JP6455862B2 - コラーゲン様構造を有する重合ペプチド及びゲル - Google Patents
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Description
三重らせん構造を有する3本鎖ペプチドを繰り返し単位として有し、酸化架橋で重合され、
前記3本鎖ペプチドを構成する各ペプチド鎖は、同一であっても又は相互に異なっていてもよく、
各ペプチド鎖は、-(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位として少なくとも5回の繰り返し構造を有する三重らせん形成用ペプチド基と、アミノ末端及びカルボキシ末端の各々から10残基以内に少なくとも2残基のシステイン(Cys)残基を含む架橋形成用ペプチド基とを有する重合ペプチドを提供する。
[Xaa及びYaaは、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リシン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa位及びYaa位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよい。]
前記ペプチド鎖が、
(i) 少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と少なくとも1つの架橋形成用ペプチド基からなるペプチド鎖、
(ii) 少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と少なくとも1つの架橋形成用ペプチド基、及び生理活性を有するモチーフを有する少なくとも1つのペプチド基を含むペプチド鎖、及び、
(iii) 少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と架橋形成用ペプチド基、及び、アミノ酸残基の側鎖にリンカーを介して生理活性を有するモチーフを結合させた少なくとも1つのペプチド基を含むペプチド鎖
からなる群から選択される少なくとも1つであるペプチド鎖である場合がある。
下記式(I)で表される3本のペプチド鎖から形成される三量体ペプチドの構造単位を有し、酸化架橋されてなる重合ペプチドの場合がある。
A1, A2及び A3は、同一又は相違してもよく、それぞれ独立して下記式(II)で表されるペプチド鎖であり、
A1, A2及び A3は、三重らせん構造を有する三量体を形成し、各々のペプチド鎖に含まれるシステイン(Cys)残基によってジスルフィド結合で架橋されていてもよく、
該三量体は、前記Cysのジスルフィド結合で酸化架橋により重合される。
R1及びR4は、各々アミノ末端及びカルボキシ末端を有し、相互に独立して少なくとも2残基のCys残基を含む任意の2〜10残基のアミノ酸残基からなるペプチド基であり、
Zは、
(i) -(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位とする繰り返し構造のみからなるペプチド基、
(ii) -(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位として繰り返す構造及び生理活性を有するモチーフを有するペプチド基、又は、
(iii) -(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位として繰り返す構造を有し、かつ、該ペプチド鎖に含まれる少なくとも1残基のアミノ酸残基の側鎖にリンカーを介して生理活性を有するモチーフ配列を結合させてなるペプチド基、
から選択される少なくとも1つであり、
R2及びR3は独立して-(Xaa-Yaa-Gly)-を単位として連続して繰り返す構造を含むペプチド基であり、
-(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位とする繰り返し構造における繰り返し回数は、R2、Z及びR3の各々は0回以上であり、R2、Z及びR3で合計して3回以上であり、
mは1以上の整数である。)]
前記ペプチド鎖は、下記式(III)で表される場合がある。
R5及びR6は、各々アミノ末端及びカルボキシ末端であり、相互に独立して少なくとも2残基のCys残基を含む任意の2〜10残基のアミノ酸残基からなるペプチド基であり、
p、q及びrは、いずれも0以上の整数であり、p、q及びrの合計は3以上であり、sは1以上の整数である。]
前記生理活性は生体高分子に対する特異的な結合活性である場合がある。
前記生体高分子に対する特異的な結合活性を有するリガンドの結合モチーフは、インテグリン、ジスコイジンドメイン受容体(DDR)若しくはヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)から選択されるコラーゲン受容体に対する結合モチーフ、又はフィブロネクチン由来のインテグリンαvβ3に対する結合モチーフの少なくとも1つから選択される重合ペプチドの場合がある。
前記インテグリンに対する結合モチーフは-Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg-、ジスコイジンドメイン受容体に対する結合モチーフは-Gly-Val-Met-Gly-Phe-Hyp-、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合モチーフアミノ酸配列は-Lys-Gly-His-Arg-Gly-Phe-であり、フィブロネクチン由来のインテグリンαvβ3に対する結合モチーフは-Arg-Gly-Asp-である場合がある。
前記ペプチド鎖は、配列番号1〜7、10〜18、23及び24から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドから選択される場合がある。
前記ペプチド鎖は、配列番号1〜7、10〜18、23及び24から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列に対して1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる場合がある。
前記ペプチド鎖は、配列番号1、2、5〜7、10〜18及び23から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドから選択される場合がある。
前記ペプチド鎖は、配列番号1、2、5〜7、10〜18及び23から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列に対して1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる場合がある。
前記生理活性を有するモチーフを有するペプチド鎖は、フィブロネクチン由来のインテグリン結合モチーフがBis(NHS)PEG5(bis(succinimidyl)penta(ethylene glycol))をリンカーとして、前記ペプチド基のLys残基の側鎖のアミノ基に結合されてなる場合がある。
前記生理活性を有するモチーフの2種類以上を組み合わせて製造される共重合ペプチドの場合がある。
-(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位として少なくとも5回の繰り返し構造を有し、アミノ末端及びカルボキシ末端の各々から10残基以内に少なくとも2残基のシステイン(Cys)残基を含む相互に異なっていてもよいペプチド鎖を変性温度以上の温度で溶媒に溶解する工程、
冷却することにより自己集合により前記ペプチドの3本からなる三重らせん構造を有する3本鎖ペプチドを形成する工程、
該3本鎖ペプチドを構造単位として、酸化架橋で重合させる工程、
を含む製造方法を提供する。
該製造方法において、Xaa及びYaaは、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リシン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa位及びYaa位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよい。
ゲルが、ヒドロゲルであり、細胞を細胞選択的に培養するための基材として使用される場合がある。
再生医療材料は、創傷治癒促進用組成物である場合がある。
本発明に係る3本鎖ペプチドは、一般に、コラーゲン様ペプチドともいわれる。本明細書において、「コラーゲン様ペプチド」とは、非天然のペプチド又はポリペプチドであって、天然のコラーゲンと同様に、-(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位とする繰り返し構造を有するペプチド鎖の3本が、溶媒中で自己集合して、らせん構造を形成することにより、3本鎖ペプチドを形成させたもの、又は、該らせん構造を有する3本鎖ペプチドを、さらに、架橋させたペプチド又はポリペプチドを言う。ただし、前記Xaa及びYaaは、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リシン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa位及びYaa位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよい。
三重らせん構造を有する3本鎖ペプチドを繰り返し単位として有し、酸化架橋で重合され、
前記3本鎖ペプチドを構成する各ペプチド鎖は、同一であっても又は相互に異なっていてもよく、-(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位として少なくとも5回の繰り返し構造を有し、アミノ末端及びカルボキシ末端の各々から10残基以内に少なくとも2残基のシステイン(Cys)残基を含むことを特徴とする、重合ペプチド。
[Xaa及びYaaは、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リシン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa位及びYaa位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよい。]
前記ペプチド鎖に生理活性を有するモチーフを組み込む、及び/又は、ペプチド鎖の側鎖に生理活性を有するモチーフを有するペプチドを結合させることにより、該生理活性を有する重合ペプチド、該重合ペプチドを含有するゲル及び該重合ペプチドを含有する薄膜を製造することができる。コラーゲン様ペプチドに組み込むモチーフを選択することにより、天然のコラーゲンと相違し、所望の生理活性に選択的な生理活性を有する重合ペプチドを付与できる。また、これらの生理活性を有するペプチドを組み込まないことにより、生理活性を付与しないコラーゲン様ペプチドの重合体を製造できる。
前記「1.コラーゲン様ペプチドの重合ペプチド」に記載の重合ペプチドであって、
前記ペプチド鎖は、
(i) 少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と少なくとも1つの架橋形成用ペプチド基からなるペプチド鎖、
(ii) 少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と少なくとも1つの架橋形成用ペプチド基、及び生理活性を有するモチーフを有する少なくとも1つのペプチド基を含むペプチド鎖、及び、
(iii) 少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と架橋形成用ペプチド基、及び、アミノ酸残基の側鎖にリンカーを介して生理活性を有するモチーフを結合させた少なくとも1つのペプチド基を含むペプチド鎖
からなる群から選択される少なくとも1つであることを特徴とする、重合ペプチド。
前記重合ペプチドであって、
下記式(I)で表される3本のペプチド鎖から形成される三量体ペプチドの構造単位を有し、酸化架橋されてなることを特徴とする、重合ペプチド。
A1, A2及び A3は、同一又は相違してもよく、それぞれ独立して下記式(II)で表されるペプチド鎖であり、
A1, A2及び A3は、三重らせん構造を有する三量体を形成し、各々のペプチド鎖に含まれるシステイン(Cys)残基によってジスルフィド結合で架橋されていてもよく、
該三量体は、前記Cysのジスルフィド結合で酸化架橋により重合される。
R1及びR4は、各々アミノ末端及びカルボキシ末端であり、相互に独立して少なくとも2残基のCys残基を含む任意の2〜10残基のアミノ酸残基からなるペプチド基であり、
Zは、
(i) -(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位とする繰り返し構造のみからなるペプチド基、
(ii) -(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位として繰り返す構造及び生理活性を有するモチーフを有するペプチド基、及び、
(iii) -(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位として繰り返す構造を有し、かつ、該ペプチド鎖に含まれる少なくとも1残基のアミノ酸残基の側鎖にリンカーを介して生理活性を有するモチーフ配列を結合させてなるペプチド基、
からなる群から選択される少なくとも1つであり、
R2及びR3は独立して-(Xaa-Yaa-Gly)-を単位として連続して繰り返す構造を含むペプチド基であり、
-(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位とする繰り返し構造における繰り返し回数は、R2、Z及びR3の各々は0回以上であり、R2、Z及びR3で合計して3回以上であり、
mは1以上の整数である。)]
本発明の態様の一つは、前記コラーゲン様ペプチドの重合体であって、特定の生理活性を付与しない重合ペプチドである。該特定の生理活性を付与しない重合ペプチドは、-(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位とする繰り返し配列と、複数のCys残基を含むペプチド基からなるペプチド鎖によって構成され、該ペプチド鎖の3本が三重らせん構造を有するコラーゲン様ペプチドを形成し、該コラーゲン様ペプチドがジスルフィド結合で架橋重合された重合ペプチドであり、より具体的には以下に記載の構成を有する。
前記ペプチド鎖は、
少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と少なくとも1つの架橋形成用ペプチド基からなるペプチド鎖であることを特徴とする。
生理活性を有するモチーフを、前記ペプチド鎖に組み込む、又は前記一本鎖の側鎖にリンカーを介して結合させることにより、所望の生理活性有する、活性強度を調節した、及び/又は、複数の生理活性を組み合わせたコラーゲン様ペプチドの重合ペプチドを製造できる。
生理活性を有するモチーフを組み込んだコラーゲン様ペプチドの重合体は、以下の構成を有する。
前記「1.コラーゲン様ペプチドの重合体」に記載の構成を有する重合ペプチドであって、
前記ペプチド鎖は、
少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と少なくとも1つの架橋形成用ペプチド基、及び生理活性を有するモチーフを有する少なくとも1つのペプチド基からなるペプチド鎖であることを特徴とする。
前記ペプチド鎖は、下記式(III)で表される場合がある。
R5及びR6は、各々アミノ末端及びカルボキシ末端であり、相互に独立して少なくとも2残基のCys残基を含む任意の2〜10残基のアミノ酸残基からなるペプチド基であり、
p、q及びrは、いずれも0以上の整数であり、p、q及びrの合計は3以上であり、sは1以上の整数である。]
ペプチド鎖の側鎖にリンカーを介して生理活性を有するモチーフを結合させたコラーゲン様ペプチドの重合体は、以下の構成を有する。
前記「1.コラーゲン様ペプチドの重合体」に記載の構成を有する重合ペプチドであって、
前記ペプチド鎖は、
-(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位として繰り返す構造を有し、かつ、該ペプチド鎖に含まれる少なくとも1残基のアミノ酸残基の側鎖にリンカーを介して生理活性を有するモチーフを結合させてなるペプチド基である場合がある。
前記ペプチド鎖は、下記式(III)で表される場合がある。
R5及びR6は、各々アミノ末端及びカルボキシ末端であり、相互に独立して少なくとも2残基のCys残基を含む任意の2〜10残基のアミノ酸残基からなるペプチド基であり、
p、q及びrは、いずれも0以上の整数であり、p、q及びrの合計は3以上であり、sは1以上の整数である。]
前記生理活性は生体高分子に対する特異的な結合活性である場合がある。
本発明の態様として、前記の生理活性モチーフを組み込んだペプチド鎖及び/又は前記の生理活性モチーフを結合させたペプチド鎖を組み合わせて使用することにより、それぞれの生理活性を選択的に組み合わせた活性を有し、各活性の活性強度を所望の割合に調整した重合ペプチドが挙げられる。
前記重合ペプチドは、水溶媒中で製造される場合に、本発明の重合ペプチドと水とのヒドロゲルとして製造され、即ち、本発明の重合ペプチドは、ゲル化剤としての用途を有する。
本発明の重合ペプチドは、前記に説明のとおり、所望の生理活性を有するモチーフを組み込む又はリンカーを介して結合させることにより、選択的な生理活性を有するゲル、ヒドロゲル又は重合ペプチド薄膜を製造することができる。あるいは、生理活性を有するモチーフを組み込まない又は結合させないことにより、特段の生理活性を有さない、換言すれば、生体で刺激性が小さく、安全性の高いゲル、ヒドロゲル又は重合ペプチド薄膜を製造することができる。
アミノ酸残基(全てL体)
Arg(R):アルギニン
Asp(D):アルパラギン酸
Cys(C):システイン
Gln(Q):グルタミン
Glu(E):グルタミン酸
Gly(G):グリシン
His(H):ヒスチジン
Hyp(O):4-ヒドロキシプロリン
Lys(K):リジン
Pro(P):プロリン
Tyr(Y):チロシン
Ile(I):イソロイシン
Leu(L):ロイシン
Met(M):メチオニン
Phe(F):フェニルアラニン
Ser(S):セリン
Val(V):バリン
Fmoc: 9-フルオレニルメトキシカルボニル
tBu: tert-ブチル
Trt:トリフェニルメチル(トリチル)
Pbf: 2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
Boc: tert-ブトキシカルボニル
CTC:塩化2-クロロトリチル
BCA:ビシンコニン酸
BSA:ウシ血清アルブミン
CHCA:α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸
DCM:ジクロロメタン
DIC: N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA: N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMAP: N,N-ジメチルアミノピリジン
DMF: N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO:ジメチルスルホキシド
DTNB: 5,5'-ジチオビス-2-ニトロ安息香酸
DTT:ジチオトレイトール
EDT:エタンジチオール
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
FBS:ウシ胎児血清
HOBt: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
MeCN:アセトニトリル
MeOH:メタノール
MOPS: 3-モルホリノプロパンスルホン酸
NEM: N-エチルマレイミド
PBS:リン酸緩衝液
PMSF:フェニルメチルスルホニルフルオリド
SDS:ドデシル硫酸ナトリウム
TBS:トリス緩衝生理食塩水
TFA:トリフルオロ酢酸
TMSO:テトラメチレンスルホキシド
RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
MALDI-TOF-MS:マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計
CD:円偏光二色性
DDR:ジスコイジンドメイン受容体
ECM:細胞外マトリックス
FAK:接着斑キナーゼ (focal adhesion kinase)
HDF:ヒト皮膚線維芽細胞
HRP:ホースラディッシュペルオキシダーゼ
HSPG:ヘパラン硫酸プロテオグリカン
PEDF:色素上皮由来因子
SDS-PAGE:ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
vWF:フォン・ビルブランド因子
材料及び方法
ペプチド合成
本実施例で下記表1に記載の配列番号1〜22のペプチドを固相合成し、使用する。
固相合成にはPD-10 empty column (GE Healthcare、米国) 又はLibra Tube (株式会社ハイペップ研究所、京都)を用いた。ペプチドの分析にはHPLC C20A シリーズ(株式会社島津製作所、京都)を用い、カラムはCOSMOSIL 5C18 AR-II (ナカライテスク株式会社、京都)を用いた。ペプチドの精製にはLC 2000 Plus シリーズ(日本分光株式会社、東京)を用い、カラムはCOSMOSIL 5C18 AR-II (ナカライテスク株式会社)又はCadenza CD-C18 (インタクト株式会社、京都)を用いた。ペプチドの質量分析にはAutoflex-III (Bruker Corporation、ドイツ)を用いた。ペプチドのCDスペクトル測定には円二色性分散計J-820 (日本分光株式会社)を用いた。Fmoc基のUV吸光度測定には紫外可視分光光度計V-630 (日本分光株式会社)を用いた。ペプチドのリフォールディングの温度制御にはTaKaRa Thermal Cycler (タカラバイオ株式会社、滋賀)を用いた。ゲル形成の判定にはステンレス球(直径1.5 mm、有限会社舟辺精工、兵庫)を用いた。細胞培養皿にはNunc Cell-Culture/Petri Dishes (9 cm ディッシュ)、Nunc MicroWell 96-Well Microplates (96 ウェルプレート)、Nunc Cell-Culture Treated Multidishes (6 ウェルプレート) (Thermo Fisher Scientific, Inc.、米国)を用いた。細胞の観察にはレーザー走査型共焦点顕微鏡FV1000 (オリンパス株式会社、東京)を用いた。ウエスタンブロッティングの可視化にはLAS-3000 (富士フィルム株式会社、東京)を用いた。
ペプチドは、当業者に慣用のFmoc合成法(特開2005-263784号公報)により、合成した。
ペプチドの精製にはRP-HPLC (LC 2000 Plusシリーズ、日本分光株式会社)を用いて、0.05% (v/v) TFA-H2Oと0.05% (v/v) TFA-MeCNの直線濃度勾配により溶出させた。カラム径を20 mm、カラム温度を60℃、流速を5 ml/分、検出波長を220 nmとした。カラムはCOSMOSIL 5C18 AR-II (ナカライテスク株式会社)又はCadenza CD-C18 (インタクト株式会社)を用いた。
合成したペプチドを精製した後、その純度を確かめるためにRP-HPLC により分析した。ペプチドは移動相に0.05% TFA/H2O と0.05% TFA/MeCN を用いた直線濃度勾配により溶出させ、Soluble KGHRGF の分析時の濃度勾配は0.05% TFA/MeCN 0〜30%/30分、30〜90%/5分とし、その他のペプチドの分析時の濃度勾配は0.05% TFA/MeCN 10〜40%/30min、40〜90%/5分とした。また、カラム温度は60℃、測定波長は220nm とした。
合成し、精製した上記の各ペプチドの質量分析をMALDI-TOF MSにより行った。各ペプチドの質量の計算値と実測値を表3に示す。測定サンプルを調製するときのマトリックスにはCHCAを用いた。この結果から、すべてのペプチドは目的としたペプチドであることが確認された。
ペプチドのコンフォメーションの確認による三重らせん構造の確認
ペプチドの構造をCDスペクトル(円二色性分散計J-820、日本分光株式会社)により確認した。ペプチド粉末を、脱気した0.05% TFA/H2Oに溶解し、1 mg/mlの溶液を調製した。80℃で5分間加熱後、4℃にて一晩静置してリフォールディングさせた溶液を測定サンプルとして調製した。CDスペクトルは、温度4、37、80℃、セル長0.05 cm、感度standard (100 mdeg)、測定波長250〜190 nm、データ取り込み間隔0.2 nm、走査速度50 nm/分、レスポンス0.5秒、バンド幅1 nm、積算回数4回の条件で測定した。得られたシグナル(θobs)を残基平均モル楕円率(θmrw)として示した。θmrwを以下の式により算出した。
合成したそれぞれのペプチドについて、4℃、37℃及び80℃におけるCDスペクトルを測定した結果を図3A〜図3Gに示す。また、YCC2及びYCC2-Scrについて、225 nmのCDスペクトル強度(θ225)の温度変化測定を行った結果を図4A及び図4Bに示す。これらの測定結果から、YCC2-Scrを除くすべてのペプチドが4℃及び37℃においてのみ225 nm付近で正のコットン効果を示したため、37℃以下で三重らせん構造を形成しており、80℃では変性状態であることが確認された。C2のCDスペクトル測定は未実施であるが、同様の三重らせん骨格を有するすべてのペプチドにおいて三重らせん形成が見られたことから、C2も同様に三重らせんを形成していると考えられた。一方、YCC2-Scrは測定したすべての温度において225 nm付近に正のコットン効果が見られた。225 nmにおけるθ225の温度変化測定の結果より、CC2では75℃付近で熱変性が起こっている様子が観察された一方、YCC2-Scrでは1次関数的な減衰が見られた。これらのことから、YCC2-Scrを除くコラーゲン様ペプチドは末端配列及び内部配列によらず三重らせんを形成しており、YCC2-Scrは三重らせん構造は形成しないものの、ポリプロリンII型の立体構造をとっていると考えられた。
上記三重らせん構造を有するペプチドを、酸化剤であるDMSOで酸化架橋させることにより、コラーゲン様ペプチドを重合させた重合ペプチドからなるゲルを作製した。残存チオール基を測定することにより、酸化的架橋による重合反応の進行を確認した。
脱気した水を用いて、1.11% (w/v)濃度のペプチド溶液を調製し、PCRチューブに入れた。これを80℃で5分間加熱後、4℃で一晩静置した。この溶液にDMSOを加えて終濃度10% DMSO、ペプチド1% (w/v)のペプチド溶液を調製した。表面を覆うようにミネラルオイルを充填した。ペプチド溶液から測定毎にミネラルオイルを取り除いて酸化モニター用のペプチド溶液を調製した。エルマン試薬は、DTNBを50 mM リン酸緩衝液(pH8.4)に9 mg/mlとなるように調製した。最終濃度が、ペプチド0.167 mg/ml、33 mM リン酸緩衝液(pH8.4)、Ellman試薬1.5 mg/mlの条件で5分間静置した後に吸光度を測定した。DMSOを加えた時間を始点(0時間)として時間経過に伴う吸光度の変化を記録した。Ellman試薬はペプチドのもつチオール基(以下「SH基」と記載)の量に依存して5-メルカプト-2-ニトロ安息香酸(λmax = 412 nm、ε = 1.55×104)を生成するため、412 nmにおける吸光度を測定した。測定後、997 nmと900 nmにおける吸光度を測定して光路長補正を行った。
脱気した水を用いて、1.11% (w/v)又は1.66% (w/v)濃度のペプチド溶液を調製し、PCRチューブに入れた。これをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)機(TaKaRa PCR Thermal Cycler、タカラバイオ株式会社)にて80℃で5分間加熱後、4℃で一晩静置した。この溶液にDMSO及び水を加えて10% DMSO、0.1〜1.5% (w/v)濃度のペプチド溶液を調製した。液面を覆うようにミネラルオイルを充填し、室温で一定時間静置してゲル化した。その後、ステンレス球をゲルに保持できるかどうかでゲル形成を判定した。
各ペプチドの1% (w/v)濃度でのゲル形成能を評価した結果を図6に示す。白色矢印はステンレス球の位置を示す。この結果から、N末端及びC末端の両側近傍にCys残基を2つ以上もつゲルではゲル形成が観察された(CC2と、CC1及びC2とを参照)。また、ランダムコイル構造を有するペプチドではゲルが形成されなかった(YCC2とYCC2-Scrとを参照)。このことから、ゲル形成に三重らせん構造が重要であることが示された。また、1% (w/v)でのゲル形成に要した時間を表4に示す。
1% (w/v)濃度においてゲル化したペプチド(CCCC2、CCC2、CC2及びYCC2)を用いて、室温、3日間の酸化条件下でのゲル化必要濃度を評価した結果を表5に示す。
ヒドロゲルの還元処理に対する安定性の測定
Cys残基を NC 両末端近傍に2個以上持つペプチドをDMSOで酸化することによってヒドロゲルが形成されることが示された。そこで、還元処理によってジスルフィド架橋を切断することでゲルは崩壊するのかを検証した。作製したヒドロゲル(30 μl)に100 μlの還元溶液(100 mM DTT、50 mM リン酸緩衝液(pH8.4))あるいは水を加えた。最終濃度がペプチド濃度2.3 mg/ml、2.3% DMSO 23 mM DTT、12 mMリン酸緩衝液(pH8.4)あるいは 2.3 mg/ml、2.3% DMSOとなった。その後、それぞれを約90 回/分の頻度で100μl/回の容量を黄色チップ(〜200μl)を用いてピペッティングした。図7にその結果を示す。
作製したヒドロゲルにステンレス球を載せた後、恒温装置に移し、35℃〜95℃までの間のさまざまな温度で10分間静置した。ステンレス球の沈降によってゲルが崩壊したかを判定した。
1% (w/v)のペプチドを用いて作製したヒドロゲルの熱安定性を測定した結果を図8に示す。この結果から、CCCC2、CCC2又はYCC2から形成されたヒドロゲルは95℃以下ではステンレス球の沈降はみられなかった。CC2から形成されたヒドロゲルは85〜90℃でステンレス球が沈降を開始し、95℃で完全に沈降した。したがって、ジスルフィド結合の数に比例して、三重らせん構造が安定化し、ペプチドの変性温度が高くなったと考えられる。
重合ペプチド薄膜の作製にはYCC2を用いた。脱気した水を用いて、1.11% (w/v)濃度のペプチド溶液を調製し、PCRチューブに入れた。これを80℃で5分間加熱後、4℃で一晩静置した。この溶液にDMSOを加えて終濃度10% DMSO、1.0% (w/v)ペプチド溶液を調製した。このペプチド溶液を非吸水基盤(パラフィルム、シリコン加工したホールガラス、テフロン(登録商標)板)上に移した。この時、支持体としてPVDF膜又はナイロンメッシュを非吸水基盤上に設置した。湿潤条件(10% DMSO)の室温で3日間静置することでゲル化させた。その後、乾燥条件に切り換えて、室温で3日間乾燥させた。非吸水基盤と支持体との組み合わせは、テフロン(登録商標)板とナイロンメッシュとの組み合わせが最も優れていた。
YCC2ペプチドから形成された重合ペプチド薄膜を作製したコラーゲン様重合ペプチド薄膜は、非常に透明度が高かった(図9)。
上記方法で作製した重合ペプチド薄膜に非吸水フィルム上で水を添加した。数分間水和させた後、重合ペプチド薄膜が吸収しなかった水を回収除去した。これにより、再水和した重合ペプチドヒドロゲルを得た。
再水和させた重合ペプチドのヒドロゲルを得た結果を図10に示す。再水和で得たヒドロゲルは、乾燥前のヒドロゲルより保水量が少ないため、ペプチド密度が高くなり、強度の高いヒドロゲルを作製することができた。
CCC2-GFOGER(short)(配列番号11)で製造した重合ペプチドを使用して、積層した重合ペプチド薄膜を以下の方法で製造した。
1) 前記実施例4と同様に、コラーゲン様ペプチドを脱気したH2Oに溶解し (22.2 mg/ml)、加熱後、徐冷することにより三重らせんを形成した。
2) DMSOを添加 (10% DMSO、20 mg/mlペプチド)し、支持体 (直径1 cm円)上、10% DMSOを充填した密閉容器中で約4日静置することで酸化し、ヒドロゲルを形成させた。
3) 大気中で乾燥し脱水した。
4) 2)と同様に調製した10% DMSO、20 mg/mlペプチド溶液を積層し、10% DMSOを充填した密閉容器中で約4日酸化した。
5) 大気中で乾燥し脱水した。
この乾燥させた重合ペプチド積層薄膜を再水和し、支持体から切り離すことにより、又は、支持体から切り離した後に再水和させることにより、強度がより向上した重合ペプチド薄膜を製造した。
生理活性を有するモチーフを組み込んだペプチド鎖のコラーゲン様ペプチドの重合ペプチドの製造
YCC2-GFOGER(配列番号12)、YCC2-GVMGFO(配列番号13)及びYCC2-KGHRGF(配列番号14)、並びに、これらの各ペプチドの対照として、各ペプチドのN末端及びC末端の両端近傍にCys残基を含まないSoluble GFOGER(配列番号19)、Soluble GVMGFO(配列番号20)及びSoluble KGHRGF(配列番号21)を、実施例2と同様の方法で合成し、その各ペプチド溶解液のCDスペクトルを測定することにより、三重らせん構造の構築を確認した。
細胞培養
D-MEM高グルコース、D-MEM低グルコース及び0.5%トリプシン/EDTAは和光純薬工業株式会社(大阪)から、FBS、ペニシリン・ストレプトマイシン(100 x)はInvitrogen(Thermo Fisher Scientific corporation)から購入した。ヒト乳腺癌(MDA-MB-231)はATCCから、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)はCell Applications から購入した。MDA-MB-231は、DMEM高グルコース(10% FBS、100 Units/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン)で培養し、HDFはDMEM低グルコース(10% FBS、100 Units/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン)で培養し、維持した。細胞接着アッセイ及びウエスタンブロッティングに用いる場合は、細胞を0.05%トリプシン/EDTAで処理し、細胞を15 ml チューブに回収して1200 rpmで4分間遠心した。上清を除去した後、細胞を培養培地で懸濁し、37℃で20〜30分間インキュベートすることで回復した。この細胞懸濁液を細胞接着アッセイ及びウエスタンブロッティングに用いた。
I型コラーゲン(株式会社高研、東京)及びBSA (Jackson Immuno Research Laboratories Inc.、米国)を、30 μg/mlの水溶液として50 μl/wellを96ウェルプレート(Nunc MicroWell 96-Well Microplates)に添加して2晩乾燥させた。Cys残基を含まないコラーゲン様ペプチドは1〜3 mg/mlの水溶液とし、95℃で5分間加熱した後、4℃で1晩保存することで三重らせんを形成させた。これを30 μg/mlに希釈し、50 μl/wellを96ウェルプレートに添加して2晩乾燥させた。Cys残基を含むコラーゲン様ペプチドは脱気した0.05% (v/v) TFA水溶液に溶解し、300 μg/mlとして80℃で5分間加熱した後、1℃/分で4℃まで徐冷し、4℃で1晩保存することで三重らせんを形成させた。これを30 mM MOPS緩衝液(pH7.8) (Sigma-Aldrich:シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社、東京)、15%メタノールとなるように30 μg/mlに希釈し、50 μl/wellを96ウェルプレートに添加して2晩乾燥させた。異なるリガンドを組み込んだ重合ペプチドをコートするときは、各ペプチドを脱気した0.05% (v/v) TFA水溶液に溶解して(1 mg/ml)、80℃で5分間加熱した後、1℃/分で4℃まで徐冷し、4℃で1晩保存することで三重らせんを形成させた。これらのペプチドを様々な割合で混合するとともに、20% (v/v) DMSO、総ペプチド濃度が0.3 mg/mlとなるように希釈し、ペプチド溶液上にミネラルオイルを重層し、Ellman試験によってチオールが検出されなくなるまで室温で酸化させた。このペプチド溶液をMilliQ水で30 μg/mlに希釈し、50 μl/wellを96ウェルプレートに添加して2晩風乾した。
ペプチド又はタンパク質をコートした96ウェルプレートを60〜70℃で熱変性させた5 mg/ml BSAでブロッキングし、37℃で1〜2時間インキュベートした。BSA溶液を除いてPBS (10 mM リン酸緩衝液 (pH 7.4), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl) (Sigma Aldrich)で洗浄し、MDA-MB-231細胞懸濁液(40-60 x 103 cells/well)又はHDF細胞懸濁液(4-10 x 103 cells/well)を添加して37℃で30〜180分間インキュベートした。その後、培地とともに浮遊細胞を除去してPBSで洗浄の後、4% (v/v) p-ホルムアルデヒド/リン酸バッファー(pH7.4) (和光純薬工業株式会社)で接着細胞を固定し、2%クリスタルバイオレット/MeOH (和光純薬工業株式会社)で染色した。染色細胞はレーザー走査型共焦点顕微鏡FV1000 (オリンパス株式会社)を用いて観察した。
ペプチド又はタンパク質をコートした6ウェルプレートを60〜70℃で熱変性したBSA(5 mg/ml)でブロッキングし、37℃で1〜2時間インキュベートした。BSA溶液を除去し、PBSで洗浄の後、MDA-MB-231細胞懸濁液(50 x 103 cells/well)を添加し、37℃で90分間インキュベートした。培地を除去した細胞にSDS サンプルバッファー(50 mM Tris・HCl (pH 6.7), 2% SDS, 10%グリセロール、 1 μg/ml ペプスタチンA、 1 μg/ml ロイペプチン、 1 mM PMSF、2 mM NEM、1 mM Na3VO4、10 mM NaF)を添加し、細胞を溶解した。これを1.5 mlチューブに回収し、95℃で5分間加熱したものをSDS-PAGEサンプルとした。調製したSDS-PAGEサンプルはBCA法により、タンパク質を定量した。10% (w/v)アクリルアミドゲルに各サンプルを30 μg/well添加し、SDS-PAGEにより分離した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜(GE Healthcare)に転写した。その後、スキムミルク(和光純薬工業株式会社)と、TBS (50 mM Tris・HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl)とを用いて調製した5% (w/v)ブロッキング溶液に浸漬して1晩ブロッキングした。1次抗体希釈液(1 : 1000)(抗FAKマウス抗体(Merck Millipore Corporation、米国)、抗pFAK (pTyr397)ウサギ抗体(Invitrogen)、又は抗β-アクチンマウス抗体(Sigma Aldrich)を添加して2〜3時間静置した。1次抗体を除去して、ニトロセルロース膜をTBST(0.1% Tween-20)に浸して10〜20分間振盪した。これを3回繰り返した後、2次抗体希釈液(1 : 1000)(抗マウス抗体ヤギ抗体-HRP複合体(プロメガ株式会社、東京)、抗ウサギ抗体ヤギ抗体-HRP複合体(Santa Cruz Biotechnologies Inc.、米国))を加えて、30分間静置した。2次抗体を除去し、ニトロセルロース膜をTBS-Tに浸して10〜20分間振盪した。これを3回繰り返した後、Western blotting KitPlus (Pierce; サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を用いて発色し、LAS-3000 (富士フィルム株式会社)により可視化して定量した。
BSA、I型コラーゲン、YCC2重合ペプチド(Pol-GPOGPR)、YCC2-GFOGER重合ペプチド(Pol-GFOGER)及びリガンドを含み、重合ペプチドを形成しないペプチド(Soluble GFOGER)を96ウェルプレートにコートし、MDA-MB-231を培養したときの細胞接着を観察し、比較した(図12A及び図12B)。YCC2及びYCC2-GFOGERは還元状態で三重らせんを形成させた後、塩基性バッファーで希釈することで酸化条件とした。これによって96ウェルプレート上でペプチドを酸化し、ジスルフィド架橋させた。
BSA、I型コラーゲン、YCC2-GFOGER重合ペプチド(Pol-GFOGER)及びYCC2重合ペプチド(Pol-GPOGPR)を96ウェルプレートにコートし、MDA-MB-231を90分間培養した。このとき、YCC2及びYCC2-GFOGERは還元状態で三重らせんを形成させた後、塩基性バッファーで希釈することで酸化条件とした。これによって96ウェルプレート上でペプチドを酸化し、ジスルフィド架橋することでコートした。培養した細胞のFAK及びpFAK (pTyr397)のウエスタンブロッティングの結果を図13Aに示す。また、FAKのバンド強度に対するpFAK (pTyr397)のバンド強度を画像解析ソフトウェアImage Jにより解析し、数値化した結果を図13Bに示す。Pol-GPOGPR上で培養した細胞ではFAKのリン酸化が見られなかったが、Pol-GFOGER上で培養した細胞ではI型コラーゲン上で培養した細胞と同程度のリン酸化が観察された。この結果から、本ペプチド配列中にインテグリンのリガンドを組み込むことで、インテグリンを介した細胞接着を誘導するだけでなく、細胞内シグナルの入力が可能であることが示された。なお、インテグリンだけでなく、DDRやHSPGのリガンドのモチーフを組み込んだ場合においても受容体特異的なシグナルの入力が可能であると考えられた。
BSA、I型コラーゲン、熱変性させたI型コラーゲン(ゼラチン)及び様々な重量比で混合したYCC2とYCC2-GFOGERの重合ペプチドを96ウェルプレートにコートし、このプレート上でMDA-MB-231を37℃で5% CO2条件下で180分間培養した。YCC2とYCC2-GFOGERは還元状態で三重らせんを形成させた後、様々な重量比で混合し、塩基性バッファーで希釈することにより酸化し、共重合させ、96ウェルプレートにコートした。細胞を培養した後、接着細胞を固定し、染色し、観察した結果を図14Aに示す。また、接着細胞数を計数し、比較した結果を図14B及び図14Cに示す。
BSA、I型コラーゲン、YCC2重合ペプチド(Pol-GPOGPR)、YCC2-GFOGER重合ペプチド(Pol-GFOGER)、YCC2-GVMGFO重合ペプチド(Pol-GVMGFO)、YCC2-KGHRGF重合ペプチド(Pol-KGHRGF)、Soluble GFOGER、Soluble GVMGFO及びSoluble KGHRGFを96ウェルプレートにコートし、このプレート上でHDFを37℃、5% CO2条件下で60分間培養した。このとき、YCC2-GFOGER、YCC2-GVMGFO及びYCC2-KGHRGFは還元状態で三重らせんを形成させた。その後、塩基性バッファーで希釈し、酸化条件で96ウェルプレート上で酸化し、重合化してコートした。細胞培養後、細胞を固定、染色して観察した結果を図15Aに示す。また、Pol-GFOGER及びPol-KGHRGFへの細胞接着がEDTA、又は三重らせん配列中のKGHRGFに対して特異的に結合することが知られているヘパリンによって阻害されるかどうかを検討した。この結果を図15B及び図15Cに示す。
YCC2-GFOGERとYCC2-GVMGFOとを様々な割合で混合し、共重合させた重合ペプチドをコートした96ウェルプレート上でHDFを培養したときの細胞接着の様子と、接着した細胞数を計数した結果を図16A及び図16Bに示す。
次に、生理活性を有するモチーフを、ペプチド鎖の側鎖にリンカーを介して結合させたコラーゲン様ペプチドの重合ペプチドとこれを含むゲルを作製し、ヒト線維芽細胞の接着性を評価した。
CCC2-KGHRGF(配列番号18)を、前記実施例2と同様の方法で合成した。このCCC2-KGHRGFを1.11 mg/mlで三重らせん形成後、10%までDMSOを加えて、上にミネラルオイルを重層し、室温で1週間程度酸化・重合させた。次に、CCC2-KGHRGFを使用した重合ペプチドを30 μg/mlに希釈して96ウェルプレートに1晩コートし、溶液を除去して、5 mg/ml NaHCO3 水溶液に溶解した1 mg/ml BS(PEG)5(Pierce社製、カタログ番号No.21581)を加え、室温で1時間程度反応させることにより、リンカーを結合させた。次に、10 mM エタノールアミン(EA)、又は、5 mg/ml NaHCO3水溶液に溶解した100 μg/ml RGD pep(配列番号22)を加え、室温で1時間程度反応させることにより、CCC2-KGHRGFに結合させたリンカーに結合させた。
前記RGDモチーフを結合させたゲルに、5 mg/ml BSAを加えて1時間程度ブロッキングした。次にヒト線維芽細胞 (HDF) 懸濁液を加えて37℃で1時間程度培養後、浮遊している細胞を培地とともに除去し、PBSで洗浄した。接着した細胞を4% p-ホルムアルデヒドで固定後、2%クリスタルバイオレット染色、水で洗浄し、風乾後、顕微鏡で観察することにより、この重合ペプチドにリンカーを介して結合させたRGDモチーフへのHDFの結合性を評価した。
実施例5と同様にKGHRGFにリンカーを結合させていない重合ペプチドのゲル(KGHRGD)は、HDFの接着性を示した。一方、このKGHRGFにリンカーを結合させたペプチドの重合ペプチド(KGHRGF-Linker)は、HDFの接着性を示さなかった。このリンカーにさらに、RGDモチーフを結合させた重合ペプチド(KGHRGF-RGD)では、HDFの接着性を示した。また、対照として使用したRGDモチーフを有する可溶性ペプチド(soluble RGD)を使用した場合には、HDFの結合性を示さなかった(図17)。
ゲルの硬さの制御用ペプチド鎖としてCCC2-GPOGPR (short)、CC2-GPOGPR (short)及びC2-GPOGPR (short)の各ペプチドより構成される3本鎖ペプチドと、生理活性モチーフを有するペプチド鎖であるCCC2-GFOGER(short)で構成される3本鎖ペプチドとを組み合わせて、酸化架橋して製造される重合ペプチドのゲルを作製し、ヒト皮膚線維芽細胞の細胞凝集活性に与える影響を評価した。
最初に、ペプチド鎖CCC2-GPOGPR (short)で構成される3本鎖ペプチドにヒト皮膚線維芽細胞接着能を有する少量のCCC2-GFOGER(short)で構成される3本鎖ペプチドを添加して、架橋重合して作製したゲルでのヒト皮膚線維芽細胞の接着性及び細胞間相互作用に基づく細胞凝集性を評価した。
CCC2-GPOGPR (short)(配列番号10)、CC2-GPOGPR (short)(配列番号23)又はC2-GPOGPR (short)(配列番号24)をそれぞれ脱気した超純水に溶解し、80oCで5分間加熱した後、4oCで一晩静置することで三重らせんを形成させた。これらを様々な割合で混合し、終濃度10%となるようにDMSOを添加し、96ウェルプレート中に50 μLずつ加えた。このとき、すべてのペプチド混合液に対して重量比1%のCCC2-GFOGER (short)(配列番号16)で構成される3本鎖ペプチドを添加し、添加していないものをLigand-freeとした。このプレートを10% DMSOで満たした容器中で4日間以上静置することでペプチド溶液をゲル化させた。これらのゲルは細胞培養培地に一晩浸すことでDMSOを希釈し、以下の細胞を用いた実験に使用した。なお、I型コラーゲンを陽性対照とした。
コラーゲン、CCC2-GPOGPR (short)の3本鎖ペプチドのみを架橋重合して製造されるゲル(ligand free)、及び、CCC2-GPOGPR (short)の3本鎖ペプチドと重量比1%のCCC2-GFOGER (short)の3本鎖ペプチドとを混合後、ゲル化して製造される重合ペプチドを含有するゲルでのヒト皮膚線維芽細胞に対する接着性を比較した結果を図18Aに示した。
次に、システイン残基数が異なるペプチド鎖を用い、各ペプチド鎖より構成される3本鎖ペプチドの各種構成比のゲルで、重量比1%のCCC2-GFOGER (short)の3本鎖ペプチドを含むゲルについて、そのゲル化能及び細胞接着能を比較、評価した。
CCC2-GPOGPR (short)、CC2-GPOGPR (short)及びC2-GPOGPR (short)のそれぞれより構成される3本鎖ペプチド中の2種の異なる3本鎖ペプチドを9:1、7:3、5:5、3:7又は1:9の配合比率で組み合わせて溶媒中で混合し、さらに、上記実験と同様に重量比1%のCCC2-GFOGER (short)より構成される3本鎖ペプチドを添加した後に、酸化架橋して3本鎖ペプチドを重合させたゲルを作製し、ゲル化能、及びこのゲルに接着するヒト皮膚線維芽細胞の細胞凝集性を上記実験と同様の方法で評価した。
CC2-GPOGPR (short):C2-GPOGPR (short)が7:3と5:5、3:7、1:9の構成比率のゲル、及びCCC2 (short):C2-GPOGPR (short)が3:7と1:9の構成比率のゲルでは、酸化架橋剤であるDMSOを添加してもゲル化しなかった。
ゲル薄膜を再水和したゲルを生体に移植し、生体中における挙動を検討し、評価した。
1.ゲル薄膜の製造と再水和
CCC2-GPOGPR (short)(配列番号10)で構成される3本鎖ペプチドとSoluble GPOGPR (short)(配列番号25)で構成される3本鎖ペプチドとを1:1の割合で混合後、DMSOで酸化架橋することにより重合ペプチドを含むゲルを製造した。このゲルを乾燥し、室温で1週間以上保存し、使用直前に生理食塩水で再水和したゲルを使用した。このとき、生分解を受けないPVDF(ポリフッ化ビニリデン)膜を移植位置のマーカーとして使用するための支持体として製造した後、下記のin vivo埋込実験に使用した。
コラーゲン様重合ペプチド薄膜をC57BL6マウス(雄性、8週齢)の背部皮下に移植した。移植実験では、イソフルランによる吸入麻酔下、マウスの背部を除毛後2cm程度の皮膚切開を加えた。切開部よりモスキート鉗子を挿入して皮下ポケットを作製し、コラーゲン様重合ペプチド薄膜をこの皮下ポケットに挿入して移植操作を完了し、ナイロン糸を用いて縫合閉鎖した。
Claims (10)
- ゲル化剤であって、
システイン(Cys)残基を含むペプチド鎖を含む3本鎖からなる三重らせん構造を有する3本鎖ペプチドを重合単位として、前記Cys残基間でのジスルフィド結合による酸化架橋で重合され、
前記3本鎖ペプチドを構成する各ペプチド鎖は、同一であっても又は相互に異なっていてもよく、
各ペプチド鎖は、-(Xaa-Yaa-Gly)-を基本単位として少なくとも5回の繰り返し構造を有する三重らせん形成用ペプチド基と、アミノ末端及びカルボキシ末端の各々から10残基以内に少なくとも2残基のシステイン(Cys)残基を含む架橋形成用ペプチド基とを有する重合ペプチドの少なくとも1種を含むことを特徴とするゲル化剤。
[Xaa及びYaaは、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リシン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa位及びYaa位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよい。] - 請求項1に記載のゲル化剤であって、
前記ペプチド鎖は、
(i) 少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と少なくとも1つの架橋形成用ペプチド基からなるペプチド鎖、
(ii) 少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と少なくとも1つの架橋形成用ペプチド基、及び生理活性を有するモチーフを有する少なくとも1つのペプチド基を含むペプチド鎖、及び、
(iii) 少なくとも1つの前記三重らせん形成用ペプチド基と架橋形成用ペプチド基、及び、アミノ酸残基の側鎖にリンカーを介して生理活性を有するモチーフを結合させた少なくとも1つのペプチド基を含むペプチド鎖
からなる群から選択される重合ペプチドの少なくとも1種を含むことを特徴とするゲル化剤。 - 請求項2に記載のゲル化剤であって、
前記生理活性を有するモチーフの2種類以上を組み合わせて製造される共重合ペプチドを少なくとも1種含むことを特徴とするゲル化剤。 - 請求項1に記載のゲル化剤の製造方法であって、
(Xaa-Yaa-Gly)を基本単位として少なくとも5回の繰り返し構造を有し、アミノ末端及びカルボキシ末端の各々から10残基以内に少なくとも2残基のシステイン(Cys)残基を含む相互に異なっていてもよいペプチド鎖を溶媒に溶解する工程、
自己集合により前記ペプチドの3本からなる三重らせん構造を有する3本鎖ペプチドを形成する工程、
該3本鎖ペプチドを重合単位として前記Cys残基間でのジスルフィド結合による酸化架橋で重合させる工程、
を含むことを特徴とする、製造方法。
[Xaa及びYaaは、それぞれ独立して、プロリン(Pro又はP)残基、ヒドロキシプロリン(Hyp又はO)残基、アルギニン(Arg又はR)残基、リシン(Lys又はK)残基、バリン(Val又はV)残基、ロイシン(Leu又はL)残基、イソロイシン(Ile又はI)残基、セリン(Ser又はS)残基、トレオニン(Thr又はT)残基、アラニン(Ala又はA)残基、グリシン(Gly又はG)残基、フェニルアラニン(Phe又はF)残基、メチオニン(Met又はM)残基、グルタミン酸(Glu又はE)残基、アスパラギン酸(Asp又はD)残基、アスパラギン(Asn又はN)残基、グルタミン(Gln又はQ)残基、ヒスチジン(His又はH)残基、トリプトファン(Trp又はW)残基又はチロシン(Tyr又はY)残基から選択され、プロリン残基はアミノ基又はフッ素原子で修飾されていてもよく、Xaa位及びYaa位にはN-イソブチル基グリシン残基を用いてもよい。] - 請求項1〜3のいずれか1項に記載のゲル化剤の少なくとも1種を含むことを特徴とする、ゲル。
- システイン残基を含まない3本鎖ペプチドの少なくとも1種をさらに含むことを特徴とする、請求項5に記載のゲル。
- 請求項5又は6に記載のゲルであって、
ゲルが、ヒドロゲルであり、選択的な細胞を培養するための基材として使用されることを特徴とする、ゲル。 - 請求項5〜7のいずれか1項に記載のゲルを乾燥させて製造されることを特徴とする、重合ペプチド薄膜。
- 請求項5〜7のいずれか1項に記載のゲル又は請求項98に記載の重合ペプチド薄膜を含むことを特徴とする、再生医療材料。
- 請求項9に記載の再生医療材料であって、
創傷治癒促進用組成物であることを特徴とする、再生医療材料。
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