JPH04279598A - 血清カルシウム降下因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はブタ由来の血清カルシウ
ム降下因子、該因子の製造方法、及び該因子を含有する
医薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】血清カルシウム降下因子の存在が高岡ら
〔日本医事新報２９５１，　１５〜２０（１９８０）〕
により示唆されているが、まだ精製されておらず、その
物質としての特徴も解明されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ブタ
由来の単離された新規な血清カルシウム降下因子を提供
しようとするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ブタの膵臓
から目的とする血清カルシウム降下因子を単離精製する
ことに成功し、その物質としての特徴を解明し、さらに
若干の生物学的特徴を明らかにすることにより本発明を
完成した。すなわち、本発明は、次の性質：（１）マウ
スにおいて投与量依存的に血清カルシウムレベルを降下
せしめる； （２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
測定した分子量が約２６，５００〜２８，０００Ｄであ
る。 （３）等電点電気泳動により測定した等電点が約４．５
である； （４）Ｎ−末端又はその近傍に次のアミノ酸配列（配列
番号１）：Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅ
ｕ−を有する；（５）プロテアーゼ活性を有し、プロテ
アーゼ阻害剤フェニルメタンスルホニルフルオリド（Ｐ
ＭＳＦ）（１ｍＭ）　、キモスタチン（１００μＭ）及
びトリプシンインヒビター（１００μｇ／ｍｌ）により
阻害されるが、（４−アミジノフェニル）メタンスルホ
ニルフロリド（ＡＰＭＳＦ）（５０μＭ）及びＮ−〔Ｎ
−（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２−カ
ルボニル）−Ｌ−ロイシル〕アグマチン（Ｅ−６４）（
２．５μｇ／ｍｌ）によって阻害されない；を有するブ
タ由来の新規な血清カルシウム降下因子を提供する。

【０００５】本発明はさらに、前記血清カルシウム降下
因子をブタ膵臓から単離することを特徴とする、該血清
カルシウム降下因子の製造方法を提供する。本発明はさ
らに、前記血清カルシウム降下因子を含んで成る医薬を
提供する。

【０００６】

【具体的な説明】製造方法 本発明の血清カルシウム降下因子はブタの膵臓から次の
様にして単離・精製することができる。まず、ブタの膵
臓を摘出し、常法に従って破砕してアセトンにより脱水
することによりアセトンパウダーを調製する。次に、こ
のアセトンパウダーを適当な緩衝液、例えば２％ＮａＣ
ｌ含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ＝８）により抽出する
ことにより抽出液を得る。次にこの抽出液にアセトンを
３０％濃度に加えて生成する沈澱物を除去した後、上清
に６０％濃度までアセトンを加え、生成する沈澱物を得
る。

【０００７】こうして得られた３０−６０％アセトン画
分を適当な緩衝液、例えば脱イオン水に対し透析し、ア
セトンを除去した後、この溶液に硫酸アンモニウムを加
えて４５％飽和とした後生成する沈澱物を除去する。次
にこの上清に硫酸アンモニウムを加えて６０％飽和とし
、生成する沈澱を得る。この溶液を適当な緩衝液、例え
ば５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、同溶液
に対して透析して硫酸アンモニウムを除去することによ
り血清カルシウム降下因子粗抽出物を得る。

【０００８】この抽出液から、実施例１に詳細に記載す
る方法により、本発明の血清カルシウム降下因子が得ら
れる。要約すれば、まず前記粗抽出液をＱ−セファロー
ス・ファースト・フロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ
ａｓｔ　Ｆｌｏｗ）カラムに適用し、５０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．５）及び０．１Ｍ　ＮａＣｌ　を含有する
同酢酸緩衝液をカラムに通した後、０．２Ｍ　ＮａＣｌ
　を含有する同酢酸緩衝液で溶出することにより、図１
に示す３個のピークが得られる。これらのピークの内、
ピークＩＩＩ　のみがイン−ビボ測定（実施例１）にお
けるマウスでの血清カルシウム降下作用を示す。この結
果を実施例１の表１に示す。

【０００９】次に、上記ピークＩＩＩ　をスーパーデッ
クス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５ＨＲカラムによるゲル濾
過を行えば図２のＢに示すように１個のシャープなメイ
ンピークと３個のマイナーピークが観察され、このメイ
ンピークのみがイン−ビボ測定における血清カルシウム
降下作用、及びルイスの骨培養系〔Ｒａｉｓｚ　Ｌ．Ｇ
．，　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，　４４，　１０
３　−１１６（１９６５）　〕における副甲状腺ホルモ
ン　（ＰＴＨ）−誘導カルシウム放出に対する阻害作用
を有する。この結果を図２のＡに示す。

【００１０】次に、前記ゲル濾過クロマトグラフィーに
より得られたメインピークをＭｏｎｏ　ＱＨＲ　カラム
によるイオン交換クロマトグラフィーにかけ、５０ｍＭ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中　ＮａＣｌ　濃
度直線グラジエントにより溶出する。この結果、図３に
示すようにおよそ０．２Ｍ　ＮａＣｌ　においてメイン
ピークが溶出し、このピークはイン−ビボ測定における
血清カルシウム降下作用を有する。

【００１１】次に、前記ゲル濾過クロマトグラフィーに
より得られたメインピークをＷａｋｏｓｉｌ　５Ｃ−１
８　カラムによる逆相液体クロマトグラフィーにかけ、
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　中アセトニトリ
ル濃度直線グラジエントにより溶出すれば図４に示すよ
うな溶出プロフィールが得られ、Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ　
カラムによる精製によって本発明の血清カルシウム降下
因子が単一蛋白質として精製されたことが確認される。

【００１２】本発明の血清カルシウム降下因子は上記の
様にして単離・精製されたが、一旦単離・精製され、下
記の様にその性質が解明された後は、それらの性質を指
標として、蛋白質の単離、精製に用いられる任意の常法
を用いて本発明の血清カルシウム降下因子を単離・精製
することができることは明らかである。

【００１３】さらに、本発明の血清カルシウム降下因子
を遺伝子工学的手段により製造することも可能である。 例えば、ブタ膵臓から常法に従ってｍＲＮＡを単離し、
そのｍＲＮＡに基き常法に従ってｃＤＮＡライブラリー
を作製することができる。このｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするためのＤＮＡプローブは、例えば本
発明によって明らかにされた血清カルシウム降下因子の
Ｎ−末端又はその近傍のアミノ酸配列に基いて設計する
ことができる。あるいは、本発明の血清カルシウム降下
因子を酵素的に又は化学的に切断し、その断片のアミノ
酸配列を決定した後、そのアミノ酸配列に基いてＤＮＡ
プローブを設計することができる。

【００１４】次に、こうして得られた、血清カルシウム
降下因子をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターに
挿入した後、この発現ベクターにより宿主を形質転換し
、この形質転換体を培養することにより本発明の血清カ
ルシウム降下因子を製造することができる。このための
宿主として、大腸菌のごとき原核細胞、酵母のごとき下
等真核細胞、哺乳類培養細胞のごとき高等真核細胞等、
常用の宿主を用いることができる。

【００１５】血清カルシウム降下因子の性質（１）分子
量 本発明の血清カルシウム降下因子の分子量をＳＤＳ−ア
クリルアミドゲル電気泳動により測定した場合、約２６
，５００〜２８，０００Ｄの単一分子量を示す。 （２）等電点 等電点電気泳動法により測定した場合、本発明の血清カ
ルシウム降下因子は約４．５の単一の等電点を示す。

【００１６】（３）部分アミノ酸配列 本発明の精製血清カルシウム降下因子を常法に従ってエ
ドマン分解にかけた場合、Ｎ−末端端又はその近傍に次
のアミノ酸配列（配列番号１）：Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−
Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−を有する。このアミノ酸配列
はブタ−プラスミノーゲン、ヒト−アポプロテインＡ、
ブタ−エラスターゼ２、ウシ−キモトリプシノーゲンＡ
、ウシ−キモトリプシノーゲンＢ、ヒト−プラズマカリ
クレイン（Ｐｒｅ）　及びヒト−凝固因子ＸＩ（Ｐｒｅ
）　のアミノ酸配列との間にホモロジーが存在するが同
一ではなく、本発明の血清カルシウム降下因子は新規な
蛋白質である。

【００１７】（４）プロテアーゼ阻害剤による作用本発
明の血清カルシウム降下因子はプロテアーゼ活性を有し
、プロテアーゼ阻害剤に対する本発明の血清カルシウム
降下因子の挙動を実施例３及び表２に詳細に記載する。

【００１８】

【効果】本発明の血清カルシウム降下因子は、イン−ビ
ボにおいて血清カルシウム降下作用を有するから、種々
の骨疾患、例えば骨粗鬆症、原発性副甲状腺機能亢進症
、悪性腫瘍に伴なう高カルシウム血症等の治療及び予防
のための医薬の活性成分として有用であると期待される
。本発明の血清カルシウム降下因子は、常用の医薬キャ
リヤーと共に製剤化して非経口投与、例えば静脈内投与
、皮下投与、筋肉内投与等、又は経腸もしくは経口投与
等により投与することができる。

【００１９】実施例１．ブタ膵臓由来血清カルシウム降
下因子の精製 ブタ膵臓のアセトンパウダーを調製し、これを２％Ｎａ
Ｃｌを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液により抽出し、次
にアセトン濃度３０−６０％でアセトン沈澱画分を得た
。この画分を脱イオン水に対し透析した後硫酸アンモニ
ウム塩析を行い、硫酸アンモニウム４５−６０％飽和で
沈澱画分を得た。

【００２０】この硫酸アンモニウム沈澱画分を５０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解した後、同緩衝液に対
して透析して硫酸アンモニウムを除去して血清カルシウ
ム降下因子粗抽出液を得た。この抽出液をＱ−セファロ
ース・ファースト・フロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　
Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）カラムを用いてイオン交換クロマ
トグラフィーにかけた。大部分の蛋白質は５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．５）により素通りした。 次に、０．１ＭＮａＣｌ　を含有する同緩衝液により段
階溶出した後、０．２Ｍ　ＮａＣｌ　を含有する同緩衝
液により段階溶出した。この結果図１に示す３個のピー
クが得られた。

【００２１】次に、これらのピークについて、次の方法
（イン−ビボ測定）によりマウスにおける血清カルシウ
ム降下作用を調べた。４〜６週齢のＢＡＬＢ／Ｃ　系雄
マウスを１８時間絶食し、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ＝７．５）のみ、又は同緩衝液に上記各ピークをそ
れぞれ溶解した検体を体重２０ｇあたり　１００μｌの
割合でマウス尾静脈より投与する。４時間後にエーテル
麻酔下にて心臓より採血を行ない、血清を得る。血清カ
ルシウム濃度の測定はオルトクレゾールフタレインコン
プレクソン法に従った。その結果を次の表１に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】表１の結果から明らかなように、血清カル
シウム降下活性はピークＩＩＩ　に存在し、このピーク
を１／１０濃度に希釈しても有意な血清カルシウム降下
活性が認められた。

【００２４】次に、上記ピークＩＩＩ　をゲル濾過クロ
マトグラフィーにかけた。すなわち、ピークＩＩＩ　を
０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．８）中でス
ーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５　ＨＲ　１０
／３０カラムにかけ、０．５ｍｌ／分で溶出を行い、１
ｍｌずつ分画した。この結果を図２のＢに示す。この結
果、１個のシャープなメインピークと３個のマイナーピ
ークが見られ、このメインピークは、分子量約２２，０
００ＫＤに相当し、このピークにイン−ビボ測定による
血清カルシウム降下作用が認められた。次に、前記４個
のピークに相当する画分を含む幾つかの画分についてル
イスの骨培養系を用いて、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）
　によるカルシウムの放出を阻害する各画分の活性を調
べた。この試験は次の様にして行った。

【００２５】ＩＣＲ系妊娠１５日目マウスに、１０〜２
０μＣｉの４５Ｃａを皮下注し、翌日、胎児の前腕骨を
切り出し、α−ＭＥＭ培地で１日間、前培養を行う。検
体と副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む同培地に交換し
、３日間培養する。骨中４５Ｃａは酸脱灰にて求める。 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）によるカルシウム放出効果
は骨中と培地中の４５Ｃａの総和に対する培地中の４５
Ｃａの割合で表わす。

【００２６】この結果を図２のＡに示す。図２において
、Ａの棒の位置はＢにおける画分番号に対応する。この
図に示すように、ＰＴＨ　（１０−７Ｍ）はカルシウム
の放出を約８０％促進するが、メインピークに相当する
画分はこのカルシウム放出促進を完全に阻害した。これ
に対して、３個のマイナーピークに相当する画分及びい
ずれのピークにも対応しない画分はいずれも阻害作用を
示さなかった。

【００２７】このメインピークをドデシル硫酸ナトリウ
ム存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）　にかけ、分子量標準（アルブミン６７Ｋ
Ｄ、オブアルブミン４３ＫＤ、カーボニックアンヒドラ
ーゼ３０ＫＤ、トリプシンインヒビター２０ＫＤ、及び
α−ラクトアルブミン１４ＫＤと比較したところ、主バ
ンドは分子量約２６，５００Ｄを示した。

【００２８】次に、前記ゲル濾過クロマトグラフィーに
より得られたメインピークをＭｏｎｏ　ＱＨＲ　５／５
カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーにかけた
。緩衝液Ａ〔５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）〕
及び緩衝液Ｂ〔０．５Ｍ　ＮａＣｌ　を含有する５０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）〕を用いて　ＮａＣｌ
　濃度直線グラジエントにより流速０．５ｍｌ／分で溶
出を行い１ｍｌずつ分画した。この結果を図３に示す。 ＮａＣｌ濃度約０．２Ｍにおいてメインピークが得られ
、このピークはイン−ビボ測定において血清カルシウム
降下作用を有していた。

【００２９】次に、前記　Ｍｏｎｏ　Ｑ　カラムを用い
るイオン交換クロマトグラフィーから得られた活性メイ
ンピークの純度を逆相液体クロマトグラフィーにより調
べた。Ｗａｋｏｓｉｌ　５Ｃ−１８　２００　カラムを
用い、溶媒Ａ〔２０％アセトニトリル中０．１％トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）　〕及び溶媒Ｂ（８０％アセトニ
トリル中０．１％　　ＴＦＡ）を用いるアセトニトリル
濃度直線グラジエントにより流速１ｍｌ／分にて溶出を
行った。溶出は、　１００％Ａ：５分間；０−５０％Ｂ
：２５分間；５０−１００　％Ｂ：５分間；　１００％
Ｂ：５分間で行った。この結果を図４に示す。アセトニ
トリル濃度約５０％で単一ピークが得られ、本発明の血
清カルシウム降下因子が単一蛋白質まで精製されたこと
が確認された。

【００３０】次に、前記　Ｍｏｎｏ　Ｑ　イオン交換ク
ロマトグラフィーにより得られた活性ピーク及びＷａｋ
ｏｓｉｌ　５Ｃ−１８　逆相液体クロマトグラフィーに
より得られたピークについて、前記の方法により非還元
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量を調べたところ、血清カ
ルシウム降下因子の分子量は約２８，０００Ｄと計算さ
れた。

【００３１】また、前記　Ｍｏｎｏ　Ｑ　イオン交換ク
ロマトグラフィーからの画分の等電点（ｐＩ）を等電点
電気泳動法により調べたところ、等電点標準（ヒトカー
ボニックアンヒドラーゼＢ：ｐＩ＝６．５５：ウシカー
ボニックアンヒドラーゼＢ：ｐＩ＝５．８５：β−ラク
トグロブリンＡ：ｐＩ＝５．２：大豆トリプシンインヒ
ビターｐＩ＝４．５５）と比較して、本発明の血清カル
シウム降下因子はおよそｐＩ＝４．５の位置に単一ピー
クを示した。

【００３２】実施例２．部分アミノ酸配列の決定前記　
Ｍｏｎｏ　Ｑ　カラムによるゲル濾過クロマトグラフィ
ーにより得られたメイン活性画分、及びＷａｋｏｓｉｌ
　５Ｃ−１８　による逆相液体クロマトグラフィーによ
り得られた画分について、蛋白質のＮ−末端のアミノ酸
配列を常法に従いエドマン分解法により調べた。その結
果、上記２個の試料について同じ結果が得られ、本発明
の血清カルシウム降下因子はそのＮ−末端又はＮ−末端
近傍に次のアミノ酸配列（配列番号１）を有することが
推定された。

【００３３】Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−

【００３４】次に、１０番目〜１８番目のアミノ
酸配列に基きホモロギー検索を行ったところ、ブタ−プ
ラスミノーゲン、ヒト−アポプロテインＡ、ブタ−エラ
スターゼ２、ウシ−キモトリプシノーゲンＡ、ウシ−キ
モトリプシノーゲンＢ、ヒト−プラズマカリクレイン（
Ｐｒｅ）　、及びヒト−凝固因子ＸＩ（Ｐｒｅ）とアミ
ノ酸配列のホモロジーが存在することが見出されたが、
そのいずれとも同一ではなく、本発明の血清カルシウム
降下因子が新規な蛋白質であることが確認された。

【００３５】実施例３． 前記精製工程において、血清カルシウム降下因子蛋白質
の分解断片と推定される断片の生成が観察されることか
ら、血清カルシウム降下因子自体がプロテアーゼ活性を
有することが推定されたので、本発明の血清カルシウム
降下因子のプロテアーゼ活性に対する各種プロテアーゼ
阻害剤の効果を、次の様にして調べた。

【００３６】即ち、１ｍｇ／ｍｌのアゾカゼインを基質
とし、０．２５ｍｌの系で３７℃３０分間インキュベー
ションを行い、５％トリクロル酢酸１ｍｌを加えた後、
遠心上清の　ＯＤ３４０ｎｍを測定し、これをプロテア
ーゼ活性とした。各プロテアーゼ阻害剤の効果は、対照
（阻害剤を含まない）のプロテアーゼ活性を　１００と
したときの％として示す。

【００３７】プロテアーゼ阻害剤として、セリンプロテ
アーゼ阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオリ
ド（ＰＭＳＦ）；トリプシン型セリンプロテアーゼ阻害
剤である（４−アミジノフェニル）メタンスルホニルフ
ロリド　（ＡＰＭＳＦ）；トリプシン型セリンプロテア
ーゼ−チオールプロテアーゼ阻害剤であるロイペプチン
（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）；キモトリプシン型セリンプロ
テアーゼ阻害剤であるキモスタチン（ｃｈｙｍｏｓｔａ
ｔｉｎ）　；チオールプロテアーゼ阻害剤であるＮ−〔
Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２−
カルボニル）−Ｌ−ロイシル〕アグマチン（Ｅ−６４）
、酸性プロテアーゼ阻害剤であるペプスタチン（ｐｅｐ
ｓｔａｔｉｎ）　；トリプシン、Ｘａ　因子、プラスミ
ン及びプラズマカリクレインの阻害剤であるトリプシン
インヒビター（ｔｒｙｐｓｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）
　；並びにプラスミン及びカリクレインの阻害剤である
アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）　を用いた。

【００３８】その結果、表２に次すように、ＰＭＳＦ（
１ｍＭ）、キモトリプシン（１００μＭ）、及びトリプ
シンインヒビター（１００μｇ／ｍｌ）により阻害され
、ＡＰＭＳＦ（５０μＭ）及びＥ−６４（２．５μｇ／
ｍｌ）により阻害されず、そしてロイペプチン（１００
μＭ）、ペプスタチン（１００μＭ）及びアプロチニン
（２ｍｇ／ｍｌ）により部分的に阻害された。

【００３９】

【表２】

【００４０】実施例４．血清カルシウム降下因子の作用
機作の検討 血清カルシウム降下因子がプロテアーゼ活性を有するこ
とから、この因子が、血清カルシウムを調節している副
甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）　を分解している可能性があ
る。そこで、血清カルシウム降下因子とＰＴＨとを一緒
にインキュベートした後反応生成物を逆相液体クロマト
グラフィーで調べたところ、ＰＴＨは血清カルシウム降
下因子により分解して低分子化しており、この反応にプ
ロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦを共存させるとＰＴＨ
の分解が阻害された。

【００４１】そこで、血清蛋白質が高濃度で存在するイ
ン−ビボ系やルイスの骨培養系（前記）において血清カ
ルシウム降下因子がＰＴＨを分解するか否かを調べた。 ルイスの骨培養系でのＰＴＨ又はビタミンＤによるカル
シウムの放出を血清カルシウム降下因子が阻害するか否
かを調べた。その結果、血清カルシウム降下因子は１０
ｎｇ／ｍｌの低濃度でＰＴＨの効果を阻害したが、　１
００ｎｇ／ｍｌの濃度でもビタミンＤの効果を阻害しな
かった。

【００４２】そこで、ＰＴＨの効果の阻害が血清カルシ
ウム降下因子のプロテアーゼ活性によるものであるか否
かを調べるため、プロテアーゼに不可逆的に結合するプ
ロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦにより前処理した血清
カルシウム降下因子がＰＴＨ及びビタミンＤのカルシウ
ム放出作用を阻害するか否か調べた。その結果、プロテ
アーゼ阻害剤ＰＭＳＦで前処理された血清カルシウム降
下因子は無処理の降下因子と同様、ＰＴＨの作用を阻害
したが、ビタミンＤの作用を阻害しなかった。

【００４３】次に、マウスでのイン−ビボ測定における
血清カルシウム降下因子による血清カルシウム濃度の低
下を、ＰＭＳＦで処理した血清カルシウム降下因子と無
処理の因子を用いて調べた。この結果を図５に示す。図
中、白円は無処理の血清カルシウム降下因子の結果を示
し、黒円はＰＭＳＦ処理した血清カルシウム降下因子の
結果を示し、そして黒四角は、横軸に示すだけの血清カ
ルシウム降下因子が投与された場合にそれに伴って投与
される量のＰＭＳＦのみを投与した場合の結果（対照）
を示す。

【００４４】ＰＭＳＦは血清カルシウムを降下させない
が、無処理血清カルシウム降下因子は投与量依存的に血
清カルシウムを低下させた。ＰＭＳＦ処理の血清カルシ
ウム降下因子も投与量依存的に血清カルシウムを低下せ
しめ、曲線はむしろ低濃度の側にシフトした。この結果
は、プロテアーゼ活性を阻害された血清カルシウム降下
因子が血清カルシウム降下作用を発現している可能性を
示唆している。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＱ−セファロース・ファスト・フローカ
ラムクロマトグラフィーにおける溶出の様子を示す。ピ
ークＩＩＩ　のみが血清カルシウム降下作用を有する。

【図２】図２において、Ａはスーパーデックス７５　Ｈ
Ｒ　によるゲル濾過クロマトグラフィーにおける溶出の
様子を示す。ＡはＢに対応する幾つかの画分による、ル
イスの骨培養系におけるカルシウム放出（ＰＴＨによる
）の阻害を示す。メインインピークのみにカルシウム放
出阻害作用が認められた。

【図３】図３は　Ｍｏｎｏ　Ｑ　カラムによるイオン交
換クロマトグラフィーにおける溶出の様子を示す。メイ
ンピークのみが血清カルシウム降下作用を示す。

【図４】図４はＷａｋｏｓｉｌ　５Ｃ−１８　カラムに
よる逆相液体クロマトグラフィーにおける溶出の様子を
示す。

【図５】図５は血清カルシウム降下因子（白円）、及び
プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦで処理された血清カルシウ
ム降下因子（黒円）が投与量依存的に血清カルシウムを
降下させる様子を示すグラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　次の性質を有するブタ由来の血清カル
   シウム降下因子： （１）マウスにおいて投与量依存的に血清カルシウムレ
   ベルを降下せしめる； （２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
   測定した分子量が約２６，５００〜２８，０００Ｄであ
   る；（３）等電点電気泳動により測定した等電点が約４
   ．５である； （４）Ｎ−末端又はその近傍に次のアミノ酸配列（配列
   番号１）：Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
   Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔ
   ｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅ
   ｕ−を有する；（５）プロテアーゼ活性を有し、プロテ
   アーゼ阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフロリド
   （ＰＭＳＦ）（１ｍＭ）　、キモスタチン（１００μＭ
   ）及びトリプシンインヒビター（１００μｇ／ｍｌ）に
   より阻害されるが、（４−アミジノフェニル）メタンス
   ルホニルフトリド（ＡＰＭＳＦ）（５０μＭ）及びＮ−
   〔Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２
   −カルボニル）−Ｌ−ロイシル〕アグマチン（Ｅ−６４
   ）（２．５μｇ／ｍｌ）によって阻害されない。
2. 【請求項２】　　ブタ膵臓から請求項１に記載する蛋白
   質を単離することを特徴とする血清カルシウム降下因子
   の製造方法。
3. 【請求項３】　　請求項１に記載の血清カルシウム降下
   因子を含んで成る医薬。