TW201631157A - 用以治療癌症之短干擾核糖核酸分子 - Google Patents
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Abstract
在此揭示新穎的雙股短干擾核糖核酸分子(siRNA),其係可抑制細胞內Aurora-A基因之mRNA的轉譯。本文同時也揭示以這些新穎siRNA來製造癌症藥物的用途,該癌症藥物是可治療經由表皮生長因子受體(EGFR)訊遞機制所媒介之癌症。因此,本文還提供了包含所揭示siRNA分子的藥學組合物,以及透過施用所揭示siRNA分子至亟需治療之個體身上,來治療該個體身上經由EGFR媒介之癌症。
Description
本揭示內容係有關於癌症的治療。詳言之,本揭示內容係有關於以新穎的雙股短干擾性核醣核酸(short interfering RNA, siRNA)分子來抑制Aurora-A基因之mRNA的轉譯作用,以達成治療癌症之目的。
已知在多種癌細胞中Aurora-A基因和表皮生長因子受體(EGFR)的表現量都超出正常範圍。同時,也已經知道表皮生長因子(EGF)可能會經由先在Aurora-A mRNA的5’-UTR區域形成一起始轉譯前複合物,而專一性地提高Aurora-A mRNA的轉譯。因此,認為Aurora-A mRNA的5’-UTR區域,是潛在的藥物作用目標區域,可用來開發能治療與EGFR-相關癌症的藥物。
隨著轉錄後基因靜默技術的發展,干擾性RNA (RNAi)變成一種廣泛用來去除有機體特定基因表現的研發工具。目前已可透過系統性地使功能性基因靜默而找出細胞訊遞路徑上每一種蛋白質的功能,RNAi因此也成為一種用來開發治療性藥物的新式工具。本案發明人經過長久試驗與臨床研究後發現,某些非-編碼區的短RNA,具有抑制Aurora-A基因表現的功效,這些非-編碼區的短RNA因此可做為藥物,來治療經由EGFR訊遞機制媒介而生長的癌症,以減輕或減少罹患此類癌症之患者的病徵。
本揭示內容是有關於以新穎的、短干擾性RNA來治療、預防或對抗癌症,特別是,經由EGFR訊遞機制所媒介生長之癌症。
因此,本揭示內容第一目的係提供一種單離的雙股短干擾性RNA(siRNA),其係可藉由RNA干擾來抑制Aurora-A基因之mRNA的轉譯,其中(a)每一股該siRNA含有17-21個核糖核苷;且(b)該siRNA分子中的一股包含一核糖核酸序列,其具有與序列編號:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中任一條序列至少約90%的序列相似度。
依據本揭示內容一實施方式,該siRNA分子中的一股包含至少一鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)分子、經修飾的2’-糖 (2’-sugar modification)、經修飾的核苷與核苷間的連結(modified internucleoside linkage)或上述之組合。
本揭示內容第二目的係提供一種治療罹患經由EGFR訊遞機制所媒介生長之癌症個體的方法。所述方法包含對該個體施用一治療有效量之上述本發明的siRNA分子,藉由抑制Aurora-A基因mRNA的轉譯來對抗該經由EGFR訊遞機制所媒介之癌細胞的生長。
依據某些實施方式,本發明該siRNA分子乃是雙股siRNA,其可透過RNA干擾來抑制Aurora-A基因之mRNA的轉譯。該siRNA分子中的每一股含有17-21個核糖核苷;且該siRNA分子中的一股包含一核糖核酸序列,其具有與序列編號: 3、5或11中任一條序列至少約90%的序列相似度。
依據某些實施方式,本發明該siRNA分子的一股包含至少一個LNA分子、經修飾的2’-糖 (2’-sugar modification)、經修飾的核苷與核苷間的連結(modified internucleoside linkage)或上述之組合。依據一實例,本發明該siRNA分子的一股包含8個LNA分子。依據另一實例,本發明該siRNA分子的一股包含10個LNA分子。
本發明該siRNA分子乃依據某些實施方式,該經由EGFR訊遞機制所媒介之癌可以是大腸直腸癌、肝癌、乳癌、或子宮頸癌。在一實例中,該個體是罹患大腸直腸癌。
本發明第三方面是提供一種可治療癌症的藥學組合物。所述組合物包含一藥學有效量之上述siRNA分子,以及其之藥學上可接受載體。
依據某些實施方式,該siRNA分子中的一股包含至少一鎖核酸(LNA)分子。
本發明第四方面是提供一種可治療癌症的方法。所述方法包含對該個體施用上述本發明之藥學組合物,以抑制癌症的生長或減輕與該癌症相關的病徵。
本揭示內容的一或多個實施方式,將詳述於下文實施方式中。透過以下的詳細說明與附隨之申請專利範圍將可更了解上述本揭示內容的特徵。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備,下文針對本發明實施態樣與具體實施例提出說明性的描述;但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而,亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
1. 名詞定義
為簡便起見,統一在此對本文中所使用到的名詞提供解釋。除非本說明書另有定義,此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外,在不和上下文衝突的情形下,本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型;而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
除非本說明書另有定義,所述「核酸(nucleic acid)」一詞係指由二或多個核苷經由共價鍵結所形成的分子,所述核苷包含DNA、RNA或這些DNA或RNA的類似物。「核酸(nucleic acid)」與「多核苷(polynucleotide)」在本文中係可彼此交替使用。
核酸之「序列(sequence)」一詞在此指組成該核酸的核苷順序。在本文中,每一核酸都具有一5’-端與一3’-端,除非特別指明,否則一單股核酸的左手方向端是5’-端,而其右手手方向端是3’-端。
「鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)」在本文中指一核酸分子中的某些核苷乃是鎖核酸單體(亦即,雙環核苷或其類似物),亦即核酸分子中的核糖部分多出了一個可連接2’-羥基上之氧原子和4’-碳原子的橋鍵,使得該核醣部分被固定在3’-內構形(3’-endo conformation),因而使核酸分子不易被核酸酶水解。適合的LNA單體可參見WO2000/56746、WO2001/25248、WO2003/006475、或WO2003/095467,這些公開文獻內容在此一併併入本文作為參考。
「siLNA」一詞在此係泛指雙股LNA,因此本文中「siLNA」指至少包含一個LNA單體的siRNA。
「siRNA」一詞在此係泛指雙股RNA,典型的siRNA通常是由每股長度約17-21個核苷且彼此互補的兩條核酸所組成的雙股RNA。在siRNA中,其中一股是引導股並會與目標RNA序列互補(亦即,反義股(anti-sense strand)),另一股則是與目標RNA序列相同的正義股(sense strand),因此與該引導股和/或反義股序列彼此互補。
對核酸序列而言,「序列相似度百分比(%)」是指一候選序列與一參考序列的核苷順序完全相同的百分比。進行比對時,可將候選序列與參考序列並排,並於必要時引入間隙,以使二序列間具有最高的序列相似度。相關領域中已有多種方法可供進行上述的序列並排比對,譬如利用可開取得的軟體(如,BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等)來進行比對。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行序列並排比對時,可選擇適當的參數與計算方式,以獲得最佳的排列。在本說明書中,二序列間的序列並排比對是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information,簡稱NCBI)所提供的核酸分析軟體Blastn來進行。一候選序列A相較於一參考序列B的序列相似度(在本說明書中亦稱之為序列A與序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下:,其中X是利用Blastn軟體對序列A、B進行排列後所得到的相同核苷數目(identical matches),而Y是A、B二序列中較短者的核苷總數。
於本說明書中,「治療」一詞的各種詞性與時態(如treat、treating或treatment)係指預防性(如,預防用藥)、療癒性或緩和性的處置。「治療」一詞可用以指稱將此處提出的短干擾性核苷投予或施用於一個體,此個體可能有一醫療疾患、症狀、疾病或與疾患相關的異常或易於罹患一疾患,以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕一特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵,或延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對並未表出現疾病、異常和/或病症之徵兆的個體和/或呈現早期徵兆的個體進行治療,以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關之病理變化的風險。在本說明書中,當一或更多種症狀或臨床指標減少時,通常認為該治療是「有效」的。或者是,有效的治療意味著一疾病的進展減少或暫停。亦即,「治療」不僅包含改善症狀或降低疾病指標,還涵蓋了停止或減緩原本在不治療情形下,極有可能發生的疾病進展或症狀惡化等。有益的臨床結果包括,但不限於:緩解一或多種症狀、縮減疾病程度、穩定疾病狀態(如,並未惡化)、延遲或延緩疾病進程、部分或完全改善或緩和疾病狀態,以上所述包含可偵測或不可偵測的症狀、程度、狀態或進程。
在此處,「有效量(an effective amount)」一詞係指一成分的用量足以獲致所欲的反應或效果。「治療有效量(a therapeutically effective amount)」一詞則是指藥學組合物中的治療藥劑之含量足以產生上文定義的所欲「有效治療」。具體的治療有效量取決於多種因素,諸如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如,個體體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。治療有效量亦指於此用量下,該化合物或組合物的毒性或負面效果不及於其所帶來的正面療效。
「個體」、「受測者」或「患者」一詞在本文中可交替使用,係指被診斷出患有癌症或腫瘤(包括固體瘤或轉移性癌)且接受本發明方法和/或組合物治療之人類或非人類動物。除非本說明書另有定義,否則「個體」、「受測者」或「患者」一詞在本文中涵蓋雌性和雄性動物兩種性別的動物。非人類動物在本文中泛指所有的脊椎動物,例如,哺乳動物(如,靈長類、狗、齧鼠類(如小鼠和大鼠)、貓、羊、馬、或豬)和非哺乳動物(如,鳥類、兩棲類、爬蟲類等)。
2. 本發明之siRNA或siLNA
本發明是有關於利用短的干擾性核糖核酸分子來治療癌症(如,大腸直腸癌)的新穎方法。據此,以最廣的角度而言,本發明是有關一種雙股核酸,其包含至少與一部分目標基因RNA序列(例如,Aurora-A基因之RNA)互補的兩股核糖核酸分子,且能透過RNA干擾機制來使已表現的目標基因的mRNA被裂解或是抑制其轉譯作用。本發明的siRNA分子包含兩股核糖核酸分子,其中(a)每一股該siRNA分子含有17-21個核糖核苷;且(b)該siRNA分子中的一股包含一核糖核酸序列,其具有與序列編號:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中任一條序列至少約80%的序列相似度,用以透過RNA干擾來抑制Aurora-A基因之mRNA的轉譯。
本發明雙股siRNA分子中的每一股長度界於17-21個核糖核苷間,例如17、18、19、20或21個核糖核苷。在一較佳實施方式中,本發明雙股siRNA分子中的每一股長度是17個核糖核苷。在另一較佳實施方式中,本發明雙股siRNA分子中的每一股長度是18個核糖核苷。在再一較佳實施方式中,本發明雙股siRNA分子中的每一股長度是21個核糖核苷。本發明雙股siRNA分子中的每一股可以完全由RNA組成或是由RNA與至少一個LNA分子(如,2’-O-, 4’-C亞甲基雙環核苷單體)組成。一般來說,本發明雙股siRNA分子中的每一股可包含至少約5%、10%、15%或20%的LNA分子,此係以每股所含核苷總數來做計算。在特定實施方式中,本發明雙股siRNA分子中的每一股可包含至少約25%、30%、40%、50%或60%的LNA分子,此係以每股所含核苷總數來做計算。較佳是,本發明雙股siRNA分子中的每一股可包含至少約40%的LNA分子,更佳是包含至少約60%的LNA分子。依據本發明一實施方式,本發明雙股siRNA分子是完全由RNA分子組成,其中一股包含具有與序列編號:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中任一條序列至少約90%的序列相似度,例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。依據本發明另一實施方式,本發明雙股siRNA分子是由RNA與LNA分子共同組成,其中一股完全由RNA組成,另一股則由RNA和50%或60%的LNA共同組成。或者,本發明雙股siRNA分子也可包含其他種修飾,例如在2’-糖處有修飾(2’-sugar modification)、在核酸分子間連結處有修飾(modified internucleoside linkage)或其之組合。
依據一實施方式,本發明雙股siRNA分子的正義股(sense strand)中包含至少一個LNA分子。舉例來說,所述雙股siRNA分子的正義股中包含二個LNA分子,反義股則不包含LNA分子。在一實例中,所述雙股siRNA分子的正義股中包含9個LNA分子,反義股則不包含LNA分子。在另一實例中,所述雙股siRNA分子的正義股中包含10個LNA分子,反義股則不包含LNA分子。依據本發明另一實施方式,所述雙股siRNA分子的正義股中包含至少一個LNA分子,反義股也包含至少一個LNA分子。舉例來說,所述雙股siRNA分子的正義股中包含二個LNA分子,反義股則包含一個LNA分子。
在核酸分子中納入LNA分子的優點之一是可改善核酸分子的安定性。因此,本發明雙股siRNA或siLNA分子包括將LNA單體併入至一標準的RNA分子中,藉以提高所得siRNA或siLNA分子的安定性,例如使所得的siRNA或siLNA分子較不易被核酸酶(內切核酸酶或外切核酸酶)分解,因此可提高siRNA或siLNA分子在一生物樣本中存活的時間。
目前有多種方式可用來製造基因靜默研究用的siRNA,包括化學合成、試管內轉錄、以第III族RNAase酵素來裂解長鏈雙股RNA、以表現質體或病毒載體在細胞中表現siRNA、或是在細胞中表現以即時聚合酶鏈反應產生的siRNA表現盒。前面三種方法是先在活體外製造siRNA,然後再透過脂染、電穿孔或其他技術將活體外製造的siRNA送到活體內表達。後面兩種方法則依賴將能表現siRNA的DNA-載體和表現盒送入細胞內表現。
本發明雙股siRNA分子可利用習知技術在活體外製備而成,或是以化學方式合成。舉例來說,可利用核酸化學中的聚合反應技術來製造本發明雙股siRNA分子。一般來說,可使用標準的膦醯胺酸寡聚合反應來進行製備,但也可使用其他諸如H-膦酸酯或是膦酸三乙酯化學合成法來製備。或是,將RT-PCR表現盒放入適當的載體,送至細胞內,以轉殖方式在活體外製造出本發明雙股siRNA分子。一旦本發明雙股siRNA分子被表現後,即可與目標基因的RNA分子作用,而產生干擾RNA的效果。本發明雙股siRNA分子還可包含一用以將雙股siRNA分子送到待測個體內的傳送載體(如,脂質體)、藥學載體、和/或稀釋物,且係以藥學上可接受的量存在於藥學配方中。用來傳送核酸分子的方法乃是此領域中眾所周知的,包括但不限於,脂質體包埋、離子導入法或是將其併入諸如生物可分解聚合物、水凝膠、環糊精等載體或是蛋白載體中來傳送。
本發明所用到的siRNA分子列於下表1中。透過以至少一個LNA分子(如,2’-O,4’-C亞甲基雙環核苷單體)修飾表1中siRNA分子即可獲得與該些siRNA相對應的siLNA分子。表2列出透過以LNA分子取代表1序列編號:5、11和13之siRNA分子中的部份核糖核酸後所製得的siLNA分子,序列中大寫字母代表LNA分子。
表1 本發明siRNA分子序列
*括弧內的數字代表總長度為110個核苷的exon2 mRNA序列中核糖核酸分子位置。
表2 本發明siLNA分子實例
大寫字母代表LNA分子,小寫字母代表RNA。
本發明另一方面是有關以本發明雙股核酸分子來製造用以治療癌症的醫藥品的用途。
因此,本發明也提供一種用來治療或預防癌症的藥學組合物。所述藥學組合物包含至少一本發明雙股核酸分子作為其活性成分,以及一藥學上可接受的載體。所述藥學組合物還可非必要的包含有另一種抗癌藥物,例如化療藥物、抗發炎藥物或是免疫調節藥物。
可將本發明核酸分子懸浮在適當分散基質中,例如水、PBS、生理食鹽水、油或脂肪酸。所製成的藥學組合物可經由腸胃外(parenterally)、吸入性噴劑、局部表面塗抹、直腸(rectally)、鼻內、頰內或陰道內給藥等方式施用。「腸胃外(parenterally)」一詞在此包含皮下、靜脈內、肌肉內、動脈內、滑膜內(intra-synovial)、胸骨內、鞘內(intrathecal)、肝臟內、病灶內(intraleasional)和顱內注射或灌流等。較佳是透過肌肉內、腹膜內或靜脈內注射方式來施用本發明核酸分子,最佳是以肌肉內注射方式來施用本發明核酸分子。在一實例中,是由個體四肢肌肉(如,手臂或腿)某處位置將本發明核酸分子注射到個體體內。可依據下述條件來選擇適合注射的位置:想要釋出的核酸分子種類或個體個人狀況(如,年齡、性別、體重、和/或目前及過去用藥紀錄)。有經驗的醫師可在不需過度實驗的情況下依據上述因子決定最佳的注射位置。可利用適當的分散劑、濕潤劑或懸浮劑,以習知技術將本發明組合物配方成無菌的水性或油性懸浮注射溶液。例如懸浮在無毒注射用稀釋物或溶劑(如,1,3-丁二醇)中的無菌注射溶液。可用的溶劑包括水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、磷酸鹽緩衝溶液和氯化鈉等張溶液(即,生理食鹽水)。此外,也可使用習知的無菌固定用油做為溶劑或懸浮劑,來製造油性注射液。據此,可使用任何廠牌適合的油,包括合成的單或雙酸甘油酯。也可使用諸如油酸之類的脂肪酸及其之甘油酯衍生物,以及中性藥學可接受的油(如,橄欖油、菜子油,特別是以聚氧乙基化形式存在的橄欖油或菜子油)來製造油性注射液。至些油性注射液或懸浮液也可包含配方中常用的長鏈的醇類稀釋物或分散劑,如羧甲基纖維素或類似物,作為乳化劑或懸浮劑。其他常用的介面活性劑包括Tweens、Spans及其他乳化劑或常用來製造藥學上可接受的固體、液體或其他劑型之油可提升生物可利用性的物質。所需施用的劑量視施用途徑,配方本身性質,個體狀態(包括病史、體重、表面積、年齡或性別),是否併用其他藥物,以及照護醫師的判斷等來決定。適當的劑量一般介於約0.15-1.5毫克核酸/公斤體重間,例如約0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5毫克核酸/公斤體重;較佳是介於約0.3-1.2毫克核酸/公斤體重間,例如約0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、或1.2毫克核酸/公斤體重間;更佳是介於約0.5-1.0毫克核酸/公斤體重間,例如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0毫克核酸/公斤體重間。視個體是否使用其他抑制血管新生藥物及施用途徑來調整適用的劑量範圍。此領域具普通技藝人士可依據上述配方,評估相關因子後來決定適合的施用劑量。
本發明也提供一種治療一被預斷患有癌症之個體的方法。所述方法包含對該個體施用一治療有效量之上述本發明的siRNA分子,且更包含對該個體施用額外的藥物(如,化療或放療藥物),以治療其體內的癌症。在此所述的個體係指人類或非人類個體。在較佳實施例中,所述個體為人類。適合以本發明方法進行治療的癌症包括,但不限於,直腸癌、大腸直腸癌、乳癌、前列腺癌、肝臟細胞癌、黑色素瘤、纖維母細胞癌、腦癌、血癌、視網膜母細胞癌、腎臟細胞癌、頭頸癌、子宮頸癌、食道癌、及鱗狀細胞癌。在一實例中,該個體是被診斷或預斷罹患有大腸直腸癌。在另一實例中,該個體是被診斷或預斷罹患有肝臟細胞癌(HCC)。在再一實例中,該個體是被診斷或預斷罹患有乳癌。該個體可以在接受本發明方法和/或組合物治療前,即已接受過其他醫療。在此所指的「其他醫療」包括一般用來治療癌症的手術、藥物或放射線治療。為了放大基因療法對抗癌細胞的效果,已經被診斷出患有癌症的個體在接受本發明方法和/或組合物治療之前、期間或之後,也可接受其他醫療處理。在一實例中,該個體在接受本發明方法和/或組合物治療之前,已接受過化學藥物或放射線治療。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備,下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述;但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而,亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
實施例
材料與方法
細胞株及其培育方法
本發明使用了以下幾種細胞株,包括大腸直腸癌細胞株(包括LS174T、SW620、SW480、HCT116和C2BBe1)、直腸癌細胞WiDr、正常大腸細胞株CRL-1790、肝癌細胞株(包括Huh7、SK、HepG2、Hep3B和PLC-5)、乳癌細胞株(包括MCF7、MB468和HS678T)以及子宮頸癌細胞株HeLa。一般來說,細胞是培養在其個別培養基中,並添加10%經過熱失活處理的胎牛血清(fetal bovine serum, FBS),100μg/mL的鏈黴素和100 U/mL的青黴素,並維持在37℃的潮溼環境下(5% CO2
及95%空氣)。明確的說,LS174細胞是培養在MEM-GIBCO基質中(Invitrogen公司產品);SW480和SW620是培養在L-15基質中;HCT116和MB468細胞是培養在RPMI 1640基質中;HeLa、Huh7、SK、HepG2、Hep3B、PLC-5、C2BBe1和CRL-1790是培育在DMEM基質中;WiDr和MCF7是培養在ATCC-配方的Eagle MEM培養基中。
建構小鼠
Aurora-A siRNA
或
siLNA
以人類Aurora-A mRNA 的5’-UTR作為目標序列,來製備可干擾Aurora-A基因表現的siRNA。分別使用下述目標序列位置的核酸來製備本發明的siRNA:384-402、434-452、436-452、385-404、436-454、379-396、和438-455。此外,同時以市售的PCR-衍生之siRNA表現盒(購自Dharmacon, Thermo, Lafayette, CO, USA)來製造負控制組siRNA。
已知LNA可在不干擾siRNA本身整體螺旋架構的請況下提高siRNA的安定度,因此,依照儀器的指示,以1nmol的量在MOSS加速儀器平台上,以上述表1之siRNA為模板,製造出經過LNA改造的siRNA(上述表2,以下稱siLNA)。
接著,將可干擾小鼠Aurora-A mRNA 5’-UTR的siRNA和siLNA轉殖到pGL3質體內,其包含SV40啟動子和螢光素酶報導基因,透過接合酶將與目標基因相對應的雙股DNA寡核苷接合到pGL3質體內,來建構出欲求的siRNA或siLNA的轉殖質體,並以PCR和定序來確認接合後的產物。
以小鼠Aurora-A siRNA或siLNA建構物來轉染細胞
將包括大腸直腸癌細胞株(包括LS174T、SW620、SW480、HCT116和C2BBe1)、直腸癌細胞WiDr、正常大腸細胞株CRL-1790、肝癌細胞株(包括Huh7、SK、HepG2、Hep3B和PLC-5)、乳癌細胞株(包括MCF7、MB468和HS678T)以及子宮頸癌細胞株HeLa在內的各式細胞株培養在6-孔的培養盤中,然後藉由轉染試劑(Lipofectamine 2000)以可表現出本發明siRNA和siLNA的質體轉染個細胞株。詳言之,於不含抗生素的DMEM中,混合0.5μg/每孔可表現出本發明siRNA或siLNA的質體與6μL/每孔的轉染試劑(Lipofectamine 2000),在室溫下培育約25分鐘,使形成複合物。將此複合物加入到培育在6-孔培養盤中的細胞,繼續培育約24小時。透過即時定性PCR(或稱Q-PCR或RT-PCT)分析或ELISA試驗來確認並偵測所表現出來的人類Aurora-A mRNA 5’-UTR基因產物。
即時定性
PCR(
或稱
Q-PCR
或
RT-PCT)
依據TriSure試劑製造商的指示,利用該試劑分離出轉染有Aurora-A mRNA 5’-UTR siRNA之細胞的總RNA。以約400-800 ng經過DNA酶處理過的總RNA作為模板來合成第一股DNA。以ABI PRISM 7000來執行RT-PCR,藉以分析所合成的cDNA。將針對目標基因序列設計的引子和探針分別與TaqMan Universal Mastermix混合,然後加入所欲分析的cDNA。每一樣品進行三重複並以ABI PRISM提供的SDS軟體來分析所得數據。
免疫墨點分析
以內含1 mM正釩酸鈉、1 mM苯甲磺醯氟、10μg/mL亮肽素和10μg/mL抑肽酶的分解緩衝液(50mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.5%脫氧膽酸鈉, 1mM EDTA, 2mM EGTA)處理所培育的細胞,並收集之。在4℃下將分解液以12,000 x g的速度離心5分鐘。收集上清液並儲存在-70℃。以SDS-PAGE來分離免疫沉澱物並以可認得Aurora-A、含有Exon-2的Aurora-A 5’-UTR、Exon-2、GNDPH、前-半胱胺酸天冬安酸-3蛋白酶、半胱胺酸天冬安酸-3蛋白酶、和管蛋白的抗體來進行免疫墨點分析。
活體外轉錄試驗
依據Yeh等人(Mol Biol Cell (2008) 19:3812-3822)所揭示的步驟來執行活體外轉錄試驗。簡言之,以各種濃度之內含螢光素酶報導基因的本發明siRNA、siLNA或是Aurora-A 5’-UTR異構物(如,exon2+或exon2-)的基因構築物,來轉染SW480細胞。依據製造商所提供的指示,以螢光素酶報導基因試劑來偵測螢光素酶報導基因活性。
細胞毒性分析
在正常直腸細胞(CRL-1790)以及癌細胞株SW480、HeLa上測試本發明siRNA或siLNA對該些細胞的影響。簡言之,利用Lipofectamine 2000將各種濃度的本發明siRNA或siLNA(0, 0.1, 0.5, 1. 2, 5, 10, 20, 50或100nM)轉染至細胞株內,然後以免疫墨點分析細胞內酵素caspase-3或caspase-7的活性來評估其細胞毒性。
細胞增生能力分析
以細胞計算套組-8 (cell counting kit-8, CCK8)來評估細胞的增生能力。此套組可進行一種比色分析,其可量測酵素(即,還原酶)在活細胞內將黃色的四唑化合物還原成甲䐶(formazane)的活性。只有在細胞存活時,才能進行這種還原作用;因此通常會利用此比色分析來評估細胞存活與增殖的能力。簡言之,先以本發明siRNA或siLNA (10 nM)處理癌細胞不同時間(如,1-4天);之後加入套組所附染料(500 μg/ml),並讓還原反應進行4小時;而後加入500 μl的異丙醇以終止還原反應。利用分光光度計測量樣本在450 nm之波長下的吸光度。
誘發原位癌及活體內治療
本試驗使用5-6週齡之NOD-SCID小鼠,飼養在無病原菌的環境下,室溫維持於22±3℃,相對濕度保持於50±20%,日夜週期維持12/12小時,並可自由取用飲水及食物。所有動物實驗操作,皆遵循中華實驗動物學會出版之「實驗動物管理與使用指南」之規範。
試驗前一天,將動物依體重分組,分組後確認各組間體重無統計上顯著差異,然後,將動物左後大腿外側剃毛。試驗開始當天,注射腫瘤細胞於剃毛處皮下,將人類大腸直腸癌SW480細胞(1X106
個細胞)注射至小鼠皮下。待腫瘤體積成長至約50立方毫米(mm3
)時,再將動物隨機分成3組,以每週2次的頻率,分別投予載體、siLNA控制組或siLNA-2,投藥當日定為投藥試驗第1天,此外,實驗期間,每天量取小鼠體重。所有投藥溶液均當日配製。小鼠第16天完成試驗,實驗完成後將腫瘤取下,秤量腫瘤重量並且計算本發明siRNA或siLNA抑制腫瘤生長的比例。腫瘤大小是以如下公式計算:長度x(寬度)2
x 0.5。
實施例
1
各種癌細胞株都會表現內含
Exon2
的
Aurora-A 5’-UTR
Aurora-A mRNA之5’-UTR區域(分別為exon1、exon2、和exon3)有6種異構物,,其中exon1有3種變異物(即,exon1、1a和1b)且exon2有2種變異物(即,exon2和2a)。先前研究顯示,在癌細胞Aurora-A mRNA 5’-UTR區域中exon2區域的表現量會隨著EGF處理而升高,因此,在本實施例中,我們調查了各類型癌細胞中Aurora-A mRNA 5’-UTR中exon2區域的表現量。
本實驗使用了大腸直腸癌細胞株(包括LS174T、SW620、SW480、WiDr、HCT116和C2BBe1)、肝癌細胞株(包括Huh7、SK、HepG2、Hep3B和PLC-5)、乳癌細胞株(包括MCF7、MB468和HS678T)以及子宮頸癌細胞株HeLa。依據上述「材料與方法」段落中所述步驟來培育細胞,以免疫墨點分析來偵測細胞中內生性exon2、Aurora-A、內含exon2的Aurora-A mRNA 5’-UTR、以及甘油醛-3-磷酸去氫酶(GNDPH,本身當作管家基因)的表現量,結果繪示於第1A-1D圖中。
第1A-1D圖結果確認所測試的癌細胞株都會表現不同形式的Aurora-A 5’-UTR,包括內含exon2的Aurora-A 5’-UTR及其變異體。
實施例
2
大腸直腸癌患者體內
Aurora-A exon2
和
Aurora-A
基因的表現模式
本實施方式中收集了155份不同期大腸直腸癌患者組織樣本,並分析所收集樣本的Aurora-A基因與Aurora-A exon2的表現模式。簡言之,先從這些組織樣本中分離出其總RNA,接著利用RT-PCR來分析其中的Aurora-A與Aurora-Aexon2基因表現程度,並相對於管家基因GNDPH,將各基因表現量正常化後,結果總結於表3中。
表3 人類大腸直腸癌患者組織樣本中有無Aurora-A或Aurora-A exon2的樣本數
*Chi square分析,p<0.0001.
如表3所示,在人類大腸直腸癌患者癌症組織樣本中,同時出現exon2與Aurora-AA兩基因表現的癌樣本數最高,代表exon2與Aurora-A兩基因的表現與大腸直腸癌出現的機率習習相關。
實施例
3
本發明
siRNA
或
siLNA
可抑制
Aurora-A mRNA 5’-UTR
中
exon2
的轉譯
在本實施方式中,以本發明siRNA或siLNA來處理大腸直腸癌細胞株SW480,然後分別以RT-PCR和免疫墨點分析來測定Aurora-A、Aurora-A mRNA 5’-UTR中exon2與exon1的表現量,結果繪示於第2及3圖中。
如第2圖所示,相較於僅裂解Aurora-A之exon1區域而言(第2A圖),以本發明siLNA來裂解Aurora-A之exon1和exon2兩區域(第2B圖),可明顯抑制Aurora-A基因的表現。此結果間接證明exon2區域對Aurora-A基因表現的重要性,而且Aurora-A之exon1和exon2兩區域被本發明siRNA降解的程度與所用siRNA劑量相關。
再依據第3A及3C圖,Aurora-A與exon2兩者的表現程度明顯會受到本發明siLNA抑制而減弱。相較來說,Exon1表現量減少的程度則沒有特別明顯(第3B圖)。
實施例
4
本發明
siLNA-2
可降低細胞存活率並減少癌細胞增生能力
在本實施例中,依照「材料與方法」段落中所述方法,透過量測capase-3和capase-7的活性或細胞增生能力,來評估本發明siLNA-2毒殺大腸直腸癌細胞(包括SW480和HTC116細胞株)的效果,結果繪示於第3及4圖。
如第3A圖所示,隨著處理時間增長,胞外可測得的capase-3/7的活性增加,72小時後,所測得的capase-3/7的活性約為控制組的4倍,代表癌細胞大量死亡,此結果也可由本發明siLNA-2抑制癌細胞增生能力的實驗中獲得證實。如第3B圖所示,相較於未經處理的癌細胞而言,經過本發明siLNA-2 (10 nM)處理的癌細胞(包括SW480和HTC116細胞株),其增生能力明顯受到抑制。此外,藉由此細胞增生試驗,以不同濃度(介於0.5-5 nM間)之本發明siLNA-2來處理SW480細胞,可獲得其抑制50%之SW480、HCT-116和Huh7癌細胞生長的濃度(IC50
)分別約2.048、15.285和11.51 nM。
雖然本發明siLNA-2可誘發癌細胞死亡或抑制其增生,然而其並不會影響正常細胞的生長(第4圖)。相較於SW480細胞,以本發明siLNA-2 (25 nM)處理後的正常大腸直腸細胞CRL-1790之capase-3/7的活性並未增加,代表本發明siLNA-2不會誘發正常大腸直腸細胞死亡。
實施例 5 本發明
siRNA或siLNA 可抑制 原位癌的生長
依照「材料與方法」段落中所述步驟在小鼠體內誘發產生原位癌,接著再施以本發明siRNA或siLNA處理。結果繪示於第5A、5B圖中。
第5A圖繪示出有或無經過本發明siRNA或siLNA處理之原位癌體積隨時間變化的情形。在載體控制組動物中,原位癌體積隨時間增加而增加,但若有本發明siLNA存在下,因會干擾Aurora-A基因之exon2的表現,因此,一如預期,相較於控制組腫瘤而言,其腫瘤體積比較小。此外,治療期間,小鼠本身體重並沒有顯著的變化(第5B圖)。
總結來說,本發明結果可支持以下假說:在有EGRF-媒介的癌細胞生長的個體體內,可透過在該個體體內引入干擾性RNA,特別是可干擾Aurora-A mRNA 5’-UTR中exon2區域表現的siRNA,而抑制Aurora-A基因的表現,進而達成抑制腫瘤生長或治療所述癌症的目的。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例,然其並非用以限定本發明,本發明所屬技術領域中具有通常知識者,在不悖離本發明之原理與精神的情形下,當可對其進行各種更動與修飾,因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下: 第1A圖為依據本發明一實施方式所繪示的各類癌細胞株包括大腸直腸癌細胞株LS174T、肝臟腫瘤(HCC)細胞株Huh7和HepG2、血癌細胞株RS4;11以及子宮頸癌細胞株HeLa中內含exon2之Aurora-A 5’-UTR的表現模式; 第1B圖為依據本發明一實施方式所繪示的各類大腸直腸癌細胞株LS174T、SW620、SW480、HCT116、WiDr、和C2BBe1中內含exon2之Aurora-A 5’-UTR的表現模式; 第1C圖為依據本發明一實施方式所繪示的各類肝臟腫瘤(HCC)細胞株Huh7、SK、HepG2、Hep3B、和PL-5中內含exon2之Aurora-A 5’-UTR的表現模式; 第1D圖為依據本發明一實施方式所繪示的乳癌細胞株MCF7、MB468、和HS678T中內含exon2之Aurora-A 5’-UTR的表現模式; 第2圖為依據本發明一實施方式所繪示之以siLNA混合物(控制組)或是本發明siLNA-2來抑制(1) Aurora-A RNA之exon1,或(B) Aurora-A RNA之exon1和exon2的轉錄程度; 第3A圖為依據本發明一實施方式所繪示之本發明siLNA-2誘發大腸直腸癌細胞死亡的結果; 第3B圖為依據本發明一實施方式所繪示之本發明siLNA-2抑制大腸直腸癌細胞SW480或HCT116增生的結果; 第3C圖為依據本發明一實施方式所繪示之本發明siLNA-2裂解大腸直腸癌細胞SW480或HCT116中caspase 3活性的結果; 第4圖為依據本發明一實施方式所繪示之本發明siLNA-2對SW480細胞株和正常直腸細胞(CRL-1790)的影響; 第5A圖為依據本發明一實施方式所繪示之本發明siLNA抑制小鼠體內原位癌生長的結果;以及 與5B圖為依據本發明一實施方式所繪示之本發明siLNA對第5A圖小鼠體重的影響。
根據慣常的作業方式,圖中各種特徵與元件並未依比例繪製,其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外,在不同圖式間,以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。
<110> 國立成功大學 <120> 用以治療癌症之短干擾核糖核酸分子 <130> P2727-1-TW <150> US62/120,355 <151> 2015-02-24 <160> 14 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_正義 <400> 1 uuucuuauca aauauccccu u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_反義 <400> 2 ggggauauuu gauaagaaau u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_正義 <400> 3 aaaaugcugg gauuacgggu u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_反義 <400> 4 cccguaaucc cagcauuuuu u 21 <210> 5 <211> 17 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_正義 <400> 5 aaaaugcugg gauuacg 17 <210> 6 <211> 17 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_反義 <400> 6 cguaauccca gcauuuu 17 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_正義 <400> 7 aguuucuuau caaauauccu u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_反義 <400> 8 ggauauuuga uaagaaacuu u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_正義 <400> 9 cgaaaaugcu gggauuacgu u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_反義 <400> 10 cguaauccca gcauuuucgu u 21 <210> 11 <211> 18 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_正義 <400> 11 aucaaauauc cccgcacu 18 <210> 12 <211> 18 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_反義 <400> 12 agugcgggga uauuugau 18 <210> 13 <211> 18 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_正義 <400> 13 ccgaaaaugc ugggauua 18 <210> 14 <211> 18 <212> RNA <213> 人工序列 <220> <223> siRNA_反義 <400> 14 uaaucccagc auuuucgg 18
Claims (9)
- 一種單離的雙股短干擾性RNA(siRNA)分子,其可透過RNA干擾來抑制Aurora-A基因之mRNA的轉譯,其中(a)每一股該siRNA分子含有17-21個核糖核苷;且(b)該siRNA分子中的一股包含一核糖核酸,其具有與序列編號:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中任一條序列至少約90%的序列相似度。
- 如請求項1所述之siRNA分子,其中該siRNA分子的一股包含序列編號:3、5或11之核糖核酸。
- 如請求項1所述之siRNA分子,其中該siRNA分子中的一股包含至少一個鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)分子。
- 如請求項3所述之siRNA分子,其中該siRNA分子包含10個LNA分子。
- 一種治療癌症之藥學組合物,包含一治療有效量之如請求項1所述之siRNA分子;和一藥學上可接受的載體。
- 如請求項5所述之藥學組合物,其中該siRNA分子的一股包含序列編號:3、5或11之核糖核酸。
- 如請求項6所述之藥學組合物,其中該siRNA分子中的一股包含至少一個LNA分子。
- 如請求項7所述之藥學組合物,其中該siRNA分子包含10個LNA分子。
- 如請求項5所述之藥學組合物,其中該癌症為大腸直腸癌、肝癌、乳癌、或子宮頸癌。
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