KR100550385B1 - 트랜스글루타미나아제를 포함하는 칸디다 속의 미생물과그의 숙주 세포 사이의 결합 저해제 - Google Patents

트랜스글루타미나아제를 포함하는 칸디다 속의 미생물과그의 숙주 세포 사이의 결합 저해제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합 저해제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합을 저해하는 트랜스글루타미나아제를 포함하는 결합 저해제에 관한 것이다. 본 발명은 트랜스글루타미나아제를 포함하는 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합 저해제, 그리고 트랜스글루타미나아제를 포함하는 항진균 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 결합 저해제는 칸디다 속의 미생물과 숙주 세포 사이의 결합을 성공적으로 저해하며, 본 발명의 항진균 약제학적 조성물은 칸디다 속의 미생물과 숙주 세포의 결합을 직접적으로 저해함으로써 칸디다 병에 대한 항진균 효과를 나타낸다.
칸디다 알비칸스, 트랜스글루타미나아제, 결합 저해제, 항진균 조성물

Description

트랜스글루타미나아제를 포함하는 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합 저해제{Inhibitor from Adhesion between Candida and Its Host Cell Comprising Transglutaminase as Active Ingredient}
도 1은 트랜스글루타미나아제 4에 의한 칸디다 알비칸스와 HeLa 세포 사이의 상대적 결합율을 나타내는 그래프;
도 2는 타액에 의한 칸디다 알비칸스와 HeLa 세포 사이의 상대적 결합율을 나타내는 그래프;
도 3은 산성 프롤린-풍부 단백질 및 트랜스글루타미나아제 4에 의한 칸디다 알비칸스와 HeLa 세포 사이의 상대적 결합율을 나타내는 그래프;
도 4는 염기성 프롤린-풍부 단백질 및 트랜스글루타미나아제 4에 의한 칸디다 알비칸스와 HeLa 세포 사이의 상대적 결합율을 나타내는 그래프; 및
도 5는 엘라핀 및 트랜스글루타미나아제 4에 의한 칸디다 알비칸스와 HeLa 세포 사이의 상대적 결합율을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합 저해제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합을 저해하는 트랜스글루타미나아제를 포함하는 결합 저해제에 관한 것이다.
칸디다 (Candida)는 진균류의 한 속으로서, 칸디다 병 (candidiasis)의 병원균으로 알려져 있는 효모이다. 칸디다는 출아에 의해 증식하며, 출아 세포의 크기는 4-6 ㎛이다. 또한, 출아 세포와는 별도로 진정균사를 형성하기도 하고 출아에 의한 위균사를 형성하기도 한다. 칸디다는 동물의 입 안, 피부, 점막, 분변, 객담 및 요 등에 존재하며, 정상 상태에서는 인체에 무해하나 항생 물질을 장기 사용하거나, 면역에 대한 저항성이 약해졌을 때에 체내에서 이상 번식을 하여 숙주세포에 결합함으로써 칸디다 병을 일으킨다. 칸디다에 의한 감염 빈도가 특히 높은 부위는 구강 내 및 음부 등의 점막으로, 감염에 의해 점막이 짓무르고 가려움이나 통증이 발생한다.
칸디다 병의 90% 이상은 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)에 의하여 유발된다. 칸디다 알비칸스의 증식 및 이에 따른 감염의 첫 단계는 칸디다 알비칸스가 숙주 세포에 결합 (adhesion)되는 것이므로, 칸디다 알비칸스로 인한 감염의 예방 및 치료를 위해서는 칸디다의 결합 메커니즘에 대한 이해가 필요하다. 이러한 결합 메커니즘은 숙주 세포의 표면에서 발현되는 특이한 수용체 또는 수용체 복합체와의 특이적 결합과 관련된다. 특정 미생물과의 상호 작용에 관계되는 숙주 세포의 분자 기능에 대해서는 알려져 있는 것도 있고 그렇지 않은 것도 있는데, 트랜 스글루타미나아제 (transglutaminase)는 이러한 기능이 알려져 있는 분자의 예이다.
최근의 연구에 따르면, 칸디다 알비칸스는 트랜스글루타미나아제의 기질로서 작용하여 이와 상호작용할 수 있는 단백질, 예컨대, 균사벽 단백질 (hyphal wall protein 1, Hwp1)을 발현한다. Hwp1은 칸디다 알비칸스의 균사 표면에서 발현되는 단백질로서, 균사 표면에 노출된 N-말단 프롤린 및 글루타민-풍부 아미노산 서열 (N-terminal proline and glutamine-rich amino acid) 및 세포벽에 고정된 세린 및 트레오닌-풍부 C-말단 (serine and threonine-rich C-terminal)으로 구성된다. 상기 N-말단 아미노산 반복의 특성 때문에 Hwp1은 트랜스글루타미나아제와의 상호작용에서 기질로 기능할 수 있다.
현재, 칸디다에 의한 감염의 치료는 소수의 항진균제, 예컨대, 암포테리신 B, 플루시토신 또는 아졸 유도체 등에 근거하고 있다. 그러나, 이러한 항진균제는 신부전증, 저칼슘혈증 및 빈혈 등과 같은 부작용을 유발하기도 한다. 따라서, 숙주 세포와 칸디다의 결합을 직접적으로 저해할 수 있고, 부작용이 극소화된 효과적인 치료제의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합을 저해할 수 있는 물질을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 트랜스글루타미나아제의 처리에 의하여 칸디다와 그의 숙주 세포 사이의 결합이 저해됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 트랜스글루타미나아제를 포함하는 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합 저해제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 트랜스글루타미나아제를 포함하는 항진균 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 트랜스글루타미나아제를 유효 성분으로 포함하는 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합 저해제를 제공한다.
본 발명자들은 다양한 질병 또는 질환의 원인이 되는 칸디다 속의 미생물의 숙주 세포와의 결합을 효과적으로 저해할 수 있는 물질을 개발하고자 다양한 물질에 대하여 스크리닝한 결과, 생체 단백질인 트랜스글루타미나아제가 이러한 저해 효과를 갖는 다는 것을 발견하였다.
본 명세서에 사용된 용어 "결합 저해제 (adhesion inhibitor)"는 미생물이 숙주 세포에 고정적으로 부착 (attachment)되거나 결합 (adhesion)하는 것을 저해하는 분자 수준의 물질을 포함하는 조성물을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 저해제는 칸디다 속의 미생물과 같은 효모의 균사가 숙주 세포에 부착되는 것을 저해하는 분자 수준의 물질을 포함하는 조성물이다.
본 발명의 결합 저해제에 유효 성분으로 포함되는 트랜스글루타미나아제는 글루타민의 감마-카보닐기 및 라이신의 엡실론-아미노기 사이의 고도로 안정한 이소디펩티드 결합을 형성함으로써 분자 상호 교차결합을 촉매하는 효소로 알려져 있다 (FASEB J. 5(15):3071-7(1991)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 트랜스글루타미나아제는 포유동물 유래 트랜스클루타미나아제이며, 보다 더 바람직하게는 인간-유래, 가장 바람직하게는 인간 타액 또는 전립선-유래 트랜스글루타미나아제이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 트랜스글루타미나아제는 상기한 소스에서 얻은 트랜스글루타미나아제의 유전자로 형질전환된 원핵 세포 (예: E. coli) 또는 바이러스 (예: 배큘로바이러스, baculovirus)로부터 유래된 것도 물론 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 트랜스글루타미나아제는 여러 개의 아종, 예컨대, 트랜스글루타미나아제 1, 2, 3 및 4를 포함하며, 보다 바람직하게는 트랜스글루타미나아제 4이다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 상기 트랜스글루타미나아제 4는 인간 타액 또는 전립선-유래 트랜스글루타미나아제 4이다.
본 발명의 트랜스글루타미나아제는 자연적으로 생성되는 (naturally occurring) 것 뿐만 아니라, 이 효소의 활성을 증가시키거나 또는 크게 감소시키지 않는 범위 내에서의 변이체 (variants)도 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 저해제는 산성 프롤린-풍부 단백질 (acidic proline-rich protein, APRP), 염기성 프롤린-풍부 단백질 (basic proline-rich protein, BPRP), 엘라핀 (elafin), 또는 이들의 조합에서 선택되는 최소 1종 이상의 단백질을 추가적으로 포함한다. 상기 프롤린-풍부 단백질들은 생체 내에서 트랜스글루타미나아제의 기질로 작용하는 것으로 알려져 있는 물질로서, 병원성 미생물의 결합을 저해하며 높은 전하 및 구조적 비대칭성 (asymmetry)을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, 4(3/4):495-502(1993)). 상기 프롤린-풍부 단백질의 추가적인 첨가에 의해, 트랜스글루타미나아제의 저해 효과가 상승적 (synergistic)으로 증가하게 된다.
상기 프롤린-풍부 단백질은 천연 및 합성 프롤린-풍부 단백질일 수 있으며, 생물학적 수단 또는 화학적 수단에 의하여 얻어질 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프롤린-풍부 단백질은 인간 타액 유래 프롤린-풍부 단백질이다.
또한, 본 발명의 결합 저해제에 추가적으로 포함되는 엘라핀은 침샘 조직 및 타액 등에서 발견된다. 또한 이와 비슷한 호몰로그인 SLPI (secretory leukocyte protease inhibitor)의 경우에는 다양한 병원성 미생물 및 바이러스의 불활성화에 관련이 있다는 보고가 있으며, 엘라핀도 항-미생물 효과를 보인다고 알려져 있다. 현재까지 알려진 바로는, 엘라핀은 각질세포막 형성에서 트랜스글루타미나아제 1의 기질로 작용하여 막 형성에 관여한다는 보고가 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 저해제에 의하여 숙주 세포와의 결합이 저해되는 미생물은 칸디다 속에 속하는 미생물로서, 바람직하게는 병원성인 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스 (C. tropicalis), 칸디다 파라프실로시스 (C. parapsilosis), 칸디다 갈라브라타 (C. glabrata), 칸디다 크루세이 (C. krusei), 칸디다 귈리어몬디 (C. gulliermondii), 칸디다 루시타니애 (C. lusitaniae), 칸디다 케피르 (C. kefyr), 칸디다 루고사 (C. rugosa) 또는 칸디다 스텔라토이데아 (C. stellatoidea)이며, 가장 바람직하게는 칸디다 알비칸스이다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 결합 저해제에 의하여 결합이 저해되는 숙주 세포는 인간-유래 세포이다. 바람직하게는 인체의 감염 (전신성 또는 국부성) 시 이동 통로가 될 수 있는 부위의 세포이며, 보다 바람직하게는 점막-유래 세포이며, 가장 바람직하게는 구강 점막 상피 세포, 질 점막 상피 세포 또는 혈관의 내피 세포이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 칸디다 속의 미생물 및 숙주 세포의 결합을 저해하며 트랜스글루타미나아제를 포함하는 상술한 본 발명의 결합 저해제의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 칸디다 속에 대한 항진균 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 결합 저해제를 유효 성분으로 포함하기 때문에, 상술한 결합 저해제와 공통되는 내용은 본 명세서의 과도한 중복에 의한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 항진균 조성물은 상술한 특성을 갖는 트랜스글루타미나아제를 단독으로 또는 상기 프롤린-풍부 단백질들과의 조합으로 포함하며, 칸디다 속에 속하는 미생물과 다양한 숙주 세포와의 결합을 저해하여 항진균 효과를 나타낸다.
본 발명의 항진균 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구적 방법으로 투여될 수 있으며, 비경구적 방법으로, 예컨대, 국부적으로 감염된 피부에 도말하여 적용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 약 0.1-300 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/ 또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
한편, 현대의 화학 요법은 많은 질병을 극복할 수 있는 수단으로 이용되고 있으나, 이에 의해 환자의 면역계가 손상을 받고, 결국 진균류의 감염이 발생되는 문제점이 초래된다. 이러한 진균류의 감염에 의해 발생되는 질병 중 하나가 칸디다 병 (candidiasis)이다. 이러한 칸디다 병은 인간의 구강 (oral candidiasis) 또는 질 내 (vaginal candidiasis)에서 국부적으로 발생되기도 하며, 전신성으로 발생되기도 한다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 칸디다 속 진균류의 국부적 또는 전신적 감염에 의해 발생되는 칸디다 병의 치료 또는 예방에 적용될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 약제학적 조성물은 생체에서 유래된 효소를 유효 성분으로 이용하기 때문에 인체에 적용 시 부작용이 극히 적다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 트랜스글루타미나아제 4의 생산 및 정제
실시예 1-1: 트랜스글루타미나아제 4의 생산
트랜스글루타미나아제 4 (TGase 4)의 타입 M을 코딩하는 유전자를 pAcHLT-B (Pharmingen)에 클로닝을 하였다 (최경호, 사람 전립선 트랜스글루타미나아제의 유전자 구조, 서울대학교 의과대학, 1999년 2월).
이어, Pharmingen 사에서 추천하는 배큘로바이러스 (baculovirus) 제조 방법에 따라, TGase 4 유전자가 클로닝된 pAcHLT-B을 BaculoGold에 함께 sf21 세포에 공동-트랜스펙션 하여 배큘러바이러스를 제조하였다. 이어, 배큘러바이러스 배양 상층액 500 ㎕를 sf21 세포를 포함하는 100pi 디쉬에 다시 감염시키고, 3일 동안 배양 한 다음, 배양액 50 ㎕를 취하여 sf21 세포를 포함하는 150pi 디쉬에 감염시켰다. 이러한 과정을 3회 반복하여, 배큘러바이러스를 증폭하였다. 그런 다음, sf21 세포를 Grace's 곤충 세포 배양액 (Gibco)을 이용하여 서스펜션 배양으로 250 ㎖ 성장시키고, 상기 3회 증폭된 배큘러바이러스 15 ㎖으로 감염시켰다. 이어, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후에 sf21 세포를 수확하였다.
실시예 1-2: 트랜스글루타미나아제 4의 정제
상기 실시예 1-1에서 최종적으로 수확된 sf21 세포를 PBS로 세척하고, 라이시스 완충액 (10 mM Tris, pH 7.5, 130 mM NaCl, 1% TritonX-100, 10 mM NaF 및 10 mM Na-인산염 완충액) 20 ㎖을 첨가하고, 주사기 바늘을 이용하여 2회 라이시스 시켰다. 그런 다음, 라이시스된 것을 20,000 rpm으로 30분 동안 원심분리 (Beckman JA-20 로터 이용)하고, 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. 그리고 나서, 여과액을 Ni-NTA 레진이 충진된 컬럼에 로딩하고, 세척 완충액-1 (50 mM Na-인산염 완충액, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM 이미다졸, pH 8.0) 30 ㎖로 세척한 다음, 세척 완충액-2 (50 mM Na-인산염 완충액, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 20 mM 이미다졸, pH 8.0) 10 ㎖로 세척하였다. 이어, 용출 완충액 (50 mM Na-인산염 완충액, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 500 mM 이미다졸, pH 6.0) 5 ㎖로 용출하고, 용출액을 HBS 완충액 (10 mM Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl)에 대하여 투석하였다.
실시예 2: 칸디다 알비칸스에 대한 트랜스글루타미나아제의 결합 저해 효과
상기 실시예 1에서 수득한 트랜스글루타미나아제 (TGase) 4의 결합 저해 효과를 알아보기 위하여, TGase 4를 단독으로 및 TGase 4의 교차-결합 억제자 (cross-linking inhibitor)인 시스타민과 혼합하여 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)에 처리하는 실험을 수행하였다.
먼저, 칸디다 알비칸스 (대한민국 이화여자대학교, 미생물학과, 최원자 교수)를 YPD 배지에서 밤새 배양한 후 그 배양 상등액을 취하였다. 상기 배양 상등액 1 ㎖를 RPMI-10% FBS (pH 7.4) 50 ㎖에 첨가하였다. 상기 혼합물을 재현탁시키고 페트리디쉬 5개에 각각 10 ㎖씩 나누어 담고, 37℃ 항온기에서 2시간 동안 배양 하였다. 배양후 다시 50 ㎖ 코니칼 튜브로 옮긴 후 2000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 배양액만 제거하고, 가라앉은 칸디다를 100 μCi 35S-Met를 포함하는 메티오닌 결함 RPMI-10 배지 10 ㎖에 첨가하고, 37℃ 항온기에서 2시간 동안 배양하였다. 이어, 배양액을 2000 rpm에서 원심분리하고, 펠릿을 PBS로 두 번 세척한 다음, PBS에 재현탁하고, 24개의 마이크로 튜브에 동량씩 나누어 담은 후 상기 튜브를 원심분리하고 잔여 PBS를 완전히 흡인하였다. 여기에 0.1 ㎎/㎖ TGase 4 및 BSA를 TGase 4 (㎕):BSA (㎕) = 0:100, 10:90, 50:50 및 100:0으로 첨가하고, TGase 반응 완충용액 (10 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2) 60 ㎕ 및 증류수 440 ㎕를 각각의 혼합액에 첨가하였다. 이어, 상기 반응 혼합액을 37℃에서 30분 동안 항온 처리하였다.
별도로, TGase 4가 반응하는 동안 컨풀루언트 HeLa 세포 (ATCC)를 0.5% 포름알데히드를 사용하여 48-웰 디쉬에 10분 동안 고정시켰다. 그런 다음, 각각의 TGase 4 반응된 칸디다 혼합물을 HeLa 세포가 고정된 48-웰 디쉬 (300 ㎕/웰)에 나누어 담고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 웰을 PBS로 두 번 세척하고, 각각의 웰에 1N NaOH 500 ㎕를 첨가하여 각 웰의 배양액을 용해 (resolving) 하였다. 그리고 나서, 각각의 혼합물을 반응 칵테일 4 ㎖를 포함하는 신틸레이션 병에 옮겨 담고 베타 카운팅하였다 (참조: 도 1).
도 1에 나타난 바와 같이, TGase 4를 처리하였을 경우에는 농도-의존적으로 칸디다 알비칸스가 HeLa 세포에 결합하는 것이 저해되었다. 더욱이, TGase 4와 10 mM 시스타민을 함께 처리하였을 경우에는, TGase 4 단독 처리할 때 보다 HeLa 세포와 칸디다 알비칸스의 결합 저해율이 감소 되었다.
따라서, 본 발명의 TGase 4는 칸디다와 숙주 세포 사이의 결합을 성공적으로 저해함을 알 수 있다.
실시예 3: 타액에 의한 칸디다 알비칸스의 결합 저해 효과
타액에 의한 칸디다 알비칸스의 결합 저해 효과가 타액 내의 TGase 4에 의한 것인지를 알아보기 위하여, 타액을 단독으로 및 TGase의 교차-결합 억제자 (cross-linking inhibitor)인 시스타민과 혼합하여 칸디다 알비칸스에 처리하였다.
완충액 (10 mM Hepes, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2)에 대해 투석시킨 후 3배로 농축시킨 타액을 단백질 정량을 한 다음, 각각 0, 33.3, 167 및 333 ㎍/㎖의 단백질 농도로 칸디다 알비칸스에 단독으로 또는 시스타민과 혼합으로 처리하였다 (참조: 도 2). 이외의 칸디다 알비칸스의 수득 과정 및 HeLa 세포에의 처리 과정은 상기 실시예 2와 같다.
도 2에 나타난 바와 같이, 칸디다 알비칸스에 타액만을 처리하였을 경우에는 그 농도가 증가함에 따라 HeLa 세포와 칸디다 알비칸스의 상대적 결합율이 감소되었으나, 시스타민을 함께 처리하였을 경우에는 상대적 결합율이 거의 감소되지 않았다. 따라서, 타액에 포함되어 있는 물질, 즉 TGase 4는 칸디다 및 숙주 세포의 결합을 성공적으로 저해할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4: 트랜스글루타미나아제의 기질 단백질 및 트랜스글루타미나아제에 의한 칸디다 알비칸스의 결합 저해 효과
실시예 4-1: 트랜스글루타미나아제의 기질 단백질들의 발현 및 정제
트랜스글루타미나아제의 기질 단백질인 산성 프롤린-풍부 단백질 (APRP), 염기성 프롤린-풍부 단백질 (BPRP) 또는 엘라핀 (elafin)을 발현하는 E. coli BL21 (DE3)은 다음과 같이 제조하였다: 우선, 인간의 타액 조직으로부터 총 RNA를 구아니디늄 티오시아네이트 페놀 클로로포름 방법으로 수득하였다. 100 ㎎ 침샘을 변성 용액 (4 M 구아니디움 티오시아네이트, 25 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0, 0.5% 사르코실, 0.1 M 2-머르캅토에탄올) 0.8 ㎖에서 균질화하고, 2 M 소듐 아세테이트 0.1 ㎖, 물-포화 페놀 0.8 ㎖ 및 클로로포름 0.2 ㎖을 순서대로 첨가한 다음, 10 초 동안 격렬하게 교반하고, 15분 동안 얼음에 정치 시켰다. 이어, 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하고, 수용액 층을 새로운 튜브로 옮겼다. 동일한 부피의 이소프로판올을 상기 튜브에 첨가하고, -20℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상기 변성 용액 0.3 ㎖을 첨가하여 침전물을 다시 용해시켰다. 그리고 나서, 이소프로판올로 다시 침전시킨 다음, 각 튜브를 75% 에탄올로 세척하고, 건조시켰다. 건조된 침전물을 DEPC (diethylpyrocarbonate)-처리 물로 용해시키고, RNA 정량을 하였다.
이어, 수득한 RNA를 SuperScripⅡ (GibcoBRL)을 이용하여 역전사함으로써, cDNA를 얻었다.
그런 다음, 상기 cDNA를 이용하여 총 35회의 세미-네스티드 PCR을 수행하였 다 (어닐링, 48℃, 30초; 신장 반응, 72℃, 90초; 변성, 94℃). 이용된 프라이머는 APRP의 경우, APRP1 (ATG CTT CTG ATT CTG CTG), APRP2 (GAA TTC CAT ATG CAG GAT TTA AAT GAA GAT) 및 APRP4 (GTC GAC TTA CTG AGG AGA CTC CCC)이고, BPRP의 경우, BPRP1 (CAT ATG CAG AAC TTA AAT GAA GAT), BPRP2 (TCA CTG GGG AGG TCT GGA) 및 BPRP3 (CAT ATG CTG TTG ATT CTG CTG)이다. 첫 번째 PCR에서는 APRP1 및 APRP4, 그리고 BPRP3 및 BPRP2가 이용 되었고, 두 번째 PCR에서는 APRP2 및 APRP4, 그리고 BPRP1 및 BPRP2가 이용 되었다.
엘라핀은 클로닝하여 사용하였다. 이 클론의 엘라핀은 VSV and Myc 에피토프로 태깅된 것이다.
PCR 생성물을 T7 블루 T-벡터에 클로닝하고, 클로닝 여부를 시퀀싱으로 확인하였다. 시퀀싱으로 확인된 클론을 NdeI 및 XhoI으로 절단하고, pET-15b에 삽입하였다. pET-15b 서브클론을 발현능 E. coli BL21에 트랜스포메이션시키고, 클로닝된 박테리아를 LB 배지에서 OD600가 0.6이 될 때까지 성장시킨 다음, 1 mM IPTG를 첨가하여 3시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 그런 다음, 박테리아 펠릿을 수획 및 음파 파쇄한 다음, 20,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 Ni-충진 Ni-NTA 레진이 충진된 컬럼에 로딩하였다. 이어, 세척 및 용출은 상기 실시예 1-2와 동일하게 실시하되, 세척에 이용된 이미다졸은 60 mM까지 증가시켜 사용하였으며, 용출에 이용된 이미다졸은 1 M의 것을 이용하였다.
정제를 마친 후 HBS 완충용액 (10 mM Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl)로 투석하 여 농축시킨 후 단백질 정량을 하고 -80℃에서 보관하였으며, 사용할 때는 적정 농도로 희석하여 사용하였다.
실시예 4-2: 산성 프롤린 풍부-단백질 및 트랜스글루타미나아제에 의한 칸디다 알비칸스의 결합 저해 효과
상기 실시예 4-1에서 수득한 APRP를 각각의 농도로 준비하여 단독으로 및 TGase 4와 혼합으로 칸디다 알비칸스에 처리하고, 이어 HeLa 세포에 처리하였다. 칸디다 알비칸스의 수득 과정 및 HeLa 세포에의 처리 과정은 상기 실시예 2와 같다 (참조: 도 3).
도 3에 나타난 바와 같이, 칸디다 알비칸스에 APRP 만을 처리하였을 경우, 그 농도가 증가함에 따라 HeLa 세포와 칸디다 알비칸스의 상대적 결합율이 감소되었다. 한편, APRP 및 TGase 4를 함께 처리하였을 경우에는, APRP를 단독으로 처리하였을 때보다 칸디다 알비칸스의 상대적 결합율이 현저히 감소되었다. 따라서, APRP는 트랜스글루타미나아제와 함께 처리될 때 상승적인 결합 저해 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실시예 4-3: 염기성 프롤린-풍부 단백질 및 트랜스글루타미나아제에 의한 칸디다 알비칸스의 결합 저해 효과
상기 실시예 4-1에서 수득한 BPRP를 각각의 농도로 준비하여 단독으로 및 TGase 4와 혼합으로 칸디다 알비칸스에 처리하고, 이어 HeLa 세포에 처리하였다. 칸디다 알비칸스의 수득과정 및 HeLa 세포에의 처리 과정은 상기 실시예 2와 같다 (참조: 도 4).
도 4에 나타난 바와 같이, 칸디다 알비칸스에 BPRP 만을 처리하였을 경우, 그 농도가 증가함에 따라 HeLa 세포와 칸디다 알비칸스의 상대적 결합율이 감소되었다. 한편, BPRP 및 TGase 4를 함께 처리하였을 경우에는, APRP를 단독으로 처리하였을 때보다 칸디다 알비칸스의 상대적 결합율이 현저히 감소되었다. 따라서, BPRP는 트랜스글루타미나아제와 함께 처리될 때 상승적인 결합 저해 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실시예 4-4: 엘라핀 및 트랜스글루타미나아제에 의한 칸디다 알비칸스의 결합 저해 효과
상기 실시예 4-1에서 수득한 엘라핀을 각각의 농도로 준비하여 단독으로 및 TGase 4와 혼합으로 칸디다 알비칸스에 처리하고, 이어 HeLa 세포에 처리하였다. 칸디다 알비칸스의 수득 및 정제 과정 및 HeLa 세포에의 처리 과정은 상기 실시예 2와 같다 (참조: 도 5).
도 5에 나타난 바와 같이, 칸디다 알비칸스에 엘라핀 만을 처리하였을 경우, 그 농도가 증가함에 따라 HeLa 세포와 칸디다 알비칸스의 상대적 결합율이 감소되었다. 한편, 엘라핀 및 TGase 4를 함께 처리하였을 경우에는, 엘라핀을 단독으로 처리하였을 때보다 칸디다 알비칸스의 상대적 결합율이 현저히 감소되었다. 따라서, 엘라핀은 트랜스글루타미나아제와 함께 처리될 때 상승적인 결합 저해 효과를 나타냄을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 트랜스글루타미나아제를 포함하는 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합 저해제를 제공한다. 또한, 본 발명은 트랜스글루타미나아제를 포함하는 항진균 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 결합 저해제는 칸디다 속의 미생물과 숙주 세포의 결합을 성공적으로 저해하며, 본 발명의 항진균 약제학적 조성물은 칸디다 속의 미생물과 그의 숙주 세포 사이의 결합을 직접적으로 저해함으로써 칸디다 병에 대한 항진균 효과를 나타낸다.

Claims (9)

  1. 트랜스글루타미나아제 4 (TGase 4)를 유효 성분으로 포함하는 칸디다 알비칸스와 인간 숙주세포 사이의 결합을 저해하는 항진균제.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항진균제는 상기 트랜스글루타미나아제의 생체 내 기질인 엘라핀을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항진균제.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 인간 숙주세포는 구강 점막 상피 세포, 질 점막 상피 세포 또는 혈관의 내피 세포인 것을 특징으로 하는 항진균제.
  9. (a) 칸디다 알비칸스 및 인간 숙주세포의 결합을 저해하며 트랜스글루타미나아제 4를 포함하는 상기 제 1, 2 및 8 항 중 어느 한 항의 결합 저해제의 약제학적 유효량; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 칸디다 알비칸스에 대한 항진균 약제학적 조성물.
KR1020020069560A 2002-11-11 2002-11-11 트랜스글루타미나아제를 포함하는 칸디다 속의 미생물과그의 숙주 세포 사이의 결합 저해제 KR100550385B1 (ko)

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