JP2022522247A - 生体材料およびそれに関連する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、１つ以上のクリスタリンタンパク質を含む生体適合性組成物、ならびに治療方法および研究方法、例えば外科的方法、徐放性薬物送達、および細胞ベースの方法におけるそのような組成物の使用に関する。【選択図】図３

Description

本発明は、タンパク質性生体材料ならびにそれらの調製および使用のための方法に関する。より具体的には、本発明は、クリスタリンタンパク質を含む生体材料、当該生体材料を調製するための方法、ならびに、外科的方法、細胞ベースの療法および薬物送達などの医学および治療方法、生物医学研究、例えば細胞および組織培養法、および組織工学などを含む広範な分野において当該生体材料を使用する様々な方法に関する。

以下は、本発明を理解するのに役立ち得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であるか、または現在記載されているもしくは特許請求されている発明に関連していること、または具体的もしくは暗黙的に参照されているいずれかの刊行物もしくは文書が先行技術であることを認めるものではない。明細書全体にわたる先行技術のいかなる考察も、そのような先行技術が広く知られているか、または当該分野の一般常識の一部を形成していることを認めるものとして決してみなされるべきではない。

生体適合性材料は、多くの治療方法および科学的方法にとって重要である。例えば、一定の期間にわたって安全に溶解できる縫合糸は、多くの外科的方法に不可欠であるが、インプラントおよび移植可能な組成物（持続的な薬物送達のための移植可能な組成物など）は、有利に生体適合性であり、非炎症性であり、かつ安全である。さらに、そのようなインプラントおよび移植可能な組成物がそれらの機能的寿命にわたってまたはその後に分解するように設計されている場合、理想的には、分解産物自体も同様に生体適合性であり、かつ安全である。

生体適合性は、材料が、例えば対象上または対象内で直接的に使用されるか、あるいは細胞ベースの療法または人工組織の調製などで間接的に使用されるかに関係なく重要である。前者の場合、例えば、生体適合性接着剤は、刺激、瘢痕化および不快感に関連する問題（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を軽減することができる。後者の場合、例えば、組織および臓器工学用の足場は、一般に生分解性合成ポリマーから合成されるが、そのような合成ポリマーの多くは、生体適合性および／もしくは機械的強度が低いか、または生理学的条件下での最適な分解プロファイルよりも低いため、使用に制限がある。

医学的療法および多くの研究方法で使用される材料の生体適合性が望ましいという明確な認識にもかかわらず、多くのそのような療法および方法にとって、生体適合性の選択肢は存在しないか、１つ以上の欠陥を抱えている。例えば、眼科手術との関係では、既存の外科用接着剤は通常、合成であり、瘢痕化および毒性に関連している。

したがって、例えば、外科的用途および薬物送達用途などの多くの治療用途および研究用途のための新たな生体適合性材料を開発する必要がある。

故に、本発明の目的は、クリスタリンタンパク質を含む１つ以上の生体適合性材料を提供すること、または少なくとも既存の生体材料およびそれらに依拠する方法に対する有用な代替物を提供すること、または少なくとも有用な選択を公衆に提供することである。

第１の態様において、本発明は、生体適合性組成物であって、
１つ以上の単離、精製、組換えまたは合成タンパク質であって、
ａ）α－クリスタリン、
ｂ）β－クリスタリン、
ｃ）γ－クリスタリン、
ｄ）ホキ（Ｍａｃｒｕｒｏｎｕｓ ｎｏｖａｅｚｅｌａｎｄｉａｅ）由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
ｅ）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
ｆ）本明細書の表１に特定されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｇ）上記ａ）～ｆ）のうちのいずれか１つからの少なくとも約１０個の連続するアミノ酸を含むか、またはそれらからなるポリペプチド、
ｈ）上記ａ）～ｇ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質、
ｉ）インビボでクリスタリンタンパク質の天然構造を有する上記ａ）～ｈ）のうちのいずれか１つによるタンパク質、
ｊ）上記ａ）～ｉ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせ、を含む群から選択される１つ以上の単離、精製、組換えまたは合成タンパク質と、
任意選択的に、１つ以上の可塑剤と、
任意選択的に、１つ以上の共開始剤と、
１つ以上の架橋剤と、を含む、生体適合性組成物に関する。

別の態様において、本発明は、生体高分子組成物であって、
ａ）α－クリスタリン、
ｂ）β－クリスタリン、
ｃ）γ－クリスタリン、
ｄ）ホキ（Ｍａｃｒｕｒｏｎｕｓ ｎｏｖａｅｚｅｌａｎｄｉａｅ）由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
ｅ）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
ｆ）本明細書の表１に特定されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｇ）上記ａ）～ｆ）のうちのいずれか１つからの少なくとも約１０個の連続するアミノ酸を含むか、またはそれらからなるポリペプチド、
ｈ）上記ａ）～ｇ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質、
ｉ）インビボでクリスタリンタンパク質の天然構造を有する上記ａ）～ｈ）のうちのいずれか１つによるタンパク質、
ｊ）上記ａ）～ｉ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせ、を含む群から選択されるタンパク質と、
任意選択的に、１つ以上の可塑剤と、
任意選択的に、１つ以上の共開始剤と、
１つ以上の架橋剤と、を含み、
当該１つ以上のタンパク質が架橋可能であり、ポリマーを形成する、生体高分子組成物に関する。

様々な実施形態において、１つ以上のタンパク質は、インビボで架橋可能である。

一態様において、本発明は、インビボゲル化組成物であって、
ａ）α－クリスタリン、
ｂ）β－クリスタリン、
ｃ）γ－クリスタリン、
ｄ）ホキ（Ｍａｃｒｕｒｏｎｕｓ ｎｏｖａｅｚｅｌａｎｄｉａｅ）由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
ｅ）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
ｆ）本明細書の表１に特定されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｇ）上記ａ）～ｆ）のうちのいずれか１つからの少なくとも約１０個の連続するアミノ酸を含むか、またはそれらからなるポリペプチド、
ｈ）上記ａ）～ｇ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質、
ｉ）インビボでクリスタリンタンパク質の天然構造を有する上記ａ）～ｈ）のうちのいずれか１つによるタンパク質、
ｊ）上記ａ）～ｉ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせと、
任意選択的に、１つ以上の可塑剤と、
任意選択的に、１つ以上の共開始剤と、
１つ以上の架橋分子と、を含み、
インビボゲル化組成物が、対象の体内またはその上の標的部位で少なくとも部分的に重合および／もしくはゲル化するか、またはインビボゲル化組成物の架橋が、対象の体内またはその上の標的部位に存在するときに起こるか、または開始される、インビボゲル化組成物に関する。

したがって、一実施形態において、生体適合性組成物は、対象の体内もしくはその上の標的部位で少なくとも部分的に重合および／もしくはゲル化するように配合されたインビボゲル化組成物であるか、または生体適合性組成物は、インビボゲル化組成物の架橋が対象の体内もしくはその上の標的部位に存在するときに起こるか、もしくは開始されるように配合されたインビボゲル化組成物である。

本発明の別の態様は、架橋生体高分子組成物を製造するための方法であって、
組成物であって、
ａ）α－クリスタリン、
ｂ）β－クリスタリン、
ｃ）γ－クリスタリン、
ｄ）ホキ（Ｍａｃｒｕｒｏｎｕｓ ｎｏｖａｅｚｅｌａｎｄｉａｅ）由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
ｅ）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
ｆ）本明細書の表１に特定されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｇ）上記ａ）～ｆ）のうちのいずれか１つからの少なくとも約１０個の連続するアミノ酸を含むか、またはそれらからなるポリペプチド、
ｈ）上記ａ）～ｇ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質、
ｉ）インビボでクリスタリンタンパク質の天然構造を有する上記ａ）～ｈ）のうちのいずれか１つによるタンパク質、
ｊ）上記ａ）～ｉ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせと、
ｋ）任意選択的に、１つ以上の可塑剤と、
ｌ）任意選択的に、１つ以上の共開始剤と、を含む組成物を提供することと、
当該組成物を１つ以上の架橋分子と接触させることと、
架橋を開始し、それにより、架橋された生体高分子組成物を形成することと、を含む、方法に関する。

本発明のさらなる態様は、１つ以上の精製クリスタリンタンパク質を含む組成物を製造するための方法であって、
ｉ．脊椎動物の眼組織を提供することと、
ｉｉ．天然のクリスタリンタンパク質構造の維持に好適な条件下で、抽出緩衝液の存在下で組織を均質化することと、
ｉｉｉ．液体ホモジネートを、例えば遠心分離または濾過によって残留固体から分離して、クリスタリンタンパク質含有溶液を提供することと、
ｉｖ．任意選択的に、クリスタリンタンパク質を少なくとも部分的にさらに精製することと、
ｖ．任意選択的に、クリスタリンタンパク質含有溶液を透析して、抽出緩衝液を除去することと、
ｖｉ．任意選択的に、クリスタリンタンパク質含有溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を提供することと、
ｖｉｉ．任意選択的に、クリスタリンタンパク質含有溶液または凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を、例えば、０℃以下で保存することと、を含み、
精製クリスタリンタンパク質の実質的な割合がそれらの天然構造を保持している、方法に関する。

したがって、一実施形態において、１つ以上の精製クリスタリンタンパク質を含む組成物を製造するための方法は、
ｉ．脊椎動物の眼組織を提供することと、
ｉｉ．生理学的ｐＨを有する抽出緩衝液の存在下で組織を均質化することであって、ホモジネートが約１５℃未満の温度で維持される、均質化することと、
ｉｉｉ．液体ホモジネートを、例えば遠心分離または濾過によって残留固体から分離して、クリスタリンタンパク質含有溶液を提供することと、
ｉｖ．任意選択的に、クリスタリンタンパク質を少なくとも部分的にさらに精製することと、
ｖ．任意選択的に、クリスタリンタンパク質含有溶液を透析して、抽出緩衝液を除去することと、
ｖｉ．任意選択的に、クリスタリンタンパク質含有溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を提供することと、
ｖｉｉ．任意選択的に、クリスタリンタンパク質含有溶液または凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を、例えば、０℃以下で保存することと、を含み、
精製クリスタリンタンパク質の実質的な割合がそれらの天然構造を保持している、方法に関する。

一実施形態において、天然のクリスタリンタンパク質構造の維持に好適な条件は、
ａ．ホモジネートを７以上のｐＨの抽出緩衝液中で維持すること、または
ｂ．ホモジネートを生理学的ｐＨで維持すること、または
ｃ．ホモジネートを約１５℃未満の温度で維持すること、
ｄ．上記ａ）とｃ）の両方、または
ｅ．上記ｂ）とｃ）の両方、を含む。

一実施形態において、天然のクリスタリンタンパク質構造の維持に好適な条件は、
ａ．ホモジネートを７以上のｐＨの抽出緩衝液中で維持すること、または
ｂ．ホモジネートを生理学的ｐＨで維持すること、または
ｃ．ホモジネートを約１５℃未満の温度で維持すること、
ｄ．上記ａ）とｃ）の両方、または
ｅ．上記ｂ）とｃ）の両方、を含み、
方法は、
液体ホモジネートを、遠心分離または濾過によって任意の残留固体から分離して、クリスタリンタンパク質含有溶液を提供することと、
クリスタリンタンパク質含有溶液を透析して、抽出緩衝液を除去することと、
任意選択的に、クリスタリンタンパク質含有溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を提供することと、
クリスタリンタンパク質含有溶液または凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を、天然のクリスタリンタンパク質構造の維持に適切な条件下、例えば、約４℃以下で使用するまで維持することと、を含み、
精製クリスタリンタンパク質の実質的な割合は、それらの天然構造を保持している。

したがって、一実施形態において、１つ以上の精製クリスタリンタンパク質を含む組成物を製造するための方法は、
ｉ．脊椎動物の眼組織を提供することと、
ｉｉ．７以上のｐＨの抽出緩衝液の存在下で組織を均質化することであって、ホモジネートが約１５℃未満の温度で維持される、均質化することと、
ｉｉｉ．液体ホモジネートを、遠心分離または濾過によって任意の残留固体から分離して、クリスタリンタンパク質含有溶液を提供することと、
ｉｖ．クリスタリンタンパク質含有溶液を透析して、抽出緩衝液を除去することと、
ｖ．任意選択的に、クリスタリンタンパク質含有溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を提供することと、
ｖｉ．クリスタリンタンパク質含有溶液または凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を、約４℃以下で使用するまで維持することと、を含み、
精製クリスタリンタンパク質の実質的な割合は、それらの天然構造を保持している。

一実施形態において、脊椎動物の眼組織は水晶体組織である。

一実施形態において、脊椎動物の眼組織は水晶体超音波乳化吸引術物質である。

一実施形態において、脊椎動物の眼組織は、魚、例えば深海魚由来の眼組織である。一実施形態において、脊椎動物の眼組織は、ホキ眼の水晶体組織などのホキ由来の眼組織である。

一実施形態において、脊椎動物の眼組織は、ヒト、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、またはシカの眼組織などの哺乳動物由来の眼組織である。

一実施形態において、脊椎動物の眼組織は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓの眼の水晶体組織などのＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来の眼組織である。

一実施形態において、脊椎動物の眼組織は、水晶体超音波乳化吸引術からのものである。

一実施形態において、抽出緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＮａＣｌ、アジ化ナトリウムのうちの１つ以上、またはそれらのうちの２つ以上の任意の組み合わせを含む。

一実施形態において、抽出緩衝液は、クリスタリンタンパク質が得られる生物の生理学的ｐＨなどの生理学的ｐＨにある。一実施形態において、抽出緩衝液のｐＨは、７より大きい。例えば、抽出緩衝液のｐＨは、約７～約９の範囲にある。

一実施形態において、抽出緩衝液は、眼組織１グラムあたり少なくとも約２ｍＬの緩衝液の比率で存在する。

一実施形態において、均質化は、１つ以上のクリスタリンアイソフォームの破壊を回避もしくは最小化するため、および／またはタンパク質凝集を回避もしくは最小化するための条件下で実行される。例えば、クリスタリンナノフィブリルの形成を回避もしくは最小化するために、または天然に存在しないタンパク質配座異性体の形成を回避もしくは最小化するために、破壊および／または凝集が可能な限り回避される。

一例において、均質化は、生理学的ｐＨで、例えば、生理学的ｐＨを有する緩衝液中で実行される。一例において、均質化は、約７を超えるｐＨで実行される。一例において、均質化は、低せん断条件下で実行される。一例において、均質化は、例えば、アルギニンなどの１つ以上の安定化添加剤の存在下で実行される。

一例において、均質化は、低温で実行される。一実施形態において、均質化は、約０℃～約５℃の温度で起こる。一実施形態において、均質化は、均質化が実行されない休止相を複数回挟んでいる、例えば、ホモジネートが一定期間氷上に置かれる冷却相を複数回挟んでいる。

一実施形態において、透析は、水に対して、例えば、５℃未満で、例えば、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水などの精製水に対して実行される。

一実施形態において、精製クリスタリンタンパク質は、安定剤の存在下で保存される。例えば、精製クリスタリンタンパク質は、アルギニン、グリシン、またはそれらの組み合わせの存在下で保存される。

様々な実施形態において、それらの天然構造を保持する精製クリスタリンタンパク質の実質的な割合は、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、または約９９％を超える。様々な実施形態において、天然構造の保持は、円二色性、ＮＭＲ、または天然ＰＡＧＥを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で周知の方法によって決定される。

一実施形態において、１つ以上の精製クリスタリンタンパク質を含む組成物を製造するための方法は、本質的に、本明細書の実施例に記載されている通りである。

さらなる態様において、本発明は、組織閉鎖を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
任意選択的に、裂傷、病変、切開または創傷を閉鎖するために力を加えることと、
裂傷、病変、切開もしくは創傷、または当該裂傷、病変、切開もしくは創傷の部位を、本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質含有組成物と接触させることであって、任意選択的に、クリスタリン含有組成物が少なくとも部分的に架橋されている、接触させることと、
任意選択的に、裂傷、病変、切開または創傷を閉鎖するために力を加えることと、
架橋を開始するおよび／または維持することと、
架橋が起こるのに十分な時間、裂傷、病変、切開または創傷の閉鎖を維持することと、を含み、
クリスタリンタンパク質の適用および／または架橋が接着剤組成物を形成する、方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、組織閉鎖を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
任意選択的に、裂傷、病変、切開または創傷を閉鎖するために力を加えることと、
裂傷、病変、切開もしくは創傷、または当該裂傷、病変、切開もしくは創傷の部位を、本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質含有組成物と接触させることと、
任意選択的に、裂傷、病変、切開または創傷を閉鎖するために力を加えることと、
架橋を開始することと、
架橋が起こるのに十分な時間、裂傷、病変、切開または創傷の閉鎖を維持することと、を含み、
クリスタリンタンパク質の架橋が接着剤組成物を形成する、方法に関する。

一実施形態において、組織閉鎖の方法は、外科的切開を閉鎖する方法である。

一実施形態において、組織閉鎖の方法は、無縫合閉鎖の方法である。例えば、無縫合閉鎖は、無縫合皮膚閉鎖、無縫合創傷閉鎖、または無縫合手術切開閉鎖である。

一実施形態において、外科的手術は、眼科手術である。一例において、眼科手術は、白内障手術、結膜移植片、平面硝子体切除術を含む硝子体切除術、屈折水晶体交換、水晶体移植、または水晶体交換手術である。別の例において、眼科手術は、網膜剥離手術であり、これには、網膜復位術または強膜内陥術を組み込んだ網膜手術、黄斑円孔手術、結膜閉鎖、緑内障手術、小疱漏出手術、線維柱切除、眼瞼縫合、羊膜移植、角膜穿孔手術、翼状片切除術を含む翼状片手術、後嚢眼内レンズ移植、上皮内殖手術、表層角膜移植、深層層状角膜移植を含む角膜移植、両側斜視手術を含む斜視手術、眼瞼植皮手術、または粘膜移植手術が含まれる。

一実施形態において、組成物は、前房カニューレ（Ｒｙｃｒｏｆｔカニューレ）などの眼科手術装置を介して適用される。

様々な実施形態において、裂傷、病変、切開または創傷の閉鎖の維持は、架橋が起こるのに十分な時間であり、包帯、縫合糸、メッシュなどの１つ以上の医療補助具の適用によるか、または裂傷、病変、切開もしくは創傷を閉鎖した状態でクランプするもしくは保持するなどの（通常は一時的な）物理的力による。

様々な実施形態において、裂傷、病変、切開または創傷の閉鎖の維持は、約６０％を超える架橋が起こる、例えば、約７０％を超える架橋が起こる、約８０％を超える架橋が起こる、約９０％を超える架橋が起こる、または約９５％を超える架橋が起こるのに十分な時間である。

一実施形態において、組成物中に存在する架橋剤は光架橋剤であり、架橋の開始は、光への曝露によるものである。例えば、一実施形態において、架橋剤は、１－ヒドロキシシクロヘキシル－１－フェニルケトン（例えば、Ｉｒｇａｃｕｒｅ １８４）、２，２ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（例えば、Ｉｒｇａｃｕｒｅ ６５１）、リボフラビン、またはリチウムフェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィネート（ＬＡＰ）などであるがこれらに限定されないＵＶ架橋剤であり、開始はＵＶ光（３６５ｎｍ）への曝露によるものである。別の実施形態において、架橋剤は、エオシンＹ（ＥＹ）およびトリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）を含む可視光活性化系などの可視光架橋剤であり、開始は、可視光（５３０ｎｍ）への曝露による。

一実施形態において、本発明は、組織閉鎖を必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象が眼科手術を受けているか、または受けたものであり、当該方法が、
外科的切開または当該外科的切開の部位を、本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質含有組成物と接触させることであって、任意選択的に、クリスタリン含有組成物が少なくとも部分的に架橋されている、接触させることと、
任意選択的に、切開を閉鎖するために力を加えることと、
架橋を開始するおよび／または維持することと、
架橋が起こるのに十分な時間、外科的切開の閉鎖を維持することと、を含み、
クリスタリンタンパク質の適用および／または架橋が、外科的切開の閉鎖を維持することができる接着剤組成物を形成する、方法に関する。

別の実施形態において、本発明は、組織閉鎖を必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象が眼科手術を受けているか、または受けたものであり、当該方法が、
外科的切開または当該外科的切開の部位を、本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質含有組成物と接触させることと、
任意選択的に、切開を閉鎖するために力を加えることと、
架橋を開始することと、
架橋が起こるのに十分な時間、外科的切開の閉鎖を維持することと、を含み、
クリスタリンタンパク質の架橋が、外科的切開の閉鎖を維持することができる接着剤組成物を形成する、方法に関する。

一実施形態において、接着剤組成物は、縫合糸または他の閉鎖補助具がない場合に、外科的切開の閉鎖を維持することができる。

一実施形態において、接着剤組成物は、対象の眼の屈折率と同等の屈折率を有する。一実施形態において、接着剤組成物は、可視スペクトル全体にわたって高い透過率を有する。

さらなる態様において、本発明は、眼の損傷または眼の切開の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
ｉ．眼の損傷または切開を本明細書に記載されるクリスタリン含有組成物と接触させるステップであって、任意選択的に、クリスタリン含有組成物が少なくとも部分的に架橋されている、ステップと、
ｉｉ．架橋を開始するおよび／または維持するステップと、を含み、
架橋が生体接着性ポリマー組成物を形成する、方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、眼の損傷または眼の切開の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
ｉ．眼の損傷または切開を本明細書に記載される組成物と接触させるステップと、
ｉｉ．架橋を開始するステップと、を含み、
架橋が生体接着性ポリマー組成物を形成する、方法に関する。

別の態様において、本発明は、１つ以上の活性剤の送達を必要とする対象に対してそれを行う方法であって、
本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質含有組成物を提供することであって、組成物が１つ以上の活性剤をさらに含む、提供することと、
対象を組成物と接触させることと、
任意選択的に、組成物の架橋を開始することと、
それにより、活性剤の送達を必要とする対象に対してそれを行うことと、を含む、方法に関する。

特定の実施形態において、対象を組成物と接触させることは、例えば、外科的投与を含む、対象の体内またはその上の標的部位に組成物を投与することを含む。

さらに別の態様において、本発明は、１つ以上の細胞または組織を培養する方法であって、
培養すべき１つ以上の細胞を提供することと、
１つ以上の細胞を、本明細書に記載される組成物を含む基質と接触させることと、
１つ以上の細胞を基質と接触させた状態で、ならびに任意選択的に、継続的な生存、成長、複製および／または分化に好適な条件下で一定期間、追加の成長培地と接触させた状態で、維持することと、を含む、方法に関する。様々な実施形態において、本明細書に記載される組成物は、γ－クリスタリンを含む。一実施形態において、γ－クリスタリンは、組成物中に存在するクリスタリンタンパク質の少なくとも約１０％ｗ／ｗを構成する。

一実施形態において、１つ以上の細胞は、１つ以上の複製コンピテントセルを含む。

一実施形態において、１つ以上の細胞は、１つ以上の幹細胞である。

一実施形態において、基質は、本明細書に記載される組成物から形成された薄膜フィルム、例えば、それと接触させた状態で細胞が別の場所へ移入することを可能にするのに十分な機械的強度および／または弾性の薄膜フィルムである。一例において、場所は、第２の培養容器である。別の例において、場所は、例えば、手術部位などの対象の体内またはその上にある。例えば、１つ以上の細胞は、１つ以上の眼細胞または眼に由来する１つ以上の幹細胞であり、外科的手術部位は眼の中またはその上にある。一例において、１つ以上の細胞は、１つ以上の輪部幹細胞である。別の例において、１つ以上の細胞は、１つ以上の間質幹細胞である。さらに別の例において、１つ以上の細胞は、１つ以上の網膜色素上皮細胞である。別の例において、１つ以上の細胞は、１つ以上の全能性幹細胞、１つ以上の多能性幹細胞、または１つ以上の複能性幹細胞である。

一実施形態において、基質は、本明細書に記載される組成物から形成されたゲルである。例えば、基質は、３Ｄ細胞培養物の形成を可能にするのに十分な厚さの少なくとも１つの領域を有するゲルである。

したがって、一実施形態において、１つ以上の細胞または組織を培養する方法は、脊椎動物の眼に由来する１つ以上の細胞を培養する方法であって、
培養すべき１つ以上の脊椎動物の眼細胞を提供することと、
本明細書に記載される組成物を含む基質と１つ以上の細胞を接触させることであって、基質が光学的に透明である、接触させることと、
１つ以上の細胞を基質と接触させた状態で、ならびに任意選択的に、継続的な生存、成長、複製および／または分化に好適な条件下で一定期間、追加の成長培地と接触させた状態で、維持することと、を含み、
基質が、対象の眼への移入および／または外科的適用に関連する取り扱いを助けるのに十分な機械的耐久性のものである、方法である。

さらに別の態様において、本発明は、治療で使用するための、例えば、本明細書に記載される治療方法のうちのいずれか１つで使用するための薬剤の調製における、本明細書に記載の組成物の使用に関する。一実施形態において、薬剤は、本明細書に記載される外科的方法のうちのいずれか１つを含む眼科手術などの外科的手術で使用するためのものである。インビトロステップを使用する治療方法もしくは研究方法を含む、インビトロでの使用のための薬剤または組成物の調製における、本明細書に記載される組成物の使用も企図される。

さらなる態様において、本発明は、治療で使用するための、例えば、本明細書に記載される治療方法のうちのいずれか１つで使用するための、本明細書に記載の組成物に関する。一実施形態において、当該使用は、本明細書に記載される外科的方法のうちのいずれか１つを含む眼科手術などの外科的手術である。インビトロ治療方法もしくは研究方法、またはインビトロステップを使用する治療方法もしくは研究方法での使用のための、本明細書に記載される組成物も企図される。

さらなる態様において、本発明は、幹細胞の欠損に関連する眼障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、当該方法が治療用組成物と眼を接触させることを含み、当該治療用組成物が、
ｉ．任意選択的に本明細書に記載される培養方法に従って培養された、幹細胞と、
任意選択的に、
ｉｉ．本明細書に記載される生体適合性組成物または生体高分子組成物と、を含む、方法に関する。

一実施形態において、眼障害は、角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）または関連障害を含む。別の実施形態において、眼障害は、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）または関連障害などの黄斑変性を含む。さらに別の実施形態において、眼障害は、遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）または関連障害を含む。

さらなる実施形態において、治療用組成物は、少なくとも１つの輪部幹細胞を含む。別の実施形態において、治療用組成物は、少なくとも１つの間質幹細胞を含む。別の実施形態において、治療用組成物は、少なくとも１つの網膜色素上皮細胞を含む。別の実施形態において、治療用組成物は、少なくとも１つの全能性幹細胞、少なくとも１つの多能性幹細胞、または少なくとも１つの複能性幹細胞のうちの１つ以上を含む。

さらなる実施形態において、治療用組成物は、本明細書に記載される組成物から形成された薄膜フィルムを含む。

一実施形態において、１つ以上の幹細胞は、本明細書に記載される生体適合性組成物または生体高分子組成物の存在下で、１つ以上の細胞の組成物への接着を可能にするのに十分な期間培養される。

例えば、１つ以上の幹細胞は、本明細書に記載される生体適合性組成物または生体高分子組成物の存在下で、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、または少なくとも約２８日間培養される。

一実施形態において、１つ以上の幹細胞は、本明細書に記載される生体適合性組成物または生体高分子組成物の存在下における、組成物上もしくは組成物内での細胞のうちの１つ以上の伸長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を可能にするのに十分な期間培養される。例えば、細胞は、細胞数の増加を可能にするのに好適な条件下で培養される。

特に企図される実施形態において、細胞は、細胞数の増加、細胞伸長、接着、細胞密度の増加、および／または全能性、多能性もしくは複能性幹細胞の表現型の維持のうちの１つ以上を可能にするのに好適な条件下かつ十分な期間培養される。

一実施形態において、治療用組成物と眼を接触させることは、眼表面への外科的移植を含む。

一実施形態において、幹細胞のうちの１つ以上の眼への移入を可能にするのに十分な期間、眼を治療用組成物と接触させる。例えば、接触は、少なくとも２４時間、例えば、４８時間、７２時間、または９６時間維持される。他の例において、接触は、５日以上、例えば、６日、７日、８日、９日、１０日、または１０日を超える間維持される。通常、可能な場合は、接触は７日以上の間維持される。

様々な実施形態において、細胞は、組成物１ｃｍ^２あたり約１×１０^２～約１×１０^７個の細胞を提供するのに十分な量で、本明細書に記載される生体適合性組成物または生体高分子組成物の存在下で培養される。例えば、細胞は、組成物１ｃｍ^２あたり約１×１０^３～約１×１０^６個の細胞を提供するのに十分な量で培養される。別の例において、細胞は、１ｃｍ^２あたり約１×１０^４～約１×１０^６個の細胞、または１ｃｍ^２あたり約５×１０^４～約１×１０^６個の細胞、または１ｃｍ^２あたり約５×１０^４～約５×１０^５個の細胞、または１ｃｍ^２あたり約１×１０^５～約５×１０^５個の細胞を提供するのに十分な量で培養される。

一実施形態において、１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^２個の細胞を含む治療用組成物と眼を接触させる。例えば、組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^３個の細胞、例えば、組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^４個の細胞、組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^５個の細胞、組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^６個の細胞、または組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^７個の細胞を含む治療用組成物と眼を接触させる。別の例において、組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^３個の細胞～１ｃｍ^２あたり約１×１０^６個の細胞を含む治療用組成物と眼を接触させる。別の例において、細胞は、１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^４～約１×１０^６個の細胞、または１ｃｍ^２あたり約５×１０^４～約１×１０^６個の細胞、または１ｃｍ^２あたり約５×１０^４～約５×１０^５個の細胞、または１ｃｍ^２あたり約１×１０^５～約５×１０^５個の細胞を含む治療用組成物と眼を接触させる。

さらなる態様において、本発明は、眼障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
本明細書に記載される生体適合性組成物を提供することであって、生体適合性組成物が１つ以上の活性剤を含む、提供することと、
生体適合性組成物を対象に投与して、１つ以上の活性剤の対象への移入を可能にすることと、を含む、方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、眼障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
本明細書に記載される生体適合性組成物を提供することであって、生体適合性組成物が１つ以上の幹細胞を含む、提供することと、
生体適合性組成物を対象に投与して、幹細胞のうちの１つ以上の対象への移入を可能にすることと、を含む、方法に関する。

一実施形態において、生体適合性組成物は、対象の眼に投与される。例えば、生体適合性組成物は、例えば、本明細書に記載される外科的方法のうちの１つによって、対象の眼に外科的に投与される。

一実施形態において、眼障害は、１つ以上の幹細胞などの１つ以上の細胞の欠損に関連している。

一実施形態において、眼障害は、角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）または関連障害を含む。別の実施形態において、眼障害は、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）または関連障害などの黄斑変性を含む。さらに別の実施形態において、眼障害は、遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）または関連障害を含む。

さらなる実施形態において、治療用組成物は、少なくとも１つの輪部幹細胞を含む。別の実施形態において、治療用組成物は、少なくとも１つの間質幹細胞を含む。別の実施形態において、治療用組成物は、少なくとも１つの網膜色素上皮細胞を含む。別の実施形態において、治療用組成物は、少なくとも１つの全能性幹細胞、少なくとも１つの多能性幹細胞、または少なくとも１つの複能性幹細胞のうちの１つ以上を含む。

さらなる実施形態において、治療用組成物は、本明細書に記載される組成物から形成された薄膜フィルムを含む。

様々な実施形態において、生体適合性組成物は、対象への投与時に、約１×１０^２～約１×１０^８個の細胞を含む。例えば、約１×１０^２～約１×１０^８個の細胞を対象の眼に提供するのに十分な生体適合性組成物が投与される。特定の実施形態において、生体適合性組成物は、組成物１ｃｍ^２あたり約１×１０^２個の細胞を提供するために投与される。例えば、生体適合性組成物は、組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^３個の細胞、例えば、組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^４個の細胞、組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^５個の細胞、組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^６個の細胞、または組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^７個の細胞を提供するために投与される。別の例において、生体適合性組成物は、組成物１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^３個の細胞～１ｃｍ^２あたり約１×１０^６個の細胞を提供するために投与される。別の例において、生体適合性組成物は、１ｃｍ^２あたり少なくとも約１×１０^４～約１×１０^６個の細胞、または１ｃｍ^２あたり約５×１０^４～約１×１０^６個の細胞、または１ｃｍ^２あたり約５×１０^４～約５×１０^５個の細胞、または１ｃｍ^２あたり約１×１０^５～約５×１０^５個の細胞を提供するために投与される。

一実施形態において、投与は眼表面へである。一実施形態において、生体適合性組成物は、本明細書に記載される接着剤組成物であり、眼表面へ十分に接着して、細胞のうちの１つ以上の移入を可能にするのに十分な期間、眼表面へ接着された状態を保つ。一例において、組成物の投与は、いかなる追加の粘着剤または接着剤の塗布も伴わない。例えば、組成物の投与は、縫合を伴わない。

したがって、一実施形態において、眼障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法は、
本明細書に記載される生体適合性組成物を提供することであって、生体適合性組成物が、１つ以上の輪部幹細胞、１つ以上の間質幹細胞、１つ以上の網膜色素上皮細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、提供することと、
生体適合性組成物を対象の眼に投与して、幹細胞のうちの１つ以上の対象への移入を可能にすることと、を含む。

したがって、さらなる実施形態において、眼障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法は、
本明細書に記載される生体適合性組成物を提供することであって、生体適合性組成物が、１つ以上の全能性幹細胞、１つ以上の多能性幹細胞、１つ以上の複能性幹細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、提供することと、
生体適合性組成物を対象の眼に投与して、幹細胞のうちの１つ以上の対象への移入を可能にすることと、を含む。

本明細書に記載される実施形態のうちのいずれも、本明細書に提示される態様のうちのいずれかに関連し得る。

様々な実施形態において、組成物は、接着剤組成物、ゲル組成物、または薄膜フィルム組成物である。

一例において、接着剤組成物は、外科用接着剤である。

一例において、ゲル組成物は、外科的使用および／または薬物送達のためのコンタクトレンズを含むコンタクトレンズであるか、またはそれを含む。

一例において、ゲル組成物は、細胞接着、培養もしくは成長のためのものであり、これには、２Ｄもしくは３Ｄ細胞培養および／または組織成長もしくは組織工学のための基質としてのものが含まれる。

一例において、薄膜フィルム組成物は、細胞接着、培養もしくは成長のための基質、または細胞輸送もしくは送達のための基質である。

別の例において、薄膜フィルム組成物は包装用である。

様々な実施形態において、１つ以上のクリスタリンタンパク質は、脊椎動物の眼組織から単離および／または精製されたクリスタリンタンパク質である。

一実施形態において、１つ以上のクリスタリンタンパク質は、組換えクリスタリンタンパク質である。

様々な実施形態において、１つ以上のクリスタリンタンパク質は、α－クリスタリン、β－クリスタリン、γ－クリスタリン、およびそれらの任意の２つ以上の組み合わせを含む群から選択されるクリスタリンタンパク質である。一例において、α－クリスタリンタンパク質は、αＡ－クリスタリンである。一例において、α－クリスタリンタンパク質は、αＢ－クリスタリンである。

様々な実施形態において、１つ以上のクリスタリンタンパク質の天然の二次構造が維持されているか、１つ以上のクリスタリンタンパク質の天然の三次構造が維持されているか、および／または１つ以上のクリスタリンタンパク質の天然の四次構造が維持されている。例えば、１つ以上のクリスタリンタンパク質は、ナノフィブリルまたは他の破壊された構造形態を実質的に含まない。

様々な実施形態において、組成物中に存在するクリスタリンタンパク質のうちの少なくとも一部は、天然にグリコシル化されている、すなわち、クリスタリンタンパク質が由来する、単離される、または精製される生物に存在する場合、同じクリスタリンのものに匹敵するグリコシル化パターンおよび程度を有する。

様々な実施形態において、例えば本明細書に記載される薄膜フィルム組成物中に存在する場合、可塑剤は、多価アルコール、酸のジエステルまたはトリエステル、アルコールのジエステルまたはトリエステル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびそれらのうちの任意の２つ以上の組み合わせを含む群から選択される。

一実施形態において、多価アルコールは、グリセロール、プロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ソルビトール、およびマルチトールを含む群から選択される。

一例において、可塑剤は、グリセロール、ソルビトール、またはそれらの組み合わせである。

一実施形態において、酸のジエステルまたはトリエステルは、クエン酸トリエチル（ＴＥＣ）、クエン酸トリブチル（ＴＢＣ）、クエン酸アセチルトリエチル（ＡＴＥＣ）、セバシン酸ジブチル（ＤＢＳ）、フタル酸ジエチル（ＤＥＰ）、およびフタル酸ジブチル（ＤＢＰ）を含む群から選択される。

一実施形態において、アルコールのジエステルまたはトリエステルは、トリアセチン（ＴＡ）、植物油、分別されたココナッツ油、およびアセチル化モノグリセリドを含む群から選択される。

一実施形態において、組成物は、約０．５％ｗ／ｗ～約３％ｗ／ｗの可塑剤を含む。例えば、組成物は、約０．５％ｗ／ｗ～約２．５％ｗ／ｗの可塑剤、約１％ｗ／ｗ～約２．５％ｗ／ｗの可塑剤、約１．５％ｗ／ｗ～約２．５％ｗの可塑剤、または約２％ｗ／ｗの可塑剤を含む。

様々な実施形態において、例えば本明細書に記載される薄膜フィルム組成物中に存在する場合、共開始剤は、ＴＥＡＯＨ、Ｌ－アルギニンなどの生体適合性第三級アミンベースの共開始剤である。

一実施形態において、組成物は、約０．５％ｗ／ｗ～約５％ｗ／ｗの共開始剤を含む。例えば、組成物は、約０．５％ｗ／ｗ～約４％ｗ／ｗの共開始剤、約１％ｗ／ｗ～約４％ｗ／ｗの共開始剤、約１．５％ｗ／ｗ～約３％ｗ／ｗの共開始剤、または約２％ｗ／ｗの共開始剤を含む。

様々な実施形態において、架橋剤は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）、グルタルアルデヒド、リボフラビン、リボフラビン－５－モノホスフェート、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、およびそれらのうちの２つ以上の任意の組み合わせを含む群から選択される。

一実施形態において、架橋剤は光架橋剤である。例えば、光架橋剤は、２－ヒドロキシ－１－［４－（２－ヒドロキシエトキシ）フェニル］－２－メチル－１プロパノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９）、１－ヒドロキシシクロヘキシル－１－フェニルケトン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）１８４）、２，２ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）６５１）、リボフラビン、リチウムフェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィネート（ＬＡＰ）、エオシンＹ（ＥＹ）およびトリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）、ゲネピン（ｇｅｎｅｐｉｎ）、ＮＨＳ－ＥＤＣ、ＮＨＳ－ＰＥＧを含む修飾ＰＥＧ、ならびにそれらのうちの２つ以上の任意の組み合わせを含む群から選択される。

一実施形態において、組成物は、約０．１％ｗ／ｗ～約１．５％ｗ／ｗの架橋剤、例えば、リボフラビンまたはリボフラビン－５－モノホスフェートを含む。例えば、組成物は、約０．１％ｗ／ｗ～約１％ｗ／ｗの架橋剤、約０．１％ｗ／ｗ～約０．８％ｗ／ｗの架橋剤、約０．１％ｗ／ｗ～約０．６％ｗの架橋剤、約０．１％ｗ／ｗ～約０．５％ｗ／ｗの架橋剤、約０．１％ｗ／ｗ～約０．４％ｗ／ｗの架橋剤、約０．１％ｗ／ｗ～約０．３％ｗ／ｗの架橋剤、約０．１％ｗ／ｗ～約０．２％ｗ／ｗの架橋剤、または約０．２％ｗ／ｗの架橋剤を含む。

一実施形態において、組成物は、約０．５％ｗ／ｗ～約３％ｗ／ｗの架橋剤、例えば、ＰＥＧＤＥまたはグルタルアルデヒドを含む。例えば、組成物は、約０．５％ｗ／ｗ～約２．５％ｗ／ｗの架橋剤、約１％ｗ／ｗ～約３％ｗ／ｗの架橋剤、約１％ｗ／ｗ～約２．５％ｗの架橋剤、約１％ｗ／ｗ～約３％ｗ／ｗの架橋剤、約１．５％ｗ／ｗ～約２．５％ｗ／ｗの架橋剤、または約２．５％ｗ／ｗの架橋剤を含む。

別の実施形態において、組成物は、約３％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗの架橋剤、例えば、ＰＥＧＤＡを含む。例えば、組成物は、約５％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗの架橋剤、約５％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗの架橋剤、約１０％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗの架橋剤、約１０％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗの架橋剤、約１５％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗの架橋剤、約１５％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗの架橋剤、約２０％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗの架橋剤、または約２０％ｗ／ｗの架橋剤を含む。

様々な実施形態において、組成物は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質を含む。例えば、組成物は、約３０ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約３０ｍｇ／ｍＬ～約１４０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約３０ｍｇ／ｍＬ～約１３０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約３０ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約３０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約３０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約３０ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約３０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約３０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、または約３０ｍｇ／ｍＬ～約６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質を含む。

様々な実施形態において、例えば接着剤組成物に関する実施形態において、組成物は、約３０ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、例えば、約３０ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質を含む。約３０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、または約６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質を含む。他の実施形態において、例えば接着剤組成物に関する実施形態において、組成物は、約４０ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、例えば、約５０ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約６０ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約７０ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約８０ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約８０ｍｇ／ｍＬ～約１４０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約８０ｍｇ／ｍＬ～約１３０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約８０ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約９０ｍｇ／ｍＬ～約１３０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約９０ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１００ｍｇ／ｍＬ～約１３０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１００ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１１０ｍｇ／ｍＬ～約１３０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１１０ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、または約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質を含む。

様々な実施形態において、例えば、ゲル組成物に関する実施形態において、組成物は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、例えば、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１０ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約２０ｍｇ／ｍＬ約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約３０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、または約４０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質を含む。

様々な実施形態において、例えば、薄膜フィルム組成物を含むフィルム組成物に関する実施形態において、組成物は、約５０ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、例えば、約５０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０ｍｇ／ｍＬ～約６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、または約６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質を含む。

薄膜フィルム組成物などであるがこれらに限定されない特に企図される特定の実施形態において、組成物は、約１００ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５ｍＭ～約１０ｍＭのグルタルアルデヒド、および約１．５％ｗ／ｗ～約２．５％ｗ／ｗのグリセロールを含む。例えば、組成物は、約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５ｍＭ～約１０ｍＭのグルタルアルデヒド、および約２％ｗ／ｗのグリセロールを含む。

特に企図される１つの例において、組成物は、約６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリン、約２％（ｖ／ｖ）のグリセロール、および約２．５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧＤＥを含む薄膜フィルム組成物である。一例において、当該薄膜フィルム組成物は、包装用途での使用に特に適している。

特に企図される別の例において、組成物は、約６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリン、約２％（ｖ／ｖ）のグリセロール、および約５ｍＭのＧＡを含む薄膜フィルム組成物である。一例において、当該薄膜フィルム組成物は、細胞培養用途での使用に特に適している。

特に企図される別の例において、組成物は、約６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリン、約２％（ｖ／ｖ）のグリセロール、約０．２％（ｗ／ｗのクリスタリン）のリボフラビン－５－ホスフェート、および任意選択的に約０．４％（クリスタリンのｗ／ｗ）のＬ－アルギニンを含む薄膜フィルム組成物である。

接着剤組成物などであるがこれらに限定されない特に企図される特定の実施形態において、組成物は、約１００ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１０％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗのＰＥＧＤＡ、および約０．２％ｗ／ｗ～約１．０％ｗ／ｗの光開始剤（Ｉｇｒａｃｕｒｅなど（例えば、Ｉｇｒａｃｕｒｅ ２９５９））を含む。例えば、組成物は、約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１５％ｗ／ｗのＰＥＧＤＡ、および約０．５％ｗ／ｗのＩｇｒａｃｕｒｅ ２９５９を含む。

特に企図された特定の実施形態において、組成物は、約５０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１０％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗのＰＥＧＤＡ、および約０．２％ｗ／ｗ～約１．０％ｗ／ｗの光開始剤（Ｉｇｒａｃｕｒｅなど（例えば、Ｉｇｒａｃｕｒｅ ２９５９））を含む。例えば、組成物は、約６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１５％ｗ／ｗのＰＥＧＤＡ、および約０．５％ｗ／ｗのＩｇｒａｃｕｒｅ ２９５９を含む。

様々な実施形態において、組成物は、約５０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約２５％ｗ／ｗ～約５０％ｗ／ｗのＰＥＧＤＡ、約０．２％～約１．０％ｗ／ｗの光開始剤（リボフラビンなど）、および１０％ｗ／ｗ～２０％ｗ／ｗの共開始剤（Ｌ－アルギニンなど）を含む。例えば、組成物は、約６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５０％ｗ／ｗのＰＥＧＤＡ、約０．２％のリボフラビン、および約１０％のＬ－アルギニンを含む。

様々な実施形態において、架橋組成物は、可視スペクトルにわたって光学的に透明である。例えば、架橋組成物は、約７５％を超える、例えば、約８０％を超える、または約８５％を超える可視スペクトル（４００ｎｍ～７００ｎｍ）全体の光の透過率を有する。光学的透明性および／または高い透過性、例えば、可視スペクトルにわたる高い透過性は、本明細書で同様に企図されるような薄膜フィルム組成物、接着剤組成物、およびゲル組成物に有利であることが理解されるであろう。

様々な実施形態において、架橋組成物は、約１ＭＰａ～約６ＭＰａの弾性率を有する。例えば、架橋組成物は、約１．５ＭＰａ～約６ＭＰａ、または約１．６ＭＰａ～約６ＭＰａ、例えば、約１．６ＭＰａ～約５．６ＭＰａの弾性率を有する。

様々な実施形態において、架橋組成物は、約０．１ＭＰａ～約１．５ＭＰａの最大抗張力（ＵＴＳ）を有する。例えば、架橋組成物は、約０．１ＭＰａ～約１ＭＰａ、または約０．３ＭＰａ～約１ＭＰａのＵＴＳを有する。

様々な実施形態において、架橋組成物は、約０．１ＭＰａ～約１ＭＰａの０．２％降伏強度を有する。

様々な実施形態において、約１００ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５ｍＭ～約１０ｍＭのグルタルアルデヒド、および約２％のグリセロールを含む、本明細書に記載される組成物から形成された薄膜フィルムは、
ｉ）約１０Ｍｐａ～約２０Ｍｐａの弾性率、
ｉｉ）約０．５Ｍｐａ～約１．２ＭｐａのＵＴＳ、
ｉｉｉ）約０．２Ｍｐａ～約０．８Ｍｐａの０．２％降伏強度、
ｉｖ）上記ｉ）～ｉｉｉ）のうちの任意の２つ以上、を有する。

様々な実施形態において、本明細書に記載される組成物から形成された薄膜フィルムは、
ｉ）約０．５Ｍｐａ～約４．０Ｍｐａの弾性率、
ｉｉ）約０．１Ｍｐａ～約１．０ＭｐａのＵＴＳ、
ｉｉｉ）約０．０１Ｍｐａ～約０．５Ｍｐａの０．２％降伏強度、
ｉｖ）上記ｉ）～ｉｉｉ）のうちの任意の２つ以上、を有する。

様々な実施形態において、本明細書に記載される２つ以上の組成物が組み合わせて使用される。例えば、特に企図される実施形態において、本明細書に記載される接着剤組成物は、本明細書に記載される組成物から形成される薄膜フィルムに適用され、例えば、眼科手術などの外科的用途に好適な薄膜フィルム接着剤組成物を提供する。

本明細書に開示される数値範囲（例えば、１～１０）への言及には、その範囲内のすべての有理数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９および１０）ならびにその範囲内の任意の有理数の範囲（例えば、２～８、１．５～５．５および３．１～４．７）への言及も組み込まれることを意図する。

本発明の他の目的、態様、特徴および利点は、以下の説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、例示のみを目的とすることを理解されたい。

本明細書の実施例２に記載の半精製クリスタリンサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ａ）１５分の均質化を使用して抽出されたクリスタリン、およびｂ）３５分の均質化を使用して抽出され、透析されたクリスタリン。サンプルは、ゲルに負荷する前に、緩衝液とＭｉｌｌｉ－Ｑをそれぞれ使用して１：１００の比率で希釈した。 Ｌ＝ラダー（左手側にｋＤａ単位で示される分子量）、Ｃ＝粗クリスタリン抽出物。 異なる種から抽出されたクリスタリンのＳＤＳ－ＰＡＧＥを提示し、３つの異なる供給源すべてに、異なるクラス／サブクラスのクリスタリンタンパク質α、βおよびγが存在することを示している。ａ）ホキ水晶体、ｂ）ヒト水晶体、ｃ）ブタ水晶体であり、ＣＥは粗抽出物である。 実施例２に記載の、抽出された粗クリスタリンタンパク質のサイズ排除分離を示している。ピーク画分は、総α（赤）、β（青）、およびγ（緑）クリスタリンに対応する。 実施例２に記載の、ａ）ホキ水晶体、ｂ）ヒト水晶体、およびｃ）ブタ水晶体である、異なる供給源から抽出されたクリスタリンタンパク質のサイズ排除クロマトグラムである。 本明細書の実施例２に記載される組換えヒトα－クリスタリンのＳＤＳ－ＰＡＧＥである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、精製α－クリスタリンのサイズがその予測サイズである２０ｋＤａと一致することが明らかになった。 （ａ）Ｄ．ｒｅｒｉｏおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓ由来のαＢ－クリスタリンタンパク質、（ｂ）Ｄ．ｒｅｒｉｏおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓ由来のβＡ４－クリスタリンタンパク質、ならびに（ｃ）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、Ｂ．ｔａｕｒｕｓおよびＤ．ｒｅｒｉｏ由来のγＢ－クリスタリンタンパク質の３つのアミノ酸配列アラインメントである。 いくつかの脊椎動物のαＡ－クリスタリンオルソログのアミノ酸配列アラインメントである（Ｒｕｎｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００２から）。アスタリスクは、ゼブラフィッシュの配列と同一のアミノ酸を示す。ダッシュは、アラインメントを最適化するために導入されたギャップを表す。 いくつかの脊椎動物のαＢ－クリスタリンオルソログのアミノ酸配列アラインメントである（Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９から）。アスタリスクは、ゼブラフィッシュの配列と同一のアミノ酸を示す。ダッシュは、アラインメントを最適化するために導入されたギャップを表す。 本明細書の実施例２に記載されているホキ魚水晶体からの粗クリスタリン抽出物の円二色性スペクトルである。クリスタリンのβシート構造を示す、２１７ｎｍを中心とする最小値がはっきりと見える。 本明細書の実施例２に記載されている、ホキ魚水晶体からの粗クリスタリン抽出物のＦＴＩＲ吸収スペクトルである。βシート構造を表す１６３１ｃｍ^－１の有意なピークが見える。 本明細書の実施例３に記載されている、ＴＣＥＰ誘導性凝集に対するクリスタリン抽出物によるリゾチームのシャペロン様保護の分析を示すグラフである。 本明細書の実施例３に記載されている、ホキ魚水晶体からの粗クリスタリン抽出物の生体適合性を確認するための細胞のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色の代表的な画像を示す。示されているのは、対照細胞（クリスタリンの非存在下）、および精製α、βおよびγ－クリスタリン画分（１０ｍｇ／ｍＬ）の存在下で成長した細胞の画像である。 本明細書の実施例３に記載されている、ホキ魚水晶体からの粗クリスタリン抽出物が細胞増殖に及ぼす影響を示すグラフである。エラーバーは、３つのサンプルを使用した３セットの実験から取得した平均の標準偏差を表す。 本明細書の実施例３に記載されている、酸化ストレスに対するホキ魚水晶体からの粗クリスタリン抽出物の保護効果を示すグラフである。エラーバーは、３つのサンプルを使用した３セットの実験から取得した平均の標準偏差を表す。 実施例５に記載されている、耐えられる（ｗｉｔｈｈｅｌｄ）力のＭＰａとして表示された、薄膜フィルム組成物の上限引張強度（ＵＴＳ）を示すグラフである。アスタリスクは、０．０５（＊）、０．０１（＊＊）、および０．０１（＊＊＊）のＰ値の閾値を示す。 本明細書の実施例５に記載されている、薄膜フィルム組成物のヤング率（弾性率）値を示すグラフである。アスタリスクは、０．０５（＊）、０．０１（＊＊）、および０．０１（＊＊＊）のＰ値の閾値を示す。 本明細書の実施例５に記載されている、薄膜フィルム組成物の伸長値を示すグラフである。アスタリスクは、０．０５（＊）、０．０１（＊＊）、および０．０１（＊＊＊）のＰ値の閾値を示す。 本明細書の実施例５に記載されている、ＵＶ硬化によって得られたクリスタリンヒドロゲルの膨潤挙動を示すグラフである。エラーバーは、３つのサンプルから取得した平均の標準偏差を表す。 本明細書の実施例６に記載されている、代表的な薄膜フィルム組成物によって支持される、抗アルファチューブリンおよびＤＡＰＩ染色で標識された細胞の細胞接着および細胞伸長を示す。すべてのスケールバーは５０μｍで、行ＩおよびＩＩＩでは２０倍、行ＩＩおよびＩＶでは６３倍で視覚化されている。角膜擦過細胞株１を播種したＡ～Ｆ。角膜擦過細胞株２を播種したＧ～Ｌ。 本明細書の実施例６に記載されている、Ｐ３でのヒト角膜上皮細胞のＤＡＰＩ染色を示す。フィルム配合物：Ｆ２（Ａ～Ｃ）、Ｆ３（Ｄ～Ｆ）、Ｆ４（Ｇ～Ｉ）、およびＴＣＰ対照（Ｊ～Ｌ）。時点：０日目（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ）、７日目（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）、１４日目（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）。画像サイズ：１４．０ｍｍ×１５．０ｍｍ。 本明細書の実施例６に記載されている、ヒト角膜上皮細胞のＤＡＰＩ核染色によって視覚化された、クリスタリンフィルムの生体適合性を示す９枚の写真である。フィルム配合物：上から下へＦ２、Ｆ３およびＦ４。左から右へ：０日目／接着、７日目、１４日目。５倍ズーム、フルタイル、１３ｍｍのカバースリップは実線で示され、キャストフィルムの縁は点線で示されている。 本明細書の実施例６に記載されている、クリスタリンフィルムの生体適合性を示す３つのグラフである。クリスタリンフィルム上の細胞数の増加倍数、および０日目（接着）、７日目および１４日目の組織培養プラスチック対照。灰色－Ｆ２、青－Ｆ３、濃い灰色－Ｆ４、および水色は組織培養プレートである。 本明細書の実施例７に記載されている、薄膜フィルム組成物への播種と同日の細胞接着の光学顕微鏡による視覚化を示す６枚の写真である。すべてのスケールバーは２００μｍ。上段の最初のパネル：Ｆ１、上段の２番目のパネル：Ｆ２、上段の３番目のパネル：Ｆ３、下段の最初のパネル：Ｆ４、下段の２番目のパネル：Ｆ５、下段の３番目のパネル：Ｆ６。 本明細書の実施例８に記載されている、長期細胞培養中の薄膜フィルム組成物上の細胞成長を視覚化する４組の写真であり、（ａ）Ｆ２、（ｂ）Ｆ３、（ｃ）Ｆ４、および（ｄ）陰性ガラス対照。スケールバー＝５０μｍ 同上。 同上。 同上。 本明細書の実施例９に記載されている、代表的な薄膜フィルム配合物上での輪部外植片（ドナー２）の細胞伸長を示す４枚の写真である。（Ａ）７日目、（Ｂ）１１日目、および（Ｃ）１４日目の生細胞イメージング。（Ｄ）１４日目に固定された外植片培養物上でビメンチン（赤）およびＤＡＰＩで標識された細胞核の免疫組織化学的標識の蛍光可視化。スケールバー＝２００μｍ。 本明細書の実施例１０に記載されている、クリスタリン薄膜フィルムの光学的透明性を示す３つのグラフである。Ａ）Ｆ２、Ｂ）Ｆ３、Ｃ）Ｆ４。 同上。 同上。 本明細書の実施例１０に記載されている、クリスタリンフィルムの光学的透明性を示す３枚の写真およびグラフである。透明フィルムを示す画像。（ａ）Ｆ２、（ｂ）Ｆ３、および（ｃ）Ｆ４。グラフ－水和時のフィルムの透過率。灰色の三角形－Ｆ２、青色の円－Ｆ３、および濃い灰色の正方形－Ｆ４。エラーバーは、６つのサンプルから取得した平均の標準偏差を表す。 本明細書の実施例１１に記載されている、異なるＰＥＧ誘導体および架橋剤を使用するクリスタリンのＰＥＧ化を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。Ｌ－ラダー、１－クリスタリンのみ、２－クリスタリン＋ＰＥＧジエチレン（ＰＥＧＤＥ）、３－３７℃でインキュベートしたクリスタリン＋スクシンイミジルメチレンＰＥＧ（ｓｍＰＥＧ）。４，５，６－グルタルアルデヒドを１時間後にサンプル１、２、３に添加し、室温で１時間インキュベートした。８，９，１０－グルタルアルデヒドをサンプル１、２、３にすぐに添加し、サンプルをそれぞれ３７℃で１時間インキュベートした。 本明細書の実施例１２に記載されている、ＰＥＧＤＡ＋クリスタリン含有ヒドロゲルの透明性を実証する写真である。上：ＰＥＧＤＡ＋ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９、５分間のＵＶ照射後。中央：ＰＥＧＤＡ＋ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９＋クリスタリン（６０ｍｇ／ｍＬ）、５分間のＵＶ曝露後。下：ＰＥＧＤＡ＋ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９ ＋クリスタリン（１２０ｍｇ／ｍＬ）、５分間のＵＶ照射後。 本明細書の実施例１２に記載されている、ＰＥＧＤＡベースのクリスタリンヒドロゲルの光学的透明性を示すグラフである。 本明細書の実施例１２に記載されている、ＰＥＧＤＡベースのクリスタリンヒドロゲルのＦＴＩＲ分析を示すグラフであり、ＰＥＧＤＡのみ（青）、およびＰＥＧＤＡベースのクリスタリンヒドロゲル（黒）を示している。 本明細書の実施例１３に記載されている、クリスタリンフィルムの濡れ性を決定するための接触角測定の代表的な画像を提示する。 本明細書の実施例１３に記載されているクリスタリンフィルムの安定性を示すグラフである。灰色－Ｆ２、青色－Ｆ３、および濃い灰色－Ｆ４。エラーバーは、６つのサンプルから取得した平均の標準偏差を表す。 本明細書の実施例１３に記載されている、クリスタリンフィルムの滅菌結果を示す２つの円二色性スペクトログラムである。ａ）Ｆ２フィルムからのクリスタリンタンパク質、およびｂ）Ｆ３フィルムからのクリスタリンタンパク質。実線はｍｉｌｌｉＱ中で２４時間インキュベートしたフィルムを表し、点線はｍｉｌｌｉＱ中で２４時間インキュベートしたガンマ滅菌フィルムである。 本明細書の実施例１３に記載されている、（ａ）室温で３ヶ月間保存されたクリスタリンフィルム、（ｂ）ガンマ滅菌されたクリスタリンフィルム、（ｃ）ガンマ照射後の水和フィルムサンプルの代表的な画像を提示する。 本明細書の実施例１４に記載されている、ＰＥＧＤＡベースのクリスタリン接着剤の接着効果を示す２枚の写真である。（ａ）３分間の曝露後のサンプル（ｉ）ＰＥＧＤＡのみ、（ｉｉ）ＰＥＧＤＡベースのクリスタリン。（ｂ）切開を再度開くために、サンプルを物理的に（強制的に）伸ばした。 本明細書の実施例１５に記載されている、（ａ）ＵＶ硬化、（ｂ）硬化前後の可視光硬化のために最適化された配合物の視覚化を提示する３枚の写真である。 本明細書の実施例１５に記載されている、ブタ眼接着モデルにおけるＰＥＧＤＡベースのクリスタリン接着剤の接着効果を示す２枚の写真である。（ａ）切開した眼のサンプル、（ｂ）クリスタリンヒドロゲルを適用し、３分間ＵＶ硬化した後。 本明細書の実施例１５に記載されている、ブタ眼モデルを使用する縫合試験で確立されたクリスタリンフィルムの外科的扱いやすさを示す３枚の写真である。 本明細書の実施例１５に記載されている、ブタ皮膚サンプルに適用される重ねせん断試験で決定された、ＵＶ硬化クリスタリン生体接着性配合物の接着強度に関するデータを提示する写真およびグラフである。上：重ねせん断試験で使用されたブタ皮膚癒着サンプルの代表的な画像。下：文献（Ｎａｋａｙａｍａ＆Ｍａｔｓｕｄａ，１９９９）から得られたフィブリン糊の値と比較した、ＵＶ硬化クリスタリン生体接着性配合物の接着強度。エラーバーは、６つのサンプルから取得した平均の標準偏差を表す。 本明細書の実施例１６に記載されている、Ｆ２担体フィルム上の輪部外植片からの脱細胞化ヒト角膜を使用した、細胞担体としてのクリスタリンフィルムの有効性を示す４枚の写真である。（ａ）無細胞対照、（ｂ）培養細胞の上に置かれた角膜、（ｃ）培養細胞の下に置かれた角膜、および（ｄ）培養細胞の下に置かれた角膜（１０倍の倍率）。スケールバー＝５００μｍ。 本明細書の実施例１７に記載されている、単層薄膜フィルムの薬物送達特性を示す４つのグラフである。Ａ）２３０ｎｍで測定した、ＰＢＳにおける放出薬物％。Ｂ）２７１ｎｍで測定した、ＰＢＳにおける放出薬物％。Ｃ）２３０ｎｍで測定した、ＰＢＳにおける放出薬物の溶液濃度。Ｄ）２７１ｎｍで測定した、ＰＢＳにおける放出薬物の溶液濃度。 同上。 同上。 同上。 本明細書の実施例１７に記載されている、多層薄膜フィルムの薬物送達特徴を示す４つのグラフである。Ａ）２３０ｎｍで測定した、ＰＢＳにおける放出薬物の溶液濃度。Ｂ）２３０ｎｍで測定した、ＰＢＳにおける放出薬物％。Ｃ）２７１ｎｍで測定した、ＰＢＳにおける放出薬物の溶液濃度。Ｄ）２７１ｎｍで測定した、ＰＢＳにおける放出薬物％。 同上。 同上。 同上。 本明細書の実施例１８に記載されている、ＵＶ硬化を介して得られたクリスタリンヒドロゲルからの薬物（テトラサイクリン）放出を示すグラフである。黒色の線のデータ：重合中に添加されたテトラサイクリン（すなわち、新鮮なゲル）のパーセンテージとしての、７日間にわたるテトラサイクリンの累積放出。灰色の線のデータ：乾燥ヒドロゲルに吸収されたテトラサイクリンのパーセンテージとしての、７日間にわたるテトラサイクリンの累積放出。エラーバーは、３つのサンプルから取得した平均の標準偏差を表す。

本発明は、１つ以上のクリスタリンタンパク質を含む生体適合性材料、ならびにそれらの使用（治療方法および科学的方法の範囲内のものを含む）に関する。例えば、本発明は、生体適合性組成物の製造プロセスを含む生体適合性組成物、ならびに外科的手術、細胞ベースの療法および方法、ならびに薬物送達などにおけるそれらの使用に関する。したがって、本発明はまた、生体適合性接着剤、ヒドロゲル、薄膜フィルムおよびインプラント（特に眼療法に特に適した組成物、接着剤、ヒドロゲルおよびインプラントを含む）などの生体適合性組成物の調製における１つ以上のクリスタリンタンパク質の使用に関する。

様々な実施形態において、本発明は、生体適合性組成物であって、１つ以上の単離、精製、組換えまたは合成タンパク質であって、
ａ）α－クリスタリン、
ｂ）β－クリスタリン、
ｃ）γ－クリスタリン、
ｄ）ホキ（Ｍａｃｒｕｒｏｎｕｓ ｎｏｖａｅｚｅｌａｎｄｉａｅ）由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
ｅ）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
ｆ）本明細書の表１に特定されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｇ）上記ａ）～ｆ）のうちのいずれか１つからの少なくとも約１０個の連続するアミノ酸を含むか、またはそれらからなるポリペプチド、
ｈ）上記ａ）～ｇ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質、
ｉ）インビボでクリスタリンタンパク質の天然構造を有する上記ａ）～ｈ）のうちのいずれか１つによるタンパク質、
ｊ）上記ａ）～ｉ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせと、を含む群から選択される１つ以上の単離、精製、組換えまたは合成タンパク質と、
任意選択的に、１つ以上の可塑剤と、
１つ以上の架橋剤と、を含む、生体適合性組成物に関する。

これらの組成物には幅広い用途が存在する。それにもかかわらず、当業者に明らかであるように、この説明は、そのような組成物の治療用途および研究用途に焦点を当てている。

定義
「接着剤組成物」という用語および関連用語は、２つ以上の表面または別個のアイテムを一緒に結合することができ、少なくともある程度は分離に抵抗する接着剤であるか、またはそれを形成することができる組成物を指す。本明細書で特に企図されるのは、外科的手術で使用するための、すなわち外科用接着剤としての接着剤組成物である。

「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体を指す。特に明記しない限り、「アミノ酸」という用語は、それぞれの構造がそのような立体異性体を可能にする場合、Ｄ型立体異性体およびＬ型立体異性体の両方を含む。

天然アミノ酸としては、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｉｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＨｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｉｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）が挙げられる。

非天然アミノ酸としては、アゼチジンカルボン酸、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、ベータ－アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイス酪酸、２－アミノピメリン酸、第三級ブチルグリシン（「ｔＢｕＧ」）、２，４－ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」または「ｈｏｍｏＰ」）、ヒドロキシリジン、アロ－ヒドロキシリジン、３－ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４－ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」または「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ－メチルグリシンを含むＮアルキルグリシン（「ＮＡＧ」）、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルペンチルグリシンを含むＮ－アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）。Ｎ－メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」または「ＰＧｌｙ」）、ピペコリン酸、チオプロリン（「ＴｈｉｏＰ」または「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）、およびホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）が挙げられるが、これらに限定されない。

「アミノ酸類似体」という用語は、Ｃ末端カルボキシ基、Ｎ末端アミノ基および側鎖官能基のうちの１つ以上が、可逆的または不可逆的に化学的にブロックされているか、さもなければ別の官能基に修飾されている天然または非天然アミノ酸を指す。例えば、アスパラギン酸－（ベータ－メチルエステル）はアスパラギン酸のアミノ酸類似体である。Ｎ－エチルグリシンはグリシンのアミノ酸類似体である。またはアラニンカルボキサミドはアラニンのアミノ酸類似体である。他のアミノ酸類似体としては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ－（カルボキシメチル）－システイン、Ｓ－（カルボキシメチル）システインスルホキシド、およびＳ－（カルボキシメチル）－システインスルホンが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸の短いポリマーを指す。他のアミノ酸ポリマー（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）とは対照的に、ペプチドは一般に長さが約５０アミノ酸以下である。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、および／または修飾アミノ酸を含むことができる。ペプチドは、天然に存在するタンパク質の部分配列、または合成配列を含む非天然配列であり得る。

本明細書で使用される場合、「合成ペプチド」という用語は、天然のペプチドおよび／またはタンパク質に見られるものとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドを包含する。本明細書で使用される場合、「合成ペプチド」は、任意の好適な方法（例えば、組換え発現、化学合成、酵素合成など）によって生成または合成することができる。

「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」という用語は、タンパク質またはペプチドに由来する配列を模倣するペプチド様分子を指す。ペプチド模倣物またはペプチド模倣体は、アミノ酸および／または非アミノ酸成分を含有することができる。ペプチド模倣体の例としては、化学的に修飾されたペプチド、ペプトイド（側基がα－炭素にではなくペプチド骨格の窒素原子に付加されている）、β－ペプチド（α－炭素ではなくβ炭素に結合するアミノ基）などが挙げられる。化学修飾としては、アミノ酸側基、α－炭素原子、末端アミン基、または末端カルボキシ基での１つ以上の修飾が挙げられる。化学修飾は、化学的部分の付加、新たな結合の作成、または化学的部分の除去であり得る。アミノ酸側基での修飾としては、リジンε－アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンのＮ－アルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸側基のカルボキシル基によるリジンε－アミノ基の環化によるラクタム形成、（例えば、アルファ－ヘリックスコンフォメーションを安定化するための）炭化水素の「ステープリング」、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミド化が挙げられるが、これらに限定されない。末端アミン基の修飾としては、デサミノ、Ｎ－低級アルキル、Ｎ－ジ－低級アルキル、拘束アルキル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ａｌｋｙｌｓ）（例えば、分岐、環状、縮合、アダマンチル）およびＮ－アシル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。末端カルボキシ基の修飾としては、アミド、低級アルキルアミド、拘束アルキル（例えば、分岐、環状、縮合、アダマンチル）アルキル、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。低級アルキルはＣ１－Ｃ４アルキルである。さらに、１つ以上の側基、または末端基は、当業者であるペプチド化学者に知られている保護基によって保護することができる。アミノ酸のα－炭素は、モノメチル化またはジメチル化することができる。

特定の実施形態において本明細書に記載されるタンパク質のうちのいずれか１つは、１つ以上の非天然アミノ酸、１つ以上のアミノ酸類似体を含むか、あるいは合成ペプチドもしくはポリペプチドまたはペプチド模倣物であるかまたはそれを含むことが理解される。

本明細書で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という単語、および同様の単語は、排他的または網羅的な意味で解釈されるべきではない。つまり、「含むが、これに限定されない」ことを意味することを意図する。「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という用語を含む本明細書の各記載を解釈する場合、この用語の後に記載される１つ以上の機能以外の機能も存在する場合がある。

ポリペプチドの「断片」は、ポリペプチドの部分配列であり、典型的には、酵素活性もしくは結合活性などの活性に必要な機能を実行するもの、および／またはポリペプチドもしくはその一部（エピトープなど）の三次元構造を提供するものである。

本明細書で使用される場合、「融合ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によってそれぞれのアミノ残基およびカルボキシル残基を介して融合されて単一の連続ポリペプチドを形成する、２つ以上のアミノ酸配列、例えば２つ以上のポリペプチドドメインを含むポリペプチドを指す。２つ以上のアミノ酸配列は、直接的に融合され得るか、またはリンカーもしくはスペーサーまたは追加のポリペプチドにより、それらのそれぞれのアミノ末端およびカルボキシル末端を介して間接的に融合され得ることを理解されたい。

一実施形態において、融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列のうちの１つは粒子形成タンパク質を含み、融合タンパク質を含む１つ以上の他のアミノ酸配列は、本明細書に記載されるタンパク質を含む。

本開示との関連において、「ヒドロゲル」は、水を含むがそれ自体は水不溶性のポリマーを意味すると解釈され、その分子は化学的に連結されて三次元マトリックスを形成する。組み込まれた親水性成分により、ヒドロゲルは水中で膨潤して容量が増えるが、プロセスでそれらの材料凝集性が失われることはない。

本明細書で使用される場合、「ゲル」は、材料の凝集を実質的に保持しつつも、少なくともある程度の変形が可能な固体材料を指す。

本明細書で使用される場合、「生理学的ｐＨ」という用語は、一般に、人体で通常よく見られるｐＨを指し、約７．３５～約７．４の範囲である。しかしながら、サンプルからクリスタリンタンパク質を調製することを伴う本明細書に記載される調製方法との関係などの当業者に明らかであろう特定の関係において、生理学的ｐＨは、サンプルが得られた生物の体内で通常よく見られるｐＨを指すであろう。

本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれる。「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用することができる。

「ポリペプチド」という用語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然による修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図している。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術により産生される場合があるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。化学合成によるものを含め、任意の方法で生成されてもよい。

本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有し得るが、必ずしもそのような構造を有するわけではない。糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えばセリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有または窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合している少なくとも１つの炭水化物部分に結合したタンパク質を指す。

したがって、本明細書で企図されるポリペプチドは、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されている、全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。本明細書に記載されるポリペプチドは、精製された天然の産物であるか、または組換え技術もしくは合成技術を使用して部分的または全体的に生成される。この用語は、ポリペプチド、二量体もしくは他の多量体などのポリペプチドの凝集体、融合ポリペプチド、ポリペプチド変異体、またはそれらの誘導体を指し得る。

本明細書で企図される特定のポリペプチドおよびタンパク質については、個々の種の間に天然の変異が存在し得ることが理解されるであろう。これらの変異は、配列全体におけるアミノ酸の差異によって、または当該配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加によって実証され得る。生物学的活性および免疫学的活性を本質的に変化させないアミノ酸置換はよく知られている。関連するアミノ酸間のアミノ酸置換または進化において頻繁に発生する置換は、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである。他のアミノ付加置換としては、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、およびＡｌａ／Ｇｌｕが挙げられる。この情報に基づいて、迅速かつ高感度のタンパク質比較および相同タンパク質間の機能的類似性を決定するための方法が開発された。本明細書に記載される例示的な実施形態のそのようなアミノ酸置換、ならびに欠失および／または挿入を有する変異は、得られるタンパク質がそれらの免疫反応性を保持する限り、本発明の範囲内である。これは、本明細書に記載される１つ以上のタンパク質が、異なる供給源から単離された場合、同じ特性を有する同じタンパク質を依然として表しているにもかかわらず、１００％未満の同一性レベルを有し得る理由を説明する。本明細書で具体的に特定されたタンパク質に特異的な抗体と反応することができるタンパク質などの機能性タンパク質を依然として提供する、本明細書に記載される特定のタンパク質のアミノ酸配列のこれらの変異は、本明細書で特定されたタンパク質の機能的同等物とみなされ、そのため、タンパク質の機能性に本質的に影響を及ぼすことはない。

「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体、または誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドを意味する。特定のレベルの精製は必要ない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然環境から除去することができる。宿主細胞で発現される組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術により少なくとも部分的に分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されたとみなされる。

ポリペプチド（またはその断片、変異体、または誘導体）に関して使用される「実質的に純粋な」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、またはそれらが天然に関連する他の汚染物質から所望されるように分離される、本明細書に記載されるポリペプチドを指す。例えば、タンパク質およびポリペプチドについて言及する場合、そのタンパク質が、そのタンパク質を含む組成物の総タンパク質含有量の約５０％超、典型的には、総タンパク質含有量の約６０％超を構成する場合、タンパク質またはポリペプチドは実質的に純粋であるとみなされる。より典型的には、実質的に純粋なもしくは単離されたタンパク質またはポリペプチドは、総タンパク質の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、少なくとも約９５％を構成するであろう。好ましくは、タンパク質は、組成物中の総タンパク質の約９０％超、より好ましくは約９５％超を構成するであろう。タンパク質およびポリペプチドを組換え的に産生または合成する最新の方法は、実質的に純粋なポリペプチドを産生するのに非常に適していることが理解されるであろう。

ポリペプチドに関する「変異体」という用語は、１つ以上の非天然アミノ酸、１つ以上のアミノ酸類似体、およびペプチド模倣物を含むものなど、天然に存在する、組換え産生および合成産生ポリペプチドを包含する。変異体ポリペプチド配列は、本発明の配列に対して、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、少なくとも２０個のアミノ酸位置、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸位置、少なくとも１００個のアミノ酸位置の比較ウィンドウにわたって、または本発明のポリペプチドの全長にわたって見られる。

ポリペプチド配列同一性は、以下の方法で決定することができる。対象のポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公開されているｂｌ２ｓｅｑのＢＬＡＳＴＰ（ＢＬＡＳＴプログラムスイート、バージョン２．２．１０［２００４年１０月］から）を使用して候補ポリペプチド配列と比較される。ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメータが使用されるが、複雑度の低い領域のフィルタリングをオフにする必要がある。

ポリペプチド配列同一性はまた、グローバル配列アラインメントプログラムを使用して、候補と対象ポリヌクレオチド配列との間の重複の全長にわたって計算され得る。上で考察したＥＭＢＯＳＳ－ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／で入手可能）およびＧＡＰ（Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９４）Ｏｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １０，２２７－２３５．）も、ポリペプチド配列同一性を計算するための好適なグローバル配列アラインメントプログラムである。

本明細書で企図されるポリペプチド変異体はまた、それらの配列の機能的同等性を保持している可能性があり、偶然に発生したと合理的に予想できなかった、具体的に特定された配列のうちの１つ以上との類似性を示すものを包含する。ポリペプチドに関するそのような配列類似性は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）のＢＬＡＳＴプログラムスイート（バージョン２．２．１０［２００４年１０月］）から公開されているｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定できる。ポリペプチド配列の類似性は、以下のＵＮＩＸコマンドラインパラメーターを使用して調べることができる。
ｂｌ２ｓｅｑ－ｉ ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ１－ｊ ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ２－Ｆ Ｆ－ｐ ｂｌａｓｔｐ
変異体ポリペプチド配列は、具体的に特定された配列のうちのいずれか１つと比較して、好ましくは１×１０^－１０未満、より好ましくは１×１０^－２０未満、１×１０^－３０未満、１×１０^－４０未満、１×１０^－５０未満、１×１０^－６０未満、１×１０^－７０未満、１×１０^－８０未満、１×１０^－９０未満、１×１０^－１００未満、１×１０^－１１０未満、１×１０^－１２０未満または１×１０^－１２３未満のＥ値を示す。

パラメータ－Ｆ Ｆは、複雑度の低いセクションのフィルタリングをオフにする。パラメータ－ｐは、配列のペアに適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似領域を見つけ、そのような領域ごとに「Ｅ値」を報告する。「Ｅ値」は、ランダム配列を含む固定参照サイズのデータベースで偶然にそのような一致が見られると予想される回数である。１よりはるかに小さいＥ値が小さい場合、これはおおよそそのようなランダム一致の確率である。

その生物学的活性を有意に変化させることなく、記載されたポリペプチド配列のうちの１つまたはいくつかのアミノ酸の保存的置換もまた、本発明に含まれる。当業者は、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を行うための方法を知っているであろう（例えば、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１３０６を参照されたい）。

本明細書で企図されるポリペプチド変異体はまた、ポリペプチドをコードする核酸から産生されるものを包含するが、変更されたアミノ酸配列を有するように異なる方法で処理されるという点で野生型ポリペプチドとは異なる。例えば、変異体は、野生型ポリペプチドを産生するものに替わる一次ＲＮＡ転写物のスプライシングパターンによって産生される。

本明細書で使用される場合、「対象」は、動物、通常は哺乳動物であり、哺乳動物のコンパニオンアニマルまたはヒトを含む。代表的なコンパニオンアニマルとしては、ネコ、ウマおよびイヌが挙げられる。代表的な農業用動物としては、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカおよびブタが挙げられる。特に企図される対象は、ウシ、ヒツジおよびヤギの対象など、ミルクを生産するために商業的に使用される対象である。

「ベクター」という用語は、遺伝子構築物を宿主細胞に輸送するために使用されるポリヌクレオチド分子、通常は二本鎖ＤＮＡを指す。特定の例において、ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの少なくとも１つの追加の宿主系において複製することができる。

クリスタリンタンパク質
クリスタリンタンパク質は、すべての脊椎動物種の眼の水晶体に見られる水溶性構造タンパク質である。クリスタリンは、水晶体に必要な屈折率を維持するように機能し、眼の水晶体線維細胞のタンパク質成分の約９０％以上を構成する。

眼の水晶体および角膜に見られるクリスタリンタンパク質は、α－クリスタリン、β－クリスタリン、γ－クリスタリンの３つのサブグループに分類できる。眼組織に存在する各サブグループの割合は種によって異なる。典型的な哺乳動物の水晶体のタンパク質の約３５％はα－クリスタリンであり、魚およびげっ歯類では、γ－クリスタリンの割合がβ－クリスタリンよりも大きくなっており、他のほとんどの種の水晶体の主成分はβ－クリスタリンである。

α－クリスタリン
α－クリスタリンは、タンパク質の小さな熱ショックタンパク質（ｓＨＳＰ）グループのメンバーである。ｓＨＳＰはすべて、疎水性のＮ末端ドメインおよび親水性のＣ末端伸長を有する、約９０個のアミノ酸を含む特徴的なα－クリスタリンドメインを含有している。２つのα－クリスタリンサブユニット、αＡおよびαＢがある。αＡおよびαＢクリスタリンの多分散性およびオリゴマー性は、それらのサイズが環境に依存することを意味する。それらの平均ホモオリゴマー分子量は、αＡおよびαＢについてそれぞれ６６０ｋＤａおよび６２０ｋＤａであることがわかっているが、オリゴマーは３００～１２００ｋＤａの範囲にあり得る。

水晶体のα－クリスタリンは、白内障を形成する変性タンパク質の凝集を防ぎ、ストレスに対する細胞の耐性を高めることが報告されている。

β－クリスタリンおよびγ－クリスタリン
β－クリスタリンおよびγ－クリスタリンは構造的に類似したタンパク質であり、どちらも２つの類似したドメインで構成されており、各ドメインにはギリシャのキーパターンで折りたたまれた２つの類似したモチーフがある。γ－クリスタリンは単純な単量体であるが、β－クリスタリンは複雑なオリゴマーグループである。β－クリスタリンおよびγ－クリスタリンはいずれも水晶体の外側の組織において見られるが、それらの具体的な生物学的機能は十分に特徴付けられていない。

具体的に企図されるクリスタリンタンパク質は、αＡシスタリンまたはαＢクリスタリンなどの哺乳動物α－クリスタリン、βＡクリスタリン（例えば、βＡ１、βＡ２、βＡ３およびβＡ４クリスタリン）およびβＢクリスタリン（例えば、βＢ１、βＢ２およびβＢ３クリスタリン）などの哺乳動物β－クリスタリン、ならびにγＳ、γＡ、γＢ、γＣ、γＤ、γＥおよびγＦクリスタリンなどの哺乳動物のγ－クリスタリンである。

さらに具体的に企図されるクリスタリンタンパク質は、αＡシスタリンまたはαＢクリスタリンなどの魚類α－クリスタリン、βＡクリスタリン（例えば、βＡ１、βＡ２およびβＡ４クリスタリン）およびβＢクリスタリン（例えば、βＢ１、βＢ２およびβＢ３クリスタリン）などの魚類β－クリスタリン、ならびに、例えばライギョダマシ（Ｄｉｓｓｏｓｔｉｃｈｕｓ ｍａｗｓｏｎｉ）由来のγＭ１、γＭ３、γＭ４、γＭ５、γＭ７、γＭ８ａ、γＭ８ｂ、γＭ８ｃ、γ８ｄ、γＭ８ｅ、γＭ９、γＮ、γＳ１およびγＳ２クリスタリン、またはゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）由来のγＭ１、γＭ２ａ、γＭ２ｂ、γＭ２ｃ、γＭ２ｄ１、γＭ２ｄ２、γＭ３、γＭ４、γＭ５、γＭ６、γＭ７、γＭｘ、γＮ１、γＮ２、γＳ１、γＳ２、γＳ３およびγＳ４クリスタリンなどの魚類γ－クリスタリンである。

さらに具体的に企図されたＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来のクリスタリンタンパク質は、以下の表１ならびに図６、７および８に示されている。

天然に存在する供給源から精製されたクリスタリンタンパク質が本明細書で具体的に例示されるが、組換えまたは合成クリスタリンタンパク質も同様に、本明細書に記載される方法、組成物および材料で使用するのに適していることが理解されるであろう。さらに、クリスタリンタンパク質の供給源に関係なく、理論に拘束されることを望まないが、本明細書に記載される組成物および材料の特定の有利な特性は、組成物および材料中に存在する場合、クリスタリンタンパク質の天然のコンフォメーションに関連すると考えられることが理解されるであろう。したがって、それらの天然のコンフォメーション、構造および修飾（グリコシル化パターンなどの翻訳後修飾を含む）を有するクリスタリンタンパク質を提供することができる製造方法が具体的に企図されている。したがって、組換えまたは合成クリスタリンタンパク質を含むクリスタリンタンパク質を発現または産生することができる核酸、構築物、ベクターおよび宿主細胞が、本明細書で特に企図される。

当業者は、この説明を読むことにより、特に外科的手術、細胞療法および薬物送達を含む治療方法において、クリスタリンタンパク質を含む組成物の様々な使用および用途が提供されることを認識するであろう。

本明細書で特に企図されるのは、外科的用途で本明細書に記載されるタンパク質含有組成物のうちの１つ以上を利用する治療方法、組成物、試薬およびキットである。

したがって、一態様において、本発明は、組織閉鎖を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
任意選択的に、裂傷、病変、切開または創傷を閉鎖するために力を加えることと、
裂傷、病変、切開もしくは創傷、または当該裂傷、病変、切開もしくは創傷の部位を、本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質含有組成物と接触させることと、
任意選択的に、裂傷、病変、切開または創傷を閉鎖するために力を加えることと、
架橋を開始することと、
架橋が起こるのに十分な時間、裂傷、病変、切開または創傷の閉鎖を維持することと、を含み、
クリスタリンタンパク質の架橋が接着剤組成物を形成する、方法に関する。

一実施形態において、組織閉鎖の方法は、外科的切開を閉鎖する方法である。

一実施形態において、組織閉鎖の方法は、無縫合閉鎖の方法である。例えば、無縫合閉鎖は、無縫合皮膚閉鎖、無縫合創傷閉鎖、または無縫合手術切開閉鎖である。

一実施形態において、外科的手術は、眼科手術である。一例において、眼科手術は、白内障手術、結膜移植片、平面硝子体切除術を含む硝子体切除術、屈折水晶体交換、水晶体移植、または水晶体交換手術である。別の例において、眼科手術は、網膜剥離手術であり、これには、網膜復位術または強膜内陥術を組み込んだ網膜手術、黄斑円孔手術、結膜閉鎖、緑内障手術、小疱漏出手術、線維柱切除、眼瞼縫合、羊膜移植、角膜穿孔手術、翼状片切除術を含む翼状片手術、後嚢眼内レンズ移植、上皮内殖手術、表層角膜移植、深層層状角膜移植を含む角膜移植、両側斜視手術を含む斜視手術、眼瞼植皮手術、または粘膜移植手術が含まれる。

一実施形態において、組成物は、眼科手術装置を介して適用される。

様々な実施形態において、裂傷、病変、切開または創傷の閉鎖の維持は、架橋が起こるのに十分な時間であり、包帯、縫合糸、メッシュなどの１つ以上の医療補助具の適用によるか、または裂傷、病変、切開もしくは創傷を閉鎖した状態でクランプするもしくは保持するなどの（通常は一時的な）物理的力による。

様々な実施形態において、裂傷、病変、切開または創傷の閉鎖の維持は、約６０％を超える架橋が起こる、例えば、約７０％を超える架橋が起こる、約８０％を超える架橋が起こる、約９０％を超える架橋が起こる、または約９５％を超える架橋が起こるのに十分な時間である。

誤解を避けるために、本明細書で使用される場合、架橋のパーセンテージへの言及は、架橋を形成しており、したがって架橋に関与する、クリスタリンタンパク質中に存在する利用可能な全架橋部位の割合を企図する。完全な架橋がほとんど起こらなかった場合、本明細書に記載される組成物を使用して効果的な接着を達成できるが、形成できる架橋の実質的な割合を形成して強固な接着を提供できるようにすることが望ましいことが理解されるであろう。同様に、当業者は、組織閉鎖を達成および維持するために必要な力、ひいては（例えば、本明細書に記載される代表的な外科的方法の維持ステップ中の）所望の架橋度が、多数の要因、特に裂傷、病変、切開もしくは創傷の部位、範囲、深さおよび／もしくは面積、対象の年齢および運動性、ならびに包帯、外科用メッシュ、縫合糸などの他の医療補助具の利用可能性もしくは使用の望ましさ、または組織の閉鎖を助けるための物理的力に応じて異なることを認識するであろう。

いくつかの実施形態において、生体適合性クリスタリン含有材料の架橋時間（またはゲル化時間）は、ｐＨ、例えば、組成物のｐＨ、標的部位のｐＨ、水性緩衝液のｐＨなどによって制御される。

いくつかの実施形態において、架橋時間は、架橋の開始、例えば、光架橋剤のＵＶ光などの光への曝露によって制御される。

特定の実施形態において、架橋時間は、約２０秒～１０分である。いくつかの実施形態において、生体適合性クリスタリン含有材料は、標的部位でゲル化する。特定の実施形態において、生体適合性クリスタリン含有材料は、所定の時間にゲル化する。

いくつかの実施形態において、生体適合性クリスタリン含有材料は、生体吸収性ポリマーである。特定の実施形態において、生体適合性クリスタリン含有材料は、約１～７０日以内に生体吸収される。

いくつかの実施形態において、生体適合性クリスタリン含有材料は、実質的に非生体吸収性である。

外科用接着剤として本明細書で企図される組成物の使用を含むか、または本明細書で企図される組成物の接着能力に少なくとも部分的に依存するかもしくはその恩恵を受けるほとんどの外科的用途において、組成物の架橋は、組成物が適用または投与されると、有利に実施および／または開始される。しかしながら、特定の実施形態において、少なくとも部分的に架橋された組成物の使用が有益であり、その結果、適用または投与後の継続的な架橋が有用に維持されることが認識されるであろう。

したがって、一態様において、本発明は、組織閉鎖を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
任意選択的に、裂傷、病変、切開または創傷を閉鎖するために力を加えることと、
裂傷、病変、切開もしくは創傷、または当該裂傷、病変、切開もしくは創傷の部位を、本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質含有組成物と接触させることであって、任意選択的に、クリスタリン含有組成物が少なくとも部分的に架橋されている、接触させることと、
任意選択的に、裂傷、病変、切開または創傷を閉鎖するために力を加えることと、
架橋を開始するおよび／または維持することと、
架橋が起こるのに十分な時間、裂傷、病変、切開または創傷の閉鎖を維持することと、を含み、
クリスタリンタンパク質の適用および／または架橋が接着剤組成物を形成する、方法に関する。

本明細書に記載されるように、眼科手術を受けているまたは受けた対象における組織閉鎖の、および眼の損傷または眼の切開の治療を必要とする対象においてそれを行う、広く同等の方法もまた企図される。

本明細書に記載される組成物、使用および方法の多くの用途において、滅菌を受け、有用な構造的完全性および機能を含む有効性を保持するクリスタリン含有組成物の能力が非常に重要であることが理解されるであろう。当業者は、本開示を読むことにより、外科的処置、および細胞の培養または移入を含む処置など、多くの企図される用途において無菌性が最も重要であることを認識するであろう。好適な滅菌方法の代表的な例として、例えば、ガンマ線照射（実施例１３を参照）、ＵＶ滅菌（実施例４を参照）などが本明細書に例示されている。

組成物の滅菌は、通常、組成物が使用される用途、および組成物がどのように扱われ、保管され、輸送され、投与されるか、またはされたかなどに照らして、そうすることが最も適切なときに行われることが認識されるであろう。特定の例において、滅菌は、クリスタリン含有組成物が架橋された後に実行される。例えば、特定の実施形態において、細胞培養または移入のための薄膜フィルム組成物は、それらが架橋された後に滅菌される。架橋後滅菌の代表的な方法が本明細書に例示されている。

特定の実施形態において、滅菌は、本明細書で企図される組成物の調製または使用中に少なくとも部分的に達成される。例えば、本明細書に記載される特定のＵＶ硬化組成物は、硬化／架橋中に少なくとも部分的にＵＶ滅菌することができる。例えば、ＵＶ硬化に好適な組成物を、滅菌条件下で（例えば、本明細書の実施例４に記載される条件を参照）、クリスタリンタンパク質を架橋し、組成物を滅菌するのに十分な時間、ＵＶ光に曝露することが特に企図される。

特定の実施形態において、組成物は、架橋の前に滅菌される。例えば、本明細書に記載される接着性クリスタリン含有組成物の特定の使用は、架橋前の組成物の局所的または外科的適用を含み、組成物は、投与部位への感染の導入を回避するために無菌であることが有利である。

ガンマ線照射を含むがこれに限定されない照射による滅菌は、特に本明細書で企図されるクリスタリン含有組成物の外科的投与を含む用途に、一般に好ましいであろう。特に本明細書に記載されるＵＶ硬化性組成物（しかし、これに限定されない）のＵＶ滅菌もまた、具体的に企図される。

化学的滅菌方法、特に、例えばエチレンオキシド処理（ＣＦＣ－１２／ＥｔＯ ８８／１２ブレンドによる治療など）などの埋め込み型医療装置を含む、温度および湿気に敏感な医療装置の滅菌に好適な方法も、本明細書に記載される組成物と共に使用するのに好適である。例としては、米国環境保護庁の「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｎｅｗ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ Ｐｏｌｉｃｙ－Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ ｉｎ Ｓｔｅｒｉｌａｎｔｓ」のＷｅｂサイト（ｅｐａ．ｏｒｇ／ｓｎａｐ／ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ－ｓｔｅｒｉｌａｎｔｓ）に列挙されているものが挙げられる。

理想的には、滅菌は、組成物および／または最終的な架橋産物の有効性（形成、構造または機能のうちのいずれか１つ以上などであるが、これに限定されない）に影響を及ぼさないかまたはその影響を最小限に抑える方法を使用して、およびそのような条件下で行われる。組成物中に存在するクリスタリンタンパク質の構造を含む、本明細書に記載される組成物に対する滅菌の影響またはその欠如を決定するための方法が、本明細書に記載され、例示される。例えば、本明細書の実施例１３は、ガンマ滅菌がフィルム中のクリスタリンタンパク質の天然構造に悪影響を及ぼさなかったことを確認するために、ガンマ滅菌を受けた組成物中に存在するクリスタリンタンパク質の二次構造を調査する方法を例示する。当業者に知られているこれらおよび他の方法は、滅菌が有効性に影響を及ぼさないかまたはその影響を最小限に抑えることを確実にするために、他の滅菌方法の好適性を調査するのに適切である。

ゲル化／架橋組成物の機械的特徴
本開示を読めば当業者に明らかであるように、本明細書に記載されるゲル化／架橋組成物は、それらの機械的特性によって特徴付けることができる。例えば、本明細書に記載される組成物の引張弾性は、材料のヤング率／弾性率を決定することによって有用に定量化され、弾性率が高いほど、材料の剛性はより高くなる。引張弾性を決定する方法は当該技術分野で周知であり、代表的な方法は本明細書の実施例に記載されている。

同様に、材料が破壊する前に耐えることができる最大応力は、本明細書では最大抗張力（ＵＴＳ）として表され、材料が永久／塑性変形を示し始める点は、本明細書では０．２％降伏強度として表される。一般に、設計応用では、降伏強度が許容応力の上限として使用される。この場合も、ＵＴＳおよび０．２％降伏強度を決定する方法は当該技術分野で周知であり、代表的な方法が本明細書の実施例に提示されている。

ゲル化／架橋組成物の機械的特徴は、特定の実施形態において、組成物が使用される用途に特に合うように適合されることが理解されるであろう。例えば、薄膜フィルムとして使用するための組成物は、特定の実施形態において、接着剤として使用するための組成物よりも高いヤング率を有するように配合されるであろう。

ゲル化／架橋組成物の機械的特徴は、少なくとも部分的に、前駆体組成物の配合、例えば、架橋剤の同一性および量、および／または前駆体組成物中の特定のクリスタリンアイソフォームの存在もしくは相対量に関連することが理解されるであろう。本明細書に提示される実施例において明確に見られるように、本明細書に記載されるクリスタリン含有組成物の組成を変更することは、得られるゲル化／架橋組成物の特徴に有意義な影響を与える。

さらに、ゲル化／架橋組成物の機械的特徴に影響を与えることに加えて、前駆体組成物の配合は、ゲル化／架橋組成物中に存在する１つ以上の活性剤の放出プロファイルならびに／または組成物の分解速度および／もしくはプロファイルなど、ゲル化／架橋組成物の他の特性の影響を有する。

特定の実施形態、例えば、薄膜フィルムに関する実施形態において、パターン化、例えば、ソフトリソグラフィーを使用するフィルムのマイクロパターン化、またはパターン化されたテンプレート基質上でのゲル化によるパターン化が使用される。例えば、パターン化を使用して、有益な細胞のアラインメントまたは固定を促進する。一実施形態において、エッチングもしくはパターン化されたフィルム、例えば、エッチングされたシリコンウェーハもしくは４００～４０００ｎｍのピッチを有するポリウレタン表面上に調製されたフィルムを使用して、細胞のアラインメントおよび遊走を指示するか、あるいは細胞接着および／もしくは層化、ならびに／またはタンパク質の沈着を促進する。同様に、本明細書に記載される薄膜フィルムなど、本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質を含む組成物のパターン化を使用して、弾性、強度などの１つ以上の機械的特徴を変化もしくは増強するか、または変形、穿孔、もしくは他の破壊を指示することができる。

１つ以上のクリスタリンタンパク質に加えて、本明細書で企図される生体適合性組成物は、１つ以上の合成ペプチドを含む１つ以上の追加のポリペプチド、または１つ以上の治療用活性剤などの１つ以上の活性剤を含み得る。例えば、本明細書で企図される生体適合性材料は、特定の実施形態において、クリスタリンポリペプチドのうちの１つ以上に結合した１つ以上の物質、またはそれに結合した部分など、材料に共有結合するか、その中に組み込まれるか、または吸着される１つ以上の物質を含む。

治療用途の大部分において、１つ以上の活性剤が存在する場合、当該活性剤は、好ましくは、生理学的または薬理学的に活性な薬剤、例えば、抗生物質、細胞静止剤、抗炎症剤、代謝ホルモン、遺伝子治療薬、成長ホルモン、分化因子または調節因子、免疫抑制剤、免疫刺激物質、核酸、アポトーシス誘導剤、接着誘導剤もしくは阻害剤、受容体アゴニストおよび受容体アンタゴニスト、または混合物もしくはそれらの任意の２つ以上であろう。

具体的に企図されるのは、１つ以上の活性剤のうちの１つ以上が眼科的に許容される抗生物質、例えば、スルホンアミド、マクロライド、エルスロマイシン、クロラムフェニコール、アミノグリコシド、フルオロキノロン、バンコマイシン、およびテトラサイクリンを含む群から選択される１つ以上の抗生物質である、眼科療法に関連する組成物、使用および方法である。

広範囲の薬学的に活性な活性剤は、本明細書に記載されるように生体材料への組み込みに適しており、治療されるべき状態または疾患などの、達成されるべき治療目標に従って選択されることが理解されるであろう。例えば、本明細書で特に企図される眼療法との関連において、例えば緑内障を治療するのに有効な１つ以上の活性剤は、特定の実施形態において、眼への適用に好適な生体材料に組み込まれる。緑内障の局所治療のための代表的な活性剤としては、ピロカルピン、カルバコール、臭化デメカリウムおよびヨウ化エコチオフェートなどのコリン作動薬、エピネフリン、ジピベフリン、ブリモニジンおよびアプラクロニジンなどのアドレナリン作動薬、チモロール、カルテオロール、ベタキソロール、レボブノロールおよびメトプロロールなどのベータ遮断薬、ＰＧＦ２α、ラタノプロスト、ウノプロストンおよびＰＨＸＡ－８５などのプロスタグランジン類似体、ドルゾラミドおよびブリンゾラミドなどの炭酸脱水酵素阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。

特定の部位に局所濃度の活性剤を提供する能力は多くの治療用途において有益であるが、本明細書に記載される組成物および材料はまた、特に適用部位が全身循環への良好なアクセスを有するか、さもなければ粘膜組織と同様に活性剤の取り込みに適している場合、全身活性剤の送達に好適であることが理解されるであろう。本明細書で企図される眼の例を使用すると、眼内または眼上への適用を標的とする本明細書に記載される組成物および材料が、局所眼科用剤の送達に限定されないが、１つ以上の全身的に活性な薬剤を含むことができるように、眼を介した活性剤の全身送達が可能であることが理解される。

本明細書で例示される特定の実施形態などの特定の実施形態において、本明細書で企図される生体適合性組成物は、１つ以上の細胞を、任意選択的に、１つ以上の支持活性剤および／または上で考察した１つ以上の追加の活性剤と共に含む。例えば、特定の実施形態において、外科的使用のための代表的な組成物は、１つ以上の抗生物質および／または１つ以上の分化もしくは調節因子と共に、１つ以上の幹細胞などの１つ以上の細胞を含み、外科的適用の前、中および後の細胞生存率を改善する。

特に企図される細胞としては、輪部上皮幹細胞または角膜輪部幹細胞とも呼ばれる輪部幹細胞、間葉系幹／間質細胞とも呼ばれる間質幹細胞、および網膜色素上皮細胞が挙げられる。さらに特に企図される細胞には、全能性幹細胞、多能性幹細胞、および複能性幹細胞が含まれる。

生体適合性組成物と組み合わせて使用するために本明細書で企図される活性剤、物質および細胞は、通常、治療上の利益を提供するために利用されるが、理解されるように、支持機能も同じく具体的に企図される。

特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、１つ以上の希釈剤、または１つ以上の追加の薬剤もしくは物質などの、１つ以上の担体もしくは賦形剤を含み、これらは、組成物および／もしくはその使用、ならびに／または存在する任意の１つ以上の活性剤を含む、その構成要素のうちの任意の１つ以上の使用に、１つ以上の利益を提供する。例えば、特定の実施形態における組成物は、組成物および／もしくは組成物に含まれる１つ以上の活性剤のうちの１つ以上の配合、安定性、投与、送達、取り込み、または有効性において、あるいはその１つ以上の利益を提供する１つ以上の担体または賦形剤を含む。

活性剤の放出速度の制御
いくつかの実施形態において、生体適合性クリスタリン含有材料は、数時間～数日の範囲の時間にわたる拡散および／または浸透によって、活性剤を標的部位にゆっくりと送達する。特定の実施形態において、薬剤は標的部位に直接送達される。いくつかの実施形態において、活性剤を含む生体適合性クリスタリン含有材料を標的部位に送達する手順は、必要であれば数回繰り返される。他の実施形態において、活性剤は、材料の生分解により、生体適合性クリスタリン含有材料から放出される。いくつかの実施形態において、活性剤は、拡散、浸透、および／または分解メカニズムの組み合わせを介して放出される。特定の実施形態において、材料からの活性剤の放出プロファイルは単峰性である。いくつかの実施形態において、材料からの活性剤の放出プロファイルは二峰性である。特定の実施形態において、材料からの活性剤の放出プロファイルは多峰性である。

いくつかの実施形態において、活性剤は、拡散または浸透により、生体適合性クリスタリン含有材料から放出される。特定の実施形態において、活性剤は、１８０日以内に生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。いくつかの実施形態において、活性剤は、１４日以内に生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。特定の実施形態において、活性剤は、２４時間以内に生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。いくつかの実施形態において、活性剤は、１時間以内に生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。

特定の実施形態において、活性剤は、約１８０日、約１５０日、約１２０日、約９０日、約８０日、約７０日、約６０日、約５０日、約４０日、約３５日、約３０日、約２８日、約２１日、約１４日、約１０日、約７日、約６日、約５日、約４日、約３日、約２日、約１日、約０．５日、約６時間、約４時間、約２時間、約または１時間以内に、生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。いくつかの実施形態において、活性剤は、１８０日よりも長く、１５０日よりも長く、１２０日よりも長く、９０日よりも長く、８０日よりも長く、７０日よりも長く、６０日よりも長く、５０日よりも長く、４０日よりも長く、３５日よりも長く、３０日よりも長く、２８日よりも長く、２１日よりも長く、１４日よりも長く、１０日よりも長く、７日よりも長く、６日よりも長く、５日よりも長く、４日よりも長く、３日よりも長く、２日よりも長く、１日よりも長く、０．５日よりも長く、６時間よりも長く、４時間よりも長く、２時間よりも長く、１時間またはよりも長く、生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。特定の実施形態において、活性剤は、１８０日よりも短く、１５０日よりも短く、１２０日よりも短く、９０日よりも短く、８０日よりも短く、７０日よりも短く、６０日よりも短く、５０日よりも短く、４０日よりも短く、３５日よりも短く、３０日よりも短く、２８日よりも短く、２１日よりも短く、１４日よりも短く、１０日よりも短く、７日よりも短く、６日よりも短く、５日よりも短く、４日よりも短く、３日よりも短く、２日よりも短く、１日よりも短く、０．５日よりも短く、６時間よりも短く、４時間よりも短く、２時間よりも短く、１時間またはよりも短く、生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。いくつかの実施形態において、活性剤は、約１日～約１４日以内に、生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。特定の実施形態において、活性剤は、約１日～約７０日以内に生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。

いくつかの実施形態において、活性剤は生体分子であり、材料からの生体分子の放出は、材料の組成によって制御される。特定の実施形態において、生体分子は、材料が分解し始めるときに放出される。

いくつかの実施形態において、活性剤は細胞またはその集団であり、材料からの細胞または集団の放出は、材料の組成によって制御される。

いくつかの実施形態において、生体適合性材料は、活性剤を含み、活性剤は、拡散、浸透、生体適合性クリスタリン含有材料の分解、またはそれらの任意の組み合わせにより、生体適合性クリスタリン含有材料から放出される。特定の実施形態において、活性剤は、最初に、拡散により生体適合性クリスタリン含有材料から放出され、その後、生体適合性クリスタリン含有材料の分解により放出される。

いくつかの実施形態において、活性剤は、１８０日以内に生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。

特定の実施形態において、活性剤は、２４時間以内に生体適合性クリスタリン含有材料から実質的に放出される。

いくつかの実施形態において、生体適合性クリスタリン含有材料は、活性剤と相互作用するか、または活性剤に結合する。特定の例において、活性剤の１０％超が、生体適合性クリスタリン含有材料の分解によって放出される。

特定の実施形態において、活性剤の放出は、生体適合性クリスタリン含有材料の組成によって決定される。特定の実施形態において、活性剤の放出は、生体適合性クリスタリン含有材料が分解し始める時まで本質的に阻害される。

特定の実施形態において、生体適合性クリスタリン含有材料が分解し始める時間が長くなるほど、生体適合性クリスタリン含有材料の架橋度が高くなる。

いくつかの実施形態において、活性剤は、薬学的に活性な生体分子である。特定の実施形態において、薬学的に活性な生体分子は、タンパク質、酵素、またはペプチドである。いくつかの実施形態において、薬学的に活性な生体分子は抗体である。特定の実施形態において、薬学的に活性な生体分子はワクチンである。いくつかの実施形態において、薬学的に活性な生体分子はオリゴヌクレオチドである。

例示的なキットおよび方法
一実施形態において、本明細書に記載される架橋された生体適合性クリスタリン含有組成物を含む外科用キットが、任意選択的には、架橋された生体適合性クリスタリン含有組成物を標的部位に送達するための説明書と共に、任意選択的には、架橋された生体適合性クリスタリン含有組成物を標的部位に送達するための装置と共に提供される。

本明細書でさらに提供されるのは、ａ）本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質を含む組成物と、ｂ）架橋剤と、を含むキットであって、生体適合性クリスタリン含有材料が、組成物と架橋剤を混合した後に形成される、キットである。

また、ここに提供されるのは、ａ）本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質を含む組成物と、ｂ）可塑剤と、ｃ）架橋剤と、を含むキットであって、生体適合性クリスタリン含有材料が、組成物、可塑剤および架橋剤を混合した後に形成される、キットである。

また、本明細書で提供されるのは、ａ）本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質を含む組成物を、任意選択的に可塑剤と共に含み、かつ、ｂ）架橋剤を含むキットであって、生体適合性クリスタリン含有材料が、組成物と架橋剤を混合した後に形成される、キットである。

本明細書でさらに提供されるのは、本明細書に記載されるインビボゲル化または架橋医薬組成物を調製するためのキットであって、本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質を含む組成物を含む第１の容器であって、任意選択的に可塑剤を含む、第１の容器と、架橋剤を含む第２の容器と、任意選択的に、１つ以上の活性剤を含む１つ以上の追加の容器と、任意選択的に、緩衝液を含む容器と、任意選択的に、混合容器と、混合容器内の各容器内に存在する材料を混合するための説明書、および／または生体適合性クリスタリン含有材料を生成するための架橋のための説明書と、生体適合性クリスタリン含有材料を標的部位に送達するための説明書と、を含む、キットである。

また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるインビボゲル化または架橋医薬組成物を調製するためのキットであって、本明細書に記載される生体適合性クリスタリン含有組成物を含む第１の容器であって、任意選択的に可塑剤を含む、第１の容器と、任意選択的に、架橋剤を含む追加の容器と、任意選択的に、１つ以上の活性剤を含む１つ以上の追加の容器と、任意選択的に、緩衝液を含む容器と、任意選択的に、混合容器と、混合容器内の各容器内に存在する材料を混合するための説明書、および／または生体適合性クリスタリン含有材料を生成するための架橋のための説明書と、生体適合性クリスタリン含有材料を標的部位に送達するための説明書と、を含む、キットである。

様々な実施形態において、本明細書に記載されるキットのうちの１つ以上は、共開始剤を含む容器などの共開始剤をさらに含む。

本明細書に記載される材料および方法の特定の用途では、架橋材料のインサイチュ形成が標的とされる。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物のインサイチュ架橋は、接着剤組成物のものであり、それにより、接着効果を提供する。そのようなインサイチュ架橋は、本明細書の実施例に例示されている。

他の実施形態において、インサイチュ架橋に使用される組成物は、ヒドロゲル材料を提供する。ここで、組成物は、保護されるべき部位で患者の体内に導入されるまで、完全には架橋されないことが有利である。

この場合の組成物は、注射可能な形態または噴霧可能な形態で使用することができ、外科的介入に関連して使用することも可能であるが、低侵襲的に使用することが好ましい。

特定の実施形態において、この場合の組成物は、例えば、それを体内に適用する直前に、架橋剤と混合され、次いで、この混合物は、架橋がインサイチュでのみ進行するような方法で、液体またはスプレーとして患者の体内に導入される。しかしながら、組成物および架橋剤を、保護されるべきヒトまたは動物の患者の体内の部位に対して別々に実施し、そこでそれらを混合することも想定される。さらに、例えば、光架橋剤が使用される場合、架橋剤を含む組成物を標的部位に対して実施し、その後、適切な波長の光への曝露によって架橋が開始されることが想定される。

インサイチュで使用するための組成物、特にさらなる開始ステップ（光活性化など）なしに架橋剤の添加時に架橋が起こる組成物は、特定の実施形態において、外科的または低侵襲性適用の直前に生成され、次いでスプレーとして、インプラントとして、液体として、プラグとして、またはゲルフィルムとして使用される。

したがって、架橋が、クリスタリンタンパク質含有組成物との混合を行った後にさらなる開始を必要としない実施形態において、材料は、その生成のためのすべての成分が存在した後、患者の体内またはその上に導入される。このような場合、材料は、塗布前、塗布中、または塗布後に完全に架橋する。

薄膜フィルムまたはヒドロゲルなどの完全に架橋された材料の移植を伴う実施形態において、材料のいくらか固体の粘稠度が好ましく、これにより、材料の実際の取り扱いが可能になるか、または容易になる。この場合の材料の固さまたは流体特性の程度は、架橋度によって設定することができ、材料は、より固体であるほど、より架橋されるか、または薄膜フィルムとの関連では、乾燥の程度は堅牢性にも貢献する。したがって、ゲルの流体特性は、液体の流体特性と固体の流体特性との間にある。

したがって、本発明はまた、記載された組成物を含む第１の容器を有し、接着剤材料、ヒドロゲル形成材料、または薄膜フィルム材料などのクリスタリンタンパク質含有材料のインサイチュ生成に使用するための組成物用の架橋剤を含む第２の容器を有するキットに関する。

当業者は、本開示および本明細書で提供される実施例のガイダンスにより、組成物および架橋剤が、それぞれの所望の治療に好適な架橋された生体適合性クリスタリン含有組成物が形成されるように、互いに一致し得ることを認識するであろう。

この場合、架橋速度、粘度、吸収動力学などは、適用される成分、例えば、本明細書で企図されるようなキットに存在する成分が、別々にまたは一緒に噴霧可能であるか、または液体として注射可能であるように調整することができる。

本明細書に記載される組成物が、例えば液体状態で、外傷を受けた無傷の組織表面に、または外科的に除去もしくは切開された組織に適用できることが、そのような使用の１つの利点であると理解されるであろう。

例えば、本明細書に記載される組成物は、特定の実施形態において、例えば液体としてまたはスプレーとして、低侵襲性の方法で問題なく容易に使用される。特定の実施形態において、得られたゲルまたは接着剤は、任意の不均一な組織表面を含む組織に適合または接着する。特に企図された実施形態は、同様に、著しく流動することなく、乾燥組織上および湿った組織表面上での形成に適している。

結果として、本明細書で提供される組成物の特定の実施形態の１ｍｍ未満の層厚でさえ、構造的完全性および／または凝集を維持するのに十分に頑強であるため、組織表面上に非常に薄い層を形成することができる。

特定の実施形態において、所望の場合、生体適合性は、例えば、約２１日未満、例えば、約１４日未満の滞留時間内に急速に再吸収される。

大半の場合、本明細書で企図される治療用途が、典型的には、非常に高度の生体適合性を有し、炎症、瘢痕、病理学的もしくは望ましくない組織形成、病理学的もしくは望ましくない血管新生、または病理学的もしくは望ましくない神経新生を引き起こさない組成物および材料を必要とすることが理解されるであろう。

さらに、本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質を含む特に企図される生体適合性材料、特に外科的使用のための生体適合性材料は、例えば注射もしくは噴霧によって主に液体状態にある間、架橋前もしくは架橋中に適用できるか、または、例えばゲルもしくは薄層として架橋の完了時に適用することができるため、堅牢かつ取り扱いが容易である。噴霧または注射の場合、例えば架橋を開始するために必要な場合、保護されるべき体の部位の直前またはその部位で、あるいはこの部位から離れたところで成分を組み合わせることができる。

一般に、本明細書に記載される組成物および材料は、縫合または他の切開もしくは創傷保持手段を必要とせずに外科的状況での使用に好適であり、それにより、瘢痕、異常組織形成、および他の合併症を最小限に抑える。

以下の実施例を参照して本発明をさらに説明する。特許請求される本発明は、これらの実施例によって決して限定されることを意図するものではないことが理解されよう。

実施例１：精製された天然クリスタリンタンパク質の調製
本実施例では、クリスタリンタンパク質の天然構造が保持されている精製クリスタリンタンパク質組成物の調製について説明する。

材料および方法
新鮮なヒト角膜強膜縁を、ニュージーランド国立アイバンクからの倫理承認を得て入手した。利用された初代角膜上皮細胞株は、伝統的に、同じくニュージーランド国立アイバンクから供給された組織からの液体窒素に由来し、その中に保存されていた。ヒト羊膜はニュージーランド国立アイバンクから供給された。

ホキ魚の頭は商業的な水産業者から入手した。水晶体を社内で取り出し、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに約１２ｇのロットで分注し、－２０℃で保存した。ブタ眼は、商業的な供給業者から入手した。クリスタリンの抽出および特徴付けのために、水晶体をホキ由来の水晶体と同じ方法で処理した。

溶液および培地
特に指定のない限り、使用したＭｉｌｌｉ－Ｑ水の抵抗率は１８．２ＭΩ．ｃｍ^－１であり、オートクレーブ処理してから使用した。濾過したＭｉｌｌｉ－Ｑを０．２０μｍの酢酸セルロース膜（ＧＶＳ Ｆｉｌｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＦＪ１３ＡＳＣＣＡ００２ＤＬ０１）でシリンジ濾過した。

水晶体クリスタリン抽出
水晶体クリスタリン抽出のために、眼の水晶体の秤量したアリコートを解凍し、ホモジナイザー容器（ＩＫＡ ＵＬＴＲＡ－ＴＵＲＲＡＸ Ｔｕｂｅ Ｄｒｉｖｅ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）に入れた。クリスタリン抽出緩衝液は、水晶体１グラムあたり２ｍＬの緩衝液の比率で添加した。次に、ホモジナイザーを５分間隔で作動させ、水晶体の固形物が分散するまで（約３０分）、氷上での５分の冷却相を複数回挟んでいた。得られた泡状溶液を５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに注いだ。この時点で、残っている大きな不溶性水晶体片をすべて取り除いた。次に、クリスタリン溶液を４１２２×ｇで４℃で３０分間遠心分離した。次に上清を１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに分配し、９６００×ｇで３０分間再度遠心分離した。得られたクリスタリン上清をクリーンなＦａｌｃｏｎチューブにデカントした。

抽出緩衝液を除去するために、５％ｖ／ｖグリセロールをクリスタリン溶液に添加してから、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセットに製造元の指示に従って注入した。透析は、穏やかに撹拌しながら４℃で４時間、新鮮なのＭｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ_２Ｏ中で行われた。カセットあたり約２ＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ_２Ｏを使用し、１時間ごとに新鮮なものと交換した。完了したら、溶液をカセットから取り出し、最終液量が１５ｍＬ以下となるように５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに分注した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを実行して、溶液を凍結乾燥する前の濃度および予想収量を決定した（Ｃｈｒｉｓｔ Ａｌｐｈａ ２－４ ＬＤ ｐｌｕｓ、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｉｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。凍結乾燥したクリスタリンは、使用するまで－２０℃で保存した。

クリスタリン抽出プロセスの典型的な収量は３６～４８％で、次のように計算される。均質化および遠心分離後の約１ｇの出発物質（例、ホキ眼の水晶体）により、クリスタリンタンパク質濃度が１８０～２４０ｍｇ／ｍＬ（すなわち、３６０～４８０ｍｇの総クリスタリンタンパク質）の範囲内である２ｍＬのクリスタリンタンパク質抽出物が得られる。

実施例２：精製および組換えクリスタリンタンパク質の特徴付け
本実施例では、上記の実施例１で説明したように調製したクリスタリンタンパク質の特性を説明する。

抽出されたタンパク質サンプルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってクリスタリンタンパク質の存在について評価した。ホキ水晶体サンプルの代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを図１および図２ａに示す。クリスタリンタンパク質には、α、βおよびγと呼ばれる３つの異なるクラスがあり、これらのクラスはそれぞれ異なるサブユニットを有する。α－クリスタリン複合体は、２０ｋＤａサブユニットの非常に不均一な凝集体であり、約３００～１０００ｋＤａの多量体をもたらす。β－クリスタリンは、２０～３０ｋＤａのサブユニットから形成される約５０～２００ｋＤａの小さな複合体として存在し、γ－クリスタリンは約２０ｋＤａの単量体として存在する（Ｅｃｒｏｙｄ ａｎｄ Ｃａｒｖｅｒ，２００９）。予想通り、抽出されたサンプルはさらに精製されていないため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより３つのクラスのクリスタリンタンパク質すべての存在が確認された。これらの３つのクラスのクリスタリンタンパク質は、ヒト水晶体（図２ｂ）およびブタ水晶体（図２ｃ）からの抽出物でも観察された。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に続いて、図３に示すように、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、ホキから抽出されたクリスタリンタンパク質をさらに３つのクラス、α、βおよびγに半精製した。全αクリスタリン、全βクリスタリンおよび全γクリスタリンに対応するピーク画分は、それぞれ赤、青および緑のボックスで識別される。ホキ水晶体（図４ａ）、ヒト水晶体図４ｂ）、およびブタ水晶体（図４ｃ）から抽出されたクリスタリンタンパク質のさらなるＳＥＣ分析は、α－、β－、およびγ－クリスタリンピークの分離を再び示した。

組換えヒトα－クリスタリンが発現し、それを精製し（Ｈｏｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９８に記載されるように）、次いで、図５に示すようにＳＤＳ－ＰＡＧＥで特徴付けして、精製α－クリスタリンのサイズがその予測サイズである２０ｋＤａと一致することが明らかになった。

本明細書の図６、７および８は、様々な種からのクリスタリンタンパク質の様々なアミノ酸配列アラインメントを示し、これらのタンパク質間の類似性の程度を明確に示している。図６ａは、Ｄ．ｒｅｒｉｏおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓ由来のαＢ－クリスタリンタンパク質のアミノ酸配列アラインメントであり、図６ｂは、Ｄ．ｒｅｒｉｏおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓ由来のβＡ４－クリスタリンタンパク質のアミノ酸配列アラインメントであり、図６ｃは、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、Ｂ．ｔａｕｒｕｓおよびＤ．ｒｅｒｉｏ由来のγＢ－クリスタリンタンパク質のアミノ酸配列アラインメントである。

図７は、いくつかの脊椎動物のαＡ－クリスタリンオルソログのアミノ酸配列アラインメントである（Ｒｕｎｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００２（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ４３，Ｉｓｓｕｅ ４，Ａｕｇｕｓｔ ２００３，Ｐａｇｅｓ ４８１－４９１，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｉｃｂ／４３．４．４８１から改作））。ゼブラフィッシュタンパク質の残基６４～１４１は、α－クリスタリンドメインに相当する。

図８は、いくつかの脊椎動物のαＢ－クリスタリンオルソログのアミノ酸配列アラインメントである（Ｐｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ４３，Ｉｓｓｕｅ ４，Ａｕｇｕｓｔ ２００３，Ｐａｇｅｓ ４８１－４９１，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｉｃｂ／４３．４．４８１から改作））。

ホキ水晶体抽出物からの精製クリスタリンタンパク質をさらに特徴付けるために、円二色性（ＣＤ）およびフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法を使用してタンパク質構造を調査した。図９に見られるように、ホキ魚水晶体からの粗クリスタリン抽出物のＣＤスペクトログラムは、クリスタリンのβシート構造を示す２１７ｎｍを中心とする最小値を示した。これは、ウシクリスタリン、ウシおよびヒトα－クリスタリン、およびマジェランアイナメ（ｔｏｏｔｈｆｉｓｈ）γクリスタリンに関する文献の以前の報告と一致している。図１０に示すようにＦＴＩＲ分光法で観察されたβシート構造を表す１６３１ｃｍ^－１の有意なピークは、クリスタリンタンパク質の天然構造が上記の方法を使用した抽出および精製後に保存されていることをさらに確認した。

実施例３：精製クリスタリンタンパク質の機能的特徴付け
本実施例では、上記の実施例１で説明したように調製したクリスタリンタンパク質の機能的特徴付けについて説明する。

特定のクリスタリンタンパク質のシャペロン様の抗凝集機能を調べた。簡単に説明すると、リゾチームのＴＣＥＰ誘導性凝集に対するホキクリスタリン抽出物による保護を評価した。これにより、リゾチーム（１０μＭ）をホキ魚水晶体から得られた１０ｍｇ／ｍＬクリスタリン抽出物と組み合わせ、３７℃でインキュベートした。４００ｎｍでの吸光度を測定することにより、光散乱の変化について溶液をモニターした。

クリスタリンの存在下で観察された光散乱の減少（図１１、黒の点線）は、ホキクリスタリン抽出物の非存在下でのリゾチーム＋ＴＣＥＰと比較して、リゾチームが凝集から保護されていることを示している（図１１、黒色の実線）。リゾチームのみの対照は、ＴＣＥＰの非存在下で光散乱を示さなかった（図１１、灰色の実線）。

次に、哺乳動物細胞に対する精製クリスタリンタンパク質との生体適合性およびその効果を調べた。まず、クリスタリン抽出物が哺乳動物細胞と生体適合性があることを確認するために、ホキ水晶体抽出物から精製したα－、β－、およびγ－クリスタリン画分（１０ｍｇ／ｍＬ）の存在下でヒト角膜上皮細胞を培養した。図１２に示した細胞のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色の代表的な画像に示されているように、クリスタリンの存在は、対照（すなわち、クリスタリンの非存在下）と比較して、細胞の生存率に悪影響を及ぼさなかった。

粗クリスタリン抽出物は、哺乳動物の細胞増殖にプラスの影響を与えることが示された。無血清培地または１０％ＦＣＳを補充した培地の存在下で２４時間、ヒト角膜上皮細胞をホキクリスタリンタンパク質で処理した後、ＭＴＴアッセイを行った。どちらの場合も、図１３に示すように、クリスタリンタンパク質の濃度が高くなると、細胞増殖も増えた。

次に、ホキ魚水晶体からの粗クリスタリン抽出物が、哺乳動物細胞を生物学的ストレスから保護することが示された。酸化ストレスに対する細胞応答のアッセイにおいて、ヒト角膜上皮細胞を１０μＭのＨ_２Ｏ_２で処理した後、クリスタリンとインキュベートした。図１４に示すように、ＭＴＴアッセイの結果は、高濃度（５～２０ｍｇ／ｍＬ）の粗クリスタリン抽出物が、Ｈ_２Ｏ_２に曝露されたときに観察可能な細胞生存率の増加をもたらし、酸化ストレスに対する粗クリスタリン抽出物の保護効果を確立することを示した。

本実施例で報告された研究により、本明細書に記載される方法を使用して調製されたクリスタリンタンパク質が、その天然構造だけでなく、生物学的に重要な機能も保持することが明確に実証された。

実施例４：クリスタリンタンパク質を含む薄膜フィルム組成物の調製
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含む薄膜フィルム組成物の調製について説明する。

無菌性を維持するために、クラス２フードでフィルムキャスティングを行った。上記実施例１に記載のように調製された凍結乾燥クリスタリンを、濾過滅菌されたＭｉｌｌｉ－Ｑ水に再懸濁した。成分容量（以下の表３に記載）を次の順序で滅菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆに添加した：クリスタリンストック、グリセロール、水、添加剤、架橋剤（ｃｒｏｓｓ ｌｉｎｋｅｒ）。

一貫した架橋条件を確保するために、各架橋剤は、溶液をキャストする直前にのみ溶液に添加した。適切に混合するために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆを約１０回反転させた。

細胞培養で使用されるフィルムの場合、５０μＬの溶液を１３ｍｍのガラス製カバースリップにキャストし、ピペットチップを使用して端まで広げた。毛細管現象により溶液が下に引き込まれて、カバースリップがキャスティング皿にしっかりと接着するため、溶液がカバースリップの縁から溢れ出ないように注意した。フィルムを３７℃の乾燥オーブンで４８時間乾燥させた。リボフラビンフィルムを、オーブン乾燥の前に、フード滅菌ＵＶ光の下で３０分間ＵＶ処理した。

フィルムは、４８時間の乾燥期間の直後に使用するのが好ましく、使用しない場合には、パラフィルムで密封されたキャスティング皿に室温で保存した。

実施例５：クリスタリンタンパク質を含む薄膜フィルム組成物の機能的特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含む薄膜フィルム組成物の機械的特徴の評価について説明する。

方法
この試験に使用されたフィルムを、３８ｍｍの円形ＰＤＭＳモールド上に３ｍＬでキャストした。キャスティングおよびＵＶ架橋（適切な場合）に続いて、フィルムを室温で２４時間乾燥させ、続いて３７℃で４８時間乾燥させた。割り当てられた乾燥時間が完了した直後に、試験を実施した。

試験のために、可能な限り多くの材料が確実に残るように注意しながら、メスを使用して円形フィルムを正方形に切断した。マイクロメータ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）を使用して、フィルムの四隅および中央の厚さを測定し、後の計算で使用するために平均した。次に、５ｍｍ幅のテンプレートを使用してサンプルをストリップに切断し、それらの真の最終幅をノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）で取得した。各フィルムタイプについて、４つのストリップを得て、試験した。

試験は、１０Ｎロードセルおよび１０ｍｍ／分の伸長速度を使用してＩｎｓｔｒｏｎ ５５４４に対して実施した。ゲージの長さは１０ｍｍに設定し、サンプルが滑らないようにクランプ上にサンドペーパーを置いた。乾燥フィルムストリップを、破損するまで試験した。

フィルムの中央ではなくクランプでの破損は、一般にヌルの結果とみなされるが、１００％のサンプルが試験中このように破損した。結果の継続を選択したが、この破損モードのために、すべてが系統的に強度の点で過小表示されていることに注意する必要がある。

データを取得したら、平均厚さおよび個々のストリップ幅を使用して、各サンプルの断面積（Ａ）を求めた。記録された各時点でＩｎｓｔｒｏｎによって提示された荷重データ（Ｆ）を使用して、その時点で材料に加えられた応力（σ）（σ＝Ｆ／Ａ）を計算した。

サンプルの長さの変化（ΔＬ）として、各時点での伸長も記録した。初期ゲージ長（Ｌｉ）で割ると、サンプルにおけるひずみのパーセンテージ（ε％）は次のように計算される。

サンプルの上限引張強度（ＵＴＳ）は、ニュートン単位で加えられた最大荷重を断面積で割ることによって求めることができる。

材料のヤング率は剛性を表し、弾性段階でのサンプルの応力－ひずみ関係の勾配を求めることで決定できる。

結果
３ｍＬの溶液および７２時間の総乾燥時間を使用して、３８ｍｍのフィルムキャスティングをＰＤＭＳモールド上に作製した。得られたフィルムは、柔軟性があり、手触りが滑らかで、透明であった。

フィルムを５ｍｍ幅のストリップに調製する前に、フィルムの厚さをノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）を使用して決定した。処理後、断面積の正確な測定値を確保するために測定された処理済みサンプルの真の幅を、ＵＴＳを計算する際に使用した。中央および四隅で測定したフィルムの厚さにはばらつきがあった。これはおそらく、完全に平坦に配置されていない金型表面の不整合が原因である。

これらの組成物の試験中に、すべてのサンプルがクランプで破損した。材料が破損する原因となったのは縦方向に加えられた力ではなく、引張力とクランププロセスによって与えられた損傷との組み合わせであるため、これは、慣行通りに、失敗の結果とみなされる。したがって、ここで報告されている薄膜フィルムの上限引張強度スコアは、フィルム強度の系統的な過小表示である。

図１５に示すように、Ｆ２のＵＴＳは０．３６３±０．０２１３ＭＰａと最も低く、ヤング率スコアが１．６５±０．６６３ＭＰａで最も弾性が大きいことが証明された（図１６）。Ｆ３のＵＴＳは０．６７３±０．０２７２ＭＰａ、ヤング率は２．８９±０．７８０ＭＰａであった。Ｆ４のＵＴＳおよび弾性率はそれぞれ０．６４４±０．０４７８５ＭＰａおよび３．３０±０．７３５ＭＰａであった。

配合物の中で最も弾性が低いのはＦ５で、弾性率スコアは４．４６±０．４５５ＭＰａであった。このスコアは、報告されている早産羊膜の弾性の標準偏差（３．６０±１．４ＭＰａ水和（Ｂｅｎｓｏｎ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６））の範囲内であり、これらのフィルムが現在のゴールドスタンダード担体と同等またはそれ以上の弾性を有することを示唆している。Ｆ５のＵＴＳは０．６２６±０．１０８ＭＰａで、Ｆ３およびＦ４のＵＴＳに匹敵していた。４つの組成物の伸長値を計算したところ、図１７に示すように、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４の各々がＦ５よりも統計的に有意に大きな伸長を示した。

Ｉｎｓｔｒｏｎ ５５４４を使用し、１０Ｎの負荷および１０ｍｍ／分の伸長速度で、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４配合物を用いて調製された乾燥フィルムの追加試験の結果を、以下の表５に提示する。

表５からわかるように、以前の試験と同等の結果が見られ、機械的特徴の再現性が優れたフィルムを調製できることが示された。

考察
試験した４つの配合物から形成された薄膜フィルムの機械的特性は、担体材料としてのそれらの好適性を裏付けている。Ｉｎｓｔｒｏｎ保持クランプでのサンプルの早期破損により系統的に過小表示されても、各試験フィルムは、羊膜の報告された上限引張強度（空気乾燥で保存した場合は１８．４±８．２３Ｐａ、グリセロールで保存した場合は９．９±４．１４Ｐａ（ｖｏｎ Ｖｅｒｓｅｎ－Ｈｏｅｙｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００８））を数桁超えている。しかしながら、文献で報告されたこれらの値は水和引張試験であったが、本実施例で試験したサンプルは乾式試験であった。

Ｆ２フィルムのＵＴＳ強度スコアは０．３６３±０．０２１３ＭＰａと最低であった。それにもかかわらず、これはグリセロール保存された羊膜の強度と４５５００倍異なることを表している。出産羊膜のヤング率は２．２９±０．７ＭＰａ、早産羊膜のヤング率は３．６０±１．４ＭＰａである（Ｂｅｎｓｏｎ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。Ｆ２のヤング率は１．６５±０．６６３ＭＰａであった。

ヤング率は、材料の剛性の尺度を表し、スコアが大きいほど剛性は大きくなる。逆に、スコアが低いほど、材料の弾性－弾性変形を受け、変形力が取り除かれた後に元の形状に戻る能力が高いことを示す。したがって、Ｆ２は、ヒト羊膜よりも強力かつ高弾性である。

Ｆ３～Ｆ５の上限引張強度は、それぞれ０．６７３±０．０２７２ＭＰａ、０．６４４±０．４９０ＭＰａおよび０．６２６±０．１０８ＭＰａで、Ｆ２よりも大きかった。上で考察したように、これらの結果は、サンプルがクランプで破損したためにこれらの材料の真の強度を過小表示しており、クランプ手順によって試験中に材料が弱化したことを示している。

これらの配合物の中で最も弾性が低いのはＦ５で、ヤング率は４．４６±０．４５５ＭＰａであった。この弾性率は、報告されている早産羊膜の弾性の標準偏差（３．６０±１．４ＭＰａ（Ｂｅｎｓｏｎ－Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６））の範囲内であり、すべてのクリスタリン含有配合物が現在のゴールドスタンダード担体と少なくとも同等またはそれ以上の弾性であることを示唆している。病変組織に物理的ストレスを加えることなく患者の眼の形状に合致する能力は、輪部幹細胞担体としての使用にとって極めて重要であることが理解されるであろう。

本明細書に記載される組成物を望ましく使用することができる外科的用途を含む多くの用途は、ある程度の寸法安定性を必要とすることがさらに理解されるであろう。ＵＶ硬化によって調製されたクリスタリンヒドロゲルの膨潤挙動を評価した。図１８は、対照（ＰＥＧＤＡのみ）、およびＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２４時間膨潤した後の６％および１２％クリスタリンベースのヒドロゲルの膨潤率を示している。明確にわかるように、６％および１２％クリスタリンヒドロゲルの両方について、ＰＥＧＤＡ対照と比較して膨潤の低下が観察され、これは膨潤特性の改善を示している。

実施例６：クリスタリンタンパク質を含む組成物の生体適合性の特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含む薄膜フィルム組成物の生体適合性の評価について説明する。

材料および方法
細胞培養
Ｎｉｋｏｎ Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎでのサンプル培養および生細胞イメージングを、３７℃、５％ＣＯ_２、周囲湿度で行った。上皮細胞培地（ＭＥＭ、１０ｍＬ（１０％）ＦＳＣ、１ｍＬ（１％）Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ（１００ｍＬあたり））、および外植片培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０ｍＬ（１０％）ＦＣＳ、５０μＬ ＩＴＳ、１００μＬ ＥＧＦ、１ｍＬ（１％）Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ（１００ｍＬあたり））を使用した。細胞の成長速度に応じて、培地交換の間隔を変えた。おおむね、３～４日ごとに５０％の培地交換を行った。細胞フラスコが８０％のコンフルエンシーに近づいたら、それらを継代し、過剰な細胞はフィルム培養に使用するか、または廃棄した。

Ｇｉｂｃｏ（商標）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（１×）Ｎｏ Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ（Ｇｉｂｃｏ、１２６０４－０１３）および適切な培地を水槽で３７℃に温めた。フラスコからの培地を廃棄物に注ぎ、少量の温めたＰＢＳをフラスコに加えて、残っている血清エステラーゼ活性を希釈した。すすいだ後、ＰＢＳも廃棄物に注いだ。フラスコの底を完全に覆うのに十分なＴｒｙｐＬＥ（商標）を加え、３７℃で１０～１５分間振とうしながらインキュベートした。インキュベーション時間が経過すると、細胞接着が観察された。大量の細胞がまだなお付着している場合は、フラスコの内容物を収集し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）処理を繰り返した。すべての細胞を分離して収集したら、懸濁液を３８０×ｇで７分間穏やかにペレット化した。次に、上清を廃棄し、細胞を、予想される細胞数に適した容量の培地（コンフルエントなＴ７５の場合は１～３ｍＬ）に穏やかに再懸濁した。

細胞数をカウントするために、１０μＬの細胞懸濁液を１０μＬのＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ６１４６）に加えた。１０μＬの混合物をピペットでカウントグリッドに移し、倍率１０倍で観察した。３つのグリッド領域を斜めにカウントした後、次の式を実行して総細胞数を取得した。
（カウントされた細胞の数／カウントされた領域の数）×２（希釈係数）×１０^４（細胞の大きさ）＝細胞／ｍＬ
細胞／ｍＬ×細胞懸濁液のｍＬ＝細胞総数

次に、適切な容量の懸濁液をフラスコに播種して、フラスコのサイズに必要な播種密度に等しい数の細胞を提供した。フィルムあたり１×１０^４個の細胞を、上皮細胞フィルム播種のために播種した。

免疫組織化学
サンプルを、染色する前に３７℃および５％ＣＯ_２で７、１４または２８日間培養した。フィルムをそれらの初期培養ウェルから新たな滅菌プレートウェルに移して処理した。フィルムがキャスティングカバースリップから分離した場合には、フィルムを別途動かした。後にスライドを形成するときに新たなカバースリップを使用して、フィルムではなくガラスに付着した細胞を視覚化する頻度を低下させた。サンプルをＰＢＳで５×５分間洗浄して培地を除去し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２０分間固定した。ＰＦＡを除去し、サンプルをＰＢＳで３×１０分間洗浄した。

固定後、サンプルを－２０℃で１０分間メタノールで透過処理し、ＰＢＳで３×１０分間再度洗浄した。血清ブロッキングは、１００ｍＭグリシン、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、およびＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清中、シェーカー上で２時間サンプルをインキュベートすることによって行われた。ＰＢＳで３×１０分間洗浄する。

一次抗体をＰＢＳ－Ｂ（ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ）＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で調製し、サンプルをそれらの適切な抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－Ｂで３×１０分間洗浄することにより、非結合抗体を除去した。二次抗体のインキュベーションは、ＰＢＳ－Ｂ中で室温にて３時間行った。ＰＢＳで３×１０分間洗浄した。

核染色は、シェーカー上で、暗所にて６０分間、ＰＢＳ中の４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）処理を通じて達成された。フィルムをＣｉｔｉｆｌｏｕｒ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７９７０２５）中のスライドに載置し（未付着フィルム用に新たなカバースリップを置いた）、マニキュアで密封する前に、５×ＰＢＳですすぎ、残ったＤＡＰＩをすべて除去した。

フィルム上の細胞株培養はＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｌｉｄｅ（ＬａｂＳｅｒｖ、ＬＢＳ４９５１＋）上で行い、フィルムまたは羊膜上での外植片培養はＳｉｎｇｌｅ Ｃｏｎｃａｖｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｌｉｄｅｓ（Ｓａｉｌ Ｂｒａｎｄ、７１０３）上で行った。

本実施例で説明する実験には免疫組織化学が含まれ、顕微鏡スライドに載置されたサンプルの作製が必要になるため、薄膜フィルム配合物の試験用薄膜フィルムキャスティングを円形ガラスカバースリップ（Ｋｎｉｔｔｅｌ Ｇｌａｓｓ）上に直接作製した。試験した容量は、１０μＬ、５０μＬ、１００μＬおよび１５０μＬであった。１００μＬおよび１５０μＬの容量では、乾燥プロセス中に亀裂が縁に発生したより厚いフィルムが作製され、１０μＬではほとんど知覚できないフィルムが形成されることがわかった。５０μＬのキャスティングは縁での変形が制限されており、視覚的には完全なフィルムを形成したため、将来のキャスティング用に選択された。

クリスタリンタンパク質フィルムの細胞担体としての好適性の初期試験では、細胞集団を長期間維持および拡大できるかどうかを調査する必要があった。角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）の治療では、細胞を羊膜上で３週間培養した後、眼表面に外科的に移植する。臨床治療による細胞移植の成功が報告されている最小接触時間は３日であった。しかしながら、患者の眼への最適な細胞移入には、１週間を超える接触時間が好ましい。したがって、Ｆ２フィルムには、２つの社内ヒト角膜擦過細胞株（本明細書では細胞株１および細胞株２と呼ぶ）からの５０μＬの上皮培地中、１×１０^４個の細胞を播種し、２８日間培養しこれらの細胞の生存および拡大を評価した。

細胞接着および伸長は、７、１４および２８日目に光学顕微鏡で観察された。細胞を固定し、抗アルファチューブリン、抗サイトケラチン３／１２、または抗平滑筋アクチンで染色し、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８結合二次抗体を使用した。

薄膜フィルム培養物および対照培養物における参照遺伝子の遺伝子発現を、ＲＮＡ発現によって評価した。

結果
上記のように調製されたＦ２薄膜フィルム配合物は、高度に生体適合性であった。図６は、抗アルファチューブリンおよびＤＡＰＩ核染色で視覚化した、細胞播種後７、１４および２８日目のＦ２フィルム配合物の細胞接着および伸長を示している。

Ｆ２薄膜フィルムは、７日目に観察された実質的な細胞密度からわかるように、優れた初期細胞接着性を示した（図１９：Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ）。培養中の細胞伸長の観察（データは示さず）により、１４日以内に中心（播種位置）から縁までフィルム全体で細胞コンフルエントになることがわかった。図１９Ｃに見ることができるように、培養細胞の２８日目までに、細胞は過剰にコンフルエントになり、互いに成長し始めた。抗平滑筋アクチンおよびＤＡＰＩ核染色で染色された複製培養物でも同等の結果が観察された（データは示さず）。特に、培養の７日目から２８日目までの間に細胞形態の明白な変化は観察されず、これは、本明細書に記載される薄膜フィルム配合物が、培養を開始した見かけの間質細胞運命とは異なる細胞運命に細胞を向かわせていないことを示唆していた。

確かに、間質表現型は、角膜上皮遺伝子ＫＲＴ１２およびＫＲＴ３の発現が観察されなかった培養細胞のＲＮＡ発現分析によって裏付けられた（データは示さず）。ＣＯＬ４Ａ５の発現は眼に由来することを確認し、観察されたＫＲＴ１３発現の欠如は、結膜が汚染されていないことを示した（データは示さず）。ＡＣＴＡ２およびＶＩＭの発現は、時間経過を通じてほぼ一定であり、組織培養プラスチック上で成長した対照細胞と同様の倍数差であった（データは示さず）。ＰＣＮＡの発現は、組織培養プラスチック対照よりもすべての時点において、フィルム上で大きかった。最初の７日目の対照のフィルム配合物ではＡＢＣＧ２、ＴＰ６３およびΔＮＰ６３は検出されなかったが、２８日目の対照は弱い発現を示した。

図２０および図２１に示すように、Ｆ３およびＦ４薄膜フィルム配合物でも高い生体適合性が観察され、ヒト角膜上皮細胞のＤＡＰＩ染色により、Ｆ２配合物で観察されたものと同等の成長が示された。

実際、本明細書に記載されるように調製されたクリスタリンフィルム組成物の生体適合性は、培養中の細胞数が急速に増加するようなものであった。図２２に示すように、クリスタリン薄膜フィルム配合物は、培養１週目（図２２、左のグラフ）および培養２週目（図２１、右のグラフ）の両方で細胞数の複数倍の増加を支持し、全体として組織培養プレートのみの対照に匹敵する（図２１、中央のグラフ）。

全体として、クリスタリンを含む薄膜フィルムは増殖性細胞集団を支持し、組織培養プラスチック条件と同等の運命を維持する成長表面を提供した。

実施例７：クリスタリンタンパク質を含む組成物の生体適合性の特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含むさらなる薄膜フィルム組成物の生体適合性の評価について説明する。

材料および方法
組成物Ｆ１～Ｆ６（上記の表３を参照）から形成された薄膜フィルムであって、それぞれが６０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質と２％ｗ／ｖのグリセロールで構成されているが、示されているように、架橋剤、可塑剤または共開始剤が異なっていた。

すべての試験フィルムには、５０μＬの培地中、１×１０^４個の細胞を播種し、細胞を静置して接着させるために１０分してから追加の培地をオーバーレイした。その同じ日に、光学顕微鏡検査を実施して、その１０分間におけるフィルムへの初期細胞接着レベルを観察した。

結果
図２３に見られるように、細胞接着レベルはフィルム間で大幅に異なった。Ｆ３であるＲ５Ｐ＋Ｌ－アルギニンフィルム組成物（図２３、右上）が最も有望であるように見え、Ｆ４（図２３、左下）およびＦ２（図２３、上中央）が続いた。ＰＥＧＤＥフィルムであるＦ１（図２３、左上）およびＦ５（図２３、中央下）は、Ｆ２～Ｆ４と比較して接着レベルがかなり低下していた。Ｆ５にＲＧＤモチーフを追加しても、元のＦ１配合物よりも接着レベルが大幅に増加することはなかった。Ｆ６は不透明であり、それ以上の検討は行わなかった（図２３、右下）。

播種後４日目で、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色と組み合わせた顕微鏡を使用して、担体としての薄膜フィルム配合物の有効性を評価した（データは示さず）。目視検査から、Ｆ２およびＦ３は最大かつ同等の細胞保持を示した。Ｆ１、Ｆ４およびＦ５には細胞がほとんど存在しなかった。どの配合物にも死細胞は存在しなかった。Ｆ６は不透明なままであったため、細胞を視覚化することはできなかった。

実施例８：クリスタリンタンパク質を含む組成物の長期生体適合性の特徴付け
本実施例では、長期の細胞培養中のクリスタリンタンパク質を含む薄膜フィルム組成物の生体適合性の評価について説明する。

材料および方法
薄膜フィルムは、組成物Ｆ２、Ｆ３およびＦ４から形成した（上記の表３を参照）。ヒト初代角膜上皮細胞をこれらの薄膜フィルム上で７、１４および２８日間成長させ、ＤＡＰＩ核染色（青）および総アルファチューブリン（赤）で染色して、形態素解析のために細胞骨格を可視化した。

結果
図２４に見られるように、Ｆ２（図２４ａ）、Ｆ３（図２４ｂ）、およびＦ４（図２４ｃ）上で成長した細胞は、特にガラスのみの対照（図２４ｄ）と比較した場合、長期細胞培養の全期間にわたって、７日目（左）～１４日目（中央）に、そして再び２８日目（右）に、アラインメントおよび密度の増加を示した。アラインメントおよび密度の増加は、２０倍（上）および６３倍（下）の両方の倍率ですぐに明らかになった。

実施例９：クリスタリンタンパク質を含む組成物の生体適合性の特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含む薄膜フィルム組成物の生体適合性の評価について説明する。

材料および方法
角膜輪部外植片
輪部外植片は、ＵＶ処理されたクラス２フード内で採取した。簡単に説明すると、エタノールに浸したコルク板に滅菌ガーゼをピン固定した。滅菌された鉗子を使用して、ドナーの角膜縁を輸送媒体から取り出し、滅菌ガーゼ上に置いた。次に、エタノール滅菌ピンを使用して角膜縁をガーゼで覆われたボードにピン固定し、張力を加えて組織を伸ばして平らにするように配置した。メスを使用して、前縁表面の深さの１／３を切開し、余分な角膜および強膜組織を除去した。次に、前縁表面をフィレットで取り除き、ペトリ皿の蓋内の少量の輸送媒体に入れてから、幅１ｍｍの片に切断した。次に、外植片を培養表面に置き、１０分間静置して接着させた後、両側から培地を注意深く加えた。

羊膜ディスク
ヒト羊膜はニュージーランド国立アイバンクから入手し、－２０℃でニトロセルロース濾紙上のグリセロール中に保存した。組織培養の処理のために、羊膜表面を、ＴｒｙＰＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで１０分間インキュベートした後、細胞スクレーパーでやさしく掻き取り、表面を滅菌ＰＢＳですすいだ。次に、８ｍｍの滅菌生検パンチ（Ｍｉｌｔｅｘ、ＲＥＦ３３－３７）を使用して、培養用切片を得た。

ヒト角膜外植片伸長実験を、４つの代表的な薄膜フィルム配合物Ｆ２～Ｆ５に対して実行した。５人の個々のドナーを用いた外植片伸長実験、およびさらに２人のドナーを用いたＲＮＡ発現分析を実行した。

外植片実験のために、輪部の前部１／３の１ｍｍ片を解剖し、クリスタリン含有薄膜フィルム配合物上に置き、対照のゴールドスタンダード表面として羊膜を用いた。羊膜の複製を用いて、フィルム配合物ごとに３回の外植を実施した。

膨大な数の外植片伸長が生じたため、各生物学的複製の代表的な複製の染色およびイメージングを行ったが、すべての複製の生細胞光学顕微鏡検査を４つの時点で行った。

結果
すべてのドナー外植片からＦ２薄膜フィルム配合物への強い細胞伸長があった。最初の細胞は、培養４日目に組織から表面へと遊走するのが見えた。外植片はクリスタリンフィルムへと首尾よく接着し、１４日間のインキュベーションの過程で、３つのドナー外植片すべてがフィルム表面に十分に定着した（平均キャスティング直径約１２ｍｍ）。

Ｆ２薄膜フィルム上の輪部外植片の代表的な光学および蛍光顕微鏡による視覚化を図２５に示す。伸長物の組成は、インキュベーション時間およびドナーの両方に応じてさまざまであった。ドナー１および２からの伸長物は、外観が間質であり、伸長して高度に遊走性であり（例えば、図２５Ａ、２５Ｂを参照）、ビメンチン（赤）に対して陽性に染色された（図２５Ｄ）。比較すると、ドナー３は最初に上皮集団を拡大し、これは細胞の明確な玉石状形態の存在およびビメンチン染色の欠如によって実証された（データは示さず）。

ドナー１および２の間質伸長に関連していたのは、輪部から伸長した別個の隆起した組織ブリッジの形成であった。図２５Ｃに明確に示されているように、これらのブリッジは間質組成のものであり、アンカーケーブルに似ており、外植片をＦ２フィルム表面にしっかりと接着させている。

Ｆ３フィルムの外植片伸長はＦ２フィルムのものと同等であった。組織はフィルム表面に接着し、最初の細胞伸長が４日目に再び見られた（データは示さず）。ドナー１は、細胞伸長ブリッジの形成を示したが、上皮細胞の大部分を拡大し、遍在性のビメンチン発現が少なくなっていた（データは示さず）。ドナー２は同様の形態を有していたが、外植片とは別の細胞の隆起部分が加わっていた。Ｆ２の伸長パターンと同様に、ドナー３も、密集したアレイ内に上皮細胞の予備的な伸長を有していた（データは示さず）。

いくつかの物理的破壊に続いて、Ｆ４薄膜フィルム上のドナー１外植片を再配置する必要があり、その後、外植片からフィルム表面への細胞の急速な遊走が４日目から７日目まで起こった。ドナー１に特徴的なブリッジ形成が培養１１日目までには観察され、１４日目までには外植片を取り囲んだ（データは示さず）。

Ｆ５薄膜フィルム上の外植片は、いくつかの小さな孤立した細胞集団の成長を支持したが、細胞伸長を制限した。特に、幹細胞の遊走および拡大がドナー２の外植片で観察され、１４日目にＡＢＣＢ５標識の複数のクラスターがフィルム上に見られ、増殖性細胞集団の確立が観察された（データは示さず）。培養１１日目に幹細胞球が形成されるのが見られ、他のすべてのドナー２の伸長時に見られる固定組織ブリッジと同様の構造が見られた（データは示さず）。ドナー３の外植片はＦ５フィルムにうまく接着したが、細胞伸長は７日目まで見られず（データは示さず）、配合物Ｆ２～Ｆ４で観察された細胞遊走よりもやや遅く、細胞は４日目までには表面で遊走していた。

特に、ＡＢＣＢ５標識の可視化の成功は、各フィルム集団の少なくとも１つのドナー伸長で見られ、これは、生存可能な幹細胞集団の存在を示している。

羊膜対照
クリスタリンを含む薄膜フィルム配合物とは対照的に、羊膜上の外植片の伸長はさまざまであった。ドナー１の外植片は、その外植片から大きくかつコンフルエントな細胞伸長を生じ、ビメンチンに対して陽性に染色された（データは示さず）。ドナー２は、組織の上側および左側に伸びる小さな非対称の伸長を有していたが、下側には小さな縁しかなかった。ドナー３からの外植片は、膜に接着していたが、１４日間の培養期間中、羊膜上に細胞伸長を生じなかった。

羊膜上の伸長の視覚化は、不透明で高倍率のイメージングを実行不可能にする安定化ニトロセルロースフィルターの存在によって困難になった。５倍の倍率で、ドナー２の外植片の上縁のすぐ上にＡＢＣＢ５陽性細胞の小さな集団が観察された。

ＲＮＡ発現
フィルム外植片伸長からの遺伝子発現データを、羊膜対照での外植片伸長発現と比較した。すべての場合において、Ｆ２でのＰＣＮＡ発現を妨げると、評価されたフィルム配合物は、羊膜と比較して、増殖マーカーＰＣＮＡおよびＭＫＩ６７の発現が数倍増加した。上皮マーカーおよび間質マーカーの両方がすべてのフィルムで発現しており、これは、天然の輪部ニッチに存在するすべての細胞型の伸長が成功したことを示している。羊膜と比較してＶＩＭおよびＫＥＲＡの発現が顕著に増加した。これは、クリスタリン含有フィルムが角膜間質細胞の拡大を促進したことを示唆している。ＴＰ６３、ΔＮｐ６３およびＮｏｔｃｈ１発現の減少の観察が、急速に拡大する集団で予想された。

表６は、薄膜フィルム配合物Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、およびＦ５、ならびに羊膜で成長させた場合に、外植片ドナー６と７との間で平均した１４日目のサンプルで検出された幹細胞マーカーＡＢＣＢ５およびＡＢＣＧ２の１μｌあたりのコピー数を提示している。

表６に見られるように、ＡＢＣＢ５およびＡＢＣＧ２の発現は、羊膜と比較してすべてのクリスタリン含有フィルムで大きかった。これは、輪部幹細胞の拡大に加えて、娘前駆細胞も羊膜のものと比較してよりよく分化していたことを示唆している。

実施例１０：クリスタリンタンパク質を含む薄膜フィルム組成物の光学的特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含む薄膜フィルム組成物の光学的透明性および透過性の評価について説明する。

薄膜フィルムは、上記の表３に記載されているように、配合物Ｆ２、Ｆ３およびＦ４から調製した。

すべてのサンプルについて、可視スペクトル（４００～７００ｎｍ）全体の光の透過率を評価した。

図２６および２７に明確に見られるように、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４からの薄膜フィルムは、湿潤状態および乾燥状態の両方において可視スペクトルにわたって非常に高い透過性を示す。実際、水和および乾燥Ｆ２配合物についての図２６Ａ、水和および乾燥Ｆ３配合物についての図２６Ｂ、ならびに水和および乾燥Ｆ４配合物についての図２６Ｃに示すように、より高い波長にわたって９０％以上の透過性が各配合物で観察された。水和Ｆ２、Ｆ３およびＦ４配合物は、優れた色均一性を示し（それぞれ、図２７ａ、２７ｂおよび２７ｃを参照）、追加の透過アッセイでも高い透過率が示され、すべてのフィルムが、眼の用途に必要な７２％の透明度閾値よりも優れていた（図２７の下部を参照）。

実施例１１：ＰＥＧ化クリスタリンタンパク質を含む組成物の調製
本実施例では、ＰＥＧ化クリスタリンタンパク質を含む組成物の調製について説明する。

ＰＥＧ化戦略を検討して、クリスタリンタンパク質の安定性への任意の影響を評価し、例えば、貯蔵寿命および有効性の両方を改善し、クリスタリンタンパク質の凝集架橋を介してクリスタリンヒドロゲルを得た。抽出後、粗クリスタリン抽出物をさまざまなＰＥＧ誘導体と反応させて、ゲル形成を助けるための架橋用の官能基へのアクセスを最適化した。

ＰＥＧ化反応は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用してＰＥＧ－クリスタリンコンジュゲートを特徴付けることによって評価した。図２８に示すように、ＰＥＧの存在下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける高分子量種の存在により、クリスタリンのＰＥＧ化が成功したことが確認された。

実施例１２：クリスタリンタンパク質を含む接着剤組成物の光学的特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含む接着剤組成物の光学的透明性および透過性の評価について説明する。

異なる濃度のＰＥＧＤＡ、クリスタリンおよび光開始剤（リボフラビンおよびｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９の両方）を最初にスクリーニングして、ＰＥＧＤＡベースのクリスタリンヒドロゲルを得た。

代表的な実施形態は、１５および０．５（ｗ／ｖ％）の濃度のＰＥＧＤＡおよびｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９を使用して調製され、ヒドロゲル中のクリスタリンタンパク質の最大濃度は１２０ｍｇ／ｍＬであり、透明なヒドロゲルが得られた。ＰＥＧＤＡのみおよびＰＥＧＤＡ＋クリスタリンタンパク質ヒドロゲルの最初の視覚的スクリーニングは、図２９の上部と比較して、図２９の中央および図２９の下部に見られるように、６０ｍｇ／ｍＬおよび１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンの含有がヒドロゲルの透明性に悪影響を及ぼさないことを示した。

可視スペクトル（４００～７００ｎｍ）全体の光の透過率を、事前に硬化したサンプルおよび硬化したヒドロゲルの両方について評価した。ヒドロゲルは、さまざまな容量の事前に硬化したプレミックスサンプル（５０～６００ｕＬの範囲）を使用してキャストした。事前に硬化したサンプルおよびヒドロゲルの両方が高い透過率（＞８０％）を示した。ヒト角膜移植用の材料に好適な現在提案されている閾値は７２％である（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ａｎｄｒａｄｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１５）。ヒドロゲル（６００ｕＬのプレポリマー溶液を使用してキャスト）の光学的透明度を図３０に示す。

図３０に明確に見られるように、可視スペクトル全体にわたって非常に高い光学的透明性および透過性を有するクリスタリンタンパク質含有ヒドロゲルを含むヒドロゲルは、本明細書に記載される組成物を使用して得ることができる。

ＰＥＧＤＡヒドロゲルにクリスタリンタンパク質が組み込まれていることを確認するために、ＡＴＲ－ＦＴＩＲを実施した。架橋されていないクリスタリンを除去するために、ヒドロゲルを水中に２４時間入れた後、３７℃で一晩乾燥させてからＦＴＩＲ分析を行った。ＰＥＧＤＡのみとＰＥＧＤＡ－クリスタリンヒドロゲルとを比較した代表的なＦＴＩＲグラフを図３１に示す。１６２７、１６３７、３３００、３１００、６１９ｎｍのピークは、それぞれベータシート、ＮＨ伸張、Ｉｓｔアミド、およびＯＣＮ曲げに対応する。

クリスタリンタンパク質はベータシート構造を示すことが知られているため、ＰＥＧＤＡ－クリスタリンサンプルの１６２７ｎｍのピークはクリスタリンタンパク質の存在を確認する。実際、ＰＥＧＤＡ－クリスタリンのＦＴＩＲスペクトログラムは、上記の実施例２で説明し、図１０に示した粗クリスタリン抽出物で観察されたものと非常に類似している。

実施例１３：クリスタリンタンパク質を含む組成物の物理的特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含む代表的な組成物の特定の物理的特徴の評価について説明する。

クリスタリン組成物Ｆ２、Ｆ３およびＦ４を、上記のように調製した。

これらのクリスタリンフィルムの濡れ性を決定するために、図３２に示すように接触角値を測定した。以下の表７に見られるように、各クリスタリンタンパク質配合物の接触角値は９０°未満であり、これらの組成物を親水性材料として分類した。

次に、これらのクリスタリンフィルムの安定性を、２１日間にわたる水和中の質量変化を測定することによって評価した。図３３に見られるように、（開始質量と比較して）水和時にフィルムから失われた質量の大部分は、水和後の最初の１時間以内に発生した。この急速な質量損失は、結合していないタンパク質が急速に拡散した結果である。この最初の損失の後、水和フィルムの質量は次の２１日間安定したままであった。

これらのクリスタリンフィルムが滅菌を受け、有用な構造的完全性および機能を保持する能力は、外科的処置などの望ましい用途での使用にとって非常に重要である。クリスタリン組成物Ｆ２およびＦ３は、２５～３２ＫＧｙでガンマ線滅菌された。図３４は、Ｆ２フィルム（図３４ａ）およびＦ３フィルム（図３４ｂ）から浸出したクリスタリンタンパク質の円二色性分光法の結果を提示している。実線のデータは、ｍｉｌｌｉＱ中で２４時間インキュベートしたフィルムを表し、点線のデータは、ｍｉｌｌｉＱ中で２４時間インキュベートしたガンマ滅菌フィルムである。ガンマ線滅菌フィルムおよび非滅菌フィルムからのサンプルにおけるβシート構造を示す、２１７ｎｍに最小の負のピークが存在することにより、ガンマ線滅菌がフィルム内のクリスタリンタンパク質の天然構造に悪影響を及ぼさないことが確認された。

図３５は、室温で３か月間保管した後のクリスタリンフィルム（図３５ａ）、上記のガンマ線滅菌後のクリスタリンフィルム（図３５ｂ）、およびガンマ線照射後の水和フィルムサンプルの代表的な画像を示しており、これらのフィルムがその構造的完全性を保持し、不溶性のままであったことを示している。

実施例１４：クリスタリンタンパク質を含む接着剤組成物の機能的特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含む接着剤組成物の接着効果の評価について説明する。

組成物の接着特性を実証するために、トリ胸肉サンプルを、入手が容易かつ安価であるため、柔らかい湿潤組織の代表として使用した。メスの刃を使用してトリ胸肉サンプルを切開し、２００μＬのＰＥＧＤＡのみ（図３６、左上）と、１％光開始剤を含むＰＥＧＤＡベースのクリスタリン（図３６、右上）事前硬化サンプルとを適用し、続いて３分間ＵＶに曝露した。

コーティングされた溶液はすぐに膨潤ゲルに変換され、ゲルは組織にしっかりと接着した（図３６）。

図３６から容易に見られるように、クリスタリン含有組成物（図３６、右下）は切開を効果的に密封し、ＰＥＧＤＡのみの対照（図３６、左下）組成物が適用された切開を開くのに十分な物理的伸張を受けたにもかかわらず閉鎖したままであった。

これらのデータは、本明細書に記載される代表的なクリスタリン含有組成物の接着効果を裏付けている。これらの例は、本明細書に記載される１つ以上のクリスタリンタンパク質を含む生体高分子組成物が生体接着剤としての使用に好適であり、それらの高い透明性を考えると、眼科手術での使用に特に適していることを明確に示している。

実施例１５：クリスタリンタンパク質を含む接着剤組成物の機能的特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含む接着剤組成物の接着効果の評価について説明する。

可視光硬化またはＵＶ硬化のいずれかに好適なＰＥＧＤＡクリスタリン接着剤配合物を、以下の表８に従って調製した。

これらの組成物の視覚的特徴付けを示す代表的な画像を図３７に提示しており、ＵＶ硬化した配合物を図３７ａに示し、可視光配合物の前（図３７ｂ、左）および後（図３７ｂ、右）を示す。これらの硬化配合物の高い透明性は、眼科手術における使用への適用可能性を支持する。

組成物の接着特性および外科的用途における使用に対するそれらの好適性を調査するために、ブタ眼サンプルを代表的な眼組織として使用した。図３８ａに示すように、メスの刃を使用して眼を切開した。

次に、クリスタリンヒドロゲル組成物を切開に適用し、３分間硬化させた（図３８ｂ、ＵＶ硬化クリスタリン組成物を参照）。

図３８（ｂ）から容易に見られるように、クリスタリン含有組成物は、湿った状態（３７℃）で切開を密封し、最大２日間密封状態が続いた。これは、必要に応じてさらなる外科的処置を実行するのに十分な時間である。

さらに、クリスタリンフィルムの外科的扱いやすさは、図３９に示すブタ眼モデルを使用した縫合試験で確立された。図３９ａから容易に見られるように、クリスタリンフィルム配合物Ｆ３は、水和すると良好な折り畳み性を示し、それ自体に貼り付かないので、逆に折り畳んで容易に取り扱うことができた。図３９ｂは、Ｆ３フィルムを簡単に切断し、持ち上げて、角膜表面に置くことができることを示している。図３９ｃに示すように、クリスタリンフィルムは簡単に縫合できる。

ＵＶ硬化クリスタリン配合物の接着強度は、図４０の上部に示すように、ブタ皮膚サンプルを使用して、重ねせん断試験で決定された。図４０の下部は、この試験の接着強度に関するデータを提示している。エラーバーは、６つのサンプルから取得した平均の標準偏差を表している。フィブリン糊の値は文献から取得される（Ｎａｋａｙａｍａ＆Ｍａｔｓｕｄａ，１９９９）。わかるように、クリスタリンフィルムの接着強度は、フィブリン糊について報告されているものに匹敵する。

これらのデータは、本明細書に記載される代表的なクリスタリン含有組成物の接着効果を裏付けている。これらの例は、本明細書に記載される１つ以上のクリスタリンタンパク質を含む生体高分子組成物が生体接着剤としての使用に好適であり、それらの高い透明性を考えると、眼科手術での使用に特に適していることを明確に示している。

実施例１６：クリスタリンタンパク質を含む組成物の生体適合性および細胞移入効果の特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含む薄膜フィルム組成物の生体適合性の評価、特に細胞集団を移入するそれらの効果について説明する。

材料および方法
８ｍｍの生検パンチを使用して、提供されたヒト組織から角膜中央部を取り出した。角膜を、－８０℃の滅菌ＭｉｌｌｉＱで３回の凍結／解凍サイクルによって脱細胞化した。脱細胞化後、組織を滅菌ＭｉｌｌｉＱで３回すすいで、緩んだ細胞破片を除去した後、４Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉで一晩３７℃で処理した。５ｍＭのＥＤＴＡを使用して、ＤＮａｓｅを不活化した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色では生細胞は示されなかった。角膜組織を滅菌ＰＢＳで５回洗浄した後、５つの等しいセグメントに切断し、次のように配置した。
１．無細胞対照フィルムの上
２．１８－１３８Ａ培養フィルムの上
３．１８－１３８Ａ培養フィルムの下
４．１８－１４７培養フィルムの上
５．１８－１４７培養フィルムの下

Ｆ２フィルム配合物を１３ｍｍガラスカバースリップ上にキャストして硬化させた。Ｐ３およびＰ４の２つの初代ヒト角膜上皮細胞株からの２×１０^４個の細胞を６枚のフィルム（各細胞株について３枚）上に播種した。これらを７日間培養して、細胞をフィルム表面全体に増殖させた。

サンプルを３７℃で７日間インキュベートした。７日目に角膜組織をその処理表面から取り出し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤで染色した。イメージング後、組織を処理表面とは別の培養物に戻し、さらなる増殖を評価した。

結果
図４１から容易に見られるように、Ｆ２薄膜フィルムを使用したヒト上皮細胞の脱細胞化ヒト角膜への移入は非常に効果的であった。図４１ａは無細胞対照を示し、図４１ｂは培養細胞の上に置かれた角膜を示し、図４１ｃは培養細胞の下に置かれた角膜を示し、図４１ｄは培養細胞の下に置かれた角膜を１０倍の倍率で示している。細胞の増殖および付着は、移入後すぐに明らかになった。生細胞の存在（緑）、死細胞の不在（赤）、ならびに細胞増殖およびその角膜への付着が観察されたことにより、健康な細胞が角膜表面へ移入したことが確認される。これらのデータは、クリスタリンフィルムが、例えば、脱細胞化された角膜および他の標的組織を再増殖させるために、良好な細胞担体として使用できることを確認している。

これらのデータは、角膜上皮細胞集団および／または眼療法で使用するための幹細胞集団などの幹細胞集団の移入を含む細胞移入用途における、本明細書に記載されるクリスタリンタンパク質を含む組成物の驚くべき有効性を確立する。

実施例１７：クリスタリンタンパク質を含む活性剤送達組成物の機能的特徴付け
本実施例は、クリスタリンタンパク質を含むヒドロゲル組成物が活性剤、この場合は眼用抗生物質の送達を提供する能力の評価について説明している。

材料および方法
本実施例で使用されたすべての薄膜フィルムは、クリスタリン－１２０ｍｇ／ｍＬ、グリセロール－２％、グルタルアルデヒド１０ｍＭで構成されていた。

薬物放出速度を測定するために、クロラムフェニコールをクリスタリンフィルムに負荷した。クリスタリンフィルムは、１０ｍｍのＰＤＭＳシート上の溶液に薬物を負荷してキャストした。次に、これらのフィルムをオーブンに一晩入れて乾燥させた。乾燥後、フィルムを１ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れてから、ＰＢＳまたは模擬涙液（ＳＴＦ、ＮａＣｌ ０．６８ｇ、ＮａＨＣＯ_３ ０．２２ｇ、ＣａＣｌ_２●２Ｈ_２Ｏ ０．００８ｇ、ＫＣｌ ０．１４ｇおよび１００ｍＬまでの蒸留脱イオン水を含む）の５００ｕＬ溶液に浸した。次に、１００ｕＬのサンプルを特定のタイムスロット（５、１０、１５、２０、２５、３０、６０、１８０、３００、３６０分）で採取し、プレートリーダー上で２７１ｎｍおよび２３０ｎｍで分析して、クロラムフェニコール濃度を測定した。多層フィルム（３層）の場合、中央のフィルムのみに薬物（クロラムフェニコール）を含有させた。クリスタリン－１２０ｍｇ／ｍＬ、グリセロール－２％、ＧＡ－１０ｍＭの３層で多層フィルムを作製し、中間層には試験濃度（３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬおよび１５ｍｇ／ｍＬ）のクロラムフェニコールを含有させた。最初の層を１０ｍｍのＰＤＭＳシート上にキャストし、乾燥させたら、２番目（中央）の層を上にキャストし、それが乾いたら、最後の層を上にキャストした。

分析方法
クロラムフェニコールの標準曲線を吸光度を使用して作成してから、２３０ｎｍ、２４０ｎｍ、２５４ｎｍおよび２７１ｎｍで、０ｍｇ／ｍＬ～３ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で試験した。次に、これらの曲線を使用して、サンプルから得られた吸光度を変換し、濃度に変換した。

長時間の薬物送達
フィルムを溶液中に最大１週間放置して、７日後のクロラムフェニコールの濃度を測定した。２３０ｎｍおよび２７１ｎｍの波長で、ノイズが非常に少ない対照が生成され、これらの波長での読み取り値は分析にとって好ましいものであった。

結果
単層フィルムの場合、薬物放出は、試験したすべての薬物負荷に関して１０～２５分でピークに達した（図４２Ａ、４２Ｂを参照）。放出薬物％（負荷された薬物の量のパーセンテージとしての、溶液に放出された薬物の量）は、濃度と同様のプロファイルに従っていた（図４２Ｃ、４２Ｄを参照）。すべてのフィルムは少なくとも７０％の薬物放出に達することができ、１０ｍｇ／ｍＬが１００％を達成した。

２３０ｎｍおよび２７１ｎｍでの薬物濃度の読み取り値は非常に類似しており、２７１ｎｍでの読み取り値は、初期ピークでのすべてのサンプルで、クロラムフェニコールのレベルがわずかに上昇していた（図４２Ｃおよび４２Ｄを参照）。溶液中の薬物濃度は、初期の薬物負荷を反映しており、両方の波長の間で非常によく一致している。

同様に、％薬物送達を評価する場合、両方のアッセイ波長間で非常によく一致しており、各負荷濃度で、非常に類似した結果が得られた（図４２Ａおよび４２Ｂを参照）。

すべてのフィルムで同じ傾向が観察され、溶液中のクロラムフェニコール濃度の大きな初期増加が約１５～２５分でプラトーに達し、その後、最終的に減少し、５０分の点を過ぎると比較的定常状態の濃度を達成した。

ＰＢＳ試験と非常に類似した結果がＳＴＦで得られた。ここでは、３０分またはそれ以前にピークまで薬物送達のパーセンテージおよび濃度が増加し、その後はプラトーになる（データは示さず）。

図４３Ｂ（２３０ｎｍ）および図４３Ｄ（２７１ｎｍ）、ならびに図４３Ａ（２３０ｎｍ）および図４３Ｃ（２７１ｎｍ）にそれぞれ示すように、放出薬物％および溶液中の全体的な薬物濃度の両方が、薬物負荷が同等である単層フィルムと比較して、多層フィルムで低下した。しかしながら、図４３Ａ～Ｄに示すように、これらのフィルムの放出プロファイルはより安定しており、予測可能であった。全体的な傾向は単層フィルムに匹敵するが（プラトーは定常状態に達するまで最終的に減少する）、ピーク後の濃度の減少は著しく低下する。単層フィルムの濃度の減少（最大から定常状態領域まで）は約０．２～１．２ｍｇ／ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌフィルムの場合がより高い）であるが、多層フィルムの濃度の減少は０．１～０．２ｍｇ／ｍｌ（すべてのフィルムの場合）である。したがって、多層フィルムからの薬物放出は、より滑らかな曲線によって示されるように、より一定である。

多層フィルムの放出プラトーは６０分～１８０分の間で見られ、その直後に定常領域がある。

％薬物送達は、より高濃度のフィルムが溶液中でより高濃度の薬物を生成するという点で、薬物負荷と一致している。

実施例１８：クリスタリンタンパク質を含む活性剤送達組成物の機能的特徴付け
本実施例では、クリスタリンタンパク質を含むヒドロゲル組成物が活性剤、この場合は抗生物質テトラサイクリンの送達を提供する能力の評価について説明する。

材料および方法
この実験では、テトラサイクリンを、重合中にＵＶ硬化クリスタリンヒドロゲル組成物（０．１％ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９、１０％ＰＥＧＤＡ）に添加し（本明細書では「新鮮なゲル」と呼ぶ）、同じ配合の乾燥ＵＶ硬化ヒドロゲル（本明細書では「乾燥ゲル」と呼ぶ）に別々に吸収させた。上記のように、薬物放出を７日間にわたって評価した。

結果
累積的な薬物放出を示す図４４に見られるように、新鮮なゲルからの放出プロファイル（黒色の線のデータ）は、全体的な薬物の総放出と同様に、乾燥ゲルの放出プロファイル（灰色の線のデータ）と同等であった。したがって、テトラサイクリン抗生物質の効果的な送達は、テトラサイクリンが重合中または重合後に送達組成物に導入されるかどうかに関係なく達成することができる。これにより、特定の用途のための活性剤送達組成物を調製する際の望ましい柔軟性が得られる。

これらの実施例は、本明細書に記載される１つ以上のクリスタリンタンパク質を含む生体高分子組成物が、薬物送達材料としての使用、例えば、眼科手術または他の眼療法における眼に効果的な抗生物質の送達に好適であることを明確に実証している。

刊行物
Ｂｅｎｓｏｎ－Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．，Ｚａｍｍａｒｅｔｔｉ，Ｐ．，Ｂｉｌｉｃ，Ｇ．，Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｔ．，Ｐｏｒｔｍａｎｎ－Ｌａｎｚ，Ｂ．，Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，Ｔ．，…Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ－Ｋｏｌｂｌｅ，Ｎ．（２００６）．Ｔｈｅ Ｙｏｕｎｇ’ｓ Ｍｏｄｕｌｕｓ ｏｆ Ｆｅｔａｌ Ｐｒｅｔｅｒｍ ａｎｄ Ｔｅｒｍ Ａｍｎｉｏｔｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ＆Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２８（１），１０３－１０７．
Ｄｏｉ．Ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｊ．Ｅｊｏｇｒｂ．２００５．１２．０１１
Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ａｎｄｒａｄｅｓ Ｍ，Ｃａｒｄｏｎａ ＪｄｌＣ，Ｉｏｎｅｓｃｕ ＡＭ，Ｍｏｓｓｅ ＣＡ，Ｂｒｏｗｎ ＲＡ（２０１５）Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ－Ｂａｓｅｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｒｅｐａｉｒ：Ａ Ｎｅｗ Ｅａｓｙ－Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（１１）：ｅ０１４２０９９．
Ｄｏｉ．Ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４２０９９
Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｑ．Ｌ．，Ｄｉｎｇ，Ｌ．，＆Ｂｏｖａ，Ｍ．Ｐ．（１９９８）．Ｌｅｎｓ α－ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ：Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．２９０，ｐｐ．３６５－３８３）．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．
Ｍａｓｏｎ Ｐｏｓｎｅｒ，Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｖｉｅｗ ｏｆ Ａｌｐｈａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｓ：Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ４３，Ｉｓｓｕｅ ４，Ａｕｇｕｓｔ ２００３，Ｐａｇｅｓ ４８１－４９１，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｉｃｂ／４３．４．４８１
Ｎａｋａｙａｍａ，Ｙ．，＆Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．（１９９９）．Ｐｈｏｔｏｃｕｒａｂｌｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｇｌｕｅｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｐｈｏｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８（４），５１１－５２１．
Ｐｏｓｎｅｒ，Ｍ．，Ｋａｎｔｏｒｏｗ，Ｍ．，＆Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｊ．（１９９９）．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ αＢ－ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ，Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，１４４７（２－３），２７１－２７７．
Ｒｕｎｋｌｅ，Ｓ．，Ｈｉｌｌ，Ｊ．，Ｋａｎｔｏｒｏｗ，Ｍ．，Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｊ．，＆Ｐｏｓｎｅｒ，Ｍ．（２００２）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｐａｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）αＡ－ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖｉｓｉｏｎ，８，４５．
Ｖｏｎ Ｖｅｒｓｅｎ－Ｈｏｅｙｎｃｋ，Ｆ．，Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ，Ａ．Ｐ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．，Ｈｅｒｍｅｌ，Ｍ．，Ｒａｔｈ，Ｗ．，＆Ｈｅｓｓｅｌｂａｒｔｈ，Ｕ．（２００８）．Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｍｎｉｏｎ Ｇｒａｆｔｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，３６（４），２４８－２５５．
Ｄｏｉ．Ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．２００８．０２．００１

上記および下記の引用されたすべての出願、特許および刊行物の開示全体は、もしあれば、参照により本明細書に組み込まれる。

前述の説明において、整数またはその既知の同等物を有する構成要素が参照された場合、それらの整数は、個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載の現在好ましい実施形態に対する様々な変更および修正は、当業者には明らかであることを留意すべきである。そのような変更および修正は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、また付随する利点を損なうことなく行うことができる。したがって、そのような変更および修正が本発明に含まれることが意図されている。

本発明は、本明細書で言及または示される部品、要素、および特徴、個別にまたは集合的に、２つ以上の当該部品、要素、または特徴の任意またはすべての組み合わせで構成されると広く言うこともできる。

本発明の態様は、例としてのみ説明されており、例えば、特許請求の範囲に定義されるような発明を提示する場合、本発明の範囲から逸脱することなく、変形、修正、および追加を行うことができることを理解されたい。さらに、特定の特徴について既知の同等物が存在する場合、そのような同等物は、本明細書で具体的に言及されているかのように組み込まれる。

Claims (44)

1. 生体適合性組成物であって、
   １つ以上の単離、精製、組換えまたは合成タンパク質であって、
   ａ．α－クリスタリン、
   ｂ．β－クリスタリン、
   ｃ．γ－クリスタリン、
   ｄ．ホキ（Ｍａｃｒｕｒｏｎｕｓ ｎｏｖａｅｚｅｌａｎｄｉａｅ）由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
   ｅ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
   ｆ．本明細書の表１に特定されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
   ｇ．上記ａ）～ｆ）のうちのいずれか１つからの少なくとも約１０個の連続するアミノ酸を含むか、またはそれらからなるポリペプチド、
   ｈ．上記ａ）～ｇ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質、
   ｉ．インビボでクリスタリンタンパク質の天然構造を有する上記ａ）～ｈ）のうちのいずれか１つによるタンパク質、
   ｊ．上記ａ）～ｉ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせ、を含む群から選択される１つ以上の単離、精製、組換えまたは合成タンパク質と、
   任意選択的に、１つ以上の可塑剤と、
   任意選択的に、１つ以上の共開始剤と、
   １つ以上の架橋剤と、を含む、生体適合性組成物。
2. 前記１つ以上のタンパク質が架橋可能であり、ポリマーを形成する、請求項１に記載の生体適合性組成物。
3. 前記生体適合性組成物が、対象の体内もしくはその上の標的部位で少なくとも部分的に重合および／もしくはゲル化するように配合されたインビボゲル化組成物であるか、または前記生体適合性組成物が、前記インビボゲル化組成物の架橋が対象の体内もしくはその上の標的部位に存在するときに起こるか、もしくは開始されるように配合されたインビボゲル化組成物である、請求項１または請求項２に記載の生体適合性組成物。
4. 架橋生体高分子組成物を製造するための方法であって、
   組成物であって、
   ａ．α－クリスタリン、
   ｂ．β－クリスタリン、
   ｃ．γ－クリスタリン、
   ｄ．ホキ（Ｍａｃｒｕｒｏｎｕｓ ｎｏｖａｅｚｅｌａｎｄｉａｅ）由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
   ｅ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来の上記ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つからのタンパク質、
   ｆ．本明細書の表１に特定されたアミノ酸配列を含むタンパク質、
   ｇ．上記ａ）～ｆ）のうちのいずれか１つからの少なくとも約１０個の連続するアミノ酸を含むか、またはそれらからなるポリペプチド、
   ｈ．上記ａ）～ｇ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質、
   ｉ．インビボでクリスタリンタンパク質の天然構造を有する上記ａ）～ｈ）のうちのいずれか１つに記載のタンパク質、
   ｊ．上記ａ）～ｉ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせと、
   任意選択的に、１つ以上の可塑剤と、
   任意選択的に、１つ以上の共開始剤と、を含む組成物を提供することと、
   前記組成物を１つ以上の架橋分子と接触させることと、
   架橋を開始し、それにより、架橋された生体高分子組成物を形成することと、を含む、方法。
5. １つ以上の精製クリスタリンタンパク質を含む組成物を製造するための方法であって、
   脊椎動物の眼組織を提供することと、
   天然のクリスタリンタンパク質構造の維持に好適な条件下で、抽出緩衝液の存在下で前記組織を均質化することと、
   液体ホモジネートを、例えば遠心分離または濾過によって任意の残留固体から分離して、クリスタリンタンパク質含有溶液を提供することと、
   任意選択的に、前記クリスタリンタンパク質を少なくとも部分的にさらに精製することと、
   任意選択的に、前記クリスタリンタンパク質含有溶液を透析して、前記抽出緩衝液を除去することと、
   任意選択的に、前記クリスタリンタンパク質含有溶液を凍結乾燥させて、凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を提供することと、
   任意選択的に、前記クリスタリンタンパク質含有溶液または前記凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を、例えば、０℃以下で保存することと、を含み、
   前記精製クリスタリンタンパク質の実質的な割合がそれらの天然構造を保持している、方法。
6. 前記天然のクリスタリンタンパク質構造の維持に好適な前記条件が、
   ａ．前記ホモジネートを７以上のｐＨの抽出緩衝液中で維持すること、または
   ｂ．前記ホモジネートを生理学的ｐＨで維持すること、または
   ｃ．前記ホモジネートを約１５℃未満の温度で維持すること、
   ｄ．上記ａ）とｃ）の両方、または
   ｅ．上記ｂ）とｃ）の両方、を含み、
   前記方法が、
   前記液体ホモジネートを、遠心分離または濾過によって任意の残留固体から分離して、クリスタリンタンパク質含有溶液を提供することと、
   前記クリスタリンタンパク質含有溶液を透析して、前記抽出緩衝液を除去することと、
   任意選択的に、前記クリスタリンタンパク質含有溶液を凍結乾燥させて、凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を提供することと、
   前記クリスタリンタンパク質含有溶液または前記凍結乾燥クリスタリンタンパク質組成物を、天然のクリスタリンタンパク質構造の維持に適切な条件下、例えば、約４℃以下で使用するまで維持することと、を含み、
   精製されたクリスタリンタンパク質の実質的な割合がそれらの天然構造を保持している、請求項５に記載の方法。
7. 前記脊椎動物の眼組織が、水晶体組織または水晶体超音波乳化吸引術物質である、請求項５または請求項６に記載の方法。
8. 前記脊椎動物の眼組織が魚由来の眼組織であるか、または哺乳動物由来の眼組織である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 均質化が、１つ以上のクリスタリンアイソフォームの破壊を回避もしくは最小化する、および／またはタンパク質凝集を回避もしくは最小化する条件下で実行される、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 均質化が、
    ａ．約７を超えるｐＨで実行されるか、または
    ｂ．生理学的ｐＨで実行されるか、または
    ｃ．低せん断条件下で実行される、
    ｄ．例えば、アルギニンなどの１つ以上の安定化添加剤の存在下で実行されるか、または
    ｅ．低温で実行される、
    ｆ．約０℃～約５℃の温度で起こる、
    ｇ．均質化が実行されない休止相を複数回挟んでいる、例えば、前記ホモジネートが一定期間氷上に置かれる冷却相を複数回挟んでいるか、または
    ｈ．上記のうちの２つ以上の任意の組み合わせである、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記それらの天然構造を保持する精製クリスタリンタンパク質の前記実質的な割合が約６０％を超える、請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 組織閉鎖を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
    任意選択的に、裂傷、病変、切開または創傷を閉鎖するために力を加えることと、
    裂傷、病変、切開もしくは創傷、または前記裂傷、病変、切開もしくは創傷の部位を、請求項１～１１のいずれか一項に定義されたクリスタリンタンパク質含有組成物と接触させることであって、任意選択的に、前記クリスタリンタンパク質含有組成物が少なくとも部分的に架橋されている、接触させることと、
    任意選択的に、前記裂傷、病変、切開または創傷を閉鎖するために力を加えることと、
    架橋を開始するおよび／または維持することと、
    架橋が起こるのに十分な時間、前記裂傷、病変、切開または創傷の前記閉鎖を維持することと、を含み、
    前記クリスタリンタンパク質の架橋が接着剤組成物を形成する、方法。
13. 前記組織閉鎖の方法が外科的切開を閉鎖する方法である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記組織閉鎖の方法が無縫合閉鎖の方法であり、例えば、前記無縫合閉鎖が無縫合皮膚閉鎖、無縫合創傷閉鎖、または無縫合手術切開閉鎖である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記外科的手術が眼科手術である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記裂傷、病変、切開または創傷の前記閉鎖の維持が、
    ａ．包帯、縫合糸、メッシュなどの１つ以上の医療補助具の適用によるか、または前記裂傷、病変、切開もしくは創傷を閉鎖した状態でクランプするもしくは保持するなどの（通常は一時的な）物理的力によるか、
    ｂ．約６０％を超える架橋が起こるのに十分な時間であるか、または
    ｃ．上記ａ）とｂ）の両方である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記組成物中に存在する前記架橋剤が光架橋剤であり、架橋の開始が光への曝露によるものである、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 組織閉鎖を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象が眼科手術を受けているか、または受けたものであり、前記方法が、
    外科的切開もしくは前記外科的切開の部位を、請求項１～１７のいずれか一項に定義されたクリスタリンタンパク質含有組成物と接触させることであって、任意選択的に、前記クリスタリンタンパク質含有組成物が少なくとも部分的に架橋されている、接触させることと、
    任意選択的に、前記切開を閉鎖するために力を加えることと、
    架橋を開始するおよび／または維持することと、
    架橋が起こるのに十分な時間、前記外科的切開の前記閉鎖を維持することと、を含み、
    前記クリスタリンタンパク質の架橋が、前記外科的切開の閉鎖を維持することができる接着剤組成物を形成する、方法。
19. 眼の損傷または眼の切開の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
    前記眼の損傷または切開を本明細書に記載される組成物と接触させるステップであって、任意選択的に、前記クリスタリンタンパク質含有組成物が少なくとも部分的に架橋されている、ステップと、
    架橋を開始するおよび／または維持するステップと、を含み、
    前記架橋が生体接着性ポリマー組成物を形成する、方法。
20. １つ以上の活性剤の送達を必要とする対象に対してそれを行う方法であって、
    請求項１～１９のいずれか一項に定義されたクリスタリンタンパク質含有組成物を提供することであって、任意選択的に、前記クリスタリンタンパク質含有組成物が少なくとも部分的に架橋されており、前記組成物が１つ以上の活性剤をさらに含む、提供することと、
    前記対象を前記組成物と接触させることと、
    任意選択的に、前記組成物の架橋を開始するおよび／または維持することと、
    それにより、前記活性剤の送達を必要とする対象に対してそれを行うことと、を含む、方法。
21. 前記対象を前記組成物と接触させることが、例えば、外科的投与を含む、前記対象の体内またはその上の標的部位に前記組成物を投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
22. １つ以上の細胞または組織を培養する方法であって、
    培養すべき１つ以上の細胞を提供することと、
    前記１つ以上の細胞を、請求項１～２１のいずれか一項に定義された組成物を含む基質と接触させることと、
    前記１つ以上の細胞を前記基質と接触させた状態で、ならびに任意選択的に、継続的な生存、成長、複製および／または分化に好適な条件下で一定期間、追加の成長培地と接触させた状態で、維持することと、を含む、方法。
23. 本明細書に記載される前記組成物がγ－クリスタリンを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記１つ以上の細胞が、１つ以上の複製コンピテントセル、または１つ以上の幹細胞を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 前記基質が、請求項１～２４のいずれか一項に定義された組成物から形成された薄膜フィルム、例えば、それと接触させた状態で細胞が別の場所へ移入することを可能にするのに十分な機械的強度および／または弾性の薄膜フィルムである、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記場所が第２の培養容器である、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記場所が対象の体内またはその上にある、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
28. １つ以上の細胞が、１つ以上の眼細胞または眼に由来する１つ以上の幹細胞であり、前記場所が、眼の中またはその上の外科的手術部位である、請求項２７に記載の方法。
29. １つ以上の細胞が、１つ以上の輪部幹細胞、または１つ以上の間質幹細胞である、請求項２７または２８に記載の方法。
30. 前記基質が、３Ｄ細胞培養物の形成を可能にするのに十分な厚さの少なくとも１つの領域を有する、請求項１～２９のいずれか一項に定義された組成物から形成されるゲルである、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記１つ以上の細胞または組織を培養する方法が、前記脊椎動物の眼に由来する１つ以上の細胞を培養する方法であって、前記方法が、
    培養すべき１つ以上の脊椎動物の眼細胞を提供することと、
    請求項１～３０のいずれか一項に定義された組成物を含む基質と前記１つ以上の細胞を接触させることであって、前記基質が光学的に透明である、接触させることと、
    前記１つ以上の細胞を前記基質と接触させた状態で、ならびに任意選択的に、継続的な生存、成長、複製および／または分化に好適な条件下で一定期間、追加の成長培地と接触させた状態で、維持することと、を含み、
    前記基質が、対象の眼への移入および／または外科的適用に関連する取り扱いを助けるのに十分な機械的耐久性のものである、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 幹細胞の欠損に関連する眼障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記方法が、治療用組成物と眼を接触させることを含み、前記治療用組成物が、
    ｉ．任意選択的に請求項１～３１のいずれか一項に定義された培養方法に従って培養された、幹細胞と、
    任意選択的に、
    ｉｉ．請求項１～３１のいずれか一項に定義された生体適合性組成物または生体高分子組成物と、を含む、方法。
33. 眼障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
    請求項１～３２のいずれか一項に定義された生体適合性組成物を提供することであって、前記生体適合性組成物が１つ以上の活性剤を含む、提供することと、
    前記生体適合性組成物を前記対象に投与して、前記１つ以上の活性剤の前記対象への移入を可能にすることと、を含む、方法。
34. 眼障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
    請求項１～３３のいずれか一項に定義された生体適合性組成物を提供することであって、前記生体適合性組成物が１つ以上の幹細胞を含む、提供することと、
    前記生体適合性組成物を前記対象に投与して、前記幹細胞のうちの１つ以上の前記対象への移入を可能にすることと、を含む、方法。
35. 療法に使用するための薬剤の調製における、請求項１～３４のいずれか一項に定義された組成物の使用。
36. インビトロステップを使用する治療方法もしくは研究方法を含む、インビトロでの使用のための薬剤または組成物の調製における、請求項１～３５のいずれか一項に定義された組成物の使用。
37. 本明細書に記載される治療方法のうちのいずれか１つにおける使用を含む、療法における使用のための請求項１～３６のいずれか一項に定義された組成物。
38. インビトロ治療方法もしくは研究方法、またはインビトロステップを使用する治療方法もしくは研究方法での使用のための、請求項１～３７のいずれか一項に定義された組成物。
39. ａ．前記１つ以上のクリスタリンタンパク質の天然の二次構造が維持されているか、または
    ｂ．前記１つ以上のクリスタリンタンパク質の天然の三次構造が維持されているか、または
    ｃ．前記１つ以上のクリスタリンタンパク質の天然の四次構造が維持されているか、または
    ｄ．前記１つ以上のクリスタリンタンパク質が、ナノフィブリルもしくは他の破壊された構造形態を実質的に含まないか、または
    ｅ．前記組成物中に存在する前記クリスタリンタンパク質の少なくとも一部が、天然にグリコシル化されているか、または
    ｆ．上記ａ）～ｅ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせである、請求項１～３８のいずれか一項に記載の組成物、方法または使用。
40. 前記組成物が、
    ａ．約０．１％ｗ／ｗ～約１．５％ｗ／ｗの架橋剤、または
    ｂ．約０．５％ｗ／ｗ～約３％ｗ／ｗの架橋剤、または
    ｃ．約３％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗの架橋剤、または
    ｄ．約１０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、または
    ｅ．約１０ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、または
    ｆ．約０．５％ｗ／ｗ～約３％ｗ／ｗの可塑剤、または
    ｇ．約０．５％ｗ／ｗ～約５％ｗ／ｗの共開始剤、または
    ｈ．上記ａ）～ｇ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせを含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物、方法または使用。
41. 前記組成物が、
    ａ．約１００ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約５ｍＭ～約１０ｍＭのグルタルアルデヒド、および約１．５％ｗ／ｗ～約２．５％ｗ／ｗのグリセロール、または
    ｂ．約１００ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１０％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗのＰＥＧＤＡ、および約０．２％ｗ／ｗ～約１．０％ｗ／ｗの光開始剤、または
    ｃ．約５０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約１０％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗのＰＥＧＤＡ、および約０．２％ｗ／ｗ～約１．０％ｗ／ｗの光開始剤、または
    ｄ．約５０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのクリスタリンタンパク質、約２５％ｗ／ｗ～約５０％ｗ／ｗのＰＥＧＤＡ、約０．２％～約１．０％ｗ／ｗの光開始剤、および１０％ｗ／ｗ～２０％ｗ／ｗの共開始剤、を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の組成物、方法または使用。
42. 前記組成物が、架橋されるとき、
    ａ．可視スペクトル全体で光学的に透明であるか、または
    ｂ．投与される、もしくは投与された対象の眼の屈折率と同等の屈折率を有するか、または
    ｃ．約７５％を超える可視スペクトル（４００ｎｍ～７００ｎｍ）全体の光の透過率を有するか、または
    ｄ．上記ａ）～ｃ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせである、請求項１～４１のいずれか一項に記載の組成物、方法または使用。
43. 存在する場合、前記組成物中に存在する前記１つ以上の活性剤が眼科的に許容される抗生物質である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の組成物、方法または使用。
44. 前記クリスタリンタンパク質のうちの１つ以上が、ホキ（Ｍａｃｒｕｒｏｎｕｓ ｎｏｖａｅｚｅｌａｎｄｉａｅ）に由来するか、またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の組成物、方法または使用。

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