CN114126661A - 生物材料和其相关方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括一种或多种晶体蛋白的生物相容性组合物以及此类组合物在治疗和研究方法中，例如在手术方法中、在缓释药物递送中和在基于细胞的方法中的用途。

Description

生物材料和其相关方法

技术领域

本发明涉及蛋白质生物材料及其制备和使用方法。更具体地，本发明涉及包括晶体蛋白的生物材料、用于制备所述生物材料的方法以及在一系列学科中使用所述生物材料的各种方法，包含在医学和治疗方法如手术方法、基于细胞的疗法和药物递送中和在生物医学研究中例如细胞和组织培养方法中以及在组织工程中。

背景技术

以下包含可能有助于理解本发明的信息。这并非承认本文所提供的任何信息是现有技术或与当前描述或要求保护的发明相关，或并非承认任何具体或隐含引用的出版物或文件是现有技术。贯穿本说明书，任何对现有技术的讨论决不应被视为承认此类现有技术是众所周知的或构成所属领域的一般常识的一部分。

生物相容性材料对许多治疗和科学方法至关重要。例如，能够在限定时间内安全溶解的缝线对于许多手术方法是必不可少的，而植入物和可植入组合物，如用于持续药物递送的可植入组合物等有利地是生物相容的、非炎性的和安全的。进一步地，当此类植入物和可植入组合物被设计成在其功能使用期内或之后降解时，理想地，降解产物本身同样是生物相容的和安全的。

无论材料是直接用于例如受试者身上或体内，还是间接用于如基于细胞的疗法或工程化组织的制备，生物相容性都是重要的。例如，在前一种情况下，生物相容性粘合剂可以减少与刺激、瘢痕和不适相关的并发症。例如，在后一种情况下，组织和器官工程的支架通常由可生物降解的合成聚合物合成，但许多此类合成聚合物具有低生物相容性和/或低机械强度，或在生理条件下未达最佳的降解曲线，因此限制了其用途。

尽管明确认识到在医学疗法和许多研究方法中使用的材料的生物相容性是可取的，但对于许多此类疗法和方法而言，生物相容性选项要么不存在，要么存在一个或多个缺陷。例如，在眼科手术的背景下，现有的手术粘合剂通常是合成的，并且与瘢痕和毒副作用有关。

因此需要开发用于多种治疗和研究用途的新的生物相容性材料，包含例如用于手术和药物递送用途。

因此，本发明的一个目的是提供包括晶体蛋白的一种或多种生物相容性材料，或至少为现有的生物材料和对其依赖的方法提供有用的替代物，或至少为公众提供有用的选择。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种生物相容性组合物，其包括：

一种或多种分离的、纯化的、重组的或合成的蛋白质，所述蛋白质选自包括以下的组：

a)α-晶体蛋白；

b)β-晶体蛋白；

c)γ-晶体蛋白；

d)来自长尾鳕(蓝尖尾无须鳕(Macruronus novaezelandiae))的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

e)来自智人(Homo sapiens)的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

f)包括本文在表1中鉴定的氨基酸序列的蛋白质；

g)包括来自以上a)到f)中的任一项的至少约10个连续氨基酸或由其组成的多肽；

h)与以上a)到g)中的任一项具有至少约90％氨基酸同一性的蛋白质；

i)根据以上a)到h)中的任一项的蛋白质，所述蛋白质在体内具有晶体蛋白的天然结构；

j)以上a)到i)中的两项或更多项的任何组合；

任选地一种或多种增塑剂；

任选地一种或多种共引发剂；以及

一种或多种交联剂。

另一方面，本发明涉及一种生物聚合物组合物，其包括选自包括以下的组的蛋白质：

a)α-晶体蛋白；

b)β-晶体蛋白；

c)γ-晶体蛋白；

d)来自长尾鳕(蓝尖尾无须鳕)的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

e)来自智人的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

f)包括本文在表1中鉴定的氨基酸序列的蛋白质；

g)包括来自以上a)到f)中的任一项的至少约10个连续氨基酸或由其组成的多肽；

h)与以上a)到g)中的任一项具有至少约90％氨基酸同一性的蛋白质；

i)根据以上a)到h)中的任一项的蛋白质，所述蛋白质在体内具有晶体蛋白的天然结构；

j)以上a)到i)中的两项或更多项的任何组合；

任选地一种或多种增塑剂；

任选地一种或多种共引发剂；以及

一种或多种交联剂；

其中所述一种或多种蛋白质可交联以形成聚合物。

在各个实施例中，所述一种或多种蛋白质在体内是可交联的。

一方面，本发明涉及体内胶凝组合物，所述组合物包括：

a)α-晶体蛋白；

b)β-晶体蛋白；

c)γ-晶体蛋白；

d)来自长尾鳕(蓝尖尾无须鳕)的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

e)来自智人的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

f)包括本文在表1中鉴定的氨基酸序列的蛋白质；

g)包括来自以上a)到f)中的任一项的至少约10个连续氨基酸或由其组成的多肽；

h)与以上a)到g)中的任一项具有至少约90％氨基酸同一性的蛋白质；

i)根据以上a)到h)中的任一项的蛋白质，所述蛋白质在体内具有晶体蛋白的天然结构；

j)以上a)到i)中的两项或更多项的任何组合；

任选地一种或多种增塑剂；

任选地一种或多种共引发剂；以及

一种或多种交联分子；

其中所述体内胶凝组合物至少部分地在受试者体内或身上的目标部位聚合和/或胶凝，或者其中当存在于受试者体内或身上的目标部位时，所述体内胶凝组合物发生交联或开始交联。

因此，在一个实施例中，所述生物相容性组合物是被调配成至少部分地在受试者体内或身上的目标部位聚合和/或胶凝的体内胶凝组合物，或者其中所述生物相容性组合物是被调配成使得当存在于受试者体内或身上的目标部位时所述体内胶凝组合物的交联发生或被引发的体内胶凝组合物。

本发明的另一方面涉及一种用于产生交联的生物聚合物组合物的方法，所述方法包括：

提供包括以下的组合物：

a)α-晶体蛋白；

b)β-晶体蛋白；

c)γ-晶体蛋白；

d)来自长尾鳕(蓝尖尾无须鳕)的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

e)来自智人的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

f)包括本文在表1中鉴定的氨基酸序列的蛋白质；

g)包括来自以上a)到f)中的任一项的至少约10个连续氨基酸或由其组成的多肽；

h)与以上a)到g)中的任一项具有至少约90％氨基酸同一性的蛋白质；

i)根据以上a)到h)中的任一项的蛋白质，所述蛋白质在体内具有晶体蛋白的天然结构；

j)以上a)到i)中的两项或更多项的任何组合；

k)任选地一种或多种增塑剂；

l)任选地一种或多种共引发剂；以及

使所述组合物与一个或多个交联分子接触；

引发交联，由此形成交联的生物聚合物组合物。

本发明的另外的方面涉及一种用于产生包括一种或多种纯化晶体蛋白的组合物的方法，所述方法包括：

i.提供脊椎动物眼组织；

ii.在适合于维持天然晶体蛋白结构的条件下在存在提取缓冲液的情况下使所述组织均质化；

iii.例如通过离心或过滤来将液体匀浆与任何残留固体分离，以提供含有晶体蛋白的溶液；

iv.任选地至少部分地进一步纯化所述晶体蛋白；

v.任选地透析所述含有晶体蛋白的溶液以去除所述提取缓冲液；

vi.任选地冻干所述含有晶体蛋白的溶液以提供冻干的晶体蛋白组合物；

vii.任选地例如在0℃或以下储存所述含有晶体蛋白的溶液或所述冻干的晶体蛋白组合物；

其中相当大比例的所述纯化的晶体蛋白保持其天然结构。

因此，在一个实施例中，所述用于产生包括一种或多种纯化晶体蛋白的组合物的方法包括：

i.提供脊椎动物眼组织；

ii.在存在具有生理pH的提取缓冲液的情况下使所述组织均质化，其中所述匀浆维持在低于约15℃的温度下；

iii.例如通过离心或过滤来将液体匀浆与任何残留固体分离，以提供含有晶体蛋白的溶液；

iv.任选地至少部分地进一步纯化所述晶体蛋白；

v.任选地透析所述含有晶体蛋白的溶液以去除所述提取缓冲液；

vi.任选地冻干所述含有晶体蛋白的溶液以提供冻干的晶体蛋白组合物；

vii.任选地例如在0℃或以下储存所述含有晶体蛋白的溶液或所述冻干的晶体蛋白组合物；

其中相当大比例的所述纯化的晶体蛋白保持其天然结构。

在一个实施例中，适合于维持天然晶体蛋白结构的条件包括：

a.将所述匀浆维持在pH为7或更大的提取缓冲液中；或者

b.将所述匀浆维持在生理pH下；或者

c.将所述匀浆维持在低于约15℃的温度下；

d.以上a)和c)两者；或者

e.以上b)和c)两者。

在一个实施例中，适合于维持天然晶体蛋白结构的条件包括：

a.将所述匀浆维持在pH为7或更大的提取缓冲液中；或者

b.将所述匀浆维持在生理pH下；或者

c.将所述匀浆维持在低于约15℃的温度下；

d.以上a)和c)两者；或者

e.以上b)和c)两者；

并且所述方法包括：

通过离心或过滤将所述液体匀浆与任何残留固体分离，以提供含有晶体蛋白的溶液；

透析所述含有晶体蛋白的溶液以去除所述提取缓冲液；

任选地冻干所述含有晶体蛋白的溶液以提供冻干的晶体蛋白组合物；

在适于维持天然晶体蛋白结构的条件下，例如在约4℃或以下维持所述含有晶体蛋白的溶液或所述冻干的晶体蛋白组合物，直至使用；

其中相当大比例的所述纯化的晶体蛋白保持其天然结构。

因此，在一个实施例中，所述用于产生包括一种或多种纯化晶体蛋白的组合物的方法包括：

i.提供脊椎动物眼组织；

ii.在存在pH为7或更大的提取缓冲液的情况下使所述组织均质化，其中所述匀浆维持在低于约15℃的温度下；

iii.通过离心或过滤将所述液体匀浆与任何残留固体分离，以提供含有晶体蛋白的溶液；

iv.透析所述含有晶体蛋白的溶液以去除所述提取缓冲液；

v.任选地冻干所述含有晶体蛋白的溶液以提供冻干的晶体蛋白组合物；

vi.在约4℃或以下维持所述含有晶体蛋白的溶液或所述冻干的晶体蛋白组合物，直至使用；

其中相当大比例的所述纯化的晶体蛋白保持其天然结构。

在一个实施例中，脊椎动物眼组织是晶状体组织。

在一个实施例中，脊椎动物眼组织是超声乳化材料。

在一个实施例中，脊椎动物眼组织是来自鱼例如深海鱼的眼组织。在一个实施例中，脊椎动物眼组织是来自长尾鳕的眼组织，如长尾鳕眼晶状体组织。

在一个实施例中，脊椎动物眼组织是来自哺乳动物的眼组织，如人、牛、猪、山羊、绵羊或鹿眼组织。

在一个实施例中，脊椎动物眼组织是来自智人的眼组织，如智人眼晶状体组织。

在一个实施例中，脊椎动物眼组织来自超声乳化手术。

在一个实施例中，提取缓冲液包括三(羟甲基)氨基甲烷、NaCl、叠氮化钠中的一种或多种，或其两种或更多种的任何组合。

在一个实施例中，提取缓冲液处于生理pH下，如从中获得晶体蛋白的生物体的生理pH。在一个实施例中，提取缓冲液的pH大于7。例如，提取缓冲液的pH在约7到约9的范围内。

在一个实施例中，提取缓冲液以每克眼组织至少约2mL缓冲液的比率存在。

在一个实施例中，均质化在避免或最小化对一种或多种晶体蛋白同种型的破坏和/或避免或最小化蛋白质聚集的条件下执行。例如，尽可能避免破坏和/或聚集，以避免或最小化晶体蛋白纳米原纤维的形成，或者避免或最小化非天然存在的蛋白质构象异构体的形成。

在一个实例中，均质化在生理pH下执行，例如，在具有生理pH的缓冲液中执行。在一个实例中，均质化在大于约7的pH下执行。在一个实例中，均质化在低剪切条件下执行。在一个实例中，均质化在存在一种或多种稳定添加剂，例如精氨酸的情况下执行。

在一个实例中，均质化在低温下执行。在一个实施例中，均质化在约0℃到约5℃的温度下发生。在一个实施例中，均质化穿插有不执行均质化的静止阶段，例如，穿插有将匀浆放置在冰上持续一段时间的冷却阶段。

在一个实施例中，在低于5℃下对水执行透析，例如对纯化水如Milli-Q水执行透析。

在一个实施例中，在存在稳定剂的情况下储存纯化晶体蛋白。例如，在存在精氨酸、甘氨酸或其组合的情况下储存纯化晶体蛋白。

在各个实施例中，保持其天然结构的纯化晶体蛋白的相当大的比例大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、大于约95％或大于约99％。在各个实施例中，天然结构的保持是通过本领域众所周知的方法确定的，所述方法包含但不限于圆二色性、NMR或天然PAGE。

在一个实施例中，用于产生包括一种或多种纯化晶体蛋白的组合物的方法基本上如本文实例中所述。

在另外的方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中进行组织闭合的方法，所述方法包括：

任选地施加力以闭合裂伤、损伤、切口或伤口；

使裂伤、损伤、切口或伤口或所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的部位与如本文所述的含有晶体蛋白的组合物接触，任选地其中所述含有晶体蛋白的组合物至少部分地交联，

任选地施加力以闭合所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口，

引发和/或维持交联；

维持所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的闭合持续足以发生交联的时间；

其中晶体蛋白的应用和/或交联形成粘合剂组合物。

在另外的方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中进行组织闭合的方法，所述方法包括：

任选地施加力以闭合裂伤、损伤、切口或伤口；

使裂伤、损伤、切口或伤口或所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的部位与如本文所述的含有晶体蛋白的组合物接触，

任选地施加力以闭合所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口，

引发交联；

维持所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的闭合持续足以发生交联的时间；

其中所述晶体蛋白的交联形成粘合剂组合物。

在一个实施例中，组织闭合方法是闭合手术切口的方法。

在一个实施例中，组织闭合方法是无缝线闭合的方法。例如，无缝线闭合是无缝线皮肤闭合、无缝线伤口闭合或无缝线手术切口闭合。

在一个实施例中，手术是眼科手术。在一个实例中，眼科手术是白内障手术、结膜移植、包含平坦部玻璃体切除术的玻璃体切除术、屈光性晶状体置换术、晶状体植入术或晶状体替换手术。在另一个实例中，眼科手术是视网膜脱离手术，包含合并视网膜固定术或巩膜扣带术的视网膜手术、黄斑裂孔手术、结膜闭合术、青光眼手术、滤过泡渗漏手术、小梁切除术、睑缝合术、羊膜移植术、角膜穿孔手术、包含翼状胬肉切除术的翼状胬肉手术、后囊人工晶状体植入术、上皮向内生长手术、包含板层角膜移植术的角膜移植术、深前板层角膜移植术、包含双侧斜视手术的斜视手术、眼睑皮肤移植手术或粘膜移植手术。

在一个实施例中，组合物通过如前房插管(Rycroft插管)等眼科手术装置涂施。

在各个实施例中，通过应用如绷带、缝线、网片等一种或多种医疗辅助器材或者通过如夹紧裂伤、损伤、切口或伤口或保持其闭合等(通常是暂时的)物理力来维持裂伤、损伤、切口或伤口闭合持续足以发生交联的时间。

在各个实施例中，维持裂伤、损伤、切口或伤口的闭合持续足以发生大于约60％交联，例如，发生大于约70％交联、发生大于约80％交联、发生大于约90％交联或发生大于约95％交联的时间。

在一个实施例中，组合物中存在的交联剂是光交联剂，其中交联的引发是通过暴露于光。例如，在一个实施例中，交联剂是UV交联剂，如但不限于1-羟基环己基-1-苯基酮(例如，Irgacure 184)、2,2二甲氧基-2-苯基苯乙酮(例如，Irgacure 651)、核黄素或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)，并且通过暴露于UV光(365nm)引发。在另一个实施例中，交联剂是可见光交联剂，如包括曙红Y(EY)和三乙醇胺(TEOA)的可见光激活系统，并且通过暴露于可见光(530nm)引发。

在一个实施例中，本发明涉及一种在有需要的受试者中进行组织闭合的方法，其中所述受试者正在经历或已经经历眼科手术，所述方法包括：

使手术切口或所述手术切口的部位与如本文所述的含有晶体蛋白的组合物接触，任选地其中所述含有晶体蛋白的组合物至少部分地交联；

任选地施加力以闭合所述切口；

引发和/或维持交联；

维持所述手术切口的闭合持续足以发生交联的时间；

其中晶体蛋白的应用和/或交联形成能够维持手术切口的闭合的粘合剂组合物。

在另一个实施例中，本发明涉及一种在有需要的受试者中进行组织闭合的方法，其中所述受试者正在经历或已经经历眼科手术，所述方法包括：

使手术切口或所述手术切口的部位与如本文所述的含有晶体蛋白的组合物接触；

任选地施加力以闭合所述切口；

引发交联；

维持所述手术切口的闭合持续足以发生交联的时间；

其中所述晶体蛋白的交联形成能够维持所述手术切口的闭合的粘合剂组合物。

在一个实施例中，粘合剂组合物能够在不存在缝线或其它闭合辅助器材的情况下维持手术切口的闭合。

在一个实施例中，粘合剂组合物的折射率等于受试者眼睛的折射率。在一个实施例中，粘合剂组合物跨可见光谱具有高透过率。

在另外的方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的眼外伤或眼切口的方法，所述方法包括以下步骤：

i.使眼外伤或眼切口与如本文所述的含有晶体蛋白的组合物接触，任选地其中含有晶体蛋白的组合物至少部分地交联；

以及

ii.引发和/或维持交联；

其中交联形成生物粘附聚合物组合物。

另一方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的眼外伤或眼切口的方法，所述方法包括以下步骤：

i.使眼外伤或眼切口与如本文所述的组合物接触；

以及

ii.引发交联；

其中所述交联形成生物粘附聚合物组合物。

另一方面，本发明涉及一种向有需要的受试者递送一种或多种活性剂的方法，所述方法包括：

提供如本文所述的包括晶体蛋白的组合物，其中所述组合物另外包括一种或多种活性剂，使所述受试者与所述组合物接触；

任选地引发组合物的交联，

由此向所述有需要的受试者递送所述活性剂。

在某些实施例中，使受试者与组合物接触包括将组合物施用于受试者身上或体内的目标部位，包含例如手术施用。

在仍另外的方面，本发明涉及一种培养一个或多个细胞或组织的方法，所述方法包括：

提供一个或多个待培养细胞；

使所述一个或多个细胞与包括如本文所述的组合物的基材接触；

使所述一个或多个细胞在适合于继续生存、生长、复制和/或分化的条件下与所述基材以及任选地与另外的生长培养基接触一段时间。在各个实施例中，如本文所述的组合物包括γ-晶体蛋白。在一个实施例中，γ-晶体蛋白包括组合物中存在的晶体蛋白的至少约10％w/w。

在一个实施例中，一个或多个细胞包括一个或多个具有复制能力的细胞。

在一个实施例中，一个或多个是一个或多个干细胞。

在一个实施例中，基材是由如本文所述的组合物形成的薄膜，例如具有足够的机械强度和/或弹性以使得与其接触的细胞能够转移到另一个位置的薄膜。在一个实例中，所述位置是第二培养器皿。在另一个实例中，所述位置在受试者身上或体内，例如，手术部位。例如，一个或多个细胞是一个或多个眼细胞或源自眼睛的一个或多个干细胞，并且所述手术部位在眼睛中或眼睛上。在一个实例中，一个或多个细胞是一个或多个角膜缘干细胞。在另一个实例中，一个或多个细胞是一个或多个基质干细胞。在仍另一个实例中，一个或多个细胞是一个或多个视网膜色素上皮细胞。在另一个实例中，一个或多个细胞是一个或多个全能干细胞、一个或多个多潜能干细胞或一个或多个多能干细胞。

在一个实施例中，基材是由如本文所述的组合物形成的凝胶。例如，基材是具有至少一个厚度足以允许形成3D细胞培养物的区域的凝胶。

因此，在一个实施例中，培养一个或多个细胞或组织的方法是培养来自脊椎动物眼睛的一个或多个细胞的方法，所述方法包括：

提供一个或多个待培养脊椎动物眼细胞；

使所述一个或多个细胞与包括如本文所述的组合物的基材接触，其中所述基材是光学透明的；

使所述一个或多个细胞在适合于继续生存、生长、复制和/或分化的条件下与所述基材以及任选地与另外的生长培养基接触一段时间；

其中所述基材具有足够的机械耐久性，以支持向受试者的眼睛进行的转移和/或与手术应用相关的处理。

在仍另外的方面，本发明涉及一种如本文所述的组合物的用途，其用于制备用于疗法的药剂，例如，用于本文所述的治疗方法中的任一种中。在一个实施例中，药剂用于如眼科手术等手术，包含本文所列举的手术方法中的任一种。还考虑了一种如本文所述的组合物的用途，其用于制备供体外使用的药剂或组合物，包含采用体外步骤的治疗或研究方法。

在另外的方面，本发明涉及用于治疗的如本文所述的组合物，例如，用于本文所述的治疗方法中的任一种。在一个实施例中，用途用于如眼科手术等手术中，包含本文所列举的手术方法中的任一种。还考虑了如本文所述的组合物用于体外治疗或研究方法，或采用体外步骤的治疗或研究方法。

在另外的方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的与干细胞缺乏相关的眼部病症的方法，所述方法包括使眼睛与包括以下的治疗组合物接触：

i.干细胞，所述干细胞任选地根据如本文所述的培养方法进行培养；

以及任选地

ii.如本文所述的生物相容性组合物或生物聚合物组合物。

在一个实施例中，眼部病症包括角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)或相关病症。在另一个实施例中，眼部病症包括黄斑变性，如年龄相关性黄斑变性(ARMD)或相关病症。在仍另一个实施例中，眼部病症包括遗传性视网膜疾病(IRD)或相关病症。

在另外的实施例中，治疗组合物包括至少一个角膜缘干细胞。在另一个实施例中，治疗组合物包括至少一种基质干细胞。在另一个实施例中，治疗组合物包括至少一种视网膜色素上皮细胞。在另一个实施例中，治疗组合物包含至少一种全能干细胞、至少一种多潜能干细胞或至少一种多能干细胞中的一种或多种。

在另外的实施例中，治疗组合物包括由如本文所述的组合物形成的薄膜。

在一个实施例中，在存在如本文所述的生物相容性组合物或生物聚合物组合物的情况下对一种或多种干细胞进行培养，持续足以允许一个或多个细胞粘附到组合物的时间。

例如，在存在如本文所述的生物相容性组合物或生物聚合物组合物的情况下将所述一种或多种干细胞培养至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天或至少约28天。

在一个实施例中，在存在如本文所述的生物相容性组合物或生物聚合物组合物的情况下对一种或多种干细胞进行培养，持续足以允许组合物上或中的一个或多个细胞生长的时段。例如，在适合于允许细胞数量增加的条件下培养细胞。

在特别考虑的实施例中，在适合的条件下培养细胞并持续足以允许细胞数量增加、细胞生长、粘附、细胞密度增加和/或全能干细胞、多潜能干细胞或多能干细胞表型的维持中的一种或多种的时段。

在一个实施例中，使眼睛与治疗组合物接触包括到眼表面的手术移植。

在一个实施例中，眼睛与治疗组合物接触足以允许干细胞中的一种或多种转移到眼睛的时段。例如，维持接触至少24小时的时段，例如48小时、72小时或96小时。在其它实例中，接触维持5天或更长时间，例如，6天、7天、8天、9天、10天或多于10天。通常，在可能的情况下，接触维持7天或更长时间。

在各个实施例中，在存在如本文所述的生物相容性组合物或生物聚合物组合物的情况下以足以提供每cm²组合物约1×10²到约1×10⁷个细胞的量培养细胞。例如，以足以提供每cm²组合物约1×10³到约1×10⁶个细胞的量培养细胞。在另一个实例中，细胞以足以提供以下的量进行培养：每cm²约1×10⁴到约1×10⁶个细胞，或每cm²约5×10⁴到约1×10⁶个细胞，或每cm²约5×10⁴到约5×10⁵个细胞，或每cm²约1×10⁵到约5×10⁵个细胞。

在一个实施例中，眼睛与包括每cm²至少约1×10²个细胞的治疗组合物接触。例如，眼睛与包括以下的治疗组合物接触：每cm²组合物至少约1×10³个细胞，例如每cm²组合物至少约1×10⁴个细胞、每cm²组合物至少约1×10⁵个细胞、每cm²组合物至少约1×10⁶个细胞或每cm²组合物至少约1×10⁷个细胞。在另一个实例中，眼睛与包括每cm²组合物至少约1×10³个细胞到每cm²组合物约1×10⁶个细胞的治疗组合物接触。在另一个实例中，眼睛与包括以下的治疗组合物接触：每cm²至少约1×10⁴到约1×10⁶个细胞，或每cm²约5×10⁴到约1×10⁶个细胞，或每cm²约5×10⁴到约5×10⁵个细胞，或每cm²约1×10⁵到约5×10⁵个细胞。

在另外的方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的眼部病症的方法，所述方法包括：

提供如本文所述的生物相容性组合物，其中所述生物相容性组合物包括一种或多种活性剂，

向所述受试者施用所述生物相容性组合物，以允许将所述一种或多种活性剂转移到所述受试者。

在另外的方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的眼部病症的方法，所述方法包括：

提供如本文所述的生物相容性组合物，其中所述生物相容性组合物包括一种或多种干细胞，

向所述受试者施用所述生物相容性组合物，以允许将所述干细胞中的一种或多种干细胞转移到所述受试者。

在一个实施例中，生物相容性组合物施用于受试者的眼睛。例如，通过手术将生物相容性组合物施用于受试者的眼睛，包含例如通过如本文所述的手术方法之一。

在一个实施例中，眼部病症与如一个或多个干细胞等一个或多个细胞的缺乏有关。

在一个实施例中，眼部病症包括角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)或相关病症。在另一个实施例中，眼部病症包括黄斑变性，如年龄相关性黄斑变性(ARMD)或相关病症。在仍另一个实施例中，眼部病症包括遗传性视网膜疾病(IRD)或相关病症。

在另外的实施例中，治疗组合物包括至少一个角膜缘干细胞。在另一个实施例中，治疗组合物包括至少一种基质干细胞。在另一个实施例中，治疗组合物包括至少一种视网膜色素上皮细胞。在另一个实施例中，治疗组合物包含至少一种全能干细胞、至少一种多潜能干细胞或至少一种多能干细胞中的一种或多种。

在另外的实施例中，治疗组合物包括由如本文所述的组合物形成的薄膜。

在各个实施例中，在施用于受试者时，生物相容性组合物包括约1×10²到约1×10⁸个细胞。例如，施用足够的生物相容性组合物以向受试者的眼睛提供约1×10²到约1×10⁸个细胞。在某些实施例中，施用生物相容性组合物以提供每cm²组合物约1×10²个细胞。例如，施用生物相容性组合物以提供每cm²组合物至少约1×10³个细胞，例如每cm²组合物至少约1×10⁴个细胞、每cm²组合物至少约1×10⁵个细胞、每cm²组合物至少约1×10⁶个细胞或每cm²组合物至少约1×10⁷个细胞。在另一个实例中，施用生物相容性组合物以提供每cm²组合物至少约1×10³个细胞到每cm²组合物约1×10⁶个细胞。在另一个实例中，施用生物相容性组合物以提供每cm²至少约1×10⁴到约1×10⁶个细胞，或每cm²约5×10⁴到约1×10⁶个细胞，或每cm²约5×10⁴到约5×10⁵个细胞，或每cm²约1×10⁵到约5×10⁵个细胞。

在一个实施例中，施用于眼表面。在一个实施例中，生物相容性组合物是如本文所述的粘合剂组合物，其对眼表面具有足够的粘附力，以在足以允许细胞中的一个或多个细胞转移的时段内保持粘附于眼表面。在一个实例中，组合物的施用不涉及任何另外的一种或多种粘合剂的应用。例如，组合物的施用不涉及缝合。

因此，在一个实施例中，治疗有需要的受试者的眼部病症的方法包括：

提供如本文所述的生物相容性组合物，其中所述生物相容性组合物包括一个或多个角膜缘干细胞、一个或多个基质干细胞、一个或多个视网膜色素上皮细胞或其任何组合；

向受试者的眼睛施用生物相容性组合物，以允许将干细胞中的一个或多个干细胞转移到受试者的眼睛。

在另外的实施例中，治疗有需要的受试者的眼部病症的方法包括：

提供如本文所述的生物相容性组合物，其中所述生物相容性组合物包括一个或多个全能干细胞、一个或多个多潜能干细胞、一个或多个多能干细胞或其任何组合；

向受试者的眼睛施用生物相容性组合物，以允许将干细胞中的一个或多个干细胞转移到受试者的眼睛。

本文所述的实施例中的任何实施例可以涉及本文呈现的方面中的任何方面。

在各个实施例中，组合物是粘合剂组合物、凝胶组合物或薄膜组合物。

在一个实例中，粘合剂组合物是手术粘合剂。

在一个实例中，凝胶组合物是或者包括接触晶状体，包含用于手术用途和/或药物递送的接触晶状体。

在一个实例中，凝胶组合物用于细胞粘附、培养或生长，包含作为用于2D或3D细胞培养和/或组织生长或组织工程的基材。

在一个实例中，薄膜组合物是用于细胞粘附、培养或生长的基材，或用于细胞运输或递送的基材。

在另一个实例中，薄膜组合物用于包装。

在各个实施例中，一种或多种晶体蛋白是从脊椎动物眼组织中分离和/或纯化的晶体蛋白。

在一个实施例中，一种或多种晶体蛋白是重组晶体蛋白。

在各个实施例中，一种或多种晶体蛋白是选自包括以下的组的晶体蛋白：α-晶体蛋白、β-晶体蛋白、γ-晶体蛋白和其任何两种或更多种的组合。在一个实例中，α-晶体蛋白是αA-晶体蛋白。在一个实例中，α-晶体蛋白是αB-晶体蛋白。

在各个实施例中，一种或多种晶体蛋白的天然二级结构得以维持，一种或多种晶体蛋白的天然三级结构得以维持，和/或一种或多种晶体蛋白的天然四级结构得以维持。例如，一种或多种晶体蛋白基本上不含纳米原纤维或其它破坏的结构形式。

在各个实施例中，组合物中存在的晶体蛋白中的至少一些晶体蛋白是天然糖基化的——即，当存在于其所来源、分离或纯化的生物体中时，具有与相同晶体蛋白的糖基化模式和程度相当的糖基化模式和程度。

在各个实施例中，当存在于例如本文所述的薄膜组合物中时，增塑剂选自包括以下的组：多元醇、酸的二酯或三酯、醇的二酯或三酯、聚乙二醇、聚丙二醇和其任何两种或多种的组合。

在一个实施例中，多元醇选自包括以下的组：甘油、丙二醇、聚乙烯醇、山梨醇和麦芽糖醇。

在一个实例中，增塑剂是甘油、山梨醇或其组合。

在一个实施例中，酸的二酯或三酯选自包括以下的组：柠檬酸三乙酯(TEC)、柠檬酸三丁酯(TBC)、乙酰柠檬酸三乙酯(ATEC)、癸二酸二丁酯(DBS)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)。

在一个实施例中，醇的二酯或三酯选自包括以下的组：三乙酸甘油酯(TA)、植物油、分馏椰子油和乙酰化甘油单酯。

在一个实施例中，组合物包括约0.5％w/w到约3％w/w增塑剂。例如，组合物包括约0.5％w/w到约2.5％w/w增塑剂、约1％w/w到约2.5％w/w增塑剂、约1.5％w/w到约2.5％w/w增塑剂或约2％w/w增塑剂。

在各个实施例中，当存在于例如本文所述的薄膜组合物中时，共引发剂是基于生物相容性叔胺的共引发剂，如TEOAH、L-精氨酸等。

在一个实施例中，组合物包括约0.5％w/w到约5％w/w共引发剂。例如，组合物包括约0.5％w/w到约4％w/w共引发剂、约1％w/w到约4％w/w共引发剂、约1.5％w/w到约3％w/w共引发剂或约2％w/w共引发剂。

在各个实施例中，交联剂选自包括以下的组：聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、戊二醛、核黄素、核黄素-5-单磷酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)及其两种或更多种的任何组合。

在一个实施例中，交联剂是光交联剂。例如，光交联剂选自包括以下的组：2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1丙酮(

2959)、1-羟基环己基-1-苯基酮(

184)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(

651)、核黄素、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰次膦酸锂(LAP)、曙红Y(EY)和三乙醇胺(TEOA)、genepin、NHS-EDC、包含NHS-PEG的改性PEG及其两种或更多种的任何组合。

在一个实施例中，组合物包括约0.1％w/w到约1.5％w/w交联剂，如核黄素或核黄素-5-单磷酸酯。例如，组合物包括约0.1％w/w到约1％w/w交联剂、约0.1％w/w到约0.8％w/w交联剂、约0.1％w/w到约0.6％w/w交联剂、约0.1％w/w到约0.5％w/w交联剂、约0.1％w/w到约0.4％w/w交联剂、约0.1％w/w到约0.3％w/w交联剂、约0.1％w/w到约0.2％w/w交联剂或约0.2％w/w交联剂。

在一个实施例中，组合物包括约0.5％w/w到约3％w/w的交联剂，如PEGDE或戊二醛。例如，组合物包括约0.5％w/w到约2.5％w/w交联剂、约1％w/w到约3％w/w交联剂、约1％w/w到约2.5％w/w交联剂、约1％w/w到约3％w/w交联剂、约1.5％w/w到约2.5％w/w交联剂或约2.5％w/w交联剂。

在另一个实施例中，组合物包括约3％w/w到约30％w/w交联剂，如PEGDA。例如，组合物包括约5％w/w到约30％w/w交联剂、约5％w/w到约25％w/w交联剂、约10％w/w到约30％w/w交联剂、约10％w/w到约25％w/w交联剂、约15％w/w到约30％w/w交联剂、约15％w/w到约25％w/w交联剂、约20％w/w到约25％w/w交联剂或约20％w/w交联剂。

在各个实施例中，组合物包括约10mg/mL到约200mg/mL晶体蛋白。例如，组合物包括约30mg/mL到约150mg/mL晶体蛋白、约30mg/mL到约140mg/mL晶体蛋白、约30mg/mL到约130mg/mL晶体蛋白、约30mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白、约30mg/mL到约110mg/mL晶体蛋白、约30mg/mL到约100mg/mL晶体蛋白、约30mg/mL到约90mg/mL晶体蛋白、约30mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白、约30mg/mL到约70mg/mL晶体蛋白或约30mg/mL到约60mg/mL晶体蛋白。

在各个实施例中，例如在涉及粘合剂组合物的实施例中，组合物包括约30mg/mL到约150mg/mL晶体蛋白，例如，约30mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白、约30mg/mL到约110mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约110mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约100mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约90mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约70mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约60mg/mL晶体蛋白或约60mg/mL晶体蛋白。在其它实施例中，例如在涉及粘合剂组合物的实施例中，组合物包括约40mg/mL到约150mg/mL晶体蛋白，例如，约50mg/mL到约150mg/mL晶体蛋白、约60mg/mL到约150mg/mL晶体蛋白、约70mg/mL到约150mg/mL晶体蛋白、约80mg/mL到约150mg/mL晶体蛋白、约80mg/mL到约140mg/mL晶体蛋白、约80mg/mL到约130mg/mL晶体蛋白、约80mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白、约90mg/mL到约130mg/mL晶体蛋白、约90mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白、约100mg/mL到约130mg/mL晶体蛋白、约100mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白、约110mg/mL到约130mg/mL晶体蛋白、约110mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白或约120mg/mL晶体蛋白。

在各个实施例中，例如在涉及凝胶组合物的实施例中，组合物包括约10mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白，例如，约10mg/mL到约110mg/mL晶体蛋白、约10mg/mL到约100mg/mL晶体蛋白、约10mg/mL到约90mg/mL晶体蛋白、约10mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白、约20mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白、约30mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白或约40mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白。

在各个实施例中，例如在涉及包含薄膜组合物的膜组合物的实施例中，组合物包括约50mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白，例如，约50mg/mL到约110mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约100mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约90mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约70mg/mL晶体蛋白、约50mg/mL到约60mg/mL晶体蛋白或约60mg/mL晶体蛋白。

在如但不限于薄膜组合物等某些特别考虑的实施例中，组合物包括约100mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白、约5mM到约10mM戊二醛和约1.5％w/w到约2.5％w/w甘油。例如，组合物包括约120mg/mL晶体蛋白、约5mM到约10mM戊二醛和约2％w/w甘油。

在一个特别考虑的实例中，组合物是包括约60mg/mL晶体蛋白、约2％(v/v)甘油和约2.5％(w/v)PEGDE的薄膜组合物。在一个实例中，所述薄膜组合物特别适用于包装应用。

在另一个特别考虑的实例中，组合物是包括约60mg/mL晶体蛋白、约2％(v/v)甘油和约5mM GA的薄膜组合物。在一个实例中，所述薄膜组合物特别适用于细胞培养应用。

在另一个特别考虑的实例中，组合物是包括约60mg/mL晶体蛋白、约2％(v/v)甘油、约0.2％(w/w晶体蛋白)核黄素-5-磷酸和任选地约0.4％(w/w晶体蛋白)L-精氨酸的薄膜组合物。

在如但不限于粘合剂组合物等某些特别考虑的实施例中，组合物包括约100mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白、约10％w/w到约20％w/w PEGDA和约0.2％w/w到约1.0％w/w光引发剂，如Igracure，例如Igracure 2959。例如，组合物包括约120mg/mL晶体蛋白、约15％w/wPEGDA和约0.5％w/w Igracure 2959。

在某些特别考虑的实施例中，组合物包括约50mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白、约10％w/w到约20％w/w PEGDA和约0.2％w/w到约1.0％w/w光引发剂，如Igracure，例如Igracure2959。例如，组合物包括约60mg/mL晶体蛋白、约15％w/w PEGDA和约0.5％w/wIgracure2959。

在各个实施例中，组合物包括约50mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白、约25％w/w到约50％w/w PEGDA、约0.2％到约1.0％w/w如核黄素等光引发剂和10％w/w到20％w/w如L-精氨酸等共引发剂。例如，组合物包括约60mg/mL晶体蛋白、约50％w/w PEGDA、约0.2％核黄素和约10％L-精氨酸。

在各个实施例中，交联组合物在可见光谱上是光学透明的。例如，交联组合物跨可见光谱(400nm到700nm)的透光率大于约75％，例如，大于约80％或大于约85％。应当理解，光学透明度和/或高透过率，例如可见光谱上的高透过率，将有利于如本文所考虑的薄膜组合物、粘合剂组合物和凝胶组合物。

在各个实施例中，交联组合物的弹性模量为约1MPa到约6MPa。例如，交联组合物的弹性模量为约1.5MPa到约6MPa或约1.6MPa到约6MPa，如约1.6MPa到约5.6MPa。

在各个实施例中，交联组合物的极限抗拉强度(UTS)为约0.1MPa到约1.5MPa。例如，交联组合物的UTS为约0.1MPa到约1MPa或约0.3MPa到约1MPa。

在各个实施例中，交联组合物的0.2％屈服强度为约0.1MPa到约1MPa。

在各个实施例中，由如本文所述的包括约100mg/mL晶体蛋白、约5mM到约10mM戊二醛和约2％甘油的组合物形成的薄膜具有：

i)约10Mpa到约20Mpa的弹性模量；

ii)约0.5Mpa到约1.2Mpa的UTS；

iii)约0.2Mpa到约0.8Mpa的0.2％屈服强度；

iv)以上i)到iii)中的任何两个或更多个。

在各个实施例中，由本文所述的组合物形成的薄膜具有：

i)约0.5Mpa到约4.0Mpa的弹性模量；

ii)约0.1Mpa到约1.0Mpa的UTS；

iii)约0.01Mpa到约0.5Mpa的0.2％屈服强度；

iv)以上i)到iii)中的任何两个或更多个。

在各个实施例中，组合使用两种或更多种如本文所述的组合物。例如，在特别考虑的实施例中，将如本文所述的粘合剂组合物涂施到由如本文所述的组合物形成的薄膜上，例如以提供适合于如眼科手术等手术应用的薄膜粘合剂组合物。

对本文中所公开的数字范围(例如，1到10)的提及旨在也包括提及该范围内的全部有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)，以及该范围内的任何有理数范围(例如，2到8、1.5到5.5和3.1到4.7)。

本发明的其它目的、方面、特征和优点将通过以下描述变得明显。然而，应当理解，虽然详细说明和具体实例指示了本发明的优选实施例，但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得明显。

附图说明

图1示出了如本文实例2中所述的半纯化晶体蛋白样品：a)使用15分钟均质化提取的晶体蛋白和b)使用35分钟均质化提取并透析的晶体蛋白的SDS-PAGE。在加载到凝胶上之前，分别使用缓冲液和Milli-Q以1:100的比例稀释样品。

L＝梯(在左侧以kDa指示的分子量)，C＝粗晶体蛋白提取物。

图2呈现了从不同物种中提取的晶体蛋白的SDS-PAGE，其示出了在所有三种不同来源a)长尾鳕晶状体、b)人晶状体、c)猪晶状体中存在不同类别/子类别的晶体蛋白α、β和γ，并且CE是粗提取物。

图3示出了如实例2中所述提取的粗晶体蛋白的尺寸排阻分离。峰级分对应于总α(红色)、β(蓝色)和γ(绿色)晶体蛋白。

图4是从不同来源a)长尾鳕晶状体、b)人晶状体、c)猪晶状体中提取的晶体蛋白的尺寸排阻色谱图，如实例2中所述。

图5是如本文实例2中所述的重组人α-晶体蛋白的SDS-PAGE。SDS-PAGE揭示了纯化α-晶体蛋白的大小与其20kDa的预测大小相匹配。

图6是以下三项的氨基酸序列比对：(a)来自斑马鱼(D.rerio)和智人(H.sapiens)的αB-晶体蛋白；(b)来自斑马鱼和智人的βA4-晶体蛋白；以及(c)来自智人、牛(B.taurus)和斑马鱼的γB-晶体蛋白。

图7是几种脊椎动物αA-晶体蛋白直系同源物的氨基酸序列比对(来自Runkle等人，2002)。星号指示与斑马鱼序列相同的氨基酸。破折号表示为优化比对而引入的间隙。

图8是几种脊椎动物αB-晶体蛋白直系同源物的氨基酸序列比对(来自Posner等人，1999)。星号指示与斑马鱼序列相同的氨基酸。破折号表示为优化比对而引入的间隙。

图9是如本文实例2中所述的来自长尾鳕鱼晶状体的粗晶体蛋白提取物的圆二色光谱。清晰可见的是以217nm为中心的最小值，其指示晶体蛋白中的β-片状结构。

图10是来自长尾鳕鱼晶状体的粗晶体蛋白提取物的FTIR吸收光谱，如本文实例2中所述。在1631cm^-1处可看到明显的峰，其表示β-片状结构。

图11是描绘晶体蛋白提取物针对TCEP诱导的聚集对溶菌酶的伴侣蛋白样保护的分析的图，如本文实例3中所述。

图12示出了用于确认来自长尾鳕鱼晶状体的粗晶体蛋白提取物的生物相容性的活/死细胞染色的代表性图像，如本文实例3中所述。示出了对照细胞(不存在晶体蛋白)和在存在纯化的α、β和γ-晶体蛋白级分(10mg/mL)的情况下生长的细胞的图像。

图13是示出来自长尾鳕鱼晶状体的粗晶体蛋白提取物对细胞增殖的影响的图，如本文实例3中所述。误差条表示从具有三份样品的3组实验中取得的平均值的标准偏差。

图14是示出来自长尾鳕鱼晶状体的粗晶体蛋白提取物对氧化应激的保护作用的图，如本文实例3中所述。误差条表示从具有三份样品的3组实验中取得的平均值的标准偏差。

图15是描绘示出为保持力的MPa的薄膜组合物的抗拉强度上限(UTS)的图，如实例5中所述。星号表示0.05(*)、0.01(**)和0.01(***)的P值阈值。

图16是描绘薄膜组合物的杨氏模量(弹性模量)值的图，如本文实例5中所述。星号表示0.05(*)、0.01(**)和0.01(***)的P值阈值。

图17是描绘薄膜组合物的延伸值的图，如本文实例5中所述。星号表示0.05(*)、0.01(**)和0.01(***)的P值阈值。

图18是示出通过UV固化获得的晶体蛋白水凝胶的溶胀行为的图，如本文实例5中所述。误差条表示从三份样品中取得的平均值的标准偏差。

图19示出了由如本文实例6中所述的代表性薄膜组合物支撑的用抗α微管蛋白和DAPI染色剂标记的细胞的细胞粘附和生长。所有比例尺均为50μm，在第I行和第III行以20倍可视化，并且在第II行和第IV行以63倍可视化。A-F接种了角膜刮片细胞系1。G-L接种了角膜刮片细胞系2。

图20示出了人角膜上皮细胞在P3处的DAPI染色，如本文实例6中所述。膜调配物F2(A-C)、F3(D-F)、F4(G-I)和TCP对照组(J-L)。时间点第0天(A、D、G、J)、第7天(B、E、H、K)、第14天(C、F、I、L)。图像尺寸14.0mm×15.0mm。

图21是示出如通过人角膜上皮细胞的DAPI核染色可视化的晶体蛋白膜的生物相容性的九张照片，如本文实例6中所述。膜调配物从上到下为F2、F3和F4。从左到右：第0天/粘附、第7天、第14天。5x变焦，全平铺，实线示出13mm盖玻片，虚线示出流延膜的边缘。

图22是示出晶体蛋白膜的生物相容性的三个图，如本文实例6中所述。在第0天(粘附)、第7天和第14天，晶体蛋白膜和组织培养塑料上的细胞数量成倍增加，其中灰色-F2、蓝色-F3、深灰色-F4和浅蓝色是组织培养板。

图23是示出在薄膜组合物上接种的同一天细胞粘附的光学显微镜可视化的六张照片，如本文实例7中所述。所有比例尺均为200μm。顶行，第一分图，F1；顶行，第二分图，F2；顶行，第三分图，F3；底行，第一分图，F4；底行，第二分图，F5；底行，第三分图，F6。

图24是可视化在延长的细胞培养期间薄膜组合物上的细胞生长的四组照片，如本文实例8中所述，其中(a)F2、(b)F3、(c)F4和(d)是阴性玻璃对照组。比例尺＝50um

图25是示出代表性薄膜调配物上的角膜缘外植体(供体2)细胞生长的四张照片，如本文实例9中所述。(A)第7天、(B)第11天和(C)第14天的活细胞成像。(D)在14天固定的外植体培养物上用DAPI标记的波形蛋白(红色)和细胞核的免疫组织化学标记的荧光可视化。比例尺＝200μm。

图26是描绘晶状体薄膜的光学透明度的三个图，如本文实例10中所述。A)F2；B)F3；C)F4。

图27是描绘晶体蛋白膜的光学透明度的三张照片和图，如本文实例10中所述。图像示出了透明膜，其中(a)F2、(b)F3和(c)F4；图-水合时膜的透光率。灰色三角形-F2、蓝色圆圈-F3和深灰色方块-F4。误差条表示从六个样品中取得的平均值的标准偏差。

图28示出了SDS-PAGE，其示出使用不同PEG衍生物和交联剂对晶体蛋白进行的PEG化，如本文实例11中所述：L-梯，1-仅晶体蛋白，2-晶体蛋白+PEG二乙烯(PEGDE)，3-晶体蛋白+在37℃下温育的琥珀酰亚胺基亚甲基PEG(smPEG)；1小时后将4,5,6-戊二醛添加到样品1,2,3中，并在室温下温育1小时；立即将8,9,10-戊二醛添加到样品1,2,3中，并将样品分别在37℃下温育1小时。

图29是证明含有PEGDA+晶体蛋白的水凝胶的透明度的照片，如本文实例12中所述。上图：UV照射5分钟后的PEGDA +irgacure 2959；中间：UV照射5分钟后60mg/mL的PEGDA+irgacure 2959+晶体蛋白；下图：UV照射5分钟后120mg/mL的PEGDA+irgacure 2959+晶体蛋白。

图30是描绘基于PEGDA的晶体蛋白水凝胶的光学透明度的图，如本文实例12中所述。

图31是描绘基于PEGDA的晶体蛋白水凝胶的FTIR分析的图，如本文实例12中所述，其示出了仅PEGDA(蓝色)和基于PEGDA的晶体蛋白水凝胶(黑色)。

图32呈现了用于确定晶体蛋白膜的润湿性的接触角测量的代表性图像，如本文实例13中所述。

图33是示出晶体蛋白膜的稳定性的图，如本文实例13中所述。灰色-F2、蓝色-F3和深灰色-F4，其中误差条表示从六个样品中取得的平均值的标准偏差。

图34是呈现晶体蛋白膜的灭菌结果的两个圆二色光谱图，如本文实例13中所述。a)来自F2膜的晶体蛋白和b)来自F3膜的晶体蛋白，其中实线表示在milliQ中温育24小时的膜，并且虚线是在milliQ中温育24小时的γ灭菌膜。

图35呈现了(a)在室温下储存3个月、(b)经γ灭菌、(c)在γ辐照后与膜样品水合的晶体蛋白膜的代表性图像，如本文实例13中所述。

图36是描绘基于PEGDA的晶体蛋白粘合剂的粘合功效的两张照片，如本文实例14中所述。(a)暴露3分钟后的样品，(i)仅PEGDA，(ii)基于PEGDA的晶体蛋白；(b)对样品进行物理拉伸(强制)以重新打开切口。

图37是呈现在固化之前和之后用于(a)UV固化、(b)可见光固化的优化调配物的可视化的三张照片，如本文实例15中所述。

图38是示出基于PEGDA的晶体蛋白粘合剂在猪眼粘附模型中的粘合功效的两张照片，如本文实例15中所述。(a)具有切口的眼部样品，(b)在应用晶体蛋白水凝胶并用UV固化3分钟之后。

图39是示出在使用猪眼模型的缝合试验中建立的晶体蛋白膜的手术易处理性的三张照片，如本文实例15中所述。

图40是呈现关于在涂施于猪皮肤样品的搭接剪切测试中确定的UV固化的晶体蛋白生物粘合剂调配物的粘合强度的数据的照片和图，如本文实例15中所述。上图：用于搭接剪切测试的猪皮肤粘附样品的代表性图像。下图：UV固化的晶体蛋白生物粘合剂调配物的粘合强度与取自文献的纤维蛋白胶值的比较(Nakayama和Matsuda，1999)。误差条表示从六个样品中取得的平均值的标准偏差。

图41是示出使用来自F2载体膜上的角膜缘外植体的脱细胞人角膜的晶体蛋白膜作为细胞载体的功效的四张照片，如本文实例16中所述，其中(a)无细胞对照组，(b)角膜置于培养细胞顶部，(c)角膜置于培养细胞下面和(d)角膜置于培养细胞下面，10倍放大。比例尺＝500μm。

图42是示出如本文实例17中所述的单层薄膜的药物递送特性的四个图。A)在PBS中释放的药物百分比，如在230nm处测量的；B)在PBS中释放的药物百分比，如在271nm处测量的；C)在PBS中释放的药物的溶液浓度，如在230nm处测量的；D)在PBS中释放的药物的溶液浓度，如在271nm处测量的。

图43是示出如本文实例17中所述的多层薄膜的药物递送特性的四个图。A)在PBS中释放的药物的溶液浓度，如在230nm处测量的；B)在PBS中释放的药物百分比，如在230nm处测量的；C)在PBS中释放的药物的溶液浓度，如在271nm处测量的；D)在PBS中释放的药物百分比，如在271nm处测量的。

图44是示出药物(四环素)从通过UV固化获得的晶体蛋白水凝胶中释放的图，如本文实例18中所述。黑线数据：7天内四环素的累积释放量占聚合期间添加的四环素(即，新鲜凝胶)的百分比。灰线数据：7天内四环素的累积释放量占吸收到干燥水凝胶中的四环素的百分比。误差条表示从三份样品中取得的平均值的标准偏差。

具体实施方式

本发明涉及包括一种或多种晶体蛋白的生物相容性材料和其用途，包含其在一系列治疗和科学方法中的用途。例如，本发明涉及生物相容性组合物，包含生物相容性组合物的生产过程和其用途，如其在手术、基于细胞的疗法和方法以及药物递送中的用途。因此，本发明还涉及一种或多种晶体蛋白在制备生物相容性组合物中的用途，所述生物相容性组合物如生物相容性粘合剂、水凝胶、薄膜和植入物，包含特别适用于眼部疗法的组合物、粘合剂、水凝胶和植入物。

在各个实施例中，本发明涉及包括一种或多种分离的、纯化的、重组的或合成的蛋白质的生物相容性组合物，所述蛋白质选自包括以下的组：

a)α-晶体蛋白；

b)β-晶体蛋白；

c)γ-晶体蛋白；

d)来自长尾鳕(蓝尖尾无须鳕)的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

e)来自智人的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

f)包括本文在表1中鉴定的氨基酸序列的蛋白质；

g)包括来自以上a)到f)中的任一项的至少约10个连续氨基酸或由其组成的多肽；

h)与以上a)到g)中的任一项具有至少约90％氨基酸同一性的蛋白质；

i)根据以上a)到h)中的任一项的蛋白质，所述蛋白质在体内具有晶体蛋白的天然结构；

j)以上a)到i)中的两项或更多项的任何组合；

任选地一种或多种增塑剂；以及

一种或多种交联剂。

这些组合物有着广泛的用途。然而，如将对技术人员显而易见的，本说明书的重点是此类组合物的治疗和研究应用。

定义

术语“粘合剂组合物”和相关术语是指作为或可以形成能够将两个或更多个表面或分开的物体结合在一起并且至少在一定程度上抗分离的粘合剂的组合物。本文特别考虑了用于手术即作为手术粘合剂的粘合剂组合物。

术语“氨基酸”是指天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。除非另有说明，否则术语“氨基酸”包含D和L立体异构体两者，条件是相应的结构允许此类立体异构形式。

天然氨基酸包含丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gin或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(He或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Tip或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。

非天然氨基酸包含但不限于：氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、萘丙氨酸(“naph”)、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基-甘氨酸(“tBuG”)、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸(“hPro”或“homoP”)、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、3-羟脯氨酸(“3Hyp”)、4-羟脯氨酸(“4Hyp”)、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸(“MeAla”或“Nime”)、包含N-甲基甘氨酸的N-烷基甘氨酸(“NAG”)、N-甲基异亮氨酸、包含N-甲基戊基甘氨酸的N-烷基戊基甘氨酸(“NAPG”)、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸(“Norval”)、正亮氨酸(“Norleu”)、辛基甘氨酸(“OctG”)、鸟氨酸(“Orn”)、戊基甘氨酸(“pG”或“PGly”)、哌啶酸、硫代脯氨酸(“ThioP”或“tPro”)、高赖氨酸(“hLys”)和高精氨酸(“hArg”)。

术语“氨基酸类似物”是指天然或非天然氨基酸，其中C-末端羧基、N-末端氨基和侧链官能团中的一个或多个已被可逆或不可逆地化学封闭，或以其它方式修饰为另一个官能团。例如，天冬氨酸-(β-甲酯)是天冬氨酸的氨基酸类似物；N-乙基甘氨酸是甘氨酸的氨基酸类似物；或丙氨酸甲酰胺是丙氨酸的氨基酸类似物。其它氨基酸类似物包含甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)半胱氨酸亚砜和S-(羧甲基)-半胱氨酸砜。

如本文所使用的，术语“肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的短聚合物。与其它氨基酸聚合物(例如，蛋白质、多肽等)相比，肽的长度通常为约50个氨基酸或更短。肽可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物和/或经修饰的氨基酸。肽可以是天然存在的蛋白质的子序列，也可以是非天然的，包含合成序列。

如本文所使用的，术语“合成肽”涵盖具有不同于在天然肽和/或蛋白质中发现的氨基酸序列的肽。如本文所使用的，“合成肽”可以通过任何合适的方法(例如，重组表达、化学合成、酶促合成等)产生或合成。

术语“肽模拟物(peptide mimetic或peptidomimetic)”是指模拟源自蛋白质或肽的序列的肽样分子。肽模拟物(peptide mimetic或peptidomimetic)可以含有氨基酸和/或非氨基酸组分。肽模拟物的实例包含经化学修饰的肽、类肽(侧基附加到肽主链的氮原子而不是附加到α-碳)、β-肽(氨基键合到β碳而不是α-碳)等。化学修饰包含氨基酸侧基、α-碳原子、末端胺基或末端羧基处的一种或多种修饰。化学修饰可以是添加化学部分、创建新键或去除化学部分。氨基酸侧基处的修饰包含但不限于：赖氨酸ε-氨基的酰化；精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化；谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化；通过赖氨酸ε-氨基与谷氨酸或天冬氨酸侧基羧基的环化形成内酰胺；烃“装订(stapling)”(例如，用于稳定α-螺旋构象)和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺作用。末端胺基的修饰包含但不限于脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基、受限烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)和N-酰基修饰。末端羧基的修饰包含但不限于酰胺、低级烷基酰胺、受限烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)烷基、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1-C4烷基。此外，一个或多个侧基或末端基团可以由普通肽化学工作人员已知的保护基团保护。氨基酸的a-碳可以是单甲基化的或二甲基化的。

将理解，在某些实施例中，本文所述的蛋白质中的任一种蛋白质包括一种或多种非天然存在的氨基酸、一种或多种氨基酸类似物，或者是或包括合成肽或多肽或肽模拟物。

如本说明书中所使用的，词语“包括(comprise/comprises/comprising)”和类似词语不应以排他性或穷举性意义来解释。换句话说，其旨在意指“包含但不限于”。当解释本说明书中包含术语“包括(comprise/comprises/comprising)”的每个陈述时，还可能存在除了所述术语或以所述术语开头的那些特征之外的特征。

多肽的“片段”是多肽的子序列，通常是执行如酶活性或结合活性等活性所需的功能和/或提供多肽或其部分如表位的三维结构的子序列。

如本文所使用的，术语“融合多肽”是指包括两种或更多种氨基酸序列，例如两个或更多个多肽结构域，由肽键通过相应氨基和羧基残基融合以形成单个连续多肽的多肽。应理解，两个或更多个氨基酸序列可以通过其相应的氨基和羧基末端通过接头或间隔子或另外的多肽直接融合或间接融合。

在一个实施例中，包括融合多肽的氨基酸序列之一包括颗粒形成蛋白质，并且包括融合蛋白的一个或多个其它氨基酸序列包括如本文所述的蛋白质。

在本公开的上下文中，“水凝胶”被认为意指含有水但本身不溶于水的聚合物，所述聚合物的分子化学连接以形成三维基质。由于掺入了亲水组分，水凝胶在水中膨胀，体积增加，但在此过程中不会失去其材料内聚力。

如本文所使用的，“凝胶”是指能够至少在一定程度上变形同时基本上保持材料内聚力的固体材料。

如本文所使用的，术语“生理pH”通常是指通常存在于人体中的pH，并且其范围为约7.35到约7.4。然而，在本领域技术人员清楚的某些背景下，包含在本文所述的涉及由样品制备晶体蛋白的制备方法的背景下，生理pH将指通常存在于从中获得样品的生物体中的pH。

如本文所使用的，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其它术语均包含在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何术语或与其互换使用。

术语“多肽”还旨在指多肽的表达后修饰的产物，所述表达后修饰包含但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解裂解或非天然氨基酸的修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定由指定的核酸序列翻译而来。其可以以任何方式产生，包含通过化学合成产生。

本发明的多肽的大小可以为约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或2,000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，但是其不一定具有此类结构。术语糖蛋白是指与至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白质，所述碳水化合物部分通过氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链与蛋白质连接。

因此，本文所考虑的多肽涵盖任何长度的氨基酸链，包含全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本文所述的多肽是纯化天然产物，或者部分或全部使用重组或合成技术产生。所述术语可以指多肽、如二聚体或其它多聚体等多肽的聚集体、融合多肽、多肽变体或其衍生物。

应理解，对于本文所考虑的特定多肽和蛋白质，个体物种之间可以存在天然变异。这些变异可以通过整个序列中的(一种或多种)氨基酸差异或所述序列中的(一个或多个)氨基酸的缺失、取代、插入、倒位或添加来证明。本质上不改变生物学和免疫学活性的氨基酸取代是众所周知的。相关氨基酸之间的氨基酸替换或进化中经常发生的替换尤其是Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val。其他氨基酸取代包含Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。基于此信息，开发了快速且灵敏的蛋白质比较和确定同源蛋白质之间功能相似性的方法。本文所述的示例性实施例的此类氨基酸取代以及具有缺失和/或插入的变异均在本发明的范围内，只要所得蛋白质保留其免疫反应性。这解释了为什么本文所述的一种或多种蛋白质当从不同来源分离时可能具有低于100％的同一性水平而仍表示具有相同特性的相同蛋白质的原因。仍然提供如能够与特异于本文具体鉴定的蛋白质的抗体反应的蛋白质等功能蛋白的本文所述的某种蛋白质的氨基酸序列中的那些变异被认为是本文所鉴定的蛋白质的功能等同物，并且因此本质上不会影响蛋白质的功能。

“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不在其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以从其原生或天然环境中去除。出于本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，通过任何合适的技术至少部分分离、分级或者部分地或基本上纯化的原生或重组多肽也是如此。

在提及多肽(或其片段、变体或衍生物)时使用的术语“基本上纯的”是指如本文所述的根据需要从RNA、DNA、蛋白质或与其天然相关的其它污染物中分离的多肽。例如，当提及蛋白质和多肽时，当蛋白质占含有所述蛋白质的组合物的总蛋白质含量的约50％以上并且通常占总蛋白质含量的约60％以上时，所述蛋白质或多肽被认为是基本上纯的。更典型地，基本上纯的或分离的蛋白质或多肽将占蛋白质总量的至少约75％、至少约80％、至少约85％，更优选地至少约90％、至少约95％。优选地，蛋白质将占组合物中蛋白质总量的约90％以上，并且更优选地，约95％以上。将理解，重组产生或合成蛋白质和多肽的现代方法非常适于产生基本上纯的多肽。

关于多肽的术语“变体”涵盖天然存在的、重组和合成产生的多肽，包含那些包括一种或多种非天然氨基酸、一种或多种氨基酸类似物和肽模拟物的多肽。变体多肽序列优选地展现出与本发明的序列至少50％、更优选地至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在至少20个氨基酸位置，优选地至少50个氨基酸位置，至少100个氨基酸位置的比较窗口上或在本发明的多肽的整个长度上存在同一性。

可以通过以下方式确定多肽序列同一性。使用可从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的bl2seq中的BLASTP(来自BLAST程序套件，版本2.2.10[2004年10月])将主题多肽序列与候选多肽序列进行比较。利用bl2seq的默认参数，但应关闭对低复杂度区域的过滤。

还可以使用全局序列比对程序在候选多核苷酸序列与主题多核苷酸序列之间重叠的整个长度上计算多肽序列同一性。如上所述的EMBOSS-needle(可从http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/获得)和GAP(Huang,X.(1994)“关于全局序列比对(OnGlobal Sequence Alignment)”《计算机在生物科学中的应用(Computer Applications inthe Biosciences)》10,227-235)也是用于计算多肽序列同一性的合适的全局序列比对程序。

本文所考虑的多肽变体还涵盖展现出与具体鉴定的序列中的一个或多个序列具有相似性并且不能合理地预期已经随机出现的多肽变体，所述相似性可能保存那些序列的功能对等。可以使用可从来自NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST程序套件(版本2.2.10[2004年10月])中公开获得的bl2seq程序确定此类关于多肽的序列相似性。可以使用以下unix命令行参数来检查多肽序列的相似性：

bl2seq–i peptideseq1–j peptideseq2-F F–p blastp

当与具体鉴定的序列中的任一序列相比时，变体多肽序列优选地展现出小于1×10^-10，更优选地小于1×10^-20、小于1×10^-30、小于1×10^-40、小于1×10^-50、小于1×10^-60、小于1×10^-70、小于1×10^-80、小于1×10^-90、小于1×10^-100、小于1×10^-110、小于1×10^-120或小于1×10^-123的E值。

参数-F F关闭对低复杂度区段的过滤。参数-p针对序列对选择适当的算法。此程序查找序列之间的相似性区域，并针对每个此类区域报告“E值”，所述E值是人们在包含随机序列的固定参考大小的数据库中碰巧看到这种匹配的预期次数。对于远小于一的较小E值，这大约是这种随机匹配的概率。

本发明还包含在不显著改变多肽序列的生物活性的情况下对所述多肽序列的一个或几个氨基酸的保守取代。技术人员将会知道用于进行表型沉默的氨基酸取代的方法(参见例如Bowie等人,1990,《科学(Science)》247,1306)。

本文所考虑的多肽变体还涵盖由编码多肽的核酸产生的变体，但所述变体与野生型多肽的不同之处在于其加工方式不同使得其具有改变的氨基酸序列。例如，通过初级RNA转录物与产生野生型多肽的替代剪接模式产生变体。

如本文所使用的，“受试者”是动物，通常是哺乳动物，包含哺乳动物伴侣动物或人。代表性伴侣动物包含猫科动物、马科动物和犬科动物。代表性农业动物包含牛、绵羊、山羊、鹿和猪。具体考虑的受试者是商业上用于产乳的受试者，如牛、绵羊和山羊受试者。

术语“载体”是指多核苷酸分子，通常是双链DNA，其用于将基因构建体运输到宿主细胞中。在某些实例中，载体能够在至少一个如大肠杆菌等另外的宿主系统中进行复制。

晶体蛋白

晶体蛋白是存在于所有脊椎动物物种的眼晶状体中的水溶性结构蛋白。晶体蛋白用于维持晶状体所需的折射率，并且包括眼晶状体纤维细胞的蛋白质成分的约90％或更多。

眼睛的晶状体和角膜中存在的晶体蛋白可以分为三个亚组：α-晶体蛋白、β-晶体蛋白和γ-晶体蛋白。眼组织中每个亚组的比例因物种而异：典型的哺乳动物晶状体中大约35％的蛋白质是α-晶体蛋白；在鱼和啮齿动物中，γ-晶体蛋白的比例大于β-晶体蛋白；并且大多数其它物种的晶状体的主要组分是β-晶体蛋白。

α-晶体蛋白

α-晶体蛋白是小热休克蛋白(sHSP)蛋白质组的成员。所有sHSP都含有独特的α-晶体蛋白结构域，其包括约90个氨基酸，具有疏水性N末端结构域和亲水性C末端延伸。存在两个α-晶体蛋白亚基αA和αB。αA和αB晶体蛋白的多分散和低聚性质意味着其大小取决于环境。已发现αA和αB的平均同源寡聚分子量分别为660kDa和620kDa，然而低聚物的范围可以为300到1200kDa。

据报告，晶状体中的α-晶体蛋白有助于防止形成白内障的变性蛋白质的聚集，并增加细胞对压力的耐受性。

β-晶体蛋白和γ-晶体蛋白

β-晶体蛋白和γ-晶体蛋白是结构类似的蛋白质，两者都由两个类似的结构域构成，其中每个结构域都有两个以希腊钥匙图案折叠的类似基序。γ-晶体蛋白是简单的单体，而β-晶体蛋白是一组复杂的低聚物。已发现β-晶体蛋白和γ-晶体蛋白两者均存在于晶状体外部的组织中，但是其具体生物学功能的特性不明显。

具体考虑的晶体蛋白是如αA晶体蛋白或αB晶体蛋白等哺乳动物α-晶体蛋白、如βA晶体蛋白(例如，βA1、βA2、βA3和βA4晶体蛋白)和βB晶体蛋白(例如，βB1、βB2和βB3晶体蛋白)等哺乳动物β-晶体蛋白以及如γS、γA、γB、γC、γD、γE和γF晶体蛋白等哺乳动物γ-晶体蛋白。

进一步具体考虑的晶体蛋白是如αA晶体蛋白或αB晶体蛋白等鱼α-晶体蛋白、如βA晶体蛋白(例如，βA1、βA2和βA4晶体蛋白)和βB晶体蛋白(例如，βB1、βB2和βB3晶体蛋白)等鱼β-晶体蛋白以及如来自例如南极齿鱼(Dissostichus mawsoni)的γM1、γM3、γM4、γM5、γM7、γM8a、γM8b、γM8c、γ8d、γM8e、γM9、γN、γS1和γS2晶体蛋白或来自斑马鱼(Danio rerio)的γM1、γM2a、γM2b、γM2c、γM2d1、γM2d2、γM3、γM4、γM5、γM6、γM7、γMx、γN1、γN2、γS1、γS2、γS3和γS4晶体蛋白等鱼γ-晶体蛋白。

仍进一步具体考虑的来自智人的晶体蛋白在下表1和图6、7和8中阐述。

表1.智人晶体蛋白

晶体蛋白	基因库参考	晶体蛋白	基因库参考	晶体蛋白	基因库参考
						α-A	<u>NP_001300979.1</u>	β-A2	<u>NP_476434.1</u>	γ-A	<u>NP_055432.2</u>
α-B1	<u>NP_001276736.1</u>	β-A3	<u>NP_005199.2</u>	γ-C	<u>NP_066269.1</u>
						α-B	<u>AAP36581.1</u>	β-A4	<u>NP_001877.1</u>	γ-D	<u>NP_008822.2</u>
		β-B1	<u>NP_001878.1</u>	γ-N	<u>NP_653328.1</u>
								β-B2	<u>NP_000487.1</u>	γ-S	<u>NP_060011.1</u>
		β-B3	<u>NP_004067.1</u>
								β-S	<u>XP_018879280.1</u>

将理解，虽然本文具体例示了从天然存在来源纯化的晶体蛋白，但重组或合成的晶体蛋白同样适用于本文所述的方法、组合物和材料。将进一步理解，无论晶体蛋白的来源如何，不希望受任何理论束缚，据信本文所述的组合物和材料的某些有利性质与晶体蛋白在组合物和材料中存在时的天然构象有关。因此，具体考虑了能够提供具有天然构象、结构和修饰(包含翻译后修饰，如糖基化模式)的晶体蛋白的生产方法。因此，本文特别考虑了能够表达或产生晶体蛋白，包含重组或合成的晶体蛋白的核酸、构建体、载体和宿主细胞。

本领域技术人员在阅读本说明书时将认识到，提供了包括晶体蛋白的组合物的各种用途，特别是在包含手术、细胞疗法和药物递送的治疗方法中的各种用途。

本文特别考虑了在手术应用中利用如本文所述的含有蛋白质的组合物中的一种或多种组合物的治疗方法、组合物、试剂和试剂盒。

因此，一方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中进行组织闭合的方法，所述方法包括：

任选地施加力以闭合裂伤、损伤、切口或伤口；

使裂伤、损伤、切口或伤口或所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的部位与如本文所述的含有晶体蛋白的组合物接触，

任选地施加力以闭合所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口，

引发交联；

维持所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的闭合持续足以发生交联的时间；

其中所述晶体蛋白的交联形成粘合剂组合物。

在一个实施例中，组织闭合方法是闭合手术切口的方法。

在一个实施例中，组织闭合方法是无缝线闭合的方法。例如，无缝线闭合是无缝线皮肤闭合、无缝线伤口闭合或无缝线手术切口闭合。

在一个实施例中，手术是眼科手术。在一个实例中，眼科手术是白内障手术、结膜移植、包含平坦部玻璃体切除术的玻璃体切除术、屈光性晶状体置换术、晶状体植入术或晶状体替换手术。在另一个实例中，眼科手术是视网膜脱离手术，包含合并视网膜固定术或巩膜扣带术的视网膜手术、黄斑裂孔手术、结膜闭合术、青光眼手术、滤过泡渗漏手术、小梁切除术、睑缝合术、羊膜移植术、角膜穿孔手术、包含翼状胬肉切除术的翼状胬肉手术、后囊人工晶状体植入术、上皮向内生长手术、包含板层角膜移植术的角膜移植术、深前板层角膜移植术、包含双侧斜视手术的斜视手术、眼睑皮肤移植手术或粘膜移植手术。

在一个实施例中，通过眼科手术装置涂施组合物。

在各个实施例中，通过应用如绷带、缝线、网片等一种或多种医疗辅助器材或者通过如夹紧裂伤、损伤、切口或伤口或保持其闭合等(通常是暂时的)物理力来维持裂伤、损伤、切口或伤口闭合持续足以发生交联的时间。

在各个实施例中，维持裂伤、损伤、切口或伤口的闭合持续足以发生大于约60％交联，例如，发生大于约70％交联、发生大于约80％交联、发生大于约90％交联或发生大于约95％交联的时间。

为免存疑，如本文所使用的交联百分比是指存在于晶体蛋白中的已形成交联并因此参与交联的总可用交联位点的比例。将理解，虽然当发生较少的完全交联时，使用如本文所述的组合物可以实现有效的粘合，但期望允许形成相当大比例的可以形成的交联，以提供牢固的粘合。类似地，本领域技术人员将认识到，实现和维持组织闭合所需的力以及因此期望的交联度(例如在本文所述的代表性手术方法的维持步骤期间)取决于许多因素，尤其是裂伤、损伤、切口或伤口的部位、程度、深度和/或面积、受试者的年龄和能动性，以及使用如绷带、手术网片、缝线等其它医疗辅助器材的可用性或可取性，或者帮助组织闭合的物理力。

在一些实施例中，包括生物相容性晶体蛋白的材料的交联时间(或胶凝时间)通过pH进行控制，例如，组合物的pH、目标部位的pH、水性缓冲液的pH等。

在一些实施例中，交联时间通过引发交联进行控制，例如，将光交联剂暴露于光，如UV光。

在某些实施例中，交联时间介于约20秒与10分钟之间。在一些实施例中，包括生物相容性晶体蛋白的材料在目标部位处胶凝。在某些实施例中，包括生物相容性晶体蛋白的材料在预定时间胶凝。

在一些实施例中，包括生物相容性晶体蛋白的材料是生物可吸收聚合物。在某些实施例中，包括生物相容性晶体蛋白的材料在约1到70天内被生物吸收。

在一些实施例中，包括生物相容性晶体蛋白的材料基本上是生物不可吸收的。

在涉及使用本文所考虑的组合物作为手术粘合剂或至少部分地依赖于或受益于如本文所考虑的组合物的粘合能力的大多数手术应用中，一旦涂施或施用了组合物，就有利地进行和/或引发组合物的交联。然而，将认识到，在某些实施例中，使用至少部分地交联的组合物是有益的，使得在应用或施用之后有效地维持持续的交联。

因此，一方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中进行组织闭合的方法，所述方法包括：

任选地施加力以闭合裂伤、损伤、切口或伤口；

使裂伤、损伤、切口或伤口或所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的部位与如本文所述的含有晶体蛋白的组合物接触，任选地其中所述含有晶体蛋白的组合物至少部分地交联，

任选地施加力以闭合所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口，

引发和/或维持交联；

维持所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的闭合持续足以发生交联的时间；

其中晶体蛋白的应用和/或交联形成粘合剂组合物。

还考虑了正在经历或已经经历眼科手术的受试者的组织闭合以及治疗有需要的受试者的眼外伤或眼切口的大致等效的方法，如本文所描述的。

将理解，在本文所述的组合物、用途和方法的许多应用中，包括晶体蛋白的组合物经历灭菌和保持效力，包含有用的结构完整性和功能的能力是非常重要的。本领域技术人员在阅读本公开时将认识到，在许多预期应用中，如在外科手术和涉及细胞培养或转移的过程中，无菌是最至关重要的。本文例示了合适的灭菌方法的代表性实例，例如γ辐照(见实例13)UV灭菌(见实例4)。

应认识到，根据组合物的用途以及如何处理、储存、运输、施用等，组合物的灭菌通常在最适宜的时候执行。在某些实施例中，在包括晶体蛋白的组合物已经交联之后执行灭菌。例如，在某些实施例中，用于细胞培养或转移的薄膜组合物在交联后被灭菌。本文例示了后交联灭菌的代表性方法。

在某些实施例中，在本文所考虑的组合物的制备或使用期间至少部分地实现了灭菌。例如，本文所述的某些UV固化的组合物可以在固化/交联期间至少部分地UV灭菌。例如，特别考虑了在无菌条件下(参见例如本文实例4中所描述的)将适合于UV固化的组合物暴露于UV光线下并持续足以交联晶体蛋白并使组合物灭菌的持续时间。

在某些实施例中，组合物在交联之前灭菌。例如，本文所述的包括粘合晶体蛋白的组合物的某些用途涉及交联之前组合物的局部或手术应用，其中组合物有利地是无菌的，以避免将感染引入到施用部位。

通常优选通过辐照灭菌，包含但不限于γ辐照，特别是对于涉及本文所考虑的包括晶体蛋白的组合物的手术施用的应用。还具体考虑了UV灭菌，特别是对于但不限于本文所述的UV可固化组合物。

化学灭菌方法，特别是那些适合于对包含植入式医疗装置的温度和湿度敏感型医疗装置进行灭菌的方法，例如环氧乙烷加工(如用CFC-12/EtO 88/12混合物处理)，也适合于使用本文所述的组合物。实例包含美国环境保护署的“重要新替代品政策——灭菌剂替代品(Significant New Alternatives Policy–Substitutes in Sterilants)”网站epa.org/snap/substitutes-sterilants中所列的那些实例。

理想地，使用对组合物和/或最终交联产品的功效(例但不限于形成、结构或功能中的任何一种或多种)没有影响或影响很小的方法和条件进行灭菌。本文描述并例示了用于确定灭菌对本文所述的组合物，包含对组合物中存在的晶体蛋白的结构的影响或缺乏影响的方法。例如，本文中实例13例示了用于研究存在于已经历了γ灭菌的组合物中的晶体蛋白的二级结构的方法，以确认γ灭菌对膜中晶体蛋白的天然结构没有不利影响。本领域技术人员已知的这些和其它方法适用于研究其它灭菌方法的适用性，以确保灭菌对功效没有影响或影响很小。

胶凝/交联组合物的机械特性

本领域技术人员在阅读本公开时将清楚的是，本文所述的胶凝/交联组合物的特征在于其机械性质。例如，本文所述组合物的抗拉弹性可以通过确定材料的杨氏模量/弹性模量来有效地量化，其中模量越高则材料越硬。用于确定抗拉弹性的方法是本领域众所周知的，并且代表性方法在本文的实例中描述。

类似地，材料在断裂前可以承受的最大应力在本文中表示为极限抗拉强度(UTS)，并且材料开始展现出永久/塑性变形的点在本文中表示为0.2％屈服强度。在设计应用中，屈服强度通常用作容许应力的上限。同样，用于确定UTS和0.2％屈服强度的方法是本领域众所周知的，并且代表性方法在本文的实例中呈现。

将理解，在某些实施例中，胶凝/交联组合物的机械特性将适于特别适合组合物将要施加的应用。例如，在某些实施例中，用作薄膜的组合物将被调配成比用作粘合剂的组合物具有更高的杨氏模量。

将进一步理解，胶凝/交联组合物的机械特性至少部分地与前体组合物的调配有关，例如交联剂的同一性和量，和/或前体组合物中特定晶体蛋白异构体的存在或相对量。如在本文呈现的实例中可以清楚地看出的，改变本文所述的含有晶体蛋白的组合物的组成对所得胶凝/交联组合物的特性具有有意义的影响。

此外，除了影响胶凝/交联组合物的机械特性外，前体组合物的调配还影响胶凝/交联组合物的其它性质，如胶凝/交联组合物中存在的一种或多种活性剂的释放曲线，和/或组合物的降解速率和/或曲线。

在某些实施例中，例如在与薄膜相关的实施例中，采用图案化，例如使用软光刻对膜进行微图案化，或通过图案化模板基材上的胶凝作用进行图案化。例如，采用图案化来促进有益的细胞排列或锚定。在一个实施例中，采用蚀刻膜或图案化膜，例如在具有400-4000nm节距的蚀刻硅晶片或聚氨酯表面上制备的膜来引导细胞的排列和迁移，或促进细胞粘附和/或分层，和/或蛋白质沉积。类似地，可以采用如本文所述的包括晶体蛋白的组合物，如本文所述的薄膜的图案化来改变或增强如弹性、强度等一种或多种机械特性，或引导变形、穿孔或其它破坏。

除了一种或多种晶体蛋白之外，本文所考虑的生物相容性组合物还可以包括一种或多种活性剂，如包含一种或多种合成肽的一种或多种另外的多肽，或一种或多种治疗活性剂。例如，在某些实施例中，本文所考虑的生物相容性材料将包括一种或多种共价结合到或掺入或吸附到材料中的物质，如与晶体蛋白多肽中的一种或多种结合的一种或多种物质，或与其结合的部分。

在大多数治疗用途中，当存在一种或多种活性剂时，所述活性剂将优选地是生理学或药理学活性剂，如选自包括以下的组的药剂：抗生素、细胞抑制剂、抗炎剂、代谢激素、基因治疗剂、生长激素、分化或调节因子、免疫抑制剂、免疫刺激物质、核酸、凋亡诱导剂、粘附诱导或抑制剂、受体激动剂和受体拮抗剂，或其混合物或任何两种或更多种。

具体考虑了与眼科疗法相关的组合物、用途和方法，其中一种或多种活性剂中的一种或多种是眼科可接受的抗生素，例如，一种或多种选自包括以下各县的组的抗生素：磺胺类、大环内酯类、红霉素、氯霉素、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、万古霉素和四环素类。

将理解，各种各样的药物活性活性剂适于掺入到本文所述的生物材料中，并且将根据要达到的治疗目标，如要治疗的病状或疾病进行选择。例如，在本文特别考虑的眼部疗法的背景下，在某些实施例中，有效治疗例如青光眼的一种或多种活性剂将被掺入到适合应用于眼睛的生物材料中。用于局部治疗青光眼的代表性活性剂包含但不限于：拟胆碱药，如毛果芸香碱(pilocarpine)、碳酰胆碱(carbachol)、地美溴铵(demecarium bromide)和碘依可酯(echothiophate iodide)；肾上腺素能激动剂，如肾上腺素、地匹福林(dipivefrin)、溴莫尼定(brimonidine)和阿拉可乐定(apraclonidine)；β封闭剂，如噻吗洛尔(timolol)、卡替洛尔(carteolol)、倍他洛尔(betaxolol)、左布诺洛尔(levobunolol)和美托洛尔(metoprolol)；前列腺素类似物，如PGF2α、拉坦前列素(latanoprost)、乌诺前列酮(unoprostone)和PHXA-85；以及碳酸酐酶抑制剂，如多佐胺(dorzolamide)和布林佐胺(brinzolamide)。

将理解，虽然向特定部位提供局部浓度的活性剂的能力在许多治疗应用中是有益的，但本文所述的组合物和材料也适合于全身性活性剂的递送，特别是当应用部位具有进入体循环的良好通道，或在其它方面适于活性剂摄入，粘膜组织也是如此。使用如本文所考虑的眼睛的实例，将理解通过眼睛全身递送活性剂是可能的，使得本文所述的针对眼内或眼上应用的组合物和材料不限于局部眼科药剂的递送，而且可以包括一种或多种全身活性剂。

在某些实施例中，如在本文所例示的某些实施例中，本文所考虑的生物相容性组合物包括一个或多个细胞，任选地连同一种或多种支持性活性剂和/或一种或多种如以上所讨论的另外的活性剂。例如，在某些实施例中，供手术使用的代表性组合物包括如一个或多个干细胞等一个或多个细胞，连同用于在手术应用之前、期间和之后提高细胞活力的一种或多种抗生素和/或一种或多种分化或调节因子。

特别考虑的细胞包含：角膜缘干细胞，其也被称为缘上皮干细胞或角膜缘干细胞；基质干细胞，其也被称为间充质干细胞/基质细胞；以及视网膜色素上皮细胞。进一步特别考虑的细胞包含全能干细胞、多潜能干细胞和多能干细胞。

本文考虑的与生物相容性组合物结合使用的活性剂、物质和细胞将通常用于提供治疗益处，但将理解，同样具体考虑了支持功能。

在某些实施例中，本文所考虑的组合物包括一种或多种载体或赋形剂，如一种或多种稀释剂或一种或多种另外的试剂或物质，其为组合物和/或其用途和/或其成分中的任何一种或多种，包含同样存在的活性剂中的任何一种或多种提供一种或多种益处。例如，在某些实施例中，组合物包括一种或多种载体或赋形剂，其在组合物和/或其中包括的一种或多种活性剂中的一种或多种的调配、稳定性、施用、递送、摄入或功效方面提供一种或多种益处。

活性剂释放速率的控制

在一些实施例中，包括生物相容性晶体蛋白的材料通过扩散和/或渗透在数小时到数天的时间范围内缓慢地将活性剂递送到目标部位。在某些实施例中，药剂直接递送到目标部位。在一些实施例中，如果需要，将包括活性剂的包括生物相容性晶体蛋白的材料递送到目标部位的程序重复数次。在其它实施例中，活性剂通过材料的生物降解从包括生物相容性晶体蛋白的材料中释放出来。在一些实施例中，活性剂通过扩散、渗透和/或降解机制的组合释放。在某些实施例中，活性剂从材料中释放的曲线是单峰的。在一些实施例中，活性剂从材料中释放的曲线是双峰的。在某些实施例中，活性剂从材料中释放的曲线是多峰的。

在一些实施例中，活性剂通过扩散或渗透从包括生物相容性晶体蛋白的材料中释放出来。在某些实施例中，活性剂在180天内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放。在一些实施例中，活性剂在14天内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放。在某些实施例中，活性剂在24小时内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放。在一些实施例中，活性剂在一小时内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放。

在某些实施例中，活性剂在以下时间内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放：约180天、约150天、约120天、约90天、约80天、约70天、约60天、约50天、约40天、约35天、约30天、约28天、约21天、约14天、约10天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天、约1天、约0.5天、约6小时、约4小时、约2小时或约1小时。在一些实施例中，活性剂在以下时间内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放：超过180天、超过150天、超过120天、超过90天、超过80天、超过70天、超过60天、超过50天、超过40天、超过35天、超过30天、超过28天、超过21天、超过14天、超过10天、超过7天、超过6天、超过5天、超过4天、超过3天、超过2天、超过1天、超过0.5天、超过6小时、超过4小时、超过2小时或超过1小时。在某些实施例中，活性剂在以下时间内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放：少于180天、少于150天、少于120天、少于90天、少于80天、少于70天、少于60天、少于50天、少于40天、少于35天、少于30天、少于28天、少于21天、少于14天、少于10天、少于7天、少于6天、少于5天、少于4天、少于3天、少于2天、少于1天、少于0.5天、少于6小时、少于4小时、少于2小时或少于1小时。在一些实施例中，活性剂在约一天到约十四天内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放。在某些实施例中，活性剂在约一天到约70天内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放。

在一些实施例中，活性剂是生物分子，并且生物分子从材料中的释放由材料的组成控制。在某些实施例中，当材料开始降解时释放生物分子。

在一些实施例中，活性剂是细胞或其群体，并且细胞或群体从材料中的释放由材料的组成控制。

在一些实施例中，生物相容性材料包括活性剂，其中活性剂通过包括生物相容性晶体蛋白的材料的扩散、渗透、降解或其任何组合从包括生物相容性晶体蛋白的材料中释放出来。在某些实施例中，活性剂最初通过扩散从包括生物相容性晶体蛋白的材料中释放出来，并且随后通过包括生物相容性晶体蛋白的材料的降解释放。

在一些实施例中，活性剂在180天内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放。

在某些实施例中，活性剂在24小时内从包括生物相容性晶体蛋白的材料中基本释放。

在一些实施例中，包括生物相容性晶体蛋白的材料与活性剂相互作用或结合。在某些实例中，超过10％的活性剂通过包括生物相容性晶体蛋白的材料的降解释放。

在某些实施例中，活性剂的释放由包括生物相容性晶体蛋白的材料的组成确定。在某些实施例中，活性剂的释放基本上被抑制，直到包括生物相容性晶体蛋白的材料开始降解。

在某些实施例中，包括生物相容性晶体蛋白的材料开始降解的时间越长，包括生物相容性晶体蛋白的材料的交联度就越高。

在一些实施例中，活性剂是药物活性生物分子。在某些实施例中，药物活性生物分子是蛋白质、酶或肽。在一些实施例中，药物活性生物分子是抗体。在某些实施例中，药物活性生物分子是疫苗。在一些实施例中，药学活性生物分子是寡核苷酸。

示例性试剂盒和方法

在一个实施例中，提供了一种手术试剂盒，其包括如本文所述的包括交联生物相容性晶体蛋白的组合物，任选地连同用于将包括交联生物相容性晶体蛋白的组合物递送到目标部位的说明书，任选地连同用于将包括交联生物相容性晶体蛋白的组合物递送到目标部位的装置。

本文进一步提供了一种试剂盒，其包括a)包括如本文所述的晶体蛋白的组合物；b)交联剂；其中在混合组合物和交联剂之后形成包括生物相容性晶体蛋白的材料。

此处还提供了一种试剂盒，其包括a)包括如本文所述的晶体蛋白的组合物；b)增塑剂；以及c)交联剂；其中在混合组合物、增塑剂和交联剂之后形成包括生物相容性晶体蛋白的材料。

此处还提供了一种试剂盒，其包括a)包括如本文所述的晶体蛋白，任选地连同增塑剂的组合物；b)交联剂；其中在混合组合物和交联剂之后形成包括生物相容性晶体蛋白的材料。

本文进一步提供了一种用于制备如本文所述的体内胶凝或交联药物组合物的试剂盒，所述试剂盒包括具有包括如本文所述的晶体蛋白，任选地包括增塑剂的组合物的第一容器、具有交联剂的第二容器、任选地具有一种或多种活性剂的一个或多个另外的容器、任选地具有缓冲剂的容器、任选地混合器皿、用于在混合器皿中混合存在于每个容器中的材料的说明书和/或用于交联以产生包括生物相容性晶体蛋白的材料的说明书，以及用于将包括生物相容性晶体蛋白的材料递送到目标部位的说明书。

本文还提供了一种用于制备如本文所述的体内胶凝或交联药物组合物的试剂盒，所述试剂盒包括具有如本文所述包括生物相容性晶体蛋白，任选地包括增塑剂的组合物的第一容器、任选地具有交联剂的第二容器、任选地具有一种或多种活性剂的一个或多个另外的容器、任选地具有缓冲剂的容器、任选地混合器皿、用于在混合器皿中混合存在于每个容器中的材料的说明书和/或用于交联以产生包括生物相容性晶体蛋白的材料的说明书，以及用于将包括生物相容性晶体蛋白的材料递送到目标部位的说明书。

在各个实施例中，本文所述的试剂盒中的一种或多种另外包括共引发剂，如包括共引发剂的容器。

在本文所述的材料和方法的某些应用中，以原位形成交联材料为目标。在某些实施例中，本文所述的组合物的原位交联具有粘合剂组合物的性质，由此提供粘合功效。此类原位交联在本文的实例中例示。

在其它实施例中，用于原位交联的组合物提供了水凝胶材料。此处有利的是，组合物直到在要保护的部位处被引入到患者体内时才完全交联。

在这种情况下，组合物可以以可注射形式或以可喷射形式使用，其中优选地以最小侵入性方式使用，但是也可以将其与手术干预结合使用。

在某些实施例中，在这种情况下，组合物与交联剂例如在将其应用到体内之前立即混合，并且然后将此混合物作为液体或作为喷雾以仅在原位进行交联的方式引入到患者体内。然而，还设想将组合物和交联剂分别输送到要保护的人或动物受试者身体中的部位，并在所述部位将其混合。进一步设想，例如当使用光交联剂时，将包括交联剂的组合物输送到目标部位，随后通过暴露于合适波长的光来引发交联。

在某些实施例中，供原位使用的组合物，特别是那些在没有进一步引发步骤(如光活化)的情况下在添加交联剂时发生交联的组合物，将紧接着手术或最小侵入性应用之前产生，并且然后用作喷雾、植入物、液体、填塞物或凝胶膜。

在除了与包括晶体蛋白的组合物混合之外不需要进一步引发交联的实施例中，当用于其生产的所有组分存在之后将材料因此引入到患者身上或体内。在这种情况下，材料在应用之前、应用期间或应用之后完全交联。

在涉及植入如薄膜或水凝胶等完全交联的材料的实施例中，优选材料具有一定的固体稠度，这允许或有助于材料的实际处理。在这种情况下，材料的坚固程度或流体性质可以通过交联程度来设置，其中材料越坚固，交联得越多，或者在薄膜的背景下，干燥程度可以也有助于坚固性。因此，凝胶的流体性质介于液体与固体的流体性质之间。

因此，本发明还涉及一种试剂盒，其具有包括所述组合物的第一容器和包括供组合物在原位产生如粘合材料、水凝胶形成材料或薄膜材料等包括晶体蛋白的材料中使用的交联剂的第二容器。

在本公开和本文提供的实例的指导下，本领域技术人员将认识到组合物和交联剂可以以形成适合于相应的期望治疗的包括交联生物相容性晶体蛋白的组合物的方式互相匹配。

在这种情况下，交联速率、粘度、再吸收动力学等可以以这样的方式进行调整，即待涂施的组分，例如本文所考虑的试剂盒中存在的组分，可作为液体单独地或联合地喷射或注射。

将理解，这种用途的一个优点是如本文所述的组合物可以例如以液态涂施到受创伤的和完整的组织表面或手术清除或切开的组织。

例如，在某些实施例中，如本文所述的组合物易于例如作为液体或喷雾以最小侵入性方式使用而不会造成问题。在某些实施例中，所得凝胶或粘合剂适应或粘附到组织，包含任何不均匀的组织表面。特别考虑的实施例适于在干燥组织上形成，并且同样适于在潮湿组织表面上形成而没有明显流动。

作为结果，可以在组织表面上形成非常薄的层，因为本文提供的组合物的某些实施例的层厚度即使小于1mm也足够牢固以维持结构完整性和/或内聚力。

在某些实施例中，当需要时，生物相容性例如在小于约21天，例如小于约14天的停留时间内被快速再吸收。

将理解，在大多数情况下，本文所考虑的治疗用途通常需要具有很高程度的生物相容性并且不会引发炎症、瘢痕、病理性或不期望的组织形成、病理性或不期望的血管生成或病理性或不希望的神经形成的组合物和材料。

另外，特别考虑的包括如本文所述的晶体蛋白的生物相容性材料，特别是那些供手术使用的材料，是牢固且易于操作的，因为其可以在交联之前或期间以主要呈液态的方式例如通过注射或喷雾涂施，或者可以在交联完成时例如作为凝胶或薄层涂施。对于喷雾或注射，当必要时，例如为了引发交联，可以在要保护的身体部位之前不久或在所述身体部位处或者在此部位的远端合并组合物。

通常，如本文所述的组合物和材料适合于在不需要缝合或其它切口或伤口保持装置的情况下用于手术环境，由此最小化瘢痕、异常组织形成和其它并发症。

参考以下实例进一步描述本发明。将理解，所要求保护的本发明并不旨在以任何方式受限于这些实例。

实例

实例1：纯化天然晶体蛋白的制备

此实例描述了保留晶体蛋白的天然结构的纯化晶体蛋白组合物的制备。

材料和方法

新鲜人角膜巩膜缘获得了新西兰国家眼库的伦理批准。所利用的原代角膜上皮细胞系历来是从同样来源于新西兰国家眼库的组织中取得并储存在液氮中。人羊膜来源于新西兰国家眼库。

长尾鳕鱼头从商业渔场获得。在内部去除晶状体，并在15mL Falcon试管中分装成大约12g的等分试样，并储存在-20℃下。猪眼从商业供应商获得。为了提取和表征晶体蛋白，以与来自长尾鳕的晶状体相同的方式处理晶体。

溶液和培养基

除非另有说明，否则所使用的Milli-Q水的电阻率为18.2MΩ.cm^-1，并且在使用前经过高压灭菌。经过滤的Milli-Q通过0.20μm醋酸纤维素膜进行注射式过滤(GVS过滤器技术公司(GVS Filter Technology)，FJ13ASCCA002DL01)。

表2.溶液和培养基组合物。

晶状体晶体蛋白提取

对于晶状体晶体蛋白提取，将眼晶状体的称重等分试样解冻并放入匀浆器容器(IKA ULTRA-TURRAX试管驱动工作站)中。以每克晶状体2mL缓冲液的比例添加晶体蛋白提取缓冲液。然后以5分钟的间隔运行匀浆器，其间穿插有5分钟冰上冷却相，直到晶状体固体分散(大约30分钟)。将所得泡沫溶液倒入50mL Falcon试管中。此时去除任何剩余的大的、不可溶解的晶状体片。然后将晶体蛋白溶液在4℃下以4122x g离心30分钟。然后将上清液分配到1.5mL艾本德(Eppendorf)试管中，并再次以9600x g离心30分钟。将所得晶体蛋白上清液倾析到干净的Falcon试管管中。

为了去除提取缓冲液，按照制造商的说明，将5％v/v甘油在注射到赛默科技公司的

透析盒中之前添加到晶体蛋白溶液中。在4℃下在新鲜Milli-Q H₂O中进行4小时透析并轻轻搅拌。每个盒使用大约2L Milli-Q H₂O，并且每小时更换新鲜的。一旦完成，就将溶液从盒中去除并分装到50mL Falcon试管中，其中最终流体体积为15mL或以下。在冻干溶液之前进行布拉德福德(Bradford)测定以确定浓度和预期产量(ChristAlpha 2-4LD plus，约翰·莫里斯科技公司(John Morris Scientific))。冻干的晶体蛋白在使用前储存在-20℃下。

晶体蛋白提取过程的典型产率为36-48％，计算如下：均质化和离心后大约1g起始材料(例如，长尾鳕眼晶状体)提供2mL晶体蛋白浓度在180-240mg/mL范围内(即，360-480mg晶体蛋白总量)的晶体蛋白提取物。

实例2：纯化和重组晶体蛋白的表征

此实例描述了如以上实例1中所述制备的晶体蛋白的表征。

通过SDS-PAGE评估所提取蛋白质样品中晶体蛋白的存在。来自长尾鳕晶状体样品的代表性SDS-PAGE在图1和图2a中示出。存在三种不同类别的晶体蛋白，称为α、β和γ，其中这些类别中的每一种都具有不同的亚基。α-晶体蛋白复合物是20kDa亚基的高度异质聚集体，其产生大约300到1000kDa的多聚体。β-晶体蛋白以大约50-200kDa的较小复合物形式存在，由20-30kDa亚基形成，并且γ-晶体蛋白以大约20kDa的单体形式存在(Ecroyd和Carver，2009)。正如预期的，由于所提取样品没有进一步纯化，因此SDS-PAGE证实了所有三种类别的晶体蛋白的存在。还在来自人状晶体(图2b)和猪状晶体(图2c)的提取物中观察到这三种类别的晶体蛋白。

在SDS-PAGE分析后，使用尺寸排阻色谱(SEC)将从长尾鳕中提取的晶体蛋白进一步半纯化为三个类别α、β和γ，如图3所示。分别在红色、蓝色和绿色框中标识了对应于总α晶体蛋白、总β晶体蛋白和总γ晶体蛋白的峰级分。从长尾鳕晶状体(图4a)、人晶状体(图4b)和猪晶状体(图4c)中提取的晶体蛋白的另外的SEC分析再次示出了α-晶体蛋白峰、β-晶体蛋白峰和γ-晶体蛋白峰的分离。

表达并纯化重组人α-晶体蛋白(如Horwitz等人所述，1998)，然后通过如图5所示的SDS-PAGE进行表征，这揭示了纯化α-晶体蛋白的大小与其20kDa的预测大小相匹配。

本文中的图6、7和8示出了来自各种物种的晶体蛋白的各种氨基酸序列比对，清楚地描绘了这些蛋白质之间的相似程度。图6a是来自斑马鱼和智人的αB-晶体蛋白的氨基酸序列比对，图6b是来自斑马鱼和智人的βA4-晶体蛋白的氨基酸序列比对，并且图6c是来自智人、金牛和斑马鱼的γB-晶体蛋白的氨基酸序列比对。

图7是几种脊椎动物αA-晶体蛋白直系同源物的氨基酸序列比对(来自Runkle等人,2002,改编自：《综合与比较生物学(Integrative and Comparative Biology)》,第43卷,第4期,2003年8月,第481-491页,https://doi.org/10.1093/icb/43.4.481)。斑马鱼蛋白的残基64-141对应于α-晶体蛋白结构域。

图8是几种脊椎动物αB--晶体蛋白直系同源物的氨基酸序列比对(来自Posner等人,1999,改编自：《综合与比较生物学》,第43卷,第4期,2003年8月,第481-491页,https://doi.org/10.1093/icb/43.4.481)。

为了进一步表征从长尾鳕晶状体提取物中纯化晶体蛋白，采用了圆二色性(CD)和傅里叶变换红外(FTIR)光谱方法来研究蛋白质结构。从图9中可以看出，来自长尾鳕晶状体的粗晶体蛋白提取物的CD光谱图示出了以217nm为中心的最小值，其指示了晶体蛋白中的β-片状结构。这与之前文献中关于牛晶体蛋白、牛和人ɑ-晶体蛋白以及齿鱼γ晶体蛋白的报告一致。如图10所示，通过FTIR光谱观察到的表示β-片状结构的1631cm^-1处的显著峰进一步证实了在使用上述方法提取和纯化之后，晶体蛋白的天然结构得以保留。

实例3：纯化晶体蛋白的功能表征

此实例描述了如以上实例1中所述制备的晶体蛋白的功能表征。

研究了某些晶体蛋白的伴侣蛋白样抗聚集功能。简而言之，评估了长尾鳕晶体蛋白提取物针对TCEP诱导的聚集对溶菌酶的保护作用，其中溶菌酶(10μM)与从长尾鳕鱼晶状体中获得的10mg/mL晶体蛋白提取物组合并在37℃下温育。通过测量400nm处的吸光度来监测溶液的光散射变化。

在存在晶体蛋白的情况下(图11，黑色虚线)观察到的光散射减少指示，与不存在长尾鳕晶体蛋白提取物的溶菌酶+TCEP(图11，黑色实线)相比，溶菌酶防止聚集。在不存在TCEP(图11，灰色实线)的情况下，仅溶菌酶对照组示出没有光散射。

然后研究了纯化晶体蛋白对哺乳动物细胞的生物相容性和影响。首先，为了证实晶体蛋白提取物与哺乳动物细胞具有生物相容性，在存在来自长尾鳕晶状体提取物的纯化α-晶体蛋白、β-晶体蛋白和γ-晶体蛋白级分(10mg/mL)的情况下培养人角膜上皮细胞。如图12中描绘的活/死细胞染色的代表性图像所示，与对照组(即，在不存在任何晶体蛋白的情况下)相比，晶体蛋白的存在对细胞的活力没有不利影响。

粗晶体蛋白提取物显示出对哺乳动物细胞增殖有积极影响。在存在无血清培养基或添加有10％FCS的培养基的情况下，用长尾鳕晶体蛋白处理人角膜上皮细胞24小时，随后进行MTT测定。在这两种情况下，如图13所示，晶体蛋白浓度的增加导致更大的细胞增殖。

然后，来自长尾鳕鱼晶状体的粗晶体蛋白提取物被证明可以保护哺乳动物细胞免受生物压力。在细胞对氧化应激的响应的测定中，用10μM H₂O₂处理人角膜上皮细胞，随后用晶体蛋白温育。如图14中所呈现的，MTT测定结果显示，当暴露于H₂O₂时，较高浓度(5-20mg/mL)的粗晶体蛋白提取物导致细胞活力显著增加，从而建立了粗晶体蛋白提取物对氧化应激的保护作用。

此实例中报告的工作清楚地表明，使用本文所述方法制备的晶体蛋白不仅保留了其天然结构，而且还保留了生物学上重要的功能。

实例4：包括晶体蛋白的薄膜组合物的制备

此实例描述了包括晶体蛋白的薄膜组合物的制备。

在2级罩中进行膜流延以保持无菌。将如以上实例1中所述制备的冻干晶体蛋白重新悬浮在经过滤除菌的Milli-Q水中。将组分体积(如下表3所述)按以下顺序添加到无菌艾本德试管中：晶体蛋白原料、甘油、水、添加剂、交联剂。

表3.长尾鳕鱼晶状体蛋白膜调配物

调配物	晶体蛋白(mg/mL)	甘油(％)	交联剂	添加剂
					F1	60	2	2.5％w/v PEGDE
F2	60	2	50mM戊二醛
					F3	60	2	0.20％w/w R5P*	0.40％w/w L-精氨酸
F4	60	2	0.20％w/w R5P
					F5	60	2	2.5％w/v PEGDE	100μg/mL RGD
F6	60	2	20％w/v PEGDA

*R5P是核黄素-5-单磷酸酯

为确保交联条件一致，每种交联剂仅在溶液流延之前直接添加到所述溶液中。为了充分混合，将艾本德试管倒置约10次。

对于细胞培养中使用的膜，使50μL溶液流延到13mm玻璃盖玻片上，并使用移液器尖端铺展到边缘。小心不要将溶液洒到盖玻片的边缘，因为毛细作用会将溶液吸到下面，并将盖玻片牢牢地粘附到流延盘上。将膜在37℃的烘箱中干燥48小时。在烘箱干燥之前，将核黄素膜在罩式灭菌UV灯下用UV处理30分钟。

膜优选地在48小时干燥期后立即使用，要么在室温下储存在用石蜡膜密封的流延盘中。

实例5：包括晶体蛋白的薄膜组合物的功能表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的薄膜组合物的机械特性的评估。

方法

用于此测试的膜以3mL流延到38mm圆形PDMS模具上。在流延和UV交联(在合适的情况下)后，将膜在室温下干燥24小时，随后在37℃下干燥48小时。在指定的干燥时间完成后立即进行测试。

为了进行测试，使用手术刀将圆形膜切成方形，小心确保尽可能多地保留材料。使用千分尺(三丰公司(Mitutoyo))在膜的四个角和中心进行厚度测量，取平均值以供后续计算。然后使用5mm宽的模板将样品切成条，并用游标卡尺(三丰公司)测量其真实最终宽度。针对每种膜类型获得并测试4个条。

使用10N的测压元件和10毫米/分钟的延伸速率在Instron 5544上进行测试。规格长度设置为10mm，并将砂纸放置在夹具上以防止样品滑动。对干膜条进行测试，直至失效。

在夹具处而不是在膜中间失效通常被认为是无效结果，但是在测试过程中，100％的样品以这种方式失效。选择利用结果继续，但是必须注意，由于这种失效模式，所有结果都有对强度的系统代表性不足的问题。

取得数据后，使用平均厚度和单个条宽度来算出每个样品的横截面积(A)。使用Instron在每个记录时间点呈现的载荷数据(F)，计算在所述点施加到材料上的应力(σ)，其中σ＝F/A。

还记录了每个时间点的延伸，作为样品长度(Δ)的变化。当除以最初规格长度()时，样品中的应变百分比(ε％)通过以下计算：

样品的抗拉强度上限(UTS)可以通过将以牛顿为单位施加的最大载荷除以横截面积来算出。

材料的杨氏模量表示刚度，并且可以通过算出样品在弹性阶段期间的应力-应变关系的斜率来确定。

结果

使用3mL溶液和72小时的总干燥时间在PDMS模具上制作38mm流延膜。所得膜柔韧、触感光滑且透明。

在将膜制备成5mm宽的条之前，使用游标卡尺(三丰公司)确定膜的厚度。加工后测量加工样品的真实宽度，以确保在UTS计算中使用横截面积的准确测量值。在中心和4个角处测量的膜的厚度存在差异，这可能是由于没有完全平整的模具表面的不一致导致的。

表4.用于机械测试的膜的厚度测量。

在这些组合物的测试期间，所有样品都在夹具处失效。这通常被认为是失败的结果，因为导致材料失效的不是纵向施加的力，而是拉力和夹紧过程造成的损坏的组合。因此，此处报告的薄膜的较高抗拉强度分数的系统性膜强度代表性不足。

从图15中可以看出，F2在0.363±0.0213MPa下具有最低的UTS，并且结果表明在杨氏模量分数为1.65±0.663MPa的情况下弹性最大(图16)。F3具有0.673±0.0272MPa的UTS和2.89±0.780MPa的杨氏模量。F4的UTS和模量分别为0.644±0.04785MPa和3.30±0.735MPa。

调配物中弹性最小的是F5，其模量分数为4.46±0.455MPa。此分数在所报告的早产羊膜弹性的标准偏差(3.60±1.4MPa水合(Benson-Martin等人，2006))内，这表明这些膜与当前的金标准载体等效或更具弹性。F5的UTS为0.626±0.108MPa，与F3和F4的相当。计算了四种组合物的延伸值，其中F2、F3和F4中的每一个均示出统计学上显著大于F5的延伸，如图17所示。

使用Instron 5544用F2、F3和F4调配物制备的干燥膜在10N载荷和10毫米/分钟的延伸速率下的另外测试结果在下表5中呈现。

表5.膜的干燥测试。

调配物	UTS(MPa)	标准偏差	YM(MPa)	标准偏差
					F2	0.304	0.061	1.695	0.504
F3	0.508	0.192	2.306	0.900
					F4	0.509	0.136	2.565	0.918

从表5中可以看出，观察到了与早期测试相当的结果，这表明可以制备具有优异机械特性再现性的膜。

讨论

由四种测试调配物形成的薄膜的机械性质支持其作为载体材料的适用性。即使由于Instron固定夹处的样品过早失效而导致系统代表性不足，测试膜中的每个膜都超过了所报告的羊膜抗拉强度上限几个数量级，所述抗拉强度上限当通过空气干燥保存时为18.4±8.23Pa，当保存在甘油中时为9.9±4.14Pa(von Versen-Hoeynck等人，2008)。然而，文献中报告的这些值是水合拉伸试验，而在此实例中测试的样品是干燥测试的。

F2膜的最低UTS强度分数为0.363±0.0213MPa。尽管如此，这表示甘油保存的羊膜强度的45500倍差异。足月羊膜的杨氏模量为2.29±0.7MPa，并且早产羊膜的杨氏模量为3.60±1.4MPa(Benson-Martin等人，2006)。F2的杨氏模量为1.65±0.663MPa。

杨氏模量表示对材料刚度的量度，其中分数越高则刚度越大。相反，较低的分数表明材料具有更大的弹性——在去除变形力之后能够经历弹性变形并恢复其原始形状的能力。因此，F2比人羊膜更结实且更有弹性。

F3-F5的抗拉强度上限大于F2，分别为0.673±0.0272MPa、0.644±0.490MPa和0.626±0.108MPa。如以上所讨论的，由于样品在夹具处失效，因此这些结果对这些材料的真实强度的代表性不足，这指示在测试期间夹紧程序使材料变弱。

这些调配物中弹性最小的是F5，其杨氏模量为4.46±0.455MPa。此模量在所报告的早产羊膜弹性的标准偏差(3.60±1.4MPa(Benson-Martin等人，2006))内，这表明所有含有晶体蛋白的调配物至少与当前的金标准载体具有等效弹性或更具弹性。将理解，在不向患病组织施加物理应力的情况下符合患者眼睛的形状的能力对于用作角膜缘干细胞载体是极其重要的。

将进一步理解，许多应用需要一定程度的尺寸稳定性，所述应用包含手术应用，如本文所述的组合物可以以期望方式用于所述应用。对通过UV固化制备的晶体蛋白水凝胶的溶胀行为进行了评估。图18示出了对照组(仅PEGDA)以及6％和12％基于晶体蛋白的水凝胶在pH 7.4的PBS中溶胀24小时后的溶胀百分比。可以清楚地看出，与PEGDA对照组相比，针对6％和12％晶体蛋白水凝胶两者均观察到溶胀减少，这指示溶胀特性得到改善。

实例6：包括晶体蛋白的组合物的生物相容性的表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的薄膜组合物的生物相容性的评估。

材料和方法

细胞培养

Nikon Biostation上的样品培养和活细胞成像在37℃、5％CO₂和环境湿度下进行。使用上皮细胞培养基(MEM，10mL(10％)FSC，1mL(1％)Anti-Anti/100mL)和外植体培养基(DMEM/F12，10mL(10％)FCS，50μL ITS，100μL EGF，1mL(1％)Anti-Anti/100mL)。根据细胞的生长速度，培养基变化之间的次数会有所不同。通常，每3-4天更换50％培养基。当细胞烧瓶接近80％汇合时对其进行传代，多余的细胞用于膜培养或丢弃。

Gibco^TMTrypLE^TM表达酶(1X)无酚红(Gibco公司，12604-013)和适当的培养基在水浴中加热至37℃。将烧瓶中的培养基倒入废物中，并将少量温热的PBS添加到烧瓶中以稀释任何剩余的血清酯酶活性。冲洗后，将PBS也倒入废物中。添加足量的TrypLE^TM以完全覆盖烧瓶底部，然后在37℃下摇动温育10-15分钟。温育时间过去后，观察到细胞粘附。如果仍有大量细胞附着，则收集烧瓶内容物，并重复TrypLE^TM处理。分离并收集所有细胞后，将悬浮液以380xg温和沉淀7分钟。然后丢弃上清液，将细胞轻轻地重新悬浮在适合预期细胞数量的大量培养基中(对于汇合的T75，1-3mL)。

对于细胞计数，将10μL细胞悬液添加到10μL锥虫蓝(西格玛公司，T6146)中。将10μL混合物移液到计数网格上并在10倍放大倍数下观察。对角计算3个网格区域后，执行以下方程式以获得细胞总数：

(计数细胞数/计数区域数)×2(稀释因数)×10⁴(细胞量级)＝细胞数/毫升

细胞数/毫升×细胞悬浮液毫升数＝细胞总数

然后将适当体积的悬浮液接种到烧瓶中，以提供与烧瓶大小所需的接种密度相等的细胞数量。对于上皮细胞膜接种，每个膜接种1×10⁴个细胞。

免疫组织化学

样品在染色前在37℃和5％CO₂下培养7天、14天或28天。将膜从其最初的培养孔移到新的无菌板孔中进行处理。如果膜与流延盖玻片分离，则将其单独移动。随后在形成载玻片时使用新的盖玻片，以减少可视细胞粘附到玻璃上而不是膜上的发生率。将样品在PBS中洗涤5×5分钟以去除培养基，然后用4％多聚甲醛(PFA)固定20分钟。去除PFA，并将样品在PBS中洗涤3×10分钟。

固定后，样品在-20℃下在甲醇中渗透10分钟，然后再次在PBS中洗涤3×10分钟。血清封闭通过将样品在100mM甘氨酸、0.1％Triton X-100和10％正常山羊血清的PBS溶液中的振荡器上温育2小时来进行。在PBS中洗涤3×10分钟。

在PBS-B(PBS+3％BSA)+0.5％Triton X-100中制备第一抗体，并将样品与适当的抗体在4℃下温育过夜。通过在PBS-B中洗涤3×10分钟去除未缀合的抗体。在室温下在PBS-B中将抗体温育3小时。在PBS中洗涤3×10分钟。

核染色通过4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在PBS中在黑暗中在振荡器上处理60分钟来实现。在将膜安装到Citiflour(电子显微镜科技公司(Electron MicroscopySciences)，1797025)中的载玻片上之前进行5xPBS冲洗以去除任何残留的DAPI(为未附着的膜放置新的盖玻片)并用清漆密封。

在SuperFrost Plus显微镜载玻片(LabServ公司，LBS4951+)上制备膜上的细胞系培养物，并在单凹面显微镜载玻片(Sail Brand公司，7103)上制备膜或羊膜上的外植体培养物。

由于本实例中描述的实验涉及免疫组织化学并且需要产生安装在显微镜载玻片上的样品，因此直接在圆形玻璃盖玻片(Knittel玻璃公司)上制作薄膜调配物的试验流延薄膜。测试的体积为10μL、50μL、100μL和150μL。发现100μL和150μL体积产生较厚的膜，所述较厚的膜在干燥过程期间在边缘处开裂，而10μL形成的薄膜几乎无法察觉。50μL流延在边缘处变形有限，并且明显形成了完整的膜，并且因此选择用于将来的流延。

晶体蛋白膜作为细胞载体的适用性的初步测试需要研究其是否可以长期维持和扩大细胞群。在角膜缘干细胞缺陷(LSCD)的治疗中，细胞在手术移植到眼表面之前在羊膜上培养3周。据报告，临床治疗中成功转移细胞的最短接触时间为3天。然而，为了使细胞以最佳方式转移到患者的眼睛，接触时间优选大于1周。因此，F2膜接种了来自两个内部人角膜刮擦细胞系(本文称为细胞系1和细胞系2)的50μL上皮培养基中的1×10⁴细胞并培养28天，并评估这些细胞的生存力和扩增。

在第7天、第14天和第28天通过光学显微镜观察细胞粘附和生长。将细胞固定并用抗α微管蛋白、抗细胞角蛋白3/12或抗平滑肌肌动蛋白染色，然后与Alexa-Fluor 488缀合。

通过RNA表达评估薄膜培养物和对照培养物中的参考基因的基因表达。

结果

如上所述制备的F2薄膜调配物具有高度生物相容性。图6示出了通过抗α微管蛋白和DAPI核染色可视化的细胞接种后7天、14天和28天的F2膜调配物上的细胞粘附和生长。

从7天观察到的大量细胞密度可以看出，F2薄膜具有优异的最初细胞粘附(图19：A、D、G、J)。在培养期间观察细胞生长(数据未示出)发现在14天内整个膜的细胞从中心(接种位置)汇合到边缘。从图19C中可以看出，到培养细胞的第28天，细胞过度汇合并开始竞相生长。在用抗平滑肌肌动蛋白和DAPI核染色剂染色的复制培养物中观察到了相当的结果(数据未示出)。值得注意的是，在培养的第7天与第28天之间没有观察到细胞形态的明显变化，这表明如本文所述的薄膜调配物没有驱使细胞走向与其开始培养的明显的基质细胞不同的细胞命运。

事实上，基质表型由培养细胞的RNA表达分析的支持，在所述表达分析中没有观察到角膜上皮基因KRT12和KRT3的表达(数据未示出)。COL4A5的表达证实了眼部来源，并且没有观察到KRT13指示没有结膜污染(数据未示出)。ACTA2和VIM表达在整个时间过程中几乎保持不变，并且与在组织培养塑料上生长的对照细胞具有类似的倍数差异(数据未示出)。PCNA在膜上的表达在所有时间点都高于组织培养塑料对照组。尽管在最初的第7天对照组的膜调配物上没有检测到ABCG2、TP63和ΔNP63，但第28天的对照组展现出较弱的表达。

通过F3和F4薄膜调配物也观察到高度生物相容性，其中人角膜上皮细胞的DAPI染色示出了与针对F2调配物观察到的相当的生长，如图20和图21所示。

事实上，如本文所述制备的晶体蛋白膜组合物的生物相容性使得培养物中的细胞数量迅速增加。如图22所示，晶体蛋白薄膜调配物在培养的第一周(图22，左图)和培养的第二周(图21，右图)均支持细胞数量成倍增加，总体上与仅组织培养板对照组相当(图21，中图)。

总之，包括晶体蛋白的薄膜支持增殖细胞群，并提供维持与组织培养塑料条件等效命运的生长表面。

实例7：包括晶体蛋白的组合物的生物相容性的表征

此实例描述了对另外的包括晶体蛋白的薄膜组合物的生物相容性的评估。

材料和方法

薄膜由组合物F1-F6(见上表3)形成，所述组合物中的每一种都包括60mg/mL晶体蛋白和2％w/v甘油，但在交联剂、增塑剂或共引发剂方面有所不同，如图所示。

所有试验膜均在50μL培养基中接种1×10⁴个细胞，并且在用另外的培养基覆盖之前使细胞沉降和粘附10分钟。在同一天进行光学显微镜检查以观察在所述10分钟时间段内最初的细胞粘附到膜上的水平。

结果

从图23中可以看出，膜之间的细胞粘附水平变化很大。R5P+L-精氨酸膜组合物F3(图23，右上方)似乎最有希望，其次是F4(图23，左下方)和F2(图23，中上方)。与F2-F4相比，PEGDE膜F1(图23，左上方)和F5(图23，中下方)的粘附水平大大降低。与原始F1调配物相比，在F5中添加RGD基序并没有显著增加粘附水平。F6不透明，并且不作进一步考虑(图23，右下方)。

接种后4天，使用显微镜结合活/死染色剂评估薄膜调配物作为载体的功效(数据未示出)。根据目视检查，F2和F3的细胞保持最大且等效。F1、F4和F5的细胞很少。所述调配物中的任何调配物上均不存在死细胞。F6保持不透明，并且因此无法使细胞可视化。

实例8：包括晶体蛋白的组合物的长期生物相容性的表征

本实施例描述了在延长的细胞培养过程中对包含有晶体蛋白的薄膜组合物的生物相容性的评估。

材料和方法

薄膜由组合物F2、F3和F4形成(见上表3)。人原代角膜上皮细胞在这些薄膜上生长7天、14天和28天，并用DAPI核染色剂(蓝色)和总α微管蛋白(红色)染色，以使细胞骨架可视化从而进行形态学分析。

结果

从图24中可以看出，在长时间细胞培养的整个时段中，在F2(图24a)、F3(图24b)和F4(图24c)上生长的细胞显示出从7天(左)到14天(中)以及28天(右)的排列和密度增加，特别是与仅玻璃对照组相比(图24d)。排列和密度的增加在20倍(上图)和63倍(下图)放大倍数下都很明显。

实例9：包括晶体蛋白的组合物的生物相容性的表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的薄膜组合物的生物相容性的评估。

材料和方法

角膜缘外植体

在经UV处理的2级罩内收获角膜缘外植体。简而言之，将一块无菌纱布钉在浸泡在乙醇中的软木板上。使用灭菌钳将供体角膜缘从运输培养基中取出并放置在无菌纱布上。然后使用乙醇灭菌针将缘钉在覆盖纱布的板上，以施加张力来拉伸和压平组织的方式定位。使用手术刀在前角膜缘表面深度的1/3处做切口，并去除多余的角膜和巩膜组织。然后将前角膜缘表面切掉并放入培养皿盖中的少量运输培养基中，然后切成1mm宽的片。然后将外植体放置在其培养表面上，使其沉降并粘附10分钟，然后从侧面小心添加培养基。

羊膜片

人羊膜从新西兰国家眼库中取得，并在-20℃下储存在硝酸纤维素滤纸上的甘油中。对于组织培养物的处理，在TryPLE Express中温育10分钟后，用细胞刮刀轻轻刮擦羊膜表面，并用无菌PBS冲洗表面。然后使用8mm无菌活检穿孔器(Miltex，REF33-37)获得切片以进行培养。

对四种代表性薄膜调配物F2-F5执行人角膜外植体生长实验。用5个单独供体执行外植体生长实验，并用另外2个供体执行RNA表达分析。

对于外植体实验，将前1/3角膜缘切成1mm片，并放置在含有晶体蛋白的薄膜调配物上，其中羊膜作为对照组金标准表面。每个膜调配物进行三份外植体，其中针对羊膜为两份。

由于产生了大量的外植体衍生物，对每个生物复制品的代表性复制品进行染色和成像，但是所有复制品的活细胞光学显微镜在4个时间点进行拍摄。

结果

所有供体外植体在F2薄膜调配物上都有很强的细胞生长。在培养4天时，可以看到第一批细胞从组织迁移到表面上。外植体成功粘附到晶体蛋白膜上，并且在14天的温育过程中，所有三个供体外植体完全占据薄膜表面(平均流延直径约12mm)。

F2薄膜上的角膜缘外植体的代表性光和荧光显微镜可视化如图25中所示。生长物的组成随温育时间和供体而变化。来自供体1和2的生长物的外观为基质的，细长且高度迁移(参见例如图25A、25B)，并且波形蛋白的染色呈阳性(红色)(图25D)。相比之下，供体3首先扩增了上皮细胞群，这通过细胞的独特鹅卵石形态的存在和波形蛋白染色的缺乏来证明(数据未示出)。

从角膜缘长出的明显抬高的组织桥的形成与供体1和2中的基质生长相关。如图25C中清楚地示出的，这些桥由基质组成并且类似于锚索，将外植体牢牢地粘附在F2膜的表面。

F3膜上的外植体生长与F2膜上的相当。组织粘附到膜表面，并且在4天时再次看到第一细胞生长(数据未示出)。供体1表现出形成细胞生长桥，但也扩增了更大比例的上皮细胞，波形蛋白表达不太普遍(数据未示出)。供体2具有类似的形态，外加与外植体分离的细胞的升高隆起。与F2上的生长模式类似，供体3再次具有紧密排列的上皮细胞的初步生长(数据未示出)。

在一些物理破坏后，F4薄膜上的供体1外植体需要重新定位，之后细胞在第4天与第7天之间从外植体快速迁移到膜表面。在培养11天时观察到供体1的桥形成特性，并在14天时包围外植体(数据未示出)。

F5薄膜上的外植体支持几个小的、分离的细胞群的生长，但细胞生长有限。值得注意的是，通过供体2外植体观察到了干细胞迁移和扩增，在第14天时在膜上可见多个ABCB5标记簇，并观察到增殖性细胞群的建立(数据未示出)。在培养的第11天看到干细胞球体形成，并观察到与在所有其它供体2生长物上看到的锚定组织桥类似的结构(数据未示出)。供体3的外植体成功粘附到F5膜上，但是直到第7天才看到细胞生长(数据未示出)，这比在调配物F2-F4上观察到的细胞4天迁移到表面上的细胞迁移稍晚。

值得注意的是，在每个膜群体的至少一个供体生长中看到ABCB5标记的成功可视化，这指示活的干细胞群体的存在。

羊膜对照组

与包括晶体蛋白的薄膜调配物相比，羊膜上外植体的生长是可变的。供体1外植体从外植体产生大且汇合的细胞生长，波形蛋白的染色呈阳性(数据未示出)。供体2具有小且不对称的生长，延伸到组织的上侧和左侧，但在下侧上只存在小的边缘。来自供体3的外植体虽然粘附在膜上，但在14天的培养期间没有在羊膜上产生任何细胞生长。

由于稳定硝化纤维过滤器的存在，羊膜上的生长物的可视化变得困难，所述稳定硝化纤维过滤器是不透明的并且使高放大倍数成像不可行。在5倍放大倍数下，仅在供体2外植体的上边缘上方观察到一小群ABCB5阳性细胞。

RNA表达

将来自膜外植体的基因表达数据与羊膜对照组上的外植体生长表达进行比较。在所有情况下，除F2上的PCNA表达之外，与羊膜相比，评估的膜调配物的增殖标志物PCNA和MKI67的表达增加了几倍。上皮和基质标志物两者在所有膜上表达，这指示天然角膜缘生态位中存在的所有细胞类型都成功生长。与羊膜相比，VIM和KERA的表达明显增加，这表明含有晶体蛋白的膜促进了角膜基质细胞的扩增。在快速扩增的种群中，观察到的TP63、ΔNp63和Notch1表达的降低是期望的。

表6呈现了当在薄膜调配物F2、F3、F4和F5上以及在羊膜上生长时在外植体供体6与外植体供体7之间取平均的、14天时在样品中检测到的每μl干细胞标志物ABCB5和ABCG2的拷贝数。

表6.干细胞标志物表达——每μL拷贝数

*标准偏差

从表6中可以看出，与羊膜相比，ABCB5和ABCG2的表达在所有含有晶体蛋白的膜上都更高。这表明除了角膜缘干细胞扩增外，子代祖细胞的分化也比羊膜上的分化更好。

实例10：包括晶体蛋白的薄膜组合物的光学表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的薄膜组合物的光学透明度和透过率的评估。

薄膜由如上表3所述的调配物F2、F3和F4制备。

评估所有样品跨可见光谱(400-700nm)的透光率。

从图26和27中可以清楚地看出，来自F2、F3和F4的薄膜在湿态和干态下在可见光谱范围内都具有非常高的透过率。事实上，对于每种调配物，观察到跨更高波长的透过率达到或超过90％，如图26A的水合和干燥F2调配物、图26B的水合和干燥F3调配物和图26C的水合和干燥F4调配物所示。水合F2、F3和F4调配物显示出优异的颜色均匀性(分别参见图27a、27b和27c)，并且另外的透射测定再次显示出高透光率，其中所有膜都表现出优于眼部应用所需的72％透明度阈值(参见图27，下图)。

实例11：包括PEG化晶体蛋白的组合物的制备

此实例描述了包括PEG化晶体蛋白的组合物的制备。

探索了PEG化策略以评估对晶体蛋白稳定性的任何影响，例如，提高的保质期和功效，并通过晶体蛋白的内聚交联获得晶体蛋白水凝胶。提取后，粗晶体蛋白提取物与不同的PEG衍生物反应，以优化对交联的官能团的访问，从而有助于凝胶形成。

通过使用SDS-PAGE表征PEG-晶体蛋白偶联物来评估PEG化反应。如图28所示，在存在PEG的情况下SDS-PAGE上存在高分子量物质证实了晶体蛋白PEG化成功。

实例12：包括晶体蛋白的粘合剂组合物的光学表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的粘合剂组合物的光学透明度和透过率的评估。

最初筛选不同浓度的PEGDA、晶体蛋白和光引发剂(核黄素和irgacure 2959两者)以获得基于PEGDA的晶体蛋白水凝胶。

使用浓度分别为15和0.5(w/v％)的PEGDA和irgacure 2959制备代表性实施例，其中水凝胶中的晶体蛋白的最大浓度为120mg/mL，以获得透明水凝胶。对仅PEGDA和PEGDA+晶体蛋白水凝胶的初步视觉筛选示出，包含60mg/mL和120mg/mL的晶体蛋白不会对水凝胶透明度产生负面影响，如从图29中间和图29底部与图29顶部的比较可以看出的。

评估预固化样品和固化水凝胶两者跨可见光谱(400-700nm)的透光率。使用不同体积的预固化预混样品(范围为50到600uL)流延水凝胶。预固化样品和水凝胶两者均示出高透光率(>80％)。目前建议的适合于人角膜移植材料的阈值为72％(Gonzalez-Andrades等人，2015)。水凝胶的光学透明度(使用600uL预聚物溶液流延)在图30中示出。

从图30中可以清楚地看出，使用本文所述的组合物可以获得包括在可见光谱上具有极高的光学透明度和透过率的含有晶体蛋白的水凝胶的水凝胶。

为了确认PEGDA水凝胶中晶体蛋白的掺入，进行了ATR-FTIR。为了去除任何未交联的晶体蛋白，将水凝胶放置在水中24小时，随后在37℃下干燥过夜，然后进行FTIR分析。对仅PEGDA和PEGDA-晶体蛋白水凝胶进行比较的代表性FTIR图在图31中示出。1627、1637、3300、3100、619nm处的峰分别对应于β-片、NH拉伸、Ist酰胺和OCN弯曲。

PEGDA-晶体蛋白样品中1627nm处的峰证实了晶体蛋白的存在，因为已知晶体蛋白表现出β-片状结构。事实上，PEGDA-晶体蛋白的FTIR光谱图与通过如以上实例2中所述和图10中所示的粗晶体蛋白提取物观察到的光谱图具有高度可比性。

实例13：包括晶体蛋白的组合物的物理表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的代表性组合物的某些物理特性的评估。

如上所述制备晶体蛋白组合物F2、F3和F4。

如图32中所描绘的对接触角值进行测量，以确定这些晶体蛋白膜的润湿性。从下表7中可以看出，每个晶体蛋白调配物的接触角值均低于90°，从而将这些组合物归类为亲水材料。

表7.晶体蛋白组合物的接触角值

然后通过在21天时段内测量水合过程中的质量变化来评估这些晶体蛋白膜的稳定性。从图33中可以看出，水合后膜的大部分质量损失(与起始质量相比)发生在水合后的第一个小时内。这种快速的质量损失由未结合蛋白质的快速扩散造成的。在这种最初的损失之后，水合膜的质量在随后的21天内保持稳定。

这些晶体蛋白膜经历灭菌并保持有用的结构完整性和功能的能力对于其在如外科手术等期望应用中的使用是至关重要的。晶体蛋白组合物F2和F3在25-32KGy下进行γ灭菌。图34呈现了从F2膜(图34a)和从F3膜(图34b)中浸出的晶体蛋白的圆二色光谱的结果，其中实线数据表示在milliQ中温育24小时的膜，并且虚线数据来自在milliQ中温育24小时的γ灭菌膜。指示来自γ灭菌膜和未灭菌膜的样品中存在β-片状结构的217nm处最小负峰的存在证实了γ灭菌对膜中晶体蛋白的天然结构没有不利影响。

图35示出了在室温下储存3个月后的晶体蛋白膜(图35a)、如上所述的γ灭菌后的晶体蛋白膜(图35b)和γ辐照后的水合膜样品的代表性图像，其示出了这些膜保持其结构完整性并保持不溶。

实例14：包括晶体蛋白的粘合剂组合物的功能表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的粘合剂组合物的粘合功效的评估。

为了证明组合物的粘合性质，使用鸡胸样品作为软湿组织的代表，因为其容易获得且价格低廉。使用手术刀刀片在鸡胸样品上做出切口，并用1％光引发剂涂施200μL仅PEGDA(图36，左上方)和基于PEGDA的晶体蛋白(图36，右上)预固化样品，随后进行3分钟UV曝光。

涂覆的溶液立即转化为溶胀的凝胶，并且凝胶紧紧地粘附在组织上(图36)。

从图36中可以容易地看出，含有晶体蛋白的组合物(图36，右下方)有效地密封了切口，尽管物理拉伸足以打开涂施仅PEGDA对照组(图36，左下方)组合物的切口，但切口仍然保持闭合。

这些数据支持本文所述的代表性的含有晶体蛋白的组合物的粘合功效。这些实例清楚地表明，包括一种或多种如本文所述的晶体蛋白的生物聚合物组合物适合于用作生物粘合剂，并且鉴于其高透明度，特别适合用于眼科手术。

实例15：包括晶体蛋白的粘合剂组合物的功能表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的粘合剂组合物的粘合功效的评估。

根据下表8制备适合于可见光固化或UV固化的PEGDA晶体蛋白粘合剂调配物。

表8.UV光和可见光粘合剂组合物

*三乙醇胺

**N-乙烯基吡咯烷酮

示出这些组合物的视觉表征的代表性图像在图37中呈现，其中经UV固化的调配物在图37a中示出，并且示出了之前(图37b，左)和之后(图37b，右)的可见光调配物。这些固化调配物的高度透明性质支持其在眼科手术中的适用性。

为了研究组合物的粘合性质和其在手术应用中的适用性，使用猪眼样品作为代表性眼部组织。使用手术刀刀片在如图38a所示的眼睛上做出切口。

然后将晶体蛋白水凝胶组合物涂施到切口上，并固化3分钟(参见图38b，经UV固化的晶体蛋白组合物)。

从图38(b)中可以容易地看出，含有晶体蛋白的组合物在潮湿条件(37℃)下密封切口并保持密封至多2天。如果需要，这是执行另外的外科手术的足够时间。

另外，使用图39中描绘的猪眼模型在缝合试验中建立晶体蛋白膜的手术易处理性。从图39a中可以容易地看出，晶体蛋白膜调配物F3在水合时具有良好的可折叠性并且不粘附自身，这使得折叠能够逆转并易于处理。图39b示出F3膜可以容易地切割、提起并放置在角膜表面上，并且如图39c所示，晶体蛋白膜可以容易地缝合。

使用猪皮肤样品在搭接剪切测试中确定经UV固化的晶体蛋白调配物的粘合强度，如图40顶部所示。图40底部呈现了关于来自此试验的粘合强度的数据，其中误差条表示取自六个样品的平均值的标准偏差。纤维蛋白胶值取自文献(Nakayama和Matsuda，1999)。如可以看出的，晶体蛋白膜的粘合强度与所报告的纤维蛋白胶的粘合强度相当。

这些数据支持本文所述的代表性的含有晶体蛋白的组合物的粘合功效。这些实例清楚地表明，包括一种或多种如本文所述的晶体蛋白的生物聚合物组合物适合于用作生物粘合剂，并且鉴于其高透明度，特别适合用于眼科手术。

实例16：包括晶体蛋白的组合物的生物相容性和细胞转移效率的表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的薄膜组合物的生物相容性，并且特别是其在转移细胞群中的功效的评估。

材料和方法

使用8mm活检穿孔器从捐赠的人体组织中取出中央角膜。角膜在-80℃的无菌MilliQ中通过3次冷冻/解冻循环脱细胞。脱细胞后，将组织在无菌MilliQ中冲洗3次，以去除任何松散的细胞碎片，然后在37℃下在4U/mL DNase I中处理过夜。使用5mM EDTA灭活DNase。活/死染色示出没有活细胞。将角膜组织在无菌PBS中洗涤5次，然后切成5个相等的部分并如下排列：

1.在无细胞对照膜上方

2.在18-138A培养膜上方

3.在18-138A培养膜下方

4.在18-147培养膜上方

5.在18-147培养膜下方

F2膜调配物在13mm玻璃盖玻片上流延并固化。将来自P3和P4处的两个原代人角膜上皮细胞系的2×10⁴个细胞接种到6个膜上(每个细胞系3个)。将其培养7天，使细胞在膜表面上增殖。

将样品在37℃下温育7天。在7天时，将角膜组织从其治疗表面去除并进行活/死染色。成像后，将组织与处理表面分离，返回培养，以评估进一步的增殖。

结果

如从图41中可以容易地看出的，使用F2薄膜将人上皮细胞转移到脱细胞人角膜上是非常有效的，其中图41a示出了无细胞对照组，图41b示出了放置在培养细胞顶部的角膜，图41c示出了放置在培养细胞下面的角膜，并且图41d示出了放置在放大10倍的培养细胞下面的角膜。转移后细胞增殖和附着很明显。活细胞的存在(绿色)、死细胞的不存在(红色)以及观察到的细胞增殖和附着到角膜证实了健康细胞向角膜表面的转移。这些数据证实，晶体蛋白膜可以用作成功的细胞载体，例如用于重新填充脱细胞角膜和其它靶组织。

这些数据证实了包括如本文所述的晶体蛋白的组合物在细胞转移应用中的惊人功效，包含如用于眼部治疗的角膜上皮细胞群和/或干细胞群在干细胞群的转移中的功效。

实例17：包括晶体蛋白的活性剂递送组合物的功能表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的水凝胶组合物用于提供活性剂(在这种情况下是眼部抗生素)递送的能力的评估。

材料和方法

此实例中使用的所有薄膜均包括晶体蛋白-120mg/mL、甘油-2％、戊二醛10mM。

为了测量药物释放速率，将氯霉素加载到晶体蛋白膜中。在10mm PDMS片上用加载到溶液中的药物流延晶体蛋白膜。然后将这些膜放入烘箱中过夜干燥。干燥后，将膜放入1mL艾本德试管中，然后浸泡在500uL PBS或模拟泪液(STF，包括0.68g NaCl、0.22gNaHCO₃、0.008g CaCl₂·2H₂O、0.14g KCl和100mL蒸馏去离子水)溶液中。然后在5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、60分钟、180分钟、300分钟、360分钟的特定时间段取100uL样品，并在酶标仪上以271nm和230nm进行分析，以确定氯霉素浓度。对于多层膜(3层)，只有中间膜含有药物(氯霉素)。多层膜由3层以下组合物制成：晶体蛋白-120mg/mL、甘油-2％、GA-10mM，其中中间层含有测试浓度的氯霉素(3mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL)。第一层在10mm PDMS片上流延，并且干燥后，使第二(中间)层在上面流延，并且当其干燥时，使最后一层在上面流延。

分析方法

在测试前使用吸光度创建在230nm、240nm、254nm和271nm处浓度范围为0mg/mL到3mg/mL的氯霉素的标准曲线。然后使用这些曲线来转换从样品获得的吸光度并将其转换为浓度。

延长时间药物递送

将膜留在溶液中持续至多一周，以确定7天后氯霉素的浓度。波长230nm和271nm产生了噪声极低的对照，并且这些波长的读数是分析的首选。

结果

对于单层膜，对于所有测试的载药量，药物释放在10-25分钟达到峰值(参见图42A、42B)。药物释放百分比(释放到溶液中的药物量占载药量的百分比)遵循与浓度类似的曲线(参见图42C、42D)。所有膜都能达到至少70％的药物释放——其中10mg/mL达到100％。

药物浓度在230nm和271nm处的读数与271nm读数非常类似，所有样品在最初峰处的氯霉素水平略有升高(参见图42C和42D)。溶液中的药物浓度反映了最初的载药量，其中两个波长之间具有非常好的一致性。

同样，在评估药物递送百分比时，两个测定波长之间存在非常好的一致性，其中每个加载浓度的结果具有高度可比性(参见图42A和42B)。

所有膜都观察到相同的趋势，溶液中氯霉素浓度的最初大幅增加在15-25分钟左右达到平稳，然后最终降低并在50分钟点后达到相对稳态的浓度。

使用STF获得了与PBS试验非常类似的结果，其中药物递送百分比和浓度增加，在30分钟或之前达到峰值，此后趋于平稳(数据未示出)。

与具有等效载药量的单层膜相比，多层膜的药物释放百分比和溶液中的总药物浓度两者均有所降低，分别如图43B(230nm)和图43D(271nm)以及图43A(230nm)和图43C(271nm)所示。然而，这些膜的释放曲线更加稳定且可预测，如图43A-D所示。总体趋势与单层膜相当(其中平稳导致最终降低，直到其达到稳态)，但峰值后浓度的降低显著减少。单层膜的浓度降低(从最大值到稳态区域)了约0.2-1.2mg/ml(对于10mg/ml膜更高)，而多层膜降低了0.1-0.2mg/ml(对于所有膜)。因此，多层膜的药物释放更加稳定，如更平滑的曲线所指示的。

多层膜的释放平稳期在60分钟与180分钟之间出现，紧随其后的是稳定区域。

药物递送百分比与载药量一致，因为较高浓度的膜在溶液中产生较高浓度的药物。

实例18：包括晶体蛋白的活性剂递送组合物的功能表征

此实例描述了对包括晶体蛋白的水凝胶组合物用于提供活性剂(在这种情况下是抗生素四环素)递送的能力的评估。

材料和方法

在此实验中，在聚合期间将四环素添加到经UV固化的晶体蛋白水凝胶组合物(0.1％irgacure 2959，10％PEGDA)中(此处称为“新鲜凝胶”)，并分别吸收到相同调配物的经干燥UV固化水凝胶中(此处称为“干凝胶”)。如上所述，在7天内评估药物释放。

结果

从描绘累积药物释放的图44中可以看出，新鲜凝胶的释放曲线(黑线数据)与干凝胶的释放曲线(灰线数据)相当，总药物释放也是如此。因此，无论四环素是在聚合期间还是聚合之后引入到递送组合物中，都可以实现四环素抗生素的有效递送。这为制备用于特定应用的活性剂递送组合物提供了理想的灵活性。

这些实例清楚地证明，包括一种或多种如本文所述的晶体蛋白的生物聚合物组合物适合于用作药物递送材料，例如在眼科手术或其它眼部治疗中例如递送眼部有效的抗生素。

出版物

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上文和下文中引用的所有申请、专利和出版物(如果有的话)的全部公开内容通过引用并入本文。

其中前面的描述已经参考具有其已知等效物的整体或组分，那些整体如同单独阐述一样并入本文。

应当注意，对本文所描述的当前优选实施例的作出的各种改变和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。可以在不脱离本发明的精神和范围并且在不减少其伴随的优点的情况下作出此类改变和修改。因此，此类改变和修改旨在包含在本发明内。

本发明还可以从广义上说包含本申请的说明书中单独地或共同地提及或指示的部分、要素和特征、所述部分、要素或特征中的两个或更多个的任何或所有组合。

已经仅通过举例描述了本发明的各方面，并且应当理解，例如当本发明如指示性权利要求中所限定时，可以在不脱离本发明的范围的情况下进行改变、修改和添加。此外，在存在具体特点的已知同等特点的情况下，并入所述同等特点，如同在本说明书中具体提及一样。

Claims (44)

1.一种生物相容性组合物，其包括：

一种或多种分离的、纯化的、重组的或合成的蛋白质，所述蛋白质选自包括以下的组：

a.α-晶体蛋白；

b.β-晶体蛋白；

c.γ-晶体蛋白；

d.来自长尾鳕(蓝尖尾无须鳕)的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

e.来自智人的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

f.包括本文在表1中鉴定的氨基酸序列的蛋白质；

g.包括来自以上a)到f)中的任一项的至少约10个连续氨基酸或由其组成的多肽；

h.与以上a)到g)中的任一项具有至少约90％氨基酸同一性的蛋白质；

i.根据以上a)到h)中的任一项的蛋白质，所述蛋白质在体内具有晶体蛋白的天然结构；

j.以上a)到i)中的两项或更多项的任何组合；

任选地一种或多种增塑剂；

任选地一种或多种共引发剂；以及

一种或多种交联剂。

2.根据权利要求1所述的生物相容性组合物，其中所述一种或多种蛋白质能够交联以形成聚合物。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的生物相容性组合物，其中所述生物相容性组合物是被调配成至少部分地在受试者体内或身上的目标部位聚合和/或胶凝的体内胶凝组合物，或者其中所述生物相容性组合物是被调配成使得当存在于受试者体内或身上的目标部位时所述体内胶凝组合物的交联发生或被引发的体内胶凝组合物。

4.一种用于产生交联的生物聚合物组合物的方法，所述方法包括：

提供包括以下的组合物：

a.α-晶体蛋白；

b.β-晶体蛋白；

c.γ-晶体蛋白；

d.来自长尾鳕(蓝尖尾无须鳕)的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

e.来自智人的以上a)到c)中的任一项的蛋白质；

f.包括本文在表1中鉴定的氨基酸序列的蛋白质；

g.包括来自以上a)到f)中的任一项的至少约10个连续氨基酸或由其组成的多肽；

h.与以上a)到g)中的任一项具有至少约90％氨基酸同一性的蛋白质；

i.根据以上a)到h)中的任一项的蛋白质，所述蛋白质在体内具有晶体蛋白的天然结构；

j.以上a)到i)中的两项或更多项的任何组合；

任选地一种或多种增塑剂；

任选地一种或多种共引发剂；以及

使所述组合物与一个或多个交联分子接触；

引发交联，由此形成交联的生物聚合物组合物。

5.一种用于产生包括一种或多种纯化晶体蛋白的组合物的方法，所述方法包括：

提供脊椎动物眼组织；

在适合于维持天然晶体蛋白结构的条件下在存在提取缓冲液的情况下使所述组织均质化；

例如通过离心或过滤来将液体匀浆与任何残留固体分离，以提供含有晶体蛋白的溶液；

任选地至少部分地进一步纯化所述晶体蛋白；

任选地透析所述含有晶体蛋白的溶液以去除所述提取缓冲液；

任选地冻干所述含有晶体蛋白的溶液以提供冻干的晶体蛋白组合物；

任选地例如在0℃或以下储存所述含有晶体蛋白的溶液或所述冻干的晶体蛋白组合物；

其中相当大比例的所述纯化的晶体蛋白保持其天然结构。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述适合于维持天然晶体蛋白结构的条件包括：

a.将所述匀浆维持在pH为7或更大的提取缓冲液中；或者

b.将所述匀浆维持在生理pH下；或者

c.将所述匀浆维持在低于约15℃的温度下；

d.以上a)和c)两者；或者

e.以上b)和c)两者；

并且其中所述方法包括：

通过离心或过滤将所述液体匀浆与任何残留固体分离，以提供含有晶体蛋白的溶液；

透析所述含有晶体蛋白的溶液以去除所述提取缓冲液；

任选地冻干所述含有晶体蛋白的溶液以提供冻干的晶体蛋白组合物；

在适于维持天然晶体蛋白结构的条件下，例如在约4℃或以下维持所述含有晶体蛋白的溶液或所述冻干的晶体蛋白组合物，直至使用；

其中相当大比例的所述纯化的晶体蛋白保持其天然结构。

7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述脊椎动物眼组织是晶状体组织或超声乳化材料。

8.根据权利要求5到7中任一项所述的方法，其中所述脊椎动物眼组织是来自鱼的眼组织或者是来自哺乳动物的眼组织。

9.根据权利要求5到8中任一项所述的方法，其中均质化在避免或最小化对一种或多种晶体蛋白同种型的破坏和/或避免或最小化蛋白质聚集的条件下执行。

10.根据权利要求5到9中任一项所述的方法，其中均质化

a.在大于约7的pH下执行；或者

b.在生理pH下执行；或者

c.在低剪切条件下执行；

d.在存在一种或多种稳定添加剂，例如精氨酸的情况下执行；或者

e.在低温下执行；

f.在约0℃到约5℃的温度下发生；

g.穿插有不执行均质化的静止阶段，例如，穿插有将所述匀浆放置在冰上持续一段时间的冷却阶段；或者

h.以上中的两项或更多项的任何组合。

11.根据权利要求5到10中任一项所述的方法，其中保持其天然结构的所述纯化晶体蛋白的所述相当大比例大于约60％。

12.一种在有需要的受试者中进行组织闭合的方法，所述方法包括：

任选地施加力以闭合裂伤、损伤、切口或伤口；

使裂伤、损伤、切口或伤口或所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的部位与如前述权利要求中任一项所限定的含有晶体蛋白的组合物接触，任选地其中所述含有晶体蛋白的组合物至少部分地交联，

任选地施加力以闭合所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口，

引发和/或维持交联；

维持所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的闭合持续足以发生交联的时间；

其中所述晶体蛋白的交联形成粘合剂组合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述组织闭合方法是闭合手术切口的方法。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述组织闭合方法是无缝线闭合的方法，例如，所述无缝线闭合是无缝线皮肤闭合、无缝线伤口闭合或无缝线手术切口闭合。

15.根据权利要求12到14中任一项所述的方法，其中手术是眼科手术。

16.根据权利要求12到15中任一项所述的方法，其中维持所述裂伤、所述损伤、所述切口或所述伤口的闭合是

a.通过应用如绷带、缝线、网片等一种或多种医疗辅助器材或者通过如夹紧所述裂伤、所述损伤、所述切口所述或伤口或保持其闭合等(通常是暂时的)物理力

b.持续足以发生大于约60％交联的时间；或者

c.以上a)和b)两者。

17.根据权利要求12到16中任一项所述的方法，其中所述组合物中存在的交联剂是光交联剂，其中交联的引发是通过暴露于光。

18.一种在有需要的受试者中进行组织闭合的方法，其中所述受试者正在经历或已经经历眼科手术，所述方法包括：

使手术切口或所述手术切口的部位与如前述权利要求中任一项所限定的含有晶体蛋白的组合物接触，任选地其中所述含有晶体蛋白的组合物至少部分地交联；

任选地施加力以闭合所述切口；

引发和/或维持交联；

维持所述手术切口的闭合持续足以发生交联的时间；

其中所述晶体蛋白的交联形成能够维持所述手术切口的闭合的粘合剂组合物。

19.一种治疗有需要的受试者的眼外伤或眼切口的方法，所述方法包括以下步骤：

使所述眼外伤或所述眼切口与如本文所述的组合物接触，任选地其中含有晶体蛋白的组合物至少部分地交联；以及

引发和/或维持交联；

其中所述交联形成生物粘附聚合物组合物。

20.一种向有需要的受试者递送一种或多种活性剂的方法，所述方法包括：

提供如前述权利要求中任一项所限定的包括晶体蛋白的组合物，任选地其中所述含有晶体蛋白的组合物至少部分地交联，其中所述组合物另外包括一种或多种活性剂；

使所述受试者与所述组合物接触；

任选地引发和/或维持所述组合物的交联，

由此向所述有需要的受试者递送所述活性剂。

21.根据权利要求20所述的方法，其中使所述受试者与所述组合物接触包括将所述组合物施用于所述受试者身上或体内的目标部位，包含例如手术施用。

22.一种培养一个或多个细胞或组织的方法，所述方法包括：

提供一个或多个待培养细胞；

使所述一个或多个细胞与包括如前述权利要求中任一项所限定的组合物的基材接触；

使所述一个或多个细胞在适合于继续生存、生长、复制和/或分化的条件下与所述基材以及任选地与另外的生长培养基接触一段时间。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述如本文所述的组合物包括γ-晶体蛋白。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述一个或多个细胞包括一个或多个具有复制能力的细胞或者一个或多个干细胞。

25.根据权利要求22到24中任一项所述的方法，其中所述基材是由如前述权利要求中任一项所限定的组合物形成的薄膜，例如具有足够的机械强度和/或弹性以使得与其接触的细胞能够转移到另一个位置的薄膜。

26.根据权利要求22到25中任一项所述的方法，其中所述位置是第二培养器皿。

27.根据权利要求22到25中任一项所述的方法，其中所述位置在受试者身上或体内。

28.根据权利要求27所述的方法，其中一个或多个细胞是一个或多个眼细胞或源自眼睛的一个或多个干细胞，并且所述位置是眼睛中或眼睛上的手术部位。

29.根据权利要求27或28所述的方法，其中一个或多个细胞是一个或多个角膜缘干细胞或者一个或多个基质干细胞。

30.根据权利要求22到29中任一项所述的方法，其中所述基材是由如前述权利要求中任一项所限定的组合物形成的凝胶，所述凝胶具有至少一个厚度足以允许形成3D细胞培养物的区域。

31.根据权利要求22到30中任一项所述的方法，其中所述培养一个或多个细胞或组织的方法是培养来自所述脊椎动物眼睛的一个或多个细胞的方法，所述方法包括：

提供一个或多个待培养脊椎动物眼细胞；

使所述一个或多个细胞与包括如前述权利要求中任一项所限定的组合物的基材接触，其中所述基材是光学透明的；

使所述一个或多个细胞在适合于继续生存、生长、复制和/或分化的条件下与所述基材以及任选地与另外的生长培养基接触一段时间；

其中所述基材具有足够的机械耐久性，以支持向受试者的眼睛进行的转移和/或与手术应用相关的处理。

32.一种治疗有需要的受试者的与干细胞缺乏相关的眼部病症的方法，所述方法包括使眼睛与包括以下的治疗组合物接触：

i.干细胞，所述干细胞任选地根据如前述权利要求中任一项所限定的培养方法进行培养；

以及任选地

ii.如前述权利要求中任一项所限定的生物相容性组合物或生物聚合物组合物。

33.一种治疗有需要的受试者的眼部病症的方法，所述方法包括：

提供根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组合物，其中所述生物相容性组合物包括一种或多种活性剂，以及

向所述受试者施用所述生物相容性组合物，以允许将所述一种或多种活性剂转移到所述受试者。

34.一种治疗有需要的受试者的眼部病症的方法，所述方法包括：

提供根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组合物，其中所述生物相容性组合物包括一个或多个干细胞，以及

向所述受试者施用所述生物相容性组合物，以允许将所述干细胞中的一个或多个干细胞转移到所述受试者。

35.一种如前述权利要求中任一项所限定的组合物在制备用于疗法中的药剂中的用途。

36.一种如前述权利要求中任一项所限定的组合物在制备供体外使用的药剂或组合物中的用途，包含采用体外步骤的治疗或研究方法。

37.一种如前述权利要求中任一项所限定的组合物，其用于疗法中，包含用于本文所述的治疗方法中的任一种治疗方法中。

38.一种如前述权利要求中任一项所限定的组合物，其用于体外治疗或研究方法或采用体外步骤的治疗或研究方法中。

39.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或用途，其中

a.所述一种或多种晶体蛋白的天然二级结构得以维持；或者

b.所述一种或多种晶体蛋白的天然三级结构得以维持；或者

c.所述一种或多种晶体蛋白的天然四级结构得以维持；或者

d.所述一种或多种晶体蛋白基本上不含纳米原纤维或其它破坏的结构形式；或者

e.所述组合物中存在的所述晶体蛋白中的至少一些晶体蛋白是天然糖基化的；或者

f.以上a)到e)中的两项或更多项的任何组合。

40.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或用途，其中所述组合物包括：

a.约0.1％w/w到约1.5％w/w交联剂；或者

b.约0.5％w/w到约3％w/w交联剂；或者

c.约3％w/w到约30％w/w交联剂；或者

d.约10mg/mL到约200mg/mL晶体蛋白；或者

e.约10mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白；或者

f.约0.5％w/w到约3％w/w增塑剂；或者

g.约0.5％w/w到约5％w/w共引发剂；或者

h.以上a)到g)中的两项或更多项的任何组合。

41.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或用途，其中所述组合物包括

a.约100mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白、约5mM到约10mM戊二醛和约1.5％w/w到约2.5％w/w甘油；或者

b.约100mg/mL到约120mg/mL晶体蛋白、约10％w/w到约20％w/w PEGDA和约0.2％w/w到约1.0％w/w光引发剂；或者

c.约50mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白、约10％w/w到约20％w/w PEGDA和约0.2％w/w到约1.0％w/w光引发剂；或者

d.约50mg/mL到约80mg/mL晶体蛋白、约25％w/w到约50％w/w PEGDA、约0.2％到约1.0％w/w光引发剂和10％w/w到20％w/w的共引发剂。

42.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或用途，其中所述组合物当交联时

a.在可见光谱上是光学透明的；或者

b.具有与其所施用于或已经施用于的受试者的眼睛的折射率相等的折射率；或者

c.跨可见光谱(400nm到700nm)的透光率大于约75％；或者

d.以上a)到c)中的两项或更多项的任何组合。

43.根据前述权利要求中任一项的组合物、方法或用途，其中当存在时，所述组合物中存在的所述一种或多种活性剂是眼科可接受的抗生素。

44.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、方法或用途，其中所述晶体蛋白中的一种或多种晶体蛋白来自长尾鳕(蓝尖尾无须鳕)或来自智人。

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