WO2004096277A1

WO2004096277A1 - 眼内血管新生疾患の予防又は治療剤

Info

Publication number: WO2004096277A1
Application number: PCT/JP2004/006098
Authority: WO
Inventors: Nagahisa Yoshimura
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-04-27
Publication date: 2004-11-11
Also published as: JPWO2004096277A1

Abstract

本発明は、クリスタリン阻害物質を有効成分として含む、眼内血管新生疾患の予防または治療剤を提供するものである。クリスタリン阻害物質の具体例としては、CCUGAAGGAGACUGGUAUGTT(配列番号1)のヌクレオチド配列を有するRNA鎖及びその相補鎖より構成されるsiRNA等の二本鎖RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。本発明の医薬組成物は、眼内における血管新生を抑制する効果を有しており、糖尿病網膜症、未熟児網膜症等の眼内血管新生疾患に有用である。

Description

明細書眼内血管新生疾患の予防又は治療剤技術分野

本発明は、眼内血管新生疾患の予防または治療剤に関するものである。

更に詳しく述べれば、クリスタリン阻害物質を含む、眼内血管新生疾患の予防または治療剤に関するものである。背景技術

血管新生は、一般的に、プロテア一ゼによる血管の基底膜の消化 ·破壊、血管内皮細胞の遊走 ·増殖及び血管内皮細胞の分化による管腔形成、並びに血管の再構成を伴い進展する。眼内においてこのような血管新生が原因として発症する血管新生疾患としては、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症を始め種々の疾患が知られている。例えば、糖尿病網膜症は、視神経乳頭、網膜、虹彩或いは隅角に血管新生を認める失明原因の最大疾患であり、血管新生がその予後に最も重要な要因となる眼科疾患の一つである。網膜静脈閉塞症は、網膜新生血管膜を認め、硝子体出血を繰り返す重篤な血栓性疾患である。未熟児網膜症は、環境変化に伴うストレス、酸素投与、呼吸窮迫症候群、交換輸血、敗血症等の原因により早産児の網膜に血管新生を認める疾患であり、その大半は自然寛解するが、網膜剥離等の視力障害に至る場合がある。加齢黄斑変性症は、加齢に伴い網膜色素上皮細胞が脆弱化し、主として脈絡膜から網膜下に血管新生が起こり、視機能に障害を来たすことのある疾患である。

その治療方法としては、網膜光凝固術、汎網膜冷凍凝固術、硝子体手術、レ一ザ一毛様体破壊術、毛様体冷凍凝固術、放射線照射が施行されている。また、加齢黄斑変性症はおいては、ビタミン Eなどの抗酸化薬、亜鉛、インターフエロン 2 aやインターフェロン |3が投薬され、未熟児網膜症では、イブプロフェンが有効であることが報告されている（例えば、下記文献 1参照）。しかしながら、眼内における血管新生の形成機序は未だ解明されておらず、確立された薬物療法も存在しない。

最近、加齢黄斑変性症患者のドルーゼンにおいてクリスタリンが検出されたことが報告されているが、クリス夕リンと血管新生の形成との関係については何ら言及されていない（例えば、下記文献 2参照）。現在、上述の眼内血管新生疾患に対し、新規な予防又は治療方法の開発が望まれている。文献 1 ：特開 2002— 326929号公報

文献 2 ： Crabb JW.、外 11名，「 Proc. Natl. Acad. Sci. USA」 .， 200 2年 1 1月，第 99巻，第 23号， p.14619— 14621 発明の開示

本発明の目的は、新規な眼内血管新生疾患の予防又は治療剤を提供することである。

本発明者らは、眼内血管新生疾患の予防または治療に有用な薬剤を見出すベ鋭意検討した結果、クリスタリンが眼内における血管新生の形成に深く関与しており、このクリスタリンの発現を阻害することにより未熟児網膜症を始めとする眼内血管新生疾患における血管新生を抑制できるという驚くべき知見を得、本発明を成すに至った。

即ち、本発明は、

[1]クリスタリン阻害物質を含む、眼内血管新生疾患の予防または治療剤； [2] クリスタリンがクリスタリン ιδである、前記 [1] 記載の予防または治療剤；

[3] クリス夕リンがクリスタリン /3—Β2である、前記 [2] 記載の予防または治療剤；

[4] クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖 RN A である、前記 [1] 〜 [3] の何れかに記載の予防または治療剤； [5] 二本鎖 RNAが s i RNAである、前記 [4] 記載の予防または治療剤；

[6] s i RNAが配列番号 1〜 7の何れかに示されるヌクレオチド配列を有する RNA鎖及びその相補鎖より構成される RNAである、前記 [5] 記載の予防または治療剤；

[7] クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するァンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記 [1] 〜 [3] の何れかに記載の予防または治療剤；

[8] クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、前記 [1] 〜 [3] の何れかに記載の予防または治療剤；

[9] クリスタリン阻害物質が、クリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 RN A発現組換えべク夕一、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一である、前記 [1] 〜 [3] の何れかに記載の予防または治療剤；

[10] クリスタリン阻害物質が、クリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 R N A発現組換えべク夕一、クリスタリンに対するァンチセンスォリゴヌクレオチド発現組換えべク夕一、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えべクタ一により形質転換された宿主細胞である、前記 [1] 〜 [3] の何れかに記載の予防または治療剤；

[11] 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルべォ一シスおよび

E a 1 e s病から選択される疾患である、前記 [1] 〜 [10] の何れかに記載の予防または治療剤；

[12] 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、前記 [11] 記載の予防または治療剤； [13] 眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、前記 [11] 記載の予防または治療剤；

[14] 眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、'前記 [11] 記載の予防または治療剤；

[15] 眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、前記 [11] 記載の予防または治療剤；

[16] クリス夕リン阻害物質を有効量投与することからなる、眼内血管新生疾患の予防または治療方法；

[17] クリス夕リンがクリスタリン ]3である、前記 [16] 記載の予防または治療方法；

[18] クリスタリンがクリスタリン^— B 2である、前記 [17] 記載の予防または治療方法；

[19] クリスタリン阻害物質がクリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 RN Aである、前記 [16] 〜 [18] の何れかに記載の予防または治療方法；

[20] 二本鎖 RNAが s i RNAである、前記 [19] 記載の予防または治療方法；

[21] s i RN Aが配列番号 1〜7の何れかに示されるヌクレオチド配列を有する RNA鎖及びその相補鎖より構成される RNAである、前記 [20] 記載の予防または治療方法；

[22] クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記 [16] 〜 [18] の何れかに記載の予防または治療方法；

[23] クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、前記 [16] 〜 [18] の何れかに記載の予防または治療方法；

[24] クリス夕リン阻害物質が、クリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 R N A発現組換えべクタ一、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一、或いはクリス夕リン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一である、前記 [16] 〜 [1 8] の何れかに記載の予防または治療方法；

[25] クリス夕リン阻害物質が、クリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 R N A発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、前記 [16；! 〜 [18] の何れかに記載の予防または治療方法；

[26] 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルべォ一シスおよび E a 1 e s病から選択される疾患である、前記 [16] 〜 [25] の何れかに記載の予防または治療方法；

[27] 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、前記 [26] 記載の予防または治療方法；

[28] 眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、前記 [26] 記載の予防または治療方法；

[29] 眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、前記 [26] 記載の予防または治療方法；

[30] 眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、前記 [26] 記載の予防または治療方法；

[31] 眼内血管新生疾患の予防または治療用の医薬組成物を製造するためのクリスタリン阻害物質の使用；

[32] クリス夕リンがクリスタリン^である、前記 [31] 記載の使用； [33] クリス夕リンがクリス夕リンである、前記 [32] 記載の使用；

[34] クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖 RN Aである、前記 [31] 〜 [33] の何れかに記載の使用；

[35] 二本鎖 RNAが s i RNAである、前記 [34] 記載の使用； [36] s i RNAが配列番号 1〜 7の何れかに示されるヌクレオチド配列を有する RNA鎖及びその相補鎖より構成される RNAである、前記 [35] 記載の使用；

[37] クリスタリン阻害物質がクリス夕リンに対するァンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記 [31] 〜 [33] の何れかに記載の使用；

[38] クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、前記 [31] 〜 [33] の何れかに記載の使用；

[39] クリスタリン阻害物質が、クリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 R NA発現組換えべクタ一、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターである、前記 [31] 〜 [3 33 の何れかに記載の使用；

[40] クリスタリン阻害物質が、クリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 R NA発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一から選択される組換えべクタ一により形質転換された宿主細胞である、前記 [31] 〜 [33] の何れかに記載の使用；

[41] 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルべォ一シスおよび E a 1 e s病から選択される疾患である、前記 [31] 〜 [40] の何れかに記載の使用；

[42] 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、前記 [413記載の使用； [43] 眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、前記 [41] 記載の使用； [44] 眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、前記 [41] 記載の使用； [ 4 5 ] 眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、前記 [ 4 1 ] 記載の使用；

[ 4 6 ] 配列番号 1〜7の何れかに示されるヌクレオチド配列を有する R N A鎖及びその相補鎖より構成される s i R NA；等に関するものである。詳細に述べれば、第一に、本発明者らは、高酸素負荷マウス網膜血管新生モデルを用いた i n V i v o試験において、血管新生が認められた網膜組織中にクリスタリン )3— B 2、クリス夕リン) 3— A 3、クリスタリン /3— A l、クリスタリンァ一 Cなどの種々のクリスタリンの m R N Aが高発現していることを D N Aマイクロアレーにて確認した。また、血管新生が認められた網膜組織においてクリス夕リン) 3タンパク質産生が亢進していることをウエスタンプロット法にて確認し、網膜内の新生血管が生じる部位にのみクリスタリン ]3が存在していることを免疫染色にて確認した。更には、ヒト糖尿病網膜症患者において、網膜新生血管部位にクリス夕リン) 3が局在していることを免疫染色にて確認した。それ故、以上の結果から、血管新生形成やその進展においてクリスタリン、特にはクリス夕リン )3が深く関与していることが認められる。

更に、本発明者らは、眼内におけるクリスタリン産生を阻害すべく、特異的なクリスタリン /3阻害物質である s i R NAを作製し、高酸素負荷マウス網膜血管新生モデルに眼内投与した。その結果、網膜組織切片の硝子体側に認められる新生血管核数が顕著に減少していることを観察した。それ故、クリスタリン阻害物質は、眼内に起きる血管新生を阻害でき、血管新生が関与して発症する眼内血管新生疾患の予防又は治療に有用であることが認められた。

即ち、下記配列番号 1〜 7で示されるヌクレオチド配列を有する R N A鎖及びその相補鎖より構成される s i R NAを始めとするクリスタリン阻害物質を有効成分として含有させることにより、眼内血管新生疾患の予防または治療に有用な薬剤を提供するこ,とができる。

本発明において、眼内血管新生疾患とは、血管新生が関与して発症する眼内疾患をいい、例えば、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルべォ一シス、 Ea 1 e s 病等を挙げることができる。

本発明において、クリス夕リン阻害物質とは、クリスタリン阻害作用を有する物質をいい、クリス夕リン阻害作用とは、それ自体クリスタリンの産生或いは作用の阻害に限定されるものではなく、生体内または培養系におけるクリス夕リンの産生或いは作用の阻害を含む。クリス夕リン阻害物質としては、クリスタリン 3に対するものが好ましく、クリスタリン i3— B2に対するものが更に好ましい。具体的には、（i) クリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 RNA、 (i i) クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、（i i i) クリスタリン阻害作用を有する化合物及びそのセンスオリゴヌクレオチド、並びに（i V)クリスタリン阻害作用を有する二本鎖 RN A発現組換えべクタ一、 ( V ) クリス夕リンに対するァンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべク夕一、（v i) クリス夕リン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一、（V i i) クリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 RNA発現組換えべクタ一、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一によって形質転換された宿主細胞等を例示することができる。二本鎖 RN Aおける二本鎖構造は、単一の自己相補性 RN A鎖又は 2つの別個の相補性 RN A鎖により形成することができる。本発明において二本鎖 RNAとしては、例えば、クリスタリン遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズ（例えば、 400mM NaC 1、 4 OmM P I PES (pH6. 4) 、 ImM EDTA、 50°C又は 70°C で 12〜16時間ハイブリダィゼーシヨン後に洗浄）する RNA及びその相補的 RNAより構成される二本鎖 RNAが含まれる。ストリンジエンドな条件下とは、通常、クリスタリン遺伝子又はその一部と RNAの間において少なくとも 90%の配列同一性を確立するために当該技術分野における当業者により用いられる条件を指す。ハイブリダィゼーション及びそれに続く洗浄の条件としては、例えば、 Current Protocol in Molecular Biology, Vol.1, Chap.2.10, John & Sons, Publishers (1994)； Sanibrook et al. , Molecul r Cloning, Cold Spring Harbor (1989)を参照することができる。上記の配列同一性は、当業者に公知の配列比較又はアラインメント ·アルゴリズム（Sequence Analysis Primer, Stockton Press (1991)； Computational Molecular Biology, Oxford University Press (1988)； Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press (1993)； Computer Analysis in Molecular Biology, Academic Press (1987))により計算することができる。本発明におけるクリス夕リン阻害物質としては、特には、 RN A干渉により標的遺伝子の機能を部分的又は完全に喪失させクリスタリンの発現を阻害する、 21〜23塩基の二本鎖 RN Aを意味する、 s i RNA (sma 1 1 i n t e r f e r i ng RNA) が挙げられる。このような s i RNAとしては、実施例 1記載の下記配列番号 1〜 7の何れかに示される RN A鎖及びその相補鎖より構成される二本鎖 RN Aが $f.ましい。尚、本発明において、クリス夕リンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべク夕一とは、クリスタリンに対するァンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列を複製し、標的組織または宿主細胞内で当該アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる組換えべクタ一を意味する。クリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターとは、クリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドを標的組織または宿主細胞内で発現することができる組換えべクタ一を意味する。また、クリス夕リン阻害作用を有する化合物としては、クリスタリン抗体を含むタンパク質の他、クリス夕リン阻害作用を有する低分子化合物等が含まれる。

本発明で使用される s i RNAは、例えば、酵素的に或いは部分的又は全有機合成的に一般的に行われている R N A合成技術を用いて作製することがきる (Sambrooket al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989)； Dna Cloning, Vol. I and II, D.N. Glover ed. , (1985)； Oligo Nucleotide Synthesis, M.J. Gait ed. , (1984)； Nucleic Acid Hybridisation, B.D. Hanies & S. J. Higgins eds, , (1984)； Animal Cell Culture, R. I. Freshney ed. , (1986)； Immobi l ised Cel l s and Enzymes, IRL Press (1986)； B. Perbal, A Pract ical Guide to Molecular Cloning (1984)他) 。

本発明のクリスタリン阻害物質の使用方法としては、上述のクリスタリン阻害作用を有する二本鎖 R NA発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべク夕一、クリス夕リン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターや、それらの組換えべクタ一によって形質転換された宿主細胞を生体内の標的組織に適当な方法により導入し、所望の二本鎖 R NA、アンチセンスヌクレオチド、各種化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチドを発現させることによる遺伝子的な予防または治療剤としての使用や、クリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 R N A、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物を経口または非経口的に投与させることによる薬物的な予防または治療剤としての使用を挙げることができる。非経口的な投与方法としては、例えば、眼内への局所投与や静脈内投与を挙げることができる。

本発明において使用できるベクターとしては、プラスミドベクタ一、ウィルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ一、へルぺスウィルスベクター、センダイウィルスベクタ一、ワクシニアウィルスべクタ一）、リボソームベクター（例えば、カチォニックリボソームベクター）等を挙げることができる。

組換えべクタ一においては、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖 R NA、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド等をコードする塩基配列の他に、これを実際に標的組織または宿主細胞に導入して所望の二本鎖 R N A、アンチセンスオリゴヌクレオチド等を発現させるために、その発現を制御する塩基配列（例えば、プロモー夕一配列、ターミネータ一配列、ェンハンサ一配列）や微生物、昆虫細胞または動物培養細胞等を選択するための遺伝子マ —カー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。本発明において使用できる宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、並びに CHO細胞、 COS細胞、ミンク肺上皮細胞（例えば、 Mv lL u細胞）、リンパ球、線維芽細胞（N IH/3T3細胞）、血液系細胞、腎細胞（例えば、 293細胞）および腫瘍細胞（例えば、 He 1 a細胞）等の動物細胞を挙げることができる。

組換えベクターの標的組織または宿主細胞への導入方法としては、 HV Jリポソーム法（金田，実験医学， Vol.12， No.2, p.78 (1994); 森下等，実験医学， Vol.12, No.15, p.158 (1994)) 、クリスタリン阻害物質を注射等により直接投与する方法、リン酸カルシウム法、 DEAE—デキストラン法、エレクトロボレーシヨン法、遺伝子銃による方法（T. M. Klein et al.， Bio/Technology 10, P.286-291 (1992))、リポフエクシヨン法によって投与する方法（Nabel et al. , Science, Vol.244, p.1285 (1990)) 、ベクター（例えば、レトロウイルスべク夕一、アデノウイルスベクタ一、ヘルぺスウィルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等）を使う方法等を挙げることができる。

クリスタリン阻害物質を有効成分とする医薬組成物を実際に眼内血管新生疾患の予防または治療において用いる場合、用法に応じ種々の製剤形態のものが使用される。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤、注射剤、直腸投与剤、座剤等を挙げることができ、経口または非経口的に投与される。

クリス夕リン阻害物質を含有するこれらの各種医薬組成物は、上記クリスタリン阻害物質を有効成分として、通常用いられている賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物と適宜混合または希釈若しくは溶解し、常法に従い調剤することにより製造することができる。

クリスタリン阻害物質の眼内血管新生疾患に対する薬物的な予防または治療における投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度や疾患の種類等を考慮して適宜決定することができる。また、クリスタリン阻害物質の眼内血管新生疾患に対する遺伝的な予防または治療における投与量も同様にして適宜決定することができる。

本発明によれば、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖 RNA、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、クリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列またはこれを含むベクター、またはそのベクターにより形質転換させた宿主細胞を用いて標的組織に接触又は導入することにより、眼内血管新生疾患の発症または進展を抑制することができる。また、クリス夕リン阻害作用を有する二本鎖 RNA、クリスタリンに対するァンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を経口または非経口的に投与することにより、眼内血管新生疾患の発症または進展を抑制することができる。図面の簡単な説明

第 1図は、高濃度負荷マウスの摘出網膜新生血管におけるクリスタリン i3夕ンパク質の発現量を示すウエスタンプロット像である。縦軸は、タンパク質の重量（kDa) を示し、横軸は誕生から網膜摘出迄の経過日数（日）を示し、 ROP P 13とは生後 13日を、 ROP P 14とは生後 14日を、 ROP P 15とは生後 15日を、 ROP P 16とは生後 16日を、 ROP P 17とは生後 17日を、 RO P P 18とは生後 18日をそれぞれ意味する。

第 2図は、マウス網膜内の新生血管におけるクリスタリンの発現部位を示す共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真である。 ' 第 3図は、マウス網膜内の新生血管におけるクリスタリン βの発現部位を示す共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真である。

第 4図は、ヒト糖尿病網膜症患者におけるクリス夕リン 3の発現部位を示す共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真である。実施例本発明の内容を以下の試験例および実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。

(試験例 1 )

高酸素負荷マウス網膜血管新生モデルの作製

C57BLZ6 Jマウスを生後 7日から 5日間、母親と共に 75%酸素下にて飼育した後、通常酸素濃度に戻した（以下、高酸素負荷群という）。対照群のマウスは生後より通常酸素濃度下にて飼育した。麻酔下にて F I TC (蛍光性イソチオシァネート）ーデキストラン 5 OmgZmLを左心室に注入した後、眼球を摘出した。フラットマウント標本を作製して蛍光眼底造影を行う網膜血管新生の評価を行った。また、摘出眼球を 4%パラホルムアルデヒドに固定し、乳頭を通る垂直面で半切したパラフィン包埋切片を作製してへマトキシリン一ェォジン染色を行い光学顕微鏡下で網膜血管新生の評価を併せて行った。その結果、高酸素負荷群では、生後 12日後には新生血管は認められなかったが、生後 15日及び 17日に新生血管を顕著に認めた。

(試験例 2)

網膜新生血管における mRN Aの発現量の確認

試験例 1記載のマウスを用いて、生後 15日に高酸素負荷群および対照群より眼球を摘出し、摘出網膜より RNAを抽出した。ジーンチップ MGU74A V 2 (ァフィメトリックス社製）を用いてハイブリダィゼーシヨンを行い、両群間における RNA発現量の増減を比較検討した。その結果は、以下の表 1に示す通りであり、網膜上の新生血管においては、クリス夕リン ]3— B2、クリスタリン i3— A3ZA1やクリスタリンァー Cの mR N Aが顕著に高発現していることが確認された。

1] mRNAの種類増加率（倍）

クリスタリン )3— B2 19. 6

クリスタリン i3— A3ZA1 11. 6

クリスタリンァ一 C 9. 3

(試験例 3)

網膜新生血管におけるクリスタリン ]3タンパク質の発現量の確認

試験例 1記載の高酸素負荷群のマウスを用いて、生後 1 3〜1 8日に眼球を摘出し、摘出網膜よりタンパク質を抽出し、ウェスタンプロット法にてクリス夕リン /3の発現量を確認した。その結果は、第 1図に示す通りであり、網膜上の新生血管においては、生後 14及び 1 5日にクリスタリン /3タンパク質が高発現していた。

(試験例 4)

網膜新生血管におけるクリス夕リン ;8の発現部位の確認

試験例 1にて作製したパラフィン包埋切片を用いて、クリス夕リン /3特異的ペプチド抗体（S t r e s Ge n S PA- 2 3 0) 及び血管内皮細胞特異的蛍光抗体 (Griffonia si即 licifolia lectin) にてクリスタリン i3の発現部位を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で確認した。その結果は、第 2図及び第 3図に示す通りであり、クリスタリン jSの発現が血管内皮細胞に局在的に認められた。特に、硝子体側に突出している新生血管部位（neovascular tuft) に多く発現していた。

(試験例 5)

ヒト糖尿病網膜症患者におけるクリスタリン )3の発現部位の確認

ヒト糖尿病網膜症患者から摘出した網膜新生血管のパラフィン包埋切片を用いて、クリスタリン /3特異的ペプチド抗体 (S t i e s Ge n S PA- 2 3 0) 及び血管内皮細胞特異的蛍光抗体 (Griffonia simplicifolia lectin) にてクリスタリン /3の発現部位を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で確認した。その結果は、第 4図に示す通りであり、クリス夕リンの発現が新生血管部位に局在的に認められた。

(実施例 1 )

クリス夕リン ]3に対する s i RNAの作製

酵素的に或いは部分的又は全有機合成的に一般的に行われている RNA合成技術を用いて、下記配列番号 1で示される RNA及びその相補的 RNAを作製した後、ァニ一リングによりその s i RNA (s i RNA No. 1) を作製した。

配列番号 1 ： CCUGAAGGAGACUGGUAUGTT

また、同様にして、下記配列番号 2〜 7で示された RN Aから相当する s i RNAを作製することができる（s i RNA No. 2〜7) 。

配列番号 2 ： AAGGCAGGUUCUGUCCUAGUGTT

配列番号 3 ： AAGGGCGAGCAGUUUGUGUUUTT

配列番号 4 ： AAGGGUGAGUA.CCCCCGCUGGTT

配列番号 5 ： AAGGACGGACUCCCUCAGCUCTT 配列番号 7 ： AAGAUGGAAAUCAUAGAUGACTT

(実施例 2)

網膜血管新生抑制効果の確認試験

試験例 1記載の高酸素負荷群のマウスを用いて、生後 12、 14及び 16日に実施例 1記載の s i RNA No. 1 (5^ ) を生理食塩水に溶解して静注した（s i RNA投与群）。尚、対照群には、生理食塩水のみ静注した。生後 17日に網膜を摘出した後、摘出眼球を 4%パラホルムアルデヒドに固定し、乳頭を通る垂直面で半切したパラフィン包埋切片を作製してへマトキシリンーェォジン染色を行い光学顕微鏡下で網膜新生血管核数を測定し、血管新生の抑制効果を評価した。その結果は、表 2に示す通りである。 s i RNAの投与により顕著な血管新生の抑制効果が確認された。

[表 2] s i RNA投与群対照群新生血管核数 8. 0±2. 6 29. 5±6. 7 (倆/断面）産業上の利用可能性

本発明は、クリスタリン阻害物質を有効成分として使用した眼内血管新生疾患の予防または治療に関するものである。本発.明により、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症等の各種眼内血管新生疾患の予防または治療剤を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1. クリスタリン阻害物質を含む、眼内血管新生疾患の予防または治療剤。

2. クリスタリンがクリス夕リン /3である、請求項 1記載の予防または治療剤。

3. クリス夕リンがクリスタリン /3— B2である、請求項 2記載の予防または治療剤。

4. クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖 RN A である、請求項 1〜 3の何れかに記載の予防または治療剤。

5. 二本鎖 RNAが s i RNAである、請求項 4記載の予防または治療剤。

6. s i RNAが配列番号 1〜 7の何れかに示されるヌクレオチド配列を有する RN A鎖及びその相補鎖より構成される RN Aである、請求項 5記載の予防または治療剤。

7. クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項 1〜 3の何れかに記載の予防または治療剤。

8. クリスタリン阻害物質がクリス夕リン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、請求項 1〜 3の何れかに記載の予防または治療剤。 '

9. クリス夕リン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖 RN A発現組換えべクタ一、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターである、請求項 1〜 3の何れかに記載の予防または治療剤。

10. クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖 R N A発現組換えべクタ一、クリス夕リンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えべクタ一により形質転換された宿主細胞である、請求項 1〜 3の何れかに記載の予防または治療剤。

11. 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルべォ一シスおよび E a 1 e s病から選択される疾患である、請求項 1〜 10の何れかに記載の予防または治療剤。

12. 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、請求項 11記載の予防または治療剤。

13. 眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、請求項 11記載の予防または治療剤。

14. 眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、請求項 11記載の予防または治療剤。

15. 眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、請求項 11記載の予防または治療剤。

16. クリスタリン阻害物質を有効量投与することからなる、眼内血管新生疾患の予防または治療方法。

17. クリスタリンがクリスタリン βである、請求項 16記載の予防または治療方法。

18. クリス夕リンがクリス夕リン /3— Β 2である、請求項 17記載の予防または治療方法。 .

19. クリス夕リン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖 RN Αである、請求項 16〜18の何れかに記載の予防または治療方法。

20. 二本鎖 RNAが s i RNAである、請求項 19記載の予防または治療方法。

21. s i RNAが配列番号 1〜7の何れかに示されるヌクレオチド配列を有する RNA鎖及びその相補鎖より構成される RNAである、請求項 20記載の予防または治療方法。

2 2 . クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するァンチセンスォリゴヌクレオチドである、請求項 1 6〜1 8の何れかに記載の予防または治療方法。

2 3 . クリスタリン阻害物質がクリス夕リン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、請求項 1 6〜1 8の何れかに記載の予防または治療方法。

2 4. クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖 R N A発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一である、請求項 1 6〜1 8の何れかに記載の予防または治療方法。

2 5 . クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖 R N A発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えべク夕一により形質転換された宿主細胞である、請求項 1 6〜1 8の何れかに記載の予防または治療方法。

2 6 . 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルべォ一シスおよび E a 1 e s病から選択される疾患である、請求項 1 6〜2 5の何れかに記載の予防または治療方法。

2 7 . 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、請求項 2 6記載の予防または治療方法。

2 8 · 眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、請求項 2 6記載の予防または治療方法。

2 9 . 眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、請求項 2 6記載の予防または治療方法。

3 0 . 眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、請求項 2 6記載の予防または治療方法。

3 1. 眼内血管新生疾患の予防または治療用の医薬組成物を製造するためのクリスタリン阻害物質の使用。

32. クリスタリンがクリスタリン ]3である、請求項 31記載の使用。

33. クリスタリンがクリスタリン iS— B 2である、請求項 32記載の使用。

34. クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖 R N

Aである、請求項 31〜33の何れかに記載の使用。

35. 二本鎖 RNAが s i RNAである、請求項 34記載の使用。

36. s i RNAが配列番号 1〜 7の何れかに示されるヌクレオチド配列を有する RNA鎖及びその相補鎖より構成される RNAである、請求項 35記載の使用。

37. クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するァンチセンスォリゴヌクレオチドである、請求項 31〜33の何れかに記載の使用。

38. ' クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、請求項 31〜33の何れかに記載の使用。

39. クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖 R N A発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えべクタ一、或いはクリス夕リン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターである、請求項 31〜33の何れかに記載の使用。

40. クリス夕リン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖 R N A発現組換えべクター、クリスタリンに対するァンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項 31〜33の何れかに記載の使用。

4 1 . 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルべォ一シスおよび E a 1 e s病から選択される疾患である、請求項 3 1〜4 0の何れかに記載の使用。

4 2, 眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、請求項 4 1記載の使用。 4 3 . 眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、請求項 4 1記載の使用。 4 4. 眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、請求項 4 1記載の使用。 4 5 . 眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、請求項 4 1記載の使用。

4 6 . 配列番号 1〜 7の何れかに示されるヌクレオチド配列を有する RN

A鎖及びその相補鎖より構成される s i R NA。