JP4620873B2 - Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｔｕｂａｋｉｉ由来の新規抗寄生虫薬であるセファイボール、その製造方法およびその使用 - Google Patents
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｔｕｂａｋｉｉ由来の新規抗寄生虫薬であるセファイボール、その製造方法およびその使用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は、Acremonium tubakii FH1685DSM12774から発酵時に合成され培養液中に放出される、下記でセファイボールと称される新規なペプタイボール系抗生物質、培養液から前記セファイボールを単離および精製する方法、並びに薬理学的に活性な化合物、特に寄生虫の制御用化合物としてのセファイボールの使用に関する。
【０００２】
【従来技術】
寄生虫症は広く蔓延しており、わずかな生理学的異常から重篤な（場合によって致死的な）疾患に及ぶ広範囲の病理学的作用を人および動物に引き起こす。今日、人およびそのペット並びに家畜の健康および生命を脅かす集中的に研究されてきた多くの寄生虫疾患が知られている。
【０００３】
全世界的に免疫系の弱体化が多くの人々で認められ増加傾向にある。このような群に属する人々は日和見感染性寄生虫に激しく冒され、毎年数百万人が死亡する。遠距離旅行の時代には、通常は衛生状態が高水準である非第三世界においてすら、外国産の寄生虫を想定する必要がある。これは、通常の衛生条件下において難儀な旅行をすることがこれまでになく増加傾向にあるという事実、および本国で想定される安全性のために衛生上の危険性についての感覚／知識が失われてきているという事実が原因である。人間の健康を護るだけでなく、動物の保護のためにもまた、寄生虫によって引き起こされる苦痛の治療および可能な場合には回避が要求される。経済的理由は特に畜産業で明らかである。この場合、家畜の維持および飼育に不利な条件のために（例えばある種の大量飼育形態の場合）、寄生虫疾患が発生し易く、量的（肉量、卵の数、競争速度）または質的（肉質または羊毛の質）特性の低下をもたらす。人および動物で寄生虫によってもたらされる多大な損害のために、寄生虫の制御は健康や経済の問題として必須でないとしても大いに所望されるところである。
【０００４】
寄生虫は単細胞または多細胞生物で、一時的または永久的に異種生物の体内（内部寄生生物）または体外（外部寄生生物）に停留し、ホストの費用で生存する。人および動物では、多くの寄生虫は亜急性疾患をもたらすが、また劇症疾患も引き起こす。単細胞性寄生虫には、例えば形質胞体（マラリア病原体）、トリパノソーマ類（シャーガス病病原体）、アメーバ、トリコモナドまたはトキソプラズマのような原虫が含まれる。重要な単細胞性寄生虫は内部寄生生物（蠕虫）で、とりわけ線虫（線虫類）、条虫類（多節条虫類）およびヒル類（吸虫類）は人および動物で重篤な障害を引き起こす。同様な多細胞性外部寄生生物には、ダニ、ダニ類、ノミおよび他の生物が含まれる。寄生虫疾患を制御および治療するために利用できる多くの薬剤（抗寄生虫薬）があるが、一方ではこれら薬剤の副作用のために、他方では耐性の増加のために、新規で効果の強い抗原虫薬、駆虫剤および他の駆虫薬が希求されている。特に熱帯地方の人々が寄生虫の蔓延に被害を受けている。この地域の罹患者数は数億人と概算され、さらに相当な被害が農業分野で見積もられている。
【０００５】
個々の寄生虫または比較的大きな群の寄生虫に対して活性を有し、ホスト（人、動物）における毒性が許容可能な化学物質の使用がなお寄生虫制御ではもっとも重要である。
それらの作用スペクトルにしたがい、寄生虫に対して作用する駆虫薬、原虫に対して活性をもつ抗原虫薬、昆虫に活性を示す殺虫剤およびダニ類（ダニ目）に対して活性なダニ駆除剤に区別される。最後の２つのグループはまた外部寄生生物駆除剤という用語で一括される。
【０００６】
特に近代の大規模畜産において長期に及ぶ大量使用によって助長された薬剤耐性の増加のために、またはグローバリゼーションの進行という体制の中で熱帯および亜熱帯で比較的長期間仕事に従事しなければならない人々の特に持続的な医療処置時のいくつかの事例における重篤な副作用の出現、およびある種の化学療法の場合の予防／治療における出費の増大のために、異なる作用メカニズムを有し毒性のより低い安価な他の種類の物質の検索が必須となった。さらにまた単に有効なだけでなく大量に経済的な製造が可能で、なおかつ環境に配慮した抗寄生虫薬が必要とされている。
【０００７】
（いくつかの事例では構造的に通常ではない）２０までのアミノ酸を含むペプチドが、細菌および真菌からそれらの二次代謝によって非リボソーム系ペプチドシンセターゼにより産生される。ペプチド構造をもつこれまでに知られている二次代謝産物の多くは、抗生物質、酵素抑制物質、強心剤、免疫調節剤、殺虫剤、抗線虫剤、および多くの他の薬剤としての興味深い生物学的作用を有する（例えば以下を参照されたい：U. Graefe, Biochemie der Antibiotika, Spektrum Heidelberg, 1992)。
【０００８】
活性ペプチド化合物の構造をもつ種類では、いわゆるペプタイボールは、通常とは異なり多くのアミノ酸（２０まで、とりわけα−アミノ酪酸の割合が高い：H. Brueckner, W.A. Koenig, M. Greiner, G. Jung, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 18:476-477(1979))をもつものとして区別されている。さらに、ペプタイボールは極めて頻繁にＮ−末端でアセチル化されてアルコール基をもつラジカルを含むか（例えばフェニルアラニノール）、またはＣ−末端にアルデヒド基を含む。
【０００９】
上記で述べたペプタイボールの例は、アイベリン（aibellin）（J. Antibiotics, 47:1136-1144(1994))；アンピュロスポリン（ampullosporin）（J. Antibiotics, 50:72-728(1997))；アンチアメービン（antiamoebin）（Structure, 6:783-792(1998))；クロノスタチン（clonostachin）（J. Antibiotics, 50:105-110(1997))；エメリミシン（emerimicins）（J. Antibiotics, 27:274-282(1974)）またはゼルバミシン（zervamicins）（J. Antibiotics, 27:321-328(1974))である。これらのペプタイボールは、エメリセロプシス（Emericellopsis）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、アピオクレア（Apiocrea）属および他の多くの属の非常に多様な株によって合成される。これらは、グラム陽性細菌、いくつかのタイプの真菌およびアメーバーに対して抗生物質活性を示す。さらにまたアンピュロスポリンの解熱作用および神経安定作用が報告されている。
【００１０】
しかしながらこれまでに分かったペプチド活性化合物はしばしば、不満足な作用能力、高い毒性および／または望ましくない副作用という欠点をもつ。
本発明の目的は、したがって改善された特性および／または新規な作用メカニズムをもつ新規な微生物系ペプチド活性化合物を探すことである。
【００１１】
この目的は、Acremonium tubakii FH1685DSM12774株を、炭素および窒素源並びに通常の無機塩を含む栄養溶液中で培養液に新規なペプタイボール（以下でセファイボールと称される）が蓄積されるまで培養することによって達成される。さらに前記セファイボールを培養液から単離し、場合によってこれらセファイボールを個々の活性なペプチド化合物に分離する。単離セファイボールは薬理学的に活性を有し、したがって医薬としての使用に適している。それらの抗寄生虫特性、特にそれらの強力な抗蠕虫活性および外部寄生生物に対する殺虫作用のゆえに、それらは特に、動物並びに人の内部および外部寄生生物に対抗する作用を有する抗生物質として用いることができる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は以下に関する。
１．下記式Ｉの化合物およびそれらの生理学的に許容できるその塩：
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−ｘ−ｗ−Ｌｅｕ−ｙ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−ｚ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｒ (Ｉ)
式中、ＲはＰｈｅ−ｏｌまたはＰｈｅ−ａｌであり、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは以下の意味を有する：
ａ) ｗはＧｌｙまたはＡｌａであり、ｘはＡｉｂであり、ｙおよびｚはＩｖａであり；
ｂ) ｗはＧｌｙであり、ｘ、ｙおよびｚはＩｖａであり；
ｃ) ｗはＧｌｙであり、ｘおよびｚはＡｉｂであり、ｙはＩｖａであり；
ｄ) ｗはＧｌｙであり、ｘ、ｙおよびｚはＡｉｂであるか；または
ｅ) ｗはＧｌｙであり、ｘおよびｙはＡｉｂであり、ｚはＩｖａである、または
下記式IIの化合物および生理学的に許容できるその塩：
ＡｃＰｈｅ−Ｉｖａ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−ｘ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ (II)
式中、ｘはＨｙｐまたはＰｒｏである。
【００１３】
２．式ＩまたはIIの１つまたは２つ以上の化合物の製造方法で、前記方法は、Acremonium tubakii、特にAcremonium tubakii FH1685 DSM12774を、１つまたは２つ以上の式ＩまたはIIの化合物が培養液に蓄積するまで前記培養液中で培養し、さらに前記培養液から前記化合物を単離することを含む。
３．薬理学的に活性な物質、特に人または動物の寄生虫、特に好ましくは蠕虫に対抗する抗生物質としての式ＩまたはIIの化合物の使用。
４．１つまたは２つ以上の式ＩまたはIIの化合物を含む人および／または動物で使用する医薬調製物。
以下で本発明を詳細に、特にその好ましい実施態様について述べる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
式ＩまたはIIの化合物はまた、ペプチド活性化合物またはセファイボールと称される。
セファイボールＡは、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＧｌｙ、ｘがＡｉｂ、さらにｙおよびｚがＩｖａであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号１）。
【００１５】
セファイボールＡ１は、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＡｌａ、ｘがＡｉｂ、さらにｙおよびｚがＩｖａであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号８）。
【００１６】
セファイボールＢは、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＡｌａ、さらにｘ、ｙおよびｚがＩｖａであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｉｖａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号２）。
【００１７】
セファイボールＣは、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＡｌａ、ｘおよびｚがＡｉｂ、さらにｙがＩｖａであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号３）。
【００１８】
セファイボールＤは、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＡｌａ、さらにｘ、ｙおよびｚがＡｉｂであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号４）。
【００１９】
セファイボールＥは、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＡｌａ、ｘおよびｙがＡｉｂ、さらにｚがＩｖａであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号５）。
【００２０】
セファイボールＰは、式IIの化合物であって、ｘがＨｙｐであるものを指す。 ＡｃＰｈｅ−Ｉｖａ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号６）。
【００２１】
セファイボールＱは、式IIの化合物であって、ｘがＰｒｏであるものを指す。 ＡｃＰｈｅ−Ｉｖａ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号７）。
【００２２】
ＡｃＰｈｅはＮ−アセチルフェニルアラニンで、Ａｉｂはα−アミノイソ酪酸で、Ａｌａはアラニンで、Ｉｖａはイソバリンで、Ｈｙｐはヒドロキシプロリンで、Ｐｈｅ−ｏｌはフェニルアラニノールで、Ｐｈｅ−ａｌはフェニルアラニナールで、Ｐｈｅはフェニルアラニンで、Ｇｌｙはグリシンで、Ｌｅｕはロイシンで、Ｇｌｎはグルタミンで、Ｐｒｏはプロリンで、Ｉｌｅはイソロイシンで、Ｔｈｒはスレオニンで、Ｓｅｒはセリンである。
【００２３】
本発明のセファイボールはAcremonium tubakii、好ましくはAcremonium tubakii FH1685DSM12774によって産生される。Acremonium tubakii FH1685DSM12774は赤味がかったベージュ色の菌糸体を有し、Acromonium種に特有の分生子柄をもつ。単離株は、ブダペスト条約の規定に基づきDeutsche sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（Mascheroder Weg 1B, D 38124 Brunswick, Germany）に以下の番号で９９年３月３１日に寄託された：Acremonium tubakii FH1685DSM12774。
【００２４】
炭素源および窒素源並びに通常の無機塩を含む栄養溶液（培養液ともいう）中で、Acremonium tubakii FH1685DSM12774は１つまたは２つ以上の本発明の式ＩまたはIIの化合物を産生する。
【００２５】
Acremonium tubakii FH1685DSM12774株の代わりに、１つまたは２つ以上の本発明のセファイボール化合物を合成する前記株の変異体および変種もまた利用できる。そのような変異体は、物理的手段（例えば紫外線またはＸ線の照射）または変異誘発化学物質（例えばエチルメタンスルホネート(ＥＭＳ)、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン(ＭＯＢ)またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(ＭＮＮＧ)）によって、または遺伝子工学的な方法を用いて既知の態様で作出できる。
【００２６】
１つまたは２つ以上の本発明のセファイボールを合成する変異体および変種についてのスクリーニングは、以下の計画にしたがって実施される：
- 培養後の菌糸体の分離；
- 有機溶媒による菌糸体の抽出；
- 固相または水に不混和性有機溶媒を用いた培養ろ液のセファイボール抽出;
- ＨＰＬＣ、ＴＬＣまたは生物学的活性検査による分析。
下記で述べる培養条件はAcremonium tubakii、前記寄託単離株Acremonium tubakii FH1685DSM12774並びにその変異体および変種に適合する。
【００２７】
本発明の方法は、実験室規模の培養（ミリリットルからリットルの範囲）および工業的規模（立法メートル規模）に用いることができる。別に記載がなければ、すべての百分率は重量に関する。液体の場合の混合比は、別に詳細が示されなければ溶液の関係である。
炭素源および窒素源並びに通常の無機塩を含む培養液では、Acremonium tubakii FH1685DSM12774は本発明の式ＩおよびIIの化合物を産生する。
【００２８】
好気性培養に適した好ましい炭素源は、同化性炭水化物および糖アルコール（例えばグルコース、ラクトース、シュクロースまたはＤ−マンニトール）並びに炭水化物含有天然生成物（例えば麦芽抽出物）である。可能な窒素含有栄養物は、アミノ酸、ペプチドおよび蛋白質並びにその分解産物（例えばペプトンまたはトリプトン）の他に獣肉抽出物、酵母抽出物、ひきわり種子（例えばトウモロコシ、小麦、豆類、大豆またはワタ）、アルコール製造の蒸留残留物、ミートミールまたは酵母抽出物、さらにまたアンモニウム塩および硝酸塩である。前記栄養溶液が含むことができる無機塩は、例えばアルカリもしくはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩である。
【００２９】
本発明のセファイボールの生成は以下を含む培養液中で良好に進行する：約０.１から５％、好ましくは０.３から２％の酵母抽出物および０.２から５％、好ましくは０.５％から３％のシュクロースおよび０.１から１０ｇ／Ｌ、好ましくは０.２から１.０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウムおよび０.０５から１.０ｇ／Ｌ、好ましくは０.１から０.５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウムもしくはナトリウムおよび０.０５から１.０ｇ／Ｌ、好ましくは０.１から１.０ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムおよび０.０１から０.１ｇ／Ｌ、好ましくは０.０２から０.１ｇ／Ｌの塩化カリウムおよび０.０１から１００μm、好ましくは５から２０μmの硫酸鉄並びに微量の硫酸亜鉛および硫酸銅。％で示した項目は、各々の事例で全培養液の重量を基準にしている。
【００３０】
培養液中でAcremonium tubakii FH1685DSM12774はセファイボール混合物を生成する。培養液の組成に応じて、本発明の１つまたは２つ以上のセファイボールの量的比を変化させることが可能である。さらにまた、個々のセファイボールの合成を培養液の組成によって制御し、それによて１つまたは２つ以上のセファイボールを全く産生させないようにするか、または微生物の検出限界以下の量に抑えることが可能である。
前記混合物は、好ましくは検出可能な８種の異なるセファイボール（セファイボールＡ、Ａ１、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ並びにＰおよびＱ）から成る。好ましくはセファイボールＡからＥが産生される。
【００３１】
セファイボールＡ１およびＡからＥ（Ｃ末端の特徴的なエレメントとしてフェニルアラニノール（Ｐｈｅ−ｏｌ１６）をもつ式Ｉの化合物）の他に、Ｃ末端基としてＰｈｅ−ｏｌ１６の代わりにアルデヒドフェニルアラニナール（Ｐｈｅ−ａｌ１６）をもつ式Ｉの化合物もまたAcremonium tubakii FH1685DSM12774の培養液中に形成される。原則としてこれらはセファイボールＡ−Ｅに対して微量生成物で、セファイボールＡ−Ｅとともに培養液から得られる。微生物は好気的に、すなわち例えば、シェーカーフラスコまたは発酵槽で振盪または撹拌しながら、適切な場合には空気または酸素を導入しながら液体中で培養される。培養は、約１８〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃、特に２２〜２８℃の温度範囲で実施できる。ｐＨは６〜８、好ましくは６.５〜７.５の範囲であろう。一般に、微生物は前述の条件下で２４〜３００時間、好ましくは３６〜１４０時間にわたって培養される。
【００３２】
培養は以下のようないくつかのステージで有利に実施される。すなわち、先ず最初に１つまたは２つ以上の予備培養を液体培養液で調製し、続いてこれを例えば１：１０の容積比で実際の製造培養液（主培養）に接種する。予備培養は、例えば菌糸体を栄養溶液に接種し、約３６〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間増殖させることによって得られる。菌糸体は、例えば約３〜４０日、好ましくは４〜１０日間固形または液体栄養培地、例えば麦芽−酵母−寒天またはポテト−デキストロース−寒天（糸状菌用標準培地、例えばDifco社製）で菌株を増殖させることによって得ることができる。
【００３３】
培養の経過は、培養物のｐＨまたは菌糸体の容積によって、さらにクロマトグラフィー法（例えば薄層クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィー）または生物学的活性の検査によってモニターできる。本発明のセファイボールは、菌糸体および培養ろ液の両方から得られるが、最大部分は菌糸体に見出される。
下記に述べる単離方法は、本発明のセファイボールの精製に、好ましくはセファイボールＡ、Ａ１、Ｂ、ＣおよびＤの精製に用いられる。
【００３４】
本発明のセファイボールの培養液からの単離または精製は、本来のセファイボールの化学的、物理的および生物学的特性を考慮しながら、既知の方法にしたがって実施される。培養液または個々の単離工程でのペプチド活性化合物の濃度を調べるために、薄層クロマトグラフィー（例えばシリカゲル上で溶出液としてイソプロパノール／２５％濃度のＮＨ3を用いる）またはＨＰＬＣを用いることができる。薄層クロマトグラフィー分離の場合の検出は、例えばアニスアルデヒド／硫酸のような染色試薬によって生成された物質量を基準溶液と簡便に比較することによって実施できる。式Ｉ（この場合ＲはＰｈｅ−ａｌラジカル）の副産物は、場合によって対応するセファイボールＡ−Ｅから当業者に既知の通常の精製方法、例えばクロマトグラフィーまたは再結晶化によって分離できる。
本発明のセファイボールの単離のためには、先ず菌糸体を通常の方法によって培養液から分離し、続いてセファイボールを場合によって水に混和性の有機溶媒を用いて細胞集塊から抽出する。有機溶媒相は本発明のセファイボールを含んでいる。これらセファイボールを場合によって真空中で濃縮し、さらに下記のように精製する。
【００３５】
培養ろ液を場合によって菌糸体抽出物の濃縮液と一緒にし、さらに水に混和性の適当な有機溶媒、例えばｎ−ブタノールで抽出する。続いて分離した有機相を場合によって真空中で濃縮する。重要な生成物の脱脂のために、濃縮物を本発明のセファイボールがほとんど溶解しない非極性溶媒、例えばヘキサン、石油エーテルまたはジエチルエーテルで希釈してもよい。この工程でセファイボールは沈殿し、親油性不純物は溶解したままで通常の固相／液相分離によって除去できる。
沈殿物（これは全てのセファイボールを含んでいる）を最初の容積の１／３０の水／メタノールに溶解する。沈殿物はこの過程で完全に溶解し、この溶液を凍結乾燥させる。続いて粗精製物と称するこの凍結乾燥物は５から５０％のセファイボールを含み、更なる単離に利用される。
【００３６】
本発明の１つまたは２つ以上のセファイボールの更なる精製は、適当な物質、好ましくは例えば分子ふるい、シリカゲルもしくはアルミナ、イオン交換物質または吸着樹脂によるクロマトグラフィーによって、または逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーによって実施される。このクロマトグラフィーを用いてセファイボールを分離する。クロマトグラフィーによるセファイボールの分離は、緩衝水溶液または水溶液と有機溶媒の混合物を用いて実施する。
水および有機溶媒の混合物は水と混和できる全ての有機溶媒（好ましくはメタノールまたはアセトニトリルを、溶媒の１０〜８０％、好ましくは溶媒の４０〜６０％濃度）、そうでなければ有機溶媒と混和できる全ての緩衝水溶液を指すと理解される。
【００３７】
その極性の相違に基づくセファイボールの分離は、逆相クロマトグラフィーによって、例えばＭＣＩ（登録商標）（吸着樹脂（三菱, 日本））またはアンバーライト（Amberlite）ＸＡＤ（登録商標）（TOSOHAAS）、またはさらに別の疎水性物質、例えばＲＰ−８またはＲＰ−１８の相を用いて実施される。さらにまたこの分離は、通常相によるクロマトグラフィーによって、例えばシリカゲル、アルミナなどを用いて実施できる。
【００３８】
セファイボールのクロマトグラフィーは、緩衝または酸性化水溶液または水溶液とアルコールもしくは水に混和性の他の有機溶媒との混合物を用いて実施される。使用有機溶媒は好ましくはプロパノールおよびアセトニトリルである。
緩衝または酸性化水溶液は、例えば水、リン酸緩衝液、酢酸アンモニウム、クエン酸緩衝液（濃度は０.１mＭから０.５Ｍ）、およびギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸または当業者に知られている通常の全ての酸（好ましくは濃度は０.０１から１％で、０.１％が特に好ましい）を指すと理解される。
クロマトグラフィーは、１００％の水で始まり、１００％の溶媒で終わる濃度勾配を用いて実施される。好ましくは３０から６０％のプロパノールまたはアセトニトリルの直線状濃度勾配が用いられる。
【００３９】
また別には、ゲルクロマトグラフィーまたは疎水相を用いるクロマトグラフィーを実施することもまた可能である。
ゲルクロマトグラフィーは、ポリアクリルアミドゲルまたは混合ポリマーゲル、例えばバイオゲル（Biogel-P2；登録商標）(Biorad）またはフラクトゲル（Fractogel）TSKHW40（登録商標）（Merck, Germany, Toso Haas, USA）またはセファデックス（Sephadex)（登録商標）(Pharmacia, Sweden）で実施される。
上記のクロマトグラフィーの順序は逆にできる。
【００４０】
セファイボールの非常に有効なさらに別の精製工程は結晶化である。セファイボールは、有機溶媒溶液から、および水と有機溶媒との混合物から容易に結晶化できる。結晶化は、それ自体既知の態様で、例えばペプチド活性化合物の飽和溶液を濃縮または冷却することにより実施される。
本発明のセファイボールは固体状態で安定で、さらに３から８、特に５から７のｐＨの溶液で安定で、したがって通常の医薬調製物に取り込むことができる。
【００４１】
式ＩまたはIIの化合物の生理学的に許容できる塩は、その有機および無機塩（例えば成書（Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, 第1418頁(1985))に記載）の両方を指すと理解される。物理的および化学的安定性並びに溶解性のために、酸性基に対してはとりわけナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩およびアンモニウム塩が好ましい。塩基性基に対してはとりわけ以下の酸の塩が好ましい：塩酸、硫酸、リン酸またはカルボン酸もしくはスルホン酸、例えば酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸およびｐ−トルエンスルホン酸。
【００４２】
本発明は、式ＩまたはIIの化合物の全ての立体異性型を含む。式IIの化合物に含まれる不斉中心は全てそれぞれ別個にＳ立体配置またはＲ立体配置を有することができる。本発明はすべての可能なエナンチオマーおよびジアステレオマーの他に２つまたは３つ以上の立体異性型の混合物、例えば任意の比率にあるエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物を含む。したがって本発明の対象は、純粋な形態（左旋性および右旋性対掌体）として、ラセミ型として、および任意の比率にある２つの鏡像体の混合物としての鏡像体である。シス／トランス異性系の存在下では、シス型およびトランス型並びに任意の比率にあるこれらの形態の混合物は本発明の対象である。
【００４３】
明らかに本発明はまた式ＩまたはIIの化合物の化学的同等物を含む。本タイプの同等物は、例えばエステル、エーテル、付加塩、複合体また他の部分的加水分解産物である。
その重要な薬理学的特性のために、本発明のセファイボールは人および／または動物の医薬としての使用に適している。本発明の物質は、特に寄生虫（特に好ましくは内部および／または外部寄生生物）に対する抗生物質としての薬理活性を有する。
【００４４】
したがって本発明は、さらに人または動物の医薬として、特に人および／または動物に病原性を有する内部および／または外部寄生生物に対する化学療法剤として本発明の式ＩまたはIIの化合物を使用することに関する。これらのペプチド活性化合物の作用メカニズムは不明であるが、蠕虫および内部寄生生物に対する顕著で致死的な作用が検出された。
【００４５】
本発明のセファイボールは、例えば動物および人に病原性を有する吸虫（肝蛭（Fasciola hepatica)、ブスキ肥大吸虫（Fasciolopsis buski)、巨大肝蛭（Fasciola gigantica)、ファシオロイデス＝マグナ（Fascioloides magna)、槍形吸虫（Dicrocoelium dendriticum)、ネコ肝吸虫（Opisthorchis felineus)、肝吸虫（Clonorchis sinensis)、ヴェステルマン肺吸虫（Paragonimus westermanni)、ケリコット肺吸虫（Paragonimus kellikotti)、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium)、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum)、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni))、および人および動物に病原性を有する線虫（これらは以下の科に属する：Trichuridae、Trichinellidae、Strongyloididae、Ancylostomatidae、Strongylidae、Trichostrongylidae、Metastrongylidae、Oesophagostomatidae、Dictyocaulidae、Protostrongylidae、Angiostrongylidae、Oxy，uridae、Ascaridae、Toxocaridae、Dracunculidae、HabronematidaeおよびFilariidae）の制御に適している。さらにまた本発明のセファイボールは、動物および人で病原性を有する外部寄生生物で、クモ形動物類（以下の科に属する：Argasidae、Ixodidae、Dermanyssidae、Demodicidae、Sarcoptidae、Psoroptidae、Varroidae）および昆虫類（これらは以下の目を含む：シラミ目（Anoplura、Mallophaga）、ハエ目およびノミ目）に属するものの制御に適している。
【００４６】
抗菌作用の他に、本発明の化合物は、植物に病原性を有するカビを含む抗真菌（すなわち抗カビ）特性を有する。
通常の薬剤に対して耐性を獲得した寄生虫の場合、新規な薬剤のみが治療に足る作用を有する。本発明の式ＩまたはIIのセファイボールはしたがってこれらの問題を有する生物に対してすら優れた潜在作用をもつ。
【００４７】
その抗菌、抗真菌および抗原虫活性のために、本発明のセファイボールは成長促進作用を有し、動物の繁殖に有効に用いることができる。飼料利用性の改善は、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマまたはウサギのような家畜で用いることができる。この場合、投与量として好ましくは０.０５〜５０mg／kg／日が用いられる。この場合のセファイボールはまたメタンガスの発生を減少させ、飼料の利用性の改善をもたらす。
【００４８】
本発明はまた、１つまたは２つ以上の本発明のセファイボールを含む医薬調製物に関する。適切な賦形剤または担体物質との混合物として使用するのが好ましい。獣医用医薬品で使用できる担体物質は通常の飼料混合物で、人の場合は薬理学的に許容できる全ての担体物質および／または賦形剤を使用できる。
【００４９】
本発明はまた前記医薬の製造方法に関し、本方法は、医薬として適当で生理学的に許容できる担体および適切な場合にはさらに適当な活性化合物、添加剤または賦形剤を用いて少なくとも１つの本発明の化合物を適当な投与剤形にすることを含む。
【００５０】
一般に本発明の医薬は、経口的、局所的または非経口的に投与されるが、原則的には直腸投与も可能である。適当な固形または液状医薬剤形、例えば顆粒、散剤、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル、坐薬、シロップ、乳液、懸濁液、エアロゾル、ドロップまたはアンプル型の注射溶液が可能であるが、さらに活性化合物の徐放性調製物も可能である。それらの製造では、担体および添加剤および／または賦形剤、例えば崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨潤剤、研摩剤もしくは潤滑剤、香料、甘味剤または可溶化剤が通常用いられる。しばしば用いられる担体または賦形剤を挙げれば、例えば炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、乳汁蛋白、ゼラチン、澱粉、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物油または植物油、ポリエチレングリコール並びに溶媒、例えば滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールである。
【００５１】
適当な場合には、単位投与剤形は、放出を遅らせるためまたはより長時間にわたって放出させるために、例えば活性化合物を被覆するか、または活性化合物を適切なポリマーまたはロウなどに包埋して粒子にすることにより経口投与用のミクロカプセルとすることができる。
【００５２】
本医薬調製物は好ましくは単位投与剤形として製造され投与される。各単位剤形は活性成分として固有量の１つまたは２つ以上の本発明のセファイボール化合物を含む。固形単位剤形、例えば錠剤、カプセルおよび坐薬の場合、１日の単位用量は約２０００mgまで可能であるが好ましくは約１〜１０００mgで、アンプル型の注射溶液の場合は約１０００mgまでで、好ましくは約１０〜３００mgである。
【００５３】
投与できる日量は、体重、年齢、性別および対象動物の症状により変動する。しかしながら、一定の状況下ではより大量またはより少量の投薬量も適切であろう。毎日の投与は、個々の単位剤形の形でただ１回の投与またはより少量で数個の単位剤形の投与によって実施するか、さらに小分けにした用量を特定の間隔で複数回投与することによって実施できる。
本発明の医薬は、通常の担体および適当な場合には添加剤および／または賦形剤を用いて、１つまたは２つ以上の本発明のセファイボール化合物を適当な投与剤形にすることによって製造される。
【００５４】
原則として、蠕虫および外部寄生生物の治療の場合、治療手段、感染後手段および予防手段の間で区別がなされなければならない。これら異なる処置方法は、特定の医薬製剤を必要とする。このタイプの製剤は、例えば準治療量から治療量の抗蠕虫薬または抗外部寄生生物薬の連続投与を保証する。さらに、これらの製剤はその放出態様にしたがって“持続放出ボーラス投与”および“パルス放出ボーラス投与”に区別される。前者はさらに、“徐放性ボーラス投与”（これらは放出速度が遅いものである）および“連続放出ボーラス投与”（これらは一定の放出態様を示すものである）に区別される。他方、“パルス放出ボーラス投与”では、全活性化合物は数時間から数日以内に放出される。活性化合物のマイクロカプセル化を含み、さらに獣医用医薬品で人気が高まっている前記放出技術の他に、いわゆる“スポット＝オン”または“ポア＝オン”製剤が動物の外用として一般的である。錠剤、ペーストまたは注射溶液の投与、並びにネックバンド（例えば外部寄生生物に対する医薬を含有する）の使用は既に知られている。
本発明を下記の実施例でさらに詳述する。百分率は重量に関するものである。液体の混合比は、特に詳細が示されないかぎり容積に関するものである。
【００５５】
【実施例】
実施例１：Acremonium tubakii FH1685DSM12774のグリセロール培養の調製
滅菌した３００mlの三角フラスコ中の１００mlの栄養溶液（麦芽抽出物２.０％、酵母抽出物０.２％、グルコース１.０％、（ＮＨ4)2ＨＰＯ4 ０.０５％、ｐＨ６.０）にAcremonium tubakii FH1685DSM12774株を接種し、回転式振盪培養機で１４０rpmで２５℃で７日間培養する。続いてこの培養の１.５mlを２.５mlの８０％グリセロールで希釈し、−２０℃で保存する。
【００５６】
実施例２：三角フラスコでのAcremonium tubakii FH1685DSM12774の培養または予備培養の調製
下記の栄養溶液１００mlを含む滅菌した３００mlの三角フラスコに斜面培養管で増殖させた培養（以下と同じ栄養溶液であるが寒天を２％含む）または１mlのグリセロール培養（実施例１参照）を接種し、振盪培養機で１８０rpmで３０℃で培養する：３０ｇ／Ｌのスクロース、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、３ｇ／ＬのＮａＮＯ3、０.５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０.０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０.５ｇ／ＬのＫＣｌおよび１.０mlの微量元素溶液（０.２ｇ／ＬのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏおよび０.７ｇ／ＬのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ）。本発明のセファイボール化合物の１つまたは２つ以上の最大産生は約１２０時間後に達成される。１０から２００ｌの発酵装置に接種した場合は、同じ栄養溶液の４８〜９６時間の液中培養（接種量は約１０％）で十分である。
【００５７】
実施例３：セファイボールの製造
３０リットルの発酵装置を以下の条件で使用する：
栄養培地：３０ｇ／Ｌのシュクロース
５ｇ／Ｌの酵母抽出物
３ｇ／ＬのＮａＮＯ3
０.５ｇ／ＬのＫＣｌ
０.５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4
０.１ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4
１０μＭのＦｅＣｌ3×６Ｈ2Ｏ
１mlの微量元素溶液
ｐＨ６.５（滅菌前）
微量元素溶液：２ｇ／ＬのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏおよび
０.７ｇ／ＬのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ
培養時間：５０時間
培養温度：２５℃
撹拌速度：３００rpm
通気：１５リットル／分
エタノール系ポリオール溶液の反復添加によって泡沫発生を抑制することができる。最大産生は約９６から１２０時間後に達成される。
【００５８】
実施例４：Acremonium tubakii FH1685DSM12774の培養溶液からセファイボール混合物の単離
Acremonium tubakii FH1685DSM12774の培養終了後、実施例３にしたがって得られた３つの発酵装置の培養ブロス（９０リットル）を約２％のろ過補助剤（例えばCelite(登録商標)）を添加してろ過し、細胞塊（６リットル）を２０リットルのメタノールで抽出する。ペプチド活性化合物を含むメタノール溶液をろ過して菌糸体から分離し、真空中で濃縮する。この濃縮物を培養ろ液（８３リットル）と一緒にしてその前に用意した４リットルのＭＣＩゲル、ＣＨＰ２０Ｐカラムに適用する。これを０.１％のトリフルオロ酢酸水溶液からプロパン−２−オール中の０.１％トリフルオロ酢酸の濃度勾配を用いて溶出する。カラムから流出するもの（１２リットル／時間）を分画して採集し（各々２.５リットル）、ペプチド活性化合物を含有する分画（２１から２４）を一緒にする。真空中で濃縮し凍結乾燥することによって４ｇの青褐色の粉末が得られる。
【００５９】
実施例５：ゲルクロマトグラフィーによるセファイボール成分の濃縮
実施例４にしたがって得られた４ｇの生成物をフラクトゲル（Fractogel(登録商標）TSK MW-40 s）を充填した３.９リットル容量のカラム（幅×高さ＝１０cm×５０cm）に適用する。溶離液のメタノールを５０ml／分の流速でポンプでカラム通し、カラムの流出液を分画（６５ml）して採集する。セファイボールは主に分画２８から３３に見出だされる。それらを一緒にし、真空中でメタノールから分離し、１.３ｇのペプチド活性化合物の混合物が得られる。
【００６０】
実施例６：逆相ＲＰ−１８でのセファイボール成分の分離
５００ml容量の調製用ＨＰＬＣカラム（５.１cm（ＩＤ）×２５cm Ｈ）にヌクレオシル（Nucleosil（登録商標)）１００−７ Ｃ１８ ＨＤを充填し、実施例５にしたがって得られたペプチド活性化合物の混合物を適用する。溶出は０.１％のトリフルオロ酢酸水溶液中の４０％アセトニトリルを用いて実施する。カラム中の流速は５０ml／分で、内容量が各々１２５mlの分画を採集する。セファイボールＤは分画４６に、セファイボールＣは分画４９および５０に、セファイボールＥは分画５１に、セファイボールＡは分画６０から６４に、セファイボールＢおよびＡ１は分画６６および６７に見出される。分画６８はセファイボールの混合物を含む。真空中で濃縮し凍結乾燥させた後、以下のような重量が得られる:
セファイボールＡ：５２０mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６７１Ｄａ(Ｍ＋Ｈ)+，
セファイボールＡ１：４mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６８５ＤＡ(Ｍ＋Ｈ)+
セファイボールＢ：３８mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６８５Ｄａ(Ｍ＋Ｈ)+，
セファイボールＣ：１９５mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６５７Ｄａ(Ｍ＋Ｈ)+，
セファイボールＤ：１６mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６４３Ｄａ(Ｍ＋Ｈ)+，
セファイボールＥ：７６mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６５７Ｄａ(Ｍ＋Ｈ)+。
【００６１】
実施例７：セファイボールＰおよびＱの単離
実施例６にしたがって得られた分画６８を凍結乾燥後（４.１mg）に２０％のアセトニトリル水溶液に溶解し、２５０／１０のヌクレオシルＣ１８ ３００−７（登録商標）カラムに適用する。溶出は４０％のアセトニトリル中の０.００５％酢酸アンモニウム緩衝液で実施する。少しのセファイボールＢの他に、乾燥後に１mgのセファイボールＰおよび１mgのセファイボールＱが得られる。
セファイボールＰ：ＥＳＩ＋ＭＳ、分子量１８７３(Ｍ＋Ｈ)+ が測定される、
セファイボールＱ：ＥＳＩ＋ＭＳ、分子量１８５７(Ｍ＋Ｈ)+ が測定される。
【００６２】
実施例８：セファイボールの検出用ＨＰＬＣシステム
下記に示すシステムによって、粗混合物または培養ろ液中のセファイボールの分離および定量が可能である。保持時間は７.０分（セファイボールＤ）から１８.８分（セファイボールＡ１）の間である。
溶離液：４０％アセトニトリル中の０.１％トリフルオロ酢酸
カラム：ヌクレオシル１００Ｃ18ＡＢ ２５０／４（Macherey-Nagel）
流量： １.０ml／分
検出： ２１０nmでの紫外光吸収
表示条件下でセファイボールは下記の保持時間を示す：
セファイボールＡ： １２.１分
セファイボールＡ１：１８.８分
セファイボールＢ： １６.０分
セファイボールＣ： ９.０分
セファイボールＤ： ７.１分
セファイボールＥ： ７.３分
セファイボールＰ： １７.３分
セファイボールＱ： １７.９分
【００６３】
実施例９：セファイボールＡの性状決定
１０μgのセファイボールＡを持続的に沸騰している塩酸中で加水分解させ、アミノ酸分析装置で調べる。以下の一般的なアミノ酸が見出された：
ヒドロキシプロリン １１.５nmol
グルタミン酸 ５.７nmol
プロリン ５.５nmol
グリシン ５.５nmol
ロイシン ５.６nmol
フェニルアラニン ５.５nmol
例外的なアミノ酸、アミノイソ酪酸およびイソバリンの含有量は査定できなかった。
【００６４】
電子噴霧イオン化（ＥＳＩ＋）を用いるフィニガン（Finnigan）ＭＡＴ ＬＣＱイオントラップ質量分析装置による質量分析によって以下のデータが得られた：
ＥＳＩ質量スペクトルは、単同位体分子量１６６９.７に対応してｍ／ｅ １６７０.７で強いＭＨ+およびｍ／ｅ １６９２.７で［Ｍ＋Ｎａ]+を示し、これは、計算によって得られた質量１６６９.９Ｄａ（単同位体、Ｃ82Ｈ127Ｎ17Ｏ20）とよく一致する。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、表９に太字で表示したフラグメント化を示した。イタリック体で示したフラグメントは計算で得られたが、実際に観察はされていない。
【００６５】
【表１】
【００６６】
プロトン付加Ｂ断片化は第一の欄−および第二の欄（Ｍ＋ナトリウム)+−Ｂフラグメント化に表示されている。第三の欄はＮａ型のＡフラグメントシリーズを示している。
【００６７】
本発明のセファイボールの物理化学的および分光特性は以下のように要約できる：
セファイボールＡ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ82Ｈ127Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化１】
分子量：１６７１Ｄａ
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表１参照
【００６８】
セファイボールＡ１：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ83Ｈ129Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化２】
分子量：１６８５Ｄａ
ＵＶデータ（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表１ａ参照
【００６９】
セファイボールＢ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ83Ｈ129Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化３】
分子量：１６８５Ｄａ
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表２参照
【００７０】
セファイボールＣ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ81Ｈ125Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化４】
分子量：１６５７Ｄａ
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表３参照
【００７１】
セファイボールＤ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ80Ｈ123Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化５】
分子量：１６４３Ｄａ
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表４参照
【００７２】
セファイボールＥ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ81Ｈ125Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化６】
分子量：１６５７Ｄａ
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表５参照
【００７３】
セファイボールＰ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ89Ｈ137Ｎ19Ｏ25
構造式：
【化７】
分子量：１８７３Ｄａ
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表６参照
【００７４】
セファイボールＱ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ89Ｈ137Ｎ19Ｏ24
構造式：
【化８】
分子量：１８５７.１９７Ｄａ
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表７参照
【００７５】
【表２】
【００７６】
【表３】
【００７７】
【表４】
【００７８】
【表５】
【００７９】
【表６】
【００８０】
【表７】
【００８１】
【表８】
【００８２】
【表９】
【００８３】
【表１０】
【００８４】
【表１１】
【００８５】
【表１２】
【００８６】
【表１３】
【００８７】
【表１４】
【００８８】
【表１５】
【００８９】
【表１６】
【００９０】
【表１７】
【００９１】
【表１８】
【００９２】
【表１９】
【００９３】
【表２０】
【００９４】
【表２１】
【００９５】
【表２２】
【００９６】
【表２３】
【００９７】
【表２４】
【００９８】
【表２５】
【００９９】
【表２６】
【０１００】
【表２７】
【０１０１】
【表２８】
【０１０２】
【表２９】
【０１０３】
【表３０】
【０１０４】
【表３１】
【０１０５】
実施例１０：抗蠕虫作用の決定
蠕虫に対するセファイボールの作用を調べるために、in vitro検査（幼虫生育テスト）をニワトリの回虫、Ascaridida galliの幼虫を用いて実施した。 A. galliの胚含有卵を５％濃度の次亜塩素酸ナトリウム溶液で処理して表面を殺菌し、前記溶液を除去した後、ガラスビーズ（５mm）を回転させて機械的に卵を開けた。孵化させたＬ２の幼虫を幼虫濃縮方法によって濃縮し、栄養培地に採り、４１℃で１０％ＣＯ2で培養した。孵化後４８時間して、幼虫をマイクロタイタープレート（９６穴）で５日間、２００、１００、５０．．．０.１μg／mlの濃度の薬剤添加培養液（２００μl）中で保温した。５日間の保温中に、運動性、形態および生命活性を顕微鏡で検査し、毎日記録した。薬剤処置後、幼虫培養を０.１６％の濃度のニュートラルレッド（Neutral Red）で４８時間保温し、培地交換によりニュートラルレッドを除去後、幼虫の腸内の生体染料の濃縮化を能動的食物摂取の指標、したがって生命活性の証拠として査定した。２００、１００、５０および２５μg／mlの濃度のセファイボールＡによる幼虫の薬剤処理によって１００％の死亡率が得られ、１２.５μg／mlおよび６.２５μg／mlの濃度では死亡率はそれぞれ９２％および２０％であった。
【０１０６】
実施例１１：外部寄生生物に対する作用
外部寄生生物に対する作用はノミ幼虫検査（ネコノミ＝Ctenocephalides felis）で調べた。５mgのセファイボールＡを０.５mlのアセトンに溶解し、５００mgのブラッドミール（線維素除去ヒツジ血液）と混合した。溶媒を気化させた後、それぞれについて２ｇの石英砂を薬剤添加ブラッドミールと混合して、濃度２０００、１０００、５００、２５０ppm等の調製物を得た。各薬剤添加サンプルまたは溶媒コントロール当たり１５のノミ卵を薬剤添加血粉と石英砂との混合物に加え、続いてこれを３７℃で高い大気湿度で保温した。３−５日間隔で幼虫の発育、サナギ化および成虫への発育をチェックし、死亡率を記録した。溶媒コントロールと比較して９０％を越える幼虫の殺虫作用が用量に依存して観察された。
【０１０７】
実施例１２
抗菌作用の決定
表８は、抗菌スペクトルについて最小抑制濃度（ＭＩＣ）をいくつか示す。
【表３２】
【配列表】
本発明は、Acremonium tubakii FH1685DSM12774から発酵時に合成され培養液中に放出される、下記でセファイボールと称される新規なペプタイボール系抗生物質、培養液から前記セファイボールを単離および精製する方法、並びに薬理学的に活性な化合物、特に寄生虫の制御用化合物としてのセファイボールの使用に関する。
【０００２】
【従来技術】
寄生虫症は広く蔓延しており、わずかな生理学的異常から重篤な（場合によって致死的な）疾患に及ぶ広範囲の病理学的作用を人および動物に引き起こす。今日、人およびそのペット並びに家畜の健康および生命を脅かす集中的に研究されてきた多くの寄生虫疾患が知られている。
【０００３】
全世界的に免疫系の弱体化が多くの人々で認められ増加傾向にある。このような群に属する人々は日和見感染性寄生虫に激しく冒され、毎年数百万人が死亡する。遠距離旅行の時代には、通常は衛生状態が高水準である非第三世界においてすら、外国産の寄生虫を想定する必要がある。これは、通常の衛生条件下において難儀な旅行をすることがこれまでになく増加傾向にあるという事実、および本国で想定される安全性のために衛生上の危険性についての感覚／知識が失われてきているという事実が原因である。人間の健康を護るだけでなく、動物の保護のためにもまた、寄生虫によって引き起こされる苦痛の治療および可能な場合には回避が要求される。経済的理由は特に畜産業で明らかである。この場合、家畜の維持および飼育に不利な条件のために（例えばある種の大量飼育形態の場合）、寄生虫疾患が発生し易く、量的（肉量、卵の数、競争速度）または質的（肉質または羊毛の質）特性の低下をもたらす。人および動物で寄生虫によってもたらされる多大な損害のために、寄生虫の制御は健康や経済の問題として必須でないとしても大いに所望されるところである。
【０００４】
寄生虫は単細胞または多細胞生物で、一時的または永久的に異種生物の体内（内部寄生生物）または体外（外部寄生生物）に停留し、ホストの費用で生存する。人および動物では、多くの寄生虫は亜急性疾患をもたらすが、また劇症疾患も引き起こす。単細胞性寄生虫には、例えば形質胞体（マラリア病原体）、トリパノソーマ類（シャーガス病病原体）、アメーバ、トリコモナドまたはトキソプラズマのような原虫が含まれる。重要な単細胞性寄生虫は内部寄生生物（蠕虫）で、とりわけ線虫（線虫類）、条虫類（多節条虫類）およびヒル類（吸虫類）は人および動物で重篤な障害を引き起こす。同様な多細胞性外部寄生生物には、ダニ、ダニ類、ノミおよび他の生物が含まれる。寄生虫疾患を制御および治療するために利用できる多くの薬剤（抗寄生虫薬）があるが、一方ではこれら薬剤の副作用のために、他方では耐性の増加のために、新規で効果の強い抗原虫薬、駆虫剤および他の駆虫薬が希求されている。特に熱帯地方の人々が寄生虫の蔓延に被害を受けている。この地域の罹患者数は数億人と概算され、さらに相当な被害が農業分野で見積もられている。
【０００５】
個々の寄生虫または比較的大きな群の寄生虫に対して活性を有し、ホスト（人、動物）における毒性が許容可能な化学物質の使用がなお寄生虫制御ではもっとも重要である。
それらの作用スペクトルにしたがい、寄生虫に対して作用する駆虫薬、原虫に対して活性をもつ抗原虫薬、昆虫に活性を示す殺虫剤およびダニ類（ダニ目）に対して活性なダニ駆除剤に区別される。最後の２つのグループはまた外部寄生生物駆除剤という用語で一括される。
【０００６】
特に近代の大規模畜産において長期に及ぶ大量使用によって助長された薬剤耐性の増加のために、またはグローバリゼーションの進行という体制の中で熱帯および亜熱帯で比較的長期間仕事に従事しなければならない人々の特に持続的な医療処置時のいくつかの事例における重篤な副作用の出現、およびある種の化学療法の場合の予防／治療における出費の増大のために、異なる作用メカニズムを有し毒性のより低い安価な他の種類の物質の検索が必須となった。さらにまた単に有効なだけでなく大量に経済的な製造が可能で、なおかつ環境に配慮した抗寄生虫薬が必要とされている。
【０００７】
（いくつかの事例では構造的に通常ではない）２０までのアミノ酸を含むペプチドが、細菌および真菌からそれらの二次代謝によって非リボソーム系ペプチドシンセターゼにより産生される。ペプチド構造をもつこれまでに知られている二次代謝産物の多くは、抗生物質、酵素抑制物質、強心剤、免疫調節剤、殺虫剤、抗線虫剤、および多くの他の薬剤としての興味深い生物学的作用を有する（例えば以下を参照されたい：U. Graefe, Biochemie der Antibiotika, Spektrum Heidelberg, 1992)。
【０００８】
活性ペプチド化合物の構造をもつ種類では、いわゆるペプタイボールは、通常とは異なり多くのアミノ酸（２０まで、とりわけα−アミノ酪酸の割合が高い：H. Brueckner, W.A. Koenig, M. Greiner, G. Jung, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 18:476-477(1979))をもつものとして区別されている。さらに、ペプタイボールは極めて頻繁にＮ−末端でアセチル化されてアルコール基をもつラジカルを含むか（例えばフェニルアラニノール）、またはＣ−末端にアルデヒド基を含む。
【０００９】
上記で述べたペプタイボールの例は、アイベリン（aibellin）（J. Antibiotics, 47:1136-1144(1994))；アンピュロスポリン（ampullosporin）（J. Antibiotics, 50:72-728(1997))；アンチアメービン（antiamoebin）（Structure, 6:783-792(1998))；クロノスタチン（clonostachin）（J. Antibiotics, 50:105-110(1997))；エメリミシン（emerimicins）（J. Antibiotics, 27:274-282(1974)）またはゼルバミシン（zervamicins）（J. Antibiotics, 27:321-328(1974))である。これらのペプタイボールは、エメリセロプシス（Emericellopsis）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、アピオクレア（Apiocrea）属および他の多くの属の非常に多様な株によって合成される。これらは、グラム陽性細菌、いくつかのタイプの真菌およびアメーバーに対して抗生物質活性を示す。さらにまたアンピュロスポリンの解熱作用および神経安定作用が報告されている。
【００１０】
しかしながらこれまでに分かったペプチド活性化合物はしばしば、不満足な作用能力、高い毒性および／または望ましくない副作用という欠点をもつ。
本発明の目的は、したがって改善された特性および／または新規な作用メカニズムをもつ新規な微生物系ペプチド活性化合物を探すことである。
【００１１】
この目的は、Acremonium tubakii FH1685DSM12774株を、炭素および窒素源並びに通常の無機塩を含む栄養溶液中で培養液に新規なペプタイボール（以下でセファイボールと称される）が蓄積されるまで培養することによって達成される。さらに前記セファイボールを培養液から単離し、場合によってこれらセファイボールを個々の活性なペプチド化合物に分離する。単離セファイボールは薬理学的に活性を有し、したがって医薬としての使用に適している。それらの抗寄生虫特性、特にそれらの強力な抗蠕虫活性および外部寄生生物に対する殺虫作用のゆえに、それらは特に、動物並びに人の内部および外部寄生生物に対抗する作用を有する抗生物質として用いることができる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は以下に関する。
１．下記式Ｉの化合物およびそれらの生理学的に許容できるその塩：
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−ｘ−ｗ−Ｌｅｕ−ｙ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−ｚ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｒ (Ｉ)
式中、ＲはＰｈｅ−ｏｌまたはＰｈｅ−ａｌであり、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは以下の意味を有する：
ａ) ｗはＧｌｙまたはＡｌａであり、ｘはＡｉｂであり、ｙおよびｚはＩｖａであり；
ｂ) ｗはＧｌｙであり、ｘ、ｙおよびｚはＩｖａであり；
ｃ) ｗはＧｌｙであり、ｘおよびｚはＡｉｂであり、ｙはＩｖａであり；
ｄ) ｗはＧｌｙであり、ｘ、ｙおよびｚはＡｉｂであるか；または
ｅ) ｗはＧｌｙであり、ｘおよびｙはＡｉｂであり、ｚはＩｖａである、または
下記式IIの化合物および生理学的に許容できるその塩：
ＡｃＰｈｅ−Ｉｖａ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−ｘ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ (II)
式中、ｘはＨｙｐまたはＰｒｏである。
【００１３】
２．式ＩまたはIIの１つまたは２つ以上の化合物の製造方法で、前記方法は、Acremonium tubakii、特にAcremonium tubakii FH1685 DSM12774を、１つまたは２つ以上の式ＩまたはIIの化合物が培養液に蓄積するまで前記培養液中で培養し、さらに前記培養液から前記化合物を単離することを含む。
３．薬理学的に活性な物質、特に人または動物の寄生虫、特に好ましくは蠕虫に対抗する抗生物質としての式ＩまたはIIの化合物の使用。
４．１つまたは２つ以上の式ＩまたはIIの化合物を含む人および／または動物で使用する医薬調製物。
以下で本発明を詳細に、特にその好ましい実施態様について述べる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
式ＩまたはIIの化合物はまた、ペプチド活性化合物またはセファイボールと称される。
セファイボールＡは、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＧｌｙ、ｘがＡｉｂ、さらにｙおよびｚがＩｖａであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号１）。
【００１５】
セファイボールＡ１は、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＡｌａ、ｘがＡｉｂ、さらにｙおよびｚがＩｖａであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号８）。
【００１６】
セファイボールＢは、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＡｌａ、さらにｘ、ｙおよびｚがＩｖａであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｉｖａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号２）。
【００１７】
セファイボールＣは、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＡｌａ、ｘおよびｚがＡｉｂ、さらにｙがＩｖａであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号３）。
【００１８】
セファイボールＤは、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＡｌａ、さらにｘ、ｙおよびｚがＡｉｂであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号４）。
【００１９】
セファイボールＥは、式Ｉの化合物であって、ＲがＰｈｅ−ｏｌ、ｗがＡｌａ、ｘおよびｙがＡｉｂ、さらにｚがＩｖａであるものを指す。
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ（配列番号５）。
【００２０】
セファイボールＰは、式IIの化合物であって、ｘがＨｙｐであるものを指す。 ＡｃＰｈｅ−Ｉｖａ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号６）。
【００２１】
セファイボールＱは、式IIの化合物であって、ｘがＰｒｏであるものを指す。 ＡｃＰｈｅ−Ｉｖａ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号７）。
【００２２】
ＡｃＰｈｅはＮ−アセチルフェニルアラニンで、Ａｉｂはα−アミノイソ酪酸で、Ａｌａはアラニンで、Ｉｖａはイソバリンで、Ｈｙｐはヒドロキシプロリンで、Ｐｈｅ−ｏｌはフェニルアラニノールで、Ｐｈｅ−ａｌはフェニルアラニナールで、Ｐｈｅはフェニルアラニンで、Ｇｌｙはグリシンで、Ｌｅｕはロイシンで、Ｇｌｎはグルタミンで、Ｐｒｏはプロリンで、Ｉｌｅはイソロイシンで、Ｔｈｒはスレオニンで、Ｓｅｒはセリンである。
【００２３】
本発明のセファイボールはAcremonium tubakii、好ましくはAcremonium tubakii FH1685DSM12774によって産生される。Acremonium tubakii FH1685DSM12774は赤味がかったベージュ色の菌糸体を有し、Acromonium種に特有の分生子柄をもつ。単離株は、ブダペスト条約の規定に基づきDeutsche sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（Mascheroder Weg 1B, D 38124 Brunswick, Germany）に以下の番号で９９年３月３１日に寄託された：Acremonium tubakii FH1685DSM12774。
【００２４】
炭素源および窒素源並びに通常の無機塩を含む栄養溶液（培養液ともいう）中で、Acremonium tubakii FH1685DSM12774は１つまたは２つ以上の本発明の式ＩまたはIIの化合物を産生する。
【００２５】
Acremonium tubakii FH1685DSM12774株の代わりに、１つまたは２つ以上の本発明のセファイボール化合物を合成する前記株の変異体および変種もまた利用できる。そのような変異体は、物理的手段（例えば紫外線またはＸ線の照射）または変異誘発化学物質（例えばエチルメタンスルホネート(ＥＭＳ)、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン(ＭＯＢ)またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(ＭＮＮＧ)）によって、または遺伝子工学的な方法を用いて既知の態様で作出できる。
【００２６】
１つまたは２つ以上の本発明のセファイボールを合成する変異体および変種についてのスクリーニングは、以下の計画にしたがって実施される：
- 培養後の菌糸体の分離；
- 有機溶媒による菌糸体の抽出；
- 固相または水に不混和性有機溶媒を用いた培養ろ液のセファイボール抽出;
- ＨＰＬＣ、ＴＬＣまたは生物学的活性検査による分析。
下記で述べる培養条件はAcremonium tubakii、前記寄託単離株Acremonium tubakii FH1685DSM12774並びにその変異体および変種に適合する。
【００２７】
本発明の方法は、実験室規模の培養（ミリリットルからリットルの範囲）および工業的規模（立法メートル規模）に用いることができる。別に記載がなければ、すべての百分率は重量に関する。液体の場合の混合比は、別に詳細が示されなければ溶液の関係である。
炭素源および窒素源並びに通常の無機塩を含む培養液では、Acremonium tubakii FH1685DSM12774は本発明の式ＩおよびIIの化合物を産生する。
【００２８】
好気性培養に適した好ましい炭素源は、同化性炭水化物および糖アルコール（例えばグルコース、ラクトース、シュクロースまたはＤ−マンニトール）並びに炭水化物含有天然生成物（例えば麦芽抽出物）である。可能な窒素含有栄養物は、アミノ酸、ペプチドおよび蛋白質並びにその分解産物（例えばペプトンまたはトリプトン）の他に獣肉抽出物、酵母抽出物、ひきわり種子（例えばトウモロコシ、小麦、豆類、大豆またはワタ）、アルコール製造の蒸留残留物、ミートミールまたは酵母抽出物、さらにまたアンモニウム塩および硝酸塩である。前記栄養溶液が含むことができる無機塩は、例えばアルカリもしくはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩である。
【００２９】
本発明のセファイボールの生成は以下を含む培養液中で良好に進行する：約０.１から５％、好ましくは０.３から２％の酵母抽出物および０.２から５％、好ましくは０.５％から３％のシュクロースおよび０.１から１０ｇ／Ｌ、好ましくは０.２から１.０ｇ／Ｌの硫酸マグネシウムおよび０.０５から１.０ｇ／Ｌ、好ましくは０.１から０.５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウムもしくはナトリウムおよび０.０５から１.０ｇ／Ｌ、好ましくは０.１から１.０ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムおよび０.０１から０.１ｇ／Ｌ、好ましくは０.０２から０.１ｇ／Ｌの塩化カリウムおよび０.０１から１００μm、好ましくは５から２０μmの硫酸鉄並びに微量の硫酸亜鉛および硫酸銅。％で示した項目は、各々の事例で全培養液の重量を基準にしている。
【００３０】
培養液中でAcremonium tubakii FH1685DSM12774はセファイボール混合物を生成する。培養液の組成に応じて、本発明の１つまたは２つ以上のセファイボールの量的比を変化させることが可能である。さらにまた、個々のセファイボールの合成を培養液の組成によって制御し、それによて１つまたは２つ以上のセファイボールを全く産生させないようにするか、または微生物の検出限界以下の量に抑えることが可能である。
前記混合物は、好ましくは検出可能な８種の異なるセファイボール（セファイボールＡ、Ａ１、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ並びにＰおよびＱ）から成る。好ましくはセファイボールＡからＥが産生される。
【００３１】
セファイボールＡ１およびＡからＥ（Ｃ末端の特徴的なエレメントとしてフェニルアラニノール（Ｐｈｅ−ｏｌ１６）をもつ式Ｉの化合物）の他に、Ｃ末端基としてＰｈｅ−ｏｌ１６の代わりにアルデヒドフェニルアラニナール（Ｐｈｅ−ａｌ１６）をもつ式Ｉの化合物もまたAcremonium tubakii FH1685DSM12774の培養液中に形成される。原則としてこれらはセファイボールＡ−Ｅに対して微量生成物で、セファイボールＡ−Ｅとともに培養液から得られる。微生物は好気的に、すなわち例えば、シェーカーフラスコまたは発酵槽で振盪または撹拌しながら、適切な場合には空気または酸素を導入しながら液体中で培養される。培養は、約１８〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃、特に２２〜２８℃の温度範囲で実施できる。ｐＨは６〜８、好ましくは６.５〜７.５の範囲であろう。一般に、微生物は前述の条件下で２４〜３００時間、好ましくは３６〜１４０時間にわたって培養される。
【００３２】
培養は以下のようないくつかのステージで有利に実施される。すなわち、先ず最初に１つまたは２つ以上の予備培養を液体培養液で調製し、続いてこれを例えば１：１０の容積比で実際の製造培養液（主培養）に接種する。予備培養は、例えば菌糸体を栄養溶液に接種し、約３６〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間増殖させることによって得られる。菌糸体は、例えば約３〜４０日、好ましくは４〜１０日間固形または液体栄養培地、例えば麦芽−酵母−寒天またはポテト−デキストロース−寒天（糸状菌用標準培地、例えばDifco社製）で菌株を増殖させることによって得ることができる。
【００３３】
培養の経過は、培養物のｐＨまたは菌糸体の容積によって、さらにクロマトグラフィー法（例えば薄層クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィー）または生物学的活性の検査によってモニターできる。本発明のセファイボールは、菌糸体および培養ろ液の両方から得られるが、最大部分は菌糸体に見出される。
下記に述べる単離方法は、本発明のセファイボールの精製に、好ましくはセファイボールＡ、Ａ１、Ｂ、ＣおよびＤの精製に用いられる。
【００３４】
本発明のセファイボールの培養液からの単離または精製は、本来のセファイボールの化学的、物理的および生物学的特性を考慮しながら、既知の方法にしたがって実施される。培養液または個々の単離工程でのペプチド活性化合物の濃度を調べるために、薄層クロマトグラフィー（例えばシリカゲル上で溶出液としてイソプロパノール／２５％濃度のＮＨ3を用いる）またはＨＰＬＣを用いることができる。薄層クロマトグラフィー分離の場合の検出は、例えばアニスアルデヒド／硫酸のような染色試薬によって生成された物質量を基準溶液と簡便に比較することによって実施できる。式Ｉ（この場合ＲはＰｈｅ−ａｌラジカル）の副産物は、場合によって対応するセファイボールＡ−Ｅから当業者に既知の通常の精製方法、例えばクロマトグラフィーまたは再結晶化によって分離できる。
本発明のセファイボールの単離のためには、先ず菌糸体を通常の方法によって培養液から分離し、続いてセファイボールを場合によって水に混和性の有機溶媒を用いて細胞集塊から抽出する。有機溶媒相は本発明のセファイボールを含んでいる。これらセファイボールを場合によって真空中で濃縮し、さらに下記のように精製する。
【００３５】
培養ろ液を場合によって菌糸体抽出物の濃縮液と一緒にし、さらに水に混和性の適当な有機溶媒、例えばｎ−ブタノールで抽出する。続いて分離した有機相を場合によって真空中で濃縮する。重要な生成物の脱脂のために、濃縮物を本発明のセファイボールがほとんど溶解しない非極性溶媒、例えばヘキサン、石油エーテルまたはジエチルエーテルで希釈してもよい。この工程でセファイボールは沈殿し、親油性不純物は溶解したままで通常の固相／液相分離によって除去できる。
沈殿物（これは全てのセファイボールを含んでいる）を最初の容積の１／３０の水／メタノールに溶解する。沈殿物はこの過程で完全に溶解し、この溶液を凍結乾燥させる。続いて粗精製物と称するこの凍結乾燥物は５から５０％のセファイボールを含み、更なる単離に利用される。
【００３６】
本発明の１つまたは２つ以上のセファイボールの更なる精製は、適当な物質、好ましくは例えば分子ふるい、シリカゲルもしくはアルミナ、イオン交換物質または吸着樹脂によるクロマトグラフィーによって、または逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーによって実施される。このクロマトグラフィーを用いてセファイボールを分離する。クロマトグラフィーによるセファイボールの分離は、緩衝水溶液または水溶液と有機溶媒の混合物を用いて実施する。
水および有機溶媒の混合物は水と混和できる全ての有機溶媒（好ましくはメタノールまたはアセトニトリルを、溶媒の１０〜８０％、好ましくは溶媒の４０〜６０％濃度）、そうでなければ有機溶媒と混和できる全ての緩衝水溶液を指すと理解される。
【００３７】
その極性の相違に基づくセファイボールの分離は、逆相クロマトグラフィーによって、例えばＭＣＩ（登録商標）（吸着樹脂（三菱, 日本））またはアンバーライト（Amberlite）ＸＡＤ（登録商標）（TOSOHAAS）、またはさらに別の疎水性物質、例えばＲＰ−８またはＲＰ−１８の相を用いて実施される。さらにまたこの分離は、通常相によるクロマトグラフィーによって、例えばシリカゲル、アルミナなどを用いて実施できる。
【００３８】
セファイボールのクロマトグラフィーは、緩衝または酸性化水溶液または水溶液とアルコールもしくは水に混和性の他の有機溶媒との混合物を用いて実施される。使用有機溶媒は好ましくはプロパノールおよびアセトニトリルである。
緩衝または酸性化水溶液は、例えば水、リン酸緩衝液、酢酸アンモニウム、クエン酸緩衝液（濃度は０.１mＭから０.５Ｍ）、およびギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸または当業者に知られている通常の全ての酸（好ましくは濃度は０.０１から１％で、０.１％が特に好ましい）を指すと理解される。
クロマトグラフィーは、１００％の水で始まり、１００％の溶媒で終わる濃度勾配を用いて実施される。好ましくは３０から６０％のプロパノールまたはアセトニトリルの直線状濃度勾配が用いられる。
【００３９】
また別には、ゲルクロマトグラフィーまたは疎水相を用いるクロマトグラフィーを実施することもまた可能である。
ゲルクロマトグラフィーは、ポリアクリルアミドゲルまたは混合ポリマーゲル、例えばバイオゲル（Biogel-P2；登録商標）(Biorad）またはフラクトゲル（Fractogel）TSKHW40（登録商標）（Merck, Germany, Toso Haas, USA）またはセファデックス（Sephadex)（登録商標）(Pharmacia, Sweden）で実施される。
上記のクロマトグラフィーの順序は逆にできる。
【００４０】
セファイボールの非常に有効なさらに別の精製工程は結晶化である。セファイボールは、有機溶媒溶液から、および水と有機溶媒との混合物から容易に結晶化できる。結晶化は、それ自体既知の態様で、例えばペプチド活性化合物の飽和溶液を濃縮または冷却することにより実施される。
本発明のセファイボールは固体状態で安定で、さらに３から８、特に５から７のｐＨの溶液で安定で、したがって通常の医薬調製物に取り込むことができる。
【００４１】
式ＩまたはIIの化合物の生理学的に許容できる塩は、その有機および無機塩（例えば成書（Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, 第1418頁(1985))に記載）の両方を指すと理解される。物理的および化学的安定性並びに溶解性のために、酸性基に対してはとりわけナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩およびアンモニウム塩が好ましい。塩基性基に対してはとりわけ以下の酸の塩が好ましい：塩酸、硫酸、リン酸またはカルボン酸もしくはスルホン酸、例えば酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸およびｐ−トルエンスルホン酸。
【００４２】
本発明は、式ＩまたはIIの化合物の全ての立体異性型を含む。式IIの化合物に含まれる不斉中心は全てそれぞれ別個にＳ立体配置またはＲ立体配置を有することができる。本発明はすべての可能なエナンチオマーおよびジアステレオマーの他に２つまたは３つ以上の立体異性型の混合物、例えば任意の比率にあるエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物を含む。したがって本発明の対象は、純粋な形態（左旋性および右旋性対掌体）として、ラセミ型として、および任意の比率にある２つの鏡像体の混合物としての鏡像体である。シス／トランス異性系の存在下では、シス型およびトランス型並びに任意の比率にあるこれらの形態の混合物は本発明の対象である。
【００４３】
明らかに本発明はまた式ＩまたはIIの化合物の化学的同等物を含む。本タイプの同等物は、例えばエステル、エーテル、付加塩、複合体また他の部分的加水分解産物である。
その重要な薬理学的特性のために、本発明のセファイボールは人および／または動物の医薬としての使用に適している。本発明の物質は、特に寄生虫（特に好ましくは内部および／または外部寄生生物）に対する抗生物質としての薬理活性を有する。
【００４４】
したがって本発明は、さらに人または動物の医薬として、特に人および／または動物に病原性を有する内部および／または外部寄生生物に対する化学療法剤として本発明の式ＩまたはIIの化合物を使用することに関する。これらのペプチド活性化合物の作用メカニズムは不明であるが、蠕虫および内部寄生生物に対する顕著で致死的な作用が検出された。
【００４５】
本発明のセファイボールは、例えば動物および人に病原性を有する吸虫（肝蛭（Fasciola hepatica)、ブスキ肥大吸虫（Fasciolopsis buski)、巨大肝蛭（Fasciola gigantica)、ファシオロイデス＝マグナ（Fascioloides magna)、槍形吸虫（Dicrocoelium dendriticum)、ネコ肝吸虫（Opisthorchis felineus)、肝吸虫（Clonorchis sinensis)、ヴェステルマン肺吸虫（Paragonimus westermanni)、ケリコット肺吸虫（Paragonimus kellikotti)、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium)、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum)、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni))、および人および動物に病原性を有する線虫（これらは以下の科に属する：Trichuridae、Trichinellidae、Strongyloididae、Ancylostomatidae、Strongylidae、Trichostrongylidae、Metastrongylidae、Oesophagostomatidae、Dictyocaulidae、Protostrongylidae、Angiostrongylidae、Oxy，uridae、Ascaridae、Toxocaridae、Dracunculidae、HabronematidaeおよびFilariidae）の制御に適している。さらにまた本発明のセファイボールは、動物および人で病原性を有する外部寄生生物で、クモ形動物類（以下の科に属する：Argasidae、Ixodidae、Dermanyssidae、Demodicidae、Sarcoptidae、Psoroptidae、Varroidae）および昆虫類（これらは以下の目を含む：シラミ目（Anoplura、Mallophaga）、ハエ目およびノミ目）に属するものの制御に適している。
【００４６】
抗菌作用の他に、本発明の化合物は、植物に病原性を有するカビを含む抗真菌（すなわち抗カビ）特性を有する。
通常の薬剤に対して耐性を獲得した寄生虫の場合、新規な薬剤のみが治療に足る作用を有する。本発明の式ＩまたはIIのセファイボールはしたがってこれらの問題を有する生物に対してすら優れた潜在作用をもつ。
【００４７】
その抗菌、抗真菌および抗原虫活性のために、本発明のセファイボールは成長促進作用を有し、動物の繁殖に有効に用いることができる。飼料利用性の改善は、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマまたはウサギのような家畜で用いることができる。この場合、投与量として好ましくは０.０５〜５０mg／kg／日が用いられる。この場合のセファイボールはまたメタンガスの発生を減少させ、飼料の利用性の改善をもたらす。
【００４８】
本発明はまた、１つまたは２つ以上の本発明のセファイボールを含む医薬調製物に関する。適切な賦形剤または担体物質との混合物として使用するのが好ましい。獣医用医薬品で使用できる担体物質は通常の飼料混合物で、人の場合は薬理学的に許容できる全ての担体物質および／または賦形剤を使用できる。
【００４９】
本発明はまた前記医薬の製造方法に関し、本方法は、医薬として適当で生理学的に許容できる担体および適切な場合にはさらに適当な活性化合物、添加剤または賦形剤を用いて少なくとも１つの本発明の化合物を適当な投与剤形にすることを含む。
【００５０】
一般に本発明の医薬は、経口的、局所的または非経口的に投与されるが、原則的には直腸投与も可能である。適当な固形または液状医薬剤形、例えば顆粒、散剤、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル、坐薬、シロップ、乳液、懸濁液、エアロゾル、ドロップまたはアンプル型の注射溶液が可能であるが、さらに活性化合物の徐放性調製物も可能である。それらの製造では、担体および添加剤および／または賦形剤、例えば崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨潤剤、研摩剤もしくは潤滑剤、香料、甘味剤または可溶化剤が通常用いられる。しばしば用いられる担体または賦形剤を挙げれば、例えば炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、乳汁蛋白、ゼラチン、澱粉、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物油または植物油、ポリエチレングリコール並びに溶媒、例えば滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールである。
【００５１】
適当な場合には、単位投与剤形は、放出を遅らせるためまたはより長時間にわたって放出させるために、例えば活性化合物を被覆するか、または活性化合物を適切なポリマーまたはロウなどに包埋して粒子にすることにより経口投与用のミクロカプセルとすることができる。
【００５２】
本医薬調製物は好ましくは単位投与剤形として製造され投与される。各単位剤形は活性成分として固有量の１つまたは２つ以上の本発明のセファイボール化合物を含む。固形単位剤形、例えば錠剤、カプセルおよび坐薬の場合、１日の単位用量は約２０００mgまで可能であるが好ましくは約１〜１０００mgで、アンプル型の注射溶液の場合は約１０００mgまでで、好ましくは約１０〜３００mgである。
【００５３】
投与できる日量は、体重、年齢、性別および対象動物の症状により変動する。しかしながら、一定の状況下ではより大量またはより少量の投薬量も適切であろう。毎日の投与は、個々の単位剤形の形でただ１回の投与またはより少量で数個の単位剤形の投与によって実施するか、さらに小分けにした用量を特定の間隔で複数回投与することによって実施できる。
本発明の医薬は、通常の担体および適当な場合には添加剤および／または賦形剤を用いて、１つまたは２つ以上の本発明のセファイボール化合物を適当な投与剤形にすることによって製造される。
【００５４】
原則として、蠕虫および外部寄生生物の治療の場合、治療手段、感染後手段および予防手段の間で区別がなされなければならない。これら異なる処置方法は、特定の医薬製剤を必要とする。このタイプの製剤は、例えば準治療量から治療量の抗蠕虫薬または抗外部寄生生物薬の連続投与を保証する。さらに、これらの製剤はその放出態様にしたがって“持続放出ボーラス投与”および“パルス放出ボーラス投与”に区別される。前者はさらに、“徐放性ボーラス投与”（これらは放出速度が遅いものである）および“連続放出ボーラス投与”（これらは一定の放出態様を示すものである）に区別される。他方、“パルス放出ボーラス投与”では、全活性化合物は数時間から数日以内に放出される。活性化合物のマイクロカプセル化を含み、さらに獣医用医薬品で人気が高まっている前記放出技術の他に、いわゆる“スポット＝オン”または“ポア＝オン”製剤が動物の外用として一般的である。錠剤、ペーストまたは注射溶液の投与、並びにネックバンド（例えば外部寄生生物に対する医薬を含有する）の使用は既に知られている。
本発明を下記の実施例でさらに詳述する。百分率は重量に関するものである。液体の混合比は、特に詳細が示されないかぎり容積に関するものである。
【００５５】
【実施例】
実施例１：Acremonium tubakii FH1685DSM12774のグリセロール培養の調製
滅菌した３００mlの三角フラスコ中の１００mlの栄養溶液（麦芽抽出物２.０％、酵母抽出物０.２％、グルコース１.０％、（ＮＨ4)2ＨＰＯ4 ０.０５％、ｐＨ６.０）にAcremonium tubakii FH1685DSM12774株を接種し、回転式振盪培養機で１４０rpmで２５℃で７日間培養する。続いてこの培養の１.５mlを２.５mlの８０％グリセロールで希釈し、−２０℃で保存する。
【００５６】
実施例２：三角フラスコでのAcremonium tubakii FH1685DSM12774の培養または予備培養の調製
下記の栄養溶液１００mlを含む滅菌した３００mlの三角フラスコに斜面培養管で増殖させた培養（以下と同じ栄養溶液であるが寒天を２％含む）または１mlのグリセロール培養（実施例１参照）を接種し、振盪培養機で１８０rpmで３０℃で培養する：３０ｇ／Ｌのスクロース、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、３ｇ／ＬのＮａＮＯ3、０.５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０.０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０.５ｇ／ＬのＫＣｌおよび１.０mlの微量元素溶液（０.２ｇ／ＬのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏおよび０.７ｇ／ＬのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ）。本発明のセファイボール化合物の１つまたは２つ以上の最大産生は約１２０時間後に達成される。１０から２００ｌの発酵装置に接種した場合は、同じ栄養溶液の４８〜９６時間の液中培養（接種量は約１０％）で十分である。
【００５７】
実施例３：セファイボールの製造
３０リットルの発酵装置を以下の条件で使用する：
栄養培地：３０ｇ／Ｌのシュクロース
５ｇ／Ｌの酵母抽出物
３ｇ／ＬのＮａＮＯ3
０.５ｇ／ＬのＫＣｌ
０.５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4
０.１ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4
１０μＭのＦｅＣｌ3×６Ｈ2Ｏ
１mlの微量元素溶液
ｐＨ６.５（滅菌前）
微量元素溶液：２ｇ／ＬのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏおよび
０.７ｇ／ＬのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ
培養時間：５０時間
培養温度：２５℃
撹拌速度：３００rpm
通気：１５リットル／分
エタノール系ポリオール溶液の反復添加によって泡沫発生を抑制することができる。最大産生は約９６から１２０時間後に達成される。
【００５８】
実施例４：Acremonium tubakii FH1685DSM12774の培養溶液からセファイボール混合物の単離
Acremonium tubakii FH1685DSM12774の培養終了後、実施例３にしたがって得られた３つの発酵装置の培養ブロス（９０リットル）を約２％のろ過補助剤（例えばCelite(登録商標)）を添加してろ過し、細胞塊（６リットル）を２０リットルのメタノールで抽出する。ペプチド活性化合物を含むメタノール溶液をろ過して菌糸体から分離し、真空中で濃縮する。この濃縮物を培養ろ液（８３リットル）と一緒にしてその前に用意した４リットルのＭＣＩゲル、ＣＨＰ２０Ｐカラムに適用する。これを０.１％のトリフルオロ酢酸水溶液からプロパン−２−オール中の０.１％トリフルオロ酢酸の濃度勾配を用いて溶出する。カラムから流出するもの（１２リットル／時間）を分画して採集し（各々２.５リットル）、ペプチド活性化合物を含有する分画（２１から２４）を一緒にする。真空中で濃縮し凍結乾燥することによって４ｇの青褐色の粉末が得られる。
【００５９】
実施例５：ゲルクロマトグラフィーによるセファイボール成分の濃縮
実施例４にしたがって得られた４ｇの生成物をフラクトゲル（Fractogel(登録商標）TSK MW-40 s）を充填した３.９リットル容量のカラム（幅×高さ＝１０cm×５０cm）に適用する。溶離液のメタノールを５０ml／分の流速でポンプでカラム通し、カラムの流出液を分画（６５ml）して採集する。セファイボールは主に分画２８から３３に見出だされる。それらを一緒にし、真空中でメタノールから分離し、１.３ｇのペプチド活性化合物の混合物が得られる。
【００６０】
実施例６：逆相ＲＰ−１８でのセファイボール成分の分離
５００ml容量の調製用ＨＰＬＣカラム（５.１cm（ＩＤ）×２５cm Ｈ）にヌクレオシル（Nucleosil（登録商標)）１００−７ Ｃ１８ ＨＤを充填し、実施例５にしたがって得られたペプチド活性化合物の混合物を適用する。溶出は０.１％のトリフルオロ酢酸水溶液中の４０％アセトニトリルを用いて実施する。カラム中の流速は５０ml／分で、内容量が各々１２５mlの分画を採集する。セファイボールＤは分画４６に、セファイボールＣは分画４９および５０に、セファイボールＥは分画５１に、セファイボールＡは分画６０から６４に、セファイボールＢおよびＡ１は分画６６および６７に見出される。分画６８はセファイボールの混合物を含む。真空中で濃縮し凍結乾燥させた後、以下のような重量が得られる:
セファイボールＡ：５２０mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６７１Ｄａ(Ｍ＋Ｈ)+，
セファイボールＡ１：４mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６８５ＤＡ(Ｍ＋Ｈ)+
セファイボールＢ：３８mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６８５Ｄａ(Ｍ＋Ｈ)+，
セファイボールＣ：１９５mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６５７Ｄａ(Ｍ＋Ｈ)+，
セファイボールＤ：１６mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６４３Ｄａ(Ｍ＋Ｈ)+，
セファイボールＥ：７６mg，ＥＳＩ＋ＭＳ：１６５７Ｄａ(Ｍ＋Ｈ)+。
【００６１】
実施例７：セファイボールＰおよびＱの単離
実施例６にしたがって得られた分画６８を凍結乾燥後（４.１mg）に２０％のアセトニトリル水溶液に溶解し、２５０／１０のヌクレオシルＣ１８ ３００−７（登録商標）カラムに適用する。溶出は４０％のアセトニトリル中の０.００５％酢酸アンモニウム緩衝液で実施する。少しのセファイボールＢの他に、乾燥後に１mgのセファイボールＰおよび１mgのセファイボールＱが得られる。
セファイボールＰ：ＥＳＩ＋ＭＳ、分子量１８７３(Ｍ＋Ｈ)+ が測定される、
セファイボールＱ：ＥＳＩ＋ＭＳ、分子量１８５７(Ｍ＋Ｈ)+ が測定される。
【００６２】
実施例８：セファイボールの検出用ＨＰＬＣシステム
下記に示すシステムによって、粗混合物または培養ろ液中のセファイボールの分離および定量が可能である。保持時間は７.０分（セファイボールＤ）から１８.８分（セファイボールＡ１）の間である。
溶離液：４０％アセトニトリル中の０.１％トリフルオロ酢酸
カラム：ヌクレオシル１００Ｃ18ＡＢ ２５０／４（Macherey-Nagel）
流量： １.０ml／分
検出： ２１０nmでの紫外光吸収
表示条件下でセファイボールは下記の保持時間を示す：
セファイボールＡ： １２.１分
セファイボールＡ１：１８.８分
セファイボールＢ： １６.０分
セファイボールＣ： ９.０分
セファイボールＤ： ７.１分
セファイボールＥ： ７.３分
セファイボールＰ： １７.３分
セファイボールＱ： １７.９分
【００６３】
実施例９：セファイボールＡの性状決定
１０μgのセファイボールＡを持続的に沸騰している塩酸中で加水分解させ、アミノ酸分析装置で調べる。以下の一般的なアミノ酸が見出された：
ヒドロキシプロリン １１.５nmol
グルタミン酸 ５.７nmol
プロリン ５.５nmol
グリシン ５.５nmol
ロイシン ５.６nmol
フェニルアラニン ５.５nmol
例外的なアミノ酸、アミノイソ酪酸およびイソバリンの含有量は査定できなかった。
【００６４】
電子噴霧イオン化（ＥＳＩ＋）を用いるフィニガン（Finnigan）ＭＡＴ ＬＣＱイオントラップ質量分析装置による質量分析によって以下のデータが得られた：
ＥＳＩ質量スペクトルは、単同位体分子量１６６９.７に対応してｍ／ｅ １６７０.７で強いＭＨ+およびｍ／ｅ １６９２.７で［Ｍ＋Ｎａ]+を示し、これは、計算によって得られた質量１６６９.９Ｄａ（単同位体、Ｃ82Ｈ127Ｎ17Ｏ20）とよく一致する。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、表９に太字で表示したフラグメント化を示した。イタリック体で示したフラグメントは計算で得られたが、実際に観察はされていない。
【００６５】
【表１】
プロトン付加Ｂ断片化は第一の欄−および第二の欄（Ｍ＋ナトリウム)+−Ｂフラグメント化に表示されている。第三の欄はＮａ型のＡフラグメントシリーズを示している。
【００６７】
本発明のセファイボールの物理化学的および分光特性は以下のように要約できる：
セファイボールＡ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ82Ｈ127Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化１】
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表１参照
【００６８】
セファイボールＡ１：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ83Ｈ129Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化２】
ＵＶデータ（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表１ａ参照
【００６９】
セファイボールＢ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ83Ｈ129Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化３】
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表２参照
【００７０】
セファイボールＣ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ81Ｈ125Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化４】
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表３参照
【００７１】
セファイボールＤ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ80Ｈ123Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化５】
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表４参照
【００７２】
セファイボールＥ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ81Ｈ125Ｎ17Ｏ20
構造式：
【化６】
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表５参照
【００７３】
セファイボールＰ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ89Ｈ137Ｎ19Ｏ25
構造式：
【化７】
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表６参照
【００７４】
セファイボールＱ：
外観：極性有機溶媒に溶解するが、水にはごくわずか溶解する。無色の物質。中性、弱酸性、および弱アルカリ性媒体中で安定。
実験式：Ｃ89Ｈ137Ｎ19Ｏ24
構造式：
【化８】
ＵＶ吸収（λmax）：２５８nm，logε：２.６２
ＮＭＲデータ：表７参照
【００７５】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
実施例１０：抗蠕虫作用の決定
蠕虫に対するセファイボールの作用を調べるために、in vitro検査（幼虫生育テスト）をニワトリの回虫、Ascaridida galliの幼虫を用いて実施した。 A. galliの胚含有卵を５％濃度の次亜塩素酸ナトリウム溶液で処理して表面を殺菌し、前記溶液を除去した後、ガラスビーズ（５mm）を回転させて機械的に卵を開けた。孵化させたＬ２の幼虫を幼虫濃縮方法によって濃縮し、栄養培地に採り、４１℃で１０％ＣＯ2で培養した。孵化後４８時間して、幼虫をマイクロタイタープレート（９６穴）で５日間、２００、１００、５０．．．０.１μg／mlの濃度の薬剤添加培養液（２００μl）中で保温した。５日間の保温中に、運動性、形態および生命活性を顕微鏡で検査し、毎日記録した。薬剤処置後、幼虫培養を０.１６％の濃度のニュートラルレッド（Neutral Red）で４８時間保温し、培地交換によりニュートラルレッドを除去後、幼虫の腸内の生体染料の濃縮化を能動的食物摂取の指標、したがって生命活性の証拠として査定した。２００、１００、５０および２５μg／mlの濃度のセファイボールＡによる幼虫の薬剤処理によって１００％の死亡率が得られ、１２.５μg／mlおよび６.２５μg／mlの濃度では死亡率はそれぞれ９２％および２０％であった。
【０１０６】
実施例１１：外部寄生生物に対する作用
外部寄生生物に対する作用はノミ幼虫検査（ネコノミ＝Ctenocephalides felis）で調べた。５mgのセファイボールＡを０.５mlのアセトンに溶解し、５００mgのブラッドミール（線維素除去ヒツジ血液）と混合した。溶媒を気化させた後、それぞれについて２ｇの石英砂を薬剤添加ブラッドミールと混合して、濃度２０００、１０００、５００、２５０ppm等の調製物を得た。各薬剤添加サンプルまたは溶媒コントロール当たり１５のノミ卵を薬剤添加血粉と石英砂との混合物に加え、続いてこれを３７℃で高い大気湿度で保温した。３−５日間隔で幼虫の発育、サナギ化および成虫への発育をチェックし、死亡率を記録した。溶媒コントロールと比較して９０％を越える幼虫の殺虫作用が用量に依存して観察された。
【０１０７】
実施例１２
抗菌作用の決定
表８は、抗菌スペクトルについて最小抑制濃度（ＭＩＣ）をいくつか示す。
【表３２】
Claims (19)
- 下記式Ｉの化合物または生理学的に許容されるその塩：
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−ｘ−ｗ−Ｌｅｕ−ｙ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−ｚ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｒ (Ｉ)
式中、ＲはＰｈｅ−ｏｌまたはＰｈｅ−ａｌであり、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは以下の意味を有する：
ａ) ｗはＧｌｙまたはＡｌａであり、ｘはＡｉｂであり、ｙおよびｚはＩｖａであり；
ｂ) ｗはＧｌｙであり、ｘ、ｙおよびｚはＩｖａであり；
ｃ) ｗはＧｌｙであり、ｘおよびｚはＡｉｂであり、ｙはＩｖａであり；
ｄ) ｗはＧｌｙであり、ｘ、ｙおよびｚはＡｉｂであるか；または
ｅ) ｗはＧｌｙであり、ｘおよびｙはＡｉｂであり、ｚはＩｖａである。 - ＲがＰｈｅ−ｏｌである請求項１に記載の式Ｉの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 下記式IIの化合物また生理学的に許容されるその塩：
ＡｃＰｈｅ−Ｉｖａ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−ｘ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ (II)
式中、ｘはＨｙｐまたはＰｒｏである。 - 下記式の化合物または生理学的に許容されるその塩：
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ；
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ；
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｉｖａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ；
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｖａ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ；
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ；
ＡｃＰｈｅ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ｉｖａ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｏｌ；
ＡｃＰｈｅ−Ｉｖａ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ；または、
ＡｃＰｈｅ−Ｉｖａ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｉｂ−Ｈｙｐ−Ａｉｂ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ。 - 微生物 Acremonium tubakii FH1685 DSM12774 またはその変種もしくは変異体の１つを、１つまたは２つ以上の式ＩまたはIIの化合物が培養液に蓄積されるまで適当な条件下で培養液中で培養し、続いて前記化合物を培養液から単離し、適当な場合にはそれらを生理学的に許容される塩に変換することによって製造される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはＩＩの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩の製造方法であって、前記方法が、微生物Acremonium tubakii FH1685 DSM12774またはその変種もしくは変異体の１つを、１つまたは２つ以上の式ＩまたはIIの化合物が培養液に蓄積されるまで適当な条件下で培養液中で培養し、続いて前記化合物を培養液から単離し、適当な場合にはそれらを生理学的に許容される塩に変換することを含む前記化合物または生理学的に許容されるその塩の製造方法。
- 培養が好気的条件下で１８から３５℃の温度で６から８のｐＨで実施される請求項６に記載の方法。
- 医薬として使用される請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 抗生物質として使用される請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 人および／または動物の寄生虫に対する抗生物質として使用される請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 人および／または動物に病原性を有する内部寄生生物および／または外部寄生生物に対する抗生物質として使用される請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 抗蠕虫薬として使用される請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 人および／または動物に病原性を有する吸虫類および／または線虫類に対する抗生物質、または人および／または動物に病原性を有する外部寄生生物であってクモ形類動物または昆虫類に属する寄生虫に対する抗生物質として使用される請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 抗真菌性、抗原虫性物質として、または抗微生物活性を有する物質として使用される請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 細菌性疾患および／または寄生虫疾患並びに真菌感染の治療および／または予防用の請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 家畜の成長促進剤として、また家畜の飼料利用性の改善のために使用される請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩の少なくとも１つを含む医薬調製物。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩもしくはIIの化合物または生理学的に許容されるその塩の少なくとも１つを、適当な賦形剤および／または担体を用いて適当な投与剤形とすることを含む請求項１７に記載の医薬調製物の製造方法。
- 抗生物質、特に人および／または動物の寄生虫に対する抗生物質として、人および／または動物に病原性を有する内部寄生生物および／または外部寄生生物に対する抗生物質として、人および／または動物に病原性を有する吸虫類および／または線虫類に対する抗生物質として、または人および／または動物に病原性を有する外部寄生生物であってクモ形類動物もしくは昆虫類に属するものに対する抗生物質として、抗蠕虫薬、抗真菌薬、抗原虫薬として、または細菌性疾患および／または寄生虫疾患並びに真菌感染の治療用および／または予防用として使用される請求項１７に記載の医薬調製物。
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