CN115698054A - 包含肽的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新的包含肽的组合物及其用途(例如，治疗黄斑裂孔)。

Description

包含肽的组合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种新的包含肽的组合物及其用途。
背景技术
黄斑是视网膜中与视力最密切相关的部分。该黄斑区出现裂孔被称为黄斑裂孔，患上该病症的患者难以看清物体。上述黄斑裂孔是因眼睛老化，特别是因为年龄的增加玻璃体产生变化而引起的。通常认为因为视网膜和玻璃体皮质有很强的黏连性，所以随着年龄的增加，玻璃体胶原纤维萎缩，对视网膜产生张力，其结果，向前的牵拉力使视网膜龟裂，黄斑区产生裂孔。在本病患者中老年人居多，随着近年高龄人口的急速增加，患者人数也在增加。
作为黄斑裂孔的治疗方法，只能进行玻璃体手术，通过将致病玻璃体切除使圆孔闭合。在黄斑裂孔的症状较轻，圆孔较小时，闭合率较高，但在病情发展，圆孔较大时，圆孔的闭合率较差，不能期待视力恢复。玻璃体手术的视力恢复率为7成，需要3～7天的住院时间。另外，在黄斑裂孔的治疗方法中，黄斑裂孔可以闭合，但是因为切除了作为基底膜的内界膜，所以会产生术后没有黄斑细胞重建的支架，治疗质量难以保证的问题。因此，期待开发出对黄斑裂孔有效的治疗剂。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题是在上述背景下，提供一种以进行治疗黄斑裂孔的玻璃体手术后，视功能视觉质量(QOV)恢复和术后生活质量(QOL)改善为目的的新的黄斑裂孔治疗剂。
问题解决方案
发明人对人工胶原样多肽进行了锐意探讨。其结果，发现使用包含肽的特殊组合物，可提供视网膜细胞再生所需的支架，只需贴上就可闭合圆孔，达到恢复、改善视功能，减轻患者负担的效果，通过进一步的研究，完成了本发明。
即，本发明涉及下述事项。
(1)一种组合物，含有以式(I)表示的三链肽为聚合单元的两种以上聚合肽
式(Ⅰ)：
－(P1,P2,P3)－ (Ⅰ)
(式(Ⅰ)中，
P1、P2和P3可以相同或不同，各自独立地是下述式(Ⅱ)表示的肽链，
P1、P2和P3形成具有三重螺旋结构的三聚体，通过各肽链所包含的半胱氨酸(Cys)残基以二硫键氧化交联而聚合，
式(Ⅱ)：
Rl－(Pro－Hyp－Gly)m－X－(Pro－Hyp－Gly)n－R2 (II)
(式(Ⅱ)中，
R1、R2是各自具有氨基末端和羧基末端，各自独立地由包含至少2个残基的Cys(半胱氨酸)残基的任意2～10个残基的氨基酸残基组成的肽基，Pro是脯氨酸残基，
Hyp是羟脯氨酸残基，
Gly是甘氨酸残基，
m和n各自独立地为4以上的整数，
X是由-Xaa-Yaa-Gly-重复1至4次表示的肽基，Xaa和Yaa各自独立地表示氨基酸残基)。
(2)根据(1)所述的组合物，其中P1、P2、P3是相同的肽链。
(3)根据(1)所述的组合物，其中X是由选自－Phe－Hyp－Gly－Glu－Arg－Gly－、－Pro－Arg－Gly－Gln－Hyp－Gly－Val－Met－Gly－Phe－Hyp－Gly－和－Pro－Lys－Gly－His－Arg－Gly－Phe－Ser－Gly－Leu－Hyp－Gly的氨基酸残基组成的肽基。
(4)根据(1)所述的组合物，其中X是由选自－Pro－Arg－Gly－或－Phe－Hyp－Gly－Glu－Arg－Gly－的氨基酸残基组成的肽基。
(5)根据(1)所述的组合物，其中R1、R2各自独立地是由2个以上Cys(半胱氨酸)残基的氨基酸残基组成的肽基。
(6)根据(1)所述的组合物，其中所述式(Ⅱ)表示的肽链选自Rl－(Pro－Hyp－Gly)m－Pro－Arg－Gly－(Pro－Hyp－Gly)n－R2(i)和
Rl－(Pro－Hyp－Gly)m－Phe－Hyp－Gly－Glu－Arg－Gly－(Pro－Hyp－Gly)n－R2(ⅱ)。
(7)根据(1)所述的组合物，其中式(Ⅱ)表示的肽链以下述序列号表示。
H-Cys-Cys-Cys-(Pro-Hyp-Gly)5-Pro-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-Cys-Cys-Cys-OH 序列号1
H-Cys-Cys-(Pro-Hyp-Gly)5-Pro-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)
4-Cys-Cys-OH序列号2
H-Cys-Cys-Cys-(Pro-Hyp-Gly)4-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-Cys-Cys-Cys-OH 序列号3
(8)根据(1)～(7)任一项所述的组合物，其特征在于进一步包含水溶性填料。
(9)根据(8)所述的组合物，其中水溶性填料是糖。
(10)根据(9)所述的组合物，其中糖是葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇中的1种以上。
(11)根据(10)所述的组合物，其中糖是葡萄糖。
(12)根据(8)～(11)任一项所述的组合物，其中水溶性填料以相对于组合物总重量的10～50％的量存在。
(13)根据(8)～(11)任一项所述的组合物，其中聚合肽以相对于组合物总重量的50～90％的量存在。
(14)根据(1)～(13)任一项所述的组合物，其为凝胶的形态。
(15)根据(1)～(13)任一项所述的组合物，其为透明的形态。
(16)一种医药品，包括(1)～(15)任一项所述的组合物。
(17)一种器械，包括(1)～(15)任一项所述的组合物。
(18)一种眼部疾患的治疗剂，包括(1)～(15)任一项所述的组合物。
(19)根据(18)所述的眼部疾患的治疗剂，其中眼部疾患是黄斑裂孔或视网膜脱离。
(20)一种眼部疾患的治疗方法，其中包括向对象施与治疗有效量的(1)～(15)任一项所述的组合物的步骤。
(21)根据(20)所述的治疗方法，其中眼部疾患是黄斑裂孔或视网膜脱离。
(22)一种(1)～(15)任一项所述的组合物的制造方法，其中包括将式(Ⅰ)表示的聚合肽和水溶性填料制成均匀物理性混合物。
(23)(1)～(15)任一项所述的组合物在制造用于治疗眼部疾患的医药品中的用途。
发明的效果
由本发明的组合物组成的肽膜具有高透明性，是治疗黄斑裂孔的理想物质。
根据本发明，可以在保持肽膜强度的同时，将其加工为最适当厚度的片状。
根据本发明，可以赋予特定的生理机能并调节其强度的组合。
根据本发明，可以通过变化支架的硬度来控制细胞粘附、增殖、分化等。
根据本发明，可以控制肽膜的分解速度。
根据本发明，可以工业化生产肽膜。
附图说明
[图1]示出了将本发明的肽膜应用于MIO-M1细胞缺陷部的试验。
[图2]示出MIO-M1细胞在本发明的肽膜上粘附、增殖。
[图3]示出在白色家兔模型中使用未添加水溶性填料的肽膜的有效性、安全性的验证(体内(invivo))。
[图4]示出在白色家兔模型中使用添加水溶性填料的肽膜的有效性、安全性的验证(invivo)。
[图5]示出在食蟹猴模型中使用的有效性、安全性的验证(invivo)。
具体实施方式
本发明的组合物含有2种以上的聚合肽。
聚合肽(第一成分)
本发明的聚合肽是以式(I)表示的三链肽为聚合单元的两种以上聚合肽
以式(Ⅰ)
－(P1,P2,P3)－ (Ⅰ)
(式(Ⅰ)中，
P1、P2和P3可以相同或不同，各自独立地是下述式(Ⅱ)表示的肽链，
P1、P2和P3形成具有三重螺旋结构的三聚体，通过各肽链所包含的半胱氨酸(Cys)残基以二硫键氧化交联而聚合，
式(Ⅱ)
Rl－(Pro－Hyp－Gly)m－X－(Pro－Hyp－Gly)n－R2 (II)
(式(Ⅱ)中，
R1、R2是各自具有氨基末端和羧基末端，各自独立地由包含至少2个残基的Cys残基的任意2～10个残基的氨基酸残基组成的肽基，
m和n各自独立地为4以上的整数，并且
X是由-Xaa-Yaa-Gly-重复1至4次表示的肽基)。
本发明的聚合肽的特征在于是具有下述式(Ⅰ)表示的3条肽链形成的三聚体肽的结构单元，并且被氧化交联而成的聚合肽。
－(P1,P2,P3)－ (Ⅰ)
[式(Ⅰ)中，P1、P2和P3可以相同或不同，各自独立地是下述式(Ⅱ)表示的肽链，P1、P2和P3可以形成具有三重螺旋结构的三聚体，通过各肽链所包含的半胱氨酸(Cys)残基以二硫键交联，该三聚体以所述Cys的二硫键氧化交联而聚合。
Rl－(Pro－Hyp－Gly)m－X－(Pro－Hyp－Gly)n－R2 (II)
(式(Ⅱ)中，R1、R2是各自具有氨基末端和羧基末端，各自独立地由包含至少2个残基的Cys残基的任意2～10个残基的氨基酸残基组成的肽基。X是以-(Xaa-Yaa-Gly)-为基本单位重复1至4次表示的肽基。m和n各自独立地是4以上的整数。)]
所述Xaa和Yaa各自独立地表示氨基酸残基，例如可以从脯氨酸(Pro或P)残基、羟脯氨酸(Hyp或O)残基、精氨酸(Arg或R)残基、赖氨酸(Lys或K)残基、缬氨酸(Val或V)残基、亮氨酸(Leu或L)残基、异亮氨酸(Ile或I)残基、丝氨酸(Ser或S)残基、苏氨酸(Thr或T)残基、丙氨酸(Ala或A)残基、甘氨酸(Gly或G)残基、苯丙氨酸(Phe或F)残基、蛋氨酸(Met或M)残基、谷氨酸(Glu或E)残基、天冬氨酸(Asp或D)残基、天冬酰胺(Asn或N)残基、谷氨酰胺(Gln或Q)残基、组氨酸(His或H)残基、色氨酸(Trp或W)残基或酪氨酸(Tyr或Y)残基中选择，脯氨酸残基可以使用氨基或氟原子修饰，Xaa位和Yaa位中可以使用N-异丁基甘氨酸残基。
所述肽链的从N末端和C末端开始10个残基以内所包含Cys残基的数量各自独立，可以相同，也可以不同，可以是2个残基以上，3个残基以上，4个残基以上，5个残基以上。
在所述聚合肽的构成中，包括至少2个半胱氨酸(Cys)残基的各个氨基末端和羧基末端的肽基可以为10个残基以内，也可以是9个残基以内，8个残基以内，7个残基以内，6个残基以内，5个残基以内，4个残基以内或3个残基以内。
在本说明书中，“聚合肽”是指通过肽中所包含的半胱氨酸残基间氧化交联而形成的二硫键聚合的肽。
本发明的聚合肽的聚合度为2以上，只要是能够形成包含本发明的聚合肽的凝胶、优选水凝胶的聚合度即可，没有特殊限制，但平均聚合度可以是小于100、100～500、500～1000、1000～5000、5000～10000或10000以上。
在本说明书和本说明书所附的序列表中，用本领域技术人员众所周知且常用的3个字符或1个字符表述氨基酸的表述方法记述了肽的构造。在本说明书中，氨基酸是L型。本说明书的氨基酸除在分子生物学中被熟知的用于翻译一般蛋白质的20种L-氨基酸外，也包括在本技术领域中被熟知的修饰氨基酸残基，例如4-羟基-L-脯氨酸、4-氟-L-脯氨酸、N-异丁基甘氨酸。在本说明书中，羟基脯氨酸是3-羟基脯氨酸或4-羟基脯氨酸，用3个字符表示为“Hyp”，用1个字符表示为“O”。
本发明中聚合肽的制造使用了市售的氨基酸，但不限于此，可以使用众所周知的肽的化学合成方法进行制造(专利第6455862号)。另外，制造编码所需的氨基酸序列的核酸序列，将其掺入表达载体，用众所周知的方法制作重组表达载体，导入至大肠杆菌等微生物等合适的宿主中，制作转化体。通过在合适的培养基中培养得到的转化体，产生基因重组肽链，由此可以通过从培养物中回收产生的基因重组肽链，配制出在本发明中使用的基因重组肽链。
这种肽链例如可以使用高效液相色谱等分离方法，分离提纯而取得，可用于制造三链肽。
在本发明中，制造向所述肽链掺入多个半胱氨酸残基的聚合肽，但不限于此，可以通过二甲基亚砜(DMSO)等氧化剂或空气氧化等使其氧化交联，提供肽以二硫键交联而得的聚合肽。
制造本发明的聚合肽时使用的氧化剂，除上述DMSO以外，可以举例氧、碘、过氧化氢、溴酸钠、溴酸钾、过硼酸钠或过硼酸钾等，但不限于此。
例如可以通过使用埃尔曼试剂定量氧化交联反应后的残存硫醇基来确认通过本发明的二硫键的交联形成。
进一步，通过干燥由本发明中在水溶剂中制造的聚合肽组成的水凝胶，提供如下所述强度改进的聚合肽薄膜。
本发明的组合物含有2种以上不同的聚合肽。可以根据聚合肽薄膜的生理活性强度和物理强度，选择不同的聚合肽。可以调节组合物中不同聚合肽的比例。例如，可以使用下述3种肽，以5:5:1、5:4:1、5:3:1的配比，制成膜。
C2s:CCPO(GPO)4GPR(GPO)4GCC
H-Cys-Cys-(Pro-Hyp-Gly)5-Pro-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-Cys-Cys-OH序列号2
C3s:CCCPO(GPO)4GPR(GPO)4GCCC
H-Cys-Cys-Cys-(Pro-Hyp-Gly)5-Pro-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-Cys-Cys-Cys-OH序列号1
C3s-GFOGER：CCCPO(GPO)3GFOGER(GPO)4GCCCH-Cys-Cys-Cys-(Pro-Hyp-Gly)4-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-Cys-Cys-Cys-OH序列号3
此处，半胱氨酸数量多时可形成较硬的膜，半胱氨酸数量少时则为较软的膜。因此，半胱氨酸的数量决定物理强度。
另一方面，GFOGER为整合素结合序列，有该序列时，可粘附细胞。因此，通过适当地配合C3s-GFOGER可以提高生理活性强度。
本发明的组合物整体(含有聚合肽和水溶性填料的组合物)中“聚合肽”的含量(％)优选50～90％(本发明中，如无特殊说明，“％”表示重量百分比)。
水溶性填料(第二成分)
本发明的组合物除聚合肽外，还可以含有水溶性填料。水溶性填料可以举例碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、乳酸钙、甘露醇、尿素、肌醇、琥珀酸镁、山梨醇、碳水化合物(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇中的一种)，或其组合，但优选葡萄糖。
本发明的组合物整体(含有聚合肽和水溶性填料的组合物)中“水溶性填料”的含量(％)优选10～50％。
本发明的组合物除聚合肽和水溶性填料外，还可以含有赋形剂。
赋形剂可以举例甘露醇、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、结晶纤维素、乳糖、白糖、淀粉、玉米淀粉、氧化钛(TiO2)、轻质无水硅酸等。上述赋形剂可以单独使用，也可以2种以上组合使用。
肽膜的制作方法
可以将不同的聚合肽分别溶解于溶剂后，通过使其凝胶化，制造肽膜的水凝胶。
另外，可以在不同聚合肽分别溶解于溶剂后，加入水溶性填料，通过凝胶化，制造肽膜的水凝胶。
进一步，通过干燥所述水凝胶，可以制造片状膜即聚合肽薄膜。该聚合肽薄膜例如可以作为黄斑裂孔的治疗材料使用。
通过干燥本发明的聚合肽薄膜，与干燥前的聚合肽组成的水凝胶相比，可以在室温下进行长期保存，且与原来的水凝胶相比，即使肽分子间的相互作用变化，再次水合，也拥有更高的强度。因此，本发明的聚合肽薄膜强度改进，可以作为可加热灭菌的具有加热耐性的医疗用材料使用。
在本说明书中，“凝胶硬度(stiffness)”是指凝胶在体内例如相对于巨噬细胞等吞噬细胞分解的坚固性。该凝胶硬度受到凝胶交联聚合的程度及交联的肽链的支链结构不同等的影响。例如，如果凝胶中含有较多通过二硫键的交联时，形成较硬的凝胶。
本发明的组合物可以直接作为黄斑裂孔或视网膜脱落的治疗剂使用，或者也可以使用药学上可接受的载体或赋形剂，通过本领域技术人员所熟知的方法制成各种剂型。使用的载体或赋形剂是本领域技术人员所熟知的，可以进行适当选择。本发明的药剂可以使用本领域技术人所熟知的手段、方法进行制造。例如，在制造注射剂或输液剂时，可以使用生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水等药学上可接受的载体。在配制本发明的药剂时，可以使用增稠剂、吸收增强剂、pH调节剂、保存剂、分散剂、润湿剂、稳定剂、防腐剂、悬浮剂、表面活性剂等药学上可接受的添加剂。
本发明的药剂剂型没有特殊限制，可以根据需治疗的黄斑裂孔或视网膜脱离的部位、大小、种类、患者状态等进行适当选择。本发明的药剂可以是液态、半固态、固态中的任一种。本发明的药剂剂型可以举例薄膜，但不限于此。或者本发明的药剂也可以是在给药时悬浮于生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水等药学上可接受的载体中的冷冻干燥品的形态。
本发明的药剂施与途径没有特殊限制，可以根据需治疗的黄斑裂孔或视网膜脱离的部位、大小、种类、患者的状态等进行适当选择。本发明的药剂施与途径可以举例通过注入或切开进行留置等，但不限于此。
本发明的药剂用量可以根据需治疗的黄斑裂孔或视网膜脱离的部位、大小、种类、患者的状态等，由医师决定适当的用量。
本发明的药剂施与可以进行一次或数次。上述的次数可以由医师考量黄斑裂孔的部位、种类、程度、患者状态等后决定。
在另一种实施方式中，本发明提供上述组合物用于制造黄斑裂孔或视网膜脱落的治疗剂的用途。
在另一个实施方式中，本发明提供上述组合物用于治疗黄斑裂孔或视网膜脱落的用途。
在另一种实施方式中，本发明提供一种包括向患有黄斑裂孔或视网膜脱落的患者施与上述组合物的黄斑裂孔的治疗方法。
下文示出实施例对本发明的进行进一步详细且具体的说明，但实施例并不旨在限定本发明的范围。
实施例
下文记载了在本实施例中使用的缩写。
氨基酸残基(均为L型)
Arg(R):精氨酸
Asp(D):天冬氨酸
Cys(C):半胱氨酸
Gln(Q):谷氨酰胺
Glu(E):谷氨酸
Gly(G):甘氨酸
His(H):组氨酸
Hyp(O):4-羟脯氨酸
Lys(K):赖氨酸
Pro(P):脯氨酸
Tyr(Y):酪氨酸
Ile(I):异亮氨酸
Leu(L):亮氨酸
Met(M):蛋氨酸
Phe(F):苯丙氨酸
Ser(S):丝氨酸
Val(V):缬氨酸
保护基
Fmoc:9-芴甲氧羰基
tBu:叔丁基
Trt:三苯甲基(trityl)
Pbf:2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
Boc:叔丁氧羰基
树脂CTC:2-氯三苯甲基氯
试剂
BCA:二辛可宁酸
BSA:牛血清白蛋白
CHCA:α-氰基-4-羟基肉桂酸
DCM:二氯甲烷
DIC:N,N′-二异丙基碳二亚胺
DIEA:N,N-二异丙基乙胺
DMAP:N,N-二甲基氨基吡啶
DMF:N,N-二甲基甲酰胺
DMSO:二甲基亚砜
DTNB:5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸
DTT:二硫苏糖醇
EDT:乙二硫醇
EDTA:乙二胺四乙酸
FBS:胎牛血清
HOBt:1-羟基苯并三唑
MeCN:乙腈
MeOH:甲醇
MOPS:3-吗啉丙磺酸
NEM:N-乙基马来酰亚胺
PBS:磷酸盐缓冲液
PMSF:苯甲基磺酰氟
SDS:十二烷基硫酸钠
TBS:Tris缓冲生理盐水
TFA:三氟乙酸
TMSO:四亚甲基亚砜
器械
RP-HPLC:反相高效液相色谱仪
MALDI-TOF-MS:基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
其他
CD:圆偏振二色性
DDR:盘状结构域受体
ECM:细胞外基质
FAK:黏着斑激酶
HDF:人真皮成纤维细胞
HRP:辣根过氧化物酶
HSPG:硫酸乙酰肝素蛋白多糖
PEDF:色素上皮衍生因子
SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
vWF:血管性血友病因子
下文中说明的本发明的实施例的目的仅为示例，不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围仅限定于权利要求书。在不脱离本发明的主旨的条件下，可以变更本发明，例如追加、削除、替换本发明的构成要件。
实施例1
肽膜的制造方法
称量各肽粉末C2s、C3s、C3s-GFOGER，溶解于脱气后的0.05％TFA溶液，制备12.5mg/mL的溶液。
在85℃温度下加热5分钟后，室温下放置一段时间，在4℃温度下静置1日。以5:4:1的比例混合C2s溶液、C3s溶液、C3s-GFOGER溶液，添加并混合DMSO至最终浓度为10％。向用作模板的丙烯酸板上注入混合液，在湿润条件下的密闭容器内室温下静置3日。
在添加水溶性填料的情况下，在85℃温度下加热5分钟后，室温下放置一段时间，在4℃的温度下静置1日。以5:4:1:1:1的比例混合C2s溶液、C3s溶液、C3s-GFOGER溶液、10％(w/v)的葡萄糖溶液和DMSO。向用作模板的丙烯酸板上注入混合液，在湿润条件下的密闭容器内室温下静置3日。
3日后，将整个丙烯酸板浸入纯水中，以使凝胶不塌陷，室温下静置1～2小时。
去除纯水，将整个模板丙烯酸板留置于干燥机内，干燥一晚。
干燥后，用直径为2毫米的环钻将肽膜打孔，并对该肽膜进行试验。
试验例1
添加了水溶性填料的肽膜应用于MIO-M1细胞缺陷部的试验
试验方法：
肽膜应用于MIO-M1细胞缺陷部的试验概要
Figure BDA0003950298350000131
将人缪勒氏细胞MIO-M1株接种于6孔的Transwell板，在CO2培养箱内进行培养。当细胞汇合时，从板中取出插入物，转移至60mm培养皿中。
抽吸去除插入物内的培养液，用直径为1mm的活检用一次性环钻在底面中央打孔，确认其被穿孔。
将插入物转移至含有培养基的6孔的Transwell板，培养基的量设定为使附着有细胞的插入物底面勉强被浸没的程度。留置肽膜以覆盖插入物的中央部穿孔部分。
向插入物底面上一点点地少量添加培养基，转移至CO2培养箱内进行培养。每隔一段时间在显微镜下进行观察，确认MIO-M1细胞在肽膜上粘附、增殖。
结果：
在用肽膜(无GFOGER)覆盖活检用一次性环钻制成的1mm穿孔的组中，因为人缪勒氏细胞MIO-M1株没有粘附于肽膜，所以没有观察到细胞的伸展、增殖。相反，在用肽膜(具有GFOGER)覆盖穿孔的组中，因为人缪勒氏细胞MIO-M1株粘附于肽膜，所以观察到了细胞的伸展、增殖(图1和2)。
试验例2
在白色家兔模型中的有效性、安全性的验证(体内(in vivo))
试验方法：
麻醉家兔(氯胺酮+甲苯噻嗪)，实施植入实验。向右眼滴表面麻醉剂(0.4％Benoxil滴眼液，参天制药株式会社)。保持仰卧位，使用开睑器撑开右眼，用生理盐水40倍稀释后的Isodine液或用生理盐水4倍稀释后的PA·碘滴眼液/洗眼液对眼球进行消毒、洗净，用生理盐水进行冲洗。用保护膜覆盖手术部位。通过玻璃体手术切除玻璃体后，形成约500μm的圆孔。之后，从巩膜将肽膜和添加了水溶性填料的肽膜分别插入眼内，留置于圆孔部。通过将粘弹性物质、氮气置换和全氟碳化物等并用而固定试验物质。植入完成后，在2日后、1周后进行光学相干断层扫描(OCT)，对粘附进行评估。
结果：
在并用粘弹性物质的示例中，观察到了1周后的粘附，没有发现炎症部位等(图3：未添加水溶性填料的肽膜；图4：添加了水溶性填料的肽膜)。
试验例3
在食蟹猴模型中的有效性、安全性的验证(in vivo)
试验方法：
麻醉雄性食蟹猴，实施植入实验。用浸泡了10％Isodine液(Meiji Seika Pharma株式会社)的棉花或灭菌纱布等对眼睑周围的皮肤进行消毒。干燥后，用浸泡了生理盐水(大塚制药工厂)4倍稀释后的PA·碘滴眼液/洗眼液(株式会社日本点眼药研究所)的棉花对眼睑进行消毒。向右眼滴表面麻醉剂(0.4％Benoxil滴眼液，参天制药株式会社)。保持仰卧位，用已灭菌的开睑器撑开右眼，用生理盐水40倍稀释后的Isodine液或用生理盐水4倍稀释后的PA·碘滴眼液/洗眼液对眼球进行消毒、洗净，用生理盐水进行冲洗。用保护膜覆盖手术部位。通过玻璃体手术切除玻璃体，插入玻璃体镊子，部分剥离对应黄斑部位的内界膜(直径约4mm)。在黄斑部形成圆孔(0.5～1个视盘直径)后，将添加了水溶性填料的肽膜插入眼内，留置于圆孔部。根据需要，在眼内进行气体置换，将试验物质压接在视网膜。植入完成后，基于黄斑，记录模型制备和试验物质植入部位。
结果
在术中气体置换或术后气体置换示例中，观察到了8日后的粘附，没有观察到炎症部位等(图5)。
序列表
<110> 科拉-基因制药公司
<120> 包含肽的组合物及其用途
<160> 3
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>MOD_RES
<222>i5jDDi5j
<223>4Hyp
<220>
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<223>4Hyp
<220>
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<223>4Hyp
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<223>4Hyp
<220>
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<223>4Hyp
<220>
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<223>4Hyp
<220>
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<223>4Hyp
<220>
<221>MOD_RES
<222>i32jDDi32j
<223>4Hyp
<400>1
Cys Cys Cys Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly
1 5 10 15
Pro Arg Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Cys Cys Cys
20 25 30 35
<210>2
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>MOD_RES
<222>i4jDDi4j
<223>4Hyp
<220>
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<223>4Hyp
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<220>
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<222>i31jDDi31j
<223>4Hyp
<400>2
Cys Cys Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro
1 5 10 15
Arg Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Cys Cys
20 25 30
<210>3
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221>MOD_RES
<222>i5jDDi5j
<223>4Hyp
<220>
<221>MOD_RES
<222>i8jDDi8j
<223>4Hyp
<220>
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<223>4Hyp
<220>
<221>MOD_RES
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<223>4Hyp
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<220>
<221>MOD_RES
<222>i26jDDi26j
<223>4Hyp
<220>
<221>MOD_RES
<222>i29jDDi29j
<223>4Hyp
<220>
<221>MOD_RES
<222>i32jDDi32j
<223>4Hyp
<400>3
Cys Cys Cys Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Phe Xaa Gly
1 5 10 15
Glu Arg Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Cys Cys Cys
20 25 30 35

Claims (23)

1.一种组合物，含有以式(I)表示的三链肽为聚合单元的两种以上聚合肽
式(I)：
－(P1,P2,P3)－ (I)
(式(I)中，
P1、P2和P3可以相同或不同，各自独立地是下述式(I I)表示的肽链，
P1、P2和P3形成具有三重螺旋结构的三聚体，通过各肽链所包含的半胱氨酸(Cys)残基以二硫键氧化交联而聚合，
式(Ⅱ)：
Rl－(Pro－Hyp－Gly)m－X－(Pro－Hyp－Gly)n－R2 (II)
(式(Ⅱ)中，
R1、R2是各自具有氨基末端和羧基末端，各自独立地由包含至少2个残基的Cys(半胱氨酸)残基的任意2～10个残基的氨基酸残基组成的肽基，
Pro是脯氨酸残基，
Hyp是羟脯氨酸残基，
Gly是甘氨酸残基，
m和n各自独立地为4以上的整数，
X是由-Xaa-Yaa-Gly-重复1至4次表示的肽基，Xaa和Yaa各自独立地表示氨基酸残基)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中P1、P2和P3是相同的肽链。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中X是由选自－Phe－Hyp－Gly－Glu－Arg－Gly－、－Pro－Arg－Gly－Gln－Hyp－Gly－Val－Met－Gly－Phe－Hyp－Gly－和－Pro－Lys－Gly－His－Arg－Gly－Phe－Ser－Gly－Leu－Hyp－Gl y的氨基酸残基组成的肽基。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中X是由选自－Pro－Arg－Gly－或－Phe－Hyp－Gly－Glu－Arg－Gly－的氨基酸残基组成的肽基。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中R1、R2各自独立地是由2个以上Cys(半胱氨酸)残基的氨基酸残基组成的肽基。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中
所述式(Ⅱ)表示的肽链选自
Rl－(Pro－Hyp－Gly)m－Pro－Arg－Gly－(Pro－Hyp－Gly)n－R2 (i)
和
Rl－(Pro－Hyp－Gly)m－Phe－Hyp－Gly－Glu－Arg－Gly－(Pro－Hyp－Gly)n－R2(ⅱ)。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中
式(Ⅱ)表示的肽链以下述序列号表示
H-Cys-Cys-Cys-(Pro-Hyp-Gly)5-Pro-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-Cys-Cys-Cys-OH 序列号1
H-Cys-Cys-(Pro-Hyp-Gly)5-Pro-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-Cys-Cys-OH 序列号2
H-Cys-Cys-Cys-(Pro-Hyp-Gly)4-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-Cys-Cys-Cys-OH 序列号3。
8.根据权利要求1～7任一项所述的组合物，其特征在于进一步包含水溶性填料。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中水溶性填料是糖。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中糖是葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇中的1种以上。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中糖是葡萄糖。
12.根据权利要求8～11任一项所述的组合物，其中水溶性填料以相对于组合物总重量的10～50％的量存在。
13.根据权利要求1～12任一项所述的组合物，其中聚合肽以相对于组合物总重量的50～90％的量存在。
14.根据权利要求1～13任一项所述的组合物，其为凝胶的形态。
15.根据权利要求1～13任一项所述的组合物，其为透明的形态。
16.一种医药品，其包括权利要求1～15任一项所述的组合物。
17.一种器械，其包括权利要求1～15任一项所述的组合物。
18.一种眼部疾患的治疗剂，其包括权利要求1～15任一项所述的组合物。
19.根据权利要求18所述的眼部疾患的治疗剂，其中眼部疾患是黄斑裂孔或视网膜脱离。
20.一种眼部疾患的治疗方法，其中包括向对象施与治疗有效量的权利要求1～15任一项所述的组合物的步骤。
21.根据权利要求20所述的治疗方法，其中眼部疾患是黄斑裂孔或视网膜脱离。
22.一种权利要求8～15任一项所述的组合物的制造方法，其中包括将式(Ⅰ)表示的聚合肽和水溶性填料制成均匀物理性混合物。
23.权利要求1～15任一项所述的组合物在制造用于治疗眼部疾患的医药品中的用途。
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