KR20020053060A

KR20020053060A - 각막굴절교정용 렌즈의 착용중 또는 착용후에 각막 조직을안정화시키기 위한 조성물

Info

Publication number: KR20020053060A
Application number: KR1020027003389A
Authority: KR
Inventors: 브루스 에이치 드울프손; 데일 피 드보어
Original assignee: 브루스 에이치 드울프손; 데일 피 드보어
Priority date: 1999-09-15
Filing date: 2000-09-15
Publication date: 2002-07-04
Also published as: DK1218027T3; DE60043736D1; JP4786095B2; WO2001019386A2; JP2003509376A; ATE455556T1; CN1390133A; EP1218027B1; EP1218027A2; KR100720291B1; ES2338750T3; AU7580200A; JP2011063602A; WO2001019386A3; CN1214815C

Abstract

본 발명은 각막굴절교정술 도중이나 그 이후에 사용하여 각막 조직이 다시 원래 각막의 전면 곡률로 이완되는 것을 방지하거나 지연시키는, 점안제 전달 시스템을 갖는 두가지 유형의 조성물에 관한 것이다. 각각의 조성물은 서로 독립적으로 작용하며, 안정화제를 제조하기 위한 상이한 조성물이다. 첫 번째 조성물은 단속성 3중 나선을 갖는 원섬유 결합 콜라겐(fibril associated collagen with interrupted triple-helix, FACIT) 및/또는 소(小) 류신-풍부 반복 프로테오글리칸(small leucine-rich repeat proteoglycan, SLRP)을 포함하는 생물학적으로 적합한 조성물에 관한 것이다. 원섬유 결합 콜라겐 계열은 VI형 콜라겐, XX형 콜라겐, XII형 콜라겐 및 XIV형 콜라겐과 같은 다양한 유형의 콜라겐을 포함한다. 소 류신-풍부 반복 프로테오글리칸 계열은 데코린, 케라토칸, 비글리칸, 에피피칸, 루미칸, 미미칸 및 피브로모듈린을 포함한다. 두 번째 조성물은 조직, 혈장 또는 표피의 통상적인 성분으로 발견되는 효소, 예를 들면 트랜스글루타미나제를 포함한다.

Description

각막굴절교정용 렌즈의 착용중 또는 착용후에 각막 조직을 안정화시키기 위한 조성물{COMPOSITION FOR STABILIZING CORNEAL TISSUE DURING OR AFTER ORTHOKERATOLOGY LENS WEAR}

인간 각막의 구조 및 구성: 각막은 안구 광학계의 첫 번째의 가장 강력한 굴절 표면이다. 망막 수용체에 선명한 상을 맺기 위해서는 각막이 투명하고 적절한 굴절력을 가질 필요가 있다. 각막의 굴절력은 주로 각막의 곡률 및 각막의 굴절률이라는 두가지 요인에 따라 달라진다. 각막이 기형이거나 또는 안구의 축방향 길이가 너무 길거나 짧거나 또는 안구의 수정체가 비정상적으로 작용하는 경우, 근시, 난시, 원시 등과 같은 다양한 시각 관련 문제들이 야기될 수 있다. 상기 문제들을 교정하기 위해서는 안경 또는 콘택트 렌즈가 필요하다. 안경은 빛이 각막에도달하기 전에 렌즈를 이용하여 빛을 굴절시켜 빛이 각막에 들어가는 각도를 변화시킴으로써 굴절 이상을 교정한다. 콘택트 렌즈는 안구가 정시안이 되게 하도록 계산된 전면 곡선의 콘택트 렌즈로 기형 각막을 대체함으로써 안구의 굴절 이상을 교정한다. 그러나, 렌즈를 빼면, 각막은 여전히 기형이거나 결함이 있으며 굴절 이상은 여전히 남게 된다.

각막은 습윤 중량 기준으로 75 내지 80%의 물을 함유한다. 나머지 20 내지 25%의 고체 중에는 대부분이 콜라겐이거나, 또는 다른 단백질, 및 글라이코스아미노글리칸이다. 각막 간질의 골격을 형성하는 각막 원섬유는 순수하게 구성되며 콜라겐의 전형적인 64 내지 66 nm 주기성을 나타낸다. 그러나, 각막 콜라겐의 물리화학적 성질은 건 및 피부 콜라겐의 상기 성질과 크게 다르지 않다. 상기 다른 근원의 콜라겐과 마찬가지로, 각막 콜라겐은 높은 질소, 글라이신, 프롤린 및 하이드록시프롤린 함량을 갖는다. 비등수 또는 산에서, 각막 콜라겐은 젤라틴으로 전환되며, 콜라겐은 콜라게나제, 펩신 또는 파파인과 같은 단백질가수분해 효소에 의해 용해될 수 있다.

각막굴절교정술: 각막굴절교정술은 안구의 굴절 이상을 개선하기 위한 비수술적 절차이며, 예를 들면, 레이저 안구수술에 대한 대체 방법이다. 구체적으로, 각막굴절교정술은 환자 각막의 곡률을 재성형하기 위한 치료 절차이다. 통상적인 각막굴절교정술은 각막을 점진적으로 재성형하여 보다 구형의 전면 곡률을 만들기 위한 일련의 점진적인 콘택트 렌즈들을 이용함을 포함한다. 상기 과정은 3 내지 6쌍의 콘택트 렌즈의 착용을 포함할 수 있으며, 전통적으로 광학적 재성형을 달성하는데 대략 3 내지 6 개월이 소요되었다. 상기 절차는 근시 및 난시를 경감시키거나 배제시켜 원래의 시각을 개선하고 정시안(시각이 제로(0) 굴절 이상을 나타내거나 교정이 필요없는 상태)을 만드는 것으로 입증되었다. 최근 각막굴절교정용 렌즈 디자인에서의 개선으로 인해 훨씬 더 신속하게 정시안을 달성하는 것이 가능하다. 많은 경우에서, 상기 정시안은 한 쌍의 최종 결과용 렌즈의 하룻밤 착용으로 달성될 수 있다.

각막굴절교정술에 따른 문제는 재성형된 각막 조직이 그의 원래의 곡률에 대한 기억을 유지시켜 렌즈를 제거한 후 원래의 곡률로 이완되고 복귀되려는 경향이 있다는 것이다. 그러므로, 각막굴절교정술 환자가 최대 결과에 이른 경우, 유지용 콘택트 렌즈는 결과를 확고히 하기 위해 전시간 착용 또는 한시적 착용에 대해 처방된다. 유지용 콘택트 렌즈는 전형적으로 경질의 기체 투과성 물질로 제조되어 왔다. 각막굴절교정술 환자는 목적하는 결과를 신속히 얻기 위해 밤동안 유지용 콘택트 렌즈를 점점 더 많이 착용하며, 낮시간의 활동 중에는 거의 정시안의 시각을 누리게 된다. 상기와 같은 양식의 단점은 각막의 이전 형태로의 복귀로부터 각막을 유지시키기 위해 매일밤 유지용 렌즈를 착용할 필요가 있다는 것이다.

각막 성형술: 상기 문제를 해결하기 위한 관련된 절차는 각막을 일시적으로 연화시키는 각막 연화제를 사용하여 정시안을 만들기에 바람직한 형태로 보다 용이하게 재성형될 수 있다. 각막 성형술 절차는 1회의 통원치료로 수행되거나 또는 수주간의 기간에 걸쳐 수행되는 3 단계 과정이다. 상기 3 단계 과정은 첫째, 연화제를 각막에 투여하여 각막 조직을 연화시키고; 둘째, 경질 콘택트 렌즈를 각막 위에 착용시켜 안구를 정시안이 되게 하고; 셋째, 안정화제를 투여함을 포함한다. 그런 다음, 각막을 재성형하고 경질 콘택트 렌즈에 의해 결정되는 목적하는 형태에 순응시킨다. 각막 연화제를 투여하면 보다 단기간에 보다 큰 굴절 이상을 교정하는 것이 용이하게 된다.

그러나, 각막 조직의 재성형을 조절하기 위해 시각의 축에 대해 성형 콘택트 렌즈를 정확히 배치하기는 어려운 것으로 밝혀졌다. 몇몇 실패한 적용에서, 각막 성형술은 성형 콘택트 렌즈를 잘못 배치함으로써 야기된 이상으로 인해 난시 또는 복시를 유도하였다. 또한, 상기 3 단계는 모두 1회 통원치료에서 수행되기 때문에, 환자들은 재성형된 각막 조직의 결과에 대해 반응할 기회를 갖지 못한다. 환자는 수술 과정동안 "한번 보거나(try and see)" 또는 자신의 결정을 바꿀 수 없다.

전술한 내용들로 미루어 보아, 예를 들면, 환자가 교정을 영구적으로 만들 것인지를 선택할 때까지 절차가 가역적이도록 하기 위해 이전의 시력 수준으로 다시 되돌리는 선택권은 유지시키면서, 환자가 신속히 정시안에 이를 수 있게 하는 시력 교정 절차를 수행하기 위한 개선된 방법이 필요하다. 또한, 각막 기질을 안정화시키는 조성물 및 상기 조성물을 제조하고 투여하는 방법이 필요하다. 조성물은 각막굴절교정술로부터 비롯되는 각막의 곡률을 안정화시켜 각막굴절교정술 환자가 경질의 유지용 콘택트 렌즈를 착용할 필요가 없어지고 연화제를 투여할 필요가 없어지며 환자가 교정을 영구적으로 할 지를 확신할 때까지 원래의 각막 곡률로 복귀할 기회를 남겨 놓을 수 있어야 한다.

본 발명은 각막굴절교정술에 의해 형성된 각막 곡률을 유지시키기에 적합한 화학 조성물, 이러한 화학 조성물의 제조 방법 및 각막굴절교정술 치료를 받은 후에 각막 곡률을 유지시키기 위해 각막에 상기 화학 조성물을 투여하는 방법에 관한 것이다.

도 1a 내지 1e는 본 발명에 따른 안정화제 성분으로 처리된 각막에서 상기 성분이 각막 조직에 침투하여 작용하는 양태를 나타내는 공초점 현미경 사진들이다.

도 2는 본 발명에 따른 안정화제 성분으로 처리된 각막 시험편의 공초점 현미경 사진이다.

도 3은 본 발명에 따른 안정화제 성분으로 처리되지 않은 각막 시험편의 공초점 현미경 사진이다.

본 발명의 이점 및 목적의 일부는 하기 설명에 나타낼 것이며, 일부는 설명으로부터 명백하거나 본 발명의 실시에 의해 습득될 수 있다. 본 발명의 이점 및 목적은 첨부된 청구의 범위에 특별히 지적한 구성 요소들 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.

본원에서 구체화되고 광범위하게 기술한 바와 같이, 본 발명의 이점을 달성하기 위해서 및 본 발명의 목적에 따라, 본 발명의 첫 번째 태양은 각막굴절교정술 후에 각막 조직의 목적하는 형태를 유지시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 단속성 3중 나선을 갖는 원섬유 결합 콜라겐(fibril associated collagen with interrupted triple helix, "FACIT") 및 소(小) 류신-풍부 반복 프로테오글리칸(small leucine-rich repeat proteoglycan, "SLRP") 중 하나 이상을포함하는 콜라겐 조성물로 이루어진 안정화제 형태를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 안정화제는 각막 조직을 안정화시켜 목적하는 형태를 유지시킨다.

본 발명의 두 번째 태양도 또한 각막굴절교정술 후에 각막 조직의 목적하는 형태를 유지시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 단백질-유도된 트랜스글루타미나제로부터 얻은 안정화제를 환자에게 투여함으로써 안정화제가 각막 조직을 안정화시켜 목적하는 형태를 유지시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 세 번째 태양은 FACIT 및 SLRP 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 네 번째 태양은 각막굴절교정술로부터 비롯된 각막 곡률을 유지시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 각막 연화제를 투여하지 않고도 콜라겐 원섬유와 반응함으로써 각막 곡률을 안정화시키는 조성물을 각막에 투여하는 단계, 및 각막에서 콜라겐 원섬유를 결합시키는 가교를 형성하여 콜라겐 원섬유의 이동을 제한하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다섯 번째 태양은 화학 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 생리학적으로 적합한 용액에 FACIT 및 SLRP로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 용해시키는 단계, 및 수득된 용액을 생리학적으로 적합한 pH 수준으로 완충시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 여섯 번째 태양은 각막굴절교정술로부터 비롯된 재성형된 각막에 투여하기 위한 화학 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 완충액중의 트랜스글루타미나제를 제조하는 단계, 수득된 용액을 멸균수와 혼합하여 희석하는 단계, 및 염화 칼슘을 첨가하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일곱 번째 태양은 환자의 각막 곡률을 교정하기 위한 각막굴절교정술에 관한 것이다. 상기 절차는 각막굴절교정용 렌즈를 환자의 안구에 삽입하여 안구의 연화되지 않은 각막 조직을 각막굴절교정용 렌즈에 의해 결정된 미리 선택된 형태로 재성형하는 단계, 및 각막 조직을 미리 선택된 형태로 안정화시키기 위해 환자의 안구에 안정화제를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 여덟 번째 태양은, 연화되지 않은 각막 조직을 각막굴절교정용 렌즈에 의해 결정된 미리 선택된 각막 형태로 재성형하기 위해 환자의 안구에 삽입되도록 제조된 각막굴절교정용 렌즈, 및 각막 조직을 미리 선택된 형태로 안정화시키기 위해 환자의 안구에 투여되는 안정화제를 포함하는 각막굴절교정술 시스템에 관한 것이다.

전술한 일반적 설명 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적인 것일 뿐이며 청구된 바와 같은 본 발명을 제한하는 것이 아님을 주지해야 한다. 또 다른 이점들은 하기의 설명에 나타낼 것이며, 일부는 설명으로부터 주지되거나 또는 본 발명의 실시에 의해 교지될 수 있다. 본 발명의 이점 및 목적은 첨부된 청구의 범위에 나타낸 조합들에 의해 습득될 수 있다.

이제 본 발명의 여러 태양들을 상세히 언급할 것이다. 본 출원은 조성물을 개시하고 있으며, 상기 조성물을 제조하는 방법 및 상기 조성물을 각막에 투여하여 각막굴절교정용 렌즈를 착용하는 기간 동안 또는 후에 투여하는 경우 각막 교정 결과를 실질적으로 유지함으로써 경질의 유지용 콘택트 렌즈를 착용할 필요를 배제시키는 방법을 교지하고 있다.

본 발명에 따른 가속적 각막굴절교정술은 한 쌍의 각막굴절교정용 렌즈를 착용하여 각막 조직을 재성형하는 단계, 및 재성형된 각막 조직을 안정화시켜 각막 조직이 원래의 각막 곡률로 이완되는 것을 지연시키는 단계를 포함한다. 안정화제는 각막 조직의 재성형을 영구적이 되게 한다. 가속적 각막굴절교정술은 예정된 기간동안, 예를 들면, 약 24 시간동안 정시안 시각을 제공한다.

본 발명에 따른 가속적 각막굴절교정술에서, 환자는 재성형된 각막 조직을 통해 보는 것을 누리도록 안정화제를 투여하지 않고, 아마도 저녁에 유지용 렌즈로서 각막굴절교정용 렌즈를 착용하는 것을 선택할 수 있다. 결과가 불만족스럽다면, 환자는 각막을 검사하여 새로운 쌍의 각막굴절교정용 렌즈를 착용할 것인지를 안과의사 또는 검안사와 상의할 수 있다. 환자가 만족하고 상기 결과를 영구적으로 만들 것을 결정하면, 환자는 안정화제를 투여하여 각막 조직이 그의 원래의 각막 곡률로 이완되는 것을 지연시킴으로써 재성형된 각막 조직을 영구적으로 안정화시킬 수 있다. 안정화제는 각막 조직을 재성형후의 새로운 형태로 신속히 재안정화시킨다.

각막굴절교정용 렌즈는 눈꺼풀의 기계적 압력 또는 천연 누액이든 인공 누액이든 누액의 수압 펌프 작용을 이용하여 각막 조직을 점진적으로 재성형하도록 설계되는 것이 바람직하다.

본원에 따르면, 안정화제로 사용하기에 적합한 조성물의 두가지 이상의 대체 유형이 개시되어 있다. 각각의 조성물은 독립적으로 작용하며 각막 곡률을 안정화시키기 위한 상이한 접근 방법을 제공한다. 이들 조성물은 일반적으로 하나 이상의 FACIT 또는 SLRP를 함유하는 조성물, 또는 트랜스글루타미나제 효소 조성물로서 규정된다.

본 발명의 첫 번째 접근 방법에 따르면, 안정화제용 조성물은 안구의 콜라겐 기질을 안정화시키기에 적합한, 바람직하게는 생물학적으로 상용성인 조성물에 관한 것이다. 각막 콜라겐 원섬유는 천연 결합 거대분자와 결합된다. 본 발명에 따른 안정화제는 일반적으로 상기 두 그룹의 거대분자, 즉, 통상적으로 "FACIT"로 약칭되는 단속성 3중 나선을 갖는 원섬유-결합 콜라겐, 및 "SLRP"로 약칭되는 소 류신-풍부 반복 프로테오글리칸으로부터 선택된 하나 이상의 화합물로 이루어진다.

투여시에, FACIT 및 SLRP의 세포외 기질 성분들은 각막 콜라겐 원섬유와 가교결합하고 원섬유 직경을 제어함으로써 안정화제로서 작용한다. 안정화제는 또한 가교를 형성할 수 있으며, 원섬유들이 서로 결합하는데 관여되어 원섬유들이 서로를 지나 미끄러지는 원섬유의 능력을 제한할 수 있다. 이러한 가교는 약간의 유연성을 허용하지만 원섬유들이 이동할 수 있는 거리를 한정한다.

본 발명의 생물학적으로 상용성인 콜라겐성 반응 생성물을 생성하는데 유용한 콜라겐의 여러 유형은 VI형 콜라겐, XX형 콜라겐, XII형 콜라겐 및 XIV형 콜라겐을 포함하는 그룹에서 선택할 수 있다. 상기 유형들의 콜라겐은 FACIT의 구성원들이다. 다양한 유형의 FACIT는 추출하여 정제하거나 또는 스케펜스 아이 리서치 인스티튜트(Schepens Eye Research Institute, 미국 메사츄세츠주 보스톤 소재)와 같은 학회 출처로부터 입수할 수 있다.

안정화 조성물의 성분들로는 또한 SLRP와 같은 프로테오글리칸이 포함된다. 조성물에 상기 SLRP를 첨가하는 것은 각막을 안정화시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 혼동케하는 명명에도 불구하고, SLRP는 거대 분자이다. 예를 들면, 여러 유형의 SLRP를 데코린, 케라토칸, 비글리칸, 에피피칸, 루미칸, 미미칸 및 피브로모듈린으로부터 선택할 수 있다. 데코린은 더마탄 설페이트 글라이코스아미노글리칸 쇄를 포함하고, 케라토칸은 케라탄 설페이트 글라이코스아미노글리칸 쇄를 포함한다. 많은 SLRP(예를 들면, 비글리칸, 케라탄 설페이트 프로테오글리칸, 데오린, 라미닌 및 헤파란 설페이트 프로테오글리칸)가 또한 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co., 미국 위스콘신주 밀워키 소재; "시그마")와 같은 상업적 출처로부터 입수가능하다. 다른 것들은 학회로부터 입수가능하거나 또는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.

하기에 FACIT 부류중의 여러 유형의 콜라겐들의 상세한 설명을 나타낸다. 콜라겐 단백질은 많은 발생적이고 생리적인 기능들과 관련되는 거대한 이종 부류의 분자들을 포함한다. 20가지 이상의 콜라겐들이 현재 확인되었으며 이들 중 약 11개가 각막 구조체의 발생에 수반된다. 모든 콜라겐 분자가 공통적으로 갖는 것으로 보이는 두가지 특성은 3개의 쇄(α-쇄로 불림)로 이루어진다는 것과 이들 쇄가 3중-나선으로 배열되는 하나 이상의 영역을 갖는다는 것이다. 통상적으로, 각각의 콜라겐 유형은 발견된 연대순을 나타내는 번호(로마 숫자로)로 지정된다. FACIT는 하기에서 논의하는 바와 같이 각막 원섬유 콜라겐을 구성하는데 주된 역할을 한다.

당해 분야에서 VI형 콜라겐은 대부분의 간질 결체 조직에서 발견되는 비드필라멘트의 형태를 갖는 것으로 알려져 있다. 성인 인간의 각막 간질에서, 상기 분자는 원섬유 콜라겐에 근접한 양으로 존재한다. 상기 비드 필라멘트들은 서로 엉켜 있으며, 선형 원섬유 및 각막 프로테오글리칸과 상호작용하는 것으로 보인다.

조류의 각막 발생에 있어 XII형 및 XIV형 FACIT 분자의 발현에 관해 연구를 수행하였다. 문헌 ["A New Fibril Associated Collagen, Type XX, Expressed in the Developing Avian Cornea", by Gordon et al. (Abstract in "Through the Looking Glass" Macromolecular Morphogenesis Symposium Sponsored by The Schepens Eye Research Institute, Boston, MA, January 22-23, 1999](이하에서, "Through the Looking Glass"라 함)에 상술된 바와 같이, 상기 연구들은 각막 원섬유를 구성하는데 수반될 수 있는, XX형을 포함하여 새로운 FACIT들을 확인하였다. 상기 연구들은 XII, XIV 및 XX형 콜라겐의 발생적 발현 패턴이 조류 각막에서의 상기 분자들의 잠재적 기능과 상관된다고 결론지었다. XX형 콜라겐의 보다 작은 아미노 말단 NC3 영역은 콜라겐 원섬유가 서로에 보다 가깝게 근접하게 할 수 있음을 시사한다.

문헌 ["Assembly of the Corneal Extracellular Matrix is a Multistep Process with Each Step Independently Regulated by Different Macromolecular Interactions", by David E. Birk (Abstract in "Through the Looking Glass")]에서는, 간질 구조의 적절한 발생 및 유지가 각막의 투명성에 필요함을 입증하였다. 원섬유 구조가 각막 기능의 한 중요한 결정인자이다. 콜라겐 원섬유는 초기에 단편으로 불리는 중간물질로서 구성된다. 이들 중간물질은 발생되는 세포외 기질 중에 혼입되며, 발생이 진행됨에 따라 조절된 성숙분열이 일어난다. 상기 원섬유의 성숙분열은 미숙한 각막 간질 내의 중간물질을 보다 길고 성숙한 원섬유로 전환시킴을 포함한다. 각막에서, 길이의 증가는 다른 조직에서 길이 및 직경이 둘 다 증가하는데 반해 직경의 변화 없이 일어난다. 조류의 각막을 이용하여 콜라겐 원섬유 형성을 제어하는 것을 연구하였다. 각막에서, I형 및 V형 콜라겐의 이형 상호작용이 원섬유 단편의 초기 구성을 조절한다. 우성-음성 접근방법을 이용하여, V형 콜라겐 조성은 새로 형성된 원섬유 단편들의 직경을 결정한다. 상기 효과는 아미노 말단 영역에 의해 매개된다. V형 콜라겐의 존재로 인한 분자 구성에서의 변형은 원섬유의 성장을 제한하며 새로운 원섬유 단편의 개시를 유리하게 한다. 이것은 간질의 급속한 성장동안 존재하는 원섬유의 수를 증가시키는 역할을 한다.

원섬유 성장에서 다음 단계는 성숙한 원섬유를 제공하기 위한 길이의 증가이다. 한 연구에서는 상기 단계의 제어에 원섬유-결합 프로테오글리칸을 관련시키고 있다. 하나의 이론은 단편들이 침착후 융합에 이어 성숙한 조직의 보다 긴 원섬유를 발생시키는 분자 재배열에 적용된다는 것이다. 상기 이론을 근거로, 실험을 설계하고, 상이한 발생 단계에서 단편 표면과 결합된 성분들에서 시간 및 공간적 변화가 일어난다고 예상하였다. 이러한 변화는 원섬유생성에 있어 상이한 단계들에서 안정화 또는 불안정화시키는 역할을 할 것이다. 분리된 원섬유의 표면으로부터 프로테오글리칸을 제거하면 비정상적인 원섬유 성장이 야기되어 보다 길고 큰 직경의 원섬유가 얻어졌다. 프로테오글리칸을 다시 첨가하면 상기 비정상적 성장이 용량 의존성 방식으로 방지된다.

XII형 콜라겐과 각막 형태발생 사이의 관계에 대한 또 다른 연구(문헌 ["Type XII Collagen and Corneal Morphogenesis" by SundarRaj et al. (Abstract in "Through the Looking Glass")])에서는, XII형 콜라겐의 대안적으로 접합된 두 변이체들의 발생적으로 조절된 분포가 조직 응축을 수반하는 특정 형태발생적 상황과 관련될 수 있는 것으로 단정지었다.

달리 수행된 면역조직화학적 분석은 XII형 콜라겐의 짧은 변이체가 각막 발생의 초기 단계(14일)의 토끼 각막 간질 및 공막에서 발현되었음을 보여주었다. 상기 짧은 형태는 또한 눈꺼풀 주름 형성의 초기 단계의 눈꺼풀의 결체 조직에도 존재하였다. 그러나, 긴 형태가 후기 단계(24일까지)에서 후방 간질에서 먼저 발현되었다. 출생전 및 출생후 발생의 후기 단계동안, 긴 변이체 형태의 분포는 후방 간질에서 전방 간질로 진행되었다(각막 발생중의 간질 응축과 유사한 패턴). 긴 형태는 눈꺼풀이 모여서 합쳐지는 한정된 영역들의 상피하 조직에서 일시적으로 발현되었다. 각막 상피막("BM") 대역에서의 XII형 콜라겐의 출현은 눈꺼풀이 열리기 직전에 명백하였다.

상기 연구는 XII형 콜라겐의 길고 짧은 변이체들의 시간 및 공간적 분포에서의 차이가 상기 변이체들이 각막 발생시 상이한 기능을 가질 수 있음을 시사한다고 결론지었다. XII형 콜라겐의 긴 변이체 형태는 각막 간질 응축에 수반될 수 있다. BM 대역에서의 그의 상호작용 및 기능(들)은 간질에서의 상기 상호작용 및 기능과 상이할 것이다.

그러므로, 다양한 유형의 FACIT에 관한 전술한 연구들은 이들 독특한 콜라겐들이 각막 간질의 구성에 기여하는 간질 콜라겐 원섬유와 상호작용하여 원섬유 성장을 제어하고 각막의 투명성 및 안정성을 제공함을 보여준다.

앞에서 논의한 바와 같이, 콜라겐 혼합물에 SLRP를 첨가하면 각막을 효과적으로 안정시키는 것으로 밝혀졌다. 하기에서 SLRP를 보다 상세히 고찰할 것이다. 문헌 ["Gene-Targeted Lumican-Deficient Mice: Regulation of Collagen Fibril Assembly and Corneal Transparency by Lumican", by S. Charkravarti (Abstract in "Through the Looking Glass")]에서는, 각막 프로테오글리칸이 각막의 투명성에 필요한 고도로 구성된 콜라겐 기질의 주요 조절인자인 것으로 가정한 연구를 고안하였다. 상기 연구는 콜라겐 구조를 조절하고 각막 투명성을 획득하는데 있어 주된 각막 케라탄 설페이트("KS") 프로테오글리칸인 루미칸의 역할을 밝혔다. 상기 연구는 루미칸이 콜라겐 원섬유 구성 및 각막 투명성에 중요한 역할을 한다고 결론지었다. 혼탁의 진행은 오래된 돌연변이체에서 관찰되는 콜라겐 비정상체의 연령-의존성 증가의 직접적인 결과일 수 있다. 루미칸-결핍 마우스에서 전체 KS 함량의 감소는 각막의 특정 수화 및 기타 생리적 성질들에 영향을 미칠 것이었다.

문헌 ["Some Speculation on the Evolutionary Origin of the Genes for Corneal Keratan Sulfate Proteoglycan Core Proteins", by G. W. Conrad et al. (Abstract in "Through the Looking Glass")]에서, 과학자들은 루미칸이 각막에서 특이하게 글리코실화되긴 하지만, 데코린 또는 루미칸 코어 단백질 유전자 모두 각막-특이적 방식으로 발현되지 않았음을 시사하였다. 미미칸은 보다 한정된 배열의 조직에서 발현된 반면, 케라토칸 발현은 종에 따라 완전히, 또는 거의 완전히각막-특이적이었다. 현재 일부 척추동물로부터 충분한 게놈 서열 데이터를 이용할 수 있어 미미칸 유전자(8개 엑손)와 케라토칸 유전자(3개 엑손)의 게놈 구조의 비교가 가능하다. 그의 뉴클레오티드 서열을 근거로 하여, 케라탄 설페이트 쇄를 갖는 코어 단백질을 발현하는 유전자 부류의 계통수는 미미칸이 케라토칸보다 서열에 있어 명백히 더 확산적임을 시사한다. 그로부터 상기 유전자들이 진화된 원시 게놈은 단순하여 인트론이 후기에 나타날 수 있거나(따라서, 미미칸은 진화에 있어 후기에 나타난다), 또는 상기 게놈은 초기 인트론이 시간 경과에 따라 제거되면서 정확히 역순으로 진화될 수 있다(따라서, 미미칸은 진화에 있어 초기에 나타난다). 상기 문제의 해결은 각막을 갖는 다른 유기체들의 게놈의 분석으로부터 유도될 수 있다.

각막 손상시에 각막을 검사하기 위해, 성장 인자와 간질중의 프로테오글리칸 사이의 관계에 대한 연구(문헌 ["Growth Factors and Proteoglycans in the Storma", by V. Trinkaus-Randall, et al. (Abstract in "Through the Looking Glass")])는 TGFβ가 상처 회복 과정에서 한 역할을 한다고 지적하였다. TGFβ는 코어 단백질과 GAG 둘 다의 수준에서 간질 섬유아세포중의 세포외 기질의 조성을 변화시켰다. 펄르칸(perlecan)의 증가는 βFGF의 반응성을 증대시키고 세포 표면에 대한 그의 결합을 변화시킬 수 있다.

마우스의 각막 상피의 상처 치료에 있어 루미칸의 역할에 관한 실험(문헌 ["Role of Lumican in Wound Healing of Mouse Corneal Epithelium" by W.W.-Y. Kao (Abstract in "Through the Looking Glass"])에서는, 루미칸이 상피 세포 이동을 조절하여 각막 상피의 상처 치료에 기여할 수 있다고 결론을 내렸다.

"프로테오글리칸 신호에 의한 기질 구성 및 세포 성장의 제어"에 관한 연구(문헌 ["Control of Matrix Assembly and Cell Growth by Proteoglycan Signaling", by R. V. Lozzo (Abstract in "Through the Looking Glass")])에서는, 소 류신-풍부 프로테오글리칸의 확대된 부류의 원형 구성원인 데코린이 원섬유 콜라겐에 결합하고 원섬유생성을 지연시키는 그의 능력으로 인해 주로 기질 구성의 제어에 직접 수반됨을 밝혔다. 상기 연구는 또한 데코린이 세포 성장의 직접적인 조절제로서 작용할 수 있음을 주목하였다. 예를 들면, 데코린 수준은 성장 정지중에 현저히 상승하며, 바이러스 형질전환에 의해 그 발현이 중단되었다. 상기 연구는 데코린 단백질 코어와 EGF 수용체 사이에 직접적인 상호작용이 있음을 입증하였다. 그러므로, 상처 치료 또는 암 성장에 있어 간질 구성요소들에 의한 데코린의 증대된 생합성은 천연의 성장 조절 메카니즘을 나타낼 수 있다.

그러므로, SLRP에 관한 전술한 연구들은 상기 독특한 기질 성분들이 간질 콜라겐 원섬유에 결합하여 기질 구성을 제어하고 기질 조성을 안정화시킴을 보여준다.

본 발명에 따르면, 각막굴절교정술을 통해 각막 조직의 목적하는 형태를 달성한 후에, 안정화제를 각막 조직에 투여하여 목적하는 형태를 유지시킨다. 상기 안정화제는 각막 조직에 직접 투여되어야 한다. 그런 후에, 안정화제가 그의 기능을 수행하기에 충분한 시간을 가질 동안 성형 렌즈를 다시 각막 조직에 배치할 수 있으나 필수적인 것은 아니다. 하기에서 논의하는 바와 같이, 본 발명의 안정화제는 각막이 그의 이전 형태로 복귀되기 전에 그의 기능을 수행할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 특정 안정화제의 경우, 안정화제 투여 후 1일간 각막굴절교정용 렌즈를 각막 위에 다시 배치하는 것이 유리할 수 있다.

FACIT 및 SLRP

본 발명의 첫 번째 태양에서, FACIT 및 SLRP로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 생리학적으로 적합한 완충액에 용해 또는 현탁시킨다. 일반적으로, FACIT의 농도는 약 10 내지 약 500 ㎍/㎖의 범위일 것이다. 바람직하게는, FACIT의 농도는 약 20 내지 약 250 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 약 40 내지 약 100 ㎍/㎖의 범위일 것이다. SLRP가 또한 단독으로 또는 FACIT와 함께 포함되는 경우, SLRP는, 예를 들면, 약 10 내지 약 500 ㎍/㎖, 약 20 내지 약 25 ㎍/㎖, 약 40 내지 약 100 ㎍/㎖의 범위, 및 상기 범위들 내에 포함되는 정수들의 임의의 범위를 포함하는 범위의 농도를 갖는다.

FACIT 및/또는 SLRP는, 예를 들면, 6.5 내지 8.5, 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.6 범위의 pH에서 약 0.005 내지 0.5 M의 농도를 갖는 중성 pH 포스페이트 완충액과 같은 완충액에 희석하거나 용해시킨다. 다른 적합한 완충액으로는 HEPES, 트리즈마(TRIZMA, 등록상표; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 또는 트리스(TRIS) 완충액의 다른 공급처), 또는 당해 분야에 공지된 다른 생물학적으로 적합한 완충액이 포함되며, 이들은 또한 약 0.005 내지 약 5 M의 농도로 존재할 수 있다.

이어서, 상기 안정화제 용액을 각막굴절교정용 렌즈의 착용 중에 또는 착용 후에 약 1 내지 약 14 일의 기간동안 점적제의 형태로 각막에 투여한다. 완충 시스템 및 pH는 각막 콜라겐들과의 상호작용을 최적화하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 콜라겐 기질 구조를 개방시켜 안구 조직에 대한 조성물의 전달을 증가시키기 위해 완충액의 pH를 7.6 이상으로 증가시킬 수 있다. 당해 분야의 기술을 가진 자가 인지하듯이, pH는 안구 조직에 대한 손상 가능성에 의해 제한된다. 일반적으로, 적합한 pH는 상기 손상 위험으로 인해 약 8.0 이하일 것이다.

상기 용액은 각막중의 콜라겐 원섬유와 상호작용하여 하나의 콜라겐 원섬유를 다른 인접 원섬유에 부착시키는 가교를 형성함으로써 원섬유 직경을 제어한다. 상기 가교는 원섬유의 유연성을 허용하나 원섬유가 이동하는 거리를 제한한다. 그런 다음, 각막 조직은 재성형 렌즈를 더 사용하지 않고 그의 형태를 유지시킬 것이다.

실시예 1

안정화 효과를 최적화하기 위해 적출된 돼지 각막에 일련의 생체외 실험실 실험을 수행하였다. 적출된 돼지의 안구는 옵티졸(Optisol) 용액에 보존하여 2 내지 8 ℃에서 저장하였다. 처리된 안구를 육안으로 및 생체현미경을 이용하여 검사하여 각막 상피, 간질, 각막 혼탁, 각막 경직성, 전방 반응 및 각막 두께에 대한 효과를 조사하였다. 처리된 안구를 기계적으로 시험하여 하기에서 상세히 설명하는 바와 같이, 압축력 하에서의 응력 및 변형을 평가하기 위해 저모듈러스 및 고모듈러스에서의 변화를 조사하였다. 저모듈러스에서의 감소는 유연화, 또는 유체를배출시키는 증가된 능력으로 인한 콜라겐성 망상구조를 압축하는데 필요한 힘의 감소를 나타내었다. 대조적으로, 저모듈러스의 증가는 경직을 나타내었다. 고모듈러스에서의 임의의 변화는 콜라겐 원섬유 망상구조의 손상을 나타내었다.

상기 생체외 실험들의 첫 번째 단계에서, 총 12마리 돼지의 안구를 미리 선별한다. 적출된 안구를 1 ㎎/㎖의 농도를 가지며 0.005 M 인산 나트륨으로 약 7.2의 pH로 완충된 토끼의 VI형 콜라겐(슐레펜스 아이 인스티튜트에서 입수가능함)으로 이루어진 안정화제의 점적제에 노출시킨다. 점적제는, 옵티졸 용액으로부터 꺼내어 균형 염류 용액("BSS") 또는 포스페이트 완충된 식염수("PBS")로 세정한 후에 매일 2회 투여하면서 7일의 기간에 걸쳐 투여한다. 이어서, 안구를 옵티졸 용액에 복귀시킨다. 안구들은 모두 실온에서 보관하였으며 자연광에 노출시킨다. 처리를 위해 두 농도의 각각의 약제들을 사용한다. 이어서, 처리된 안구의 각막 표면에 슬라이드를 적용하고 엄지손가락의 압력을 이용하거나 또는 기계적으로 평활화된 표면을 형성함으로써 제자리에 유지시킨다. 7 일후에, 각막형태검사 분석 결과 최소의 반발을 나타내었다.

상기 생체외 실험의 제 2 단계에서는, 동일한 안정화제를 각막굴절교정용 렌즈를 착용시킨 적출된 돼지 안구에서 더 평가한다. 각막굴절교정용 렌즈를 착용하고 있는 동안 안정화제를 투여한다. 안구는 육안으로, 생체현미경검사에 의해서, 그리고 각막곡률측정법 및/또는 각막형태검사법에서와 같이 각막 곡률을 측정하는 장비를 이용하여 시험한다. 상기 실험의 결과는 7 일후에 최소 반발을 나타내었다.

실시예 2

시험 안구들에 성형 렌즈를 이용하여 성형 처리한 후 0.04 M 인산 나트륨으로 약 7.2의 pH로 완충시킨 500 ㎍/㎖의 농도를 갖는 SLRP인 데코린을 투여하였다. 용액을 하기 계획에 따라 투여하였다: 주형을 금요일 오후에 적용하고 주형을 제거하는 월요일 오전까지 유지시켰다. 주형 제거후에, 안구를 이어서 100 ㎕의 데코린 용액에 노출시켰다. 주형을 각각의 안구위에 재적용하였다. 그런 다음, 각각의 안구를 다시 옵티졸 용액에 놓아두었다. 데코린의 투여를 화요일과 수요일에 반복하였다.

주형을 하나의 안구에 재적용하였다. 안구를 주관적 사진 평가한 결과 주형을 재적용하여 데코린으로 처리한 것이 반발 없이 편평한 각막을 나타내었다.

두 번째 안구에 대해, 안구를 수요일에 데코린에 노출한 후 주형을 재적용하지 않았다. 이것은 안구가 그의 원래 형태로 다시 반발하는지를 결정하기 위해 수행하였다. 3 일이 더 지난 후에, 안구를 주관적인 사진 평가한 결과 각막 조직의 반발이 미미하거나 없는 것으로 나타났다.

실시예 3

시험 안구들에 성형 렌즈를 이용하여 성형 처리한 후 0.04 M 인산 이나트륨으로 약 7.2의 pH로 완충시킨 100 ㎍/㎖의 농도를 갖는 SLRP인 케라탄 설페이트를 투여하였다. 용액을 하기 계획에 따라 투여하였다: 주형을 금요일 오후에 적용하고 주형을 제거하는 월요일 오전까지 유지시켰다. 주형 제거후에, 안구를 이어서 100 ㎕의 용액에 노출시켰다. 주형을 각각의 안구위에 재적용하였다. 그런 다음,각각의 안구를 다시 옵티졸 용액에 놓아두었다. 케라탄 설페이트의 투여를 화요일과 수요일에 반복하였다.

주형을 하나의 안구에 재적용하였다. 안구를 주관적 사진 평가한 결과 주형을 재적용하여 케라탄 설페이트로 처리한 것이 반발 없이 편평한 각막을 나타내었다.

트랜스글루타미나제

본 발명의 각막을 안정화시키는 두 번째 접근방법에 따르면, 또한 바람직하게는 생물학적으로 상용성인 안정화제를 표피와 같은 조직에서 통상적으로 발견되는 효소로부터 유도할 수 있다. 상기 효소로는 트랜스글루타미나제가 포함될 수 있는데, 예를 들면, 트랜스글루타미나제(인자 XIII)는 라이신과 글루타민 잔기 사이의 공유 결합에 의해 형성된 단백질들을 가교결합시킨다.

본 발명에 따라, 트랜스글루타미나제를, 예를 들면, 약 0.01 내지 약 0.25 M 또는 약 0.05 내지 약 0.15 M 범위의 EDTA와 혼합한다. 트랜스글루타미나제의 농도는 약 0.01 내지 약 0.25 M 또는 약 0.05 내지 약 0.1 M의 범위 및 상기 범위내에 포함되는 정수들의 임의의 범위를 포함한 범위일 수 있다. 트랜스글루타미나제는 활성화되기 위해 칼슘 이온을 필요로 하므로, 너무 이른 트랜스글루타미나제 활성화를 유도할 수 있는 칼슘 이온과 결합시키기 위해 안정화제 용액에 EDTA를 첨가한다. EDTA는 많은 경우에서 첨가되지 않을 수도 있음을 물론 인지할 것이다.

용액은, 예를 들면, 약 6.8 내지 7.6, 또는 약 7.0 내지 약 7.2의 pH 범위 또는 상기 범위내에 속하는 정수들의 임의의 범위로 완충시켜야 한다. 적합한 완충액으로는 글라이신 완충액, 트리스 완충액 및 바이신(Bicine) 완충액이 포함된다. 그러나, 포스페이트는 칼슘의 존재하에서 침전되는 경향이 있으므로 완충액은 포스페이트를 함유하지 않아야 한다. 이어서, 약 5 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 20 내지 약 30 mM 범위의 염화 칼슘을 촉매로서 트랜스글루타미나제 용액에 가한다. 전달 시스템은 각막에 적용중에 성분을 첨가하기 위한 2단 장치를 포함할 것이다. 상기 장치는 사용자로 하여금 별도의 용액 또는 2개의 별도의 장치가 필요없이 적절한 때에 칼슘 촉매를 트랜스글루타미나제 용액과 혼합시킬 수 있을 것이다.

실시예 4

2% 수크로즈, 0.1 M EDTA 및 5 mM 글라이신 완충액(pH 7.2)을 함유하는 10 ㎖ 멸균수에 10 ㎎의 트랜스글루타미나제를 가하여 트랜스글루타미나제 조성물을 제조하였다. 트랜스글루타미나제는 기니 피그의 간 또는 인간 재조합 공급원을 이용하여, 시그마(Sigma)에서 카탈로그 번호 T-5398로 수득하였다. 성분들을 혼합한 다음 멸균수를 이용하여 90 ㎖로 희석하였다. 두 번째 용액은 25 mM의 염화 칼슘을 함유하였다.

각막에 적용하기 전에, 10 ㎖의 염화 칼슘 용액을 트랜스글루타미나제 조성물에 가하고 약하게 혼합하였다. 점안제를 가하는 것처럼 상기 혼합물의 소적들을 각막의 표면에 가하고 약 10 분간 반응시켰다. 이어서, 안구를 멸균수 또는 멸균 완충액, 예를 들면, "BSS"로 세척하여 과량의 트랜스글루타미나제 혼합물을 제거하였다. 그 결과, 트랜스글루타미나제 혼합물은 각막 간질중의 콜라겐의 펩타이드-결합 라이신의 다양한 일급 아민 그룹들 사이의 공유 가교결합을 매개하였다.

상기 조성물을 또한 안정화 효과를 최적화하기 위해 적출된 돼지 각막에 대해 일련의 생체외 실험실 실험을 행하였다. 적출된 돼지 안구를 처리할 때까지 얼음중에 놓아두었다. 처리 전에, 각각의 안구를 안정성을 위해 브래킷에 놓고 옵티콘(Optikon) 2000 시스템을 이용하여 각막형태검사 평가를 행하였다. 각 안구의 6개의 각막형태도를 취하여 실제 복합체를 생성하였다. 각막 표면을 멸균 거즈를 이용하여 건조시킨 다음 0.02 M 인산 이나트륨의 점적제로 습윤시켰다. 습윤된 안구를 다시 건조시키고 0.02 M 인산 이나트륨의 점적제에 노출시켰다. 유리 슬라이드를 각막 표면 상에서 균형을 맞추었다. 50 mM 트리스 완충액(pH 8.5) 중에서 트랜스글루타미나제 및 염화 칼슘(CaCl₂)의 용액을 제조하였다. 2.5 N 수산화 나트륨(NaOH)을 가하여 트리스 완충액의 pH를 8.5로 조정하였다. 트랜스글루타미나제를 10 ㎖의 트리스 완충액 중에서 1 ㎎/㎖로 제조하였다. 50 ㎖의 트리스 완충액 중에서의 25 mM의 농도로 CaCl₂를 제조하였다.

투여 전에, 트랜스글루타미나제가 촉매로서 Ca⁺⁺를 필요로 하므로 1 ㎖의 CaCl₂용액을 9 ㎖의 트랜스글루타미나제 용액과 혼합하였다.트랜스글루타미나제/CaCl₂용액을 유리 슬라이드 주변 영역에 적가하였다. 약 1 ㎖의 효소 용액을 2 분간 적용하였다. 이어서, 슬라이드를 제거하고 안구를 0.004 M 포스페이트 완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 그런 다음, 안구를 각막형태검사에 의해 재검하고 사진을 취하였다. 각막형태검사 평가에 이어, 안구를 추가의 평가동안의 보관을 위해 옵티졸에 놓아두었다. 3개의 안구를 상기 프로토콜을 이용하여 처리하였다.

유리 슬라이드를 균형을 맞추면서 효소 용액을 적용하는데 있어서의 어려움으로 인해 처음 2개의 안구들을 처리하는데 다소의 어려움이 있었다. 세 번째 시도에서, 트랜스글루타미나제 점적제를 각막에 투여하여 슬라이드를 각막 표면에 적용하여 엄지손가락 압력을 이용하여 제 자리에 유지시켰다. 효소 용액의 점적제를 연속하여 유리 슬라이드 주변의 각막 표면에 적용하였다. 처음 2개의 안구에서는 어떤 평활화 효과도 주목되지 않았다. 첫 번째 안구로부터 얻은 각막형태검사 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 각막 경사를 나타내는 것으로 보였다. 그러나, 각막형태도는 세 번째 안구의 중심 각막의 평활화를 명백히 입증하였다. 굴절력은 약 1.5 디옵터만큼 감소하였다. 모든 안구는 육안 검사에 의해 투명하게 나타났다. 안구들을 보관을 위해 옵티졸에 놓아두었다.

각막형태검사법에 의해 측정한 각막 굴절력
돼지 안구 번호	처리전(디옵터)	처리후(디옵터)
1	38.98	37.33	42.14	39.2
2	39.89	37.7	39.98	37.26
3	40.25	38.16	38.79	36.83

처리후에, 각막 버튼을 절개하여 옵티졸에 넣고 응력-변형 분석을 위해 루트거스 유니버시티(Rutgers University)로 운반하였다. 응력-변형 분석에서는, 각막 버튼을 약간 볼록한 표면위에 놓고 압축력에 노출시켰다. 응력-변형 곡선은 퍼센트로 표시되는 바와 같은 특정량으로 각막을 압축하는데 필요한 횡단면의 단위 면적당 힘을 나타낸다. 작성된 곡선은 여러 별개의 상들을 나타낸다. 하부 부분(저모듈러스 영역)은 콜라겐 원섬유 사이의 유체를 압착하는데 대한 저항을 나타낸다. 응력-변형 곡선이 변하지 않는 중간 부분, 및 상부 부분(고모듈러스 영역)은 콜라겐 원섬유의 압축을 나타낸다. 저모듈러스의 감소는 각막이 보다 유연함을 나타낸다. 증가는 각막 버튼이 더 강성이고 안정화되었음을 나타낸다.

트랜스글루타미나제 처리는 유망한 결과를 제공하였다. 각막형태검사 평가는 유리 슬라이드를 사용한 각막 평활화 후에 트랜스글루타미나제로 처리한 하나의 돼지 안구가 유리 슬라이드 제거후에 약 1.5 디옵터의 굴절력 감소를 나타내었음을 보여주었다. 2개의 다른 안구들이 상기 처리 과정에 포함되었음을 주지하는 것이 중요하다. 유리 슬라이드는 또한 상기 돼지 안구들에도 적용하였다. 그러나, 효소 첨가는 수평 위치의 안구에 적용하였으며 유리 슬라이드 아래에서 각막으로 유동하는 것 같지 않았다. 상기 안구들에서는, 각막형태검사 평가에 의한 굴절력의 감소가 입증되지 않았다. 상기 안구들은 유리 슬라이드 적용 후에 중심 각막의 평활화를 나타내지 않았으므로, 성공적인 안구에서 관찰된 각막 평활화는 단지 유리 슬라이드의 적용의 결과인 것 같지는 않았다.

실시예 5

트랜스글루타미나제 점적제가 각막굴절교정 동안 각막을 효과적으로 안정화시킬 수 있는지를 입증하기 위해 추가의 실험을 수행하였다. 10 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖ 및 1 ㎎/㎖를 포함하여 3가지 이상의 상이한 수준의 트랜스글루타미나제를 평가하였다. 처리 당, 2개의 모의 대조군, 즉, 트랜스글루타미나제 없이 완충액 점적제만을 적용한 렌즈, 및 전혀 처리하지 않은 하나의 대조군과 함께 3개의 안구가 포함된다.

상기 시리즈에서, 실험 절차는 안구를 브래킷 홀더에 놓고 각 안구에 대해 6개의 판독물로서 각막형태검사 평가를 수행함을 포함한다. 이어서, 평활 렌즈를 적용하고 고무 밴드 또는 다른 유사한 장치를 이용하여 제자리에 원만하게 유지시킨다. 안구를 수평으로부터 약 45°로 위치시키고, 0.05 M 트리스 HCl 용액(pH 7.6)으로 조절하였다. 완충액을 1 분간 상호작용시키면서, 트랜스글루타미나제를 9:1 비로 CaCl₂용액과 혼합하였다. 그런 후에, 안구를 칼슘 함유 트랜스글루타미나제 점적제(각각의 점적제는 약 0.1 ㎖의 용액을 함유한다)로 30 초 간격으로 2 분간 처리한 후 0.05 M 트리스 HCl 완충액 점적제를 적용한다. 이어서, 안구를 각막형태검사에 의해 평가하고 세극등 생체현미경을 이용하여 검사하고, 안구로부터 절개한 다음, 압축 분석을 위해 루트거스 유니버시티로 운반하였다.

각막형태검사 평가는 굴절력에 있어 1.5 내지 2.0 디옵터의 감소 및 저모듈러스에서의 증가를 나타내어 각막 조직의 경직을 나타내었다.

실시예 6

시험 안구들에 성형 렌즈를 이용하여 성형 처리한 후 0.05 M 트리스 HCl 완충액으로 약 7.2의 pH로 완충시킨 1 ㎎/㎖의 트랜스글루타미나제 농도를 갖는 트랜스글루타미나제 용액 및 25 mM 농도의 0.05 M 트리스 HCl 완충액중의 염화 칼슘을 투여하였다. 용액을 하기 계획에 따라 투여하였다: 주형을 금요일 오후에 적용하고 주형을 제거하는 월요일 오전까지 유지시켰다. 주형 제거후에, 안구를 이어서 100 ㎕의 트랜스글루타미나제 용액에 노출시켰다. 주형을 각각의 안구위에 재적용하였다. 그런 다음, 각각의 안구를 다시 옵티졸 용액에 놓아두었다. 트랜스글루타미나제 용액의 투여를 화요일과 수요일에 반복하였다.

주형을 하나의 안구에 재적용하였다. 안구를 주관적 사진 평가한 결과 주형을 재적용하여 트랜스글루타미나제로 처리한 것이 반발 없이 편평한 각막을 나타내었다.

두 번째 안구에 대해, 안구를 수요일에 데코린에 노출한 후 주형을 재적용하지 않았다. 이것은 안구가 그의 원래 형태로 다시 반발하는지를 결정하기 위해 수행하였다. 3 일이 더 지난 후에, 안구를 주관적인 사진 평가한 결과 각막 조직의 단지 약간의 반발이 존재하는 것으로 나타났다.

간략하게, 본 발명은 가속적 각막굴절교정술에 의해 교정된 각막 조직을 유지시키거나 안정화시키기 위해 각막굴절교정용 렌즈를 착용한 중이나 후에 사용하기 위한, 점안제 전달 시스템을 갖는 다양한 조성물을 교지하고 있다. 상기 조성물은 각막에 적용되어 각막중의 콜라겐 원섬유를 결합시키고 원섬유 직경을 조절하고 콜라겐 원섬유 사이에 가교를 형성한다.

본 발명은 상기 조성물을 이용하여 이미 각막굴절교정술을 받은 환자들의 각막을 안정화시킬 수 있을 것으로 기대한다. 안정화 절차는 각막의 형태를 유지시키기 위해 유지용 렌즈를 계속 착용할 필요를 배제시킬 것이다. 상기 환자들에 대해 단순히 안정화 단계를 이용하는 것도 가능할 수 있지만, 각막은 다시 안정화되어 새로운 형태를 가질 수 있기 전에 불안정화되어야 할 것으로 예상된다.

실시예 7

고양이 안구에서 데코린의 독성 평가를 위한 프로토콜

하기 평가의 목적은 (1) 안구에 데코린의 사용과 관련된 독성이 존재하는지를 측정하고; (2) 각막중 데코린의 침투를 평가하고; (3) 데코린의 외인성 적용후 각막중의 데코린을 정량화하는 것이었다.

모델 시스템으로서 정상 각막을 가진 암컷 고양이(6개월 내지 2년된 것)를 이용하여 데코린을 1일, 3일 및 5일간 투여하여 평가하였다. 데코린은 건조 분말(시그마)로 수득하였으며 0.1 M 포스페이트 완충액에 타서 복원시켰다. 현미경 평가를 수행하기 위해, 데코린을 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)에서 상업적으로 시판하는 키트를 이용하여 오레곤 그린(Oregon Green) 514로 표지하였다.

5마리의 고양이를 연구에 사용하였다. 약제의 국소 투여 또는 안구의 사진촬영 전에 각각의 고양이를 진정시켰다. 모든 동물에 처리 전에 안구 검사 및 사진촬영(전체 안구, 세극등 및 내피 세포)을 행하였다. 안구들을 무작위적으로 처리 그룹으로 지정하였다. 데코린을 콘택트 렌즈의 안쪽에 적용하고 렌즈를 고양이의 안구에 넣었다. 렌즈를 10 분간 안구상에 유지시켰다. 모든 동물을 연구동안매일 관찰하였다. 3개의 안구를 무작위적으로 처리 그룹 또는 대조 그룹으로 지정하였다. 히스토그래프, TEM 및 공초점 현미경 평가 각각에 대한 대조군으로 사용하기 위해 적어도 2개 이상의 안구를 수득하였다.

세 처리 그룹 각각으로부터 하나의 안구를 오레곤 그린 514 표지된 데코린으로 처리하였다.

·처리 그룹 1의 안구에는 1 일째에 100 ㎕ 완충액중의 50 ㎍의 데코린을 1회 적용하였다. 사진촬영 및 검사는 처리 직후에 및 처리후 2 일, 4 일 및 8 일째에 다시 행하였다. 이어서, 시험 및 사진촬영은 그 달의 나머지 기간동안 매주 행하였다.

·처리 그룹 2의 안구에는 1, 2 및 3 일째에 100 ㎕ 완충액중의 50 ㎍의 데코린을 1회 적용하였다. 사진촬영 및 검사는 처리 직후에 및 2, 3, 5 및 8 일째에 다시 행하였다. 그런 후에, 시험 및 사진촬영은 그 달의 나머지 기간동안 매주 행하였다.

·처리 그룹 3의 안구에는 1, 2, 3, 4 및 5 일째에 100 ㎕ 완충액중의 50 ㎍의 데코린을 1회 적용하였다. 사진촬영 및 검사는 매일 및 8 일째에 다시 행하였다. 그런 후에, 시험 및 사진촬영은 그 달의 나머지 기간동안 매주 행하였다.

·동물들을 모두 1 개월 되었을 때 안락사시켰다. 안구를 적출하였다. 각각의 안구를 반으로 절개하였다. 절반을 독성의 조직학적 분석(H&E 염색)을 위해 포르말린에 고정시켰다. 두 번째 절반을 다시 반으로 나누어, 한 부분을 데코린의 TEM 가시화에 이용하고 나머지 부분은 표지된 데코린으로 처리된 고양이들에 대해 공초점 현미경을 이용하여 검사하였다.

도 1a 내지 1e에 나타낸 결과(공초점 현미경 사진)는 데코린이 안구의 각막 조직을 침투하는 것을 예시한다. 또한, 도 2(시험편 #33080543)는 상기 처리 프로토콜에 따라 데코린으로 5회 처리된 각막(처리 그룹 3)이 도 3(시험편 #3380562)에 나타낸 미처리 각막보다 많은 콜라겐 원섬유-결합 데코린을 함유함을 나타낸다. 초기 정성 분석은 처리된 안구에서 데코린 필라멘트가 더 길고 "더 굵은" 것으로 나타남을 보여준다. 이들 "더 굵은" 필라멘트는 상피 영역, 중간-간질 및 내피 영역을 포함하여 간질 구역 전체에 걸쳐 관찰되었다.

이러한 관찰은 외인적으로 첨가된 데코린이 안구의 각막 조직을 침투하여 간질 기질과 결합할 수 있음을 나타낸다. 또한, 고양이 각막에 대한 외인성 데코린 적용과 관련된 어떠한 안 독성 또는 불리한 현상도 나타나지 않았다.

당해 분야에 숙련된 자라면 본 발명의 범위 또는 진의를 벗어나지 않고 본 발명에서 상기 조성물, 상기 조성물을 제조하는 방법 및 상기 조성물을 투여하는 방법 뿐 아니라 본 발명의 다른 태양들에 있어 다양한 변형 및 변화가 수행될 수 있음이 명백할 것이다.

본 발명의 다른 태양들은 명세서의 숙고 및 본원에 개시된 본 발명의 실시로부터 당해 분야에 숙련된 자에게 명백할 것이다. 명세서 및 실시예들은 단지 예시적인 것으로 간주되어야 하며 본 발명의 진정한 범위 및 진의는 하기의 청구의 범위 및 그의 등가물에 의해 나타내어진다.

Claims

단속성 3중 나선을 갖는 원섬유 결합 콜라겐(fibril associated collagen with interrupted triple-helix, FACIT) 및 소(小) 류신-풍부 반복 프로테오글리칸(small leucine-rich repeat proteoglycan, SLRP)으로 구성된 군에서 선택된 콜라겐 조성물로 이루어진 안정화제를 환자에게 투여함으로써 안정화제가 각막 조직을 안정화시켜 목적하는 형태를 유지시키는 단계를 포함하는, 각막굴절교정술 후에 각막 조직의 목적하는 형태를 유지시키는 방법.
제 1 항에 있어서,

안정화제를 환자의 각막 조직에 투여하는 방법.
제 1 항에 있어서,

안정화제가 각막 콜라겐 원섬유와 상호작용하여 콜라겐 원섬유를 결합시키는 가교를 형성하는 방법.
제 3 항에 있어서,

안정화제가 각막의 원섬유 직경을 조절하는 방법.
제 3 항에 있어서,

가교가 예정된 범위내에서 원섬유의 이동을 허용하기에 충분히 유연한 방법.
제 1 항에 있어서,

FACIT가 VI형 콜라겐, XII형 콜라겐, XIV형 콜라겐, XX형 콜라겐 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제 1 항에 있어서,

SLRP가 비글리칸, 데코린, 에피피칸, 케라토칸, 루미칸, 미미칸, 피브로모듈린 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제 1 항에 있어서,

안정화제의 농도가 약 40 내지 약 100 ㎍/㎖의 범위인 방법.
단백질 유도된 트랜스글루타미나제로 이루어진 안정화제를 환자에게 투여함으로써 안정화제가 각막 조직을 안정화시켜 목적하는 형태를 유지시키는 단계를 포함하는, 각막굴절교정술 후에 각막 조직의 목적하는 형태를 유지시키는 방법.
제 9 항에 있어서,

안정화제를 환자의 각막 조직에 투여하는 방법.
단속성 3중 나선을 갖는 원섬유 결합 콜라겐(FACIT) 및 (b) 소 류신-풍부 반복 프로테오글리칸(SLRP) 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
제 11 항에 있어서,

VI형 콜라겐, XII형 콜라겐, XIV형 콜라겐, XX형 콜라겐 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 FACIT를 포함하는 조성물.
제 11 항에 있어서,

비글리칸, 데코린, 에피피칸, 케라토칸, 루미칸, 미미칸, 피브로모듈린 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 SLRP를 포함하는 조성물.
제 11 항에 있어서,

FACIT 및 SLRP를 생리학적으로 적합한 용액에 용해시킨 조성물.
제 14 항에 있어서,

FACIT 및 SLRP를 생리학적으로 적합한 pH 수준으로 완충시킨 조성물.
제 11 항에 있어서,

약 40 내지 약 100 ㎍/㎖ 범위의 농도를 갖는 조성물.
(a) 각막 연화제를 투여하지 않고 조성물을 각막에 투여하여 콜라겐 원섬유와의 반응에 의해 각막 곡률을 안정화시키는 단계; 및

(b) 각막에서 콜라겐 원섬유를 결합시키는 가교를 형성하여 콜라겐 원섬유의 이동을 제한하는 단계

를 포함하는, 각막굴절교정술로부터 형성된 각막 곡률을 유지시키는 방법.
제 17 항에 있어서,

점안액 형태의 조성물을 투여하는 방법.
제 18 항에 있어서,

(a) 단속성 3중 나선을 갖는 원섬유 결합 콜라겐(FACIT) 및 (b) 소 류신-풍부 반복 프로테오글리칸(SLRP) 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 방법.
제 19 항에 있어서,

FACIT가 VI형 콜라겐, XII형 콜라겐, XIV형 콜라겐, XX형 콜라겐 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제 19 항에 있어서,

SLRP가 비글리칸, 데코린, 에피피칸, 케라토칸, 루미칸, 미미칸, 피브로모듈린 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
(a) 단속성 3중 나선을 갖는 원섬유 결합 콜라겐(FACIT) 및 소 류신-풍부 반복 프로테오글리칸(SLRP)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 생리학적으로 적합한 용액에 용해시키는 단계; 및

(b) 수득된 용액을 생리학적으로 적합한 pH 수준으로 완충시키는 단계

를 포함하는, 화학 조성물의 제조 방법.
제 22 항에 있어서,

화학 조성물의 농도가 FACIT 및 SLRP에 대해 약 40 내지 약 100 ㎍/㎖의 범위인 방법.
(a) 완충액중의 트랜스글루타미나제를 제조하는 단계;

(b) 수득된 용액을 멸균수와 혼합하여 희석하는 단계; 및

(c) 염화 칼슘을 첨가하는 단계

를 포함하는, 각막굴절교정술에 의해 재성형된 각막에 투여하기 위한 화학 조성물의 제조 방법.
(a) 환자의 안구에 각막굴절교정용 렌즈를 삽입하여 안구의 연화되지 않은 각막 조직을 각막굴절교정용 렌즈에 의해 결정된 미리 선택된 형태로 재성형하는 단계; 및

(b) 각막 조직을 미리 선택된 형태로 안정화시키기 위해 환자의 안구에 안정화제를투여하는 단계

를 포함하는, 환자의 각막 곡률을 교정하기 위한 각막굴절교정술.
제 25 항에 있어서,

안정화제를 투여하기 전에 각막굴절교정용 렌즈를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 각막굴절교정술.
제 26 항에 있어서,

안정화제를 투여한 후에 각막굴절교정용 렌즈를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 각막굴절교정술.
제 25 항에 있어서,

안정화제로서 트랜스글루타미나제, SLRP 및 FACIT로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 투여하는 각막굴절교정술.
(a) 연화되지 않은 각막 조직을 미리 선택된 각막 형태로 재성형하기 위해 환자의 안구에 삽입되도록 제조된 각막굴절교정용 렌즈; 및

(b) 각막 조직을 미리 선택된 형태로 안정화시키기 위해 환자의 안구에 투여되는 안정화제

를 포함하는, 각막굴절교정술 시스템.