KR101187423B1 - 양막의 가용화를 통한 양막의 성분 추출방법 및 그 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양막을 아세트산 (acetic acid) 및 3-머캅토프로피온 산 (3-mercaptopropionic acid)을 용매로 초음파 (sonication)를 통해 가용화를 시킴으로써 양막의 주요 성분을 손상 없이 추출하는 방법 및 그 추출물에 관한 것이다.
본 발명은 기존의 가용화 방법과 달리 초음파에 의한 가용화를 통해 양막의 주요 성분인 FGF, EGF, KGF, NGF, HGF등의 성장인자를 최대한 많고 손상 없이 추출할 수 있다. 또한 추출된 양막의 성분들을 화상치료제나 상처치료제로서 사용할 수 있다.

Description

양막의 가용화를 통한 양막의 성분 추출방법 및 그 추출물 {Method for Extracting Component of amnion membranes by solubilization of amnion membranes and extract thereof}

본 발명은 양막을 아세트산 (acetic acid) 및 3-머캅토프로피온 산(3-mercaptopropionic acid)을 용매로 초음파 (sonication)를 통해 가용화를 시킴으로서 양막의 주요 성분을 손상 없이 추출하는 방법 및 그 추출물에 관한 것이다.

태반은 일반적으로 태아와 모체에서 유래한 조직으로부터 형성되는데, 모체의 자궁점막에서 유래한 탈락막과 수정란에서 유래한 융모막, 양막 등으로 이루어져 있는 것으로서 태아와 모체 사이의 물질교환이 일어나는 기관을 말한다.

양막은 융모막 (chorion laeve membrane)이 붙어있으며, 태아를 보호하고 떠 받혀주기 위한 양수로 채워져 있는 태반을 구성하고 있는 가장 안쪽에 있는 투명하고 얇은 막이다. 양막은 콜라겐으로 이루어져있고, 각종 성장 인자 (growth factor) 즉, 표피세포 성장인자 (EGF, epidermal growth factor), 섬유아세포 성장인자 (FGF, fibroblast growth factor), 각질세포 성장인자 (KGF, keratinocyte growth factor), 신경 성장인자(nerve growth factor : NGF), 간장 성장인자(hepatic growth factor : HGF)등을 포함하고 있다.

양막은 이와 같은 성장 인자 (growth factor)를 포함하고 있어, 1900년대 초기에 화상치료용 드레싱으로 사용되기 시작하여 그 효능의 우수성이 알려짐에 따라 근래에 와서는 화상뿐만 아니라 피부 찰상 (dermabrasion), 궤양 말기 (lower extremity ulcers), 나병으로 인한 피부장애 (leprotic dermal lesions), 스티븐-존슨 증후군 (stevens-johnson syndrom), 복구를 위한 외과 수술, 후두학, 안과학 등과 선천적 질병, 파킨스 증후군 (parkinson syndrom), 말초와 중앙신경의 축색 (axonal)의 재생을 촉진하는데 사용되고 있다 [tyszkiewicz et.al, amnion allografts prepared in the central tissue bank in warsaw, annals of transplantation, vol.4, no.3-4, 1999, pp.85-90].

기존에는 양막 성분 추출 시 성장 인자들의 손상이 많아서 한계점을 가지고 있었다.

이에 본 발명자는 최대한으로 양막 성분을 추출할 수 있으며, 양막 성분의 손상 없이 추출하는 방법을 고안하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 양막을 초음파를 통해 가용화 시킴으로써, 양막의 주요 성분을 손상 없이 제공함을 목적으로 한다. 보다 구체적으로, 양막을 아세트산 (acetic acid) 및 3-머캅토프로피온 산 (3-mercaptopropionic acid)을 용매로 초음파 (sonication)를 통해 가용화를 시킴으로서 양막의 주요 성분을 손상 없이 추출하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아세트산(acetic acid) 및 3-머캅토프로피온 산(3-mercaptopropionic acid) 존재 하에 초음파를 방사하여 양막의 성분을 추출하는 방법을 제공한다.

상기 아세트산(acetic acid)은 5~30% 아세트산(acetic acid)인 것이 바람직하고, 10% 아세트산이 보다 바람직하다.

상기 양막의 성분 추출은 보다 구체적으로,

(a) 양막에 용매인 5~30% 아세트산(acetic acid) 및 3-머캅토프로피온 산(3-mercaptopropionic acid)을 가하고 초음파 처리하는 단계;

(b) 초음파 처리 후 원심분리시켜 상등액을 얻는 단계;

(c) 상기 상등액에서 용매를 제거하고 동결 건조시키는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 양막의 성분을 추출하는 방법을 제공한다.

상기 양막의 성분은 성장 인자(growth factor)인 것을 포함할 수 있다.

상기 성장 인자는 EGF(epidermal growth factor), FGF(fibroblast growth factor), KGF(keratinocyte growth factor), NGF(nerve growth factor), HGF(hepatic growth factor)이 바람직하다.

본 발명은 상기 양막 성분 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 양막 성분 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화상 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 양막 성분 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명은 기존의 가용화 방법과 달리 초음파에 의한 가용화를 통해 양막의 주요 성분인 FGF, EGF, KGF, NGF, HGF 등의 성장인자를 최대한 많고 손상 없이 추출할 수 있다. 또한 추출된 양막의 성분들을 화상치료제나 상처치료제로서 사용할 수 있다.

도 1은 토끼의 오른쪽 귀의 창상 부분이다. 8mm 생검펀치(biopsy punch) 로 토끼 귀에 입힌 피부 전 층 창상의 위치를 표시하고 있다. A1은 대조군으로 occlusion dressing 만을 적용한 창상이고, A2, A3, A4 는 각각 양막추출물 ( 3.6 ug/mL)를 피부에 4회 주입한 것이다.
도 2는 창상 후 28일 후의 창상의 치유정도를 관찰한 사진이다. 대조군(A1)에 비해서 양막 추출물 처리 군(A2,A3,A4)이 재상피화가 빨리 진행되어 창상이 아무는 속도가 빠른 것을 보여주고 있다. 왼쪽 위는 아무 처리 안 하고, 왼쪽 아래, 오른쪽 모두:3.6μg/㎕(A) 양막 용액 4차 처리한 것이다.
도 3은 창상 후 44일 후의 창상의 치유정도를 관찰한 사진이다. 대조군(A1)에 비해서 양막 추출물 처리 군(A2,A3,A4)이 재상피화가 빨리 진행되어 창상이 아무는 속도가 빠른 것을 보여주고 있다. 왼쪽 위는 아무 처리 안 하고, 왼쪽 아래, 오른쪽 모두:3.6μg/㎕(A) 양막 용액 4차 처리한 것이다.
도 4는 창상 후의 일(day)에 따른 창상 부위(area)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 창상 후의 일(day)에 따른 창상 지름을 나타낸 그래프이다.
도 6은 양막 추출물의 처리 및 미처리 시 0, 6, 10, 24시간 후의 섬유아세포(fibroblast)의 현미경 관찰을 나타낸 것이다.
도 7은 물과 아세트산(acetic acid) 및 머캅토프로피온 산(mercaptopropionic acid)을 용매를 사용하여 초음파 처리 시 가용화된 양의 차이를(백분율) 나타낸 그래프이다.
도 8은 물과 아세트산(acetic acid) 및 머캅토프로피온 산(mercaptopropionic acid)을 용매를 사용하여 초음파 처리 시의 양막에 있는 성장인자의 양의 차이를 나타낸 그래프이다.
도 9는 아세트산(acetic acid) 및 머캅토프로피온 산(mercaptopropionic acid)을 용매를 사용하여 초음파 처리 및 미처리 시 양막에 있는 성장인자의 양의 차이를 나타낸 그래프이다.
도 10은 아세트산(acetic acid) 및 머캅토프로피온 산(mercaptopropionic acid)을 용매를 사용하여 초음파 처리 및 미처리에 따른 양막의 가용화 정도를 나타낸 것이다.
도 11은 양막을 동결 건조한 사진이다.

본 발명의 일실시예에서는 아세트산(acetic acid) 및 3-머캅토프로피온 산(3-mercaptopropionic acid) 존재 하에 초음파를 방사하여 양막의 성분을 추출하는 방법을 제공한다. 상기 아세트산(acetic acid)은 5~30% 아세트산(acetic acid)이 바람직하고 10% 아세트산(acetic acid)이 보다 바람직하다.

상기 양막의 성분 추출은 보다 구체적으로,

(a) 양막에 용매인 5~30% 아세트산(acetic acid) 및 3-머캅토프로피온 산(3-mercaptopropionic acid)을 가하고 초음파 처리하는 단계;

(b) 초음파 처리 후 원심분리시켜 상등액을 얻는 단계;

(c) 상기 상등액에서 용매를 제거하고 동결 건조시키는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 양막의 성분을 추출하는 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계의 초음파 처리를 통하여 양막을 가용화 시킬 수 있다. 또한 10% 아세트산 (acetic acid) 및 3-머캅토프로피온 산 (3-mercaptopropionic acid)을 용매로 사용함으로서 양막의 가용화의 효율을 높일 수 있고, 양막의 주요 성분을 최대한 손상 없이 추출할 수 있게 된다.

상기 양막의 성분은 성장 인자 (growth factor)인 것을 포함할 수 있다. 상기 성장 인자는 이에 제한되지 않으나, 표피세포 성장인자 (EGF, epidermal growth factor), 섬유아세포 성장인자 (FGF, fibroblast growth factor), 각질세포 성장인자 (KGF, keratinocyte growth factor), 신경 성장인자(nerve growth factor : NGF), 간장 성장인자(hepatic growth factor : HGF) 등을 포함할 수 있다.

상기 원심분리는 5000~9000rpm 10~50분으로 하는 것이 바람직하다. 원심분리 후 침전물은 버리고 얻은 상등액을 1~3일 동안 투석 시켜 3-mercaptopropionic acid 및 10% acetic acid를 제거할 수 있고 , 동결건조기(Freeze Dryer)를 이용하여 동결 건조시켜 스폰지로 만드는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 실시예에서는 상기 양막의 성분 추출방법에 의해서 추출된 양막 성분 추출물을 제공한다.

상기 양막의 성분은 성장 인자(growth factor)인 것을 포함할 수 있고 성장인자에는 이에 제한되지 않으나, 표피세포 성장인자(EGF, epidermal growth factor), 섬유아세포 성장인자(FGF, fibroblast growth factor), 각질세포 성장인자(KGF, keratinocyte growth factor), 신경 성장인자(nerve growth factor : NGF), 간장 성장인자(hepatic growth factor : HGF)등을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 양막 성분 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 조성물 또는 화상 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상처 치료용 조성물 또는 화상 치료용 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 양막 성분 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다. 바람직하게는 국소형 제형이다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 바람직하게는 국소적으로 투여되는 경우이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

또한, 본 발명의 일실시예에서는 양막 성분 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 양막 성분 추출물은 구체적인 양태에 있어서 화장품 조성물로 파악할 수 있다. 본 발명의 화장품 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무주 및 수계), 무수생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 양막 성분 추출물 이외에 화장품 제제에 있어서 수용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기에서의 "화장품 제제에 있어서 수용 가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화장품 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉 시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 방부제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 이러한 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 방부제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

상기 담체는 본 발명의 화장품 조성물의 전체 중량을 기준으로 하였을 때 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 40 중량 % 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 본 발명의 화장품 조성물이 제조되는 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 >

1. 재료

양막(amnion membrane(bioland, korea)), 아세트산(acetic acid(samchun)), 3-머캅토프로피온 산(3-mercaptopropionic acid(aldrich)), 반투막(Dialysis tubing(sigma)), FGF basic Immunoassay(R&D)을 준비 하였다.

2. 실험 방법

양막의 가용화 및 양막의 성분 추출

양막을 10% 아세트산(acetic acid) 1.25mol/L로 3-머캅토프로피온 산(3-mercaptopropionic acid)에 3%(w/v, g/ml)로 초음파(sonication(power:50%)) 처리하여 가용화 시켰다. 그 후 7000rpm 30분으로 원심분리 시키고 상등액을 2일 동안 투석 시켜 3-mercaptopropionic acid 및 10% acetic acid를 제거했으며, 동결건조기(Freeze Dryer)를 이용하여 동결 건조시켜 스폰지로 만들었다.

성장인자( growth factor )의 정량

상기 동결 건조시켜 만들어진 스폰지에 10mM HCL에 녹여서 용액으로 만들어 growth factor를 정량한다.

용매에 대한 이점을 알아보기 위하여 물에 녹인 양막과 10% acetic acid 1.25mol/L로 3-mercaptopropionic acid에 녹인 양막을 초음파(sonication)처리하고 가용화의 효능(efficiency)과 정량된 성장인자를 비교하여 보았다 (도 7, 도 8).

초음파의 처리에 따른 효과

초음파 처리에 따른 성장인자의 양 및 양막의 가용화 정도를 알아보기 위하여, 용매로 10% acetic acid 1.25mol/L을 3-mercaptopropionic acid에 녹인 양막을 초음파(sonication)처리 및 미처리 시 성장인자의 양 및 양막의 가용화 정도를 측정해 보았다(도 9, 도 10참조).

양막 성분의 상처치료 효과 실험

토끼(Rabbit)를 고정대에 넣어, 귀(ear) 면도 후 창상(wound) 8 부분을 표시(1㎠) 하고 에틸에테르(ethyl ether) 10ml로 흡입 마취시켰다. 단, Rabbit의 머리에 힘이 풀리거나, 빨라진 심장박동이 느려지거나, 신음 및 심한 발작현상을 보이면 즉시 중단하여야 한다.

창상을 주기 한 시간 전에 해당 부분에 양막 solution을 각각40㎕씩 주입했다(solution의 종류 : 3.6μg/㎕(A)). 주사기(syringe)는 사용 전에 70% EtOH을 사용하여 내부 및 외부 소독을 하고, 멸균기를 사용하여 고온고압 멸균 및 자외선 처리하여 주사 바늘은 Rabbit ear의 앞뒤 사이에 위치하도록 하여 주사하였다.

양막 solution주입 한 시간 후, 창상을 가할 부분에 소독한 후 surgical punch를 사용하여 wound 8 sites에 구멍 뚫었다.

Wound injury 1시간 전, 1일, 2일, 3일 후, 해당 wound site에 각각 총 네 곳에 10 ㎕ 씩 주사 후 듀오덤(Duoderm)으로 덮어 두었다(총 40㎕ ). 단, open인 경우 아무처리를 하지 않고 그냥 놔두었다.wound가 가해진 시점에서 phase 기간에 따른 치료 비교를 위해 Rabbit ear의 wound sites를 관찰하였고 염증을 막기 위해 매일 cephalodin을 피하주사(50mg/kg )주사였다.

세포의 흡착 및 증식 실험

섬유아세포(Primary human foreskin fibroblasts)를 6웰 플레이트(well plate)에 (4X10⁵ cells/well)에 seeding 후 DMEM 배양액에 10% 열에 불활성인 우 태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 100 units/mL 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin)을 첨가하여 배양하였다. 세포가 거의 융합하면 yellow tip 끝으로 scratch한 후 양막 (0, 1, 10ul)을 첨가하여 배양시킨 후 각 시간마다 (0, 6, 10, 24hr) 사진을 찍어 배양액 중에 첨가된 양막 , 이동 및 증식 정도를 비교 평가하였다(도 6).

3. 실험 결과

양막 성분의 상처치료 효과

도 2와 도 3에서는 대조군(A1)에 비해서 양막 추출물 처리 군(A2,A3,A4)이 재상피화가 빨리 진행되어 창상이 아무는 속도가 빠른 것을 알 수 있었다.

세포의 흡착 및 증식

도 6에서는 양막 추출물을 1ul(3.6ug)을 처리하였을 때 control에 비해 세포의 이동성이 약간 증가한 것을 관찰할 수 있었으나, 10ul(36ug)처리하였을 때는 오히려 이동성이 감소하였다.

이 같은 창상의 개선치유 능의 기전을 이해하기 위하여, In vitro 섬유아세포 창상모델에 양막 추출물을 처리 시 세포의 이동 및 증식이 증대됨을 관찰하였다. 이는 양막추출물이 세포의 흡착 및 증식의 개선을 통하여 토끼의 창상개선효과를 나타냄을 알 수 있었다.

가용화의 효능( efficiency )과 정량된 성장인자

양막의 가용화 된 정도를 비교하면(도 7참조) 물을 용매로 사용하고 초음파를 처리했을 때에는 약 4%가 가용화가 되었지만 본 발명의 용매인 10% acetic acid 1.25mol/L로 3-mercaptopropionic acid에 초음파 처리하여 가용화 시켰을 때는 약10%가 가용화가 됐음을 알 수 있었다.

용매에 따른 growth factor(bFGF)양을 비교하면(도 8), 물을 용매로 사용하고 초음파 처리 하여 가용화 시켰을 때보다 용매 10% acetic acid 1.25mol/L로 3-mercaptopropionic acid에 초음파 처리하여 가용화 시켰을 때는 growth factor(bFGF)가 정량이 더욱 많이 됨을 알 수 있었다.

초음파의 처리에 따른 효과

초음파(sonication)처리에 따른 성장인자의 양을 비교하면 초음파 처리하여 가용화 시켰을 때 초음파 미처리 시보다 growth factor(bFGF)가 정량이 더욱 많이 됨을 알 수 있었다(도 9참조).

초음파(sonication)처리에 따른 양막의 가용화 정도를 비교하면 용매 10% acetic acid 1.25mol/L로 3-mercaptopropionic acid에 초음파 처리하지 않은 것은 양막의 가용화가 5%미만이나, 이에 비해 초음파처리 시 10%정도 가용화가 되는 것을 볼 수 있었다(도 10참조).

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. (a) 양막에 5~30% 아세트산 수용액 및 3-머캅토프로피온산을 가하고 초음파 처리하여 가용화시키는 단계;
   (b) 초음파 처리 후 원심분리하여 상등액을 얻는 단계; 및
   (c) 상기 상등액에서 아세트산 수용액 및 3-머캅토프로피온산을 제거하고 동결 건조시키는 단계;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는, 양막에서 성장인자인 FGF(fibroblast growth factor)를 추출하는 방법.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

Images