KR101979286B1 - 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱 및 이의 제조방법 - Google Patents

부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱 및 이의 제조방법 Download PDF

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본 발명은 부분 경화된 양막을 이용하여 제조된 콘택트렌즈 형태의 드레싱 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법 및 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 제조 방법이 간단하고 이물질 없이 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제조할 수 있으며, 전체 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱과 비교하여 생체 적합성이 우수하고, 투명도, 인장강도 등의 렌즈 적합성이 우수할 뿐만 아니라 상처 재생 효과 역시 뛰어난 바, 안구 각막 손상과 같은 안구 질환의 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱 및 이의 제조방법 {Partial-hardening contact lens-type dressing using amniotic membrane and preparation method thereof}
본 발명은 부분 경화된 양막을 이용하여 제조된 콘택트렌즈 형태의 양막 드레싱 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
양막은 태반 가장 안쪽에 있는 막으로 태아를 둘러싸고 있고 모체로부터의 각종 감염 및 면역반응 등으로부터 태아를 보호하는 장벽 역할을 하고 있다. 양막은 0.2 내지 0.5mm 로 얇고 반투명하며, 단순 입방 상피와 두꺼운 기저막, 무혈관성의 간엽성 간질로 구성되어 있고, 평활근 세포, 신경, 임파관 및 혈관이 없기 때문에 이식을 하여도 거부반응을 보이지 않는 특징이 있어 최근 주목받고 있다. 또한 양막이 창상 치유 과정에서 상피화를 촉진시키고 반흔 형성을 억제하는 역할이 알려진 후 지금까지 다양한 안과 질환에서 양막을 이식하고자 하는 노력이 계속되고 있다.
양막 자체를 각막 및 결막에 이식하기 위해서 봉합사를 이용하여 봉합하는 기술이 시도되었으나, 수술에 의한 봉합은 그 과정이 복잡한 어려움이 있어 최근에는 양막 드레싱을 이용하여 안구의 창상 치유를 하는 시도가 이루어지고 있다.
최근 시도되고 있는 기술은 플라스틱링으로 고정된 렌즈 타입과 고정형태 없이 수분흡착형 디스크 (시트) 타입이 있다. 렌즈 타입의 제품은 시술에 있어 편리성 및 양막 고정성을 가지고 있으나, 제품 주변부가 단단한 플라스틱으로 제조되어 시술 후 안구 내 이물감이 높아 환자가 불편감을 호소하며, 각막에 밀착하지 않아 치료효과가 떨어지는 단점이 있으며, 가격 역시 높아 일반적인 각막 상처 치료에 널리 활용하기 어려운 한계점이 있었다. 디스크 (시트) 타입의 경우 가격 경쟁력이 있고 환자의 거부감을 낮춰 기존 렌즈 타입의 문제점을 해소하였으나, 고정되지 않고, 환자 안구 표면에서 위치가 움직인다는 단점이 보고되었다. 이러한 이유로 봉합없이 고정되는 양막은 현재 거의 쓰이지 않고 있는 실정이다. 미세먼지의 증가 등과 같은 환경적 문제와 멀티미디어를 지속적으로 접하는 생활 환경에 의하여 시장의 안구 표면 질환 환자수가 증가되고 있음에도 상기와 같은 문제점을 모두 해소하고 효과적으로 이용할 수 있는 콘택트렌즈 드레싱이 보고되지 않아 이를 개선할 수 있는 새로운 형태의 콘택트렌즈형 드레싱에 대한 필요성이 있다.
삭제
KR 10-2007-0009585 A KR 10-2013-0111849 A KR 10-2011-0090242 A
본 발명자는 상처 치료 효과를 갖는 양막을 활용하여 기존 시트 형태 및 렌즈 형태의 안구용 드레싱의 문제점을 해결하기 위하여 연구하던 중, 양막의 주변부만 부분 경화시켜 제조한 콘택트렌즈형 양막 드레싱이 생체 적합성이 우수하고, 투명도, 인장 강도와 같은 렌즈 적합성이 우수하며, 성장인자 분비능 증가, 각막 상처 재생 효과가 탁월하게 우수하다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법 및 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 1) 양막을 주형 바디부 중 눈 곡률에 맞춘 볼록한 형태의 돌출부에 위치시킨 후 건조시키는 단계; 2) 상기 1) 단계의 건조된 양막이 위치한 바디부와 챔버부를 결합시키는 단계; 및 3) 가교제를 양막의 주변부만 침지되도록 챔버부에 채워 건조된 양막 주변부를 부분 경화시키는 단계; 를 포함하는 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제공한다.
본 발명의 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법 및 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 제조 방법이 간단하고 이물질 없이 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제조할 수 있으며, 전체 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱과 비교하여 생체 적합성이 우수하고, 투명도, 인장강도 등의 렌즈 적합성이 우수할 뿐만 아니라 상처 재생 효과 역시 뛰어난 바, 안구 각막 손상과 같은 안구 질환의 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 부분 경화된 콘택트렌즈 드레싱을 제조하기 위한 주형 (몰드)의 구성을 나타낸 도이며, 바디부 (body), 챔버부(chamber) 와 이를 결합한 형태를 나타낸 도이다.
도 2는 글루타르알데하이드를 가교제로 하여 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제조하는 공정 및 이를 통해 제조된 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 나타낸 도이다.
도 3은 다이알데하이드 스타치를 가교제로 하여 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제조하는 공정 및 이를 통해 제조된 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 나타낸 도이다.
도 4는 가교제가 미처리된 양막, 글루타르알데하이드 (GA), 다이알데하이드 스타치 (DAS) 를 가교제로 하여 제조된 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 두께 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 가교제가 미처리된 양막, 글루타르알데하이드(GA), 다이알데하이드 스타치(DAS) 를 가교제로 하여 제조된 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 함수 전/후의 투명도 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 가교제 미처리 (정상 AM), 글루타르알데하이드(GA), 다이알데하이드 스타치(DAS) 를 가교제로 하여 제조된 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 인장강도를 확인한 결과를 나타낸 도이다. X축 Strain= Time X Speed / Grip , Y축: Stress= Force(kg) / Thickness (m2), 그래프의 직선구간 기울기= 탄성계수.
도 7은 가교제 미처리 (정상 AM), 다이알데하이드 스타치(DAS) 를 가교제로 하여 제조된 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 인간 각막 상피세포에 대한 세포 독성 여부를 세포 부착능을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 가교제 미처리 (정상 AM), 글루타르알데하이드(GA), 다이알데하이드 스타치(DAS) 를 가교제로 하여 제조된 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 조직학적 분석 결과를 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 배양액 형태의 시료 중 DAS 로 부분 가교된 양막 (DAS partial AM), GA 로 부분 가교된 양막 (GA partial AM) 및 DAS 로 전체 가교된 양막에서 TFGb3, PDGF-AA, EG-VEGF, GDNF, IGFBP-4, BMP-7, NT-3, NT-4 성장인자 분비능을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 분말 상태의 시료 중 DAS 로 부분 가교된 양막 (DAS partial AM), GA 로 부분 가교된 양막 (GA partial AM) 및 DAS 로 전체 가교된 양막에서 bFGF, HGF, HB-EGF, FGF-7, BDNF, EG-VEGF, GH, IGF-I, IGFBP-6 성장인자 분비능을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 부분 경화 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 콜라게나아제 분해에 대한 저항성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 부분 경화 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 각막 상피가 손상된 토끼 각막에 착용시킨 후, 각막 상피의 상처 회복효과를 가교제 미처리 양막 (non AM), 부분 경화 콘택트렌즈형 양막 드레싱 (AM cover) 실험군에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 1) 양막을 주형 바디부 중 눈 곡률에 맞춘 볼록한 형태의 돌출부에 위치시킨 후 건조시키는 단계; 2) 상기 1) 단계의 건조된 양막이 위치한 바디부와 챔버부를 결합시키는 단계; 및 3) 가교제를 양막의 주변부만 침지되도록 챔버부에 채워 건조된 양막 주변부를 부분 경화시키는 단계; 를 포함하는 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법에 따르면, 간단한 방법을 통해 이물질 없이 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제조할 수 있으며, 전체 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱과 비교하여 생체 적합성이 우수하고, 투명도, 인장강도 등의 렌즈 적합성이 우수할 뿐만 아니라 상처 재생 효과 역시 뛰어난 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제공할 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 1) 단계는 양막을 주형의 바디부 중 눈 곡률에 맞춘 볼록한 형태의 돌출부에 위치시킨 후 건조시키는 단계이다. 이는 콘택트렌즈 드레싱의 재료가 되는 양막을 준비하는 단계를 포함한다. 본 발명에 있어 양막은 포유동물 유래의 양막일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래의 양막일 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 양막은 적출된 태반으로부터 직접 수득하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 태반을 세척하고, 양막을 융모막으로부터 조금씩 박리한 후, 상피가 아래를 향하도록 펼쳐 융모막과 혈병을 제거한 후, 이를 콘택트렌즈형 양막의 제조에 사용할 수 있다. 통상적으로 보관법에 의해 분류되는 양막을 모두 본 발명의 콘택트렌즈형 양막의 제조에 사용가능하고, 예컨대 냉동건조(lyophilized) 양막 혹은 동결보관 (cryopreserved) 양막 등이 본 발명의 콘택트렌즈형 양막의 제조에 사용할 수 있다. 상기 양막은 이후 감마선을 이용한 멸균과정을 거칠 수 있다.
준비된 양막은 부분 가교된 콘택트렌즈 형태로 제조하기 위하여 눈 곡률에 맞게 제작된 주형 (mold) 바디부의 돌출부에 위치된다. 주형은 양막이 위치되고 건조되는 바디부, 가교제와 양막이 가교되는 공간을 형성하는 챔버부로 구성될 수 있다.
바디부와 챔버부는 3차원 프린팅이 가능한 재료를 이용하여 제조될 수 있고, 바람직하게는 Polydimethylsiloxane (PDMS) 또는 Polylactic acid (PLA) 를 이용하여 제조될 수 있다. 바디부는 원기둥 형태에 돌출부를 갖도록 제조된다. 바디부의 돌출부는 렌즈를 제조하기 위한 곡률에 따라 제조되며, 몰드의 곡률은 목적에 따라 적절하게 조정할 수 있다. 예컨대 한국인에 적합한 양막을 제조하기 위해서는 당 분야에 알려진 참고 서적 및 통계를 이용하여 한국인의 눈 곡률반경을 반영하여 곡률을 설계할 수 있다. 몰드의 챔버부는 가교제를 투여할 수 있도록 제조된 속이 빈 원기둥의 형상을 하고 있으며, 바디부와 결합할 수 있도록 챔버부의 사이즈를 조절할 수 있다.
양막은 바디부의 돌출부에 위치시켜 건조할 수 있으며, 바람직하게는 상피세포가 있는 면과 주형이 직접 맞닿도록 주형의 돌출부 위에 양막을 위치시킨 후 수분흡착용 페이퍼를 이용해 수분을 제거한 후 자연 건조시킬 수 있다.
본 발명에 사용되는 양막은 단일 막으로만 사용될 수도 있으나, 2개 이상의 양막을 겹쳐 제조하는 방식으로 이용될 수 있고, 이 경우 최초 양막의 건조가 모두 완료된 후, 그 위에 다시 양막을 위치시키고 건조하는 과정을 반복하여 복수 개의 양막으로 이루어진 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제조할 수 있다.
본 발명의 2) 단계는 상기 1) 단계의 건조된 양막이 위치한 바디부와 챔버부를 결합시키는 단계이다.
바디부와 챔버부가 결합되는 경우, 바디부의 원기둥 형태에 존재하는 돌출부의 끝부분은 챔버부 높이보다 높거나 이의 1/2 지점 이상에 존재하도록 제조될 수 있다. 바디부와 챔버부가 결합하는 경우, 챔버부와 바디부 사이에는 가교제를 포함하는 용액이 존재할 수 있는 공간이 형성되며, 가교제를 포함하는 용액을 주입하여 바디부에 존재하는 양막과 가교제와의 결합을 유도할 수 있다.
본 발명의 3) 단계는 가교제를 양막의 주변부만 침지되도록 챔버부에 채워 건조된 양막 주변부를 부분 경화시키는 단계이다.
본 발명의 가교제는 양막의 가교를 유도할 수 있는 당 분야 알려진 물질을 모두 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 카르보디이미드(carbodiimide), EDC(또는 EDAC; 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드), 다이알데하이드 스타치 (Dialdehyde Starch, DAS), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 포름알데하이드(formaldehyde), 헥사메틸렌 디이소시아네이트 (hexamethylene diisocyanate, HMDI), 덱스트란(dextran) 또는 글루코스 용액을 포함할 수 있고, 바람직하게는 다이알데하이드 스타치 (Dialdehyde Starch, DAS) 또는 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 가장 바람직하게는 다이알데하이드 스타치 (Dialdehyde Starch, DAS) 를 포함할 수 있다.
가교제로 글루타르 알데하이드를 사용하는 경우, 0.05 내지 0.3%, 바람직하게는 0.1% 의 글루타르 알데하이드를 이용할 수 있으며, 이를 덱스트란 (20%) 용액에 녹여 사용할 수 있다. 또한 가교제로 다이알데하이드 스타치를 이용하는 경우 30 내지 50mg/ml, 바람직하게는 45mg/ml 의 농도의 다이알데하이드 스타치를 이용할 수 있다. 가교된 양막은 냉동보관 (cryopreserved) 방식 혹은 동결건조 (lyophilized) 방식의 처리방법으로 보관될 수 있으며, 감마선을 이용한 멸균 보관처리를 추가할 수 있다.
본 발명에 있어 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱이란, 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 일부 부위만 가교제에 의해 경화된 것을 의미하며, 바람직하게는 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 주변부만 부분 경화된 것을 의미한다. 본 발명에 있어 콘택트렌즈형 양막의 “주변부”란 양막 중심부의 영역을 제외한 양막 가장자리 부분을 의미하며, 바람직하게는 양막 가장자리에서부터, 양막 가장자리로부터 양막 중심부까지 거리의 1/3 지점까지, 더욱 바람직하게는, 양막 가장자리로부터 양막 중심부까지 거리의 1/2 지점까지의 거리를 의미할 수 있다. 이와 같은 주변부만 부분 가교된 콘택트렌즈형 양막을 제조하기 위하여 제조 공정상 바디부 중 돌출부에 위치한 건조된 양막이 챔버부에 존재하는 가교제와 일부만 접촉하도록 할 수 있으며, 양막의 주변부만 침지되도록 가교제를 챔버부에 채움으로써, 이와 같은 기술적 특징을 달성할 수 있다.
본 발명에 있어 3) 단계의 부분 경화는 실온에서 수행되는 것이 바람직하며, 실온에서 2 내지 10분, 바람직하게는 실온에서 5분간 수행될 수 있다.
본 발명의 제조방법은 4) 챔버부에서 가교제를 제거하고 NaBH4/EtOH 용액을 챔버 부피의 1/2 만큼 채워 실온에서 0.5 내지 2분간 안정화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 4) 단계는 가교제를 제거하고 부분 가교 반응이 일어난 부분 경화된 양막을 안정화시키는 공정이며, 가교제와 비슷한 부피의 NaBH4/EtOH 을 첨가하여 양막을 안정화 시킬 수 있다.
또한 본 발명의 제조방법은 5) 부분 경화된 양막을 수득하여 콘택트렌즈 형태로 절단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
콘택트렌즈 형태로 절단하는 단계는 당 분야에 널리 알려진 통상의 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 예컨대 선반 (lathe) 또는 레이저를 이용하는 회전 절삭 가공 등의 공정을 통해 수행될 수 있다.
또한 본 발명의 제조방법은 6) 상기 5) 단계의 콘택트렌즈 형태로 절단된 양막을 글리신으로 세척하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
상기 단계를 통해 독소 제거가 수행되며, 상기 세척단계는 다이알데하이드 스타치(DAS) 를 가교제로 이용하는 제조방법에 특히 적합할 수 있다.
세척과정에서 사용되는 글리신은 0.1 내지 0.3M 의 글리신 PBS 일 수 있으며, 이와 같은 공정을 통해 독소 제거가 일어나, 보다 생체 적합성이 우수한 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 수득할 수 있다.
또한 본 발명의 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조에 있어서, 상기 세척된 양막 드레싱은 부분 경화된 이후 동결 건조시킨 후 상온 보관하거나 이와 같은 처리 없이 냉동 보관, 예컨대 -90 내지 -50℃, 바람직하게는 -80 내지 -70℃ 에서 냉동보관 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 7) 상기 6) 단계의 글리신으로 세척된 양막을 동결건조 (lyophilzation) 또는 냉동하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 이후 감마선을 이용하여 제조된 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 멸균 처리할 수 있다.
또한 본 발명은 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제공한다.
본 발명의 상기 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 양막 주변부만 부분 경화된, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱인 것을 특징으로 하며, 상기 양막 주변부는 양막 가장자리에서부터, 양막 가장자리로부터 양막 중심부까지 거리의 최대 1/2 지점까지인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기와 같은 주변부 가교에 의해 제조되는 콘택트렌즈형 양막은 최종적으로 절단 공정을 거쳐 양막 가장자리에서부터, 양막 가장자리로부터 양막 중심부까지 1/3 지점이 고정되고 2/3 부분이 미고정된 양막으로 제조될 수 있다.
본 발명의 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 완전히 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱과 달리 콘택트렌즈형 양막의 주변부만 경화됨으로써 생체 적합성, 인장강도, 투명도, 성장인자 분비능 등이 모두 개선되는 우수한 물성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 양막 주변부만 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 특성을 모두 유지하는 경우, 이의 제조방법은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 본원 발명의 제조방법을 통해 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 제조할 수 있다.
부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 가교제 미처리 양막 대비 2 내지 4 배의 인장 강도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 전체 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱과 비교하여 성장인자 분비능 또한 증가되는 것을 특징으로 할 수 있다.
성장인자 분비능은 배양액 상태, 분말 상태에서 모두 비교할 수 있으며, 본원 발명의 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 경우 두 가지 상태 모두에서 전체 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱 대비 우수한 성장인자 분비능을 갖는다.
예컨대 본 발명의 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 다이알데하이드 스타치로 전체 가교된 양막과 비교하여 TFGb3, PDGF-AA, EG-VEGF, GDNF, IGFBP-4, BMP-7, NT-3, NT-4 (배양액), bFGF, HGF, HB-EGF, FGF-7, BDNF, EG-VEGF, GH, IGF-I, IGFBP-6 (분말) 등에서 비슷하거나 현저히 우수한 성장인자 분비능을 나타낼 수 있으며, 특히 다이알데하이드 스타치를 이용하여 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 경우 전체 경화된 콘택트렌즈형 양막뿐만 아니라 글루타르알데하이드로 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱과 비교하여도 현저히 우수한 성장인자 분비능을 나타낼 수 있다.
또한 본 발명의 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 안구 질환 치료용 또는 안구 상처 치료용일 수 있다.
본 발명에 있어서, 안구 질환 또는 안구 상처는 손상된 안구 표면 눈의 질환, 지속성 상피 결손, 지속성 결막 궤양, 주변주 각막 궤양, 허혈성 각막염, 염증성 각막염, 신경영양인자성 각막염, 윤부염, 무홍채증, 수포각막병증, 스티븐스-존슨 증후군, 안반흔성유천포창, 쇼그렌 증후군, 익상편 또는 가상익상편, 다발성내분비선 부전, 병소(lesion)의 절제, 결막 종양의 절제, 줄기세포 이식수술, 결막 염증, 급성 염증, 화학적 및 열적 화상의 급성 상태(state), 각막기질 융해 질환, 류마티스성 각막병증, 바이러스 결막염 또는 박테리아 궤양에 의해 특징되는 질환, 질병 또는 상태를 포함한다.
본 발명에 있어, 안구 질환은 예컨대 각막 부종, 각막 혼탁, 반흔, 표면 염증, 안내 염증, 각막 신혈관신생(corneal neovascular disorder) 또는 안구 건조증을 포함할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 콘택트 렌즈형 양막 드레싱 제제의 제조
1.1 양막의 준비
합병증이 없는 임산부의 제왕절개술에 의해서 적출된 태반을 멸균된 용기에 담아 냉장 보관하였다가 24시간 내에 처리하여 격리 보관하고, 조직적합성평가를 통과한 후 이식 가능한 냉동고로 옮겨 보관하였다. 태반을 의료용 용기에 담아 생리식염수로 씻어 혈병을 제거하였다. 제대 쪽부터 의료용가위를 이용하여 절개를 넣었으며 양막을 융모막 (chorion) 으로부터 포셉을 넣어 조금씩 박리하였다. 박리 후 질이 좋지 않은 가장자리의 양막은 잘라내고 나머지 양막 부분을 얻었다. 분리한 양막을 스테인레스 플레이트에 상피가 아래를 향하게 펼친 후 손으로 문질러 남아있는 융모막과 혈병을 제거해주었으며, 생리식염수를 이용하여 5회 반복하여 헹궈주었다.
세균학적 검사를 위한 검체를 얻어 배양을 수행하였다. 먼저 항생제 용액(sterile Earle's balanced salt solution) (페니실린 50 ㎍/㎖, 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖, 네틸마이신 100 ㎍/㎖, 암포테리신 B 2.5 ㎍/㎖ 포함)에 담궈주었으며, 양막 (Amniotic membrane) 을 스테인레스 플레이트에 상피가 아래를 향하게 펼친 후 NC paper(nitrocellulose paper with a pore size of 0.45 ㎍)를 위에 덮어 양막을 NC paper에 부착시켰다. 부착 후 이를 3×3(Cm)이나 10×10(Cm)크기로 잘라서 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)과 글리세린을 1:1로 섞은 보관액이 담긴 용기(nalgene bottle)에 이동시켰으며, -70℃로 냉동 보관하였다. 모든 처리 과정 후에 15KGy 방사선 조사로 2차 멸균과정을 추가로 수행하였다.
1.2 몰드의 준비 및 콘택트렌즈형 양막 드레싱 제조
한국인의 눈 곡률에 맞게 제작된 주형 (mold) 를 준비하였다. 사용된 몰드의 디자인 및 구조를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 주형은 바디부, 챔버부로 구성되어 있으며, 바디와 챔버를 결합하여 콘택트렌즈 제조에 사용하였다. 주형의 바디부 및 챔버부는 Polydimethylsiloxane (PDMS) 또는 Polylacetic acid (LA) 로 제조하였다. 주형의 바디부 중 돌출부 위에는 양막을 얹고 건조시키게 되며, 챔버부에는 부분 가교를 유도하기 위한 가교제를 채운 후, 바디부와 챔버부를 결합시켜 양막의 부분 가교를 유도할 수 있다. 상피세포를 제거하지 않은 실시예 1.1 의 양막을 사용하였으며, 양막의 상피세포가 있는 면과 주형이 직접 맞닿도록 바디부의 돌출부 위에 양막을 얹은 후 수분흡착용 페이퍼로 수분을 제거한 후 자연건조시켰다. 처음 양막이 건조되면 두 번째 양막을 다시 그 위에 얹고 충분히 자연건조시켰다.
가교제로는 글루타르알데하이드 (Glutaraldehyde, 이하, 'GA'), 다이알데하이드 스타치(Dialdehyde Starch, 이하 'DAS') 를 이용하였다. 가교제는 양막의 주변부만 침지되도록 챔버부에 채워주었으며, 양막의 주변부는 1/3 지점까지 침지하여 고정하나, 확산에 의하여 1/2 지점까지 고정될 수 있으며, 결과적으로 양막 가장자리에서부터, 양막 가장자리로부터 양막 중심까지 거리의 1/3~ 1/2 이내의 위치가 침지되도록 조절하였다.
보다 구체적으로 DAS (BOC sciences, New York, USA)를 45mg/ml이 되도록 PBS(Phosphate-buffered saline)에 녹이고 pH7.4로 조정하였다. 충분히 녹여준 DAS를 건조된 양막 부피의 1/2만큼 챔버부에 채우고 양막을 얹은 주형의 바디부와 결합하여 실온에서 5분간 가교결합시켰다.
0.1% GA (=10mM) (Merck, Darmstadt, Germany) 를 덱스트란 (20%) 용액에 녹여서 준비하였다. GA 를 주형 위에서 건조된 양막 부피의 1/2만큼 챔버부에 채우고 양막을 얹은 주형의 바디부와 결합하여 실온에서 5분간 가교결합시켰다.
가교제가 포함된 용액을 챔버에서 제거하고 1% NaBH4/EtOH 용액을 챔버에 1/2 만큼 채운 후, 실온에서 1분 동안 반응시켰다. 가교결합 처리된 양막의 직경이 18-22mm 되도록 콘택트렌즈 형태로 절단하였으며, 콘택트렌즈 형태로 절단된 가교결합 처리된 양막을 0.2M 글리신 PBS로 여러 번 세척하였다. 최종 산물인 콘택트렌즈 형태로 절단시 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 가장자리에서부터 중심부까지 거리의 1/3 지점이 가교, 고정되고, 중심부까지 나머지 2/3 지점은 미고정된 형태가 되도록 절단하였다. 제작된 양막은 글리세롤(glycerol)과 조직 배양액인 DMEM(dulcecco’s modified eagle medium, phenol red free)이 1:1로 혼합된 보존액에서 -80℃ 에서 냉동보관 (crypreserved)하는 방법과, 동결건조 (lyophilized) 방식의 처리를 거친 후 상온 보관의 두 가지 방식을 사용하였다. 제조된 GA 및 DAS 처리된 부분 가교된 콘택트렌즈형 양막 드레싱을 도 2 및 도 3에 나타내었다.
실시예 2.
실시예 1에서 제조된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 물성을 확인하는 실험을 수행하였다.
2.1 양막의 두께 및 투명도 측정
양막의 두께 측정은 포항공과대학교에서 진행하였다. 양막을 슬라이드 글라스 위에 올리고 Smart Drop(Femtobiomed, Korea) 장비를 이용하여 측면에서 사진촬영 후 1 pixel 당 길이로 양막 단면의 두께를 계산하는 방법을 사용하였다. 비교 대조군으로 가교제가 미처리된 정상 양막을 이용하였으며, 실험군으로 GA, DAS 가교 처리된 양막을 이용하였다. 두께를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 가교제가 미처리된 양막의 두께는 73.12um 으로 나타났으며, GA 및 DAS 처리로 부분 가교된 양막의 두께는 각각 36.36 um, 53.46 um 의 두께로 나타났다. 이러한 결과는 가교제 처리에 의한 부분 가교로 인하여, 두께가 얇아지는 것을 의미한다.
투명도는 양막의 흡광도를 측정 후 식 (Absorbance = -log(Transmittance(%))/100)을 사용하여 계산하였다. 가교 처리한 양막과 하지 않은 양막을 96 well plate의 well 크기에 맞게 biopsy punch로 잘라 담고, 수분을 충분히 제거한 후 microplate reader(Biotek, Winooski, USA)를 이용하여 300nm~700nm(10nm 단위) 파장을 읽어 흡광도를 측정하였다. 위 식을 사용해서 흡광도를 투명도로 바꿔서 양막의 투명도를 측정하였고, 특히 550nm 파장에서의 투명도를 비교분석 하였다. 투명도를 측정한 결과를 도 5 에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 가교제가 미처리된 양막의 함수 전과 DAS 함수 전 처리가 가장 높은 투명도를 보였지만 통계적 유의성은 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 DAS 및 GA 처리에 의한 부분 경화 시 투명도에는 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.
2.2 인장 강도 측정
양막의 인장강도 측정은 포항공과대학교 실험실의 도움을 받아 진행하였다. 5mmX15mm 크기로 양막을 자른 뒤, 양 끝을 클립으로 고정 후 인장강도 측정 장비(자체 실험장비, 분해능: 0.1N)를 사용해 일정한 힘으로 양방향으로 잡아당겼으며, 당기는 시점부터 양막이 끊어지는 순간까지 값을 측정하여 시간당 힘으로 기록하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 가교제의 종류에 따라 기계적 특성이 변화되었으며, GA 처리에 의해 부분 경화된 양막과 DAS 처리에 의해 부분 경화된 양막이 가교제 미처리 정상 양막보다 탄성계수와 인장 강도가 증가하는 것을 확인하였다. GA 처리된 부분 경화 양막은 인장강도가 약 4 배 증가하였으며, DAS 처리된 부분 경화 양막은 인장강도가 약 3배 증가하였다. 이러한 결과는 가교 과정을 거친 부분 경화 양막이 미처리 정상 양막보다 물리적 강도가 현저히 증가함을 보여주는 결과이다.
2.3 세포 생존률 측정
콘택트렌즈로 각막에 착용하기 위해서는 인간 각막에 독성을 나타내지 않아야 하므로, 인간 각막에서 일차 배양한 인간 각막 상피 세포(human cornea epithelial cell, HCEC)를 사용하여 세포 생존률을 확인하였다. 먼저 양막을 콜라겐 1형이 코팅된 디쉬 위에 올리고 잘 붙어있을 수 있게 살짝 말려준 뒤, HCEC를 디쉬에 분주 하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하였다. Live and Dead cell Assay(Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 세포 생존률을 확인하였다. 500umX500um 영역 내의 세포를 5회 반복하여 계수하였고 양막에 부착하여 살아있는 세포의 비율을 조사하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, DAS 로 부분 경화된 양막 실험군은 미처리 정상 양막과 비교하여 부착 세포 수 및 비율에서 통계적 차이를 나타내지 않아 생체 적합성이 매우 우수한 것을 확인하였다.
2.4 조직학적 분석
한 장의 양막은 두께가 너무 얇아 분석이 어려우므로 양막을 세 장 겹쳐 고정하고 Tissue-Tek OCT compound(Sakura Finetek Europe, Zoeterwoudem, NL)에 담궈주었다. 시편을 7um 두께로 잘라서 SuperFrost Plus Microscope slides(Fisher Scientific) 에 올리고 실온에서 30분 건조시킨 뒤 95% EtOH로 5분간 슬라이드에 고정시켰으며, 헤마톡실린-에오신 염색 후 광학현미경을 이용하여 관찰하였다. 기저막 구성 단백질인 콜라겐 IV 형은 면역 염색을 통해 확인하였다. 슬라이드에 부착된 조직을 PBS로 세척하고 1% BSA가 포함된 차단 용액에 1시간 반응시켜 비-특이적인 반응을 억제하였다. 일차 항체는 항-콜라겐 IV 형 (1:200, Abcam, Cambridge, UK)을 사용했고, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 일차항체 세척 후 Alexa-488이 결합된 anti-rabbit(1:200, Abcam, Cambridge, UK)을 이차항체로 사용해 실온에서 1시간 반응시켰다. 핵 염색은 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindol)를 이용하여 대비 염색하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 미처리 정상 양막과 비교하여 DAS 또는 GA 로 부분 경화된 양막에서도 분홍색으로 표시되는 세포질이 감소되지 않고, 콜라겐 IV 형이 감소되지 않는 것을 확인하였으며, 특히 DAS 로 부분 경화된 양막에서는 세포와 콜라겐 IV 형이 뚜렷하게 유지되는 것을 확인하였다.
2.5 성장인자 분석
본원 발명의 방법에 따라 부분 가교 처리한 양막과 처리하지 않은 양막을 각각 동결 건조하여 분말을 얻었고, 배양액은 양막을 세포 배양 접시에 도포한 후 혈청이 포함되지 않은 배지에서 24시간 이상 배양하여 얻었다. 분말 상태의 시료와 배양액의 단백질 함량을 측정한 뒤, 각 시료에 포함된 성장인자를 분석하였다. Human Growth Factor Array Q1(Raybiotech, Norcross, GA, USA)을 사용하였고, Raybiotech사에서 제공하는 분석 툴을 이용하여 표준 커브를 작성하고 농도를 측정하였다.
전체 경화된 콘택트렌즈형 양막과의 비교를 위하여 DAS를 가교제로 하여 전체 경화된 콘택트렌즈형 양막을 제조하고 성장 인자의 발현을 비교하였다. 전체 경화된 콘택트렌즈형 양막은 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, DAS를 건조된 양막 부피와 동일하게 챔버부에 채워 양막을 얹은 주형의 바디부와 결합함으로써, 전체 양막이 DAS 와 접촉하도록 준비한 후 실온에서 5분간 가교결합시켜 제조하였다.
다양한 성장인자의 분비량을 측정하였으며, 배양액 상태에서 측정한 결과를 도 9에, 동결건조 분말 상태에서 측정한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, DAS 로 부분 경화된 양막 (DAS partial AM), GA 로 부분 경화된 양막 (GA partial AM) 은 DAS 로 전체 경화된 AM 과 비교하여 TFGb3, PDGF-AA, EG-VEGF, GDNF, IGFBP-4, BMP-7, NT-3, NT-4 등에서 비슷하거나 현저히 우수한 성장인자 분비능을 나타내었다.
또한 도 10에 나타낸 바와 같이, 동결건조 분말 상태에서 확인한 성장인자 분비능 비교 실험에서도 배양액 상태와 유사한 결과를 확인하였다. DAS 로 부분 경화된 양막 (DAS partial AM), GA 로 부분 경화된 양막 (GA partial AM) 은 DAS 로 전체 경화된 양막과 비교하여 bFGF, HGF, HB-EGF, FGF-7, BDNF, EG-VEGF, GH, IGF-I, IGFBP-6 등에서 비슷하거나 현저히 우수한 성장인자 분비능을 나타내었다.
이러한 결과는 전체 경화된 양막 대비 부분 경화된 양막이 우수한 성장인자 분비능을 갖는 것을 보여주는 결과이다.
2.6 콜라게나아제 에세이
양막을 안구 표면에서 분해하는 주된 성분인 콜라게나아제에 저항성을 가지면 안구 표면에서 분해되지 않고 오랜 시간 머무를 수 있다. 따라서 본 발명의 부분 경화된 양막이 콜라게나아제를 처리하여도 쉽게 분해되지 않는 저항성을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 콜라게나아제 에세이를 수행하였다. 구체적으로 실시예 1에서 제조된 DAS 로 부분 경화된 양막 (DAS partial AM), GA 로 부분 경화된 양막 (GA partial AM)과 비교대조군인 정상 양막을 각각 1X1 cm 조각으로 사용하였으며, 이를 pH 7.5인 PBS 내 0.1% 콜라게나아제 용액 (EC 3.4.24.3, Clostridium histolyticum; Roche, Mannheim, Germany)이 든 페트리 접시에 담궈서 실온에서 관찰하였다. 페트리 접시 아래에 모눈종이를 부착하여, 남은 양막의 모눈눈금을 세는 방식으로 진행하였고, 계산된 값은 백분율로 산출하고 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 부분 경화된 양막은 정상 양막에 비해 분해효소에 대한 저항성이 증가되어 안구표면에서 비교적 오랜 시간 유지될 수 있음을 확인하였다. 이는 안구 표면에서 자연적으로 분해되어 없어지는 양막의 특성을 약 2~3일을 지연시켜 손상 회복 기간을 연장할 수 있다.
2.7 부분 경화 콘택트렌즈형 양막의 상피 회복 촉진 효과
백색 가토를 사용하여 동물 실험을 수행하였으며, 모든 실험동물은 실험 전에 사육환경에 적응시켰다. 수술용 칼을 이용하여 토끼 안구의 전체 각막상피세포를 제거한 후 본원 발명의 실시예에 따라 DAS 처리에 의하여 부분 경화된 양막을 토끼 각막에 콘택트렌즈처럼 착용시켜 24시간 관찰하였다. Sodium fluorescein로 염색 후 세극등으로 촬영하여 상피 회복을 관찰하였고, 상피회복이 되지 않은 면적은 ImageJ 프로그램을 사용해서 계산하였다. 토끼 각막의 상피 결손 비교 면적 결과와 이에 따른 각막 상피 손상 회복 효과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 착용 1일이 지난 후 DAS 처리에 의하여 부분 경화된 양막을 콘택트렌즈처럼 착용한 토끼의 각막에서는 상피 손상 부위가 미착용 각막보다 62% 수준으로 감소한 것을 확인하였다. 이는 부분 경화 양막을 콘택트렌즈처럼 착용하는 경우 각막 상피의 회복을 촉진할 수 있음을 보여주는 결과이다.
상기와 같이 가교제를 이용하여 양막을 부분 경화시켜 제조되는 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 경우 투명도 및 인장강도가 우수하여 제품 경쟁력이 있으며, 전체 경화된 양막 대비 생체 적합성이 우수하고, 성장인자의 분비능이 우수하여 각막 상피를 효과적으로 재생시킬 수 있으므로, 다양한 안구질환, 특히 각막 손상 환자의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Claims (14)

1) 양막을 주형 바디부 중 눈 곡률에 맞춘 볼록한 형태의 돌출부에 위치시킨 후 건조시키는 단계;
2) 상기 1) 단계의 건조된 양막이 위치한 바디부와 챔버부를 결합시키는 단계; 및
3) 가교제를 양막의 주변부만 침지되도록 챔버부에 채워 건조된 양막 주변부를 부분 경화시키는 단계; 를 포함하고,
상기 양막 주변부는 양막 가장자리에서부터, 양막 가장자리로부터 양막 중심부까지 거리의 1/2 내지 1/3 지점까지이며, 양막 중심부는 경화되지 않은 것을 특징으로 하는, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 가교제는 카르보디이미드(carbodiimide), EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드), 다이알데하이드 스타치 (Dialdehyde Starch, DAS), 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde, GA), 포름알데하이드(formaldehyde), 헥사메틸렌 디이소시아네이트 (hexamethylene diisocyanate, HMDI), 덱스트란(dextran) 및 글루코스 용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 3) 단계의 부분 경화는 실온에서 2 내지 10 분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법.
제1항에 있어서, 4) 챔버부에서 가교제를 제거하고 NaBH4/EtOH 용액을 챔버 부피의 1/2만큼 채워 실온에서 0.5 내지 2분간 안정화시키는 단계; 를 더 포함하는, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법.
제5항에 있어서, 5) 부분 경화된 양막을 수득하여 콘택트렌즈 형태로 절단하는 단계; 를 더 포함하는, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법.
제6항에 있어서, 6) 상기 5) 단계의 콘택트렌즈 형태로 절단된 양막을 글리신으로 세척하는 단계; 를 더 포함하는, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법.
제7항에 있어서, 7) 상기 6) 단계의 글리신으로 세척된 양막을 동결건조 (lyophilzation) 또는 냉동하는 단계; 를 더 포함하는, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱의 제조방법.
콘택트렌즈형 양막 드레싱에 있어서,
상기 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 양막 주변부만 부분 경화된, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱인 것을 특징으로 하며,
상기 양막 주변부는 양막 가장자리에서부터, 양막 가장자리로부터 양막 중심부까지 거리의 1/2 내지 1/3 지점까지인, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱.
제9항에 있어서, 상기 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 제1항, 제2항, 제4항, 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱.
제9항에 있어서, 상기 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 가교제 미처리 양막 대비 2 내지 4 배의 인장 강도를 갖는 것을 특징으로 하는, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱.
제9항에 있어서, 상기 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 전체 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱과 비교하여 성장 인자 분비능이 증가된 것을 특징으로 하는, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱.
제9항에 있어서, 상기 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 안구 질환 치료용인, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱.
제9항에 있어서, 상기 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱은 안구 상처 치료용인, 부분 경화된 콘택트렌즈형 양막 드레싱.
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