활성화 역시 부적절하게 발생하여 이환율 및 사망률과 연관된 병리 이상을 초래할 수 있다. 이런 병리 이상중 일부는 조절 단백질중 한가지의 결핍으로 인해 발생할 수 있다. 가령, C1 저해물질 결핍은 유전성 혈관신경성 부종(Hereditary angioneurotic edema)으로 알려진 염증 질환을 초래한다. 다른 문제는 자가 항체(예, 류머티스 관절염과 같은 자가-면역 질환); 손상된 조직 혹은 세포(예, 겸상적혈구 세포 빈혈), 또는 외래 표면(예, 혈액투석기)에서 보체 활성화에 의해 유발된다. 이런 이상은 일반적으로 증상을 완화시킬 목적으로 치료되거나 또는 치료없이 방치되게 된다. 따라서, 보체 활성화를 저해하여 질환의 원인을 제거하는 수단이 필요하다.

외래 표면과의 접촉에 의한 혈액 효소 시스템의 활성화는 상세하게 기술되어 있다. 혈액 응고의 내인적 경로가 활성화될 뿐만 아니라, 보체 활성화도 일어난다. 셀룰로오스 혈액투석막은 C3과 C4의 분해 산물의 농도를 증가시키는데, 비록 대체 경로가 우세한 것으로 보이긴 하지만 이는 양 경로의 활성화를 시사한다[Innes A, Farrel AM, Burden RP, Morgan AG, Powell RJ. J Clin Pathol 47: 155-158(1994)]. 보체 활성화는 호중구 활성화를 주도하는 것으로 생각되는데, 이는 상기 과정의 부작용인 프로테아제 분비, 호중구 감소증, 폐동맥 고혈압을유발한다. 보체 경로의 활성화는 심장-폐 이식 혈관에 잘 알려져 있고, 호중구 촉진, 폐 손상, 혈관내피 기능장애의 주요 원인인 것으로 생각되는데, 이들 부작용은 이런 경로가 결핍된 개에서는 일어나지 않는다[Finn A, Morgan BP, Robuck N, Klein N, Rogers CA, Hibbs M, Elliott M, Shore DF, Evans TW, Strobel S, Moat N. J Thoracic Cardiovasc Surg 111:451-459(1996)].

면역계가 부적절하게 활성화되는 다른 예는 이식된 조직의 거부반응이다. 초급성 거부반응 문제를 극복할 수 있다면, 인간 공여 장기의 부족은 다른 종의 장기를 이용하여 완화시킬 수 있다(이종이식). 초급성 거부반응의 주요 매개체중 하나는 보체인데, 대체 경로 및 고전적 경로를 통한 이의 활성화는 내피세포 활성화, 혈전증, 혈관내 응고, 부종 및 최종적으로 이식된 장기의 기능 상실을 초래한다. 특히 심각한 문제는 다핵 백혈구의 축적에 의한 미세혈관 폐색이다. 보체 저해물질이 이들 문제에 대한 완벽한 해결책은 될 수 없지만 이들에 상당한 이점을 제공하고, 다른 면역억제제와 병용하면 효과적인 치료를 제공할 수 있다는 유력한 증거가 있다.

보체는 자가-면역 질환에서 활성화되는 것으로 알려지고 있다. 류머티스 관절염에서, C1 저해물질-C1 복합체와 C3a의 현저한 증가가 나타난다. 보체 활성화 산물의 증가는 질환 중증도 지수 및 호중구 활성화의 진단 마커(예, 락토페린)와 연관하고, 따라서 보체의 저해물질이 이런 자가-면역 질환의 보체-매개된 증상을 완화시킬 것으로 예상할 수 있다.

보체 활성화는 사람의 패혈증에서 상세하게 기술되어 있는데, 그 이유는 활성화 산물(다시 말하면, C3a, C3d, C5a, C4)이 증가하고 질환의 중증도 및 치명적 결과와 연관하기 때문이다. 5명 환자에 대한 조사에서, 정제된 C1 저해물질을 투여하였는데, 이는 보체 활성화의 약화 및 증상의 개선과 연관하였다[Hack CE, Voerman HJ, Eisele B, Keinecke H-O, Nuijens JH, Eerenberg AJM, Ogilvie A, Van Schijndel RJMS, Delvos U, Thijs LG. Lancet 339:378(1992)]. 보체 활성화 산물의 증가는 천식, 전신 루프스 홍반, 알츠하이머병, 겸상적혈구 세포 질환에서도 보고되고 있다.

보체를 저해하는 치료약물이 광범위한 소모성 질환에 처방되고 있긴 하지만, 아직 사람에게는 사용되지 않고 있다. 진드기 타액에서 대체 보체 경로, 특히 활성화 표면에 대한 C3b 침착의 저해물질이 보고되었다[Ribeiro JMC. Exp Parasitol 64: 347-353(1987)]. 유전자-조작된 가용성 사람 보체 수용체 1(sCR1)은 사구체신염의 동물 모델에서 신장 손상을 감소시키는 것으로 밝혀졌다[Couser WG, Johnson RJ, Young BA, Yeh G, Toth CA, Rudolph AR. J Am Soc Nephrology 5: 1888-189491995)]. 어쥬번트-유도된 관절염 쥐에서 관절내 주사는 관절 부종과 활막염을 감소시켰다[Goodfellow RM, Williams AS, Levin JL, Williams BD, Morgan BP. Clin Exp Immunol 110:45-52(1997)]. 이런 저해물질은 보체가 관계하는 다수의 다른 질환에서 잠재적으로 매우 유용할 수 있다.

많은 염증과 자가-면역 질환을 치료 또는 예방하는데 효과적인 치료약이 없기 때문에, 본 발명의 목적중 하나는 제약학적 또는 치료요법적 용도에 적합한 대체 보체 경로의 저해물질을 제공하는 것이다. 이를 위해, 외기생성 거머리로부터분리할 수 있는 신규한 폴리펩티드를 제공하는데, 상기 폴리펩티드는 보체 활성화의 대체 경로를 저해하면서도 고전적 경로에 의한 보체 활성화에는 전혀 영향을 주지 않는다.

본 발명은 예로써 포유동물 기생충 조직 혹은 분비물로부터 유래되고 적절하게 유전자-조작된 미생물의 배양으로 생산할 수 있는 대체 경로(alternative complement pathway)의 신규한 저해물질에 관한다.

X1-E-F-Q-D-X2-K-K-S-S-D-X3-E-T-L-E-L-R-X4-N-K-X5 [SEQ ID NO: 50];

여기서,

X2는 임의의 단일 아미노산, 특히 시스테인이고;

X3은 임의의 단일 아미노산, 특히 시스테인이고;

X4는 임의의 단일 아미노산, 특히 시스테인이고;

X5는 자연-발생 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열이고, 상기 서열중 적어도 한 개는 번역-후 수식, 예를 들면 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌에서 당화(glycosylation); 및/또는 거머리에서 유래된 폴리펩티드에서 공통적으로 발견되는 티로신에서 설파토- 혹은 포스포-군을 포함할 수 있다.

X1이 발린인 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 서열[SEQ ID NO: 50]로 구성되고, 여기서 성숙 폴리펩티드의 N-말단의 첫 21개 아미노산은 [SEQ ID NO: 1]으로 구성된다:

V-E-F-Q-D-X-K-K-S-S-D-X-E-T-L-E-L-R-X-N-K- [SEQ ID NO: 1].

좀더 바람직하게는, X, X2, X3, X4 각각이 상기 서열에서 시스테인인 폴리펩티드다.

특히, 폴리펩티드는 상기 서열[SEQ ID NO: 50]을 보유하고, 여기서 X5는 아미노산 서열[SEQ ID NO: 51]이다:

-N-T-S-K-C-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-X6 [SEQ ID NO: 51];

여기서, X6은 자연-발생 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열이고, 상기 서열중 적어도 한 개는 번역-후 수식, 예를 들면 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌에서 당화(glycosylation); 및/또는 거머리에서 유래된 폴리펩티드에서 공통적으로 발견되는 티로신에서 설파토- 혹은 포스포-군을 포함할 수 있다.

좀더 구체적으로, 폴리펩티드는 상기 서열[SEQ ID NO: 51]을 보유하고, 여기서 X6은 아미노산 서열[SEQ ID NO: 54 및 21 내지 23]이다:

-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R [SEQ ID NO: 54];

-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 21];

-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 22];

-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 23];

본 발명의 제 2 구체예에서, 폴리펩티드는 다음의 서열[SEQ ID NO: 60]을 보유한다:

X7-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-X8-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-X9-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-X10 [SEQ ID NO: 60]

여기서, X7은 수소 원자 또는 자연-발생 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열이고, 상기 서열중 적어도 한 개는 번역-후 수식, 예를 들면 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌에서 당화(glycosylation)를 포함할 수 있고;

X8은 D 또는 E이고;

X9는 T 또는 I이고;

X10은 -D-E-D-K 또는 -E-D-K이고;

특히, [SEQ ID NO: 60]에서 X7은 [SEQ ID NO: 30]에서와 같이 X8이 D이고, X9가 T이며, X10이 -D-E-D-K인 펩티드:

-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 30];

[SEQ ID NO: 31]에서와 같이 X8이 D이고, X9가 I이며, X10이 -D-E-D-K인 펩티드:

-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 31];

또는, [SEQ ID NO: 32]에서와 같이 X8이 E이고, X9가 I이며, X10이 -E-D-K인 펩티드:

-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 32]와 결합한다.

바람직하게는, X7은 [SEQ ID NO: 61]이고:

X11-C-N-E-A-Q-C-R- [SEQ ID NO: 61];

여기서, X11은 G-; Q-G-; [SEQ ID NO: 62]에서 선택되고:

X12-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G- [SEQ ID NO: 62];

여기서, X12는 수소 원자 또는 [SEQ ID NO: 63]이고:

X13-N-T-S-K-C- [SEQ ID NO: 63];

여기서, X13은 [SEQ ID NO: 50]이다.

좀더 바람직하게는, X12가 수소 원자인 경우, X7은 상기 정의한 바와 같이 [SEQ ID NO: 30] 펩티드에 결합하고, 이때 X11은 상기 정의한 바와 같이 G(즉, [SEQ ID NO: 18]); Q-G(즉, [SEQ ID NO: 21]); 또는 [SEQ ID NO: 62](즉, [SEQ IDNO: 24])이다:

G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 18];

Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 21]; 또는

E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 24];

여기서, X7은 상기 정의한 바와 같이 [SEQ ID NO: 31] 펩티드에 결합하고, 이때 X11은 상기 정의한 바와 같이 G(즉, [SEQ ID NO: 19]); Q-G(즉, [SEQ ID NO: 22]); 또는 [SEQ ID NO: 62](즉, [SEQ ID NO: 25])이다:

G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 19];

Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 22]; 또는

E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 25];

여기서, X7은 상기 정의한 바와 같이 [SEQ ID NO: 32] 펩티드에 결합하고, 이때 X11은 상기 정의한 바와 같이 G(즉, [SEQ ID NO: 20]); Q-G(즉, [SEQ ID NO: 23]); 또는 [SEQ ID NO: 62](즉, [SEQ ID NO: 26])이다:

G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 20];

Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 22]; 또는

E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 25].

본 발명의 폴리펩티드에는 또한, 이들과 실질적으로 동일한 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 이들의 유도체가 포함된다. 본원의 '유도체'에는 후술한 리더 또는 시그널 서열을 추가로 포함하는 서열과 같은 생체전구체; 번역후 과정 또는 시스테인 잔기간 이황화-결합의 형성에 의해 변형된(예, 당화, 황산화 또는 인산화) 서열과 같은 변형체; 이황화-결합된 이중-사슬 유사체, 또는 한 개이상의 아미노산이 치환된 서열(예, 다형성)과 같은 유사체; 동소체; 절두된 또는 신장된 형태; 앞선 밝힌 것의 염이 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드는 질량 분광 측정에서 7,000-17,000 Da, 바람직하게는 15,000-17,000 Da의 분자량을 갖는데, 이는 전술한 번역-후 수식으로 인해 앞서 명시된 서열의 아미노산 총합보다 크다.

[SEQ ID NO: 50]과 [SEQ ID NO: 60]으로 구성되는 130개-아미노산 폴리펩티드가 바람직하다. 상기 130개-아미노산 폴리펩티드가 대략 14,500 달톤의 분자량 및 [SEQ ID NO: 15-17]에서 선택되는 서열을 보유하는 경우에 특히 바람직하다:

MALDI 질량 분광 측정과 같은 질량 분광 광도법에 의한 분자량 수치에는 번역-후 수식이 포함되는데, 그 이유는 전술한 폴리펩티드가 번역-후 과정에 의해 변형되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있기 때문이다. 가령, SEQ ID NOS: 15-17에 대하여 22-24번 위치에서 모티프 N-T-S에서 만들어지는데, 이는 잠재적인 N-결합 당화를 위한 공지된 부위다. 따라서, 본 발명에는 아스파라긴-22의 4번-아미드 또는본원에서 밝힌 다른 서열에서 등가의 위치에 결합된 탄수화물 성분을 포함함으로써 상기 정의된 폴리펩티드로부터 '유도가능한' 상기 서열의 폴리펩티드가 포함된다. 이런 탄수화물 성분은 단일 또는 분지된 사슬 형태의 12개이하(≤12) 당 또는 당 유도체를 포함할 수 있다. 이에 더하여, 본원의 펩티드는 티로신 잔기의 측쇄에 설페이트 또는 포스페이트-성분의 부착으로, 상기 정의된 폴리펩티드로부터 '유도가능'하다. 이는 거머리에서 유래되는 단백질의 공통적인 특징으로, 여기서 티로신의 방향족 고리는 일반적으로 4번-위치에서 설페이트-또는 포스페이트-성분의 부착으로 변형시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에는 SEQ ID NOS: 15-17의 119, 120 및/또는 122번 위치, 또는 본원에서 밝힌 다른 서열의 등가의 위치에서 1개, 2개 또는 3개의 티로신 잔기가 황산화 또는 인산화, 특히 황산화되는 서열이 포함된다.

안티스타신(antistasin)과 같은 다른 비슷한 폴리펩티드에 대한 유사점에 비추어[Nutt E, Gasie T, Rodkey J et al. J Biol. Chem 263: 10162-10167(1988)], 본 발명의 폴리펩티드는 예로써 SEQ ID NOS: 15-17의 63과 64번 위치사이에 "활성 부위"를 보유할 가능성이 높은 것으로 추정할 수 있다. 안티스타신은 이 위치에서 표적 프로테아제인 Xa 인자에 의해 절단되기 때문에, 본 발명의 폴리펩티드 역시 추정 "활성 부위"에서 단백분해의 기질이 될 가능성이 높다[Dunwiddie C, Thromberry, NA, Bull HG, et al. J Biol Chem 264: 16694-16699(1989)]. 안티스타신의 경우, 표적 프로테아제인 Xa 인자에 의한 절단에서 상동성 폴리펩티드가 만들어지는데, 여기서 단일 펩티드 결합이 절단된다. 이런 절단에서 기존의 이황화 결합에 의해 묶여지는 2개의 사슬로 구성된 폴리펩티드가 산출되고, 표적 효소에대한 저해 효과는 유지된다. 따라서, 63번 위치에서 아르기닌과 64번 위치에서 리신, 또는 절두된 서열에서 등가의 아르기닌-리신 결합을 포함하는 모든 서열로부터 '유도가능한' 2개-사슬 유사체가 존재할 수 있다고 추정할 수 있다. 2개 사슬은 이황화-결합에 의해 묶여지고, 따라서 이들 유사체들은 보체 활성화의 대체 경로를 저해할 가능성이 높다. 이런 경우에, SEQ ID NO: 16의 취약한 펩티드 결합 추정 위치 63과 64는 다음의 단편에서 화살표로 표시한다:

60 ↓ 70

...........N - E - A - Q - C - R - K - L - C - W - Y - G - F...........

본원에서 "생체전구체"는 생체내 또는 다른 사용 조건하에 본 발명의 폴리펩티드로 전환되는 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 본 발명에는 폴리펩티드가 생체내에서 발현될 때 리더 또는 시그널 서열이 존재하는 경우, 특히 리더 서열이 고유 리더 서열 M-K-Q-V-A-L-L-F-I-I-L-G-S-V-V-L-A [SEQ ID NO: 38]; 또는 벌침독 멜리틴의 서열 M-K-F-L-V-N-V-A-L-V-F-M-V-V-Y-I-S-Y-I-Y-A [SEQ ID NO: 39]로 구성되는 경우가 포함된다.

고유 리더 서열을 포함하는 [SEQ ID NOS: 15-17]에 대하여 전술한 폴리펩티드는 각각 [SEQ ID NOS: 10-12]에 도시한다.

본 발명에 포함되는 폴리펩티드는 임의의 적합한 비-독성 금속이온, 또는 유기 혹은 무기 산ㆍ염기로 염, 바람직하게는 제약학적으로 수용가능한 염으로 만들 수 있다. 이런 무기산에는 염산, 브롬산, 황산, 염산 및 산성 금속 염(예, 나트륨 모노하이드로겐 오르토포스페이트와 칼륨 하이드로설페이트)이 포함된다. 유기산에는 단일-, 이중-, 삼중- 카르복실산, 예를 들면 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루빈산, 술폰산등이 포함된다. 염기에는 암모니아; 일차, 이차, 3차 아민; 4차 암모늄염이 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 입술거머리(Rhychobdellida) 목의 거머리 종, 좀더 바람직하게는 플라코브델라(Placobdella) 속의 거머리 종, 특히플라코브델라 파필리페라(Placobdella papillifera)로부터 만들 수 있다. 대안으로, 폴리펩티드는 화학적으로 합성하거나 또는 이들을 인코드하는 DNA 서열을 보유하는 외래유전자도입 미생물에서 생산할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 적절한 완충액에서, 예로써 실질적인 전체 거머리의 균질화로 거머리 조직이나 절편, 또는 타액선이나 주둥이등으로부터 추출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 거머리 조직 또는 절편으로부터 유래가능한 대체 보체 경로의 저해물질을 제공한다. 본원에서 '유래가능한'에는 추출 또는 정제에 의해 직접적으로 유도되는 물질을 비롯하여 직접적으로 유도된 물질에 가해진 공정의 물리적-, 화학적- 또는 유전적으로-조작된 산물로 간접적으로 유도되는 또는 화학적으로-변형된 유도체로 전환되는 물질이 포함된다. 폴리펩티드는 통상적으로 당분야에 공지된 기술, 예를 들면 이온 교환, 겔 여과 및/또는 역상 크로마토그래피를 병용하여 추출 또는 정제한다.

동일 속 또는 동일 종의 거머리는 타액선에, 동일한 생화학적 효과 및 높은 상동성의 아미노산 서열을 갖는 한 개이상의 폴리펩티드를 보유한다. 이에 더하여, 동일 종의 거머리에 특정 폴리펩티드의 몇몇 상이한 동소체가 존재할 수 있는데, 이들은 단지 수개의 아미노산에 의해 차이가 난다. 따라서, 본 발명에는 대체 보체 경로를 저해하는 폴리펩티드 유도체가 포함되는데, 여기서 상기 폴리펩티드상의 아미노산과 기재된 아미노산 서열의 차이는 20% 이하다. 20% 수치는 다른 거머리 단백질인 히루딘(hirudin)의 다수 유사체가 히루도 메디시나일스(Hirudo medicinalis)에서 자연적으로 생성된다는 사실에 기초한다; 폴리펩티드에서 65개아미노산중 15개 아미노산에서 다양한 변화가 일어난다. 또한, 폴리펩티드의 약리학적 활성을 간섭하지 않는다는 조건에서 폴리펩티드 사슬에 한 개이상의 아미노산을 삽입할 수 있다(신장된 형태). 따라서, 본 발명에는 N- 또는 C-말단의 한 두 개 아미노산이 결실된 절두된 폴리펩티드 형태가 포함된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 이런 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열로 구성되는 발현 벡터로 형질전환된 숙주를 제공하고, 이렇게 수득된 폴리펩티드를 선택적으로 분리함으로써 제조할 수 있다. 이런 방식은 통상적으로, 발현하기 원하는 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 수득하고, 상기 폴리펩티드를 재조합 미생물에서 발현시키는 것에 기초한다. 유전자-조작된 미생물의 배양은 완전한 생리활성을 보이는 소요 산물의 생산을 결과한다. 따라서, 본 발명에는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 폴리펩티드가 포함된다. 또한, 본 발명에는 합성된 또는 단백질-조작된 폴리펩티드가 포함된다.

또한, 본 발명은 다음과 같이 구성되는 핵산 서열, 특히 분리된, 정제된 또는 재조합된 핵산 서열을 제공한다:

(a) 본 발명에 포함되는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열;

(b) 엄격한 조건하에 (a) 서열과 실질적으로 상동한 또는 이와 하이브리드를 형성하는 서열;

(c) 유전자 코드 축중(degeneracy)을 제외하고 (a) 또는 (b) 서열과 실질적으로 상동한 또는 이와 하이브리드를 형성하는 서열;

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c) 서열중 임의 하나에 대하여 특이적인 올리고뉴클레오티드.

본원에서 "실질적으로 상동한"은 최대 6개의 염기가 결실 또는 부가될 수 있다는 조건하에, 서열상의 대합 위치에서 핵산 서열이 (a) 서열의 염기와 80%이상의 상동성을 갖는다는 것을 의미한다. 서열은 바람직하게는 (a) 서열과 90%이상의 상동성, 좀더 바람직하게는 95%이상의 상동성을 갖는다. 이런 상동성 서열은 본 발명의 단백질과 실질적으로 동일한 생리 활성을 갖는 단백질을 인코드한다.

(a), (b) 또는 (c) 서열중 임의 하나에 "대하여 특이적인" 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 생리학적 활성 펩티드를 동정 및 분리하는데 유용하고, 상기 펩티드의 아미노산 서열의 단편을 인코드하는 특이적인 서열로 구성된다. 여기에는 하기 실시예 4에 제시된 [SEQ ID NOS: 33-36]; 하기 실시예 5에 제시된 [SEQ ID NO: 37]이 포함된다.

구체적으로, 본 발명은 전술한 핵산 서열을 제공하는데, 여기서 상기 서열은 DNA 또는 RNA 서열, 예를 들면 cDNA 또는 mRNA이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 다음에서 선택되는 DNA 서열을 제공한다: [SEQ ID NO: 6]으로 제시된 DNA 서열, 이는 [SEQ ID NO: 10]으로 동정된 폴리펩티드에 상응하고, [SEQ ID NO: 10]은 시그널 서열 [SEQ ID NO: 38] 및 [SEQ ID NO: 15]로 구성되는 폴리펩티드와 동일하다; [SEQ ID NO: 7]로 제시된 DNA 서열, 이는 폴리펩티드 [SEQ ID NO: 16] 및 시그널 서열로 구성되는 [SEQ ID NO: 11]로 동정된 폴리펩티드와 상응한다; DNA 서열 [SEQ ID NO: 8]과 [SEQ ID NO: 9], 이들은 서로에 대하여 다형이고, 각각 폴리펩티드 [SEQ ID NO: 17] 및 시그널 서열로 구성되는 폴리펩티드 [SEQ ID NO: 12]를 인코드한다. 특히 바람직한 DNA 서열은 폴리펩티드 [SEQ ID NO: 16] 및 벌침독 멜리틴 시그널 서열 [SEQ ID NO: 39]를 인코드하는 [SEQ ID NO: 13]이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음과 같이 구성된다:

(a) 전체 거머리, 또는 입술거머리(Rhychobdellida) 목의 거머리, 바람직하게는 플라코브델라(Placobdella) 속의 거머리, 예를 들면 플라코브델라 파필리페라(Placobdella papillifera)로부터 얻은 조직 혹은 추출물로부터 분리 및/또는 정제; 또는

(b) 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열의 발현 및 선택적으로, 생성된 폴리펩티드의 분리 및/또는 정제.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 임의의 핵산 서열로 구성되는 재조합 구조체; 이런 구조체로 구성되는 벡터; 이런 벡터에 의해 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하도록 유전자- 또는 단백질-조작된 세포, 세포주, 플라스미드, 살아있는 미생물 또는 다른 운반체를 제공하는데, 상기 세포, 세포주, 플라스미드, 살아있는 미생물 또는 다른 운반체는 본원에 개시된 서열을 발현가능하도록 보유한다. 이런 세포에는 본원에 언급된 이상을 치료 또는 예방하기 위한 유전자 요법에 사용되는 동물 세포, 예를 들면 포유동물 세포, 특히 사람 또는 인화 세포가 포함된다.

다른 측면에서, 본 발명은 본원에 언급된 이상 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 여기서 폴리펩티드는 환자 세포에서 발현되도록 하는 수단으로 투여되고, 상기 세포는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 발현가능하도록 보유한다. 유전자 요법에 대안 대안으로, 본 발명의 폴리펩티드는 제약학적 제형으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 유전자 요법을 비롯한 의약에서 본원에서 밝힌 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 용도; 약물의 제조에서 이런 폴리펩티드의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면에서 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 구성되는 제약학적 제형을 제공한다. 본원에서 "제약학적으로 수용가능한 담체"는 임의의 불활성, 비-독성, 고체 혹은 액체 충진제, 부형제 혹은 캡슐화제, 또는 환자 혹은 활성 성분에 부작용을 야기하지 않는 다른 부형제를 의미한다.

이런 제형과 담체는 당분야에 공지된 것으로, 여기에는 환자에 전신적으로, 예를 들면 장관외, 경구, 국소 투여할 수 있는 제약학적 제형이 포함된다.

본원에서 '장관외'에는 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 기관내 주사 및 주입이 포함된다. 장관외 제형은 환약 형태로 또는 연속 주입으로 정맥내 투여하거나, 또는 공지된 절차에 따라 피하 투여한다. 장관외 용도로 공지된 바람직한 액체 담체에는 멸균수, 식염수, 수성 덱스트로스, 설탕물, 에탄올, 글리콜, 오일이 포함된다.

경구 투여용 정제와 캡슐은 통상적인 부형제, 예를 들면 결합제, 충진제, 윤활제, 습윤제등을 함유할 수 있다. 경구 액체 제형은 수성 혹은 지성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽, 엘렉시르등의 형태로, 또는 물 혹은 사용하는데 적합한 다른 운반체로 재구성되는 건조 산물로 제공할 수 있다. 이런 액체 제형은 통상적인 부형제, 예를 들면 현탁제, 에멀젼화제, 비-수성 운반체, 방부제를 함유할 수도 있다.

국소 이용에 적합한 제형은 수성 혹은 지성 현탁액, 용액, 에멀젼, 겔, 또는 바람직하게는 에멀젼-기초한 좌약 형태로 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 제약학적 제형의 단위 약량은 일일 필요량의 폴리펩티드, 또는 소요 약량을 충족하는 다중-약량을 함유할 수 있다. 임의 환자(사람과 같은 포유동물)에 치료요법적으로 수용가능한 최적 용량 및 투여 빈도는 다양한 요인, 예를 들면 활성 성분의 효능; 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강 상태, 성별, 식습관; 투여 시간과 경로; 제거 속도; 치료 목적(예, 치료 또는 예방); 치료할 질환의 특성에 따라 달라진다. 효과적인 전신 약량은 0.005 내지 50㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.005 내지 10㎎/㎏ 체중, 좀더 바람직하게는 0.005 내지 1㎎/㎏ 체중이다. 치료할 질병의 특성에 따라, 단일 약량은 전신적 또는 국소적으로 투여되는 지에 상관없이 0.005 내지 10㎎/㎏ 체중 범위의 활성 성분으로 구성될 수 있다.

본원의 폴리펩티드는 비-항체-피복된 적혈구의 대체 보체-매개된 용혈을 저해하고, 또한 코브라 독 인자에 의해 유도된 돼지쥐 적혈구의 보체-매개된 용혈을 저해할 수 있다. 본원의 폴리펩티드는 대체 경로에 대하여 극히 선택적인데, 그 이유는 이들이 대체 경로를 50% 저해하는 농도의 100배이상 농도에서 고전 경로에의한 보체의 항체-매개된 활성화에 전혀 영향을 주지 않기 때문이다. 게다가, 이들은 프로트롬빈 시간 또는 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 측정에서 사람 혈장의 응고 시간 및 대체 경로를 50% 저해하는 농도의 100배이상 농도에서 스트렙토키나제가 사람 혈장 덩어리를 용해시키는데 필요한 시간에 별다른 영향을 주지 않는다. 이들 실험의 세부적인 내용은 하기 실시예에 제시한다.

본 발명의 폴리펩티드는 보체 활성화의 대체 경로에서 하나이상의 단계를 선택적으로 저해한다. 또한, 이들은 사람 혈장이 코브라 독 인자에 의해 활성화될 때 C3a 생산을 저해하기 때문에, 가장 적합한 작용 위치는 대체 경로의 필수 매개물질인 프로테아제 D 인자 또는 C3bBb 복합체중 한가지 또는 둘 모두를 저해하는 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 측면에서 보체 D 인자 및/또는 C3bBb 복합체와 상호작용(예, 저해 또는 결합)하는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 환자에서, 특히 혈액투석 또는 심-폐 혈관이식; 유치 도관(in-dwelling catheter) 또는 동맥내 스턴트가 존재하는 경우; 이식된 조직 또는 장기의 거부 반응; 루프스 홍반과 같은 자가-면역 질환; 류머티스 관절염; 사구체신염; 신염; 신장병; 패혈증; 또는 심장 마비와 발작에서 발생하는 허혈이후 재관류에 의해 조직에 야기된 손상에서 대체 보체 경로의 유해한 활성화를 저해하는데 효과적으로 사용할 수 있다. 생물학적 유체에서 활성화된 성분 혹은 이들의 복합체 및/또는 질병 조직에서 이들의 침착으로 판단할 때, 보체의 활성화와 관련된 아나필락시스, 천식, 피부 반응, 감염, 겸상 적혈구 빈혈, 용혈성 빈혈과 같은 다른 이상 역시 본 발명의 폴리펩티드로 치료할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 보체 활성화의 개시를 예방하기 위하여 혈액에 노출되는 인공보철물 또는 체외 순환계에 본 발명에 따른 폴리펩티드의 공유 복합체를 제공한다.

이에 더하여, 상기 폴리펩티드는 상승 작용으로 이식편 거부반응을 감소시킬 수 있는 면역억제제, 스테로이드 또는 효능을 증가시키는 비-스테로이드성 항-염증 약물과 병용할 수 있다. 본원에서 "병용"은 한가지이상의 면역억제제 및/또는 항-염증성 약물과 함께 본 발명에 따른 폴리펩티드의 동시 혹은 순차적 투여를 의미한다.

또한, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 폴리펩티드의 치료용도; (b) 약물 제조에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 용도; (c) 환자에서 질환을 치료 및 예방하는 방법, 상기 질환은 대체 보체 경로의 활성화와 연관하고, 상기 방법은 상기 환자에 본 발명에 따른 폴리펩티드의 비-독성 저해량을 투여하는 것으로 구성된다; (d) 고전적 및/또는 응혈(혈액 응고) 경로에 비하여, 보체 활성화의 대체 경로에 선택적인 저해에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 용도를 제공한다.

본 발명은 다음의 실시예를 참고로 하여 구체적으로 설명한다.

실시예 1 - 플라코브델라 파필리페라( Placobdella papillifera ) 추출물의 대체 보체 저해 활성

보체 저해 요인을 확인하기 위하여, 거머리 추출물을 준비하고 대체 보체에대한 용혈 분석으로 분석한다(AP₅₀). 추출물 준비에서, 플라코브델라 파필리페라(Placobdella papillifera)의 타액선은 인산염 완충용액(PBS)(pH 7.4, 0.5㎖)(Sigma-Aldrich Company Ltd., Fancy Road, Poole, Dorset, UK)에 균질화시키고 3분동안 13,000rpm에서 원심분리하여 조직 잔해를 제거한다. 산 시트레이트 덱스트로스(ACD)(20%v/v)(Harlan Sera-lab Ltd., Dodgeford Lane, Belton, Loughborough, Leicestershire, UK)에서 토끼 적혈구는 아이스-냉각 ACD(Sigma-Aldrich)에서 2회 세척, 7mM MgCl₂, 10mM EGTA(Sigma-Aldrich 상표, pH 7.2)(이후, VCM-MEG)로 보충된 Gelatin Veronal Buffer(GVB)(Sigma-Aldrich, UK)에서 3회 세척하고, 이후 부유시키고 10분동안 2,000rpm에서 원심분리한다. 적혈구는 사용하기에 앞서, VCM-MEG에 재-부유시킨다(1% v/v). 동결-건조된 사람 혈장(5㎖)(Sigma-Aldrich, UK)은 5㎖ 아이스-냉각 VCM-MEG에 재부유시키고 분석을 위하여 희석한다(1:4).

용혈 분석은 PBS 또는 추출 상층액(0.03㎖), 희석된 혈장(0.075㎖), 토끼 적혈구(0.075㎖), VCM-MEG(0.045㎖)를 함유하는 미세역가 평판에서 실시한다. 평판은 37℃에서 45분동안 배양하고, 이후 EDTA(0.2M, 0.0225㎖)를 용혈 웰에 첨가하여 반응을 중단시킨다. 샘플은 원심분리하고, 상층액의 흡수도는 미세역가 평판 판독기로 405nm에서 읽는다. 실험 웰에서 용혈 정도는 완전히 용해된 세포(이는 수중에서 만들어진다); 비-용해된 세포(여기서, 혈장은 VCM-MEG로 대체된다)와 비교하여 평가한다. 일반적으로 사용되는 혈장(보체)의 농도는 완충액 대조군에 비하여,70% 적혈구 용해를 야기한다. 거머리 추출물은 이런 비율을 감소시키는데, 이는 거머리 추출물이 대체 보체 저해 활성을 갖는다는 것을 시사한다(표 1).

표 1

추출물 405nm에서 흡수도 용해%

완전 용해된 세포 1.053 100.0%

PBS(대조군) 0.739 70.2%

플라코브델라 파필리페라 0.021 2.0%

실시예 2 - 플라코브델라 파필리페라( Placobdella papillifera )로부터 활성 폴리펩티드의 추출/정제

활성 폴리펩티드를 정제하기 위하여, 이온 교환 크로마토그래피와 겔 여과를 병행한다. 50종의 플라코브델라 파필리페라(Placobdella papillifera)에서 얻은 타액선은 20mM Tris HCl 완충액(pH 8.0, 6㎖)에서 균질화시킨다. 원심분리후, 상층액은 HiPrep^®16/10 Q XL 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Amersham Plce, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)에 가하고, 이는 20mM Tris HCl(pH 8.0)에서 평형화시킨다. 결합된 단백질은 10 칼럼 부피에서 출발 완충액에서부터 1M NaCl을 함유하는 20mM Tris HCl(pH 8.0)까지 선형 구배로 용출시키고, 280nm에서 흡수도로 검출한다. 분취물은 실시예 1에서 밝힌 AP₅₀방법으로 분석한다. 저해 활성을 보이는 분취물은 대략 0.56과 0.83M NaCl 사이에서 용출된다.

이들 분취물은 20mM 포름산나트륨 완충액(pH 4.0)에 투석하고, HiTrap^®SP Sepharose Fast Flow의 1㎖ 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech, UK)에 가하고, 10 칼럼 부피에서 20mM 포름산나트륨(pH 4.0)에서부터 1M NaCl을 함유하는 동일 완충액까지 선형 구배로 용출시키고, 단백질은 280nm에서 흡수도로 검출한다. AP₅₀분석에서 저해 활성은 0.1과 0.63 M NaCl에서 나타난다.

활성 피크를 보유하는 분취물은 동결건조시키고, 물(2㎖)에서 재구성하고, PBS(pH 7.4)에서 평형화시킨 Superdox^TM75 prep. 등급의 XK 16/30 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech, UK)에 가한다. AP₅₀분석에서 저해 활성 대략 0.49 칼럼 부피에서 나타난다.

저해 활성을 보이는 분취물은 20mM 포름산나트륨(pH 4.0)에 투석하고, Mini S^®PE 4.6/5 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech, UK)에 가한다. 25 칼럼 부피에서 20mM 포름산나트륨(pH 4.0)에서부터 1M NaCl을 함유하는 동일 완충액까지 선형 구배는 대략 0.22M NaCl에서, 저해 활성을 보유하는 하나의 주요 피크를 용출시킨다.

주요 피크를 보유하는 분취물을 Superdox^TM75 prep. 등급의 XK 16/30 칼럼에 가하고 PBS(pH 7.4)로 용출시키면, 대략 0.49 칼럼 부피에서 별개의 피크가 생성되는데, 이는 저해 활성을 보유한다. 상기 피크는 1㎖ RESOURCE^TMRPC 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech, UK)의 역상 HPLC에서 단일 성분을 보유한다.

실시예 3 - 활성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 분자량

실시예 2에 따라 정제된 활성 분취물은 아미노산 서열분석한다. N-말단에 분명한 아미노산 서열이 존재한다. 첫 21개 아미노산 서열[SEQ ID NO:1]은 다음과 같다: V-E-F-Q-D-X-K-K-S-S-D-X-E-T-L-E-L-R-X-N-K- [SEQ ID NO:1]

여기서, 각 X는 확인할 수 없는 단일 아미노산을 나타내고, 따라서 각 X는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

좀더 많은 아미노산 서열을 동정하기 위하여, 실시예 2의 활성 분취물의 동결건조 샘플은 프로테아제로 절단한다. 이후, 대략 0.01㎎ 동결건조된 분취물은 8M 우레아에 녹이고, 0.4M 중탄산나트륨(25㎕)과 0.045M 디티오트레이톨(5㎕)을 첨가하고, 샘플은 50℃에서 15분동안 배양한다. 시스테인 잔기는 0.1M 요오드아세트아미드(5㎕)를 첨가하여 카르복시메틸화시킨다. 샘플은 물(60㎕)로 희석하고, 0.1㎍/㎖ Lys-C 또는 Asp-N 엔도프로테아제(4㎕)(Sigma-Aldrich, UK)를 첨가하고, 샘플은 37℃에서 24시간동안 배양한다. 반응은 -20℃에서 동결시켜 중단시킨다. 절단된 펩티드는 1㎖ RESOURCE^TMRPC 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech, UK)에서 역상 HPLC로 분리하고, 아미노산은 서열분석한다. 다음의 펩티드가 동정되었다:

Lys-C 엔도프로테아제 절단[SEQ ID NO:2]:

L-X-W-Y-G-F-T-T-

Asp-N 엔도프로테아제 절단[SEQ ID NO:3]:

X-E-Y-G-X-K-R-X-L-X-Q-G-X-N-E-A-Q-X-R-K-

활성 분취물의 분자량은 MALDI 질량 분광 분석에서 대략 16,180 달톤으로 추정되었다.

실시예 4 - 활성 폴리펩티드를 인코드하는 cDNA의 클로닝과 서열분석

실시예 3에서 동정된 아미노산 서열(즉, [SEQ ID NO:3])은 이들 폴리펩티드를 인코드하는 cDNA가 동결된 타액선으로부터 클론되고 서열분석되도록 하는 올리고뉴클레오티드의 고안을 가능하게 한다. 플라코브델라 파필리페라(Placobdella papillifera)에서 얻은 타액선(대략 150㎎)은 Micro(A) Pure 키트(Ambion Inc., 2130 Woodward Street, Austin, Texas, USA)에서 밝힌 바와 같이 구아니딘 티오시아네이트 용균 용액(1㎖)에서 해동시킨다. 균질화후, 희석 완충액(1㎖)(Ambion, USA)을 첨가하고 혼합하고, 상층액은 4℃에서 15분동안 12,000g에서 원심분리하고 이후 수거한다. 폴리 A + RNA는 Ambion Micro(A) Pure 키트에서 밝힌 방법에 따라, 올리고 dT에서 추출하고 용출시킨다. 상보성 DNA 가닥은 cDNA 증폭 키트(Clontech Laboratories UK Ltd., Unit 2, Intec 2, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, UK)를 이용한 역상 전사로 작제하고, 제 2 가닥 cDNA는 T4 DNA 중합효소(Clontech, UK)로 합성한다. 생성된 이중-가닥 DNA는 페놀/클로로포름에서 추출하고 에탄올에 침전시키고 멸균수에 재-용해시킨다.

5'와 3'cDNA 말단의 분리는 Marathon Adaptor 서열(Clontech)을 결찰시켜 용이하게 한다. 5'말단은 Taq 중합효소(Life Technologies Ltd., 3 Fountain Drive,Inchinnan Business Park, Paisley, UK), AP1 프라이머(Clontech, UK) 및 실시예 3에서 밝힌 Asp-N 엔도도펩티다제 펩티드로부터 고안된 축중 프라이머:

GC(CT) TC(AG) TT(AG) CA(AGCT) CC(CT) TG(AG) CA [SEQ ID NO:33]로 중합효소 연쇄 반응(PCR)시켜 동정한다. 대략 300 염기쌍의 DNA 단편은 분리되는데, 이는 Qiagen QIA quick PCR 정제 키트로 정제하고, 서열분석이 가능한 함량을 증가시키기 위하여 플라스미드 벡터 pCR^®2.1-TOPO^TM(TOPO^TMTA Cloning^®kit)(Invitrogen BV, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Netherlands)에 결찰시킨다. 생성된 재조합 플라스미드는 콤피던트 대장균(Escherichia coli)(TOP10)에 도입하고, QIAprep Spin Miniprep Kit로 대량의 재조합 클론과 플라스미드 DNA를 생산한다. 플라스미드는 서열분석하는데, 펩티드[SEQ ID NOS: 1, 3]으로부터 예상되는 서열을 보유하는 서열은 [SEQ ID NO:4]로 동정되었다.

이는 유전자-특이적 프라이머의 고안을 가능하게 하는데, 상기 프라이머는 펩티드의 3'-말단을 수득하는데 사용한다. 비대칭 PCR 방식은 상기 cDNA(5㎕), 10x PCR 반응 완충액(Life Technologies, UK)(5㎕), 10mM dNTP 혼합물(1㎕), 1.5mM MgCl₂(1.5㎕), 0.01mM 유전자-특이적 프라이머(1㎕):

GGG GTC GGT AGT TTT GGC GGT AGA G [SEQ ID NO: 34], Taq 중합효소(0.5㎕), 물(36㎕)을 함께 배양함으로써, 1개의 프라이머를 이용하여 특이적 산물을 대량 생산하는데 사용된다. 반응 혼합물은 94℃에서 2분동안 변성시키고, 다음과 같은 Techne Genius Thermal Cycler에서 순환시킨다: 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 1분 - 15회 반복; 최종적으로 72℃에서 10분. 이후, 반응 혼합물은 유사한 조건하에 어댑터 프라이머 1(Clontech, USA) 및 유전자-특이적 프라이머를 이용한 PCR 반응에서 주형으로 사용한다. 대략 600개 염기쌍의 DNA 단편이 분리 및 정제되는데, 이는 플라스미드 벡터 pCR^®2.1-TOPO^TM(TOPO^TMTA Cloning^®키트)(Invitrogen, The Netherlands)에 결찰시켜, 대량의 재조합 클론을 전술한 바와 같이 만든다. 플라스미드는 서열분석하는데, 펩티드[SEQ ID NOS: 1, 3]로부터 예상되는 서열을 보유하는 서열은 [SEQ ID NO:5]로 동정되었다. 상기 동정된 2개의 cDNA 서열 [SEQ ID NOS: 4]와 [SEQ ID NOS: 5]로부터, 본 발명의 한 구체예에 상응하는 폴리펩티드의 아미노산 서열(즉, [SEQ ID NOS: 10])을 추정할 수 있었다.

어뎁터-결찰된 cDNA로부터 펩티드의 전체 코딩 영역을 증폭하기 위하여, 상기 동정된 DNA 서열을 이용하여 2개의 유전자-특이적 프라이머를 추가로 합성한다. 이들은 다음의 PCR 반응에 사용한다: 상기 cDNA(5㎕), 10x PCR 반응 완충액(5㎕, Life Technologies), 10mM dNTP 혼합물(1㎕), 1.5㎖ MgSo₄(1㎕), 0.01mM 유전자 특이적 프라이머(1㎕): CGG GCA GGT ATC ATA ATG [SEQ ID NO:35], 0.01mM 유전자 특이적 프라이머(1㎕): AGT CGT TCG TTC GTT TTC [SEQ ID NO:36], 플라티늄 Pfx DNA 중합효소(0.5㎕)(Life Technologies), 물(35.5㎕).

반응 혼합물은 94℃에서 2분동안 변성시키고, 다음과 같이 Techne Genius DNA Thermal Cycler에서 순환시킨다: 94℃에서 30초, 45℃에서 30초, 68℃에서 1분 - 30회 반복; 최종적으로 68℃에서 10분. 3번의 독립된 PCR 반응을 실시하는데,대략 500개 염기쌍의 특이적인 DNA 단편이 상기와 같이 분리 및 정제된다. 이들 단편 각각은 플라스미드 벡터 pCR®Blunt(ZeroBlunt®PCR Cloning Kit 사용, Invitrogen, NL)에 결찰시키고, 생성된 재조합 플라스미드는 콤피던트 대장균(E. coli)(TOP10)에 도입한다. 전술한 바와 같이, QIAprep Spin Miniprep Kit를 이용하여 대량의 재조합 클론과 플라스미드 DNA를 만든다. 3번의 독립된 PCR 반응에서 생성된 3개의 플라스미드는 서열분석하는데, 각각 [SEQ ID NO:10]과 유사한 아미노산 서열을 인코드하는 3개의 상이한 DNA 서열이 동정되었다(즉, 폴리펩티드 [SEQ ID NO:11]을 인코드하는 [SEQ ID NO:7]; 폴리펩티드 [SEQ ID NO:12]를 인코드하는 [SEQ ID NOS:8, 9]).

실시예 3에서 분리된 고유 폴리펩티드로부터 수득된 아미노산 서열과 추정 아미노산 서열([[SEQ ID NO:10-12])를 비교하여, 다음과 같이 구성되는 시그널 서열이 동정되었는데, 상기 시그널 서열은 세포에서 발현되는 단백질이 상기 세포에서 분비되기 전에 제거되는 것으로 추정된다: M-K-Q-V-A-L-L-F-I-I-L-G-S-V-V-L-A- [SEQ ID NO: 38].

실시예 5 - 재조합 활성 폴리펩티드의 제조

바쿨로바이러스-감염된 세포에서 폴리펩티드를 발현시키기 위하여, 시그널 서열은 꿀벌 멜리틴 서열로 치환한다. 고유 리더 또는 시그널 서열을 SEQ ID NO 7의 멜리틴 시그널 서열로 치환한 올리고뉴클레오티드를 고안한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:

(멜리틴 특이적): AGA ATT CTA AAT ATG AAA TTC TTA GTC AAC GTT GCC CTTGTT TTT ATG GTC GTA TAC ATT TCT TAC ATC TAT GCGGTA GAG TTT CAA GAT TGC AAG[SEQ ID NO: 40](굵게 표시된 부분을 제외하고 Tessier DC. Thomas DY. Khouri HE. Labiberte F. Vemet T. Gene 98:177-83(1991)에 개시됨);

(폴리펩티드 유전자-특이적 서열):

ACT GCA GAG TCG TTC GTT CGT TTT CAT TTA TC [SEQ ID NO: 37].

BAC-TO-BAC 바쿨로바이러스 발현 시스템 매뉴얼, Gibco BRL(Life Technologies)을 이용하여, 상기 구조체는 pFastBac1에 클론하는데, 이의 서열은 [SEQ ID NO: 13]으로 확인되었다. 대장균(E. coli) DH10 세포는 재조합 pFastBac1으로 형질전환시킨다. 전위는 블루/화이트 선택으로 확인한다. 단일 클로니를 선택하고 Bacmid DNA를 분리한다. 플라스크 진탕기에서 47.5% Ex-cell 401(AMS Biotechnology UK Ltd., 185 A&B Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, UK) 및 5% 열-불활화된 우태아 혈청(Life Technologies)을 함유하는 47.5% TC100(Life Technologies)에서 Sf21 세포(Nerc, Oxford UK)는 표준 방법[King LA & Possee RD(1992), The Baculovirus Expression Systems, published by Chapman & Hall]으로 리포펙틴(Life Technologies)의 존재하에 정제된 재조합 Bacmid DNA로 트랜스펙션시키고, 재조합 바이러스는 트랜스펙션-7일후에 수거한다.

이후, 트랜스펙션 혼합물을 이용하여 무-혈청 배지(Ex-cell 401)에서 Sf21 세포를 감염시키고, 감염-96시간후에 수거하고, 배양 배지는 실시예 1에서 밝힌 바와 같이 AP₅₀분석으로 분석한다. 가장 현저한 저해 효과를 보이는 바이러스주(stock)를 선택하고, 고역가 주는 0.5 감염 다중도의 감염으로 Ex-cell 401, TC 100, 5% 우태아 혈청에서 1.92세포/㎖로 배양된 Sf21 세포(100㎖)에서 만든다. 항생제는 50IU/㎖ 페니실린, 5㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 첨가한다. 바이러스는 7일째 수거하고, 플라크 분석[King LA & Posse RD(1992), ibid]으로 적정한다. 바이러스 주는 2x10⁸pfu/㎖인 것으로 밝혀졌다. 10 감염 다중도로 Ex-cell 401에서 Sf21 세포를 상기 바이러스주로 감염시키면, 감염-96시간후에 AP₅₀저해 분석에서 공지된 농도의 고유 폴리펩티드의 제조와 비교하여 6.8㎎/ℓ폴리펩티드가 발현된다. 동일한 방식으로 Ex-cell 405에서 Hi5 세포(Invitrogen, NL)를 감염시키면, 41.8㎎/ℓ저해 펩티드가 만들어진다. DNA 서열 [SEQ ID NO13]은 성숙(즉, 멜리틴 시그널 서열의 절단) 폴리펩티드[SEQ ID NO: 16]을 인코드한다.

실시예 6 - 재조합 활성 폴리펩티드의 정제

실시예 5로부터 재조합 폴리펩티드를 정제하기 위하여, 이온 교환 및 겔 여과 칼럼 크로마토그래피를 병행한다. Sf21 세포와 Hi5 세포의 양 배양 배지(전체 부피 410㎖)는 모으고 50mM Tris HCl, 0.3M Nacl(pH 8.0)에 투석하고 NaOH로 pH 8.0으로 조정하고 3분동안 2,500rpm으로 원심분리하여, 임의의 불용성 물질을 제거한다. 이는 HiPrep®16/10 Q XL 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech, UK)에 가하고, 이후 20mM Tris HCl(pH 8.0)에서 평형화시킨다. 결합된 단백질은 20mM Tris HCl(pH 8.0)에서부터 0.3M NaCl을 함유하는 동일 완충액까지 단계적 구배로 용출한다. 단백질 용출은 280nm에서 흡수도로 검출한다. 흡수도가 기저수준으로 복귀하면, 10 칼럼 부피에서 50mM Tris HCl, 0.3M NaCl(pH 8.0)에서부터 1M NaCl을 함유하는 20mM Tris HCl pH 8.0까지 선형 구배를 시작한다. 분취물은 실시예 1에서 밝힌 AP₅₀방법으로 분석한다. 활성은 0.46 내지 0.72 M NaCl에서 나타난다.

저해 활성을 보이는 분취물은 20mM 포름산나트륨 완충액(pH 4.0)에 투석하고 HiTrap®SP Sepharose Fast Flow의 1㎖ 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech, UK)에 가하고 15 칼럼 부피에서 20mM 포름산나트륨(pH 4.0)에서부터 1M NaCl을 함유하는 동일 완충액까지 선형 구배로 용출하고, 단백질은 280nm에서 흡수도로 검출한다. AP₅₀분석에서 저해 활성은 0.30 내지 0.50M NaCl에서 나타난다.

활성 분취물은 PBS(pH 7.4)에서 평형화시킨 SuperdexTM 75prep 등급의 XK 16/30 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech, UK)에 가한다. AP₅₀분석에서 저해 활성은 0.45 칼럼 부피에서 나타난다.

순수한 재조합 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 서열분석은 [SEQ ID NO:16]의 예상 서열과 일치하는 아미노산 서열 V-E-F-Q-D-를 입증한다.

실시예 7 - 활성 폴리펩티드의 대체 보체 경로 저해 효능

보체 활성화의 대체 경로의 저해물질로서 전술한 폴리펩티드의 효능은 실시예 1에서 밝힌 AP₅₀분석으로 측정한다. 저해 분취물은 적혈구의 용해를 저해하는데, 이는 보체 활성화의 대체 경로에 대한 저해 효과를 시사한다. 폴리펩티드의 농도를 변화시켜, IC₅₀을 측정한다(표 2)

표 2

실험 샘플 IC50(ng/㎖)

실시예 2의 고유 폴리펩티드 39.6

실시예 6의 재조합 폴리펩티드 35.9

실시예 8 - 대체 보체 경로에 대한 활성 폴리펩티드의 선택성

본 발명의 폴리펩티드는 보체 활성화의 대체 경로에 특이적인데, 그 이유는 AP₅₀분석에서 IC₅₀의 최대 500배 농도에서도 용혈(CH₅₀)분석에 대한 효과가 없다는 점으로 판단할 때 고전적 경로에 대한 효과가 없기 때문이다.

CH₅₀분석을 위한 적혈구 준비는 다음과 같이 실시한다: 양 적혈구(Oxoid Ltd., Wade Road, Basingstoke, Hampshire, UK)는 0.1%(w/v) 젤라틴(CFT-G)으로 보충한 Barbitone Complement Fixation Test 희석액에서 3회 세척하고 2,000rpm에서 10분동안 원심분리하고 재-부유시킨다. 적혈구는 다음의 과정에 따라 항원으로 피복한다: CFT-G(4㎖)에 1:200으로 희석된 용혈소(Harlan Sera-Lab)는 CFT-G(4㎖)에 1:4로 희석된 적혈구에 첨가하고 주기적으로 교반하면서 37℃에서 30분과 추가로 0℃에서 30분동안 배양한다. 피복된 적혈구는 CFT-G에서 2회 세척하고 2.5%(w/v) 글루코스와 0.1%(w/v) 아지드화나트륨으로 보충한 CFT-G에 재-부유시키고 CFT-G에서 희석하여, 완전히 용해된 경우 450nm에서 0.7의 흡수도를 얻는다.

상기 분석에서, 빈 미세역가 평판 웰(0% 용혈)은 CFT-G(0.2㎖) + 피복된 적혈구(0.05㎖)를 함유한다. 물(0.2㎖)과 피복된 적혈구(0.05㎖)를 함유하는 웰은 100% 용혈에 대한 흡수도 수치를 제공한다. 실험 웰은 다음과 같은 성분을 함유한다: CFT-G(0.1㎖); 실시예 2에서 활성 분취물의 희석액 또는 PBS(0.05㎖); 대략 75% 용혈(0.05㎖)을 제공하기 위하여 CFT-G에 희석된 사람 혈청(보체); 피복된 적혈구(0.05㎖). 평판은 뚜껑을 덮고 37℃에서 1시간동안 배양하고 1,000rpm에서 3분동안 원심분리한다. 상층액(0.2㎖)은 미세역가 평판으로 옮기고, 흡수도는 405nm에서 읽는다.

0.04pg/㎖ 내지 340ng/㎖ 범위의 농도에서 실시예 2의 활성 분취물을 함유하는 웰의 흡수도는 PBS를 함유하는 웰의 흡수도와 별로 다르지 않았다(0.227±0.012 vs. 실험 샘플: 0.233±0.014, p>0.05. T 실험, 유의성없음). 게다가, 활성 분취물의 농도와 흡수도와는 상관관계가 존재하지 않는데, 이는 이들 조건에서 CH₅₀분석에 대한 효과가 없음을 예증한다. 유사하게, 36.9pg/㎖ 내지 19.6㎍/㎖ 범위에서 실시예 6의 재조합 폴리펩티드의 효과는 없었다(PBS: 1.088±0.044 vs. 실험 샘플: 1.065±0.009, P>0.05. T 실험, 유의성없음).

실시예 9 - CVF-유도된 보체-매개된 적혈구 용혈의 저해

고전적 경로와 대체 경로에 더하여, 보체 캐스케이드는 코브라 독 인자(CVF)에 의해 활성화될 수 있다. CVF는 B 인자와 복합체를 구성하여 활성 C3과 C5 전환효소를 생성시키는데, 이들은 고전적 경로와 대체 경로 활성화 단계를 회피한다[Vogel C-W, Muller-Eberhard HJ. J Immunol Meyhods 73: 203-220(1984)].본 발명에 따른 폴리펩티드의 격별한 특징은 이들이 CVF에 의한 보체-매개된 적혈구 용혈을 저해한다는 점이다.

돼지쥐 적혈구(Harlan Sera-Lab)는 GVB(Sigma- Aldrich)에서 3회 세척하고 사용하기에 앞서 희석한다(1:5). 분석 샘플은 다음과 같은 성분을 함유한다: 돼지쥐 혈청(Harlan Sera-Lab)(0.02㎖); 세척된 돼지쥐 적혈구(Harlan Sera-Lab); PBS(0.02㎖)에서 연속 희석된 실험 샘플. 용혈은 CVF(Quidel, Appligene-Oncor-Lifescreen, Unit 15, The Metro Centre, Dwight Road, Watford, Hertfordshire, UK)(0.02㎖의 130°g/㎖)를 첨가하여 촉진시킨다. 37℃에서 30분동안 배양한 이후, 반응은 아이스-냉각 GVB(0.5㎖)를 첨가하여 중단시킨다. 원심분리후, 상층액(0.1㎖)은 미세역가 평판에 옮기고, 흡수도는 405nm에서 읽는다.

폴리펩티드는 유사한 IC₅₀으로 CVF에 의한 보체-매개된 용혈을 저해한다(표3)

표 3

실험 샘플 IC ₅₀ (ng/㎖)

실시예 2의 고유 폴리펩티드 970

실시예 6의 재조합 폴리펩티드 1217

실시예 10 - 활성 폴리펩티드에 의한 CVF-유도된 D 인자의 저해

용혈을 촉진하는 능력 이외에, 코브라 독 인자는 대체 경로를 활성화시켜,결국 C3으로부터 절단되는 펩티드 단편인 C3a를 생성시킨다. C3a 생산은 효소면역분석장치(Quidel, UK)로 측정할 수 있다.

분석 샘플은 다음과 같은 성분을 함유한다: PBS(0.02㎖)에 연속 희석된 실험 샘플; GVB(Sigma-Aldrich)(0.02㎖); 사람 혈청(0.02㎖). 보체는 CVF(Quidel)(0.02㎖)를 첨가하여 활성화시키고, 샘플은 37℃에서 30분동안 배양한다. PBS가 CVF로 대체된 비-활성화 혈청 대조군은 4℃에서 30분동안 배양한다. 모든 샘플은 ELISA 키트(Quidel)로 C3a를 측정하기에 앞서, 샘플 완충액(Quidel)에서 1:10,000으로 희석한다.

고유 폴리펩티드와 재조합 폴리펩티드 둘 모두 CVF를 통해 유도된 보체-매개된 C3a를 저해한다(표4).

표 4

실험 샘플 IC ₅₀ (ng/㎖)

실시예 2의 고유 폴리펩티드 95

실시예 6의 재조합 폴리펩티드 138

코브라 독 인자로 자극한 혈청에서 C3a 생산을 결과하는 생화학적 경로에는 프로테아제 D 인자에 의한 복합체 C3bB에서 B 인자의 절단 및 여기서 생성된 C3bBb 복합체의 단백분해 작용에 의한 C3의 절단이 포함되는 것으로 생각된다. 상당한 몰농도의 CVF가 사용되기 때문에, 상기 실시예에서 대부분의 B 인자가 활성 B인자b로 전환된다고 추정하는 것은 온당하다. 혈청에 대한 문헌 수치로부터, 상기 분석에서 B 인자 농도는 대략 540nmole/ℓ로 추정되는 반면, D 인자 농도는 대략 20nmole/ℓ이다. 저해에 대한 화학량론이 1몰 효소의 저해에 대하여 1몰 미만의 폴리펩티드 저해물질이기 때문에, 50% 저해하는 저해물질 농도는 효소 농도의 50%미만이다. 이런 실시예에서, 상기 분석을 50% 저해하는 폴리펩티드의 농도는 고유 폴리펩티드의 경우 5.9nmoles/ℓ이고 재조합 폴리펩티드의 경우 8.6nmoles/ℓ이다. 이들 IC₅₀은 상기 분석에서 D 인자 농도의 대략 50% 및 B 인자와 다른 성분 농도의 2%미만에 해당하기 때문에, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 주로 D 인자를 저해함으로써 이런 분석에서 작용할 가능성이 매우 높다.

실시예 11 - D 인자와 활성 폴리펩티드의 직접적인 상호작용

D 인자에 대한 전술한 폴리펩티드의 직접적인 결합은 Biacore® X 분석 시스템(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에서 표면 플라즈몬 공명 분석으로 조사한다.

사람 D 인자(Calbiochem, CN Biosciences UK, Boulevard Industrial park, Padge Road, Beeston, Nottingham, UK)는 센서 칩 표면에서 5㎕/min의 반응물 연속 공급으로 센서 칩(CM5)(Biacore, SE)의 표면에 공유 고정시킨다. 덱스트란 칩에서 카르복실기는 새로 혼합된 N-에틸-N'(디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드/N-하이드록시숙시니미드(EDC/NHS; 1:1 v/v)(Biacore, SE)로 2분동안 활성화시킨다. 이후, D 인자(100㎍/㎖)는 말레산나트륨, pH 3.1(20mM)에서 2분동안 20㎍/㎖로 희석시킨다. D 인자 주사는 일정한 상태의 RU 기록이 수득될 때까지 반복하고, 이후 과량의 활성화된 카르복실기는 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5, EA-HCl)(1M)를 씌운다. 고정된 단백질은 재생 완충액(1M 염화나트륨/PBS)으로 처리하여, 비-공유결합된 리간드를 제거한다.

실시예 6에서 밝힌 바와 같이 정제된 재조합 폴리펩티드는 PBS(pH 7.4)에서 다양한 농도(25, 50, 75, 100, 250nM)로 희석한다. 고정된 D 인자에 대한 폴리펩티드의 농도-의존성 결합은 D 인자가 결핍된 동시 작동 칩에서 수득된 기본 공명 단위를 감한 이후, 센서 칩에 폴리펩티드를 통과시켜 수득된 공명 센서그램(sensorgram)에서 측정한다. 25℃에서 D 인자에 대한 폴리펩티드의 농도-의존성 결합은 주사 전후의 공명 차이로 확인한다.

Claims

질량 분광 측정에서 7,000 - 17,000 Da 범위의 분자량을 갖는 분리된, 정제된 또는 재조합된 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 상기 폴리펩티드는 외기생성 거머리(바람직하게는 입술거머리(Rhychobdellida) 목의 거머리 종, 좀더 바람직하게는 플라코브델라(Placobdella) 속의 거머리 종, 특히 플라코브델라 파필리페라(Placobdella papillifera))부터 유래되고 보체 활성화의 대체 경로를 저해하면서도 고전적 경로에 의한 보체 활성화에 별다른 영향을 주지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 다음의 서열[SEQ ID NO:50]으로 구성되고, 여기서 아미노산은 통상적인 단일 문자 코드로 표시하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:

X1-E-F-Q-D-X2-K-K-S-S-D-X3-E-T-L-E-L-R-X4-N-K-X5 [SEQ ID NO: 50];

여기서,

X1은 수소 원자(H), 임의의 자연-발생 아미노산, 특히 발린, 또는 아미노산 서열이고;

X2는 임의의 단일 아미노산, 특히 시스테인이고;

X3은 임의의 단일 아미노산, 특히 시스테인이고;

X4는 임의의 단일 아미노산, 특히 시스테인이고;

X5는 자연-발생 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열이고, 상기 서열중 적어도 한 개는 번역-후 수식, 예를 들면 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌에서 당화(glycosylation); 또는 거머리에서 유래된 폴리펩티드에서 공통적으로 발견되는 티로신에서 설파토- 혹은 포스포-군을 포함할 수 있다.
제 2 항에 있어서, X1은 발린이고, 성숙 폴리펩티드의 N-말단에서 첫 21개 아미노산이 [SEQ ID NO:1]로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:

V-E-F-Q-D-X-K-K-S-S-D-X-E-T-L-E-L-R-X-N-K- [SEQ ID NO: 1]

여기서, 각 X는 확인할 수 없는 단일 아미노산을 나타내고, 따라서 각 X는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
제 2 항 또는 3 항에 있어서, X, X2, X3, X4중 적어도 하나는 시스테인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
전술한 어느 한 항에 있어서, X5는 아미노산 서열[SEQ ID NO: 51]인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:

-N-T-S-K-C-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-X6 [SEQ ID NO: 51];

여기서, X6은 자연-발생 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열이고, 상기 서열중 적어도 한 개는 번역-후 수식, 예를 들면 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌에서 당화(glycosylation); 또는 거머리에서 유래된 폴리펩티드에서 공통적으로 발견되는 티로신에서 설파토- 혹은 포스포-군을 포함할 수 있다.
제 5 항에 있어서, X6은 아미노산 서열[SEQ ID NO: 54 및 21 내지 23]에서 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:

-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R [SEQ ID NO: 54];

-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 21];

-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 22];

-Q-G-C-N-E-A-Q-C-R-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 23].
전술한 어느 한 항에 있어서, 다음의 서열[SEQ ID NO: 60]을 보유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:

X7-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-X8-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-X9-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-X10 [SEQ ID NO:60]

여기서, X7은 수소 원자 또는 자연-발생 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열이고, 상기 서열중 적어도 한 개는 번역-후 수식, 예를 들면 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌에서 당화(glycosylation)를 포함할 수 있고;

X8은 D 또는 E이고;

X9는 T 또는 I이고;

X10은 -D-E-D-K 또는 -E-D-K이다.
제 7 항에 있어서, X7은 [SEQ ID NO: 30]에서와 같이 X8이 D이고, X9가 T이며, X10이 -D-E-D-K인 펩티드:

-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-T-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 30];

[SEQ ID NO: 31]에서와 같이 X8이 D이고, X9가 I이며, X10이 -D-E-D-K인 펩티드:

-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-D-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 31]; 또는,

[SEQ ID NO: 32]에서와 같이 X8이 E이고, X9가 I이며, X10이 -E-D-K인 펩티드:

-K-L-C-W-Y-G-F-T-T-D-E-N-G-C-E-S-Y-C-K-C-N-T-K-E-T-A-C-K-N-V-L-C-S-E-S-Y-Q-C-D-P-E-S-G-N-C-V-A-V-I-P-G-K-E-H-D-Y-Y-S-Y-N-D-D-D-E-D-K [SEQ ID NO: 32]와 결합하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 7 항 내지 8항에 있어서, X7은 [SEQ ID NO: 61]이고:

X11-C-N-E-A-Q-C-R- [SEQ ID NO: 61];

여기서, X11은 G-; Q-G-; [SEQ ID NO: 62]에서 선택되고:

X12-E-C-R-N-Q-V-C-P-R-A-C-P-D-G-K-Y-K-L-D-E-Y-G-C-K-R-C-L-C-Q-G- [SEQ ID NO: 62];

여기서, X12는 수소 원자 또는 [SEQ ID NO: 63]이고:

X13-N-T-S-K-C- [SEQ ID NO: 63];

여기서, X13은 [SEQ ID NO: 50]인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
전술한 어느 한 항에 있어서, [SEQ ID NO: 15 내지 17]중 임의 하나로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
제 1 항에 있어서, 제 2 항 내지 10 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 유사한 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 보유하는 이들 폴리펩티드의 유도체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 11 항에 있어서, 유도체에는 리더 또는 시그널 서열을 추가로 포함하는 전술한 항중 어느 한 항에 따른 서열을 비롯한 생체전구체; 번역후 과정 또는 시스테인 잔기간 이황화-결합의 형성에 의해 당화 또는 황산화되는 서열을 비롯한 변형체; 이황화-결합된 이중-사슬 유사체; 다형성을 비롯하여 한 개이상의 아미노산이 치환된 서열; 앞선 밝힌 것의 염에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
분리된, 정제된 또는 재조합된 핵산 서열을 비롯하여 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 서열:

(a) 본 발명에 포함되는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열;

(b) 엄격한 조건하에 (a) 서열과 실질적으로 상동한 또는 이와 하이브리드를 형성하는 서열;

(c) 유전자 코드 축중(degeneracy)을 제외하고 (a) 또는 (b) 서열과 실질적으로 상동한 또는 이와 하이브리드를 형성하는 서열;

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c) 서열중 임의 하나에 대하여 특이적인 올리고뉴클레오티드.
분리된, 정제된 또는 재조합된 핵산 서열을 비롯한 핵산 서열에 있어서, 최대 6개의 염기가 결실 또는 부가될 수 있고 상동성 서열이 제 1 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 유사한 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코드한다는 조건하에, 서열상의 대합 위치에서 제 13 항 (a) 서열의 염기와 90%이상 상동한 뉴클레오티드 염기를 보유하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
제 13 항 또는 14 항에 따른 핵산 서열중 임의 하나에 특이적인 올리고뉴클레오티드에 있어서, [SEQ ID NOS:33 내지 37]에서 선택되는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드:

GC(CT) TC(AG) TT(AG) CA(AGCT) CC(CT) TG(AG) CA [SEQ ID NO:33];

GGG GTC GGT AGT TTT GGC GGT AGA G [SEQ ID NO: 34];

CGG GCA GGT ATC ATA ATG [SEQ ID NO:35];

AGT CGT TCG TTC GTT TTC [SEQ ID NO:36];

ACT GCA GAG TCG TTC GTT CGT TTT CAT TTT CAT TTA TC [SEQ ID NO: 37].
제 13 항 내지 15항중 어느 한 항에 있어서, 서열은 cDNA 또는 mRNA를 비롯한 DNA 또는 RNA 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
제 13 항 내지 16항중 어느 한 항에 있어서, [SEQ ID NOS: 4 내지 5]중 임의 하나로 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 13 항 내지 16항중 어느 한 항에 있어서, [SEQ ID NOS: 6 내지 9 및 13]중 임의 하나로 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 1 항 내지 12항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) 입술거머리(Rhychobdellida) 목의 거머리로부터 유래되는 물질로부터 분리 또는 정제; 또는

(b) 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열의 발현 및 선택적으로, 생성된 폴리펩티드의 분리 또는 정제.
제 13 항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 임의 핵산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 구조체.
제 20 항에 따른 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 21 항에 따른 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하도록 유전자- 또는 단백질-조작된 세포, 세포주, 플라스미드, 살아있는 미생물 또는 다른 운반체에 있어서, 상기 세포, 세포주, 플라스미드, 살아있는 미생물 또는 다른 운반체는 제 13 항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 서열을 발현가능하도록 포함하는 것을 특징으로 하는 세포, 세포주, 플라스미드, 살아있는 미생물 또는 다른 운반체.
치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 23항에 따른 세포 또는 세포주.
제 1 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 구성되는 것을 특징으로 하는 제약학적 제형.
단백질 또는 유전자 요법을 비롯한 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 12항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 이런 폴리펩티드를 코딩하는핵산 서열의 용도.
약물의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
보체 활성화의 대체 경로에서 한 개이상의 단계를 저해하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
보체 D 인자 또는 C3bBb 복합체와 상호작용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
고전적 경로 또는 응혈(혈액 응고) 경로에 비하여 보체 활성화의 대체 경로를 선택적으로 저해하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
대체 보체 경로의 활성화와 관련된 이상을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 제 1 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 비-독성 저해량을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항 내지 31 항중 어느 한 항에 있어서, 이상은 혈액투석과 심-폐 혈관이식; 유치 도관(in-dwelling catheter) 또는 동맥내 스턴트의 존재; 이식된 조직 또는 장기의 거부 반응; 루프스 홍반을 비롯한 자가-면역 질환; 류머티스 관절염; 사구체신염; 신염; 신장병; 패혈증; 허혈기이후 재관류에 의해 조직에 야기된 손상; 아나필락시스, 천식, 피부 반응, 감염, 겸상적혈구 빈혈, 용혈성 빈혈을 비롯하여 보체 활성화와 관련된 다른 질환에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
본원, 특히 실시예에 언급된 것과 실질적으로 균등한 폴리펩티드, 핵산 서열, 방법, 구조체, 벡터, 숙주, 세포주, 제형 또는 용도.