JP5685773B2 - 血管新生および創傷治癒活性がある薬剤 - Google Patents
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Description
(a)動物死体から得られる眼水晶体の水晶体シースを除去して、眼水晶体の残りの水晶体組織を残すステップと、
(b)水晶体組織からクリスタリンタンパク質を溶媒に溶解させる間、水晶体組織を水性溶媒に入れるステップと、
(c)溶媒からクリスタリンタンパク質を回収するステップと
を含む、少なくとも1つのクリスタリンタンパク質を精製する方法が提供される。
(a)眼球をスライスして、眼球に少なくとも1つの切り込みを入れるステップと、
(b)眼球に圧力をかけて、眼球から切れ目を通じて水晶体を押し出すステップと、
(c)水晶体からクリスタリンタンパク質を溶媒に溶解させるステップと、
(d)クリスタリンタンパク質を溶媒から精製するステップと
を含む、動物死体眼球の水晶体から1つ以上のクリスタリンタンパク質を精製する方法が提供される。
1.1 プロテオグリカン単離の標的とされたウシ組織
いくつかのウシ組織をプロテオグリカン単離の標的にした。これらには、皮、関節軟骨、靱帯、骨、筋肉、鼻中隔、腎臓基底膜、眼球、および大動脈が含まれた。
本研究で使用するために、表1で同定されるプロテオグリカン抽出物を調製した。
17.6gのみじん切りウシ眼球を200mLの4MグアニジニウムHClによって室温で2日間抽出し、サンプルMLA−眼球−001Fを調製した。抽出物をWhatman#541濾紙を通して真空下で濾過した。濾液をdH2Oで透析し、使用時まで凍結乾燥した。使用に先だって、10mMの塩化カルシウムを含有する100mMのTris HCl(pH8.5)緩衝液中で凍結乾燥材料を再溶解し、エラスターゼIで消化した。MLA−眼球−001F製剤は、表1に示すようにMLA−008E2とコード化した。表1で同定されるその他のプロテオグリカンも同様にして抽出した。
Phenomenex SecurityGuard C−12保護カラム付きPhenomenex Jupiter 4μ Proteo 90Å(250×4.06mm)(Phenomenex Corporate Headquarters(U.S.A.),Torrance,CA,United States)上のRP−HPLCによって、消化されたプロテオグリカン抽出物の分画を実施した。1mL/分の流速を使用して、ミリQ水中の0.1%TFAでカラムを平衡化した。緩衝液B(0.1%TFAを含有する70%アセトニトリルと30%ミリQ水)の勾配を次のように注入した。0分で0%B、5分で5%B、10分で10%B、25分で15%B、30分で20%B、35分で30%B、40分で60%B、50分で20%B、55分で0%B、および60分で0%B。吸光度は214nmでモニターした。
ウシ大動脈を地元の食肉処理場から入手し、両端をクランプした。細動脈を糸で縛った。無菌条件下において2%スクロース溶液で大動脈を洗浄し、汚染血液を除いた。PBS緩衝液中のトリプシンを添加して、30分間インキュベートした。内皮細胞懸濁液と細胞培養液(20%ウシ胎児血清、2%グルタミン、および抗生物質含有DMEM)とを1:1に混合した。960×gで10分間遠心分離して細胞を収集し、次に保存細胞アンプルを培養するのに先立って培地に懸濁した。5回の細胞継代培養後に、細胞を10%DMSO中で凍結し液体窒素内に保管した。細胞を蘇生させ、75cm2培養フラスコ内の培地中で95%集密まで成長させた。次に使用するために細胞を収集した。
ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)および10%ウシ胎児血清(FBS)中のウシ大動脈内皮細胞をウェルあたり0.8×104個含有する無菌の96ウェルプレートを調製して、24、48または72時間インキュベートした。サンプルは3つの異なる濃度(無希釈、10−2、および10−4)で、三連で調製した。試験抽出物を添加する前に、細胞を37℃、5%CO2で2時間付着させた。所望時間経過後、プレートを凍結し細胞を溶解して、Molecular Probes CyQuant細胞増殖キット(Invitrogen−Molecular Probes,Eugene,OR,United States)を使用して、製造業者の説明書に従って細胞数を読み取った。
BD Bioscience血管新生細胞遊走アッセイ24ウェルプレート(BD Bioscience,Franklin Lakes,NJ,United States)を製造業者の説明書に従って使用した。遊走プレートは必要になるまで−18℃に保った。簡単に述べると、DMEMおよびHEPES(pH7.2)中でウシ大動脈内皮細胞を2×105細胞/mLに調製した。250μLの容積の細胞懸濁液(5×104細胞)を上のチャンバーに入れた。即座に、サンプル注入口を使用して底の各ウェルに750μLを入れた。1mLのDMEM含有HEPESに糖タンパク質抽出物を添加して、サンプルを調製した。プレートを37℃、5%CO2雰囲気で、22±1時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、上のチャンバーから培養液を注意深く取り出した。4μg/mLのハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中のカルセインAMを0.5mL/ウェル含有する第2のFalcon(商標)非TC処理24ウェルプレートに挿入物を移し、37℃、5%CO2で90分間インキュベートした。さらなる操作なしに励起/放射波長485/538nmで、最低読み取りを使用して、Thermolabsystems Fluoroskan Ascent蛍光性プレートリーダー内で、侵入された細胞の蛍光を読み取った。
ラット大動脈を切除して付着する脂肪および結合組織を取り去った後、およそ3mm幅の環に切断した。マルチウェル培養プレートのウェルの底にフィブリノーゲンを入れ、トロンビン作用によってゲル化させた。次に大動脈環を各ゲル上に重ねて、その上にフィブリンのさらなる層をのせた。抗生物質を添加したMCDB131培地(Sigma,United States)中で、フィブリノーゲンを調製した。次にフィブリンの二重層に、試験抽出物を含有するMCDB131培地を重ね合わせた。対照ウェルはHBSSを含有した。陰性対照としてフマギリン(20μg/mL)を三連でアッセイした。
プロテオグリカン抽出物を調製して、エラスターゼIで加水分解した。粗製抽出物は、最初に内皮細胞遊走または増殖を促進する能力について試験した。活性を示した抽出物を、RP−HPLCを使用して分画した。分離されたペプチドを再試験して、活性の原因であるペプチドを同定した。
実施例1.4で述べられているように、MLA008E2の最初の分画は、Phenomenex SecurityGuard C−12保護カラム付き分析Phenomenex Jupiter 4μ Proteo 90Å(250×4.06mm)カラム上でのRP−HPLC分離を伴った。このカラムは、10kDaよりも小さいペプチドを結合するようにデザインされている。画分をプールして、内皮細胞遊走性(無血清培地中の5×104細胞/ウェルを5%CO2中37℃で22±1時間遊走させた)および増殖活性について試験した。増殖アッセイでは、細胞空試験が増殖バックグラウンドレベルを提供した。10%FBSが陽性細胞増殖対照を提供した。1%FBSを含有するDMEM中でウェルあたり1×104細胞の初期播種密度を使用して、細胞増殖を72時間にわたり試験した。分子プローブCyQuantキットを使用して、製造業者の説明書に従って細胞数を定量化した。
画分12をTSK2500ゲル濾過カラム上でさらに分画した。カラムをリン酸緩衝食塩水で平衡化し、100μLのサンプルを流速1mL/分でカラムに注入した。溶出プロフィールを280nmおよび214nmでモニターした。60分間にわたって1mLの画分を収集した。内皮細胞遊走を促進する能力について、得られた画分を再試験した。結果は決定的でなかった。したがってこれらのペプチド間の相乗作用が最初の観察を引き起こしたかもしれず、または効果をもたらすのにより高濃度のペプチドが必要であったと想定された。MLA008E2 RP−HPLC画分を1%FBS不在下で再試験した(無血清DMEM中の2×105個の細胞を37℃、5%CO2中で22±1時間遊走させた)。
実施例1.8で述べられているようなラット大動脈環アッセイ(生体外血管新生)と、ラット背部皮弁アッセイ(創傷治癒アッセイ)とを使用して、いくつかのMLA008E2画分の追加的分析を実施した。これらのアッセイ結果を表3に示す。
活性を有する抽出物中に存在するペプチド/タンパク質の分子量をゲル濾過によって推定した。TSK2500ゲル濾過カラムをリン酸緩衝食塩水で平衡化し、100μLのサンプルを流速1mL/分でカラムに注入した。溶出プロフィールを214nmでモニターした。60分間にわたって1mLの画分を収集した。既知の相対分子量のタンパク質、ペプチド、およびアミノ酸を同一条件下で試験してカラムを較正した。結果を表5に示す。
27kDaタンパク質のサンプルを得るために抽出物に分取SDS−PAGEを施し、27kDaタンパク質をN末端配列分析のために切り取った。N末端はブロックされていることが分かった。N末端ブロッキングを克服するために、27kDaタンパク質のさらなるサンプルを調製して、37℃で一晩トリプシンで消化した。得られたペプチドをC18 Vyadacカラム(Vyadac Company(Herperia,CA,United States)に装入し、0〜100%B(60%アセトニトリル+0.1%TFA)の1時間の勾配からピークを収集した。これらのペプチドのN末端を引き続いて配列決定した。
同定されたメジャーおよびマイナー配列を下に示す。
Sephacryl 300HR上でのゲル濾過クロマトグラフィー、およびいくつかの公称分画分子量膜を使用した限外濾過が関与する、2つの異なるアプローチを使用して、βB2クリスタリンを部分的に精製した。DEAE Sepharose fast flow上でのイオン交換クロマトグラフィーによって、αBクリスタリンを精製した。
新鮮なウシ眼球を食肉処理場から得て即座に処理した。眼水晶体を得るために、メスを使用して強膜と瞳孔の間に2〜3cmの切り込みを入れた。瞳孔の上を親指で押して、水晶体を眼球から取り出した。このアプローチを使用して、望ましくない付着組織が最小限の無傷の水晶体を回収した。あるいは、角膜の中心を通る切り込みを入れることで、水晶体を眼球から除去した。この切り込みは水晶体内に達して水晶体シースを切り開き、角膜の直径に及んだ。これは眼球を両側から穏やかに圧搾することで、水晶体シースおよびその他の物質を含まない水晶体を眼球から除去できるようにした。水晶体シースの除去は、可溶性クリスタリンタンパク質を蒸留水で単に撹拌または混合して抽出する際に、30分以内に可溶化させるために必須であった。さもなければ水晶体からのクリスタリンの抽出には、10容積(w/v)の蒸留水、または1mM DTTおよび150mM NaClを含有する100mMリン酸緩衝液(pH6.8)のどちらかの中で、一晩4℃で撹拌することが必要であった。水晶体はこの間に緩慢に溶解した。不溶性膜結合タンパク質は、50000rpmで30分の超遠心によって高度に可溶性のクリスタリンから分離された。水溶性水晶体クリスタリンを含有する上清は、Sephacryl 300 HRを含有する1Lカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに分画された。ゲル濾過はいくつかの異なる条件を使用して実施した。カラムは、蒸留水中で、または1mM DTTおよび150 mM NaClを含有する100mMリン酸緩衝液(pH6.8)の抽出緩衝液を使用して作動させた。流速は1mL/分であり18mLの画分が収集された。慣例的に25mLの45mg/mL眼水晶体抽出物をカラムに装入した。タンパク質溶出をモニターするインライン導電率モニタリング付きの214nmおよび280nmに設定したQuadTec検出器を使用して、BIORAD Biologicクロマトグラフィーシステムを使用して、カラムを4℃で作動させた。
ウシクリスタリン抽出物の典型的な溶出プロフィールを図6に示す。溶出を1mL/分で実施し、タンパク質は214nm(三角形)および280nmでモニターした。抽出物は、不溶性物質を除去する超遠心の後、典型的に約45mg/mLのタンパク質を含有した。様々な哺乳類のクリスタリンタンパク質の分離に起因するピークは、相対分子量およびイムノブロット分析によって、そして溶出プロフィールとクリスタリンタンパク質に関する文献で以前述べられているプロフィールとを比較することで、溶出プロフィール中で識別された。溶出ピークは、以前HerbrinkおよびBloemendal(1974年)によって、ゲル濾過クロマトグラフィーの下で分離することが示された、画分α、βH、βL1、βL2、γS、およびγBC/DEを表すと同定された。それぞれの画分の相対タンパク質濃度を表6に概説した。
上の所見に基づいて、βB2クリスタリン精製のための限外濾過分離技術を考案した。スケールアップに対応できる方法でウシクリスタリンを分画するために、一連の限外濾過膜を評価した。βB2クリスタリンの精製は、βB2クリスタリンとその他のクリスタリンタンパク質との分子間相互作用を利用する方法を使用して実施した。
αBクリスタリンを単離するために、変性条件下でDEAE Sepharose fast flowを使用して、粗製ウシクリスタリン抽出物を分画した。DEAE Sepharose fast flowを含有するカラム(3×33cm)(Pharmacia XK−26カラム、GE Healthcare DEAE Sepharose fast flowイオン交換樹脂を含有する)を5mM Tris HCl(pH7.6)、6M尿素、0.01%DTTで平衡化した。50mM Tris HCl(pH7.6)、6M尿素、0.01%DTTを使用して勾配溶出を実施し、35mM Tris HCl(pH7.6)、6M尿素、0.01%DTT、1M NaClを使用して溶出を完了した。BIORAD QuadTec検出器を使用して、214nmおよび280nmでタンパク質吸光度をモニターした。6mLの画分を収集した。50mLの5mg/mLウシクリスタリンを流速1mL/分で装入した。
SDS PAGEおよびウエスタンブロット分析を実施して、Wound Heal 1、Wound Heal 2、およびWound Heal 3製剤中のβB2クリスタリンおよびαBクリスタリンの濃縮度を評価した。αAクリスタリン、αBクリスタリン、およびβB2クリスタリンの存在を知るためのアッセイでは、これらの各抗原に対してそれぞれ特異的な一次抗体を利用した。3つの製剤は、αAクリスタリンを含まないようであった。Wound Heal 1およびWound Heal 2がβB2クリスタリンを含有したのに対し、Wound Heal 3はαBクリスタリンを含有した。
30匹のオスLewisラットを以下の表7に概略を説明するように、6匹ずつの5群に分けた。ラットは年齢および体重を一致させた。研究全体を通じて、ラットに齧歯類飼料と水を自由摂取させた。
0=発赤または腫脹なし
1=軽微な発赤/腫脹
2=顕著な発赤/腫脹
3=大規模な発赤/腫脹
クリスタリンタンパク質の機能特性を調査するために、研究を行った。実施例3で述べたようにして、Sephacryl 300HR上でゲル濾過クロマトグラフィーを使用してウシクリスタリンタンパク質の分画を実施した。この技術を使用して、αクリスタリンならびにβH、βL、およびβL2、γSおよびγBC/DEとして同定された画分を分離した。次に生物学的活性を評価するために、画分を以下の研究で使用した。
エラスターゼI活性を阻害する能力について、ウシクリスタリン画分を試験した。簡単に述べると、粗製ウシクリスタリン抽出物およびαA/Bクリスタリン画分で、わずかなエラスターゼ阻害が観察された。βクリスタリン画分(全てβB2クリスタリンを含有するβH、L1およびL2)中には、活性は検出されなかった。γSクリスタリンは、その他の画分と比べてかなりのエラスターゼ阻害活性を有することが示された。これらの結果も先と同様にαおよびβクリスタリンの間の違いを実証し、クリスタリンタンパク質のプロテアーゼ阻害活性が、βB2クリスタリンとは異なってシャペロン活性もまた有することが示されている、γSクリスタリンおよびαAおよびBクリスタリンに、限定されることを示唆する。
プロテアーゼエラスターゼI、トリプシン、およびキモトリプシンを熱変性から保護する能力について、ウシクリスタリン画分を試験した。簡単に述べると、クリスタリン画分の存在または不在下において、沸騰水浴内で30秒間プロテアーゼを加熱した。結果を図13に示す。
4つの別々の試験を実施して、クリスタリン製剤の血管新生効果を判定した。各サンプルを三連でアッセイした。陽性対照(VEGF)およびPBSを含有するビヒクル対照もまた、三連でアッセイした。(平均からの)標準偏差百分率を評価して、ばらつきが20%を超えることが分かった場合は異常値を除去した。予備統計的有意性を独立スチューデントt検定によってα<0.05で評価した。平均+/−標準誤差のグラフ表示を判定した。
ウシクリスタリン凝集体の血管新生効果を調査する第1の研究では、いずれのサンプルも血管新生を促進しなかった。妥当なことに、VEGFは30μg/mlではいかなる血管新生促進も生じることなく、実際にはそれは統計学的に有意ではなかったが15.08%阻害性であった。これはいくぶん意外であり、そのため第2の研究ではより高濃度のVEGFを使用した。しかし対照ウェル内の微小血管成長レベル(9.640±0.263SEM)は予期されたようであったので、実験条件は満足できるものであったと考えられる。
所望のタンパク質を精製する単純で効率的な工程を使用して、ヒツジβB2クリスタリンの精製を実施した。改善された方法は、ゲル濾過クロマトグラフィーの実施を不要にする。
ヒツジ眼球を地元の食肉処理場から入手し、即座に処理した(1時間以内)。メスを使用して、眼球の様々な位置に1〜2cmの切り込みを入れた。回収した6個の水晶体を200mLの蒸留水で洗浄し、残留する水晶体シースを除去した。水を200mLの新鮮な蒸留水に入れ換えて、20容積中4℃で30分間撹拌した。この時間後、固い水晶体核は原形を保ち処理からはずされた。水晶体外層は溶解して、濁った白色溶液が得られ、これを10℃、30000rpmで30分間遠心分離し、または10℃において5000rpmで30分間により清澄化した。RP−HPLCを使用して水溶性水晶体クリスタリンを含有する上清をさらに分画し、ヒツジ眼球からのβB2クリスタリンの可能な収率を判定した。
分取RP−HPLCプロトコルは分析法から適応させた。簡単に述べると、Phenomenex Jupiter C4 300A 10um 250×21.2、カタログ番号00G−4168−P0、およびSecurityGuardカートリッジC4−300A 15×21.2 Jupiter(シリアル番号38833−1)を使用して、RP−HPLCによってヒツジβB2クリスタリンを単離した。カラムはdH2O中の0.1%TFAおよび0.1%TFA含有10%アセトニトリルによって流速25mL/分で、平衡化した。緩衝液B(0.1%TFA含有100%アセトニトリル)の勾配は次のように注入した。0分で10%B、10分で30%B、70分40%B、90分60%B、95分98%B、および100分10%。吸光度は280、214、235、330、および450nmでモニターした。43秒毎に18mLの画分を収集した。装入容積は50mL(9.57mg/mL)であった。
ヒツジβB2クリスタリンを含有するピークは、Phenomenex Jupiter C4 300Aカラムを使用したRP−HPLC分取プロトコルにより、その他の水溶性クリスタリンタンパク質から容易に分離された。実施例5.2で述べられている短縮プロトコルを使用して、ヒツジβB2クリスタリンを精製した。
合計6個のヒツジ水晶体を収集した(4.69g)。これを200mLの水で抽出し、次にこの抽出物の152mLを遠心分離した(45mLは処理しなかった、22.5%)。遠心分離後、130mLを実施例5.2で述べられているように分取用HPLCカラムに装入した。100mgの精製タンパク質を得た。様々なヒツジ眼球組織重量およびβB2の収率は、表12および表13に示すように判定された。
ウシβB2クリスタリンのアミノ酸配列に対応するヒツジβB2クリスタリンについて、いくつかのペプチドが同定され配列決定された。精製されたヒツジβB2クリスタリンをトリプシン加水分解し、生じた断片のMS/MS分析を行った。LTQ−FTMSを使用して得られた配列を使用してタンパク質データベースを検索した。得られた唯一の肯定的結果は、対応するウシタンパク質、βB2クリスタリンであった。相同性領域は、Profoundおよび配列アラインメントツールを使用して同定した。配列中にオーバーレイが得られなかった6つの領域があった。カバレッジは51.9%であった。しかしこれらの結果は、単離されたヒツジタンパク質が、ウシタンパク質とかなりの配列類似性を有するヒツジβB2クリスタリンであることを確かに確認した。
6.1 ヒツジβB2クリスタリンの調製
本質的に実施例5.1で述べられているようにして、ヒツジ眼球を収集して即座に処理した。簡単に述べると、メスを使用して角膜を横切って2〜3cmの切り込みを入れた。ブレードを除去しながら眼球の両側をつまんで水晶体を眼球から押し出し、1分あたり約12個の眼球が処理できた。水晶体を4℃において20容積(w/v)の蒸留水中で一晩撹拌した。水晶体はこの時間内に緩慢に溶解した。濁った白色溶液が得られ、それをセライト(セライト545 34967−0025、Acros Fine Chemicals,Belgium)を通して濾過した。酢酸を使用して水溶性水晶体クリスタリンを含有する上清のpHを3.5に調節し、実施例5.2で述べられているようにRP−HPLCを使用してβB2クリスタリンを精製した。
酸性条件下において塩溶液の存在下で自然発生的に沈殿するタンパク質の能力を利用して、ヒツジβB2クリスタリンのタンパク質ゲル沈殿物を調製した。
カルシウムは、ケラチノサイトの増殖および分化調節因子として重要な役割を果たし、制御因子として皮膚の創傷治癒を助ける。実験モデルはまた、カルシウムの管理が創傷管理も改善することを提案し(Lansdown、2002年)、アルギン酸カルシウム包帯が、正常な創傷治癒のいくつかの細胞的機構を改善することが示されている(Doyleら、1996年)。油性水酸化カルシウム懸濁液はまた、非外科的歯周治療後に口腔創傷に局所的に塗布すると、歯周創傷治癒を改善することが示されている(Kasajら、2006年)。さらにβクリスタリンは、規定の化学量論比と中程度の親和性で二価のカルシウムイオンと結合することが報告されている(Sharmaら、1989年)。最近の研究(JobbyおよびSharma、2007年)では、βB2クリスタリンはカルシウムイオンと特異的に結合することが示されている。
ミリスチン酸イソプロピルおよびステアリン酸マグネシウムを含有する無水有機ゲル(INCI Magnate(商標)、Johnson & Wilkins Limited)と、実施例6.2で述べられているように調製されたRP−HPLC精製ヒツジエラスターゼIトランケート型βB2クリスタリンとを5mg/mLの濃度で混合した。凍結乾燥タンパク質を有機ゲル中に均等に混合して、滑らかなペーストを形成した。このペーストを下の実施例7で述べる5日間創傷治癒研究において使用した。
各群6匹ずつの5つの処置群に割り当てた30匹のオスのSprague−Dawleyラットを使用して、創傷治癒研究を実施した。処置群は次のとおりであった。
A群−ビヒクル対照(有機ゲル)
B群−エラスターゼI処理ヒツジβB2クリスタリン(トランケート型)(有機ゲル中5mg/g)
C群−ヒツジαAクリスタリン(有機ゲル中2.6mg/g)
D群−ウシインドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(IDO)(有機ゲル中10mg/g)
E群−陽性対照(グレープフルーツ果皮抽出物)(有機ゲル中1mg/g)
8.1 虚血性創傷治癒動物モデル
Chenら(1999年)によって以前述べられているモデルに基づく虚血性遅延治癒モデルを使用した。動物の背部中央の切除創傷の両側に2つの切開創傷(双茎皮弁)を作ることで、虚血を引き起こした。より詳しくは、週齢および体重を一致させたオスのSprague−Dawleyラットを筋肉内ケタミン塩酸塩(100mg/kg体重)で麻酔した。それぞれの背部の毛を刈り込んで、10×4cmの透明長方形テンプレートを使用して、背中の試験領域の輪郭を描いた。無菌条件下で、無菌12mm生検パンチを使用して、穏やかな旋回で全厚の切り込みを入れた。あらゆる出血は綿棒を使用して除去した。パンチが乾燥しており、残骸(例えば皮膚、毛)が創傷に入らないように注意を払った。各創傷は皮膚表面に直角に形成した。虚血性群では切除創傷を上のように形成した。さらにメスを使用して、切除創傷の両側、長手方向に、創傷の上下端から1cmずつ伸びる(長さ約3cm)全厚の切り込みを2本入れた。これらの創傷は、切除創傷の両側から約1.5cm側方に位置した。ひとたび止血が達成されたら、創傷皮弁を持ち上げて、外科用ハサミを使用して、膜および創傷床の底にあるあらゆる血管を切断した。切開は3本の結節縫合(4−0 Novafil、モノフィラメントポリブテステル、非吸収性縫合糸、Tyco、カタログ番号4402−33)を使用して、長さに沿って等距離点で閉鎖した。止血が再度達成されたら、創傷を撮影した。撮影後、Gilson Microman CP100 & CP1000ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、試験サンプル(100μlの未変性ヒツジβB2クリスタリンおよび100μlのMedifill II(商標)(実施例8.2参照))を塗布した。生検パンチの内側を無菌食塩水に浸した綿棒で拭って、あらゆる組織液および/または残骸を除去した。パンチを次の動物で使用する前に70%エタノールに浸した。創傷形成後、各動物の病状を厳密にモニターした。創傷形成の2および3日目には、各動物に新しいタオルを床材として与えた。通常は研究の5から7日目の間に、創傷が乾燥し、かんな屑によって悪影響を受けなくなった場合にのみ、紙タオルからかんな屑に変更した。対照群は切除創傷のみからなった。創傷閉鎖速度を31日間にわたり測定した。
実施例8.1で述べられている虚血性遅延創傷治癒ラットモデルを使用して、創傷治癒に特効性のある、三重らせん分子形態のタイプIウシコラーゲンを含有する創傷治癒コラーゲンゲルである、市販のMedifill II(商標)タイプIウシコラーゲン(BioCore Medical Technologies,Inc.Silver Spring,MD,United States)と比較して、未変性βB2クリスタリンの創傷治癒上の利点を評価した。コラーゲン原線維の改善された表面積/密度は、創面に接触するコラーゲンのレベルを増大させる。
以下のようにして布帛材料ガーゼまたはモスリンをRP−HPLC精製未変性またはエラスターゼI処理ヒツジβB2クリスタリンで被覆した。
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Claims (13)
- それを必要とする対象において創傷の治療、血管新生、または内皮細胞増殖および/または遊走の促進のための薬剤の製造におけるβB2クリスタリンタンパク質またはβB2クリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物の使用。
- 前記タンパク質は、βB2クリスタリンまたはβB2クリスタリンのエラスターゼ切断産物の修飾形態である、請求項1に記載の使用。
- 前記エラスターゼ切断産物は、βB2クリスタリンの血管新生断片を含む、請求項1または2の使用。
- 前記タンパク質は、ウシもしくはヒツジクリスタリンタンパク質またはウシもしくはヒツジクリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物である、請求項1から3のいずれか1項に記載の使用。
- 創傷の治療に使用する請求項1から4のいずれか1項に記載の使用。
- 前記クリスタリンタンパク質は、眼水晶体βB2クリスタリンタンパク質または眼水晶体βB2クリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物である、請求項1から5のいずれか1項に記載の使用。
- 前記タンパク質またはタンパク質のエラスターゼ切断産物は、前記対象に局所投与するために局所的に受け入れられる組成物として提供される、請求項1から6のいずれか1項に記載の使用。
- 薬学的に許容できるキャリアと共に、少なくとも1つのβB2クリスタリンタンパク質または前記クリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物を含む、対象において創傷を治療し、または血管新生、内皮細胞増殖および/または遊走を促進する医薬組成物。
- 前記タンパク質は、βB2クリスタリンまたはβB2クリスタリンのエラスターゼ切断産物の修飾形態である、請求項8に記載の組成物。
- 前記エラスターゼ切断産物は、βB2クリスタリンの血管新生断片を含む、請求項8の組成物。
- 前記タンパク質は、ウシもしくはヒツジクリスタリンタンパク質またはウシもしくはヒツジクリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物である、請求項8から10のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記対象に局所投与するために局所的に受け入れられる組成である、請求項8から11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記βB2クリスタリンは、眼水晶体クリスタリンタンパク質または眼水晶体クリスタリンタンパク質のエラスターゼ切断産物である、請求項8から12のいずれか1項に記載の組成物。
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