JP3276753B2 - カテプシンｌ特異的阻害ポリペプチド - Google Patents

カテプシンｌ特異的阻害ポリペプチド

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規ポリペプチドに関
し、更に詳しくはカテプシンＬを特異的に阻害し、骨粗
鬆症治療剤として有用な新規ポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】人口構成に占める高齢者の割合が高い社
会、すなわち高齢者社会に向かっている現在、高齢者の
骨吸収の異常亢進は各種の身体障害（腰や脊髄の湾曲、
関節機能障害、骨折しやすくなる等）の多くに関与して
いる大問題であり、中でも骨粗鬆症は大きな社会問題で
もある。しかるにこの骨粗鬆症治療の現状を見てみると
決め手の治療法は無いと言うべきである。
【０００３】骨粗鬆症の起こる要因には、カルシウムの
沈着障害と支持組織コラーゲンの異常分解との二つがあ
ると考えられている。このうち、カルシウムの沈着障害
に着目した薬剤としてはビタミンＤ3 誘導体及びリン酸
系化合物が研究されている。しかしながら、ビタミンＤ
3 誘導体は骨の成長期には有効であるが、高齢者の骨粗
鬆症には適用できないことが知られてきており、またリ
ン酸系化合物は骨表面をコートすることによる保護作用
だけであり、各種の副作用が強く治療には利用しにくい
と考えられている。
【０００４】また、カルシトニンは、強い血清カルシウ
ム低下作用を有するが、内在性ホルモンであって、一時
的な鎮痛作用は著明であり、即効目的の薬としては有効
であるが、注射法しかないので連続投与による骨吸収抑
制をすることは不可能であると言われている。
【０００５】一方、コラーゲン分解の異常亢進に着目し
た薬剤開発は始まったばかりである。このコラーゲン分
解にはある種のシステインプロテアーゼ、特にカテプシ
ン群が関与していることが明らかにされており、当該カ
テプシン群を阻害する薬剤もいくつか報告されている
〔特開昭６３−２８４１２７号公報、特開平２−２１８
６１０号公報〕。しかし、更に最近の研究によればカテ
プシン群（カテプシンＢ、カテプシンＨ、カテプシン
Ｌ）の中でも、カテプシンＬはコラーゲンの分解能が他
のカテプシンに比べて非常に強いことが知られており、
実験動物ではカテプシンＬの阻害剤は著明な骨コラーゲ
ン分解を抑制することが明らかにされた。従ってカテプ
シンＬを特異的に阻害する物質が骨粗鬆症治療剤として
有望であると言われている〔ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ，Ｖｏｌ．２６９，Ｎｏ．１，ｐ．１８９〜１９３
（１９９０）、細胞内タンパク質分解、第１１８〜１２
８頁（東京化学同人）〕。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は骨疾
患、例えば骨粗鬆症等の予防又は治療に有用な新規ポリ
ペプチドを提供することにある。より詳細にはコラーゲ
ン分解に最も大きく関与していると考えられるカテプシ
ンＬを特異的に阻害することにより骨粗鬆症の根本的な
予防及び治療を可能にする新規ポリペプチドを提供する
ことにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、動
物の白血球に着目し、カテプシンＬの特異的阻害剤を見
出すべく、種々研究してきた結果、ブタ白血球細胞質中
に、新規なポリペプチドが存在し、この新規ポリペプチ
ドが強いカテプシンＬ特異的阻害作用及び骨吸収抑制作
用を有し、骨粗鬆症治療剤として有用であることを見出
し、このポリペプチドを「エルスタチン（Ｅｌｓｔａｔ
ｉｎ）」と命名し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、配列表の配列番号１記
載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに係るものであ
る。
【０００９】また、本発明は当該ポリペプチドを有効成
分とするカテプシンＬ特異的阻害剤及び骨粗鬆症治療剤
に係るものである。
【００１０】本発明のポリペプチドは、例えばブタ白血
球の細胞質画分よりイオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過及びパパイン結合アフィニティカラムクロマトグ
ラフィーを適宜組み合せて用いることにより分離するこ
とができる。好ましくは、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及びパパ
イン結合アフィニティカラムクロマトグラフィーの順に
行われる。ここで、イオン交換クロマトグラフィーとし
てはＤＥＡＥ−セルロースカラムが、ゲル濾過としては
セファデックスＧ−５０を用いるのが好ましい。
【００１１】かくして分離精製された本発明ポリペプチ
ドは、分子量（ＳＤＳ電気泳動法及びアミノ酸組成から
の計算による）１１，７６８、等電点（ｐＩ）４．６で
あり、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。また、
本発明ポリペプチドは、配列番号１記載の１０３アミノ
酸残基を有すればよく、この配列のＮ末端側及び／又は
Ｃ末端側に更に１〜１０個程度のアミノ酸残基を有して
いてもよい。
【００１２】本発明ポリペプチドは、強い特異的カテプ
シンＬ阻害作用を有し、かつｉｎｖｉｔｒｏピット形成
法において強い骨吸収抑制作用を有し、骨粗鬆症治療剤
の有効成分として使用できる。
【００１３】本発明の有効成分は、常法に従って種々の
剤型での投与が可能である。例えば経口投与剤として
は、錠剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、シロップ剤、
ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤等が例示でき、
非経口投与剤としては、注射剤、坐剤、経鼻投与剤、軟
膏剤、パップ剤等の経皮吸収剤が挙げられる。
【００１４】本発明の治療剤を、骨粗鬆症の患者に投与
する有効成分の量の目安としては、通常成人１日当たり
０．１〜１０００mg／kg、好ましくは１〜１００mg／kg
を１〜４回に分けて経口又は非経口投与すればよい。こ
の投与量は用法、患者の年齢、性別、疾患の程度により
適宜増減することができる。
【００１５】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００１６】実施例１ （１）白血球の分離、細胞分画及び蛋白の抽出 ブタ血液よりデキストラン赤血球沈降法を用いて白血球
を分離した。実験のたびに動物を屠殺後直ちに屠殺場に
て４×１６００mlの血液を採取した。１６００mlの血液
に対して１％ヘパリンを含む０．９％塩化ナトリウム水
溶液を１００ml及び６％デキストランを含むハンクス緩
衝液を４００ml加えた。３０分間静置後上層を得、１５
分間、６０×ｇで遠心した。得られた沈査に４％アルブ
ミンを含む０．３２％塩化ナトリウム低張液を加え、１
５分間、６０×ｇで遠心した。細胞は０．３２％塩化ナ
トリウム低張液、ハンクス液、０．９％塩化ナトリウ
ム、０．３４Ｍ蔗糖の順に更に洗浄した。その後、１５
分間、６０×ｇで遠心した。庶糖液に再懸濁させた細胞
をテフロンホモゲナイザー（２０往復）で破砕した。ホ
モジネートを１５分間、６０×ｇで遠心した。上清（白
血球細胞質）と沈査（顆粒画分）を併せて１５分間、８
０００×ｇで再度遠心した。澄明な白血球細胞質に顆粒
画分の上清を加え凍結乾燥によって濃縮した。
【００１７】（２）本発明ポリペプチド 凍結乾燥サンプルをpH７．５の０．０５Ｍトリス緩衝液
で透析し、必要に応じて遠心した。澄明なサンプルをＤ
ＥＡＥ−セルロースカラム（４×６０cm）にアプライ
し、溶出液を０〜０．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾
配にかけた。溶出速度は２０ml／ｈであった。パパイン
阻害活性ピークは３つ得られ、３つ目のピーク（０．１
８Ｍ塩化ナトリウムで溶出される）のみを凍結乾燥によ
って濃縮し、更に１８ml／ｈの流速でセファデックスＧ
−５０（４．５×１２０cm）で分離した。阻害活性画分
を集め、濃縮し、更にpH６．８の０．０５Ｍ酢酸アンモ
ニウム緩衝液で前もって平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
スカラム（２×４０cm）で分画した。蛋白は塩化ナトリ
ウム（０〜０．２Ｍ）の濃度勾配を増加させることによ
り溶出させた。０．０２５Ｍ塩化ナトリウムで溶出され
る２つ目の阻害活性ピークの最終精製はCm−パパインセ
ファロースで行った。パパイン非結合性蛋白は０．５Ｍ
塩化ナトリウムを含むpH７．８の０．１Ｍトリス緩衝液
で除去した。パパイン結合蛋白は０．０１Ｍ水酸化ナト
リウムで溶出した。溶出画分のpHを３Ｍ塩酸で直ちにpH
７．５に調整し、本発明ポリペプチドを得た。
【００１８】この方法により単離された本発明ポリペプ
チドのアミノ酸配列をＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ
−Ｓｅｙｌｅｒ，Ｖｏｌ．３７０，ｐｐ１１４７（１９
８９）記載の方法に従って決定した。その結果を配列表
の配列番号１に示す。またその物性は下記の通りであ
る。
【００１９】分子量：１１，７６８（ＳＤＳ電気泳動法
及びアミノ酸組成からの計算による） ｐＩ：４．６
【００２０】実施例２酵素阻害活性 Ｅｌｓｔａｔｉｎ（本発明ポリペプチド）のパパイン及
びカテプシンＬに対する阻害活性は、Ｂｚ−ＤＬ−Ａｒ
ｇ−２−ナフチルアミドあるいはＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
ＡＭＣを基質として、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．ＪとＫｉｒ
ｓｃｈｋｅ，Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８
０，５３５−５６２（１９８１）の方法に従い測定した
（ここで、Ｂｚはベンゾイルを、Ｚはベンジルオキシカ
ルボニルを、ＡＭＣは４−メチル−７−クマリルアミド
を表す）。酵素の活性中心はシステインプロテアーゼ阻
害剤Ｅｐ−４７５（Ｌ−３−カルボキシ−ｔｒａｎｓ−
２，３−エポキシプロピル−ロイシルアミド−（３−グ
アニジノ）ブタン）によって滴定した。活性中心を滴定
したパパインは阻害物質のモル数を測定するために用い
た（Ｔｕｒｋ，Ｂ．等Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
８，７３２３−７３２９（１９９３））。Ｅｌｓｔａｔ
ｉｎとカテプシンＢ及びＨの平衡解離定数（Ｋｉ）は反
応停止法により測定した。即ち、カテプシンＢ（最終濃
度１３０nM）及びカテプシンＨ（最終濃度２５nM）を２
mMジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ
ｌ）及び１．５mM ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝
液（pH６．０）中で種々の濃度のＥｌｓｔａｔｉｎ（最
終濃度５０−７５０nM）と共に２５℃で２０分間インキ
ュベートした。残存活性は、前記Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．
ＪとＫｉｒｓｃｈｋｅ，Ｈの方法と同様の条件で基質と
してＢｚ−ＤＬ−Ａｒｇ−２−ナフチルアミドを用いて
測定した。Ｋｉ値はＨｅｎｄｅｒｓｏｎの方法（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．１２７，３２１−３３３（１９７２））
により算出した。基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭ
Ｃを用いた反応速度は、Ｅｌｓｔａｔｉｎとパパイン、
カテプシンＬの速度解析により測定した。種々の濃度の
Ｅｌｓｔａｔｉｎと基質（パパインの場合は５μM 、カ
テプシンＬの場合は１０μM ）を上記同様の緩衝液１．
９７mlに溶解した。カテプシンＬの測定には、２mMジチ
オトレイトール及び１．５mM ＥＤＴＡを含む０．３４
Ｍ酢酸緩衝液（pH５．５）を用いた。反応は３０μl の
活性化パパイン（最終濃度３８０pM）、カテプシンＬ
（最終濃度６０pM）を添加することにより開始した。全
ての実験はＥｌｓｔａｔｉｎの濃度が酵素濃度より少な
くとも１０倍高い擬１次条件で行った。データはＭｏｒ
ｒｉｓｏｎによる非線形回帰解析法（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．７，１０２−１０５（１９８
２））により解析した。この方法による酵素阻害活性を
表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】この結果より、本発明ポリペプチドはカテ
プシン群の中でも特にカテプシンＬのみを特異的に阻害
することが判明した。
【００２３】実施例３骨吸収抑制作用 ＭｃＳｈｅｅｈｙ，Ｐ．Ｍ．Ｊ．とＣｈａｍｂｅｒｓ，
Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８０，４２５
〜４２９（１９８７）の方法を一部改変して行った。生
後１〜２日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの脛
骨、大腿骨及び上腕骨から未分画骨細胞を調製した。２
０mM Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ′−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含む氷冷培地（pH
７．２）〔１００ＩＵ／ml ベンジルペニシリン添加ａ
ｌｐｈａ−ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅ
ｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ）〕中で骨を軟組織に細
切した。骨細胞の調製のため長骨は同一培地中でハサミ
で細切した。次に、広管腔のプラスチックピペットを用
い細胞懸濁液を破砕した。２００μl の細胞懸濁液（１
×１０6 cells／ml）を象牙切片（厚さ：１５０μm 、
直径：６mmで超音波処理後７５％エタノールで殺菌した
もの）を入れた９６ウェルプレートの各ウエルに加え、
細胞は３７℃で２時間ＣＯ2 インキュベーター（５％
ＣＯ2 ：９５％ ａｉｒ）でインキュベートした。切片
をα−ＭＥＭで洗浄後、１０％ＦＢＳ、各種濃度の被検
サンプルと５０nMヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（Ｐ
ｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｂｅｌｍｏｎｄ，ＣＡ）を含むＨＥＰＥＳを含ま
ない新鮮培地に移し、７２時間インキュベートした。蒸
留水で激しく洗浄することにより細胞を除去し、切片を
０．１％トルイジンブルーで５分間染色した。ピットの
総面積を顕微鏡下で測定し、破骨細胞による骨吸収を検
出した。この結果を図１に示す。図１より、本発明ポリ
ペプチドは極めて強い骨吸収抑制作用を有することが判
明した。
【００２４】
【発明の効果】本発明ポリペプチドは、強いカテプシン
Ｌ特異的阻害作用を有し、更に強い骨吸収抑制作用を有
するため、骨粗鬆症、特に老人性骨粗鬆症の治療に有用
である。
【００２５】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：１０３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Ser Glu Glu Met Leu Ala Gly Gly Leu Thr Glu Pro Arg Pro 5 10 15 Ala Thr Pro Glu Ile Gln Glu Ile Ala Asn Lys Val Lys Pro Gln Leu 20 25 30 Glu Glu Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Glu Lys Phe Glu Ala Ile Ile Tyr 35 40 45 Arg Ser Gln Val Val Ala Gly Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val His Val 50 55 60 Gly Gly Asn Asn Tyr Val His Ile Arg Val Phe Gln Ser Leu Pro His 65 70 75 80 Gln Glu Asp Pro Leu Lys Leu Ile Gly Tyr Gln Val Asp Lys Thr Lys 85 90 95 Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 103
【図面の簡単な説明】
【図１】副甲状腺ホルモン誘発骨吸収に対する本発明ポ
リペプチドの作用を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ. Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1983，Ｖ ｏ364．，Ｎｏ．11 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，255（1989）, ｐ．211−214 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，321（1993）, ｐ．247−250 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
    ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
    ポリペプチドを有効成分とするカテプシンＬ特異的阻害
    剤。
  3. 【請求項３】 配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
    ポリペプチドを有効成分とする骨粗鬆症治療剤。
JP31353393A 1993-11-12 1993-12-14 カテプシンｌ特異的阻害ポリペプチド Expired - Fee Related JP3276753B2 (ja)

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JP31353393A JP3276753B2 (ja) 1993-11-12 1993-12-14 カテプシンｌ特異的阻害ポリペプチド
HU9501580A HU214343B (hu) 1993-11-12 1994-11-08 Polipeptid, mely specifikus katepszin L gátló hatású és hatóanyagként ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény
DE69417872T DE69417872T2 (de) 1993-11-12 1994-11-08 Inhibitor peptid spezifisch für cathepsin-l
AU80674/94A AU671783B2 (en) 1993-11-12 1994-11-08 Cathepsin-L-specific inhibitor polypeptide
AT94931695T ATE178909T1 (de) 1993-11-12 1994-11-08 Inhibitor peptid spezifisch für cathepsin-l
PCT/JP1994/001878 WO1995013302A1 (fr) 1993-11-12 1994-11-08 Polypeptide a inhibition specifique de la cathepsine l
EP94931695A EP0679659B1 (en) 1993-11-12 1994-11-08 Cathepsin-l-specific inhibitor polypeptide
KR1019950702358A KR950704358A (ko) 1993-11-12 1994-11-08 카텝신 l 특이적 저해 폴리펩티드
CA002151059A CA2151059A1 (en) 1993-11-12 1994-11-08 Cathepsin-l-specific inhibitor polypeptide
US08/478,520 US5698519A (en) 1993-11-12 1995-06-07 Polypeptide specifically inhibiting cathepsin L
NO952748A NO952748L (no) 1993-11-12 1995-07-11 Polypeptid som spesifikt inhiberer Cathepsin L.

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