KR20220023958A - 생체 적합 물질 및 이와 관련된 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하나 이상의 크리스탈린 단백질을 포함하는 생체적합성 조성물, 및 치료 및 연구 방법, 예를 들어 외과적 방법, 지속 방출 약물 전달, 및 세포 기반 방법에서의 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

생체 적합 물질 및 이와 관련된 방법

본 발명은 단백성 생체 적합 물질(proteinaceous biomaterial) 및 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 크리스탈린 단백질(crystallin protein)을 포함하는 생체 적합 물질, 상기 생체 적합 물질을 제조하는 방법, 및 외과적 방법, 세포 기반 요법, 및 약물 전달과 같은 의약 및 치료 방법 분야, 및 생물 의학 연구 분야, 예를 들어 세포 배양 및 조직 배양 방법 분야, 및 조직 공학(tissue engineering) 분야를 포함한 다양한 분야에서 상기 생체 적합 물질을 사용하는 다양한 방법에 관한 것이다.

다음은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 임의의 정보가 선행 기술이거나 또는 본 발명에서 설명되거나 특허청구되는 발명과 관련이 있거나, 또는 구체적으로 또는 묵시적으로 언급된 임의의 간행물이나 문서가 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다. 명세서 전반에 걸친 선행 기술에 대한 임의의 논의는 그러한 선행 기술이 널리 알려져 있거나 해당 분야에서 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

생체적합성(biocompatible) 물질은 많은 치료적 및 과학적 방법에 중요하다. 예를 들어, 정해진 기간에 걸쳐 안전하게 용해될 수 있는 봉합사(suture)는 많은 외과적 방법에 필수적인 반면, 임플란트 및 임플란트성 조성물(implantable composition), 예를 들어 지속적인 약물 전달을 위한 임플란트성 조성물은 유리하게는 생체적합성이고, 비염증성이며, 안전하다. 또한, 이러한 임플란트 및 임플란트성 조성물이 기능적 수명에 걸쳐 또는 그 이후에 분해되도록 설계되는 경우, 이상적으로는 분해 생성물 자체도 마찬가지로 생체적합성이고 안전하다.

생체적합성은 물질이, 예를 들어, 대상체 상에 또는 대상체에 직접적으로 사용되거나 또는 예를 들어 세포 기반 요법 또는 공학적 조직(engineered tissue)의 제조시에 간접적으로 사용되는지 여부에 관계없이 중요하다. 전자의 경우, 예를 들어, 생체적합성 접착제는 자극, 흉터 및 불편함과 관련된 합병증을 줄일 수 있다. 후자의 경우, 예를 들어, 조직 및 기관 공학용 스캐폴드(scaffold)는 통상적으로는 생분해성 합성 중합체로부터 합성되지만, 많은 종류의 이러한 합성 중합체는 낮은 생체적합성 및/또는 낮은 기계적 강도를 갖거나 또는 생리학적 조건 하에서 최적의 분해 프로필보다 낮으므로 사용이 제한적이다.

의료 요법에서 및 많은 연구 방법에서 사용되는 물질의 생체적합성이 바람직하다는 명확한 인식에도 불구하고, 많은 종류의 이러한 요법 및 방법에 대해 생체적합성 옵션은 존재하지 않거나 하나 이상의 결핍으로 인해 어려움을 겪고 있다. 예를 들어, 안구 수술의 맥락에서, 기존의 수술용 접착제는 전형적으로는 합성 물질이며, 흉터 및 독성과 연관이 있다.

따라서, 예를 들어, 외과적 용도 및 약물 전달 용도를 포함하는 다수의 치료 및 연구 용도를 위한 새로운 생체적합성 물질을 개발할 필요가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 크리스탈린 단백질을 포함하는 하나 이상의 생체적합성 물질을 제공하거나, 또는 적어도 기존의 생체 적합 물질 및 이에 의존하는 방법에 대한 유용한 대안을 제공하거나, 또는 적어도 대중(public)에게 유용한 선택을 제공하는 것이다.

제1 양태에서, 본 발명은:

하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단리, 정제, 재조합, 또는 합성 단백질:

a) α-크리스탈린;

b) β-크리스탈린;

c) γ-크리스탈린;

d) 호키(Hoki)(마크루로누스 노바에젤란디아에(Macruronus novaezlandiae))로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;

e) 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;

f) 본 명세서의 표 1에서 확인되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

g) 상기 a) 내지 f) 중 어느 하나로부터의 적어도 약 10개의 연속 아미노산(contiguous amino acid)을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드;

h) 상기 a) 내지 g) 중 어느 하나에 대해 적어도 약 90%의 아미노산 동일성(amino acid identity)을 갖는 단백질;

i) 생체 내에서(in vivo) 크리스탈린 단백질의 고유 구조를 갖는 상기 a) 내지 h) 중 어느 하나에 따른 단백질;

j) 상기 a) 내지 i) 중 둘 이상의 임의의 조합;

선택적으로 하나 이상의 가소제;

선택적으로 하나 이상의 공개시제(co-initiator); 및

하나 이상의 가교결합제를 포함하는 생체적합성 조성물에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은, 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 단백질:

a) α-크리스탈린;

b) β-크리스탈린;

c) γ-크리스탈린;

d) 호키(마크루로누스 노바에젤란디아에)로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;

e) 호모 사피엔스로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;

f) 본 명세서의 표 1에서 확인되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

g) 상기 a) 내지 f) 중 어느 하나로부터의 적어도 약 10개의 연속 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드;

h) 상기 a) 내지 g) 중 어느 하나에 대해 적어도 약 90%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질;

i) 생체 내에서 크리스탈린 단백질의 고유 구조를 갖는 상기 a) 내지 h) 중 어느 하나에 따른 단백질;

j) 상기 a) 내지 i) 중 둘 이상의 임의의 조합;

선택적으로 하나 이상의 가소제;

선택적으로 하나 이상의 공개시제; 및

하나 이상의 가교결합제를 포함하며;

여기서, 상기 하나 이상의 단백질은 가교결합되어 중합체를 형성할 수 있는, 바이오 중합체 조성물(biopolymer composition)에 관한 것이다.

다양한 실시형태에서, 하나 이상의 단백질은 생체 내에서 가교결합 가능하다.

하나의 양태에서, 본 발명은 생체 내 겔화 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은:

a) α-크리스탈린;

b) β-크리스탈린;

c) γ-크리스탈린;

d) 호키(마크루로누스 노바에젤란디아에)로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;

e) 호모 사피엔스로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;

f) 본 명세서의 표 1에서 확인되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

g) 상기 a) 내지 f) 중 어느 하나로부터의 적어도 약 10개의 연속 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드;

h) 상기 a) 내지 g) 중 어느 하나에 대해 적어도 약 90%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질;

i) 생체 내에서 크리스탈린 단백질의 고유 구조를 갖는 상기 a) 내지 h) 중 어느 하나에 따른 단백질;

j) 상기 a) 내지 i) 중 둘 이상의 임의의 조합;

선택적으로 하나 이상의 가소제;

선택적으로 하나 이상의 공개시제; 및

하나 이상의 가교결합성 분자를 포함하며;

여기서, 상기 생체 내 겔화 조성물은 대상체의 신체 내부 또는 신체 상의 표적 부위에서 적어도 부분적으로 중합 및/또는 겔화되거나, 또는 상기 생체 내 겔화 조성물의 가교결합은 대상체 신체 내부 또는 신체 상의 표적 부위에 존재할 때 발생하거나 개시된다.

따라서, 하나의 실시형태에서, 생체적합성 조성물은 대상체의 신체 내부 또는 신체 상의 표적 부위에서 적어도 부분적으로 중합 및/또는 겔화되도록 제형화된 생체 내 겔화 조성물이거나, 또는 생체적합성 조성물은 상기 생체 내 겔화 조성물의 가교결합이 대상체의 신체 내부 또는 신체 상의 표적 부위에 존재할 때 발생하거나 개시되도록 제형화된 생체 내 겔화 조성물이다.

본 발명의 또 다른 양태는 가교결합된 바이오 중합체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

하기를 포함하는 조성물을 제공하는 단계:

a) α-크리스탈린;

b) β-크리스탈린;

c) γ-크리스탈린;

d) 호키(마크루로누스 노바에젤란디아에)로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;

e) 호모 사피엔스로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;

f) 본 명세서의 표 1에서 확인되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

g) 상기 a) 내지 f) 중 어느 하나로부터의 적어도 약 10개의 연속 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드;

h) 상기 a) 내지 g) 중 어느 하나에 대해 적어도 약 90%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질;

i) 생체 내에서 크리스탈린 단백질의 고유 구조를 갖는 상기 a) 내지 h) 중 어느 하나에 따른 단백질;

j) 상기 a) 내지 i) 중 둘 이상의 임의의 조합;

k) 선택적으로 하나 이상의 가소제;

l) 선택적으로 하나 이상의 공개시제; 및

상기 조성물을 하나 이상의 가교결합성 분자와 접촉시키는 단계;

가교결합을 개시하여 가교결합된 바이오 중합체 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.

본 발명의 추가의 양태는 하나 이상의 정제된 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

i. 척추동물 눈 조직(eye tissue)을 제공하는 단계;

ii. 조직을 고유 크리스탈린 단백질 구조의 유지에 적합한 조건 하에서 추출 완충액의 존재 하에 균질화하는 단계;

iii. 액상 균질물을, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해, 임의의 잔류 고체로부터 분리하여 크리스탈린 단백질-함유 용액을 제공하는 단계;

iv. 선택적으로, 크리스탈린 단백질을 적어도 부분적으로 추가로 정제하는 단계;

v. 선택적으로, 크리스탈린 단백질-함유 용액을 투석하여 추출 완충액을 제거하는 단계;

vi. 선택적으로, 크리스탈린 단백질-함유 용액을 동결 건조하여 동결 건조된 크리스탈린 단백질 조성물을 제공하는 단계;

vii. 선택적으로, 크리스탈린 단백질-함유 용액 또는 동결 건조된 크리스탈린 단백질 조성물을, 예를 들어 0℃ 이하에서, 저장하는 단계를 포함하며;

여기서, 상당한 비율의 정제된 크리스탈린 단백질은 그들의 본래의 구조를 유지한다.

따라서, 하나의 실시형태에서, 하나 이상의 정제된 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법은:

i. 척추동물 눈 조직을 제공하는 단계;

ii. 조직을 생리학적 pH를 갖는 추출 완충액의 존재 하에 균질화하는 단계 - 상기 균질액은 약 15℃ 미만의 온도에서 유지됨 -;

iii. 액상 균질물을, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해, 임의의 잔류 고체로부터 분리하여 크리스탈린 단백질-함유 용액을 제공하는 단계;

iv. 선택적으로, 크리스탈린 단백질을 적어도 부분적으로 추가로 정제하는 단계;

v. 선택적으로, 크리스탈린 단백질-함유 용액을 투석하여 추출 완충액을 제거하는 단계;

vi. 선택적으로, 크리스탈린 단백질-함유 용액을 동결 건조하여 동결 건조된 크리스탈린 단백질 조성물을 제공하는 단계;

vii. 선택적으로, 크리스탈린 단백질-함유 용액 또는 동결 건조된 크리스탈린 단백질 조성물을, 예를 들어 0℃ 이하에서, 저장하는 단계를 포함하며;

여기서, 상당한 비율의 정제된 크리스탈린 단백질은 그들의 본래의 구조를 유지한다.

하나의 실시형태에서, 고유 크리스탈린 단백질 구조를 유지하는데 적합한 조건은:

a. 균질물을 추출 완충액 중 7 이상의 pH에서 유지; 또는

b. 균질물을 생리학적 pH에서 유지; 또는

c. 균질물을 약 15℃ 미만의 온도에서 유지;

d. 상기 a) 및 c) 모두; 또는

e. 상기 b) 및 c) 모두를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 고유 크리스탈린 단백질 구조를 유지하는데 적합한 조건은:

a. 균질물을 추출 완충액 중 7 이상의 pH에서 유지; 또는

b. 균질물을 생리학적 pH에서 유지; 또는

c. 균질물을 약 15℃ 미만의 온도에서 유지;

d. 상기 a) 및 c) 모두; 또는

e. 상기 b) 및 c) 모두를 포함하고;

그 방법은:

액상 균질물을 원심분리 또는 여과에 의해 임의의 잔류 고체로부터 분리하여 크리스탈린 단백질-함유 용액을 제공하는 단계;

크리스탈린 단백질-함유 용액을 투석하여 추출 완충액을 제거하는 단계;

선택적으로, 크리스탈린 단백질-함유 용액을 동결 건조하여 동결 건조된 크리스탈린 단백질 조성물을 제공하는 단계;

크리스탈린 단백질-함유 용액 또는 동결건조된 크리스탈린 단백질 조성물을 고유 크리스탈린 단백질 구조의 유지에 적절한 조건 하에, 예를 들어 사용 전까지 약 4℃ 이하에서, 유지하는 단계를 포함하며;

여기서, 상당한 비율의 정제된 크리스탈린 단백질은 그들의 본래의 구조를 유지한다.

따라서, 하나의 실시형태에서, 하나 이상의 정제된 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법은:

i. 척추동물 눈 조직을 제공하는 단계;

ii. 조직을 추출 완충액의 존재 하에 7 이상의 pH에서 균질화하는 단계 - 상기 균질액은 약 15℃ 미만의 온도에서 유지됨 -;

iii. 액상 균질물을 원심분리 또는 여과에 의해 임의의 잔류 고체로부터 분리하여 크리스탈린 단백질-함유 용액을 제공하는 단계;

iv. 크리스탈린 단백질-함유 용액을 투석하여 추출 완충액을 제거하는 단계;

v. 선택적으로, 크리스탈린 단백질-함유 용액을 동결 건조하여 동결 건조된 크리스탈린 단백질 조성물을 제공하는 단계;

vi. 크리스탈린 단백질-함유 용액 또는 동결건조된 크리스탈린 단백질 조성물을 사용 전까지 약 4℃ 이하에서 유지하는 단계를 포함하며;

여기서, 상당한 비율의 정제된 크리스탈린 단백질은 그들의 본래의 구조를 유지한다.

하나의 실시형태에서, 척추동물 눈 조직은 수정체 조직이다.

하나의 실시형태에서, 척추동물 눈 조직은 수정체유화(phacoemulsification) 물질이다.

하나의 실시형태에서, 척추동물 눈 조직은 어류, 예를 들어 심해 어류로부터의 안구 조직이다. 하나의 실시형태에서, 척추동물 눈 조직은 호키로부터의 눈 조직, 예를 들어 호키 눈 수정체 조직이다.

하나의 실시형태에서, 척추동물 눈 조직은 포유동물로부터의 눈 조직, 예를 들어 인간, 소, 돼지, 염소, 양, 또는 사슴 눈 조직이다.

하나의 실시형태에서, 척추동물 눈 조직은 호모 사피엔스로부터의 눈 조직, 예를 들어 호모 사피엔스 눈 수정체 조직이다.

하나의 실시형태에서, 척추동물 눈 조직은 수정체유화 수술로부터 유래된다.

하나의 실시형태에서, 추출 완충액은 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, NaCl, 나트륨 아지드, 또는 이들 중 둘 이상의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 추출 완충액은 생리학적 pH, 예를 들어 크리스탈린 단백질을 수득하는 유기체의 생리학적 pH에 있다. 하나의 실시형태에서, 추출 완충액의 pH는 7 초과이다. 예를 들어, 추출 완충액의 pH는 약 7 내지 약 9의 범위이다.

하나의 실시형태에서, 추출 완충액은 눈 조직 그램당 적어도 약 2 mL 완충액의 비율로 존재한다.

하나의 실시형태에서, 균질화는 하나 이상의 크리스탈린 이소형의 파괴를 피하거나 최소화하고/하거나 단백질 응집을 피하거나 최소화하는 조건 하에 수행된다. 예를 들어, 크리스탈린 나노피브릴의 형성을 피하거나 최소화하기 위해 또는 비-자연 발생성 단백질 형태 이성질체(protein conformer)의 형성을 피하거나 최소화하기 위해 가능한 최대로 파괴 및/또는 응집을 피한다.

일 예에서, 균질화는 생리학적 pH, 예를 들어 생리학적 pH를 갖는 완충액 중에서 수행된다. 일 예에서, 균질화는 약 7 초과의 pH에서 수행된다. 일 예에서, 균질화는 낮은 전단 조건 하에서 수행된다. 일 예에서, 균질화는, 예를 들어, 아르기닌과 같은 하나 이상의 안정화 첨가제의 존재 하에 수행된다.

일 예에서, 균질화는 저온에서 수행된다. 하나의 실시형태에서, 균질화는 약 0℃ 내지 약 5℃의 온도에서 발생한다. 하나의 실시형태에서, 균질화는 균질화가 수행되지 않는, 예를 들어 균질액이 일정 기간 동안 얼음 상에 배치되는 냉각 단계가 산재되어 있는 휴지 단계가 산재되어 있다.

하나의 실시형태에서, 투석은 5℃ 미만에서 물, 예를 들어 Milli-Q 물(Milli-Q water)과 같은 정제수에 대해 수행된다.

하나의 실시형태에서, 정제된 크리스탈린 단백질은 안정제의 존재 하에 저장된다. 예를 들어, 정제된 크리스탈린 단백질은 아르기닌, 글리신, 또는 이들의 조합의 존재 하에 저장된다.

다양한 실시형태에서, 그의 고유 구조를 유지하는 정제된 크리스탈린 단백질의 실질적인 비율은 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 또는 약 99% 초과이다. 다양한 실시형태에서, 고유 구조의 보유는 원편광 이색성 분광(分光) 분석(circular dichroism), NMR 또는 고유 PAGE를 포함한 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 결정되지만, 이에 국한되지 않는다.

하나의 실시형태에서, 하나 이상의 정제된 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 본질적으로는 본 명세서에서 실시예에 기술된 바와 같다.

추가의 양태에서, 본 발명은 조직 봉합(tissue closure)을 필요로 하는 대상체에게서 조직을 봉합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

선택적으로, 힘을 가하여 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 봉합하는 단계;

열상, 병변, 절개부, 또는 상처 또는 상기 열상, 병변, 절개부, 또는 상처의 부위를 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질 함유 조성물과 접촉시키는 단계 - 선택적으로, 상기 크리스탈린 함유 조성물은 적어도 부분적으로 가교결합됨 -;

선택적으로, 힘을 가하여 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 봉합하는 단계;

가교결합을 개시 및/또는 유지하는 단계;

열상, 병변, 절개부 또는 상처의 봉합을 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지하는 단계를 포함하며;

여기서, 크리스탈린 단백질의 적용 및/또는 가교결합은 접착제 조성물을 형성한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 조직 봉합을 필요로 하는 대상체에게서 조직을 봉합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

선택적으로, 힘을 가하여 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 봉합하는 단계;

열상, 병변, 절개부, 또는 상처 또는 상기 열상, 병변, 절개부, 또는 상처의 부위를 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질 함유 조성물과 접촉시키는 단계;

선택적으로, 힘을 가하여 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 봉합하는 단계;

가교결합을 개시하는 단계;

열상, 병변, 절개부 또는 상처의 봉합을 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지하는 단계를 포함하며;

여기서, 크리스탈린 단백질의 가교결합은 접착제 조성물을 형성한다.

하나의 실시형태에서, 조직 봉합 방법은 외과적 절개부를 봉합하는 방법이다.

하나의 실시형태에서, 조직 봉합 방법은 무봉합 봉합(sutureless closure) 방법이다. 예를 들어, 무봉합 봉합은 무봉합 피부 봉합, 무봉합 상처 봉합, 또는 무봉합 수술 절개부 봉합이다.

하나의 실시형태에서, 수술은 안과 수술이다. 일 예에서, 안과 수술은 백내장 수술, 결막 이식, 국부 평면 유리체 절제술(pars planar vitrectomy)을 포함하는 유리체 절제술, 굴절 수정체 교환, 수정체 이식, 또는 수정체 교체 수술이다. 또 다른 예에서, 안과 수술은 망막 박리 수술, 예를 들어 망막 유착 또는 공막 좌굴을 포함하는 망막 수술, 황반 구멍 수술, 결막 폐쇄, 녹내장 수술, 수포 누출 수술, 섬유주 절제술, 눈꺼풀봉합, 양막 세포막 이식, 각막 천공 수술, 익상편 절제술을 포함한 익상편 수술, 후방 캡슐 안내 수정체 이식, 상피 내성장 수술, 표층각막이식을 포함한 각막이식술, 깊은 전방 표층각막이식, 양측 사시 수술을 포함한 사시 수술, 눈꺼풀 피부 이식 수술, 또는 점막 이식 수술이다.

하나의 실시형태에서, 조성물은 안과 수술 장치, 예를 들어 전방 캐뉼라(anterior chamber cannula)(Rycroft cannula)를 통해 적용된다.

다양한 실시형태에서, 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 열상, 병변, 절개부 또는 상처의 봉합을 유지하는 것은 붕대, 봉합사, 메쉬 등과 같은 하나 이상의 의료 보조 장치를 적용하거나, 또는 봉합된 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 조이거나 고정하는 것과 같은 (일반적으로는 일시적인) 물리적인 힘을 사용한다.

다양한 실시형태에서, 열상, 병변, 절개부 또는 상처의 봉합은 약 60% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안, 예를 들어, 약 70% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안, 약 80% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안, 약 90% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안, 또는 약 95% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지한다.

하나의 실시형태에서, 조성물 중에 존재하는 가교결합제는 광가교결합제이고, 여기서 가교결합은 광에 대한 노출시킴으로써 개시된다. 예를 들어, 하나의 실시형태에서, 가교결합제는 UV 가교결합제, 예를 들어 1-하이드록시사이클로헥실-1-페닐 케톤(예를 들어, Irgacure 184), 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(예를 들어, Irgacure 651), 리보플라빈, 또는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)이나 이에 국한되는 것은 아니며, 가교결합은 UV 광(365 nm)에 노출시킴으로써 개시된다. 또 다른 실시형태에서, 가교결합제는 에오신 Y(EY) 및 트리에탄올아민(TEOA)을 포함하는 가시광 활성화 시스템과 같은 가시광 가교결합제이며, 가교결합은 가시광(530 nm)에 노출시킴으로써 개시된다.

하나의 실시형태에서, 본 발명은, 대상체가 안과 수술을 받고 있거나 받은 적이 있는, 조직 봉합을 필요로 하는 대상체에게서 조직을 봉합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

외과적 절개부 또는 상기 외과적 절개부의 부위를 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질 함유 조성물과 접촉시키는 단계 - 선택적으로, 상기 크리스탈린 함유 조성물은 적어도 부분적으로 가교결합됨 -;

선택적으로, 힘을 가하여 절개부를 봉합하는 단계;

가교결합을 개시 및/또는 유지하는 단계;

외과적 절개부의 봉합을 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지하는 단계를 포함하며;

여기서, 크리스탈린 단백질의 적용 및/또는 가교결합은 외과적 절개부의 봉합을 유지할 수 있는 접착제 조성물을 형성한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 대상체가 안과 수술을 받고 있거나 받은 적이 있는, 조직 봉합을 필요로 하는 대상체에게서 조직을 봉합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

외과적 절개부 또는 상기 외과적 절개부의 부위를 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질 함유 조성물과 접촉시키는 단계;

선택적으로, 힘을 가하여 절개부를 봉합하는 단계;

가교결합을 개시하는 단계;

외과적 절개부의 봉합을 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지하는 단계를 포함하며;

여기서, 크리스탈린 단백질의 가교결합은 외과적 절개부의 봉합을 유지할 수 있는 접착제 조성물을 형성한다.

하나의 실시형태에서, 접착제 조성물은 봉합사 또는 다른 봉합 보조제의 부재 하에 외과적 절개부의 봉합을 유지할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 접착제 조성물은 대상체의 눈의 굴절률과 등가인 굴절률을 갖는다. 하나의 실시형태에서, 접착제 조성물은 가시 스펙트럼에 걸쳐 높은 투과율을 갖는다.

추가의 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게서 안구 손상 또는 안구 절개부를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

i. 안구 손상 또는 절개부를 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 함유 조성물과 접촉시키는 단계 - 선택적으로, 상기 크리스탈린 함유 조성물은 적어도 부분적으로 가교결합됨 -;

및

ii. 가교결합을 개시 및/또는 유지하는 단계를 포함하며;

여기서, 가교결합은 생체접착성 중합체 조성물을 형성한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게서 안구 손상 또는 안구 절개부를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

i. 안구 손상 또는 절개부를 본 명세서에서 기술되는 조성물과 접촉시키는 단계;

및

ii. 가교결합을 개시하는 단계를 포함하며;

여기서, 가교결합은 생체접착성 중합체 조성물을 형성한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 활성제를 이를 필요로 하는 대상체에 전달하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

하나 이상의 활성제를 추가로 포함하는, 본 명세서에서 기술되는 조성물을 포함하는 크리스탈린 단백질을 제공하는 단계,

대상체를 조성물과 접촉시키는 단계,

선택적으로 조성물의 가교결합을 개시하는 단계,

이에 의해 활성제를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 단계를 포함한다.

특정 실시형태에서, 대상체를 조성물과 접촉시키는 단계는, 예를 들어, 외과적 투여를 포함하여 대상체의 신체 상의 또는 대상체의 신체 내의 표적 부위에 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 추가의 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 세포 또는 조직을 배양하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

배양시킬 하나 이상의 세포를 제공하는 단계;

상기 하나 이상의 세포를 본 명세서에서 기술되는 조성물을 포함하는 기질과 접촉시키는 단계;

상기 하나 이상의 세포와 기질과의 접촉 및 선택적으로 추가의 성장 배지와의 접촉을 지속적인 생존, 성장, 복제, 및/또는 분화에 적합한 조건 하에 일정 기간 동안 유지하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 기술되는 조성물은 γ-크리스탈린을 포함한다. 하나의 실시형태에서, γ-크리스탈린은 조성물 중에 존재하는 크리스탈린 단백질의 적어도 약 10% w/w를 차지한다.

하나의 실시형태에서, 하나 이상의 세포는 하나 이상의 복제 적격 세포(replicatively-competent cell)를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 하나 이상의 세포는 하나 이상의 줄기 세포이다.

하나의 실시형태에서, 기질은 본 명세서에서 기술되는 조성물로부터 형성된 박막 필름, 예를 들어 이와 접촉하는 세포를 또 다른 위치로 이동시킬 수 있는 충분한 기계적 강도 및/또는 탄성을 갖는 박막 필름이다. 일 예에서, 위치는 두 번째 배양 용기이다. 다른 예에서, 위치는, 예를 들어, 수술 부위와 같은 대상체의 신체 상에 또는 신체 내에 있다. 예를 들어, 하나 이상의 세포는 눈으로부터 유래되는 하나 이상의 안과적 세포 또는 하나 이상의 줄기 세포이며, 수술 부위는 눈 내부에 또는 눈 위에 있다. 일 예에서, 하나 이상의 세포는 하나 이상의 림발 줄기 세포(limbal stem cell)이다. 다른 예에서, 하나 이상의 세포는 하나 이상의 간질 줄기 세포(stromal stem cell)이다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 세포는 하나 이상의 망막 색소 상피 세포이다. 다른 예에서, 하나 이상의 세포는 하나 이상의 전능(totipotent) 줄기 세포, 하나 이상의 만능(pluripotent) 줄기 세포, 또는 하나 이상의 다능(multipotent) 줄기 세포이다.

하나의 실시형태에서, 기질은 본 명세서에서 기술되는 조성물로부터 형성되는 겔이다. 예를 들어, 기질은 3D 세포 배양물을 형성하기에 충분한 두께를 갖는 적어도 하나의 영역을 갖는 겔이다.

따라서, 하나의 실시형태에서, 하나 이상의 세포 또는 조직을 배양하는 방법은 척추동물의 눈으로부터 하나 이상의 세포를 배양하는 방법으로, 상기 방법은:

배양시킬 하나 이상의 척추동물 눈 세포를 제공하는 단계;

상기 하나 이상의 세포를 본 명세서에서 기술되는 조성물을 포함하는 기질과 접촉시키는 단계 - 여기서, 상기 기질은 광학적으로 투명함 -;

상기 하나 이상의 세포와 기질과의 접촉 및 선택적으로 추가의 성장 배지와의 접촉을 지속적인 생존, 성장, 복제, 및/또는 분화에 적합한 조건 하에 일정 기간 동안 유지하는 단계를 포함하며;

여기서, 상기 기질은 대상체의 눈으로의 전달 및/또는 외과적 적용과 관련된 취급을 지원하기에 충분한 기계적 내구성을 갖는다.

또 다른 추가의 양태에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한, 예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 치료 방법들 중 어느 하나에서 사용하기 위한 약제(medicament)의 제조에 있어서의 본 명세서에서 기술되는 조성물의 용도에 관한 것이다. 하나의 실시형태에서, 약제는 본 명세서에서 인용되는 수술 방법들 중 어느 하나를 포함하는 안과적 수술과 같은 수술에 사용하기 위한 것이다. 또한, 시험관내 단계를 이용하는 치료 또는 연구 방법을 포함한 시험관내 사용을 위한 약제 또는 조성물의 제조에 있어서의 본 명세서에서 기술되는 조성물의 용도도 고려된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한, 예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 치료 방법들 중 어느 하나에서 사용하기 위한 본 명세서에서 기술되는 조성물에 관한 것이다. 하나의 실시형태에서, 용도는 본 명세서에서 인용되는 수술 방법들 중 어느 하나를 포함하는 안과적 수술과 같은 수술에서의 용도이다. 또한, 시험관내 치료 또는 연구 방법, 또는 시험관내 단계를 이용하는 치료 또는 연구 방법에서 사용하기 위한 본 명세서에서 기술되는 조성물도 고려된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게서 줄기 세포의 결핍과 관련된 안구 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 눈을 다음을 포함하는 치료 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다:

i. 선택적으로 본 명세서에서 기술되는 배양 방법에 따라 배양된 줄기 세포;

및 선택적으로

ii. 본 명세서에서 기술되는 생체적합성 조성물 또는 바이오 중합체 조성물.

하나의 실시형태에서, 안구 장애는 림발 줄기 세포 결핍(LSCD: limbal stem cell deficiency) 또는 관련 장애를 포함한다. 다른 실시형태에서, 안구 장애는 연령 관련 황반 변성(ARMD: age-related macular degeneration) 또는 관련 장애와 같은 황반 변성을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 안구 장애는 유전성 망막 질환(IRD: inherited retinal disease) 또는 관련 장애를 포함한다.

추가의 실시형태에서, 치료 조성물은 적어도 하나의 림발 줄기 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 적어도 하나의 간질 줄기 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 적어도 하나의 망막 색소 상피 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 적어도 하나의 전능 줄기 세포, 적어도 하나의 만능 줄기 세포, 또는 적어도 하나의 다능 줄기 세포 중 하나 이상을 포함한다.

추가의 실시형태에서, 치료 조성물은 본 명세서에서 기술되는 조성물로부터 형성되는 박막 필름을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 하나 이상의 줄기 세포는 본 명세서에서 기술되는 생체적합성 조성물 또는 바이오 중합체 조성물의 존재 하에 하나 이상의 세포를 상기 조성물에 부착시키기에 충분한 기간 동안 배양된다.

예를 들어, 하나 이상의 줄기 세포는 본 명세서에서 기술되는 생체적합성 조성물 또는 바이오 중합체 조성물의 존재 하에 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 또는 적어도 약 28일 동안 배양된다.

하나의 실시형태에서, 하나 이상의 줄기 세포는 본 명세서에서 기술되는 생체적합성 조성물 또는 바이오 중합체 조성물의 존재 하에 상기 세포 중의 하나 이상을 상기 조성물 상에서 또는 상기 조성물 내에서 생장(outgrowth)시키기에 충분한 기간 동안 배양된다. 예를 들어, 세포는 세포 수를 증가시키기에 적합한 조건 하에 배양된다.

특히 고려되는 실시형태에서, 세포는 세포 수의 증가, 세포 생장, 부착, 세포 밀도의 증가, 및/또는 전능, 만능, 또는 다능 줄기 세포 표현형의 유지 중 하나 이상을 허용하기에 적합한 조건 하에 및 허용하기에 충분한 기간 동안 배양된다.

하나의 실시형태에서, 눈을 치료 조성물과 접촉시키는 단계는 안구 표면에 대한 외과적 이식 수술을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 눈은 하나 이상의 줄기 세포를 눈으로 전달하기에 충분한 기간 동안 치료 조성물과 접촉된다. 예를 들어, 접촉은 적어도 24시간, 예를 들어 48시간, 72시간, 또는 96시간 동안 유지된다. 다른 예에서, 접촉은 5일 이상, 예를 들어 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 또는 10일 이상 동안 유지된다. 일반적으로는, 가능하다면, 접촉은 7일 이상의 기간 동안 유지된다.

다양한 실시형태에서, 세포는 본 명세서에서 기술되는 생체적합성 조성물 또는 바이오 중합체 조성물의 존재 하에 상기 조성물 ㎠당 약 1×10² 내지 약 1×10⁷개의 세포를 제공하기에 충분한 양으로 배양된다. 예를 들어, 세포는 조성물 ㎠당 약 1×10³ 내지 약 1×10⁶개의 세포를 제공하기에 충분한 양으로 배양된다. 또 다른 예에서, 세포는 ㎠당 약 1×10⁴ 내지 약 1×10⁶개의 세포, 또는 ㎠당 약 5×10⁴ 내지 약 1×10⁶개의 세포, 또는 ㎠당 약 5×10⁴ 내지 약 5×10⁵개의 세포, 또는 ㎠당 약 1×10⁵ 내지 약 5×10⁵개의 세포를 제공하기에 충분한 양으로 배양된다.

하나의 실시형태에서, 눈은 ㎠당 적어도 약 1×10²개의 세포를 포함하는 치료 조성물과 접촉된다. 예를 들어, 눈은 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10³개의 세포, 예를 들어 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10⁴개의 세포, 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10⁵개의 세포, 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10⁶개의 세포, 또는 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10⁷개의 세포를 포함하는 치료 조성물과 접촉된다. 다른 예에서, 눈은 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10³개의 세포 내지 조성물 ㎠당 약 1×10⁶개의 세포를 포함하는 치료 조성물과 접촉된다. 또 다른 예에서, 눈은 ㎠당 적어도 약 1×10⁴ 내지 약 1×10⁶개의 세포, 또는 ㎠당 약 5×10⁴ 내지 약 1×10⁶개의 세포, 또는 ㎠당 약 5×10⁴ 내지 약 5×10⁵개의 세포, 또는 ㎠당 약 1×10⁵ 내지 약 5×10⁵개의 세포를 포함하는 치료 조성물과 접촉된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게서 안구 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

하나 이상의 활성제를 포함하는, 본 명세서에서 기술되는 생체적합성 조성물을 제공하는 단계,

상기 하나 이상의 활성제를 대상체에 전달할 수 있도록 상기 생체적합성 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게서 안구 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

하나 이상의 줄기 세포를 포함하는, 본 명세서에서 기술되는 생체적합성 조성물을 제공하는 단계,

상기 하나 이상의 줄기 세포를 대상체에 전달할 수 있도록 상기 생체적합성 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 생체적합성 조성물은 대상체의 눈에 투여된다. 예를 들어, 생체적합성 조성물은, 예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 외과적 방법들 중 하나를 포함하여 대상체의 눈에 외과적으로 투여된다.

하나의 실시형태에서, 안구 장애는 하나 이상의 줄기 세포와 같은 하나 이상의 세포의 결핍과 관련된다.

하나의 실시형태에서, 안구 장애는 림발 줄기 세포 결핍(LSCD) 또는 관련 장애를 포함한다. 다른 실시형태에서, 안구 장애는 연령 관련 황반 변성(ARMD) 또는 관련 장애와 같은 황반 변성을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 안구 장애는 유전성 망막 질환(IRD) 또는 관련 장애를 포함한다.

추가의 실시형태에서, 치료 조성물은 적어도 하나의 림발 줄기 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 적어도 하나의 간질 줄기 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 적어도 하나의 망막 색소 상피 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 적어도 하나의 전능 줄기 세포, 적어도 하나의 만능 줄기 세포, 또는 적어도 하나의 다능 줄기 세포 중 하나 이상을 포함한다.

추가의 실시형태에서, 치료 조성물은 본 명세서에서 기술되는 조성물로부터 형성되는 박막 필름을 포함한다.

다양한 실시형태에서, 대상체에 투여 시, 생체적합성 조성물은 약 1×10² 내지 약 1×10⁸개의 세포를 포함한다. 예를 들어, 충분한 생체적합성 조성물은 대상체의 눈에 약 1×10² 내지 약 1×10⁸개의 세포를 제공하도록 투여된다. 특정 실시형태에서, 생체적합성 조성물은 조성물 ㎠당 약 1×10²개의 세포를 제공하도록 투여된다. 예를 들어, 생체적합성 조성물은 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10³개의 세포, 예를 들어 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10⁴개의 세포, 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10⁵개의 세포, 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10⁶개의 세포, 또는 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10⁷개의 세포를 제공하도록 투여된다. 다른 예에서, 생체적합성 조성물은 조성물 ㎠당 적어도 약 1×10³개의 세포 내지 조성물 ㎠당 약 1×10⁶개의 세포를 제공하도록 투여된다. 또 다른 예에서, 생체적합성 조성물은 ㎠당 적어도 약 1×10⁴ 내지 약 1×10⁶개의 세포, 또는 ㎠당 약 5×10⁴ 내지 약 1×10⁶개의 세포, 또는 ㎠당 약 5×10⁴ 내지 약 5×10⁵개의 세포, 또는 ㎠당 약 1×10⁵ 내지 약 5×10⁵개의 세포를 제공하도록 투여된다.

하나의 실시형태에서, 투여는 안구 표면에 대한 것이다. 하나의 실시형태에서, 생체적합성 조성물은 하나 이상의 세포의 전이를 허용하기에 충분한 기간 동안 안구 표면에 부착된 상태를 유지하기에 충분한 안구 표면에 대한 접착성을 갖는 본 명세서에서 기술되는 접착제 조성물이다. 일 예에서, 조성물의 투여는 임의의 추가적인 점착제 또는 접착제의 적용을 포함하지 않는다. 예를 들어, 조성물의 투여는 봉합을 포함하지 않는다.

따라서, 하나의 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체에게서 안구 장애를 치료하는 방법은:

하나 이상의 림발 줄기 세포, 하나 이상의 간질 줄기 세포, 하나 이상의 망막 색소 상피 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 본 명세서에서 기술되는 생체적합성 조성물을 제공하는 단계;

상기 하나 이상의 줄기 세포를 대상체의 눈에 전달할 수 있도록 상기 생체적합성 조성물을 대상체의 눈에 투여하는 단계를 포함한다.

추가의 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체에게서 안구 장애를 치료하는 방법은:

하나 이상의 전능 줄기 세포, 하나 이상의 만능 줄기 세포, 하나 이상의 다능 줄기 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 본 명세서에서 기술되는 생체적합성 조성물을 제공하는 단계;

상기 하나 이상의 줄기 세포를 대상체의 눈에 전달할 수 있도록 상기 생체적합성 조성물을 대상체의 눈에 투여하는 단계를 포함한다.

본 명세서에서 기술되는 임의의 실시형태는 본 명세서에서 제공되는 임의의 양태와 관련될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 조성물은 접착제 조성물, 겔 조성물, 또는 박막 필름 조성물이다.

일 예에서, 접착제 조성물은 수술용 접착제이다.

일 예에서, 겔 조성물은 외과적 사용 및/또는 약물 전달을 위한 콘택트 렌즈를 포함하는 콘택트 렌즈이거나 이를 포함한다.

일 예에서, 겔 조성물은 2D 또는 3D 세포 배양 및/또는 조직 성장 또는 조직 공학을 위한 기질로서 포함하는 세포 접착, 배양, 또는 성장을 위한 것이다.

일 예에서, 박막 필름 조성물은 세포 접착, 배양, 또는 성장을 위한 기질, 또는 세포 수송 또는 전달을 위한 기질이다.

다른 예에서, 박막 필름 조성물은 포장용이다.

다양한 실시형태에서, 하나 이상의 크리스탈린 단백질은 척추동물의 눈 조직으로부터 단리 및/또는 정제된 크리스탈린 단백질이다.

하나의 실시형태에서, 하나 이상의 크리스탈린 단백질은 재조합 크리스탈린 단백질이다.

다양한 실시형태에서, 하나 이상의 크리스탈린 단백질은 α-크리스탈린, β-크리스탈린, γ-크리스탈린, 및 이들 중 임의의 둘 이상의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 크리스탈린 단백질이다. 일 예에서, α-크리스탈린 단백질은 αA-크리스탈린이다. 일 예에서, α-크리스탈린 단백질은 αB-크리스탈린이다.

다양한 실시형태에서, 하나 이상의 크리스탈린 단백질의 고유 2차 구조가 유지되고, 하나 이상의 크리스탈린 단백질의 고유 3차 구조가 유지되고/거나, 하나 이상의 크리스탈린 단백질의 고유 4차 구조가 유지된다. 예를 들어, 하나 이상의 크리스탈린 단백질은 나노피브릴 또는 다른 교란된 구조 형태가 실질적으로 없다.

다양한 실시형태에서, 조성물 중에 존재하는 크리스탈린 단백질의 적어도 일부는 고유적으로 글리코실화된다 - 즉, 그것이 유래, 단리 또는 정제되는 유기체에 존재할 때 동일한 크리스탈린의 글리코실화 패턴 및 정도에 필적하는 글리코실화 패턴 및 정도를 갖는다.

다양한 실시형태에서, 예를 들어 본 명세서에서 기술되는 박막 필름 조성물 중에 존재할 때, 가소제는 다가 알코올, 산의 디에스테르 또는 트리에스테르, 알코올의 디에스테르 또는 트리에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 및 이들 중 임의의 둘 이상의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.

하나의 실시형태에서, 다가 알코올은 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 소르비톨, 및 말티톨을 포함하는 군으로부터 선택된다.

일 예에서, 가소제는 글리세롤, 소르비톨, 또는 이들의 조합이다.

하나의 실시형태에서, 산의 디에스테르 또는 트리에스테르는 트리에틸 시트레이트(TEC), 트리부틸 시트레이트(TBC), 아세틸 트리에틸 시트레이트(ATEC), 디부틸 세바케이트(DBS), 디에틸 프탈레이트(DEP), 및 디부틸 프탈레이트(DBP)를 포함하는 군으로부터 선택된다.

하나의 실시형태에서, 알코올의 디에스테르 또는 트리에스테르는 트리아세틴(TA), 식물성 오일, 분별화 코코넛 오일, 및 아세틸화 모노글리세리드를 포함하는 군으로부터 선택된다.

하나의 실시형태에서, 조성물은 약 0.5% w/w 내지 약 3% w/w의 가소제를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 0.5% w/w 내지 약 2.5% w/w의 가소제, 약 1% w/w 내지 약 2.5% w/w의 가소제, 약 1.5% w/w 내지 약 2.5% w/w의 가소제, 또는 약 2% w/w의 가소제를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 예를 들어 본 명세서에서 기술되는 박막 필름 조성물 중에 존재할 때, 공개시제는 생체적합성 3차 아민계 공개시제, 예를 들어 TEAOH, L-아르기닌 등이다.

하나의 실시형태에서, 조성물은 약 0.5% w/w 내지 약 5% w/w의 공개시제를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 0.5% w/w 내지 약 4% w/w의 공개시제, 약 1% w/w 내지 약 4% w/w의 공개시제, 약 1.5% w/w 내지 약 3% w/w의 공개시제, 또는 약 2% w/w의 공개시제를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 가교결합제는 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(PEGDE), 글루타르알데히드, 리보플라빈, 리보플라빈-5-모노포스페이트, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA), 및 이들 중 둘 이상의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.

하나의 실시형태에서, 가교결합제는 광가교결합제이다. 예를 들어, 광가교결합제는 2-하이드록시-1-[4-(2-하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논(Irgacure® 2959); 1-하이드록시사이클로헥실-1-페닐 케톤(Irgacure® 184), 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(Irgacure® 651), 리보플라빈, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP), 에오신 Y(EY) 및 트리에탄올아민(TEOA), 제네핀, NHS-EDC, NHS-PEG를 포함하는 변성 PEG, 및 이들 중 둘 이상의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.

하나의 실시형태에서, 조성물은 약 0.1% w/w 내지 약 1.5% w/w의 가교결합제, 예를 들어 리보플라빈 또는 리보플라빈-5-모노포스페이트를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 0.1% w/w 내지 약 1% w/w의 가교결합제, 약 0.1% w/w 내지 약 0.8% w/w의 가교결합제, 약 0.1% w/w 내지 약 0.6% w/w의 가교결합제, 약 0.1% w/w 내지 약 0.5% w/w의 가교결합제, 약 0.1% w/w 내지 약 0.4% w/w의 가교결합제, 약 0.1% w/w 내지 약 0.3% w/w의 가교결합제, 약 0.1% w/w 내지 약 0.2% w/w의 가교결합제, 또는 약 0.2% w/w의 가교결합제를 포함한다.

하나의 실시형태에서, 조성물은 약 0.5% w/w 내지 약 3% w/w의 가교결합제, 예를 들어 PEGDE 또는 글루타르알데히드를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 0.5% w/w 내지 약 2.5% w/w의 가교결합제, 약 1% w/w 내지 약 3% w/w의 가교결합제, 약 1% w/w 내지 약 2.5% w/w의 가교결합제, 약 1% w/w 내지 약 3% w/w의 가교결합제, 약 1.5% w/w 내지 약 2.5% w/w의 가교결합제, 또는 약 2.5% w/w의 가교결합제를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 조성물은 약 3% w/w 내지 약 30% w/w의 가교결합제, 예를 들어 PEGDA를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 5% w/w 내지 약 30% w/w의 가교결합제, 약 5% w/w 내지 약 25% w/w의 가교결합제, 약 10% w/w 내지 약 30% w/w의 가교결합제, 약 10% w/w 내지 약 25% w/w의 가교결합제, 약 15% w/w 내지 약 30% w/w의 가교결합제, 약 15% w/w 내지 약 25% w/w의 가교결합제, 약 20% w/w 내지 약 25% w/w의 가교결합제, 또는 약 20% w/w의 가교결합제를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 조성물은 약 10 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 크리스탈린 단백질을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 30 mg/mL 내지 약 150 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 30 mg/mL 내지 약 140 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 30 mg/mL 내지 약 130 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 30 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 30 mg/mL 내지 약 110 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 30 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 30 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 30 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 30 mg/mL 내지 약 70 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 또는 약 30 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 크리스탈린 단백질을 포함한다.

다양한 실시형태에서, 예를 들어 접착제 조성물에 관한 실시형태에서, 조성물은 약 30 mg/mL 내지 약 150 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 예를 들어 약 30 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 30 mg/mL 내지 약 110 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 내지 약 110 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 약 90 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 내지 약 70 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 또는 약 60 mg/mL의 크리스탈린 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 예를 들어 접착제 조성물에 관한 실시형태에서, 조성물은 약 40 mg/mL 내지 약 150 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 예를 들어 약 50 mg/mL 내지 약 150 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 60 mg/mL 내지 약 150 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 70 mg/mL 내지 약 150 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 80 mg/mL 내지 약 150 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 80 mg/mL 약 140 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 80 mg/mL 내지 약 130 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 80 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 90 mg/mL 내지 약 130 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 90 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 100 mg/mL 내지 약 130 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 100 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 110 mg/mL 내지 약 130 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 110 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 또는 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질을 포함한다.

다양한 실시형태에서, 예를 들어 겔 조성물에 관한 실시형태에서, 조성물은 약 10 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 예를 들어 약 10 mg/mL 내지 약 110 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 10 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 10 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 10 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 20 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 30 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 또는 약 40 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질을 포함한다.

다양한 실시형태에서, 예를 들어 박막 필름 조성물을 포함하는 필름 조성물에 관한 실시형태에서, 조성물은 약 50 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 예를 들어 약 50 mg/mL 내지 약 110 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 내지 약 70 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 또는 약 60 mg/mL의 크리스탈린 단백질을 포함한다.

이에 국한되는 것은 아니지만 박막 필름 조성물과 같은 특정의 특히 고려되는 실시형태에서, 조성물은 약 100 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 5 mM 내지 약 10 mM의 글루타르알데히드, 및 약 1.5% w/w 내지 약 2.5% w/w의 글리세롤을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 5 mM 내지 약 10 mM의 글루타르알데히드, 및 약 2% w/w의 글리세롤을 포함한다.

하나의 특히 고려되는 예에서, 조성물은 약 60 mg/mL의 크리스탈린, 약 2%(v/v) 글리세롤, 및 약 2.5%(w/v)의 PEGDE를 포함하는 박막 필름 조성물이다. 일 예에서, 상기 박막 필름 조성물은 패키징 용도에 사용하기에 특히 적합하다.

또 다른 특히 고려되는 예에서, 조성물은 약 60 mg/mL의 크리스탈린, 약 2%(v/v)의 글리세롤, 및 약 5 mM의 GA를 포함하는 박막 필름 조성물이다. 일 예에서, 상기 박막 필름 조성물은 세포 배양 용도에 사용하기에 특히 적합하다.

또 다른 특히 고려되는 예에서, 조성물은 약 60 mg/mL의 크리스탈린, 약 2%(v/v)의 글리세롤, 약 0.2%(w/w 크리스탈린)의 리보플라빈-5-포스페이트, 및 선택적으로 약 0.4%(w/w 크리스탈린)의 L-아르기닌을 포함하는 박막 필름 조성물이다.

이에 국한되는 것은 아니지만 접착제 조성물과 같은 특정의 특히 고려되는 실시형태에서, 조성물은 약 100 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 10% w/w 내지 약 20% w/w의 PEGDA, 및 약 0.2% w/w 내지 약 1.0% w/w의 광개시제, 예를 들어 Igracure 2959와 같은 Igracure를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 15% w/w의 PEGDA, 및 약 0.5% w/w의 Igracure 2959를 포함한다.

특정의 특히 고려되는 실시형태에서, 조성물은 약 50 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 10% w/w 내지 약 20% w/w의 PEGDA, 및 약 0.2% w/w 내지 약 1.0% w/w의 광개시제, 예를 들어 Igracure 2959와 같은 Igracure를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 60 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 15% w/w의 PEGDA, 및 약 0.5% w/w의 Igracure 2959를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 조성물은 약 50 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 25% w/w 내지 약 50% w/w의 PEGDA, 약 0.2% 내지 약 1.0% w/w의 광개시제, 예를 들어 리보플라빈, 및 10% w/w 내지 20% w/w의 공개시제, 예를 들어 L-아르기닌을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 60 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 50% w/w의 PEGDA, 약 0.2%의 리보플라빈, 및 약 10%의 L-아르기닌을 포함한다.

다양한 실시형태에서, 가교결합된 조성물은 가시 스펙트럼 범위에 걸쳐 광학적으로 투명하다. 예를 들어, 가교결합된 조성물은 약 75% 초과, 예를 들어, 약 80% 초과, 또는 약 85% 초과의 가시광선 스펙트럼 범위(400 nm 내지 700 nm)에 걸친 광 투과율을 갖는다. 광학적 투명도 및/또는 높은 투과율, 예를 들어 가시 스펙트럼 범위에 걸친 높은 투과율은 본 명세서에서 고려되는 박막 필름 조성물, 접착제 조성물, 및 겔 조성물 모두에 유리할 것임을 이해할 것이다.

다양한 실시형태에서, 가교결합된 조성물은 약 1 MPa 내지 약 6 MPa의 탄성 모듈러스를 갖는다. 예를 들어, 가교결합된 조성물은 약 1.5 MPa 내지 약 6 MPa, 또는 약 1.6 MPa 내지 약 6 MPa, 예를 들어 약 1.6 MPa 내지 약 5.6 MPa의 탄성 모듈러스를 갖는다.

다양한 실시형태에서, 가교결합된 조성물은 약 0.1 MPa 내지 약 1.5 MPa의 극한 인장 강도(UTS: Ultimate Tensile Strength)를 갖는다. 예를 들어, 가교결합된 조성물은 약 0.1 MPa 내지 약 1 MPa, 또는 약 0.3 MPa 내지 약 1 MPa의 UTS를 갖는다.

다양한 실시형태에서, 가교결합된 조성물은 약 0.1 MPa 내지 약 1 MPa의 0.2% 항복 강도를 갖는다.

다양한 실시형태에서, 약 100 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 5 mM 내지 약 10 mM의 글루타르알데히드, 및 약 2%의 글리세롤을 포함하는, 본 명세서에서 기술되는 조성물로부터 형성되는 박막 필름은:

i) 약 10 Mpa 내지 약 20 Mpa의 탄성 모듈러스;

ii) 약 0.5 Mpa 내지 약 1.2 Mpa의 UTS;

iii) 약 0.2 Mpa 내지 약 0.8 Mpa의 0.2% 항복 강도;

iv) 상기 i) 내지 iii) 중 둘 이상을 갖는다.

다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 기술되는 조성물로부터 형성되는 박막 필름은:

i) 약 0.5 Mpa 내지 약 4.0 Mpa의 탄성 모듈러스;

ii) 약 0.1 Mpa 내지 약 1.0 Mpa의 UTS;

iii) 약 0.01 Mpa 내지 약 0.5 Mpa의 0.2% 항복 강도;

iv) 상기 i) 내지 iii) 중 둘 이상을 갖는다.

다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 기술되는 2종 이상의 조성물은 조합으로 사용된다. 예를 들어, 특히 고려되는 실시형태에서, 본 명세서에서 기술되는 접착제 조성물은, 예를 들어 안과적 수술과 같은 외과적 적용에 적합한 박막 필름-접착제 조성물을 제공하기 위해 본 명세서에서 기술되는 조성물로부터 형성되는 박막 필름에 적용된다.

본 명세서에서 개시되는 수치의 범위(예를 들어, 1 내지 10)에 대한 언급은 또한 해당 범위 내의 모든 유리수(예를 들어, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10) 및 또한 해당 범위 내의 유리수의 모든 범위(예를 들어, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5 및 3.1 내지 4.7)에 대한 언급을 포함하는 것으로 의도된다.

본 발명의 다른 목적, 양태, 특징 및 이점들은 하기 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 예들은 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내지만, 본 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변경 및 수정이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문에, 단지 예시로서 제공되는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 실시예 2: a) 15분 균질화를 사용하여 추출된 크리스탈린 및 b) 35분 균질화를 사용하여 추출한 다음 투석된 크리스탈린에서의 본 명세서에서 기술되는 반정제된 크리스탈린 샘플의 SDS-PAGE를 나타낸다. 샘플은 겔 상에 로딩하기 전에 완충액 및 Milli-Q를 사용하여 각각 1:100 비율로 희석하였다.
L = 래더(ladder)(좌변에 kDa로 표시된 분자량), C = 조 크리스탈린 추출물.
도 2는 세 가지 상이한 소스 모두에서 상이한 등급/하위 등급의 크리스탈린 단백질인 α, β, 및 γ의 존재를 나타내는, 상이한 종에서 추출된 크리스탈린의 SDS-PAGE를 나타내며, 여기서 a) 호키 수정체, b) 인간 수정체, c) 돼지 수정체, 및 CE는 조 추출물이다.
도 3은 실시예 2에 기술된 바와 같이 추출된 조 크리스탈린 단백질의 크기 배제 분리를 나타낸다. 피크 분획은 전체 α(적색), β(청색), 및 γ(녹색) 크리스탈린에 해당한다.
도 4는 실시예 2에 기술된 바와 같이 상이한 소스 a) 호키 수정체, b) 인간 수정체, 및 c) 돼지 수정체로부터 추출된 크리스탈린 단백질의 크기 배제 크로마토그램이다.
도 5는 본 명세서의 실시예 2에 기술된 바와 같은 재조합 인간 α-크리스탈린의 SDS-PAGE이다. SDS-PAGE는 정제된 α-크리스탈린의 크기가 20 kDa의 그의 예상 크기와 일치함을 보여주었다.
도 6은 (a) 다니오 레리오(Danio rerio) 및 호모 사피엔스로부터 유래된 αB-크리스탈린 단백질, (b) 다니오 레리오 및 호모 사피엔스로부터 유래된 βA4-크리스탈린 단백질, (c) 호모 사피엔스, 보스 타우루스(Bos taurus) 및 다니오 레리오로부터 유래된 γB-크리스탈린 단백질의 3가지 아미노산 서열 정렬이다.
도 7은 여러 척추동물 αA-크리스탈린 오르토로그(orthologue)의 아미노산 서열 정렬이다(Runkle et al., 2002). 별표는 제브라피시 서열과 동일한 아미노산을 나타낸다. 점선은 정렬을 최적화하기 위해 도입된 간격을 나타낸다.
도 8은 여러 척추동물 αB-크리스탈린 오르토로그의 아미노산 서열 정렬이다(Posner et al., 1999). 별표는 제브라피시 서열과 동일한 아미노산을 나타낸다. 점선은 정렬을 최적화하기 위해 도입된 간격을 나타낸다.
도 9는, 본 명세서의 실시예 2에 기술된 바와 같이, 호키 피시 수정체로부터의 조 크리스탈린 추출물의 원형 이색성 스펙트럼이다. 분명하게 보이는 것은 217 nm에 중심을 둔 최소값이며, 이는 크리스탈린의 β-시트 구조를 나타낸다.
도 10은, 본 명세서의 실시예 2에 기술된 바와 같이, 호키 피시 수정체로부터의 조 크리스탈린 추출물의 FTIR 흡광도 스펙트럼이다. 1631 cm^-1에서 유의적 피크를 보이며, 이는 β-시트 구조를 나타낸다.
도 11은, 본 명세서의 실시예 3에 기술된 바와 같이, TCEP-유도 응집에 대한 크리스탈린 추출물에 의한 리소자임의 샤프론 유사 보호의 분석값을 도시하는 그래프이다.
도 12는, 본 명세서의 실시예 3에 기술된 바와 같이, 호키 피시 수정체로부터의 조 크리스탈린 추출물의 생체적합성을 확인하기 위한 세포의 LIVE/DEAD 염색의 대표적인 이미지를 나타낸다. 대조군 세포(크리스탈린의 부재), 및 정제된 α, β, 및 γ-크리스탈린 분획(10 mg/mL)의 존재 하에 성장한 세포의 이미지가 나타나 있다.
도 13은, 본 명세서의 실시예 3에 기술된 바와 같이, 호키 피시 수정체로부터의 조 크리스탈린 추출물이 세포 증식에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 삼중 샘플을 사용한 3 세트의 실험에서 얻은 평균의 표준 편차를 나타낸다.
도 14는, 본 명세서의 실시예 3에 기술된 바와 같이, 산화 스트레스에 대한 호키 피시 수정체로부터의 조 크리스탈린 추출물의 보호 효과를 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 삼중 샘플을 사용한 3 세트의 실험에서 얻은 평균의 표준 편차를 나타낸다.
도 15는, 실시예 5에 기술된 바와 같이, 억제력의 MPa로서 표시되는 박막 필름 조성물의 상부 인장 강도(UTS)를 도시하는 그래프이다. 별표는 0.05(*), 0.01(**), 및 0.01(***)의 P-값 임계값을 나타낸다.
도 16은, 본 명세서의 실시예 5에 기술된 바와 같이, 박막 필름 조성물의 영 모듈러스(탄성 모듈러스) 값을 도시하는 그래프이다. 별표는 0.05(*), 0.01(**), 및 0.01(***)의 P-값 임계값을 나타낸다.
도 17은, 본 명세서의 실시예 5에 기술된 바와 같이, 박막 필름 조성물의 신장 값을 도시하는 그래프이다. 별표는 0.05(*), 0.01(**), 및 0.01(***)의 P-값 임계값을 나타낸다.
도 18은, 본 명세서의 실시예 5에 기술된 바와 같이, UV 경화를 통해 수득되는 크리스탈린 하이드로겔의 팽윤 거동을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 삼중 샘플에서 얻은 평균의 표준 편차를 나타낸다.
도 19는, 본 명세서의 실시예 6에 기술된 바와 같이, 대표적인 박막 필름 조성물에 의해 지지되는 항-알파 튜불린 및 DAPI 염색으로 표지된 세포의 세포 부착 및 증식을 나타낸다. 모든 눈금 막대는 50㎛이며, I 및 III 행에서는 20×, 그리고 II 및 IV 행에서는 63×로 시각화된다. A - F는 각막-찰과상 세포주(corneal-scrape cell line) 1을 시딩하였다. G - L은 각막-찰과상 세포주 2를 시딩하였다.
도 20은, 본 명세서의 실시예 6에 기술된 바와 같이, P3에서 인간 각막 상피 세포의 DAPI 염색을 나타낸다. 필름 제형 F2(A-C), F3(D-F), F4(G-I), 및 TCP 대조군(J-L). 시점 0일(A, D, G, J), 7일(B, E, H, K), 14일(C, F, I, L). 이미지 크기 14.0 mm×15.0 mm.
도 21은, 본 명세서의 실시예 6에 기술된 바와 같이, 인간 각막 상피 세포의 DAPI 핵 염색에 의해 시각화된, 크리스탈린 필름의 생체적합성을 나타내는 9개의 사진이다. 필름 제형, 위에서 아래로 F2, F3 및 F4. 좌측에서 우측으로: 0일/부착성, 7일, 14일. 5배 줌, 전체 타일(full tile), 실선으로 표시된 13 mm 커버슬립, 점선으로 표시된 캐스트 필름의 가장자리.
도 22는, 본 명세서의 실시예 6에 기술된 바와 같이, 크리스탈린 필름의 생체적합성을 나타내는 3개의 그래프이다. 0일(부착), 7일 및 14일째의 크리스탈린 필름, 및 조직 배양 플라스틱 대조군에 대한 세포 수의 배수 증가, 여기서 회색 - F2, 청색 - F3, 암회색 - F4, 및 담청색은 조직 배양 플레이트이다.
도 23은, 본 명세서의 실시예 7에 기술된 바와 같이, 박막 필름 조성물에 대한 시딩한 날과 동일한 날에 대한 세포 부착의 광현미경 시각화를 나타내는 6개의 사진이다. 모든 눈금 막대 200㎛. 윗줄, 제1 패널, F1; 윗줄, 제2 패널, F2; 윗줄, 제3 패널, F3; 아랫줄, 제1 패널, F4; 아랫줄, 제2 패널, F5; 아랫줄, 제3 패널, F6.
도 24는, 본 명세서의 실시예 8에 기술된 바와 같이, 연장된 세포 배양 기간 동안 박막 필림 조성물 상에서의 세포 성장을 시각화하는 4 세트의 사진이며, 여기서 (a) F2, (b) F3, (c) F4, 및 (d) 음성 유리 대조군이다. 눈금 막대 = 50 um.
도 25는, 본 명세서의 실시예 9에 기술된 바와 같이, 대표적인 박막 필름 제형 상에서의 림발 외식편(공여체 2) 세포 성장을 나타내는 4개의 사진이다. (A) 7일째, (B) 11일째 및 (C) 14일째에 라이브 세포 이미징. (D) 14일째에 고정된 외식편 배양에 대해 DAPI로 표지된 비멘틴(적색) 및 세포 핵의 면역 조직화학적 표지화의 형광 시각화. 눈금 막대 = 200㎛.
도 26은, 본 명세서의 실시예 10에 기술된 바와 같이, 크리스탈린 박막 필름의 광학적 투명도를 도시하는 3개의 그래프이다. A) F2; B) F3; C) F4.
도 27은, 본 명세서의 실시예 10에 기술된 바와 같이, 크리스탈린 필름의 광학적 투명도를 도시하는 3개의 사진 및 그래프이다. 투명 필름을 나타내는 이미지, 여기서 (a) F2, (b) F3, 및 (c) F4; 그래프 - 수화되었을 때의 필름의 투과율. 회색 삼각형 - F2, 청색 원 - F3, 및 암회색 사각형 - F4. 오차 막대는 6개의 샘플에서 얻은 평균의 표준 편차를 나타낸다.
도 28은, 본 명세서의 실시예 11에 기술된 바와 같이, 상이한 PEG 유도체 및 가교결합제를 사용하는 크리스탈린의 페길레이션(PEGylation)을 나타내는 SDS-PAGE를 나타내는 것으로: L- 래더, 1 - 크리스탈린 단독, 2 - 크리스탈린 + PEG 디에틸렌(PEGDE), 3 - 크리스탈린 + 숙신이미딜 메틸렌 PEG(smPEG)를 37℃에서 배양하였다; 4,5,6 - 글루타르알데히드를 1시간 후에 샘플 1,2,3에 첨가한 다음, 실온에서 1시간 동안 배양하였다; 8,9,10 - 글루타르알데히드를 샘플 1,2,3에 즉시 첨가한 다음, 샘플을 각각 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
도 29는, 본 명세서의 실시예 12에 기술된 바와 같이, PEGDA + 크리스탈린 함유 하이드로겔의 투명도를 나타내는 사진이다. 위: PEGDA + irgacure 2959, 5분 UV 노출 후; 중간: PEGDA + irgacure 2959 + 크리스탈린 60 mg/mL, 5분 UV 노출 후; 아래: PEGDA + irgacure 2959 + 크리스탈린 120 mg/mL, 5분 UV 노출 후.
도 30은, 본 명세서의 실시예 12에 기술된 바와 같이, PEGDA 기반 크리스탈린 하이드로겔의 광학적 투명도를 나타내는 그래프이다.
도 31은, 본 명세서의 실시예 12에 기술된 바와 같이, PEGDA 기반 크리스탈린 하이드로겔의 FTIR 분석을 나타내는 그래프로서, PEGDA 단독(청색), 및 PEGDA 기반 크리스탈린 하이드로겔(흑색)을 나타낸다.
도 32는, 본 명세서의 실시예 13에 기술된 바와 같이, 크리스탈린 필름의 습윤성을 결정하기 위한 접촉각 측정의 대표적인 이미지를 나타낸다.
도 33은, 본 명세서의 실시예 13에 기술된 바와 같이, 크리스탈린 필름의 안정성을 나타내는 그래프이다. 회색 - F2, 청색 - F3, 및 암회색 - F4, 여기서 오차 막대는 6개의 샘플에서 얻은 평균의 표준 편차를 나타낸다.
도 34는, 본 명세서의 실시예 13에 기술된 바와 같이, 크리스탈린 필름의 멸균 결과를 나타내는 2개의 원형 이색성 스펙트로그램이다. a) F2 필름으로부터의 크리스탈린 단백질, 및 b) F3 필름으로부터의 크리스탈린 단백질, 여기서 실선은 24시간 동안 milliQ에서 배양된 필름을 나타내며, 점선은 24시간 동안 milliQ에서 배양된 감마 멸균 필름이다.
도 35는, 본 명세서의 실시예 13에 기술된 바와 같이, (a) 실온에서 3개월 동안 저장, (b) 감마 멸균, (c) 감마 조사 후 수화된 크리스탈린 필름 샘플의 대표적인 이미지를 나타낸다.
도 36은, 본 명세서의 실시예 14에 기술된 바와 같이, PEGDA 기반 크리스탈린 접착제의 접착 효능을 나타내는 2개의 사진이다. (a) 3분 노출 후 샘플 (i) PEGDA 단독, (ii) PEGDA 기반 크리스탈린; (b) 샘플을 물리적으로 연신(강제)하여 절개부를 다시 개방하였다.
도 37은, 본 명세서의 실시예 15에 기술된 바와 같이, (a) UV 경화, (b) 경화 전 및 후의 가시광선 경화에 대한 최적화된 제형의 시각화를 나타내는 3개의 사진이다.
도 38은, 본 명세서의 실시예 15에 기술된 바와 같이, 돼지 눈 접착 모델에서 PEGDA 기반 크리스탈린 접착제의 접착 효능을 나타내는 2개의 사진이다. (a) 절개부를 가진 눈 샘플, (b) 크리스탈린 하이드로겔 적용 및 3분 동안 UV 경화 후.
도 39는, 본 명세서의 실시예 15에 기술된 바와 같이, 돼지 눈 모델을 사용한 봉합 시험에서 확립된 크리스탈린 필름의 외과적 취급 용이성을 나타내는 3개의 사진이다.
도 40은, 본 명세서의 실시예 15에 기술된 바와 같이, 돼지 피부 샘플에 적용된 랩 전단 시험에서 결정된 UV 경화된 크리스탈린 바이오 접착제 제형의 접착 강도에 대한 데이터를 나타내는 사진 및 그래프이다. 위: 랩 전단 시험에 사용된 돼지 피부 접착 샘플의 대표적인 이미지. 아래: 문헌[Nakayama & Matsuda, 1999]에서 얻은 피브린 접착제 값과 비교한 UV 경화된 크리스탈린 바이오 접착제 제형의 접착 강도. 오차 막대는 6개의 샘플에서 얻은 평균의 표준 편차를 나타낸다.
도 41은, 본 명세서의 실시예 16에 기술된 바와 같이, F2 담체 필름 상의 림발 외식편으로부터의 탈세포화된 인간 각막을 사용하여 세포 담체로서 크리스탈린 필름의 효능을 나타내는 4개의 사진으로서, 여기서 (a) 무세포 대조군, (b) 배양된 세포의 상부에 배치된 각막, (c) 배양된 세포 아래에 배치된 각막, 및 (d) 10배 배율의 배양된 세포 아래에 배치된 각막이다. 눈금 막대 = 500㎛.
도 42는, 본 명세서의 실시예 17에 기술된 바와 같이, 단층 박막 필름의 약물 전달 특성을 나타내는 4개의 그래프이다. A) 230 nm에서 측정하였을 때의 PBS에서 방출된 % 약물; B) 271 nm에서 측정하였을 때의 PBS에서 방출된 % 약물; C) 230 nm에서 측정하였을 때의 PBS에서 방출된 약물의 용액 농도; D) 271 nm에서 측정하였을 때의 PBS에서 방출된 약물의 용액 농도.
도 43은, 본 명세서의 실시예 17에 기술된 바와 같이, 다층 박막 필름의 약물 전달 특성을 나타내는 4개의 그래프이다. A) 230 nm에서 측정하였을 때의 PBS에서 방출된 약물의 용액 농도; B) 230 nm에서 측정하였을 때의 PBS에서 방출된 % 약물; C) 271 nm에서 측정하였을 때의 PBS에서 방출된 약물의 용액 농도; D) 271 nm에서 측정하였을 때의 PBS에서 방출된 % 약물.
도 44는, 본 명세서의 실시예 18에 기술된 바와 같이, UV 경화를 통해 수득된 크리스탈린 하이드로겔로부터의 약물(테트라사이클린) 방출을 나타내는 그래프이다. 흑색선 데이터: 중합 동안 첨가된 테트라사이클린(즉, 새로운 겔)의 백분율로서 7일간에 걸친 테트라사이클린의 누적 방출. 회색선 데이터: 건조된 하이드로겔 내에 흡수된 테트라사이클린의 백분율로서 7일간에 걸친 테트라사이클린의 누적 방출. 오차 막대는 삼중 샘플에서 얻은 평균의 표준 편차를 나타낸다.

본 발명은 하나 이상의 크리스탈린 단백질을 포함하는 생체적합성 물질, 및 치료 및 과학적 방법의 범위를 포함한 그의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 생체적합성 조성물의 생산 방법을 포함한 생체적합성 조성물, 및 수술, 세포 기반 요법 및 방법, 및 약물 전달에서와 같은 그의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 안과적 치료에 특히 적합한 조성물, 접착제, 하이드로겔, 및 임플란트를 포함하는 생체적합성 접착제, 하이드로겔, 박막 필름, 및 임플란트와 같은 생체적합성 조성물의 제조에 있어서 하나 이상의 크리스탈린 단백질의 용도에 관한 것이다.

다양한 실시형태에서, 본 발명은: 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단리, 정제, 재조합 또는 합성 단백질:

a) α-크리스탈린;

b) β-크리스탈린;

c) γ-크리스탈린;

d) 호키(마크루로누스 노바에젤란디아에)로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;

e) 호모 사피엔스로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;

f) 본 명세서의 표 1에서 확인되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

g) 상기 a) 내지 f) 중 어느 하나로부터의 적어도 약 10개의 연속 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드;

h) 상기 a) 내지 g) 중 어느 하나에 대해 적어도 약 90%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질;

i) 생체 내에서 크리스탈린 단백질의 고유 구조를 갖는 상기 a) 내지 h) 중 어느 하나에 따른 단백질;

j) 상기 a) 내지 i) 중 둘 이상의 임의의 조합;

선택적으로 하나 이상의 가소제; 및

하나 이상의 가교결합제를 포함하는 생체적합성 조성물에 관한 것이다.

이러한 조성물에 대한 광범위한 용도가 존재한다. 그럼에도 불구하고, 당업자에게 명백한 바와 같이, 이러한 설명의 초점은 이러한 조성물의 치료 및 연구 용도이다.

정의

용어 "접착제 조성물" 및 관련 용어는 둘 이상의 표면 또는 개별 품목을 함께 결합할 수 있고 적어도 어느 정도 분리에 저항할 수 있는 접착제이거나 이를 형성할 수 있는 조성물을 지칭한다. 본 명세서에서 특히 고려되는 것은 수술시에, 즉, 수술용 접착제로서 사용하기 위한 접착제 조성물이다.

용어 "아미노산"은 천연 아미노산, 비천연(non-natural) 아미노산, 및 아미노산 유사체를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 용어 "아미노산"은 각각의 구조가 D 및 L 입체이성체 형태를 허용하는 경우 이러한 입체이성체 둘 다를 포함한다.

천연 아미노산으로는 알라닌(Ala 또는 A), 아르기닌(Arg 또는 R), 아스파라긴(Asn 또는 N), 아스파르트산(Asp 또는 D), 시스테인(Cys 또는 C), 글루타민(Gin 또는 Q), 글루타민산(Glu 또는 E), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소류신(He 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 라이신(Lys 또는 K), 메티오닌(Met 또는 M), 페닐알라닌(Phe 또는 F) 프롤린(Pro 또는 P), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 트립토판(Tip 또는 W), 티로신(Tyr 또는 Y) 및 발린(Val 또는 V)을 포함한다.

비천연 아미노산으로는 아제티딘카복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 나프틸알라닌("naph"), 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵타노산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 3차-부틸글리신("tBuG"), 2,4-디아미노이소부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸 글리신, N-에틸아스파라긴, 호모프롤린("hPro" 또는 "homoP"), 하이드록시라이신, 알로-하이드록시라이신, 3-하이드록시프롤린("3Hyp"), 4-하이드록시프롤린("4Hyp"), 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸알라닌("MeAla" 또는 "Nime"), N-메틸글리신을 포함한 N알킬글리신("NAG"), N-메틸이소류신, N-메틸펜틸글리신을 포함한 N-알킬펜틸글리신("NAPG"), N-메틸발린, 나프틸알라닌, 노르발린("Norval"), 노르류신("Norleu"), 옥틸글리신("OctG"), 오르니틴("Orn"), 펜틸글리신("pG" 또는 "PGly"), 피페콜산, 티오프롤린( "ThioP" 또는 "tPro"), 호모라이신("hLys"), 및 호모아르기닌("hArg")을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.

용어 "아미노산 유사체"는 C-말단 카복시기, N-말단 아미노기 및 측쇄 작용기 중 하나 이상이 가역적으로 또는 비가역적으로 화학적으로 차단되거나, 그렇지 않으면 다른 작용기로 변형되는 천연 또는 비천연 아미노산을 지칭한다. 예를 들어, 아스파르트산-(베타-메틸 에스테르)는 아스파르트산의 아미노산 유사체이고; N-에틸글리신은 글리신의 아미노산 유사체이거나; 또는 알라닌 카복스아미드는 알라닌의 아미노산 유사체이다. 다른 아미노산 유사체는 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 설폰, S-(카복시메틸)-시스테인, S-(카복시메틸) 시스테인 설폭사이드 및 S-(카복시메틸)-시스테인 설폰을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산의 단쇄 중합체(short polymer)를 지칭한다. 다른 아미노산 중합체(예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 등)와 대조적으로, 펩티드는 일반적으로 길이에서 약 50개 이하의 아미노산이다. 펩티드는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 펩티드는 자연 발생성 단백질의 부분 서열(subsequence) 또는 합성 서열을 포함하는 비천연 서열일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "합성 펩티드"는 천연 펩티드 및/또는 단백질에서 발견되는 것과 구별되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "합성 펩티드"는 임의의 적합한 방법(예를 들어, 재조합 발현, 화학적 합성, 효소적 합성, 등)에 의해 생성되거나 또는 합성될 수 있다.

용어 "펩티드 모방체(peptide mimetic)" 또는 "펩티도 모방체(peptidomimetic)"는 단백질 또는 펩티드로부터 유래되는 서열을 모방(emulate)하는 펩티드-유사 분자를 지칭한다. 펩티드 모방체 또는 펩티도 모방체는 아미노산 및/또는 비-아미노산 성분을 함유할 수 있다. 펩티도 모방체의 예로는 화학적으로 변형된 펩티드, 펩토이드(측기(side group)는 α-탄소가 아닌 펩티드 골격의 질소 원자에 부착됨), β-펩티드(아미노기는 α-탄소보다는 β-탄소에 결합됨), 등을 포함한다. 화학적 변형(Chemical modification)은 아미노산 측기, α-탄소 원자, 말단 아민기, 또는 말단 카복시기에서의 하나 이상의 변형을 포함한다. 화학적 변형은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하거나, 새로운 결합을 생성하거나, 또는 화학적 모이어티를 제거하는 것일 수 있다. 아미노산 측기에서의 변형은 라이신 ε-아미노기의 아실화, 아르기닌, 히스티딘, 또는 라이신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산 카복실산기의 알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산 측기 카복실기를 사용한 라이신 ε-아미노기의 고리화(cyclization)를 통한 락탐 형성, (예를 들어, 알파-나선 구조(alpha-helix conformation)를 안정화하기 위한) 탄화수소 "스테이플링(stapling)", 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아미드화를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 말단 아민기의 변형은 데사미노, N-저급 알킬, N-디-저급 알킬, 구속 알킬(예를 들어, 분지형, 환형, 융합형, 아다만틸) 및 N-아실 변형을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 말단 카복시기의 변형은 아미드, 저급 알킬 아미드, 구속 알킬(예를 들어, 분지형, 환형, 융합형, 아다만틸) 알킬, 디알킬 아미드, 및 저급 알킬 에스테르 변형을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 저급 알킬은 C1-C4 알킬이다. 또한, 하나 이상의 측기, 또는 말단기는 통상의 펩티드 화학 기술자에게 공지된 보호기에 의해 보호될 수 있다. 아미노산의 α-탄소는 모노- 또는 디메틸화될 수 있다.

특정 실시형태에서 본 명세서에서 기술되는 단백질 중 임의의 하나는 하나 이상의 비-천연 발생성 아미노산, 하나 이상의 아미노산 유사체를 포함하거나, 또는 합성 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 펩티드 모방체이거나 또는 이를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "~들을 포함하다", "~을 포함하다", "~을 포함하는", 및 이와 유사한 용어는 배타적이거나 포괄적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 다시 말해, 이들 용어는 "~을 포함하지만, 이에 국한되지 않는"다는 것을 의미한다. 용어 "~들을 포함하다", "~을 포함하다", "~을 포함하는"을 포함하는 본 명세서의 각 문장을 해석할 때, 이러한 용어 또는 이러한 용어에 의해 시작되는 것과 다른 특징이 존재할 수도 있다.

폴리펩티드의 "단편(fragment)"은 폴리펩티드의 부분 서열로서, 전형적으로는 효소적 활성 또는 결합 활성과 같은 활성에 필요한 기능을 수행하고/하거나, 폴리펩티드의 3차원 구조 또는 그의 일부, 예를 들어 에피토프를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "융합 폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 각각의 아미노 잔기 및 카복실 잔기를 통해 융합되어 단일 연속 폴리펩티드를 형성하는 2개 이상의 아미노산 서열, 예를 들어 2개 이상의 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 2개 이상의 아미노산 서열은 링커 또는 스페이서 또는 추가의 폴리펩티드를 통해 그들 각각의 아미노 및 카복실 말단을 통해 직접 융합되거나 간접적으로 융합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

하나의 실시형태에서, 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열 중 하나는 입자-형성 단백질을 포함하고, 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 다른 아미노산 서열은 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 단백질을 포함한다.

본 개시내용의 맥락에서, "하이드로겔"은 물을 함유하지만 그 자체는 수불용성인 중합체를 의미하는 것으로 간주되며, 그의 분자는 화학적으로 연결되어 3차원 매트릭스를 형성한다. 포함된 친수성 성분으로 인해, 하이드로겔은 물 중에서 팽윤되어 부피가 증가하지만 공정에서 물질 응집력을 상실하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 "겔"은 물질 응집력을 실질적으로 유지하면서 적어도 어느 정도의 변형이 가능한 고체 물질을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생리학적 pH"는 일반적으로는 인체에서 통상적으로 우세한 pH를 지칭하며, 약 7.35 내지 약 7.4의 범위이다. 그러나, 본 명세서에서 기술되는 제조 방법의 맥락에서 샘플로부터 크리스탈린 단백질을 제조하는 것을 포함하여 당업자에게 명백할 특정 맥락에서, 생리학적 pH는 통상적으로는 샘플을 수득하는 유기체의 체내에서 우세한 pH를 지칭할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 단수 "폴리펩티드" 및 복수의 "폴리펩티드"를 포괄하는 것으로 간주되며, 아미드 결합(또한 펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결되는 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하며, 생성물의 특정 길이를 지칭하지는 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하는데 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이러한 용어를 대신하거나 이들 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

용어 "폴리펩티드"는 또한, 이에 국한되는 것은 아니지만, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열, 또는 비-천연 발생성 아미노산에 의한 변형을 포함하는 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하는 것으로 간주된다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 화학적 합성을 포함한 어떤 방식으로든 생성될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 2,000개 이상의 아미노산을 갖는 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 그러한 구조를 갖는 것은 아니다. 용어 당단백은 아미노산 잔기, 예를 들어, 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기의 산소-함유 측쇄 또는 질소-함유 측쇄를 통해 단백질에 부착되는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티에 커플링된 단백질을 지칭한다.

따라서, 본 명세서에서 고려되는 폴리펩티드는 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결되는 전장 단백질(full-length protein)을 포함한 임의의 길이를 갖는 아미노산 사슬을 포함한다. 본 명세서에서 기술되는 폴리펩티드는 정제된 천연 생성물이거나, 또는 재조합 또는 합성 기술을 사용하여 부분적으로 또는 전체적으로 생성된다. 이러한 용어는 폴리펩티드, 이량체 또는 기타 다량체와 같은 폴리펩티드의 집합체, 융합 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체, 또는 이들의 유도체를 지칭할 수 있다.

본 명세서에서 고려되는 특정 폴리펩티드 및 단백질의 경우, 개별 종들 사이에 자연적 변이가 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 변이는 전체 서열에서의 아미노산 차이(들) 또는 상기 전체 서열에서의 아미노산(들)의 결실(deletion), 치환, 삽입, 역전 또는 첨가에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 및 면역학적 활성을 본질적으로 변경하지 않는 아미노산 치환은 잘 알려져 있다. 관련된 아미노산들 사이의 아미노산 치환 또는 진화시에 빈번하게 발생하는 치환은 많은 것들 중에서도 Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val이다. 다른 아미노 부가 치환은 Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val 및 Ala/Glu를 포함한다. 이러한 정보에 기초하여, 신속하고 민감하게 단백질을 비교하고 상동 단백질들 사이의 기능적 유사성을 결정하는 방법이 개발되었다. 본 명세서에서 기술되는 예시적인 실시형태의 이러한 아미노산 치환뿐만 아니라 결실 및/또는 삽입을 갖는 변이는 생성되는 단백질이 그들의 면역 반응성을 유지하는 한은 본 발명의 범위에 속한다. 이는 본 명세서에서 기술되는 하나 이상의 단백질이, 다른 공급원으로부터 단리되었을 때, 100% 미만의 동일성 수준을 가지면서도 여전히 동일한 특성을 가진 동일한 단백질을 나타낼 수 있는 이유를 설명하는 것이다. 본 명세서에서 특이적으로 확인된 단백질에 특이적인 항체와 반응할 수 있는 단백질과 같은 기능성 단백질을 여전히 제공하는 본 명세서에서 기술되는 특정 단백질의 아미노산 서열에서의 이러한 변이는 본 명세서에서 확인되는 단백질의 기능성 등가물로 간주되며, 따라서 본질적으로는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는다.

"단리된" 폴리펩티드 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체는 그의 자연 환경에 속해 있지 않은 폴리펩티드를 의미한다. 특정 수준의 정제가 필요하지 않다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그의 고유 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 적어도 부분적으로 분리, 분별 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 고유 또는 재조합 폴리펩티드와 마찬가지로 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.

폴리펩티드(또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체)와 관련하여 사용되는 "실질적으로 순수한"이라는 용어는 RNA, DNA, 단백질 또는 이들과 자연적으로 결합되어 있는 다른 오염물로부터 원하는 대로 분리된 본 명세서에서 기술되는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 단백질 및 폴리펩티드를 언급할 경우, 단백질 또는 폴리펩티드는 해당 단백질이 해당 단백질을 함유하는 조성물의 총 단백질 함량의 약 50%를 초과, 전형적으로는 총 단백질 함량의 약 60%를 초과하여 구성할 때 실질적으로 순수한 것으로 간주된다. 보다 전형적으로는, 실질적으로 순수하거나 단리된 단백질 또는 폴리펩티드는 전체 단백질의 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 적어도 약 95%를 구성할 것이다. 바람직하게는, 단백질은 조성물에서 전체 단백질의 약 90% 초과, 보다 바람직하게는 약 95% 초과를 구성할 것이다. 단백질 및 폴리펩티드를 재조합적으로 생산하거나 합성하는 현대적인 방법은 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 생산하는 데 매우 적합하다는 것을 인지하고 있을 것이다.

폴리펩티드와 관련한 용어 "변이체"는 하나 이상의 비천연 아미노산, 하나 이상의 아미노산 유사체, 및 펩티드 모방체를 포함하는 것들을 포함한 자연 발생성, 재조합, 및 합성적으로 생성된 폴리펩티드를 포함한다. 변이체 폴리펩티드 서열은 본 발명의 서열에 대해 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 %, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 나타낸다. 동일성은 적어도 20개의 아미노산 위치, 바람직하게는 적어도 50개의 아미노산 위치, 적어도 100개의 아미노산 위치의 비교 윈도우 상에서, 또는 본 발명의 폴리펩티드의 전체 길이 상에서 발견된다.

폴리펩티드 서열 동일성은 하기 방식으로 결정될 수 있다. 대상체 폴리펩티드 서열은 bl2seq에서 BLASTP(BLAST 프로그램 모음집, 버전 2.2.10[2004년 10월])를 사용하여 후보군 폴리펩티드 서열과 비교하며, 이는 NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)에서 공개적으로 사용할 수 있다. 복잡도가 낮은 영역의 필터링을 턴오프해야만 한다는 점을 제외하고는 bl2seq의 디폴트 파라미터가 사용된다.

폴리펩티드 서열 동일성은 또한 전역 서열 정렬 프로그램(global sequence alignment program)을 사용하여 후보군과 대상체 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 중첩 부분의 전체 길이에 걸쳐 계산될 수 있다. EMBOSS-니들(http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/ 에서 이용 가능) 및 상기에서 논의된 바와 같은 GAP(참조 문헌[Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.])도 또한 폴리펩티드 서열 동일성을 계산하기에 적합한 전역 서열 정렬 프로그램이다.

본 명세서에서 고려되는 폴리펩티드 변이체는 또한 이러한 서열의 기능적 동등성을 보존할 가능성이 있고 임의의 우연한 기회에 의해 발생했다고 합리적으로 예상할 수 없는 구체적으로 확인된 서열 중 하나 이상과 유사성을 나타내는 것들을 포함한다. 폴리펩티드에 대한 이러한 서열 유사성은 NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)로부터의 BLAST 프로그램 모음집(버전 2.2.10[2004년 10월])에서 공개적으로 이용 가능한 bl2seq 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 폴리펩티드 서열의 유사성은 하기 유닉스 명령 라인 파라미터를 사용하여 검사할 수 있다:

bl2seq ―i peptideseq1 ―j peptideseq2 -F F ―p blastp

변이체 폴리펩티드 서열은 구체적으로 확인된 서열 중 어느 하나와 비교하였을 때 바람직하게는 1×10^-10 미만, 보다 바람직하게는 1×10^-20 미만, 1×10^-30 미만, 1×10^-40 미만, 1×10^-50 미만, 1×10^-60 미만, 1×10^-70 미만, 1×10^-80 미만, 1×10^-90 미만, 1×10^-100 미만, 1×10^-110 미만, 미만 1×10^-120 또는 1×10^-123 미만의 E 값을 나타낸다.

파라미터 -F F는 복잡도가 낮은 섹션의 필터링을 턴오프한다. 파라미터 -p는 서열의 쌍에 적절한 알고리즘을 선택한다. 이러한 프로그램은 서열 사이의 유사성을 영역을 확인하고 각각의 이러한 영역에 대해 무작위 서열을 포함하는 고정 참조 크기의 데이터베이스에서 우연히 이러한 일치를 찾을 것으로 예상되는 횟수인 "E 값"을 기록한다. 1 보다 훨씬 미만의 작은 E 값의 경우, 이것은 대략적인 이러한 무작위 일치의 확률이다.

생물학적 활성을 크게 변경하지 않는 기술된 폴리펩티드 서열 중의 하나 또는 여러 개의 아미노산의 보존적 치환(Conservative substitution)도 또한 본 발명에 포함된다. 숙련된 기술자는 표현형적으로 침묵하는 아미노산 치환하는 방법을 알고 있을 것이다(예를 들어, 문헌[Bowie et al., 1990, Science 247, 1306] 참조).

본 명세서에서 고려되는 폴리펩티드 변이체는 또한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로부터 생성되지만 그것이 변경된 아미노산 서열을 갖도록 상이하게 처리된다는 점에서 야생형 폴리펩티드와는 다른 것을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 야생형 폴리펩티드를 생성하는 것에 대한 1차 RNA 전사체의 대안적인 스플라이싱 패턴에 의해 생성된다.

본 명세서에서 사용되는 "대상체"는 동물, 일반적으로는 포유류 반려 동물 또는 인간을 포함하는 포유동물이다. 대표적인 반려 동물은 고양이, 말, 개를 포함한다. 대표적인 농경 동물은 소, 양, 염소, 사슴, 및 돼지를 포함한다. 구체적으로 고려되는 대상체는 우유를 생산하기 위해 상업적으로 이용되는 대상체, 예를 들어 소, 양, 및 염소 대상체이다.

용어 "벡터"는 유전적 구성을 숙주 세포로 수송하는 데 사용되는 폴리뉴클레오티드 분자, 일반적으로는 이중 가닥 DNA를 지칭한다. 특정 예에서, 벡터는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 하나 이상의 추가적인 숙주 시스템에서 복제할 수 있다.

크리스탈린 단백질

크리스탈린 단백질은 모든 척추동물 종의 수정체에서 발견되는 수용성 구조 단백질이다. 크리스탈린은 수정체에 필요한 굴절률을 유지하는 기능을 하며, 수정체 섬유 세포의 단백질 성분의 ~90% 이상을 차지한다.

눈의 수정체와 각막에서 발견되는 크리스탈린 단백질은 α-크리스탈린, β-크리스탈린 및 γ-크리스탈린의 세 가지 하위 그룹으로 나눌 수 있다. 눈 조직 내에 존재하는 각각의 하위 그룹의 비율은 종에 따라 다르다: 전형적인 포유류 수정체 내 단백질의 약 35%는 α-크리스탈린이고; 어류 및 설치류에서, γ-크리스탈린의 비율은 β-크리스탈린을 초과하며; 대부분의 다른 종의 수정체의 주요 성분은 β-크리스탈린이다.

α-크리스탈린

α-크리스탈린은 단백질의 작은 열충격단백질(sHSP: small heat-shock protein) 그룹의 구성원이다. sHSP는 모두 소수성 N-말단 도메인 및 친수성 C-말단 연장부와 함께 약 90개의 아미노산을 포함하는 독특한 α-크리스탈린 도메인을 포함한다. 2개의 α-크리스탈린 서브 유닛, αA 및 αB가 있다. αA 및 αB 크리스탈린의 다분산성 및 올리고머성 특성은 그들의 크기가 환경에 따라 달라진다는 것을 의미한다. 이들의 평균 호모올리고머 분자량은 αA 및 αB에 대해 각각 660 kDa 및 620 kDa인 것으로 밝혀졌지만, 올리고머는 300 내지 1200 kDa의 범위일 수 있다.

수정체 내의 α-크리스탈린은 백내장을 형성하는 변성 단백질의 응집을 방지하고 스트레스에 대한 세포의 내성을 증가시키는 것으로 보고되어 왔다.

β-크리스탈린 및 γ-크리스탈린

β- 및 γ-크리스탈린은 구조적으로 유사한 단백질로서, 둘 모두 2개의 유사한 도메인으로 구성되며, 여기서 각각의 도메인은 그릭 키 패턴(Greek key pattern)으로 접힌 2개의 유사한 모티프를 가지고 있다. γ-크리스탈린은 단순한 단량체인 반면, β-크리스탈린은 올리고머의 복잡한 그룹이다. β- 및 γ-크리스탈린은 모두 수정체 외측의 조직에서 발견되지만, 이들의 특이적 생물학적 기능은 잘 규명되어 있지 않다.

구체적으로 고려되는 크리스탈린 단백질은 포유류 α-크리스탈린, 예를 들어 αA 크리스탈린 또는 αB 크리스탈린, 포유류 β-크리스탈린, 예를 들어 βA 크리스탈린(예를 들어, βA1, βA2, βA3, 및 βA4 크리스탈린), 및 βB 크리스탈린(예를 들어, βB1, βB2, 및 βB3 크리스탈린), 및 포유류 γ-크리스탈린, 예를 들어 γS, γA, γB, γC, γD, γE, 및 γF 크리스탈린이다.

더 구체적으로 고려되는 크리스탈린 단백질은 피신(piscine) α-크리스탈린, 예를 들어 αA 크리스탈린 또는 αB 크리스탈린, 피신 β-크리스탈린, 예를 들어 βA 크리스탈린(예를 들어, βA1, βA2, 및 βA4 크리스탈린), 및 βB 크리스탈린(예를 들어, βB1, βB2, 및 βB3 크리스탈린), 및 피신 γ-크리스탈린, 예를 들어 남극 이빨고기(Antarctic toothfish)(디소스티추스 마우소니(Dissostichus mawsoni))로부터의 γM1, γM3, γM4, γM5, γM7, γM8a, γM8b, γM8c, γ8d, γM8e, γM9, γN, γS1, 및 γS2 크리스탈린, 및 제브라피시(다니오 레리오)로부터의 γM1, γM2a, γM2b, γM2c, γM2d1, γM2d2, γM3, γM4, γM5, γM6, γM7, γMx, γN1, γN2, γS1, γS2, γS3, 및 γS4 크리스탈린이다.

호모 사피엔스로부터의 보다 더 구체적으로 고려되는 크리스탈린 단백질은 하기 표 1 및 도 6, 7 및 8에 제시되어 있다.

자연 발생성 공급원으로부터 정제된 크리스탈린 단백질이 본 명세서에서 구체적으로 예시되어 있지만, 재조합 또는 합성 크리스탈린 단백질도 마찬가지로 본 명세서에서 기술되는 방법, 조성물, 및 물질에 사용하기에 적합하다는 것이 이해될 것이다. 크리스탈린 단백질의 공급원과 관계없이, 어떠한 이론에도 구속됨이 없이, 본 명세서에서 기술되는 조성물 및 물질의 특정의 유리한 특성은 조성물 및 물질 중에 존재하는 경우 크리스탈린 단백질의 고유 형태와 관련이 있는 것으로 여겨진다는 것이 추가로 이해될 것이다. 따라서, 고유 형태, 구조 및 변형(글리코실화 패턴과 같은 번역후 변형을 포함함)을 갖는 크리스탈린 단백질을 제공할 수 있는 생산 방법이 구체적으로 고려된다. 따라서, 재조합 또는 합성 크리스탈린 단백질을 포함하는 크리스탈린 단백질을 발현하거나 생성할 수 있는 핵산, 구성물, 벡터, 및 숙주 세포가 본 명세서에서 특히 고려된다.

당업자는 특히 수술, 세포 요법, 및 약물 전달을 포함하는 치료 방법에서 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물 및 그에 대한 다양한 용도가 제공된다는 사실을 이 설명을 읽었을 때 인식하게 될 것이다.

본 명세서에서 특히 고려되는 것은 외과적 용도에서 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 하나 이상의 단백질-함유 조성물을 이용하는 치료 방법, 조성물, 시약, 및 키트이다.

따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 조직 봉합을 필요로 하는 대상체에게서 조직을 봉합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

선택적으로, 힘을 가하여 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 봉합하는 단계;

열상, 병변, 절개부, 또는 상처 또는 상기 열상, 병변, 절개부, 또는 상처의 부위를 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질 함유 조성물과 접촉시키는 단계;

선택적으로, 힘을 가하여 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 봉합하는 단계;

가교결합을 개시하는 단계;

열상, 병변, 절개부 또는 상처의 봉합을 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지하는 단계를 포함하며;

여기서, 크리스탈린 단백질의 가교결합은 접착제 조성물을 형성한다.

하나의 실시형태에서, 조직 봉합 방법은 외과적 절개부를 봉합하는 방법이다.

하나의 실시형태에서, 조직 봉합 방법은 무봉합 봉합 방법이다. 예를 들어, 무봉합 봉합은 무봉합 피부 봉합, 무봉합 상처 봉합, 또는 무봉합 수술 절개부 봉합이다.

하나의 실시형태에서, 수술은 안과 수술이다. 일 예에서, 안과 수술은 백내장 수술, 결막 이식, 국부 평면 유리체 절제술을 포함하는 유리체 절제술, 굴절 수정체 교환, 수정체 이식, 또는 수정체 교체 수술이다. 또 다른 예에서, 안과 수술은 망막 박리 수술, 예를 들어 망막 유착 또는 공막 좌굴을 포함하는 망막 수술, 황반 구멍 수술, 결막 폐쇄, 녹내장 수술, 수포 누출 수술, 섬유주 절제술, 눈꺼풀봉합, 양막 세포막 이식, 각막 천공 수술, 익상편 절제술을 포함한 익상편 수술, 후방 캡슐 안내 수정체 이식, 상피 내성장 수술, 표층각막이식을 포함한 각막이식술, 깊은 전방 표층각막이식, 양측 사시 수술을 포함한 사시 수술, 눈꺼풀 피부 이식 수술, 또는 점막 이식 수술이다.

하나의 실시형태에서, 조성물은 안과 수술 장치를 통해 적용된다.

다양한 실시형태에서, 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 열상, 병변, 절개부 또는 상처의 봉합을 유지하는 것은 붕대, 봉합사, 메쉬 등과 같은 하나 이상의 의료 보조 장치를 적용하거나, 또는 봉합된 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 조이거나 고정하는 것과 같은 (일반적으로는 일시적인) 물리적인 힘을 사용한다.

다양한 실시형태에서, 열상, 병변, 절개부 또는 상처의 봉합은 약 60% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안, 예를 들어, 약 70% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안, 약 80% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안, 약 90% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안, 또는 약 95% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지한다.

의심의 여지를 피하기 위해, 본 명세서에서 사용되는 가교결합의 백분율에 대한 언급은 가교결합을 형성하고 따라서 가교결합에 관여하는 크리스탈린 단백질 중에 존재하는 이용가능한 전체 가교결합 부위의 비율을 고려한다. 완전한 가교결합이 덜 발생하는 경우 본 명세서에서 기술되는 조성물을 사용하여 효과적인 접착을 달성할 수 있지만, 형성될 수 있는 가교결합의 상당한 비율이 견고한 접착을 제공하도록 형성될 수 있는 것이 바람직하다는 것이 이해될 것이다. 이와 유사하게, 당업자는 조직 봉합을 달성하고 유지하는 데 필요한 힘, 및 따라서 (예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 대표적인 수술 방법의 유지 단계 동안) 목적하는 가교결합의 정도가 다수의 요인, 특히 열상, 병변, 절개부, 또는 상처의 부위, 범위, 깊이 및/또는 면적, 대상체의 연령 및 운동성, 및 붕대, 수술용 메쉬, 봉합사 등과 같은 기타 의료 보조 장치, 또는 조직 봉합을 보조하기 위한 물리적인 힘의 효용 또는 그의 만족도에 의존한다는 것을 인식할 것이다.

일부 실시형태에서, 생체적합성 크리스탈린-포함 물질의 가교결합 시간(또는 겔화 시간)은 pH, 예를 들어 조성물의 pH, 표적 부위의 pH, 수성 완충액의 pH 등에 의해 제어된다.

일부 실시형태에서, 가교결합 시간은 가교결합의 개시, 예를 들어 UV 광과 같은 광에 대한 광가교결합제의 노출에 의해 제어된다.

특정 실시형태에서, 가교결합 시간은 약 20초 내지 10분이다. 일부 실시형태에서, 생체적합성 크리스탈린-포함 물질은 표적 부위에서 겔화된다. 특정 실시형태에서, 생체적합성 크리스탈린-포함 물질은 예정된 시간에 겔화된다.

일부 실시형태에서, 생체적합성 크리스탈린-포함 물질은 생체흡수성 중합체이다. 특정 실시형태에서, 생체적합성 크리스탈린-포함 물질은 약 1 내지 70일 이내에 생체흡수된다.

일부 실시형태에서, 생체적합성 크리스탈린-포함 물질은 실질적으로 생체흡수가 불가능하다.

외과용 접착제로서 본 명세서에서 고려되는 조성물의 사용을 포함하거나 본 명세서에서 고려되는 조성물의 접착 능력에 적어도 부분적으로 의존하거나 그로부터 이익을 얻는 대부분의 외과적 용도에서, 조성물의 가교결합은 유리하게는 상기 조성물이 적용되거나 투여되자마자 수행되고/되거나 개시된다. 그러나, 특정 실시형태에서, 적용 또는 투여 후 지속적인 가교결합이 유용하게 유지되도록 적어도 부분적으로 가교결합된 조성물을 사용하는 것이 유리하다는 것을 인식하고 있을 것이다.

따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 조직 봉합을 필요로 하는 대상체에게서 조직을 봉합하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

선택적으로, 힘을 가하여 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 봉합하는 단계;

열상, 병변, 절개부, 또는 상처 또는 상기 열상, 병변, 절개부, 또는 상처의 부위를 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질 함유 조성물과 접촉시키는 단계 - 선택적으로, 상기 크리스탈린 함유 조성물은 적어도 부분적으로 가교결합됨 -;

선택적으로, 힘을 가하여 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 봉합하는 단계;

가교결합을 개시 및/또는 유지하는 단계;

열상, 병변, 절개부 또는 상처의 봉합을 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지하는 단계를 포함하며;

여기서, 크리스탈린 단백질의 적용 및/또는 가교결합은 접착제 조성물을 형성한다.

본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 안과적 수술을 받고 있거나 수술을 받은 대상체에게서 조직을 봉합하는 광범위하게 동등한 방법, 및 치료를 필요로 하는 대상체에게서 안구 손상 또는 안구 절개부를 치료하는 방법이 또한 고려된다.

본 명세서에서 기술되는 조성물, 용도 및 방법의 많은 적용에서, 멸균 처리하고 유용한 구조적 동일성 및 기능을 포함한 효능을 유지하기 위한 크리스탈린-포함 조성물의 능력이 상당히 중요하다는 것이 이해될 것이다. 당업자는 본 개시내용을 탐독하였을 때 외과적 절차, 및 세포의 배양 또는 전달을 포함하는 절차에서와 같이 많은 고려되는 용도에서 무균성이 가장 중요하다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 감마선 조사(실시예 13 참조) 및 UV 멸균(실시예 4 참조)과 같은 적합한 멸균 방법의 대표적인 예가 본 명세서에 예시되어 있다.

조성물의 멸균은 전형적으로는, 조성물이 사용될 용도 및 그것이 어떤 방법으로 다루어지고, 저장되고, 수송되고, 투여되는지 등의 관점에서, 그렇게 하는 것이 가장 편리할 때 수행될 것임을 인식할 것이다. 특정 예에서, 멸균은 크리스탈린-포함 조성물이 가교결합된 후에 수행된다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 세포 배양 또는 전달을 위한 박막 필름 조성물은 가교결합된 후에 멸균된다. 가교결합 후 멸균의 대표적인 방법이 본 명세서에 예시되어 있다.

특정 실시형태에서, 멸균은 본 명세서에서 고려되는 조성물의 제조 또는 사용 중에 적어도 부분적으로 달성된다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 특정 UV-경화 조성물은 경화/가교결합 동안 적어도 부분적으로 UV 멸균될 수 있다. 예를 들어, 멸균 조건(예를 들어, 본 명세서의 실시예 4에 기술되어 있는 조건 참조) 하에 및 크리스탈린 단백질을 가교결합하고 조성물을 멸균하기에 충분한 기간 동안 UV 경화에 적합한 조성물을 UV 광에 노출시키는 것이 특히 고려된다.

특정 실시형태에서, 조성물은 가교결합 전에 멸균된다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 접착성 크리스탈린-포함 조성물의 특정 용도는 가교결합 전에 조성물의 국소 적용 또는 외과적 적용하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 투여 부위가 감염되는 것을 피하기 위해 멸균되는 것이 유리하다.

이에 국한되는 것은 아니지만, 감마 조사를 포함한 조사에 의한 멸균은 일반적으로는 특히 본 명세서에서 고려되는 크리스탈린-포함 조성물의 외과적 투여를 포함하는 적용에 바람직할 것이다. 구체적으로는, 특히 본 명세서에서 기술되는 UV 경화성 조성물에 대한 UV 멸균이 또한 고려되지만, 이에 국한되지 않는다.

화학적 멸균 방법, 특히 예를 들어 에틸렌 옥사이드 처리(예를 들어, CFC-12/EtO 88/12 블렌드로 처리)와 같은 이식 가능 의료 기기를 포함하는 온도- 및 습기-민감성 의료 기기의 멸균에 적합한 방법도 또한 본 명세서에서 기술되는 조성물과 함께 사용하기에 적합하다. 예로는 미국 환경 보호국(US Environmental Protection Agency)의 '중요한 새로운 대안 정책 - 멸균제의 대체물(Significant New Alternatives Policy - Substitutes in Sterilants)' 웹사이트(epa.org/snap/substitutes-sterilants)에 나열된 것들을 포함한다.

이상적으로는, 멸균은 조성물 및/또는 최종 가교결합된 생성물의 효능(예를 들어, 형태, 구조, 또는 기능 중 임의의 하나 이상을 포함하지만, 이에 국한되지 않음)에 영향을 미치지 않거나 영향을 거의 미치지 않는 조건 및 방법을 사용하여 수행한다. 조성물 중에 존재하는 크리스탈린 단백질의 구조를 포함하여, 본 명세서에서 기술되는 조성물에 대한 멸균의 영향 또는 멸균의 결여를 결정하는 방법이 본 명세서에서 기술되고 예시된다. 예를 들어, 본 명세서의 실시예 13은 감마 멸균을 거친 조성물 중에 존재하는 크리스탈린 단백질의 2차 구조를 조사하여 감마 멸균이 필름에서 크리스탈린 단백질의 고유 구조에 부정적인 영향을 전혀 미치지 않았음을 확인하는 방법을 예시한다. 당업자에게 공지된 이들 및 기타 방법은 멸균이 효능에 영향을 미치지 않거나 영향을 최소화하도록 보장하는 다른 멸균 방법의 적합성을 조사하는 데 적합하다.

겔화/가교결합된 조성물의 기계적 특성

본 개시내용을 판독할 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 명세서에서 기술되는 겔화/가교결합된 조성물은 그의 기계적 특성을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 조성물의 인장 탄성(tensile elasticity)은 물질의 영 모듈러스/탄성 모듈러스를 측정함으로써 유용하게 정량화되며, 여기서 모듈러스가 높을수록 재료는 더 강성화된다. 인장 탄성을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 대표적인 방법이 본 명세서의 실시예에 기술되어 있다.

이와 유사하게, 물질이 파단 전에 견딜 수 있는 최대 응력은 본 명세서에서 극한 인장 강도(UTS: Ultimate Tensile Strength)로 표시되며, 물질이 영구/소성 변형을 나타내기 시작하는 지점은 본 명세서에서 0.2% 항복 강도로 표시된다. 일반적으로, 설계 응용 분야에서, 항복 강도는 허용 응력에 대한 상한으로 사용된다. 다시 말하면, UTS 및 0.2% 항복 강도를 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 대표적인 방법이 본 명세서의 실시예에 기술되어 있다.

겔화/가교결합된 조성물의 기계적 특성은 특정 실시형태에서는 조성물(들)이 적용되는 용도에 특히 적합하도록 조정될 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 박막 필름으로서 사용하기 위한 조성물은 특정 실시형태에서는 접착제로서 사용하기 위한 조성물보다 더 높은 영 모듈러스를 갖도록 제형화될 것이다.

겔화/가교결합된 조성물의 기계적 특성은 적어도 부분적으로는 전구체 조성물의 제형, 예를 들어 가교결합제의 동일성 및 양, 및/또는 전구체 조성물 내의 특정 크리스탈린 이소형(isoform)의 존재 또는 상대적인 양과 관련이 있음이 또한 이해될 것이다. 본 명세서에서 제시되는 실시예에서 명백하게 볼 수 있는 바와 같이, 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 함유 조성물의 조성을 변경하면 생성되는 겔화/가교결합된 조성물의 특성에 의미있는 영향을 미친다.

또한, 겔화/가교결합된 조성물의 기계적 특성에 영향을 미치는 것 이외에도, 전구체 조성물의 제형은 겔화/가교결합된 조성물의 다른 특성, 예를 들어 겔화/가교결합된 조성물 중에 존재하는 하나 이상의 활성제에 대한 방출 프로파일, 및/또는 조성물의 분해 속도 및/또는 프로파일에 영향을 미친다.

특정 실시형태, 예를 들어 박막 필름에 관한 실시형태에서, 패턴화, 예를 들어 소프트 리소그래피를 사용한 필름의 마이크로패턴화, 또는 패턴화된 템플릿 기재 상의 겔화에 의한 패턴화가 사용된다. 예를 들어, 패턴화는 유익한 세포 정렬 또는 고정을 촉진하기 위해 사용된다. 하나의 실시형태에서, 에칭되거나 패턴화된 필름, 예를 들어 400 내지 4000 nm 피치를 갖는 에칭된 실리콘 웨이퍼 또는 폴리우레탄 표면 상에서 제조된 필름은 세포의 정렬 및 이동을 지시하거나, 또는 세포 부착 및/또는 계층화, 및/또는 단백질 침착을 촉진하기 위해 사용된다. 이와 유사하게, 본 명세서에서 기술되는 박막 필름과 같은 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물의 패턴화는 탄성, 강도와 같은 하나 이상의 기계적 특성을 변화 또는 증가시키거나, 또는 변형, 천공, 또는 기타 붕괴를 지시하기 위해 사용될 수 있다.

하나 이상의 크리스탈린 단백질 이외에도, 본 명세서에서 고려되는 생체적합성 조성물은 하나 이상의 합성 펩티드를 포함하는 하나 이상의 추가의 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 치료 활성제와 같은 하나 이상의 활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 고려되는 생체적합성 물질은 특정 실시형태에서는 물질에 공유 결합되거나 또는 물질 내에 혼입되거나 흡착된 하나 이상의 물질, 예를 들어 하나 이상의 크리스탈린 폴리펩티드, 또는 거기에 결합된 모이어티에 결합된 하나 이상의 물질을 포함할 것이다.

대다수의 치료 용도에서, 하나 이상의 활성제가 존재하는 경우, 상기 활성제는 바람직하게는 생리학적 또는 약리학적 활성제, 예를 들어 항생제, 세포 증식 억제제, 항염증제, 대사 호르몬, 유전자 치료용 제제, 성장 호르몬, 분화 또는 조절 인자, 면역 억제제, 면역자극 물질, 핵산, 아포프토시스-유도제, 접착-유도 또는 억제제, 수용체 작용제 및 수용체 길항제, 또는 이들의 임의의 둘 이상의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 제제일 것이다.

하나 이상의 활성제 중 하나 이상이 안과적으로 허용되는 항생제, 예를 들어, 설폰아미드, 마크롤라이드, 에르트로마이신, 클로람페니콜, 아미노글리코시드, 플루오로퀴놀론, 반코마이신, 및 테트라사이클린을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항생제인 안과적 요법과 관련된 조성물, 용도 및 방법이 구체적으로 고려된다.

광범위한 약제학적-활성 활성제가 본 명세서에서 기술되는 생체 적합 물질에 혼입될 수 있으며, 치료할 상태 또는 질병과 같은 달성해야 할 치료 목표에 따라 선택될 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 명세서에서 특히 고려되는 안구 요법의 맥락에서, 예를 들어 녹내장을 치료하는 데 효과적인 하나 이상의 활성제는 특정 실시형태에서는 눈에 적용하기에 적합한 생체 적합 물질에 혼입될 것이다. 녹내장의 국소 치료를 위한 대표적인 활성제로는 필로카르핀, 카르바콜, 데메카리움 브로마이드 및 에코티오페이트 요오다이드와 같은 콜린제; 에피네프린, 디피베프린, 브리모니딘 및 아프라클로니딘과 같은 아드레날린 작용제; 티몰롤, 카르테올롤, 베탁솔롤, 레보부놀롤 및 메토프롤롤과 같은 베타 차단제; PGF2α, 라타노프로스트, 우노프로스톤 및 PHXA-85와 같은 프로스타글란딘 유사체; 및 도르졸아미드 및 브린졸아미드와 같은 탄산 탈수효소 억제제를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.

특정 부위에 활성제의 국소화된 농도를 제공하는 능력이 많은 치료적 적용시에 유익하지만, 본 명세서에서 기술되는 조성물 및 물질은 또한, 특히 적용 부위가 전신 순환에 대한 접근성이 좋거나, 아니면 점막 조직과 마찬가지로 활성제를 흡수할 수 있는 경우에, 전신 활성제의 전달에 적합하다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에서 고려되는 눈의 예를 사용하여, 눈을 통한 활성제의 전신 전달이 가능하므로, 눈 내 또는 눈 상의 적용에 표적화된 본 명세서에서 기술되는 조성물 및 물질이 국소 안과용 제제의 전달에 국한되는 것이 아니라 하나 이상의 전신 활성제를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다.

특정 실시형태, 예를 들어 본 명세서에서 예시되는 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 생체적합성 조성물은 하나 이상의 세포를, 선택적으로 상기에서 논의된 바와 같은 하나 이상의 지지 활성제 및/또는 하나 이상의 추가의 활성제와 함께 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 외과적 용도를 위한 대표적인 조성물은 하나 이상의 세포, 예를 들어 하나 이상의 줄기 세포를 수술 적용 전, 동안 및 후에 세포 생존력을 개선하기 위해 하나 이상의 항생제 및/또는 하나 이상의 분화 또는 조절 인자와 함께 포함한다.

특히 고려되는 세포는 림발 상피 줄기 세포 또는 각막-림발 줄기 세포로도 지칭되는 림발 줄기 세포, 중간엽 줄기/간질 세포로도 지칭되는 간질 줄기 세포, 및 망막 색소 상피 세포를 포함한다. 추가의 특히 고려되는 세포는 전능 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 및 다능 줄기 세포를 포함한다.

생체적합성 조성물과 함께 사용하기 위해 본 명세서에서 고려되는 활성제, 물질, 및 세포는 일반적으로는 치료적 이점을 제공하기 위해 이용될 것이지만, 이해되는 바와 같이 지지 기능도 이와 마찬가지로 구체적으로 고려된다.

특정 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 조성물은 하나 이상의 담체 또는 부형제, 예를 들어 하나 이상의 희석제 또는 조성물 및/또는 그의 용도 및/또는 또한 존재하는 활성제 중 임의의 하나 이상을 포함하는 구성성분 중 임의의 하나 이상의 용도에 하나 이상의 이점을 제공하는 하나 이상의 추가적인 제제 또는 물질을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 특정 실시형태에서 조성물 및/또는 그 안에 포함된 하나 이상의 활성제 중 하나 이상의 제형, 안정성, 투여, 전달, 흡수, 또는 효능 중 하나 이상의 이점을 제공하는 하나 이상의 담체 또는 부형제를 포함한다.

활성제의 방출 속도의 제어

일부 실시형태에서, 생체적합성 크리스탈린-포함 물질은 수 시간 내지 수일 범위의 시간에 걸쳐 확산 및/또는 삼투에 의해 활성제를 표적 부위에 서서히 전달한다. 특정 실시형태에서, 제제는 표적 부위에 직접 전달된다. 일부 실시형태에서, 활성제를 포함하는 생체적합성 크리스탈린-포함 물질을 표적 부위에 전달하는 절차는 필요한 경우 여러 번 반복된다. 다른 실시형태에서, 활성제는 물질의 생분해를 통해 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 방출된다. 일부 실시형태에서, 활성제는 확산, 삼투, 및/또는 분해 메커니즘의 조합을 통해 방출된다. 특정 실시형태에서, 물질로부터 활성제의 방출 프로파일은 단일모드(unimodal)이다. 일부 실시형태에서, 물질로부터 활성제의 방출 프로파일은 이중모드(bimodal)이다. 특정 실시형태에서, 물질로부터 활성제의 방출 프로파일은 다중모드(multimodal)이다.

일부 실시형태에서, 활성제는 확산 또는 삼투를 통해 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 방출된다. 특정 실시형태에서, 활성제는 180일 이내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다. 일부 실시형태에서, 활성제는 14일 이내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다. 특정 실시형태에서, 활성제는 24시간 이내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다. 일부 실시형태에서, 활성제는 1시간 이내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다.

특정 실시형태에서, 활성제는 약 180일, 약 150일, 약 120일, 약 90일, 약 80일, 약 70일, 약 60일, 약 50일, 약 40일, 약 35일, 약 30일, 약 28일, 약 21일, 약 14일, 약 10일, 약 7일, 약 6일, 약 5일, 약 4일, 약 3일, 약 2일, 약 1일, 약 0.5일, 약 6시간, 약 4시간, 약 2시간, 약 또는 1시간 이내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다. 일부 실시형태에서, 활성제는 180일 초과, 150일 초과, 120일 초과, 90일 초과, 80일 초과, 70일 초과, 60일 초과, 50일 초과, 40일 초과, 35일 초과, 30일 초과, 28일 초과, 21일 초과, 14일 초과, 10일 초과, 7일 초과, 6일 초과, 5일 초과, 4일 초과, 3일 초과, 2일 초과, 1일 초과, 0.5일 초과, 6시간 초과, 4시간 초과, 2시간 초과, 또는 1시간 초과 내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다. 특정 실시형태에서, 활성제는 180일 미만, 150일 미만, 120일 미만, 90일 미만, 80일 미만, 70일 미만, 60일 미만, 50일 미만, 40일 미만, 35일 미만, 30일 미만, 28일 미만, 21일 미만, 14일 미만, 10일 미만, 7일 미만, 6일 미만, 5일 미만, 4일 미만, 3일 미만, 2일 미만, 1일 미만, 0.5일 미만, 6시간 미만, 4시간 미만, 2시간 미만, 또는 1시간 미만 내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다. 일부 실시형태에서, 활성제는 약 1일 내지 약 14일 이내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다. 특정 실시형태에서, 활성제는 약 1일 내지 약 70일 이내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다.

일부 실시형태에서, 활성제는 바이오 분자이며, 물질로부터의 바이오 분자의 방출은 물질의 조성에 의해 제어된다. 특정 실시형태에서, 바이오 분자는 물질이 분해되기 시작할 때 방출된다.

일부 실시형태에서, 활성제는 세포 또는 그의 집단이며, 물질로부터의 세포 또는 그의 집단의 방출은 물질의 조성에 의해 제어된다.

일부 실시형태에서, 생체적합성 물질은 활성제를 포함하며, 여기서 활성제는 생체적합성 크리스탈린-포함 물질의 확산, 삼투, 분해, 또는 이들의 임의의 조합을 통해 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 방출된다. 특정 실시형태에서, 활성제는 초기에는 확산을 통해 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 방출되고, 이후에는 생체적합성 크리스탈린-포함 물질의 분해를 통해 방출된다.

일부 실시형태에서, 활성제는 180일 이내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다.

특정 실시형태에서, 활성제는 24시간 이내에 생체적합성 크리스탈린-포함 물질로부터 실질적으로 방출된다.

일부 실시형태에서, 생체적합성 크리스탈린-포함 물질은 활성제와 상호작용하거나 이에 결합된다. 특정 예에서, 10% 초과의 활성제는 생체적합성 크리스탈린-포함 물질의 분해를 통해 방출된다.

특정 실시형태에서, 활성제의 방출은 생체적합성 크리스탈린-포함 물질의 조성에 의해 결정된다. 특정 실시형태에서, 활성제의 방출은 생체적합성 크리스탈린-포함 물질이 분해되기 시작할 때까지 본질적으로 억제된다.

특정 실시형태에서, 생체적합성 크리스탈린-포함 물질이 분해되기 시작하는 시간이 길수록 생체적합성 크리스탈린-포함 물질의 가교결합도는 더 높다.

일부 실시형태에서, 활성제는 약학 활성 바이오 분자이다. 특정 실시형태에서, 약학 활성 바이오 분자는 단백질, 효소, 또는 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 약학 활성 바이오 분자는 항체이다. 특정 실시형태에서, 약학 활성 바이오 분자는 백신이다. 일부 실시형태에서, 약학 활성 바이오 분자는 올리고뉴클레오티드이다.

예시적인 키트 및 방법

하나의 실시형태에서, 본 명세서에서 기술되는 가교결합된 생체적합성 크리스탈린-포함 조성물을 포함하는 수술 키트는 선택적으로 가교결합된 생체적합성 크리스탈린-포함 조성물을 표적 부위에 전달하기 위한 지침과 함께, 선택적으로 가교결합된 생체적합성 크리스탈린-포함 조성물을 표적 부위에 전달하기 위한 장치와 함께 제공된다.

a) 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물; 및 b) 가교결합제를 포함하는 키트가 본 명세서에서 추가로 제공되며; 여기서 생체적합성 크리스탈린-포함 물질은 상기 조성물 및 상기 가교결합제를 혼합한 후에 형성된다.

또한, a) 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물; b) 가소제, 및 c) 가교결합제를 포함하는 키트가 본 명세서에서 제공되며; 여기서 생체적합성 크리스탈린-포함 물질은 상기 조성물, 상기 가소제, 및 상기 가교결합제를 혼합한 후에 형성된다.

또한, a) 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질을, 선택적으로 가소제와 함께 포함하는 조성물; 및 b) 가교결합제를 포함하는 키트가 본 명세서에서 제공되며; 여기서 생체적합성 크리스탈린-포함 물질은 상기 조성물 및 상기 가교결합제를 혼합한 후에 형성된다.

선택적으로 가소제를 포함하는 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물을 갖는 제1 컨테이너(container), 가교결합제를 갖는 제2 컨테이너, 선택적으로 하나 이상의 활성제를 갖는 하나 이상의 추가의 컨테이너, 선택적으로 완충액을 갖는 컨테이너, 선택적으로 혼합 용기(mixing vessel), 상기 혼합 용기 내의 각각의 컨테이너 내에 존재하는 물질을 혼합하기 위한 지침 및/또는 생체적합성 크리스탈린-포함 물질을 생성하기 위해 가교결합하기 위한 지침, 및 상기 생체적합성 크리스탈린-포함 물질을 표적 부위에 전달하기 위한 지침을 포함하는, 본 명세서에서 기술되는 생체내 겔화 또는 가교결합성 약학 조성물을 제조하기 위한 키트가 본 명세서에서 추가로 제공된다.

또한, 선택적으로 가소제를 포함하는 본 명세서에서 기술되는 생체적합성 크리스탈린-포함 조성물을 갖는 제1 컨테이너, 선택적으로 가교결합제를 갖는 추가의 컨테이너, 선택적으로 하나 이상의 활성제를 갖는 하나 이상의 추가의 컨테이너, 선택적으로 완충액을 갖는 컨테이너, 선택적으로 혼합 용기(mixing vessel), 상기 혼합 용기 내의 각각의 컨테이너 내에 존재하는 물질을 혼합하기 위한 지침 및/또는 생체적합성 크리스탈린-포함 물질을 생성하기 위해 가교결합하기 위한 지침, 및 상기 생체적합성 크리스탈린-포함 물질을 표적 부위에 전달하기 위한 지침을 포함하는, 본 명세서에서 기술되는 생체내 겔화 또는 가교결합성 약학 조성물을 제조하기 위한 키트가 본 명세서에서 제공된다.

다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 기술되는 하나 이상의 키트는 공개시제, 예를 들어 공개시제를 포함하는 컨테이너를 추가로 포함한다.

본 명세서에서 기술되는 물질 및 방법의 특정 용도에서, 가교결합된 물질의 제자리(in situ) 형성이 표적화된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 기술되는 조성물의 제자리 가교결합은 접착제 조성물에서 일어나며, 이에 의해 접착제 효능을 제공한다. 이러한 제자리 가교결합은 본 명세서의 실시예에서 예시된다.

다른 실시형태에서, 제자리 가교결합시에 사용되는 조성물은 하이드로겔 물질을 제공한다. 여기서, 조성물은 보호되어야 하는 부위에서 조성물이 환자의 신체 내로 도입될 때까지 가교결합이 완결되지 않는 것이 유리하다.

이러한 경우의 조성물은 주사 가능한 형태 또는 분무 가능한 형태로 사용될 수 있으며, 이는 또한 외과적 개입과 관련하여 사용하는 것도 가능하지만 최소 침습 방식으로 사용하는 것이 바람직하다.

특정 실시형태에서, 이러한 경우의 조성물은 예를 들어 이를 신체에 적용하기 직전에 가교결합제와 혼합한 다음, 이 혼합물을 가교결합이 단지 제자리에서만 진행되는 그러한 방식으로 액체 또는 스프레이로서 환자의 신체 내에 도입한다. 그러나, 보호해야 하는 인간 또는 동물 환자의 신체 부위에 조성물 및 가교결합제를 별도로 전달하고 그곳에서 혼합하는 것도 또한 예상된다. 예를 들어 광가교결합제가 사용되는 경우, 가교결합제를 포함하는 조성물을 표적 부위로 전달하고, 그 후 적절한 파장을 갖는 광에 노출시킴으로써 가교결합을 개시하는 것이 추가로 예상된다.

제자리 사용을 위한 조성물, 특히 추가의 개시 단계(예를 들어, 광활성화) 없이 가교결합제의 첨가시에 가교결합이 일어나는 조성물은 특정 실시형태에서는 외과적 또는 최소 침습 적용 직전에 생성되고, 이어서 스프레이로서, 임플란트로서, 액체로서, 충전물로서 또는 겔 필름으로서 사용될 것이다.

따라서, 가교결합이 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물과의 혼합 이외에 추가의 개시를 전혀 필요로 하지 않는 실시형태에서, 물질은 그의 생산을 위한 모든 성분이 제공된 후에 환자의 신체 상으로 또는 신체 내로 도입된다. 이러한 경우, 물질은 적용 전, 적용 도중 또는 그렇지 않으면 적용 후에 가교결합이 완결된다.

박막 필름 또는 하이드로겔과 같은 완전히 가교결합된 물질의 이식을 포함하는 실시형태에서, 물질의 실질적인 취급을 허용하거나 용이하게 하는 어느 정도의 고체 농도를 갖는 물질이 바람직하다. 이러한 경우의 물질의 고형성의 정도 또는 유체 특성은 가교결합의 정도에 따라 설정될 수 있으며, 여기서 물질은 더 고형일수록 더 가교결합되거나, 또는 박막 필름의 맥락에서, 건조 정도도 또한 고형성에 기여한다. 따라서, 겔의 유체 특성은 액체의 특성과 고체의 특성 사이에 있다.

따라서, 본 발명은 또한 기술된 조성물을 포함하는 제1 컨테이너를 갖고, 크리스탈린 단백질을 포함하는 물질, 예를 들어 접착제 물질, 하이드로겔 형성 물질, 또는 박막 필름 물질의 제자리 생성시에 사용되는 조성물용 가교결합제를 포함하는 제2 컨테이너를 갖는 키트에 관한 것이다.

당업자는, 본 개시내용 및 본 명세서에서 제공되는 실시예의 지침에 따라, 각각의 목적하는 치료에 적합한 가교결합된 생체적합성 크리스탈린-포함 조성물이 형성되는 방식으로 조성물 및 가교결합제를 서로 일치시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다.

이러한 경우, 가교결합 속도, 점도, 재흡수 동역학 등은 적용되는 성분, 예를 들어 본 명세서에서 고려되는 키트 중에 존재하는 성분들이 개별적으로 또는 공동으로 액체로서 분무가능하거나 주사가능하도록 만드는 방식으로 조정될 수 있다.

이러한 용도의 한 가지 이점은 본 명세서에서 기술되는 조성물이, 예를 들어 액체 상태로, 외상을 입은 조직 표면 및 손상되지 않은 온전한 조직 표면에 또는 외과적으로 제거되거나 절개된 조직 내에 적용될 수 있다는 것임을 이해할 것이다.

예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 조성물은 특정 실시형태에서 최소 침습 방식으로, 예를 들어 액체로서 또는 스프레이로서 아무런 문제없이 용이하게 사용된다. 특정 실시형태에서, 생성되는 겔 또는 접착제는 임의의 불균일한 조직 표면을 비롯한 조직에 적응하거나 접착된다. 특히 고려되는 실시형태는 건조 조직 및 습윤 조직 표면 상에서 상당한 런닝(running) 없이 유사하게 형성될 수 있다.

그 결과, 본 명세서에서 제공되는 조성물의 특정 실시형태의 1 mm 미만의 층 두께도 구조적 완전성 및/또는 점착력을 유지하기에 충분히 견고하기 때문에, 매우 얇은 층이 조직 표면 상에 형성될 수 있다.

특정 실시형태에서, 원하는 경우, 생체적합성은 예를 들어 약 21일 미만, 예를 들어 약 14일 미만의 체류 시간 내에 빠르게 재흡수된다.

대부분의 경우, 본 명세서에서 고려되는 치료 용도는 전형적으로 매우 높은 정도의 생체적합성을 갖고 염증, 흉터, 병리학적 또는 바람직하지 않은 조직 형성, 병리학적 또는 바람직하지 않은 혈관형성, 또는 병리학적 또는 바람직하지 않은 신경 발생을 유발하지 않는 조성물 및 물질을 필요로 할 것임이 이해될 것이다.

추가적으로, 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질을 포함하는 특히 고려되는 생체적합성 물질, 특히 외과적 용도를 위한 물질은 튼튼하고 취급이 간단한데, 그 이유는 이들은 가교결합 전에 또는 동안에 주로 액체 상태에 있는 동안, 예를 들어 주사 또는 분무에 의해 적용될 수 있거나, 또는 가교결합이 완결되었을 때, 예를 들어 겔로서 또는 박막 층으로서 적용될 수 있기 때문이다. 분무 또는 주사를 위해, 예를 들어 가교결합을 개시하기 위해 필요한 경우, 성분들은 보호되어야 하는 신체의 부위 바로 직전에 또는 그 부위에서, 또는 그렇지 않으면 이러한 부위의 말단에서 조합될 수 있다.

일반적으로, 본 명세서에서 기술되는 조성물 및 물질은 봉합 또는 다른 절개부 또는 상처 보존 수단의 필요 없이 외과적 맥락에서 사용하기에 적합하여 흉터, 비정상적 조직 형성, 및 기타 합병증을 최소화한다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 기술된다. 특허청구된 본 발명은 어떤 방식으로든 이들 실시예에 의해 제한되도록 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다.

실시예

실시예 1: 정제된 고유 크리스탈린 단백질의 제조

본 실시예는 크리스탈린 단백질의 고유 구조가 유지되는 정제된 크리스탈린 단백질 조성물의 제조 방법을 기술한다.

물질 및 방법

뉴질랜드 국립 안구 은행(New Zealand National Eye Bank)의 윤리적 승인을 받아 신선한 인간 각공막 림(human corneoscleral rim)을 입수하였다. 사용된 1차 각막 상피 세포주도 또한 뉴질랜드 국립 안구 은행으로부터 조달받은 조직으로부터 역사학적 방법으로 추출하여 액체 질소에 저장하였다. 인간의 양막은 뉴질랜드 국립 안구 은행으로부터 조달하였다.

호키 피시 머리는 상업용 어장에서 입수하였다. 수정체를 체내에서 제거하고 15 mL Falcon 튜브에서 대략 12 g 로트(lot)로 분취한 다음 -20℃에서 저장하였다. 돼지 눈은 상업적 공급업체로부터 입수하였다. 크리스탈린의 추출 및 특성화를 위해, 수정체는 호키의 수정체와 동일한 방식으로 처리하였다.

용액 및 배지

달리 명시되지 않는 한, 사용된 Milli-Q 물은 18.2 MΩ.cm^-1의 저항력(resistivity)을 가졌으며, 사용하기 전에 고압멸균 처리하였다. 여과된 Milli-Q를 0.20㎛ 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인(GVS Filter Technology, FJ13ASCCA002DL01)을 통해 시린지 여과하였다.

수정체 크리스탈린 추출

수정체 크리스탈린 추출을 위해, 눈 수정체의 칭량된 분취량을 해동시킨 다음 균질화기 컨테이너(IKA ULTRA-TURRAX Tube Drive Workstation)에 넣었다. 크리스탈린 추출 완충액을 수정체 g당 완충액 2 mL의 비율로 첨가하였다. 이어서, 균질화기를 수정체 고형분이 분산될 때까지 얼음 상에서 5분 간격으로 산재된 5분 냉각 단계를 실행하였다(대략 30분). 생성된 거품 용액을 50 mL Falcon 튜브에 쏟아 부었다. 이 시점에서 남아 있는 큰 불용성 수정체 조각을 제거하였다. 이어서, 크리스탈린 용액을 4122×g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 그런 다음, 상청액을 1.5 mL Eppendorf 튜브에 분배하고, 9600×g에서 30분 동안 다시 원심분리하였다. 생성된 크리스탈린 상청액을 청결한 Falcon 튜브로 따라내었다.

추출 완충액을 제거하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 Thermo Scientific Slide-A-Lyzer® 투석 카세트에 주입하기 전에 5% v/v 글리세롤을 크리스탈린 용액에 첨가하였다. 신선한 Milli-Q H₂O 중 4℃에서 4시간 동안 부드럽게 교반하면서 투석을 수행하였다. 카세트당 대략 2 L의 Milli-Q H₂O를 사용하였으며, 매시간 새것으로 교체하였다. 완료되었을 때, 용액을 카세트에서 회수한 다음, 15 mL 이하의 최종 유체 부피로 50 mL Falcon 튜브에 분취하였다. 용액을 동결건조하기 전에 농도 및 예상 수율을 결정하기 위해 Bradford 분석을 실행하였다(Christ Alpha 2-4 LD plus, John Morris Scientific). 동결건조된 크리스탈린은 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

크리스탈린 추출 공정의 전형적인 수율은 36 내지 48%이며, 하기와 같이 계산된다: 균질화 및 원심분리 후 대략 1 g의 출발 물질(예를 들어, 호키 눈 수정체)은 180 내지 240 mg/mL 범위의 크리스탈린 단백질 농도를 갖는 2 mL의 크리스탈린 단백질 추출물(즉, 360 내지 480 mg의 총 크리스탈린 단백질)을 제공한다.

실시예 2: 정제 및 재조합 크리스탈린 단백질의 특성화

본 실시예는 상기 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조된 크리스탈린 단백질의 특성화를 기술한다.

추출된 단백질 샘플은 SDS-PAGE에 의해 크리스탈린 단백질의 존재에 대해 평가하였다. 호키 수정체 샘플로부터의 대표적인 SDS-PAGE는 도 1 및 도 2의 (a)에 나타나 있다. α, β, 및 γ라 지칭되는 세 가지 다른 부류의 크리스탈린 단백질이 있으며, 이들 각각의 부류는 별개의 서브 유닛을 가지고 있다. α-크리스탈린 복합체는 20 kDa 서브 유닛을 갖는 매우 이질적인 집합체로, 대략 300 내지 1000 kDa의 다량체를 생성한다. β-크리스탈린은 20 내지 30 kDa 서브 유닛으로부터 형성되는 약 50 내지 200 kDa의 더 작은 복합체로서 존재하며, γ-크리스탈린은 약 20 kDa의 단량체로서 존재한다(Ecroyd and Carver, 2009). 예상한 바와 같이, SDS-PAGE는 추출된 샘플을 추가로 정제하지 않기 때문에 세 가지 부류의 모든 크리스탈린 단백질의 존재를 확인하였다. 이들 세 가지 부류의 크리스탈린 단백질은 또한 인간 수정체(도 2의 (b)) 및 돼지 수정체(도 2의 (c))의 추출물에서도 관찰되었다.

SDS-PAGE 분석 후, 호키에서 추출된 크리스탈린 단백질은 도 3에 도시된 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 α, β, 및 γ의 세 가지 부류로 추가로 반정제하였다. 전체 α 크리스탈린, 전체 β 크리스탈린, 및 전체 γ 크리스탈린에 상응하는 피크 분획은 각각 적색, 청색, 및 녹색 상자에서 식별된다. 호키 수정체(도 4의 (a)), 인간 수정체(도 4의 (b)), 및 돼지 수정체(도 4의 (c))로부터 추출한 크리스탈린 단백질의 추가 SEC 분석은 다시 α-, β-, 및 γ-크리스탈린 피크의 분리를 나타내었다.

(Horwitz et al, 1998에 기술된 바와 같이) 재조합 인간 α-크리스탈린을 발현 및 정제한 다음, 도 5에 도시된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 특성화하였으며, 정제된 α-크리스탈린의 크기는 20 kDa의 그의 예측된 크기와 일치하는 것으로 밝혀졌다.

본 명세서의 도 6, 7 및 8은 다양한 종으로부터의 크리스탈린 단백질의 다양한 아미노산 서열 정렬을 나타내는 것으로, 이는 이들 단백질 사이의 유사성 정도를 명확하게 도시한다. 도 6의 (a)는 다니오 레리오 및 호모 사피엔스로부터의 αB-크리스탈린 단백질의 아미노산 서열 정렬이고, 도 6의 (b)는 다니오 레리오 및 호모 사피엔스로부터의 βA4-크리스탈린 단백질의 아미노산 서열 정렬이며, 도 6의 (c)는 호모 사피엔스, 보스 타우루스 및 다니오 레리오로부터의 γB-크리스탈린 단백질의 아미노산 서열 정렬이다.

도 7은 여러 척추동물 αA-크리스탈린 오르토로그의 아미노산 서열 정렬이다(Runkle et al., 2002, 다음 문헌으로부터 조정됨: 문헌[Integrative and Compare Biology, Volume 43, Issue 4, August 2003, Pages 481-491], https://doi.org/10.1093/icb/43.4.481). 제브라피시 단백질의 잔기 64 내지 141은 α-크리스탈린 도메인에 상응한다.

도 8은 여러 척추동물 αB-크리스탈린 오르토로그의 아미노산 서열 정렬이다(Posner et al., 1999, 다음 문헌으로부터 조정됨: 문헌[Integrative and Compare Biology, Volume 43, Issue 4, August 2003, Pages 481-491], https://doi.org/10.1093/icb/43.4.481).

호키 수정체 추출물로부터의 정제된 크리스탈린 단백질을 추가로 특성화하기 위해, 원형 이색성(CD) 및 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광법을 사용하여 단백질 구조를 조사하였다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 호키 피시 수정체로부터의 조 크리스탈린 추출물의 CD 스펙트로그램은 크리스탈린의 β-시트 구조를 나타내는 217 nm를 중심으로 최소값을 나타내었다. 이것은 소 크리스탈린, 소 및 인간 α-크리스탈린, 및 이빨고기 γ 크리스탈린에 대한 문헌의 이전 보고서와 일치한다. β-시트 구조를 나타내는 1631 cm^-1에서의 유의미한 피크는 도 10에 나타낸 바와 같이 FTIR 분광법으로 관찰하였으며, 전술된 방법을 사용하여 추출 및 정제한 후에도 크리스탈린 단백질의 고유 구조가 보존되었음을 확인하였다.

실시예 3: 정제된 크리스탈린 단백질의 기능적 특성화

본 실시예는 상기 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조된 크리스탈린 단백질의 기능적 특성화를 기술한다.

특정 크리스탈린 단백질의 샤페론 유사 항응집 기능을 조사하였다. 간단히 말해서, 리소자임의 TCEP-유도 응집에 대한 호키 크리스탈린 추출물에 의한 보호를 평가하였으며, 이에 의해 리소자임(10 μM)을 호키 피시 수정체로부터 얻은 10 mg/mL 크리스탈린 추출물과 조합한 다음 37℃에서 배양하였다. 400 nm에서 흡광도를 측정하여 용액을 광 산란에 있어서의 변화에 대해 모니터링하였다.

크리스탈린 존재 하에서의 광 산란에 있어서 관찰된 감소(도 11, 흑색 점선)는 호키 크리스탈린 추출물의 부재 하에서의 리소자임 + TCEP(도 11, 흑색 실선)와 비교하였을 때 응집으로부터 리소자임의 보호를 나타내었다. 리소자임 단독 대조군은 TCEP의 부재 하에 광 산란을 전혀 나타내지 않았다(도 11, 회색 실선).

이어서, 포유류 세포에 대한 정제된 크리스탈린 단백질의 생체적합성 및 효과를 조사하였다. 먼저, 크리스탈린 추출물이 포유류 세포와 생체적합성임을 규명하기 위해, 인간 각막 상피 세포를 호키 수정체 추출물로부터의 정제된 α-, β-, 및 γ- 크리스탈린 분획(10 mg/mL)의 존재하에 배양하였다. 도 12에 도시된 세포의 LIVE/DEAD 염색의 대표적인 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이, 크리스탈린의 존재는 대조군(즉, 임의의 크리스탈린의 부재)과 비교하였을 때 세포의 생존력에 전혀 부정적인 영향을 미치지 않았다.

조 크리스탈린 추출물은 포유류 세포 증식에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 인간 각막 상피 세포를 무혈청 배지 또는 10% FCS가 보충된 배지의 존재 하에 24시간 동안 호키 크리스탈린 단백질로 처리한 다음, MTT 분석을 수행하였다. 두 경우 모두, 도 13에 나타나 있는 바와 같이, 크리스탈린 단백질의 농도가 증가하면 세포 증식이 증가하였다.

이어서, 호키 피시 수정체로부터의 조 크리스탈린 추출물은 생물학적 스트레스로부터 포유류 세포를 보호하는 것으로 나타났다. 산화적 스트레스에 대한 세포 반응 분석에서, 인간 각막 상피 세포를 10 μM H₂O₂로 처리한 다음 크리스탈린과 함께 배양하였다. 도 14에 제시되어 있는 바와 같이, MTT 분석 결과는 더 높은 농도(5 내지 20 mg/mL)의 조 크리스탈린 추출물이 H₂O₂에 노출되었을 때 세포 생존력에서 관찰 가능한 증가를 초래하였으며, 따라서 산화적 스트레스에 대한 조 크리스탈린 추출물의 보호 효과가 규명되었음을 나타내었다.

본 실시예에서 보고된 작업은 본 명세서에서 기술되는 방법을 사용하여 제조된 크리스탈린 단백질이 그 고유 구조뿐만 아니라 생물학적으로 중요한 기능도 유지한다는 것을 분명히 보여주었다.

실시예 4: 크리스탈린 단백질을 포함하는 박막 필름 조성물의 제조

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 박막 필름 조성물의 제조 방법을 기술한다.

필름 캐스팅은 무균 상태를 유지하기 위해 클래스 2 후드에서 수행하였다. 실시예 1에서 전술한 바와 같이 제조된 동결건조된 크리스탈린을 필터 멸균된 Milli-Q 물에 재현탁하였다. 성분 부피(아래 표 3에 제시된 바와 같음)를 멸균 Eppendorf에 다음 순서로 첨가하였다; 크리스탈린 스톡, 글리세롤, 물, 첨가제, 가교결합제.

일관된 가교 조건을 보장하기 위해, 각각의 가교제는 단지 해당 용액의 캐스팅 직전에 용액에 첨가하였다. 적절하게 혼합하기 위해, Eppendorf를 ~10회 위아래로 뒤집었다.

세포 배양에 사용되는 필름의 경우, 50 μL의 용액을 13 mm 유리 커버슬립 상에 캐스팅한 다음 피펫 팁을 사용하여 가장자리로 확산시켰다. 모세관 작용이 용액을 아래쪽으로 당기고 커버슬립을 캐스팅 접시에 단단히 부착시킬 것이기 때문에, 커버슬립의 가장자리 상으로 용액이 흘러내리지 않도록 주의하였다. 필름을 37℃ 건조 오븐에서 48시간 동안 건조하였다. 리보플라빈 필름을 오븐 건조 전에 후드 멸균 UV 조명 아래에서 30분 동안 UV 처리하였다.

필름은 바람직하게는 48시간 건조 기간 직후에 사용하였고, 그렇지 않은 경우 파라필름으로 밀봉된 캐스팅 접시에서 실온에서 보관하였다.

실시예 5: 크리스탈린 단백질을 포함하는 박막 필름 조성물의 기능적 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 박막 필름 조성물의 기계적 특성의 평가 방법을 기술한다.

방법

본 테스트에 사용된 필름은 38 mm 원형 PDMS 몰드 상에서 3 mL로 캐스팅하였다. 캐스팅 및 UV 가교결합(적절한 경우) 후, 필름을 실온에서 24시간 동안 건조한 다음, 37℃에서 48시간 동안 건조하였다. 테스트는 할당된 건조 시간이 완결된 직후에 수행하였다.

테스트를 위해, 원형 필름을 가능한 한 많은 양의 재료가 남아 있도록 주의하면서 메스를 사용하여 정사각형으로 절단하였다. 마이크로미터(Mitutoyo)를 사용하여 필름의 네 모서리와 중앙부의 두께를 측정하였으며, 이후 계산에서 사용하기 위해 평균을 내었다. 이어서, 샘플을 5 mm 너비 템플릿을 사용하여 스트립으로 절단하고, 버니어 캘리퍼스(Mitutoyo)를 사용하여 그들의 실제 최종 너비를 취하였다. 각각의 필름 유형에 대해 4개의 스트립을 취득하여 테스트하였다.

테스트는 10 N 로드 셀 및 10 mm/min의 신장 속도를 사용하여 Instron 5544 상에서 수행하였다. 게이지 길이는 10 mm로 설정하였으며, 샘플이 미끄러지는 것을 방지하기 위해 클램프 상에 사포를 배치하였다. 실패할 때까지 건조 필름 스트립을 테스트하였다.

필름의 중앙이 아닌 클램프에서의 실패는 일반적으로 가치 없는 결과로 간주되지만, 이러한 방식에서는 테스트 중에 샘플의 100%가 실패하였다. 결과를 계속 얻기 위해 선택되었지만, 이러한 실패 모드로 인하여 모두 강도가 체계적으로 과소 표시된다는 점에 유의해야 한다.

데이터가 수집되었을 때, 평균 두께와 개별 스트립 너비를 사용하여 각각의 샘플의 단면적(A)을 확인하였다. 각각의 기록된 시점에서 Instron에 의해 표시된 하중 데이터(F)를 사용하여, 해당 지점에서 재료에 가해진 응력(σ)을 계산하였으며, 여기서 σ=F/A이다.

또한, 각 시점에서의 신장율을 샘플의 길이의 변화(ΔL)로서 기록하였다. 초기 게이지 길이(Li)로 나누었을 경우, 샘플의 변형률(ε %)은 다음과 같이 계산하였다:

샘플의 상부 인장 강도(UTS)는 뉴턴 단위로 적용된 최대 하중을 단면적으로 나누어 확인할 수 있다.

재료의 영 모듈러스는 강성을 나타내며, 탄성 단계 동안 샘플의 응력-변형률 관계의 기울기를 구하여 측정할 수 있다.

결과

PDMS 몰드 상에서 3 mL의 용액 및 72시간의 총 건조 시간을 사용하여 38 mm 필름 주물을 제조하였다. 생성된 필름은 유연하고 촉감이 부드러우며 투명하였다.

필름을 5 mm 너비의 스트립으로 준비하기 전에, 버니어 캘리퍼스(Mitutoyo)를 사용하여 필름의 두께를 측정하였다. 처리 후, 단면적을 정확하게 측정하기 위해 처리된 샘플의 측정된 실제 너비를 UTS 계산에서 사용하였다. 중앙과 4개의 모서리에서 측정된 필름의 두께에 차이가 있었는데, 이는 완전히 평평하지 않은 몰드 표면의 불일치로 인해 발생할 수 있는 것으로 보인다.

이러한 조성물을 테스트하는 동안, 모든 샘플이 클램프에서 실패하였다. 이것은 재료의 파손을 유발하는 원인이 세로 방향으로 가해지는 힘이 아니라 인장력과 클램핑 과정에서 가해지는 손상의 조합이기 때문에 전형적으로 실패한 결과로 간주된다. 따라서, 본 명세서에서 보고되는 박막 필름의 상부 인장 강도 점수는 필름 강도를 체계적으로 과소 표시한 것이다.

도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, F2는 0.363±0.0213 MPa에서 가장 낮은 UTS를 가졌으며, 영 모듈러스 점수는 1.65±0.663 MPa로 가장 탄력적인 것으로 입증되었다(도 16). F3는 0.673±0.0272 MPa의 UTS 및 2.89±0.780 MPa의 영 모듈러스를 가졌다. F4는 각각 0.644±0.04785 MPa 및 3.30±0.735 MPa의 UTS 및 모듈러스를 가졌다.

최소 탄성을 갖는 제형은 4.46±0.455 MPa의 모듈러스 점수를 갖는 F5였다. 이러한 점수는 보고된 조기 양막 탄성(3.60±1.4 MPa 수화(Benson-Martin et al., 2006))의 표준 편차 내에 있으며, 이는 이러한 필름이 현재의 금본위제 담체와 동등하거나 보다 더 탄력적임을 시사한다. F5는 F3 및 F4와 비슷한 0.626±0.108 MPa의 UTS를 가졌다. 4개의 조성물에 대한 신장율 값을 계산하였으며, 각각의 F2, F3 및 F4는 도 17에 나타낸 바와 같이 F5보다 통계적으로 유의하게 더 큰 신장율을 나타내었다.

10 N 하중 및 10 mm/min의 신장 속도를 갖는 Instron 5544를 사용하여 F2, F3, 및 F4 제형으로 제조된 건조 필름을 추가로 테스트한 결과가 아래 표 5에 나타나 있다.

표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 이전 테스트와 유사한 결과가 관찰되었으며, 기계적 특성의 우수한 재현성으로 필름을 제조할 수 있음을 보여주었다.

고찰

테스트된 4 가지 제형으로부터 형성된 박막 필름의 기계적 특성은 담체 물질로서의 적합성을 지지한다. Instron 고정 클램프에서 샘플의 조기 파손으로 인한 체계적인 과소 표시에도 불구하고, 테스트한 각각의 필름은 공기 건조에 의해 보존하였을 때 18.4±8.23 Pa이고 글리세롤에서 보존하였을 때 9.9±4.14 Pa인 양막의 보고된 상부 인장 강도를 몇 자릿수 이상 초과한다(von Versen-Hoeynck et al., 2008). 그러나, 문헌에 보고된 이러한 값들은 수화 인장 테스트 결과였던 반면, 본 실시예에서 테스트한 샘플은 건식 테스트였다.

F2 필름은 0.363±0.0213 MPa의 가장 낮은 UTS 강도 점수를 가졌다. 그럼에도 불구하고, 이것은 글리세롤 보존 양막의 강도에서 45500배의 차이를 나타낸다. 용어 양막의 영 모듈러스는 2.29±0.7 MPa이며, 조기 영 모듈러스는 3.60±1.4 MPa이다(Benson-Martin et al., 2006). F2는 1.65±0.663 MPa의 영 모듈러스를 가졌다.

영 모듈러스는 재료의 강성의 척도를 나타내는 것으로, 점수가 높을수록 강성이 커진다. 반대로, 더 낮은 점수는 재료가 더 큰 탄성 - 탄성 변형을 당하고 변형력이 제거된 후 원래의 형상으로 되돌아가는 능력 -을 갖는 것을 나타낸다. 따라서, F2는 인간의 양막보다 더 강하고 더 탄력적이다.

F3 - F5의 상부 인장강도는 각각 0.673±0.0272 MPa, 0.644±0.490 MPa 및 0.626±0.108 MPa로 F2보다 더 컸다. 상기에서 논의한 바와 같이, 이러한 결과는 클램프에서 실패한 샘플로 인해 이들 재료의 실제 강도에 대한 과소 표시로서, 이는 클램핑 절차가 테스트 도중에 재료를 약화시켰음을 나타낸다.

이들 제형 중 최소 탄성을 갖는 제형은 4.46±0.455 MPa의 영 모듈러스를 갖는 F5였다. 이러한 모듈러스는 보고된 조기 양막 탄성(3.60±1.4 MPa(Benson-Martin et al., 2006))의 표준 편차 내에 있으며, 이는 모든 크리스탈린-함유 제형이 현재의 금본위제 담체와 적어도 동등하게 탄력적이거나 보다 더 탄력적이라는 것을 시사한다. 병든 조직에 물리적인 스트레스를 가하지 않고 환자의 눈의 형상에 순응하는 능력은 림발 줄기 세포 담체로서 사용하는데 매우 중요하다는 것이 이해될 것이다.

본 명세서에서 기술되는 조성물이 바람직하게 사용될 수 있는 외과적 용도를 포함한 많은 용도는 어느 정도의 치수 안정성을 필요로 한다는 것이 또한 이해될 것이다. UV 경화를 통해 제조되는 크리스탈린 하이드로겔의 팽윤 거동을 평가하였다. 도 18은 PBS, pH 7.4에서 24시간 팽윤 후 대조군(PEGDA 단독), 및 6% 및 12% 크리스탈린 기반 하이드로겔의 팽윤 백분율을 나타낸다. 분명히 알 수 있는 바와 같이, 6% 및 12% 크리스탈린 하이드로겔 모두에서 PEGDA 대조군에 비해 감소된 팽윤이 관찰되었으며, 이는 개선된 팽윤 특성을 나타낸다.

실시예 6: 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물의 생체적합성의 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 박막 필름 조성물의 생체적합성의 평가 방법을 기술한다.

물질 및 방법

세포 배양

니콘 바이오스테이션(Nikon Biostation) 상에서의 샘플 배양 및 살아있는 세포 이미징은 37℃, 5% CO₂ 및 주변 습도에서 수행하였다. 상피 세포 배지(100 mL당 MEM, 10 mL(10%) FSC, 1 mL(1%) Anti-Anti) 및 외식편 배지(100 mL당 DMEM/F12, 10 mL(10%) FCS, 50 μL ITS, 100 μL EGF, 1 mL(1%) Anti-Anti)를 사용하였다. 세포의 성장 속도에 따라, 배지 교체 사이의 시간은 다양하였다. 일반적으로는, 50%의 배지를 3 내지 4일마다 교체하였다. 세포 플라스크가 80% 융합(confluency)에 도달하였을 때 계대하였으며, 초과 세포는 필름 배양에 사용하거나 폐기하였다.

Gibco^TM TrypLE^TM Express Enzyme(1X) No Phenol Red(Gibco, 12604-013) 및 적절한 배지를 수조에서 37℃로 가온하였다. 플라스크의 배지를 폐기물에 쏟아 부은 다음, 소량의 가온된 PBS를 플라스크에 첨가하여 남아 있는 혈청 에스테라제 활성을 약화시켰다. 세정 후, PBS를 또한 폐기물에 쏟아 부었다. 플라스크의 바닥을 완전히 덮도록 충분한 양의 TrypLE^TM을 첨가한 다음, 37℃에서 10 내지 15분 동안 진탕하면서 배양하였다. 배양 시간이 경과하면, 세포 부착을 관찰하였다. 다량의 세포가 여전히 부착되어 있었을 경우, 플라스크 내용물을 수집하고 TrypLE^TM 처리를 반복하였다. 모든 세포를 분리하고 수집하면, 현탁액을 380×g에서 7분 동안 부드럽게 펠렛화하였다. 이어서, 상청액을 딸아 버리고, 세포를 예상 세포 수에 적합한 부피(컨플루언트 T75의 경우 1 내지 3 mL)의 배지에 부드럽게 재현탁하였다.

세포 계수를 위해, 10 μL의 세포 현탁액을 10 μL의 Trypan Blue(Sigma, T6146)에 첨가하였다. 10 μL의 혼합물을 카운팅 그리드 상에 피펫으로 옮기고 10× 배율로 관찰하였다. 3개의 그리드 영역을 대각선으로 계수한 후, 하기 수학식을 실행하여 세포의 총 개수를 구하였다:

(계산된 세포 수/계산된 면적 수)×2(희석 인자)×10 ⁴ (세포 크기)=세포/mL

세포/mL×mL 세포 현탁액=세포 총수

이어서, 적절한 부피의 현탁액을 플라스크에 시딩하여 플라스크 크기에 필요한 시딩 밀도와 동등한 수의 세포를 제공하였다. 필름당 1×10⁴개의 세포를 상피 세포 필름 시딩을 위해 시딩하였다.

면역조직화학

샘플을 염색 전에 7일, 14일 또는 28일 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 배양하였다. 필름을 처리를 위해 초기 배양 웰에서 새로운 멸균 플레이트 웰로 제거하였다. 필름이 캐스팅 커버슬립에서 분리된 경우, 이를 별도로 이동시켰다. 새로운 커버슬립은 나중에 슬라이드를 형성할 때 필름이 아닌 유리에 부착되는 시각화 세포의 발생을 줄이기 위해 사용되었다. 샘플을 PBS에서 5×5분 동안 세척하여 배지를 제거한 다음, 4% 파라포름알데히드(PFA)로 20분 동안 고정하였다. PFA를 제거하고 샘플을 PBS에서 3×10분 동안 세척하였다.

고정 후, 샘플을 -20℃에서 10분 동안 메탄올 중에서 투과성화한 다음 PBS에서 3×10분 동안 다시 세척하였다. 혈청 차단은 샘플을 PBS 중 100 mM 글리신, 0.1% Triton X-100 및 10% 정상 염소 혈청 중에서 진탕기 상에서 2시간 동안 배양함으로써 수행하였다. PBS에서 3×10분 동안 세척하였다.

1차 항체를 PBS-B(PBS + 3% BSA) + 0.5% Triton X-100에서 준비하였고, 샘플을 그들의 적절한 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. PBS-B에서 3×10분 동안 세척하여 비접합 항체를 제거하였다. 2차 항체 배양을 PBS-B 중 실온에서 3시간 동안 수행하였다. PBS에서 3×10분 동안 세척하였다.

핵 염색은 진탕기 상의 암실에서 60분 동안 PBS에서 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 처리를 통해 달성하였다. 필름을 Citiflour(Electron Microscopy Sciences, 1797025)(부착되지 않은 필름에 대해 새 커버슬립을 배치하였음)의 슬라이드 상에 장착하고 네일 바니시(varnish)로 밀봉하기 전에, 5×PBS 헹굼을 수행하여 남아 있는 DAPI를 제거하였다.

필름 상의 세포주 배양은 SuperFrost Plus Microscope Slides(LabServ, LBS4951+) 상에서 수행하였으며, 필름 또는 양막 상의 외식편 배양은 Single Concave Microscope Slides(Sail Brand, 7103) 상에서 수행하였다.

본 실시예에서 설명된 실험은 면역조직화학을 포함하고 현미경 슬라이드 상에 장착된 샘플의 생산을 필요로 하였기 때문에, 박막 필름 제형의 시험용 박막-필름 캐스팅은 원형 유리 커버슬립(Knittel Glass) 상에서 직접 제조하였다. 테스트된 부피는 10 μL, 50 μL, 100 μL 및 150 μL였다. 100 μL 및 150 μL 부피는 건조 과정에서 가장자리에 금이 간 더 두꺼운 필름을 생성하였으며, 10 μL 부피는 거의 감지할 수 없는 필름을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 50 μL 캐스팅은 가장자리의 변형이 제한적이었고 시각적으로 완전한 필름을 형성하였기 때문에 향후 캐스팅용으로 선택되었다.

세포 담체로서의 크리스탈린 단백질 필름의 적합성에 대한 초기 테스트는 세포 집단을 장기적으로 유지하고 확장할 수 있는지 여부를 조사하는 데 필요하였다. 림발 줄기 세포 결핍증(LSCD)의 치료적 처리에서, 세포는 안구 표면에 외과적으로 이식하기 전에 양막 상에서 3주 동안 배양한다. 성공적인 세포 전달이 보고된 임상적 치료의 최소 접촉 시간은 3일이었다. 그러나, 환자의 눈으로 최적의 세포 전달을 위해서는 1주일 초과의 접촉 시간이 바람직하다. 따라서, F2 필름에 2개의 체내 인간 각막 찰과상 세포주(in-house human corneal scrape cell line)(본 명세서에서는 세포주 1 및 세포주 2로 지칭함)로부터의 상피 배지 50 μL 중의 1×10⁴개의 세포를 시딩하고 28일 동안 배양한 다음, 이들 세포의 생존 및 확장을 평가하였다.

7일째, 14일째, 및 28일째에 광학 현미경으로 세포 부착 및 증식을 관찰하였다. 세포를 고정하고 항-알파 튜불린, 항-사이토케라틴 3/12 또는 항-평활근 액틴으로 염색한 다음 Alexa-Fluor 488을 이차 접합하였다.

박막 필름 배양물 및 대조군 배양물에서 참조 유전자의 유전자 발현을 RNA 발현으로 평가하였다.

결과

전술한 바와 같이 제조된 F2 박막 필름 제형은 생체적합성이 매우 우수하였다. 도 19는 항-알파 튜불린 및 DAPI 핵 염색으로 시각화된, 세포 접종 후 7일, 14일 및 28일째에 F2 필름 제형에 대한 세포 부착 및 생장을 나타낸다.

F2 박막 필름은 7일째에 관찰된 실질적인 세포 밀도로부터 알 수 있는 바와 같이 우수한 초기 세포 접착력을 가졌다(도 19: A, D, G, J). 배양 도중 세포 생장을 관찰한 결과(데이터는 표시되지 않음) 14일 이내에 중앙부(시딩 위치)에서 가장자리까지 전체 필름의 세포 융합을 발견하였다. 도 19의 C에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포 배양 28일째에 세포는 과잉 융합되어 서로 성장하기 시작하였다. 항-평활근 액틴 및 DAPI 핵 염색으로 염색된 복제 배양물에서 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 표시되지 않음). 특히, 배양 7일째와 28일째 사이에 세포 형태의 명백한 변화는 관찰되지 않았으며, 이는 본 명세서에서 기술되는 박막 필름 제형이 세포가 배양을 시작한 명백한 기질과 다른 세포 운명을 낮추도록 유도하지 않았음을 시사한다.

실제로, 기질 표현형은 각막 상피 유전자 KRT12 및 KRT3의 발현이 관찰되지 않은 배양된 세포의 RNA 발현 분석에 의해 지지되었다(데이터는 표시되지 않음). COL4A5의 발현은 안구 기원을 확인하였으며, 관찰된 KRT13 발현의 결핍은 결막 오염을 나타내지 않았다(데이터는 표시되지 않음). ACTA2 및 VIM 발현은 시간 경과에 따라 거의 일정하게 유지되었으며, 조직 배양 플라스틱에서 성장한 대조군 세포와 유사한 배수 차이를 보였다(데이터는 표시되지 않음). PCNA의 발현은 조직 배양 플라스틱 대조군보다 모든 시점에서 필름에서 더 컸다. 초기 7일째 대조군에 대한 필름 제형에서 ABCG2, TP63 및 ΔNP63의 검출은 없었지만, 28일째 대조군은 약한 발현을 나타내었다.

F3 및 F4 박막 제형에서도 또한 높은 생체적합성이 관찰되었으며, 여기서 인간 각막 상피 세포의 DAPI 염색은 도 20 및 도 21에 나타나 있는 바와 같이 F2 제형에서 관찰된 것과 유사한 성장을 나타내었다.

실제로, 본 명세서에서 기술되는 바와 같이 제조된 크리스탈린 필름 조성물의 생체적합성은 배양물에서 세포 수가 급격히 증가하도록 하려는 것이었다. 도 22에 도시된 바와 같이, 크리스탈린 박막 필름 제형은 배양 첫 주(도 22, 좌측 그래프) 및 배양 두 번째 주(도 21, 우측 그래프) 모두에서 세포 수에서 다중 배수 증가를 지원하였으며, 조직 배양 플레이트 단독 대조군만 전반적으로 유사하였다(도 21, 중간 그래프).

전반적으로, 크리스탈린을 포함하는 박막 필름은 증식성 세포 집단을 지원하였으며, 조직 배양 플라스틱 조건과 동등한 운명을 유지하는 성장 표면을 제공하였다.

실시예 7: 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물의 생체적합성의 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 추가의 박막 필름 조성물의 생체적합성의 평가 방법을 기술한다.

물질 및 방법

조성물 F1 내지 F6(상기 표 3 참조)으로부터 형성된 박막 필름은 각각 60 mg/mL 크리스탈린 단백질 및 2% w/v 글리세롤을 포함하였지만 나타낸 바와 같이 가교결합제, 가소제, 또는 공-개시제에서 상이하였다.

모든 시험 필름에 50 μL의 배지 중의 1×10⁴ 세포를 시딩한 다음, 추가 배지로 덮기 전에 세포가 정착하고 부착되도록 10분을 제공하였다. 같은 날, 광학 현미경을 사용하여 10분 동안 필름에 대한 초기 세포 부착 수준을 관찰하였다.

결과

도 23에서 볼 수 있는 바와 같이, 필름들 사이의 세포 접착 수준은 상당히 다양하였다. F3, R5P + L-아르기닌 필름 조성물(도 23, 상단 우측)이 가장 유망한 것으로 나타났으며, F4(도 23, 하단 좌측) 및 F2(도 23, 상단 중앙)가 그 뒤를 이었다. PEGDE 필름, F1(도 23, 상단 좌측) 및 F5(도 23, 하단 중간)는 F2 내지 F4에 비해 접착 수준이 크게 감소하였다. F5에 RGD 모티프를 추가해도 본래의 F1 제형에 비해 부착 수준이 크게 증가하지 않았다. F6은 불투명하였으며, 추가 고려 대상에서 제외하였다(도 23, 하단 우측).

접종 4일 후, 담체로서의 박막 필름 제형의 효능을 LIVE/DEAD 염색과 결합된 현미경을 사용하여 평가하였다(데이터는 표시되지 않음). 육안 검사에서, F2와 F3이 가장 크고 동등한 세포 보유력을 가졌다. F1, F4 및 F5는 세포를 거의 갖고 있지 않았다. 어떤 제형에도 사멸 세포가 존재하지 않았다. F6은 불투명하게 남아 있어 세포의 시각화가 불가능하였다.

실시예 8: 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물의 장기 생체적합성의 특성화

본 실시예는 장기간의 세포 배양 기간 동안 크리스탈린 단백질을 포함하는 박막 필름 조성물의 생체적합성의 평가 방법을 기술한다.

물질 및 방법

조성물 F2, F3 및 F4로부터 박막 필름을 형성하였다(상기 표 3 참조). 인간 1차 각막 상피 세포를 이러한 박막 필름 상에서 7일, 14일 및 28일 동안 성장시키고, DAPI 핵 착색제(청색) 및 총 알파 튜불린(적색)으로 염색하여 형태학적 분석을 위한 세포 골격을 시각화할 수 있었다.

결과

도 24에서 볼 수 있는 바와 같이, F2(도 24a), F3(도 24b), 및 F4(도 24c)에서 성장한 세포는 특히 유리-단독 대조군(도 24d)과 비교하였을 때 연장된 세포 배양의 전체 기간에 걸쳐 7일(좌측), 14일(중앙), 그리고 다시 28일(우측)에 증가된 정렬 및 밀도를 나타내었다. 증가된 정렬 및 밀도는 20×(상단) 및 63×(하단) 배율에서 쉽게 알 수 있었다.

실시예 9: 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물의 생체적합성의 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 박막 필름 조성물의 생체적합성의 평가 방법을 기술한다.

물질 및 방법

각막 림발 외식편

림발 외식편은 UV 처리된 클래스 2 후드 내에서 채취하였다. 간단히, 멸균 거즈 조각을 에탄올에 적신 코르크 판에 고정하였다. 멸균된 집게를 사용하여 기증자 각막 림을 운송 배지에서 제거하여 멸균 거즈 위에 놓았다. 이어서, 조직을 연신하고 평평하게 하기 위해 장력을 적용하는 방식으로 위치를 잡은 에탄올 멸균 핀을 사용하여 테두리를 거즈가 덮혀 있는 보드에 림을 고정하였다. 메스를 사용하여 전방 림발 표면 깊이의 1/3을 절개한 다음, 과량의 각막 및 공막 조직을 제거하였다. 이어서, 전방 림발 표면을 발라내어 제거하고 1 mm 폭의 조각으로 절단하기 전에 페트리 접시 뚜껑에 있는 소량의 수송 배지에 넣었다. 그런 다음, 외식편을 배양 표면에 놓고, 10분 동안 정착 및 부착되도록 놓아둔 다음, 측면에서 배지를 조심스럽게 첨가하였다.

양막 디스크

인간 양막은 뉴질랜드 국립 안구 은행에서 입수하였으며, -20℃에서 니트로셀룰로오스 여과지 상의 글리세롤에 보관하였다. 조직 배양을 위한 처리를 위해, TryPLE Express에서 10분 동안 배양한 후 세포 스크레이퍼로 양막 표면을 부드럽게 긁어내고 표면을 멸균 PBS로 헹구었다. 이어서, 8 mm 멸균 생검 펀치(Miltex, REF33-37)를 사용하여 배양 섹션을 얻었다.

4개의 대표적인 박막 필름 제형 F2 - F5에 대해 인간 각막 외식편 증식 실험을 수행하였다. 5명의 개별 기증자에 대한 외식편 증식 실험과 추가로 2명의 기증자에 대한 RNA 발현 분석을 수행하였다.

외식편 실험을 위해, 림발의 전방 1/3 부분에서 1 mm 조각을 절개하고 금본위 표면인 대조군으로서 양막과 함께 크리스탈린-함유 박막 필름 제형 위에 놓았다. 양막에 대해 이중으로, 필름 제형당 3중 외식편을 수행하였다.

방대한 수의 외식편 증식이 생성되었기 때문에, 각각의 생물학적 복제물 중 대표적인 복제물을 염색하고 이미지화하였지만, 그러나 모든 복제물의 살아있는 세포의 광학 현미경 검사는 4개의 시점에서 수행하였다.

결과

모든 기증자 외식편에서 F2 박막 제형으로 강력한 세포 증식이 있었다. 첫 번째 세포는 배양 4일째에 조직에서 표면으로 이동하는 것을 볼 수 있었다. 외식편은 크리스탈린 필름에 성공적으로 부착되었으며, 14일 배양 기간에 걸쳐 3개의 기증자 외식편 모두가 필름 표면을 완전히 채웠다(평균 캐스팅 직경 ~12 mm).

F2 박막 필름 상의 림발 외식편의 대표적인 광학 및 형광 현미경 시각화는 도 25에 나타나 있다. 증식의 조성은 배양 시간과 기증자 모두에 따라 다양하였다. 기증자 1 및 2의 증식은 외관이 기질적이고 길쭉하고 이동성이 높았으며(예를 들어 도 25의 A, 도 25의 B 참조), 비멘틴(적색)에 대해 양성으로 염색되었다(도 25의 D). 이와 비교하여, 기증자 3은 뚜렷한 자갈 형태의 세포의 존재 및 비멘틴 염색의 결여로 인하여 입증되는 상피 집단을 먼저 확장하였다(데이터는 표시되지 않음).

기증자 1 및 2의 기질 증식과 관련하여, 림발에서 자라난 뚜렷하고 융기된 조직 가교의 형성이 있었다. 도 25의 C에 명확하게 나타나 있는 바와 같이, 이러한 가교는 기질 조성이고 앵커 케이블과 유사하여 외식편을 F2 필름의 표면에 단단히 부착시킨다.

F3 필름의 외식편 증식은 F2 필름에 필적하였다. 조직은 필름 표면에 부착되었으며, 4일째에 첫 번째 세포 증식이 다시 나타났다(데이터는 표시되지 않음). 기증자 1은 세포 증식 가교의 형성을 나타내었지만, 또한 덜 보편적인 비멘틴 발현을 갖는 더 큰 비율의 상피 세포를 확장하였다(데이터는 표시되지 않음). 기증자 2는 외식편에서 분리된 융기된 세포의 가교가 추가된 유사한 형태를 가졌다. F2의 증식 패턴과 유사하게, 기증자 3은 다시 조밀하게 채워진 어레이에서 상피 세포의 예비 증식을 가졌다(데이터는 표시되지 않음).

약간의 물리적 파괴 후, F4 박막 필름 상의 기증자 1 외식편을 재배치해야 했으며, 그 후 4일과 7일 사이에 외식편에서 필름 표면으로 세포의 빠른 이동이 발생하였다. 기증자 1의 가교 형성 특성은 배양 11일째에 관찰되었으며, 14일째에 외식편을 둘러쌌다(데이터는 표시되지 않음).

F5 박막 필름 상의 외식편은 몇 개의 작고 단리된 세포 집단의 성장을 지원하였지만 세포 증식은 제한적이었다. 특히, 줄기 세포 이동 및 확장은 기증자 2 외식편에서 관찰되었고, ABCB5 라벨링의 다중 클러스터는 14일째에 필름 상에서 볼 수 있었으며 증식 세포 집단의 확립이 관찰되었다(데이터는 표시되지 않음). 줄기 세포 구체는 배양 11일째에 형성되는 것으로 나타났고, 다른 모든 기증자 2 증식에서 관찰된 고정 조직 가교와 유사한 구조가 관찰되었다(데이터는 표시되지 않음). 기증자 3에 대한 외식편은 F5 필름에 성공적으로 부착되었지만, 제형 F2 내지 F4에서 관찰된 세포 이동보다는 다소 늦은 7일째까지 세포 증식은 관찰되지 않았으며(데이터는 나타내지 않음), 여기서 세포는 4일째까지 표면으로 이동하고 있었다.

특히, ABCB5 라벨링의 성공적인 시각화는 각각의 필름 집단에 대해 적어도 하나의 기증자 증식에서 볼 수 있었으며, 이는 생존 가능한 줄기 세포 집단의 존재를 나타낸다.

양막 대조군

크리스탈린을 포함하는 박막 필름 제형과는 대조적으로, 양막 상의 외식편의 증식은 가변적이었다. 기증자 1 외식편은 외식편으로부터 크고 융합된 세포 증식을 생성하여 비멘틴에 대해 양성으로 염색되었다(데이터는 표시되지 않음). 기증자 2는 조직의 상부측과 좌측으로 연장하는 작은 비대칭 증식을 가졌지만, 하부측에는 단지 작은 가장자리만 존재하였다. 기증자 3의 외식편은, 막에 부착되기는 하였지만, 14일간의 배양 기간 동안 양막 상에서 어떠한 세포 증식도 생성하지 않았다.

양막 상에서의 증식을 시각화하는 것은 불투명하고 고배율 이미징을 불가능하게 만드는 안정화 니트로셀룰로오스 필터의 존재로 인해 어렵게 되었다. 5× 배율에서, ABCB5 양성 세포의 작은 집단이 기증자 2 외식편의 상단 가장자리 바로 위에서 관찰되었다.

RNA 발현

필름 외식편 증식으로부터의 유전자 발현 데이터를 양막 대조군에 대한 외식편 증식 발현과 비교하였다. 모든 경우에, 평가된 필름 제형인 F2 상에서의 막대(bar) PCNA 발현은 양막과 비교하였을 때 증식 마커 PCNA 및 MKI67의 발현이 몇 배 증가하였다. 상피 및 기질 마커 모두 모든 필름 상에서 발현되었으며, 이는 고유 림발 자리에 존재하는 모든 세포 유형의 성공적인 증식을 나타낸다. 양막과 비교하였을 때 VIM 및 KERA의 발현이 현저하게 증가하였는데, 이는 크리스탈린 함유 필름이 각막 기질 세포의 확장을 촉진하였음을 시사한다. TP63, ΔNp63 및 Notch1의 발현에서 관찰된 감소는 빠르게 확장되는 집단에서 예상되었다.

표 6은 박막 필름 제형 F2, F3, F4 및 F5 상에서, 및 양막 상에서 성장하였을 때 외식편 기증자 6과 7 사이에서 평균한 14일째에 샘플에서 검출된 줄기 세포 마커 ABCB5 및 ABCG2의 μl당 사본(copy)의 수를 나타낸다.

표 6에서 알 수 있는 바와 같이, ABCB5 및 ABCG2의 발현은 양막과 비교하여 모든 크리스탈린-함유 필름에서 더 컸다. 이것은 림발 줄기 세포 확장 이외에도 딸 전구 세포(daughter progenitor cell)가 양막과 비교하였을 때 더 잘 분화되었음을 시사한다.

실시예 10: 크리스탈린 단백질을 포함하는 박막 필름 조성물의 광학적 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 박막 필름 조성물의 광학적 투명도 및 투과율의 평가 방법을 기술한다.

상기 표 3에 기술된 바와 같은 제형 F2, F3, 및 F4로부터 박막 필름을 제조하였다.

가시 스펙트럼(400 내지 700 nm) 범위에 걸친 광의 투과율을 모든 샘플에 대해 평가하였다.

도 26 및 27에서 분명히 볼 수 있는 바와 같이, F2, F3, 및 F4로부터의 박막 필름은 습윤 상태 및 건조 상태 모두에서 가시 스펙트럼 범위에 걸쳐 매우 높은 투과율을 갖는다. 실제로, 수화 및 건조 F2 제형에 대해 도 26a에, 수화 및 건조 F3 제형에 대해 도 26b에, 그리고 수화 및 건조 F4 제형에 대해 도 26c에 나타나 있는 바와 같이, 각각의 제형에 대해 더 높은 파장에 걸쳐 90% 이상의 투과율이 관찰되었다. 수화된 F2, F3 및 F4 제형은 우수한 색상 균일성을 나타내었고(각각, 도 27의 (a), (b), 및 (c) 참조), 추가적인 투과율 분석은 또한 높은 투과율을 나타내었으며, 여기서 모든 필름은 안구적 용도에 필요한 72% 투명도 임계값보다 더 우수한 투명도를 나타내었다(도 27, 하단 참조).

실시예 11: 페길레이션화된 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물의 제조

본 실시예는 페길레이션화된 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물의 제조 방법을 기술한다.

페길레이션화(PEGylation) 전략은, 예를 들어, 개선된 저장 수명 및 효능 모두에 대해 크리스탈린 단백질의 안정성에 대한 영향을 평가하고 크리스탈린 단백질의 응집성 가교결합을 통해 크리스탈린 하이드로겔을 얻기 위해 탐구하였다. 추출 후, 조 크리스탈린 추출물을 다른 PEG 유도체와 반응시켜 겔 형성에 도움을 주는 가교결합을 위한 작용기에 대한 접근을 최적화하였다.

PEG-크리스탈린 접합체를 특성화하기 위해 SDS-PAGE를 사용하여 페길레이션화 반응을 평가하였다. 도 28에 나타나 있는 바와 같이, PEG의 존재 하에서의 SDS-PAGE 상의 고분자량 종의 존재는 성공적인 크리스탈린 페길레이션화를 확인시켜 주었다.

실시예 12: 크리스탈린 단백질을 포함하는 접착제 조성물의 광학적 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 접착제 조성물의 광학적 투명도 및 투과율의 평가 방법을 기술한다.

상이한 농도의 PEGDA, 크리스탈린 및 광개시제(리보플라빈 및 irgacure 2959 모두)를 초기에 스크리닝하여 PEGDA 기반 크리스탈린 하이드로겔을 수득하였다.

대표적인 실시형태는, 투명한 하이드로겔을 얻기 위해 120 mg/mL의 하이드로겔 중의 크리스탈린 단백질의 최대 농도와 함께 PEGDA 및 irgacure 2959를 각각 15 및 0.5(w/v %)의 농도로 사용하여 제조하였다. 도 29 중간 및 도 29 하단을 도 29의 상단과 비교하였을 때 알 수 있는 바와 같이, PEGDA 단독 및 PEGDA + 크리스탈린 단백질 하이드로겔의 초기 시각적 스크리닝은 60 mg/mL 및 120 mg/mL의 크리스탈린을 포함하는 것이 하이드로겔 투명도에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타내었다.

가시 스펙트럼(400 내지 700 nm) 범위에 걸친 광의 투과율을 예비-경화된 샘플, 및 경화된 하이드로겔 모두에 대해 평가하였다. 하이드로겔은 예비-경화된 프리믹스 샘플(50 내지 600 uL 범위)의 다양한 부피를 사용하여 캐스팅하였다. 예비-경화된 샘플 및 하이드로겔 모두 높은 투과율(>80%)을 나타내었다. 인간 각막 이식용 재료에 적합한 현재 제안되어 있는 임계값은 72%이다(Gonzalez-Andrades et al. 2015). (600 uL의 프리폴리머 용액을 사용하여 캐스팅한) 하이드로겔의 광학적 투명도는 도 30에 나타나 있다.

도 30에서 명확하게 볼 수 있는 바와 같이, 가시 스펙트럼 범위에 걸쳐 매우 높은 광학적 투명도 및 투과율을 갖는 크리스탈린 단백질-함유 하이드로겔을 포함하는 하이드로겔은 본 명세서에서 기술되는 조성물을 사용하여 수득할 수 있다.

PEGDA 하이드로겔에 크리스탈린 단백질이 혼입되었는지를 확인하기 위해, ATR-FTIR을 수행하였다. 임의의 가교결합되지 않은 크리스탈린을 제거하기 위해, 하이드로겔을 24시간 동안 물 중에 배치하고, 37℃에서 밤새 건조한 다음, FTIR 분석하였다. PEGDA 단독, 및 PEGDA-크리스탈린 하이드로겔을 비교하는 대표적인 FTIR 그래프가 도 31에 나타나 있다. 1627, 1637, 3300, 3100, 619 nm에서의 피크는 각각 베타-시트, NH 연신, Ist 아미드, 및 OCN 굴곡에 해당한다.

PEGDA-크리스탈린 샘플의 1627 nm에서의 피크는 크리스탈린 단백질이 베타-시트 구조를 나타내는 것으로 알려져 있기 때문에 크리스탈린 단백질의 존재를 확인한다. 실제로, PEGDA-크리스탈린에 대한 FTIR 스펙트로그램은 상기 실시예 2에서 기술되고 도 10에 도시되어 있는 바와 같이 조 크리스탈린 추출물에 대해 관찰된 것과 매우 유사하다.

실시예 13: 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물의 물리적 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 대표적인 조성물의 특정의 물리적 특성의 평가 방법을 기술한다.

크리스탈린 조성물 F2, F3, 및 F4를 전술된 바와 같이 제조하였다.

이러한 크리스탈린 필름의 습윤성을 측정하기 위해 도 32에 도시되어 있는 바와 같이 접촉각 값을 측정하였다. 하기 표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 각각의 크리스탈린 단백질 제형의 접촉각 값은 90° 이하였으며, 이러한 조성물을 친수성 물질로 분류하였다.

이어서, 21일의 기간에 걸친 수화 동안 질량 변화를 측정하여 이러한 크리스탈린 필름의 안정성을 평가하였다. 도 33에서 볼 수 있는 바와 같이, 수화 시에 필름으로부터 손실되는 대부분의 질량 손실(출발 질량과 비교하였을 때)은 수화 후 첫 1시간 이내에 발생하였다. 이러한 빠른 질량 손실은 결합되지 않은 단백질의 빠른 확산의 결과이다. 이러한 초기 손실 후, 수화된 필름의 질량은 이후 21일 동안 안정적으로 유지되었다.

멸균 처리되고 유용한 구조적 완전성 및 기능을 유지하는 이러한 크리스탈린 필름의 능력은 외과적 수술 절차와 같은 바람직한 응용 분야에서의 그들의 용도에 매우 중요하다. 크리스탈린 조성물 F2 및 F3은 25 내지 32 KGy에서 감마 멸균하였다. 도 34는 F2 필름(도 34의 (a)) 및 F3 필름(도 34의 (b))에서 침출된 크리스탈린 단백질의 원형 이색성 분광 분석의 결과를 나타내는 것으로, 여기서 실선 데이터는 24시간 동안 milliQ에서 배양된 필름을 나타내며, 점선 데이터는 24시간 동안 milliQ에서 배양된 감마 멸균 필름을 나타낸다. 217 nm에서 최소 음성 피크(negative peak)의 존재는 감마 멸균된 필름 및 멸균되지 않은 필름의 샘플에서의 β-시트 구조를 나타내는 것으로, 감마 멸균이 필름 내의 크리스탈린 단백질의 고유 구조에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.

도 35는 실온에서 3개월 동안 보관한 후의 크리스탈린 필름(도 35의 (a)), 전술된 바와 같은 감마 멸균 후의 크리스탈린 필름(도 35의 (b)), 및 감마 조사 후의 수화된 필름 샘플의 대표적인 이미지를 나타내는 것으로, 이는 이들 필름이 구조적 완전성을 보유하고 불용성을 유지하였음을 나타낸다.

실시예 14: 크리스탈린 단백질을 포함하는 접착제 조성물의 기능적 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 접착제 조성물의 접착 효율의 평가 방법을 기술한다.

조성물의 접착 특성을 입증하기 위해, 닭 가슴살 샘플을 대표적인 연성 습윤 조직으로 사용하였는데, 이는 이것이 입수가 용이하고 값이 저렴하기 때문이다. 메스 블레이드를 사용하여 닭 가슴살 샘플을 절개하고, 200 μL의 PEGDA 단독(도 36, 상단 좌측) 및 1%의 광개시제를 포함하는 PEGDA 기반 크리스탈린(도 36, 상단 우측) 예비-경화 샘플을 적용한 다음, 3분 동안 UV에 노출하였다.

코팅된 용액은 즉시 팽윤된 겔로 전환되었고, 이러한 겔은 조직에 단단히 부착되었다(도 36).

도 36에서 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 크리스탈린 함유 조성물(도 36, 하단 우측)은 절개부를 효과적으로 밀봉하였고, PEGDA 단독 대조군(도 36, 하단 좌측) 조성물이 적용된 절개부를 개방하기에 충분한 물리적 연신에도 불구하고 밀폐된 상태를 유지하였다.

이들 데이터는 본 명세서에서 기술되는 대표적인 크리스탈린 함유 조성물의 접착 효능을 뒷받침한다. 이들 실시예는 본 명세서에서 기술되는 하나 이상의 크리스탈린 단백질을 포함하는 바이오 중합체 조성물이 바이오 접착제로서 사용하기에 적합하고, 이들의 높은 투명도를 제공하며, 안과적 수술에 사용하기에 특히 적합하다는 것을 명백히 입증한다.

실시예 15: 크리스탈린 단백질을 포함하는 접착제 조성물의 기능적 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 접착제 조성물의 접착 효율의 평가 방법을 기술한다.

가시광선 경화 또는 UV 경화에 적합한 PEGDA 크리스탈린 접착제 제형을 하기 표 8에 따라 제조하였다.

이러한 조성물의 시각적 특징을 나타내는 대표적인 이미지가 도 37에 나타나 있으며, 여기서 UV 경화된 제형은 도 37의 (a)에 나타나 있으며, 가시광선 제형의 경화 전(도 37의 (b), 좌측) 및 후(도 37의 (b), 우측)가 도시되어 있다. 이러한 경화된 제형은 높은 투명도를 갖기 때문에 안과적 수술에 사용할 수 있다.

조성물의 접착 특성 및 수술 용도에 대한 그들의 적합성을 조사하기 위해, 돼지 눈 샘플을 대표적인 안구 조직으로 사용하였다. 메스 블레이드를 사용하여 도 38의 a에 도시된 바와 같이 눈을 절개하였다.

이어서, 크리스탈린 하이드로겔 조성물을 절개부에 적용하고 3분 동안 경화시켰다(도 38의 b, UV 경화된 크리스탈린 조성물 참조).

도 38의 b에서 쉽게 볼 수 있는 바와 같이, 크리스탈린 함유 조성물은 습윤 조건(37℃)에서 절개부를 밀봉하고 최대 2일 동안 밀봉된 상태를 유지하였다. 이는 필요한 경우 추가의 수술 절차를 수행하기에 충분한 시간이다.

추가적으로, 크리스탈린 필름의 외과적 취급 용이성(tractability)은 도 39에 도시된 돼지 눈 모델을 사용한 봉합 테스트에서 확립되었다. 도 39의 (a)에서 쉽게 볼 수 있는 바와 같이, 크리스탈린 필름 제형 F3은 수화되었을 때 우수한 접힘성을 가졌고 그 자체에 달라붙지 않았으며, 접힌 부분을 뒤집을 수 있어 취급이 용이하였다. 도 39의 (b)는 F3 필름이 쉽게 절단되고, 리프팅되고, 각막 표면에 놓일 수 있음을 나타내며, 도 39의 (c)에 나타나 있는 바와 같이, 크리스탈린 필름은 쉽게 봉합될 수 있다.

UV 경화된 크리스탈린 제형의 접착 강도는 도 40의 상단에 도시된 바와 같이 돼지 피부 샘플을 사용하여 랩 전단 테스트에서 측정하였다. 도 40 하단은 이러한 테스트의 접착 강도에 대한 데이터를 나타내며, 여기서 오차 막대는 6개의 샘플에서 얻은 평균의 표준 편차를 나타낸다. 피브린 접착제 값은 문헌[Nakayama & Matsuda, 1999]에서 얻는다. 알 수 있는 바와 같이, 크리스탈린 필름의 접착 강도는 피브린 접착제에 대해 보고된 것과 유사하다.

이들 데이터는 본 명세서에서 기술되는 대표적인 크리스탈린 함유 조성물의 접착 효능을 뒷받침한다. 이들 실시예는 본 명세서에서 기술되는 하나 이상의 크리스탈린 단백질을 포함하는 바이오 중합체 조성물이 바이오 접착제로서 사용하기에 적합하고, 이들의 높은 투명도를 제공하며, 안과적 수술에 사용하기에 특히 적합하다는 것을 명백히 입증한다.

실시예 16: 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물의 생체적합성 및 세포 전달 효능의 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 박막 필름 조성물의 생체적합성, 및 특히 세포 집단을 전달하는 그들의 효능의 평가 방법을 기술한다.

물질 및 방법

8 mm 생검 펀치를 사용하여 기증된 인간 조직으로부터 중심 각막을 제거하였다. 각막을 -80℃의 멸균 MilliQ에서 동결/해동 사이클을 3회 반복하여 세포를 제거하였다. 세포를 제거한 후, 조직을 멸균 MilliQ로 3번 헹구어 임의의 이완된 세포 잔해를 제거한 다음, 37℃에서 밤새 4U/mL DNase I로 처리하였다. 5 mM EDTA를 사용하여 DNase를 비활성화하였다. LIVE/DEAD 염색은 살아있는 세포를 나타내지 않았다. 각막 조직을 멸균 PBS에서 5회 세척한 다음, 이를 5개의 동일한 세그먼트로 분할하고 아래와 같이 배열하였다:

1. 무세포 대조군 필름 위

2. 18-138A 배양 필름 위

3. 18-138A 배양 필름 아래

4. 18-147 배양 필름 위

5. 18-147 배양 필름 아래

F2 필름 제형을 13 mm 유리 커버슬립에 캐스팅한 다음 경화하였다. P3 및 P4에 있는 2개의 1차 인간 각막 상피 세포주로부터 2×10⁴개의 세포를 6개의 필름(각각의 세포주에 대해 3개) 상에 시딩하였다. 이들을 세포가 필름 표면을 가로질러 증식하도록 7일 동안 배양하였다.

샘플을 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 7일째에, 치료 표면에서 각막 조직을 제거하여 LIVE/DEAD 염색을 실시하였다. 이미지화한 후, 조직을 되돌려 보내어 치료 표면과 분리하여 배양하여 추가의 증식을 평가하였다.

결과

F2 박막 필름을 사용한 인간 상피 세포의 탈세포화된 인간 각막으로의 전달은 도 41에서 쉽게 볼 수 있는 것처럼 매우 효과적이었으며, 여기서 도 41의 (a)는 무세포 대조군을 나타내고, 도 41의 (b)는 배양된 세포 위에 놓인 각막을 나타내고, 도 41의 (c)는 배양된 세포 아래에 놓인 각막을 나타내며, 도 41의 (d)는 ×10 배율에서 배양된 세포 아래에 놓인 각막을 나타낸다. 전달 후 세포 증식 및 부착은 쉽게 인지할 수 있었다. 살아있는 세포의 존재(녹색), 사멸 세포의 부재(적색), 및 관찰된 증식 및 각막에 대한 세포의 부착은 건강한 세포가 각막 표면으로 전달되는 것을 확인해 준다. 이러한 데이터는 크리스탈린 필름이, 예를 들어 탈세포화된 각막 및 기타 표적 조직을 다시 채우는 데 성공적인 세포 담체로 사용될 수 있음을 확인해 준다.

이들 데이터는 안구 치료에 사용하기 위한 줄기 세포 집단, 예를 들어 각막 상피 세포 집단 및/또는 줄기 세포 집단의 전달을 포함하는 세포 전달 용도에서 본 명세서에서 기술되는 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물의 놀라운 효능을 입증한다.

실시예 17: 크리스탈린 단백질을 포함하는 활성제 전달 조성물의 기능적 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 하이드로겔 조성물의 활성제, 본 실시예의 경우에는 안구용 항생제를 전달하는 능력의 평가 방법을 기술한다.

물질 및 방법

본 실시예에서 사용되는 모든 박막 필름은 크리스탈린 - 120 mg/mL, 글리세롤 - 2%, 글루타르알데히드 10 mM를 포함하였다.

약물 방출 속도를 측정하기 위해, 클로람페니콜을 크리스탈린 필름 상에 로딩하였다. 크리스탈린 필름을 10 mm PDMS 시트 상의 용액에 로딩된 약물과 함께 캐스팅하였다. 이어서, 이 필름을 오븐에 넣고 밤새 건조시켰다. 건조되었을 때, 필름을 1 mL Eppendorf 튜브에 넣은 다음, PBS 또는 인공 눈물(Simulated Tear Fluid)(STF, NaCl 0.68 g, NaHCO₃ 0.22 g, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.008 g, KCl 0.14 g 및 100 mL가 되는데 필요한 양의 증류 탈이온수)의 500 uL 용액에 침지하였다. 이어서, 특정 시간 슬롯: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 60, 180, 300, 360분에서 100 uL 샘플을 채취한 다음, 271 nm 및 230 nm에서 플레이트 판독기 상에서 분석하여 클로람페니콜 농도를 결정하였다. 다층 필름(3층)의 경우에는 단지 중간 필름만이 약물(클로람페니콜)을 함유하였다. 다층 필름은 다음 조성: 크리스탈린 - 120 mg/mL, 글리세롤 - 2%, GA - 10 mM을 갖는 3개의 층으로 제조하였으며, 중간층은 클로람페니콜을 테스트 농도(3 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL 및 15 mg/mL)로 함유하였다. 제1 층을 10 mm PDMS 시트 상에 캐스팅하였고, 일단 건조되면, 제2(중간) 층을 그의 상부에 캐스팅하였으며, 그것이 건조되었을 때 최종 층을 그의 상부에 캐스팅하였다.

분석 방법

테스트하기 전에, 230 nm, 240 nm, 254 nm 및 271 nm에서 0 mg/mL 내지 3 mg/mL의 농도 범위를 갖는 흡광도를 사용하여 클로람페니콜의 표준 곡선을 생성하였다. 이어서, 이 곡선을 사용하여 샘플로부터 얻은 흡광도를 변환한 다음, 이를 농도로 변환하였다.

장기 약물 전달

7일 후 클로람페니콜의 농도를 측정하기 위해 필름을 최대 일주일 동안 용액 중에 방치하였다. 파장 230 nm 및 271 nm는 노이즈가 매우 적은 대조군을 생성하였으며, 이러한 파장에서의 판독값이 분석에 바람직하였다.

결과

단일층 필름의 경우, 약물 방출은 테스트된 모든 약물 로딩에 대해 10 내지 25분 사이에 피크에 도달하였다(도 42a, 도 42b 참조). 방출된 약물 %(로딩된 약물의 양의 백분율로서 용액 내로 방출된 약물의 양)는 농도와 유사한 프로파일을 따랐다(도 42c, 도 42d 참조). 모든 필름은 적어도 70%의 약물 방출에 도달할 수 있었으며, 10 mg/mL에서 100%에 도달하였다.

약물 농도에 대한 230 nm 및 271 nm에서의 판독값은 초기 피크에서 모든 샘플에 대해 약간 상승된 수준의 클로람페니콜을 판독한 271 nm 판독값과 매우 유사하였다(도 42c 및 도 42d 참조). 용액의 약물 농도는 초기 약물 로딩을 반영했으며, 이들 두 파장 간에 매우 잘 일치하였다.

마찬가지로, % 약물 전달을 평가할 때 두 분석 파장 사이에서 매우 양호하게 일치하였으며, 각각의 로딩된 농도에 대해 매우 유사한 결과를 나타내었다(도 42a 및 도 42b 참조).

동일한 경향이 모든 필름에서 관찰되었으며, 용액 내 클로람페니콜 농도에서의 큰 초기 증가는 약 15 내지 25분 정도에 안정기에 도달한 다음, 결국에는 감소하여 50분 지점을 지나면서 비교적 정상 상태 농도(steady state concentration)를 달성하였다.

STF를 사용하여 PBS 시험과 매우 유사한 결과를 얻었으며, 여기서 약물 전달 백분율과 농도는 30분 또는 그 이전에 피크까지 증가하고 그 후에는 정체기를 나타낸다(데이터는 표시되지 않음).

도 43b(230 nm)와 도 43d(271 nm), 및 도 43a(230 nm)와 도 43c(271 nm)에 각각 도시되어 있는 바와 같이, 방출된 약물 % 및 용액 내 전체 약물 농도는 모두 등가의 약물 로딩을 갖는 단일층 필름에 비해 다층 필름에서 감소하였다. 그러나, 이들 필름의 방출 프로파일은 도 43a 내지 도 43d에 도시되어 있는 바와 같이 보다 안정적이고 예측 가능하였다. 전반적인 경향은 단층 필름과 비슷하지만(정상 상태에 도달할 때까지 궁극적으로 감소를 초래하는 안정기가 있음), 피크 이후 농도 감소는 현저하게 줄어든다. 단일층 필름은 약 0.2 내지 1.2 mg/ml(10 mg/ml 필름의 경우에는 더 높음)의 농도 감소(최대값에서 정상 상태 영역까지)를 갖는 반면, 다층 필름은 0.1 내지 0.2 mg/ml(모든 필름에 대해)의 감소를 나타내었다. 따라서, 다층 필름으로부터의 약물 방출은 더 부드러운 곡선으로 표시되는 것처럼 더 일정하다.

다층 필름에 대한 방출 안정기는 60분에서 180분 사이에 나타나며, 곧바로 안정 영역이 이어진다.

% 약물 전달은 더 높은 농도의 필름이 용액에서 더 높은 농도의 약물을 생성한다는 점에서 약물 로딩과 일치한다.

실시예 18: 크리스탈린 단백질을 포함하는 활성제 전달 조성물의 기능적 특성화

본 실시예는 크리스탈린 단백질을 포함하는 하이드로겔 조성물의 활성제, 본 실시예의 경우에는 테트라사이클린 항생제를 전달하는 능력의 평가 방법을 기술한다.

물질 및 방법

본 실험에서, 테트라사이클린은 중합 동안 UV 경화된 크리스탈린 하이드로겔 조성물(0.1% irgacure 2959, 10% PEGDA)에 첨가되었으며(여기서는 '신선한 겔'로 지칭됨), 이와 별도로 동일한 제형의 건조된 UV 경화된 하이드로겔에 흡수되었다( 여기서는 '건조 겔'로 지칭됨). 약물 방출은 전술된 바와 같이 7일간에 걸쳐 평가하였다.

결과

누적 약물 방출을 도시하는 도 44에서 볼 수 있는 바와 같이, 신선한 겔(흑색선 데이터)로부터의 방출 프로파일은 전체 약물 방출과 마찬가지로 건조된 겔(회색선 데이터)의 방출 프로파일과 비슷하였다. 따라서, 테트라사이클린 항생제의 효과적인 전달은 중합 동안 또는 중합 후에 전달 조성물에 테트라사이클린이 도입되는지의 여부에 관계없이 달성될 수 있다. 이것은 특정 용도를 위한 활성제 전달 조성물을 제조하는데 있어서 바람직한 융통성을 제공한다.

이들 실시예는 본 명세서에서 기술되는 하나 이상의 크리스탈린 단백질을 포함하는 바이오 중합체 조성물이 약물 전달 물질, 예를 들어 안과적 수술 또는 기타 안과적 요법에서 안구에 효과적인 항생제의 전달 물질로서 사용하기에 특히 적합하다는 것을 명백히 입증한다.

간행물

Benson-Martin, J., Zammaretti, P., Bilic, G., Schweizer, T., Portmann-Lanz, B., Burkhardt, T., … Ochsenbein-Kolble, N. (2006). The Young's Modulus of Fetal Preterm and Term Amniotic Membranes. European Journal of Obstetrics & Gynecology And Reproductive Biology, 128(1), 103―107.

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Gonzalez-Andrades M, Cardona JdlC, Ionescu AM, Mosse CA, Brown RA (2015) Photographic-Based Optical Evaluation of Tissues and Biomaterials Used for Corneal Surface Repair: A New Easy-Applied Method. PLoS ONE 10(11): e0142099.

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Horwitz, J., Huang, Q. L., Ding, L., & Bova, M. P. (1998). Lens α-crystallin: Chaperone-like properties. In Methods in enzymology (Vol. 290, pp. 365-383). Academic Press.

Mason Posner, A Comparative View of Alpha Crystallins: The contribution of comparative studies to understanding function, Integrative and Comparative Biology, Volume 43, Issue 4, August 2003, Pages 481―491, https://doi.org/10.1093/icb/43.4.481

Nakayama, Y., & Matsuda, T. (1999). Photocurable surgical tissue adhesive glues composed of photoreactive gelatin and poly (ethylene glycol) diacrylate. Journal of biomedical materials research, 48(4), 511-521.

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Von Versen-Hoeynck, F., Steinfeld, A. P., Becker, J., Hermel, M., Rath, W., & Hesselbarth, U. (2008). Sterilization and Preservation Influence the Biophysical Properties of Human Amnion Grafts. Biologicals, 36(4), 248―255.

Doi.Org/10.1016/J.Biologicals.2008.02.001

상기 및 하기에서 인용되는 모든 출원, 특허 및 간행물의 전체 개시 내용은 본 명세서에서 참조에 의해 원용된다.

전술한 설명에서 정수 또는 그와 동등한 것으로 알려진 구성요소에 대한 참조가 있는 경우, 그러한 정수는 개별적으로 제시된 것처럼 본 명세서에 포함된다.

본 명세서에서 기술되는 현재의 바람직한 실시형태에 대한 다양한 변경 및 수정은 당업자에게 명백할 것이라는 사실에 유의해야 한다. 이러한 변경 및 수정은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 그리고 그에 수반되는 이점을 감소시키지 않으면서 이루어질 수 있다. 따라서, 이러한 변경 및 수정은 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다.

본 발명은 또한, 둘 이상의 부분, 요소 또는 특징의 임의의 또는 모든 조합에서 개별적으로 또는 총괄적으로 본 출원의 명세서에서 언급되거나 명시된 부분, 요소, 및 특징으로 광범위하게 이루어진다고 말할 수 있다.

본 발명의 양태는 단지 예로서 설명되었으며, 예를 들어 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명이 제시될 때 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서 변경, 수정 및 추가가 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 특정의 특징에 대해 알려진 등가물이 존재하는 경우, 이러한 등가물은 본 명세서에서 구체적으로 언급된 것처럼 포함된다.

Claims (44)

1. 생체적합성 조성물(biocompatible composition)로서
   하기 a. 내지 j.를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단리, 정제, 재조합, 또는 합성 단백질:
   a. α-크리스탈린;
   b. β-크리스탈린;
   c. γ-크리스탈린;
   d. 호키(Hoki)(마크루로누스 노바에젤란디아에(Macruronus novaezlandiae))로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;
   e. 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;
   f. 본 명세서의 표 1에서 확인되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
   g. 상기 a) 내지 f) 중 어느 하나로부터의 적어도 약 10개의 연속 아미노산(contiguous amino acid)을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드;
   h. 상기 a) 내지 g) 중 어느 하나에 대해 적어도 약 90%의 아미노산 동일성(amino acid identity)을 갖는 단백질;
   i. 생체 내에서 크리스탈린 단백질의 고유 구조를 갖는 상기 a) 내지 h) 중 어느 하나에 따른 단백질;
   j. 상기 a) 내지 i) 중 둘 이상의 임의의 조합;
   선택적으로 하나 이상의 가소제;
   선택적으로 하나 이상의 공개시제(co-initiator); 및
   하나 이상의 가교결합제
   를 포함하는, 생체적합성 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질은 가교결합되어 중합체를 형성할 수 있는, 생체적합성 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체적합성 조성물은 대상체의 신체 내부 또는 신체 상의 표적 부위에서 적어도 부분적으로 중합 및/또는 겔화되도록 제형화된 생체 내 겔화 조성물이거나, 또는 상기 생체적합성 조성물은 상기 생체 내 겔화 조성물의 가교결합이 대상체의 신체 내부 또는 신체 상의 표적 부위에 존재할 때 발생하거나 개시되도록 제형화된 생체 내 겔화 조성물인, 생체적합성 조성물.
4. 가교결합된 바이오 중합체 조성물을 제조하는 방법으로서,
   하기를 포함하는 조성물을 제공하는 단계:
   a. α-크리스탈린;
   b. β-크리스탈린;
   c. γ-크리스탈린;
   d. 호키(마크루로누스 노바에젤란디아에)로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;
   e. 호모 사피엔스로부터의 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나의 단백질;
   f. 본 명세서의 표 1에서 확인되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
   g. 상기 a) 내지 f) 중 어느 하나로부터의 적어도 약 10개의 연속 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드;
   h. 상기 a) 내지 g) 중 어느 하나에 대해 적어도 약 90%의 아미노산 동일성을 갖는 단백질;
   i. 생체 내에서 크리스탈린 단백질의 고유 구조를 갖는 상기 a) 내지 h) 중 어느 하나에 따른 단백질;
   j. 상기 a) 내지 i) 중 둘 이상의 임의의 조합;
   선택적으로 하나 이상의 가소제;
   선택적으로 하나 이상의 공개시제; 및
   상기 조성물을 하나 이상의 가교결합성 분자와 접촉시키는 단계;
   가교결합을 개시하여 가교결합된 바이오 중합체 조성물을 형성하는 단계
   를 포함하는, 방법.
5. 하나 이상의 정제된 크리스탈린 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서,
   척추동물 눈 조직을 제공하는 단계;
   상기 조직을 고유 크리스탈린 단백질 구조의 유지에 적합한 조건 하에서 추출 완충액의 존재 하에 균질화하는 단계;
   상기 액상 균질물을, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해, 임의의 잔류 고체로부터 분리하여 크리스탈린 단백질-함유 용액을 제공하는 단계;
   선택적으로, 상기 크리스탈린 단백질을 적어도 부분적으로 추가로 정제하는 단계;
   선택적으로, 상기 크리스탈린 단백질-함유 용액을 투석하여 추출 완충액을 제거하는 단계;
   선택적으로, 상기 크리스탈린 단백질-함유 용액을 동결 건조하여 동결 건조된 크리스탈린 단백질 조성물을 제공하는 단계;
   선택적으로, 상기 크리스탈린 단백질-함유 용액 또는 상기 동결 건조된 크리스탈린 단백질 조성물을, 예를 들어 0℃ 이하에서, 저장하는 단계
   를 포함하되; 상당한 비율의 상기 정제된 크리스탈린 단백질은 그들의 본래의 구조를 유지하는, 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 고유 크리스탈린 단백질 구조를 유지하는데 적합한 조건은:
   a. 상기 균질물을 추출 완충액 중 7 이상의 pH에서 유지; 또는
   b. 상기 균질물을 생리학적 pH에서 유지; 또는
   c. 상기 균질물을 약 15℃ 미만의 온도에서 유지;
   d. 상기 a) 및 c) 모두; 또는
   e. 상기 b) 및 c) 모두를 포함하고;
   상기 방법은:
   상기 액상 균질물을 원심분리 또는 여과에 의해 임의의 잔류 고체로부터 분리하여 크리스탈린 단백질-함유 용액을 제공하는 단계;
   상기 크리스탈린 단백질-함유 용액을 투석하여 추출 완충액을 제거하는 단계;
   선택적으로, 상기 크리스탈린 단백질-함유 용액을 동결 건조하여 동결 건조된 크리스탈린 단백질 조성물을 제공하는 단계;
   상기 크리스탈린 단백질-함유 용액 또는 상기 동결건조된 크리스탈린 단백질 조성물을 고유 크리스탈린 단백질 구조의 유지에 적절한 조건 하에, 예를 들어 사용 전까지 약 4℃ 이하에서, 유지하는 단계를 포함하며;
   여기서, 상당한 비율의 상기 정제된 크리스탈린 단백질은 그들의 본래의 구조를 유지하는, 방법.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 척추동물 눈 조직은 수정체 조직 또는 수정체유화 물질(phacoemulsification material)인, 방법.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 척추동물 눈 조직은 어류로부터의 눈 조직 또는 포유동물로부터의 눈 조직인, 방법.
9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균질화는 하나 이상의 크리스탈린 이소형의 파괴를 피하거나 최소화하고/하거나 단백질 응집을 피하거나 최소화하는 조건 하에 수행되는, 방법.
10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균질화는,
    a. 약 7 초과의 pH에서 수행되거나; 또는
    b. 생리학적 pH에서 수행되거나; 또는
    c. 낮은 전단 조건 하에 수행되거나;
    d. 예를 들어, 아르기닌과 같은 하나 이상의 안정화 첨가제의 존재 하에 수행되거나; 또는
    e. 저온에서 수행되거나;
    f. 약 0℃ 내지 약 5℃의 온도에서 발생하거나;
    g. 균질화가 수행되지 않는, 예를 들어 균질물이 일정 기간 동안 얼음 상에 배치되는 냉각 단계가 산재되어 있는 휴지 단계가 산재되어 있거나; 또는
    h. 상기의 것들 중 둘 이상의 임의의 조합인, 방법.
11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고유 구조를 유지하는 정제된 크리스탈린 단백질의 실질적인 비율은 약 60% 초과인, 방법.
12. 조직 봉합을 필요로 하는 대상체에게서 조직을 봉합하는 방법으로서,
    선택적으로, 힘을 가하여 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 봉합하는 단계;
    열상, 병변, 절개부, 또는 상처 또는 상기 열상, 병변, 절개부, 또는 상처의 부위를 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 크리스탈린 단백질 함유 조성물과 접촉시키는 단계로서, 선택적으로, 상기 크리스탈린 단백질 함유 조성물은 적어도 부분적으로 가교결합되는, 상기 접촉시키는 단계;
    선택적으로, 힘을 가하여 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 봉합하는 단계;
    가교결합을 개시 및/또는 유지하는 단계;
    열상, 병변, 절개부 또는 상처의 봉합을 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지하는 단계를 포함하며;
    여기서, 상기 크리스탈린 단백질의 가교결합은 접착제 조성물을 형성하는, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 조직 봉합 방법은 외과적 절개부를 봉합하는 방법인, 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 조직 봉합 방법은 무봉합 봉합(sutureless closure) 방법이며, 예를 들어, 상기 무봉합 봉합은 무봉합 피부 봉합, 무봉합 상처 봉합, 또는 무봉합 수술 절개부 봉합인, 방법.
15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수술은 안과적 수술인, 방법.
16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열상, 병변, 절개부 또는 상처의 봉합을 유지하는 것은,
    a. 붕대, 봉합사, 메쉬 등과 같은 하나 이상의 의료 보조 장치를 적용하거나, 또는 봉합된 열상, 병변, 절개부 또는 상처를 조이거나 고정하는 것과 같은 (일반적으로는 일시적인) 물리적인 힘을 사용하는 것;
    b. 약 60% 초과의 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지하는 것; 또는
    c. 상기 a) 및 b) 모두인, 방법.
17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중에 존재하는 가교결합제는 광가교결합제이고, 여기서 가교결합은 광에 노출시킴으로써 개시되는, 방법.
18. 대상체가 안과 수술을 받고 있거나 받은 적이 있는, 조직 봉합을 필요로 하는 대상체에게서 조직을 봉합하는 방법으로서,
    외과적 절개부 또는 상기 외과적 절개부의 부위를 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 크리스탈린 단백질 함유 조성물과 접촉시키는 단계로서, 선택적으로, 상기 크리스탈린 단백질 함유 조성물은 적어도 부분적으로 가교결합되는, 상기 접촉시키는 단계;
    선택적으로, 힘을 가하여 절개부를 봉합하는 단계;
    가교결합을 개시 및/또는 유지하는 단계;
    상기 외과적 절개부의 봉합을 가교결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지하는 단계
    를 포함하되; 상기 크리스탈린 단백질의 가교결합은 외과적 절개부의 봉합을 유지할 수 있는 접착제 조성물을 형성하는, 방법.
19. 치료를 필요로 하는 대상체에게서 안구 손상 또는 안구 절개부를 치료하는 방법으로서,
    안구 손상 또는 절개부를 본 명세서에서 기술되는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 선택적으로, 상기 크리스탈린 단백질 함유 조성물은 적어도 부분적으로 가교결합되는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    가교결합을 개시 및/또는 유지하는 단계
    를 포함하되; 가교결합은 생체접착성 중합체 조성물을 형성하는, 방법.
20. 하나 이상의 활성제를 이를 필요로 하는 대상체에 전달하는 방법으로서,
    전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 크리스탈린 단백질 포함 조성물을 제공하는 단계로서, 선택적으로, 상기 크리스탈린 단백질 함유 조성물은 적어도 부분적으로 가교결합되고, 상기 조성물은 하나 이상의 활성제를 추가로 포함하는, 상기 크리스탈린 단백질 포함 조성물을 제공하는 단계;
    대상체를 상기 조성물과 접촉시키는 단계,
    선택적으로 상기 조성물의 가교결합을 개시 및/또는 유지하는 단계,
    이에 의해 상기 활성제를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 단계
    를 포함하는, 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 대상체를 조성물과 접촉시키는 단계는 상기 조성물을, 예를 들어, 외과적 투여를 포함하여 대상체의 신체 상의 또는 대상체의 신체 내의 표적 부위에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
22. 하나 이상의 세포 또는 조직을 배양하는 방법으로서,
    배양시킬 하나 이상의 세포를 제공하는 단계;
    상기 하나 이상의 세포를 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 조성물을 포함하는 기질과 접촉시키는 단계;
    상기 하나 이상의 세포와 기질과의 접촉 및 선택적으로 추가의 성장 배지와의 접촉을 지속적인 생존, 성장, 복제, 및/또는 분화에 적합한 조건 하에 일정 기간 동안 유지하는 단계
    를 포함하는, 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 본 명세서에서 기술되는 조성물은 γ-크리스탈린을 포함하는, 방법.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 하나 이상의 복제 적격 세포(replicatively-competent cell), 또는 하나 이상의 줄기 세포를 포함하는, 방법.
25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 조성물로부터 형성된 박막 필름, 예를 들어 이와 접촉하는 세포를 또 다른 위치로 이동시킬 수 있는 충분한 기계적 강도 및/또는 탄성을 갖는 박막 필름인, 방법.
26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치는 제2 배양 용기인, 방법.
27. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치는 대상체의 신체 상에 또는 신체 내에 있는, 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 눈으로부터 유래되는 하나 이상의 안과적 세포 또는 하나 이상의 줄기 세포이며, 상기 위치는 눈 내부 또는 눈 위에 있는 외과적 부위인, 방법.
29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 하나 이상의 림발 줄기 세포(limbal stem cell), 또는 하나 이상의 간질 줄기 세포(stromal stem cell)인, 방법.
30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 3D 세포 배양물을 형성하기에 충분한 두께를 갖는 적어도 하나의 영역을 갖는, 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 조성물로부터 형성된 겔인, 방법.
31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 또는 조직을 배양하는 방법은 척추동물의 눈으로부터 하나 이상의 세포를 배양하는 방법으로, 상기 방법은,
    배양시킬 하나 이상의 척추동물 눈 세포를 제공하는 단계;
    상기 하나 이상의 세포를 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 조성물을 포함하는 기질과 접촉시키는 단계로서, 상기 기질은 광학적으로 투명한, 상기 접촉시키는 단계;
    상기 하나 이상의 세포와 기질과의 접촉 및 선택적으로 추가의 성장 배지와의 접촉을 지속적인 생존, 성장, 복제, 및/또는 분화에 적합한 조건 하에 일정 기간 동안 유지하는 단계
    를 포함하되; 상기 기질은 대상체의 눈으로의 전달 및/또는 외과적 적용과 관련된 취급을 지원하기에 충분한 기계적 내구성을 갖는, 방법.
32. 치료를 필요로 하는 대상체에게서 줄기 세포의 결핍과 관련된 안구 장애를 치료하는 방법으로서, 눈을 다음을 포함하는 치료 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법:
    i. 선택적으로 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 배양 방법에 따라 배양된 줄기 세포;
    및 선택적으로
    ii. 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 생체적합성 조성물 또는 바이오 중합체 조성물.
33. 치료를 필요로 하는 대상체에게서 안구 장애를 치료하는 방법으로서,
    하나 이상의 활성제를 포함하는, 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 생체적합성 조성물을 제공하는 단계, 및
    상기 하나 이상의 활성제를 대상체에 전달할 수 있도록 상기 생체적합성 조성물을 대상체에 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
34. 치료를 필요로 하는 대상체에게서 안구 장애를 치료하는 방법으로서,
    하나 이상의 줄기 세포를 포함하는, 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 생체적합성 조성물을 제공하는 단계, 및
    상기 하나 이상의 줄기 세포를 대상체에 전달할 수 있도록 상기 생체적합성 조성물을 대상체에 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
35. 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)의 제조에 있어서의 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 조성물의 용도.
36. 시험관내 단계를 이용하는 치료 또는 연구 방법을 포함한 시험관내 사용을 위한 약제 또는 조성물의 제조에 있어서의 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 조성물의 용도.
37. 치료에 사용하기 위한, 예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 치료 방법들 중 어느 하나에서 사용하기 위한 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 조성물.
38. 시험관내 치료 또는 연구 방법, 또는 시험관내 단계를 이용하는 치료 또는 연구 방법에서 사용하기 위한 전술한 청구항 중 어느 한 항에서 정의되는 조성물.
39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 상기 하나 이상의 크리스탈린 단백질의 고유 2차 구조가 유지되거나; 또는
    b. 상기 하나 이상의 크리스탈린 단백질의 고유 3차 구조가 유지되거나; 또는
    c. 상기 하나 이상의 크리스탈린 단백질의 고유 4차 구조가 유지되거나; 또는
    d. 상기 하나 이상의 크리스탈린 단백질은 나노피브릴 또는 다른 교란된 구조 형태(disrupted structural form)가 실질적으로 없거나; 또는
    e. 상기 조성물 중에 존재하는 크리스탈린 단백질의 적어도 일부는 고유적으로 글리코실화되거나; 또는
    f. 상기 a) 내지 e) 중 둘 이상의 임의의 조합인, 조성물, 방법 또는 용도.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은,
    a. 약 0.1% w/w 내지 약 1.5% w/w의 가교결합제; 또는
    b. 약 0.5% w/w 내지 약 3% w/w의 가교결합제; 또는
    c. 약 3% w/w 내지 약 30% w/w의 가교결합제; 또는
    d. 약 10 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 크리스탈린 단백질; 또는
    e. 약 10 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질; 또는
    f. 약 0.5% w/w 내지 약 3% w/w의 가소제; 또는
    g. 약 0.5% w/w 내지 약 5% w/w의 공개시제; 또는
    h. 상기 a) 내지 g) 중 둘 이상의 임의의 조합을 포함하는, 조성물, 방법 또는 용도.
41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은,
    a. 약 100 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 5 mM 내지 약 10 mM의 글루타르알데히드, 및 약 1.5% w/w 내지 약 2.5% w/w의 글리세롤; 또는
    b. 약 100 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 10 % w/w 내지 약 20 % w/w의 PEGDA, 및 약 0.2 % w/w 내지 약 1.0 % w/w의 광개시제; 또는
    c. 약 50 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 10 % w/w 내지 약 20 % w/w의 PEGDA, 및 약 0.2 % w/w 내지 약 1.0 % w/w의 광개시제; 또는
    d. 약 50 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 크리스탈린 단백질, 약 25% w/w 내지 약 50% w/w의 PEGDA, 약 0.2% 내지 약 1.0% w/w의 광개시제, 및 10% w/w 내지 20% w/w의 공개시제를 포함하는, 조성물, 방법 또는 용도.
42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 가교결합되었을 때,
    a. 가시 스펙트럼 범위에 걸쳐 광학적으로 투명하거나; 또는
    b. 그것이 투여되었거나 투여된 대상체의 눈의 굴절률과 등가인 굴절률을 갖거나; 또는
    c. 약 75% 초과의 가시광선 스펙트럼 범위(400 nm 내지 700 nm)에 걸친 광 투과율을 갖거나; 또는
    d. 상기 a) 내지 c) 중 둘 이상의 임의의 조합을 갖는, 조성물, 방법 또는 용도.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, 조성물에 존재하는 하나 이상의 활성제는 안과적으로 허용되는 항생제인, 조성물, 방법 또는 용도.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 크리스탈린 단백질은 호키(Hoki)(마크루로누스 노바에젤란디아에(Macruronus novaezelandiae))로부터 유래되거나, 또는 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터 유래되는, 조성물, 방법 또는 용도.

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