ES2241612T3 - Cefaiboles, antiparasitos de acremonium tubakii, procedimiento para su preparacion y uso de los mismos. - Google Patents
Cefaiboles, antiparasitos de acremonium tubakii, procedimiento para su preparacion y uso de los mismos.Info
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Abstract
Compuesto de la fórmula I, en la que R significa Phe-ol y w, x, y y z tienen el siguiente significado: a) w es igual a Gly o Ala; x es igual a Aib e y y z son iguales a Iva; b) w es igual a Gly; x, y y z son iguales a Iva; c) w es igual a Gly; x y z son iguales a Aib e y es igual a Iva; d) w es igual a Gly; x, y y z son iguales a Aib; o e) w es igual a Gly; x e y son iguales a Aib y z es igual a Iva; o el compuesto de la fórmula II en la que x significa Hyp o Pro, así como sus sales fisiológicamente tolerables. La invención adicional describe la utilización de cepas farmacéuticamente activas, especialmente para control de parásitos.
Description
Cefaiboles, antiparásitos de Acremonium
tubakii, procedimiento para su preparación y uso de los
mismos.
La invención se refiere a nuevos antibióticos de
peptaibol, a continuación llamados cefaiboles, que son sintetizados
durante la fermentación por Acremonium tubakii FH 1685 DSM
12774 y colocados en medio de cultivo, a un procedimiento para
aislar los cefaiboles del medio de cultivo y su purificación, así
como al uso de los cefaiboles como principios activos
farmacológicamente activos, en especial para combatir parásitos.
Las parasitosis están muy difundidas y causan en
el ser humano y en los animales un amplio espectro de efectos
patológicos que van desde escasos trastornos fisiológicos hasta
severas enfermedades, incluso mortales. En la actualidad se conocen
muchas enfermedades parasitarias, vastamente investigadas, que
amenazan la salud y la vida del ser humano y de sus animales
domésticos y útiles.
Se ha de constatar a nivel mundial un
debilitamiento del sistema inmune, con una creciente tendencia en
millones de personas. Este círculo de personas son infectadas por
parásitos oportunistas de modo tan masivo que anualmente se lamentan
millones de víctimas. En la época de los viajes lejanos, también se
debió contar con parásitos exóticos en países no tercermundistas,
que normalmente poseen un elevado estándar sanitario. Esto se
fundamenta en que cada vez hay una mayor tendencia a viajes de
trekking en las condiciones de higiene usuales del país y en que
-desde la hipotética seguridad en el propio país- se ha producido
una pérdida de la sensación / del conocimiento de los peligros de
higiene. Además de la protección de la salud de los seres humanos,
también la protección de los animales exige sanar las dolencias y
los dolores y, de ser posible, evitarlos. Las razones económicas se
ven sobre todo en el cuidado de animales útiles, donde, por
condiciones desfavorables en el mantenimiento y la alimentación de
animales (por ejemplo, en determinadas formas de la crianza de
animales en masa), se presentan preferentemente enfermedades
parasitarias que contribuyen con la reducción de la producción de
tipo cuantitativo (cantidad de carne, número, tiempo de corrida) o
de tipo cualitativo (calidad de la carne y de la lana). Los grandes
daños provocados en el ser humano y en los animales por parasitosis
hacen que se desee su control, incluso que sea indispensable en el
interés de la salud y la rentabilidad.
Los parásitos son unicelulares o pluricelulares y
residen transitoria o permanentemente en organismos (endoparásitos)
u organismos extraños (ectoparásitos) y se alimentan a costa del
huésped. Muchos parásitos llevan en el ser humano y en los animales
a enfermedades subagudas, pero también dramáticas. Entre los
parásitos unicelulares se cuentan los protozoos tales como, por
ejemplo, plasmodios (patógenos del paludismo), tripanosomas
(patógenos del mal de Chagas), amebas, tricomónadas o toxoplasmas.
Parásitos pluricelulares importantes son las lombrices
endoparasitarias (helmintos), de los que los nematodos, los cestodos
y los trematodos pueden ocasionar severos daños en el ser humano y
en los animales. Los ectoparásitos también pluricelulares comprenden
garrapatas, ácaros, piojos, pulgas y otros organismos. Se halla a
disposición una gran cantidad de agentes para el combate y el
tratamiento de enfermedades parasitarias (antiparasitarios), pero
que, por un lado, debido a los efectos colaterales de estos agentes
y, por el otro, debido a la creciente formación de resistencia,
existe una gran necesidad de nuevos protozoicidas, antihelmínticos y
parasiticidas de alta eficacia. La infestación con parásitos atañe
especialmente a la población de las regiones tropicales, aquí se
estima la cantidad de afectados en muchos cientos de millones de
personas; a esto se añade el considerable daño en el área
agrícola.
El uso de sustancias químicas, conocidas por su
eficacia contra los distintos parásitos o mayores grupos
parasitarios y toxicológicamente inocuas en el huésped (ser humano,
animal) tiene una importancia sobresaliente en el combate de los
parásitos.
Según su espectro de acción, se distinguen
antihelmínticos que actúan contra helmintos, antiprotozoos que
actúan contra protozoos, insecticidas que actúan contra insectos,
acaricidas que actúan contra ácaros; los últimos dos grupos se
reúnen también bajo el término de ectoparasiticidas.
El aumento de las resistencias a los
medicamentos, favorecida por un empleo intenso y de varios años en
especial en la actual crianza de animales en masa o la presencia de
en parte fuertes efectos colaterales, sobre todo en la medicación a
largo plazo de personas que deben trabajar durante largo tiempo en
los trópicos y subtrópicos en el marco de una creciente
globalización, así como altos costos en la prevención / terapia con
determinados agentes quimioterapéuticos vuelve inaccesible la
búsqueda de otras clases de sustancias económicas con otro mecanismo
de acción y mejor tolerancia. Incluso se requieren antiparasitarios
que no sólo son activos, sino que también se pueden preparar en
grandes cantidades de forma económica, siendo al mismo tiempo bien
tolerados por el medio
ambiente.
ambiente.
Los péptidos con hasta 20 aminoácidos, en parte
estructuralmente inusuales, son producidos por bacterias y hongos a
través de su metabolismo secundario por medio de sintetasas
peptídicas no tribosomales. Muchos de los metabolitos secundarios
conocidos hasta ahora poseen interesantes efectos biológicos como
antibióticos, inhibidores de enzimas, cardiotónicos,
inmunomoduladores, insecticidas, nematocidas, y otros (ver, por
ejemplo, Gräfe, U. Biochemie der Antibiotika, Spektrum Heidelberg,
1992).
Dentro de la clase estructural de los principios
activos peptídicos, los llamados peptaiboles se caracterizan porque
contienen inusualmente muchos aminoácidos (hasta 20, entre ellos una
gran proporción de ácido alfa-aminobutírico
(Brückner, H., König, W.A., Greiner, M., Jung, G. Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 18 (1979), 476 - 477). Además, los peptaiboles están
acetilados muy frecuentemente en el término N y presentan en el
término C un radical con un grupo alcohol (por ejemplo,
fenilalaninol) o un grupo aldehído.
Ejemplos de peptaiboles, tal como se indicó con
anterioridad, son aibellina [J. Antibiotics, 47, p.
1136-1144(1994)]; ampulosporina [J.
Antibiotics, 50, p. 72 -728, (1997)]; antiamoebina [Structure, 6, p.
783-792 (1998)]; clonostaquina [J. Antibiotics, 50,
p. 105-110 (1997)]; emerimicina [J. Antibiotics, 27,
p. 274-282 (1974)] o zervamicina [J.Antibiotics, 27,
p. 321-328 (1974)]. Estos peptaiboles son
sintetizados por muchas cepas diferentes de las especies
Emericellopsis, Trichoderma, Apiocrea y muchas otras. Despliegan su
eficacia antibiótica contra bacterias grampositivas, contra algunos
tipos de hongos y contra amebas. Más allá de ello, también se ha
descrito la acción antifebril y neuroléptica de la
ampulosporina.
En J. Antiobotics, 31, 241-243
(1978) y US 3,657,419 se describen peptaiboles (antiamoebina) con
acción antibiótica.
El aislamiento de un antibiótico similar a un
peptaibol después de la fermentación de un microorganismo es
descrito en Biochem. J. 320, 723-728 (1996).
La explicación de la estructura de otro peptaibol
se describe en Trends in Analytical Chemistry, 2,
10-14 (1983).
Los principios activos peptídicos conocidos hasta
ahora tienen desventajas que se manifiestan en un nivel de acción
insatisfactorio, alta toxicidad y/o efectos colaterales
indeseados.
Por ello, es objeto de la invención buscar nuevos
principios activos peptídicos microbianos con mejores propiedades
y/o nuevos mecanismos de acción.
Este objeto se cumple según la invención al
fermentar la cepa Acremonium tubakii FH 1685 DSM 12774 en una
disolución nutritiva con una fuente de carbono y de nitrógeno, así
como las sales inorgánicas usuales, hasta que se acumulen los nuevos
peptaiboles, a continuación llamados cefaiboles, en el medio de
cultivo, aislar luego los cefaiboles del medio de cultivo y
eventualmente separar los cefaiboles en los distintos compuestos
peptídicos activos. Los cefaiboles aislados son farmacológicamente
activos y, de esta manera, son apropiados para usar como
medicamentos. En virtud de sus propiedades antiparasitarias, en
especial su actividad fuertemente antihelmíntica, así como su acción
insecticida sobre ectoparásitos, se pueden emplear sobre todo como
antibióticos con efecto contra endo- y ectoparásitos en animales y
en el ser humano.
De esta manera, la invención se refiere a
1. un compuesto de la fórmula general I
(I)AcPhe-Aib-Aib-Aib-x-w-Leu-y-Aib-Hyp-GIn-z-Hyp-Aib-Pro-R
en la que R significa
Phe-ol y w, x, y y z tienen el siguiente
significado:
- a)
- w es igual a Gly o Ala; x es igual a Aib e y y z son iguales a Iva;
- b)
- w es igual a Gly; x, y y z son iguales a Iva;
- c)
- w es igual a Gly; x y z son iguales a Aib e y es igual a Iva;
- d)
- w es igual a Gly; x, y y z son iguales a Aib; o
- e)
- w es igual a Gly; x e y son iguales a Aib y z es igual a Iva;
así como sus sales fisiológicamente
tolerables;
o
un compuesto de la fórmula general II
(II)AcPhe-Iva-GIn-Aib-IIe-Thr-Aib-Leu-Aib-x-GIn-Aib-Hyp-Aib-Pro-Phe-Ser
en la que x significa Hyp o Pro;
así como sus sales fisiológicamente
tolerables.
2. Un procedimiento para la preparación de uno o
varios compuestos de la fórmula general I o II, que está
caracterizado porque se fermenta Acremonium tubakii, en
especial Acremonium tubakii FH 1685 DSM 12774, en un medio de
cultivo hasta que se acumulan uno o varios compuestos de la fórmula
general I o II en el medio de cultivo y se los aísla del medio de
cultivo.
\newpage
3. Un uso de un compuesto de la fórmula general I
o II como sustancia farmacológicamente eficaz, en especial como
antibiótico contra parásitos humanos o animales, con preferencia
especial contra helmintos.
4. Una preparación farmacéutica para usar en el
ser humano y/o en animales, que contiene uno o varios compuestos de
la fórmula general I o II.
A continuación se describe detalladamente la
invención, en especial en sus formas de realización preferidas.
Los compuestos de la fórmula general I o II
también son denominados principios activos peptídicos o
cefaiboles.
Cefaibol A designa un compuesto de la fórmula
general I, en la que R significa Phe-ol; w, Gly; x,
Aib; e y y z, Iva.
\vskip1.000000\baselineskip
Cefaibol A1 designa un compuesto de la fórmula
general I, en la que R significa Phe-ol; w, Ala; x,
Aib; e y y z, Iva.
Cefaibol B designa un compuesto de la fórmula
general I, en la que R significa Phe-ol; w, Ala; y
x, y y z, Iva.
Cefaibol C designa un compuesto de la fórmula
general I, en la que R significa Phe-ol; w, Ala; x y
z, Aib e y, Iva.
Cefaibol D designa un compuesto de la fórmula
general I, en la que R significa Phe-ol; w, Ala; y
x, y y z, Aib.
Cefaibol E designa un compuesto de la fórmula
general I, en la que R significa Phe-ol; w, Ala; x e
y, Aib; y z, Iva.
Cefaibol P designa un compuesto de la fórmula
general II, en la que x significa Hyp.
Cefaibol Q designa un compuesto de la fórmula
general II, en la que X significa Pro.
AcPhe es N-acetilfenilalanina,
Aib es ácido \alpha-aminoisobutírico, Ala es
alanina, Iva es isovalina, Hyp es hidroxiprolina,
Phe-ol es fenilalaninol, Phe es fenilalanina, Gly es
glicina, Leu es leucina, Gln es glutamina, Pro es prolina, Ile es
isoleucina, Thr es treonina y Ser es serina.
Los cefaiboles según la invención son producidos
por Acremonium tubakii, con preferencia por Acremonium
tubakii FH 1685 DSM 12774. Acremonium tubakii FH 1685 DSM
12774 posee un micelio de color beige rojizo y se identifica por los
conidióforos característicos de las especies de Acremonium. Se
depositó un aislado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D 38124 Braunschweig,
Alemania, según las normas del Tratado de Budapest, el 31 de marzo
de 1999 con el siguiente número: Acremonium tubakii FH 1685
DSM 12774.
En una disolución nutriente (también denominada
medio de cultivo), que contiene una fuente de carbono y una fuente
de nitrógeno, así como las sales inorgánicas usuales, Acremonium
tubakii FH 1685 DSM 12774 produce uno o varios compuestos de la
fórmula I o II según la invención.
En lugar de la cepa Acremonium tubakii FH
1685 DSM 12774 también se pueden usar sus mutantes y variantes, que
sintetizan uno o varios compuestos de los cefaiboles según la
invención. Tales mutantes se pueden producir de forma conocida por
sí misma mediante medios físicos, por ejemplo radiación, tal como
rayos ultravioleta o rayos X, o mutágenos químicos, tales como
metanosulfonato de etilo (EMS),
2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona
(MOB) o
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG) o utilizando métodos genéticos.
El control de mutantes y variantes que sintetizan
uno o varios cefaiboles según la invención se efectúa de acuerdo con
el siguiente esquema:
- separación del micelio después de la
fermentación;
- extracción del micelio con un disolvente
orgánico;
- extracción de los cefaiboles del filtrado de
cultivo con disolventes orgánicos no miscibles con fases sólidas o
con agua;
- análisis por medio de HPLC, CCD o por ensayo de
la eficacia biológica.
Las condiciones de fermentación descritas a
continuación rigen para Acremonium tubakii, el aislado
depositado Acremonium tubakii FH 1685 DSM 12774, así como
mutantes y variantes de ellos.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
puede emplear para la fermentación a escala de laboratorio
(intervalo de mililitros hasta litros) y para la escala industrial
(escala de metros cúbicos). Todos los porcentajes se refieren, si no
se indica de otro modo, al peso. Las proporciones de mezcla en el
caso de líquidos se refieren al volumen, si no se proporcionan otros
datos.
En un medio de cultivo, que contiene una fuente
de carbono y una fuente de nitrógeno, así como las sales inorgánicas
usuales, Acremonium tubakii FH 1685 DSM 12774 produce los
compuestos de la fórmula I o II según la invención.
Se prefieren como fuentes de carbono adecuadas
para la fermentación aerobia, los carbohidratos asimilables y los
polioles, tales como glucosa, lactosa, sacarosa o
D-manitol, y los productos naturales que contienen
carbohidratos, tales como extracto de malta. Como nutrientes que
contienen nitrógeno se tienen en cuenta: los aminoácidos, los
péptidos y las proteínas, y sus productos de degradación, tales como
peptonas o triptonas, además extractos de carne, extractos de
levadura, semillas molidas, por ejemplo de maíz, trigo, judías, soja
o la planta del algodón, residuos de la destilación de la producción
de alcohol, harinas de carne o extractos de levadura, pero también
sales de amonio y nitratos. Las sales inorgánicas que puede contener
la solución nutritiva son, por ejemplo, cloruros, carbonatos,
sulfatos o fosfatos de los metales alcalinos o alcalinotérreos,
hierro, zinc, cobalto y manganeso.
La formación de los cefaiboles según la invención
discurre particularmente bien en un medio de cultivo que contiene
aproximadamente 0,1 a 5%, con preferencia 0,3 a 2% de extracto de
levadura y 0,2 a 5%, con preferencia 0,5 a 3% de sacarosa y 0,1 a 10
g/l, con preferencia 0,2 a 1,0 g/l de sulfato de magnesio y 0,05 a
1,0 g/l, con preferencia 0,1 a 0,5 g/l de
hidrógeno-fosfato de potasio o de sodio y 0,05 a 1,0
g/l, con preferencia 0,1 a 1,0 g/l de nitrato de sodio y 0,01 a 0,1
g/l, con preferencia 0,02 a 0,1 g/l de cloruro de potasio y 0,01 a
100 \muM, con preferencia 5 a 20 \muM de sulfato de hierro, así
como trazas de sulfato de cinc y sulfato de cobre. Los datos en
tantos por ciento se refieren en cada caso al peso de todo el medio
de cultivo.
En el medio de cultivo, Acremonium tubakii
FH 1685 DSM 12774 forma una mezcla de cefaiboles. Dependiendo de la
composición del medio de cultivo, puede variar la proporción
cuantitativa de uno o de varios de los cefaiboles según la
invención. Además, es posible mediante la composición de los medios,
controlar la síntesis de los cefaiboles individuales de modo que uno
o también varios cefaiboles no se preparen en absoluto o se preparen
en una cantidad inferior al límite de detección del
microorganismo.
Con preferencia, la mezcla se compone de 8
cefaiboles diferentes detectables (cefaiboles A, A1, B, C, D, E, así
como P y Q). Preferentemente se forman los cefaiboles A a E.
Además de los cefaiboles A1 y A a E (compuestos
de la fórmula I, que llevan como elemento característico en el
término C fenilalaninol (Phe-ol16)), también se
forman en el medio de cultivo de Acremonium tubakii FH 1685
DSM 12774 compuestos de la fórmula I que, como grupo terminal C
llevan el aldehído fenilalaninal (Phe-al16) en lugar
de Phe-ol16. Éstos representan, por lo general,
productos minoritarios de los cefaiboles A-E y se
obtienen junto con ellos del medio de cultivo. El cultivo del
microorganismo se realiza de forma aerobia, es decir, por ejemplo,
sumergido con sacudidas o en frascos de agitación o fermentadores,
si es adecuado, con introducción de aire o de oxígeno. Se puede
realizar en un intervalo de temperatura desde aproximadamente 18
hasta 35ºC, preferentemente de aproximadamente 20 a 30ºC,
especialmente de 22 a 28ºC. El intervalo del pH debe estar entre 6 y
8, preferentemente entre 6,5 y 7,5. Los microorganismos se cultivan
bajo estas condiciones en general durante un periodo de 24 a 300
horas, preferentemente 36 a 140 horas.
De forma ventajosa, el cultivo se realiza en una
variedad de etapas, es decir, primero se preparan uno o varios
precultivos en un medio de cultivo líquido que, a continuación, se
inoculan en el medio de producción real, el cultivo principal, por
ejemplo, en una proporción en volumen de 1:10. El precultivo se
obtiene, por ejemplo, inoculando un micelio en una solución
nutritiva y permitiéndole crecer durante aproximadamente 36 a 120
horas, preferentemente 48 a 72 horas. El micelio se puede obtener,
por ejemplo, dejando crecer la cepa durante aproximadamente 3 a 40
días, con preferencia 4 a 10 días, en un suelo nutritivo sólido o
líquido, por ejemplo agar de malta-levadura o agar
de potatodextrosa (medio estándar para mohos, por ejemplo de la
empresa Difco).
El curso de la fermentación se puede vigilar
mediante el valor del pH de los cultivos o el volumen de micelio y
por métodos cromatográficos, tales como cromatografía en capa fina o
cromatografía de líquidos a alta presión o sometiendo a ensayo la
actividad biológica. Los cefaiboles según la invención están
contenidos tanto en el micelio como en el filtrado de cultivo, pero
la mayor parte se halla en el micelio.
El procedimiento de aislamiento descrito a
continuación sirve para purificar los cefaiboles según la invención,
con preferencia para purificar los cefaiboles A, A1, B, C y D.
El aislamiento y/o la purificación de los
cefaiboles de acuerdo con la invención, a partir del medio de
cultivo se realizan según métodos conocidos, teniendo en cuenta las
propiedades químicas, físicas y biológicas de las sustancias
naturales. Para ensayar la concentración del principio activo
peptídico en el medio de cultivo o en cada una de las etapas de
aislamiento, se pueden utilizar la cromatografía en capa fina, por
ejemplo en gel de sílice con isopropanol/NH_{3} al 25% como
eluyente o HPLC. La detección en el caso de la separación por
cromatografía en capa fina se puede realizar, por ejemplo, mediante
reactivos de color tales como anisaldehído/ácido sulfúrico,
comparándose la cantidad de sustancia formada convenientemente con
una solución de calibración. Los productos secundarios de la fórmula
I, en los que R significa un radical de fenilalaninal, pueden
separarse eventualmente del correspondiente cefaibol
A-E por medio de métodos de purificación
convencionales, conocidos por el especialista, por ejemplo por
cromatografía o por recristalización.
Para aislar los cefaiboles de acuerdo con la
invención, se separa en primer lugar el micelio del medio de cultivo
de acuerdo con los procedimientos convencionales y a continuación se
extraen los cefaiboles de la masa celular empleando un disolvente
orgánico que es opcionalmente miscible en agua. La fase del
disolvente orgánico contiene los cefaiboles de acuerdo con la
invención; opcionalmente se concentran a vacío y se purifican
adicionalmente tal y como se describe a continuación.
El material filtrado del cultivo se combina
opcionalmente con el material concentrado del extracto de micelio y
con un disolvente orgánico adecuado, no miscible en agua, por
ejemplo, con n-butanol o acetato de etilo. La fase
orgánica separada a continuación se concentra eventualmente al
vacío. Se puede diluir el concentrado para desgrasar el producto
valioso con un disolvente no polar, en el que los cefaiboles según
la invención son muy poco solubles, tales como, por ejemplo, con
hexano, éter de petróleo, éter dietílico. En este caso precipitan
los cefaiboles, las impurezas lipofílicas quedan disueltas y se
eliminan por medio de separaciones usuales de fase sólida/líquida.
El precipitado que contiene todos los cefaiboles se disuelve en 1/30
del volumen original de agua/metanol. El precipitado se disuelve por
completo y se liofiliza. El liofilizado, a continuación denominado
producto bruto, contiene 5 a 50% de cefaiboles y se emplea para el
ulterior aislamiento.
La purificación adicional de uno o de varios de
los cefaiboles de acuerdo con la invención se realiza por
cromatografía sobre materiales adecuados, preferentemente, por
ejemplo, sobre tamices moleculares, en gel de sílice, óxido de
aluminio, sobre intercambiadores iónicos o sobre resinas de
adsorción o sobre fases inversas (fase inversa, RP). Con ayuda de
estos procedimientos cromatográficos se separan los cefaiboles. La
cromatografía de los cefaiboles se realiza con disoluciones acuosas
tamponadas o mezclas de disoluciones acuosas y orgánicas.
Mezclas de soluciones acuosas y orgánicas
significan todos los disolventes orgánicos miscibles en agua,
preferentemente metanol, acetonitrilo, en una concentración de 10 a
80% de disolvente, preferentemente 40 a 60% de disolvente o,
alternativamente, todas las soluciones acuosas tamponadas que son
miscibles con disolventes orgánicos.
La separación de los cefaiboles en base a su
diferente polaridad se realiza con ayuda de la cromatografía en fase
inversa, por ejemplo sobre una MCI® (resina adsorbente de
Mitsubishi, Japón) o Amberlite XAD® (TOSOHAAS), sobre otros
materiales hidrófobos, tales como fases de RP-8- o
RP-18. Además, la separación puede realizarse con
ayuda de cromatografía en fase normal, por ejemplo, sobre gel de
sílice, alúmina y similares.
La cromatografía de los cefaiboles tiene lugar
empleando soluciones acuosas tamponadas o acidificadas o mezclas de
soluciones acuosas con alcoholes u otros disolventes orgánicos
miscibles con agua. Como disolventes orgánicos se usan
preferentemente propanol y acetonitrilo.
Por soluciones acuosas tamponadas o acidificadas
se entiende, por ejemplo, agua, tampón fosfato, acetato de amonio,
tampón citrato en una concentración de 0,1 mM a 0,5 M y ácido
fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético o todos los ácidos
disponibles en el comercio conocidos por la persona experta en la
técnica, preferentemente en una concentración de 0,01 a 1%. Se
prefiere especialmente 0,1%.
La cromatografía se realiza empleando un
gradiente que comienza con 100% de agua y termina con 100% de
disolvente, preferentemente se usa un gradiente lineal de 30 a 60%
de propanol o acetonitrilo.
Alternativamente, también se puede utilizar
también cromatografía en gel o cromatografía sobre fases
hidrófobas.
La cromatografía en gel se realiza sobre geles de
poliacrilamida o de polímeros mezclados, tales como p. ej.,
Biogel-P 2® (empresa Biorad) o Fractogel TSK HW 40®
(empresa Merck, Alemania, Toso Haas, EE.UU.) o sobre Sephadex® (de
Pharmacia, Suecia).
La secuencia de las cromatografías mencionadas
anteriormente es reversible.
Otra etapa de purificación muy eficaz para los
cefaiboles es la cristalización. Los cefaiboles cristalizan
fácilmente en disoluciones en disolventes orgánicos y en mezclas de
agua con disolventes orgánicos. La cristalización tiene lugar de una
forma conocida en sí, por ejemplo por concentración o enfriamiento
de disoluciones saturadas de principio activo peptídico.
Los cefaiboles de acuerdo con la invención son
estables en estado sólido o en disoluciones con un intervalo de pH
entre 3 y 8, en particular 5 y 7, y se pueden incorporar de este
modo en preparaciones farmacéuticas ordinarias.
Por sales fisiológicamente tolerables de los
compuestos de la fórmula I o II se entienden tanto sus sales
orgánicas como inorgánicas, tal como se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences (17ª edición, página 1418 (1985)). Debido a
la estabilidad física y química y la solubilidad, se prefieren para
grupos ácidos, entre otras, sales de sodio, de potasio, de calcio y
de amonio; para grupos básicos, entre otras, sales de ácido
clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o de ácidos
carboxílicos o ácidos sulfónicos, tales como, por ejemplo, ácido
acético, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido
fumárico, ácido tartárico y ácido
p-toluensulfónico.
La presente invención incluye todas las formas
estereoisómeras de los compuestos de la fórmula I o II. Los centros
asimétricos contenidos en los compuestos de fórmula II pueden tener
todos, independientemente unos de otros, la configuración S o la
configuración R. La invención incluye todos los enantiómeros y
diastereoisómeros posibles, así como las mezclas de dos o más formas
estereoisoméricas, por ejemplo, mezclas de enantiómeros y/o
diastereómeros, en todas las proporciones. También son objeto de la
invención enantiómeros en forma enantioméricamente pura, tanto las
antípodas levogiratorias como dextrogiratorias, en forma de
racematos y en forma de mezclas de los dos enantiómeros en todas las
proporciones. En presencia de isomería cis/trans, la invención se
refiere a la forma cis y a la forma trans y a mezclas de estas
formas en todas las proporciones.
La presente invención comprende también
equivalentes aparentemente químicos de los compuestos de la fórmula
I o II. Estos son, por ejemplo, ésteres, éteres, sales de adición,
complejos o también productos de hidrólisis parcial.
Basándose en sus valiosas propiedades
farmacológicas, los cefaiboles de acuerdo con la invención son
adecuados para usar como fármacos en la medicina humana y/o
veterinaria. Las sustancias según la invención poseen eficacia
farmacológica, en especial como antibiótico contra parásitos, con
preferencia especial contra endoparásitos y/o ectoparásitos.
La presente invención se refiere también al uso
de los compuestos de la fórmula I o II según la invención como
fármacos para humanos o animales, en especial como
quimioterapéuticos contra endoparásitos y/o ectoparásitos parásitos
de humanos y/o animales. El mecanismo de acción de estos principios
activos peptídicos es desconocido, pero se pudo comprobar un
significativo efecto letal contra helmintos y ectoparásitos.
Los cefaiboles según la invención son apropiados,
por ejemplo, para combatir trematodos patógenos animales y humanos
(Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski, Fasciola gigantica,
Fascioloides magna, Dicrocoelium dendriticum, Opistorchis felineus,
Clonorchis sinensis, Paragonimus westermanni, Paragonimus
kellikotti, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum,
Schistosoma mansoni) y nematodos animales y humanos, que
pertenecen a la familia de los Trichuridae, Trichinellidae,
Strongyloididae, Ancylostomatidae, Strongylidae, Trichostrongylidae,
Metastrongylidae, Oesophagostomatidae, Dictyocaulidae,
Protostrongylidae, Angiostrongylidae, Oxyuridae, Ascaridae,
Toxocaridae, Dracunculidae, Habronematidae y Filariidae; más
allá de ello, los cefaiboles según la invención sirven para combatir
ectoparásitos patógenos animales y humanos que se cuentan en la
clase de los arácnidos (familia: Argasidae, Ixodidae,
Dermanyssidae; Demodicidae, Sarcoptidae, Psoroptidae, Varroidae)
y en la clase de los insectos, que comprende el orden de los
ftirápteros (Anoplura, Mallophaga), dípteros y
sifonápteros.
Además del efecto antibacteriano, los compuestos
según la invención poseen propiedades antimicóticas, es decir,
inhibidoras de hongos, incluyendo los hongos fitopatógenos.
En caso de parásitos que constituyeron
resistencias contra los agentes convencionales, sólo nuevos agentes
poseen una acción terapéuticamente suficiente. Los cefaiboles de la
fórmula I o II según la invención presentan, así, potencialmente un
excelente efecto también contra estos organismos problemáticos.
En virtud de la actividad antibacteriana,
antimicótica y antiprotozoos, los cefaiboles según la invención
poseen acciones promotoras del crecimiento que se pueden aplicar
provechosamente en la producción de animales. Se puede sacar mejor
provecho del alimento en animales útiles tales como vacas, ovejas,
cabras, cerdos, caballos o conejos. Para ello se usan
preferentemente dosis de 0,05 - 50 mg/kg/día. Los cefaiboles también
producen en este caso una reducción de la producción de gas metano y
una mejora de la utilización del alimento.
La invención también se refiere a preparaciones
farmacéuticas que contienen uno o varios cefaiboles según la
invención. Se prefiere el uso de una mezcla con excipientes o
material de soporte adecuados. Como material de soporte se pueden
utilizar en medicamentos para animales las mezclas de forrajes
convencionales o bien, en el ser humano, todos los materiales de
soporte y/o coadyuvantes farmacológicamente tolerables.
La invención se refiere adicionalmente a un
procedimiento para la preparación de un fármaco de acuerdo con la
invención que se caracteriza porque comprende proporcionar al menos
uno de los compuestos de acuerdo con la invención con una forma de
administración adecuada empleando un vehículo farmacéuticamente
adecuado y fisiológicamente tolerable y, si es adecuado, otros
principios activos, aditivos o coadyuvantes adecuados.
Los fármacos de acuerdo con la invención se
administran generalmente por vía oral, local o parenteral, pero
también es posible en principio una administración por vía rectal.
Las formas de preparación farmacéutica sólidas o líquidas apropiadas
son, por ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, grageas,
(micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones,
suspensiones, aerosoles, gotas o disoluciones inyectables en forma
de ampolla, así como preparaciones que tiene liberación retardada
del compuesto activo, en cuya preparación se emplean normalmente
materiales de soporte y aditivos y/o coadyuvantes tales como agentes
disgregantes, agentes aglutinantes, agentes de revestimiento,
agentes de hinchamiento, agentes lubricantes, agentes saboreantes,
edulcorantes o solubilizantes. Los materiales de soporte o
coadyuvantes empleados frecuentemente que se pueden mencionar son,
por ejemplo, carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa,
manitol y otros azúcares, talco, lactoproteína, gelatina, almidón,
vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales o vegetales,
polietilenglicoles y disolventes, tales como agua esterilizada,
alcoholes, glicerol y alcoholes polivalentes.
Si es adecuado, las unidades de dosificación se
pueden microencapsular para la administración oral para retardar la
liberación o para extenderla durante un periodo de tiempo más largo,
tal como revistiendo o embebiendo el principio activo en forma de
partículas en polímeros adecuados, ceras o similares.
Con preferencia, las preparaciones farmacéuticas
se preparan y administran en unidades de dosificación, en donde cada
unidad contiene como componente activo una dosis determinada de uno
o varios compuestos de los cefaiboles según la invención. En el caso
de unidades de dosificación sólidas, tales como comprimidos,
cápsulas y supositorios, esta dosis puede ser de hasta
aproximadamente 2000 mg, pero con preferencia aproximadamente de 1 a
1000 mg, y en el caso de soluciones inyectables en forma de ampolla,
de hasta aproximadamente 1000 mg, pero con preferencia
aproximadamente de 10 a 300 mg por día.
La dosis diaria que se va a administrar depende
del peso corporal, de la edad, del sexo y del estado del mamífero.
En ciertas circunstancias, sin embargo, también pueden ser adecuadas
dosis diarias mayores o menores. La administración de la dosis
diaria se puede realizar mediante una administración aislada en
forma de una unidad de dosificación individual o en forma de
diversas unidades de dosificación menores o por la administración
repetida de dosis subdivididas a intervalos específicos.
Los medicamentos según la invención se preparan
llevando a uno o varios compuestos de los cefaiboles según la
invención con materiales de soporte usuales y eventualmente aditivos
y/o coadyuvantes a la forma de administración apropiada.
Básicamente deben distinguirse, en el tratamiento
de helmintos y ectoparásitos, entre medidas terapéuticas, meta- y
profilácticas; estos diferentes métodos de tratamiento requieren de
formulaciones galénicas especiales. Formulaciones de este tipo
garantizan, por ejemplo, la administración continua de dosis
subterapéuticas a terapéuticas de antihelmínticos o
ectoparasiticidas que se distinguen según su modo de liberación en
"bolos de liberación sostenida" y "bolos de liberación en
pulsos". A los primeros se los sigue distinguiendo en "bolos de
liberación lenta" -aquellos con una tasa de liberación
decreciente- y "bolos de liberación continua" -aquellos con
modo de liberación constante Por el contrario, "los bolos de
liberación en pulsos" liberan todo el principio activo en un
lapso de algunas horas a días. Además de la tecnología de
liberación, que también contiene la microencapsulación de principios
activos y que goza cada vez de mayor preferencia en veterinaria, son
usuales las llamadas formulaciones "spot on" o "pour on"
para la aplicación externa en el animal; pertenece al estado de la
técnica la administración de comprimidos, pastos o disoluciones
inyectables, así como la aplicación de collares que contienen
medicamentos contra, por ejemplo, ectoparásitos.
La invención se ilustra adicionalmente en los
siguientes ejemplos. Los porcentajes se refieren al peso. Las
proporciones de mezcla en el caso de líquidos se refieren al
volumen, si no se proporcionan otros datos.
100 ml de solución nutritiva (2% de extracto de
malta, 0,2% de extracto de levadura, 1,0% de glucosa, 0,05% de
(NH_{4})_{2}HPO_{4}, pH 0,05) en un matraz Erlenmeyer
estéril de 300 ml se inoculan con la cepa Acremonium tubakii
FH 1685 DSM 12774 y se incuba en un agitador giratorio durante 7
días a 25ºC y 140 rpm. A continuación se diluyen 1,5 ml de este
cultivo con 2,5 ml de glicerol al 80% y se almacena a -20ºC.
Un matraz Erlenmeyer de 300 ml con 100 ml de la
siguiente disolución nutritiva 30 g/l de sacarosa, 5 g/l de extracto
de levadura, 1 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de NaNO_{3}, 0,5 g/l
de MgSO_{4} x 7 H_{2}O, 0,01 g/l de FeSO_{4} x 7 H_{2}O, 0,5
g/l de KCl y 1,0 ml de disolución de trazas (0,2 g/l de ZnSO_{4} x
7 H_{2}O y 0,7 g/l de CuSO_{4} x 5 H_{2}O) se incuba con un
cultivo crecido en un tubito transversal (igual disolución
nutriente, pero con 2% de agar) o con 1 ml de un cultivo de glicerol
(ver Ejemplo 1) y se incuba a 180 rpm y 30ºC en un agitador. La
máxima producción de uno o varios compuestos de los cefaiboles según
la invención se alcanza después de aproximadamente 120 horas. Un
cultivo sumergido de 48 a 96 horas (cantidad de inoculación
aproximadamente 10%) de la misma solución nutritiva es suficiente
para inocular fermentadores de 10 y 200 l.
Un fermentador de 30 l funciona en las siguientes
condiciones:
- medio nutriente:
- 30 g/l de sacarosa
- \quad
- 5 g/l de extracto de levadura;
- \quad
- 3 g/l de NaNO_{3}
- \quad
- 0,5 g/l de KCl
- \quad
- 0,5 g/l de MgSO_{4}
- \quad
- 0,1 g/l de K_{2}HPO_{4}
- \quad
- 10 \muM de FeCl_{3} x 6H_{2}O
- \quad
- 1 ml de disolución de trazas
- \quad
- pH 6,5 (antes de la esterilización)
Disolución de trazas: 2 g/l de
ZnSO_{4} x 7H_{2}O, así como 0,7 g/l de CuSO_{4} x
5H_{2}O.
- Tiempo de incubación:
- 50 horas
- Temperatura de incubación:
- 25ºC
- Velocidad del agitador:
- 300 rpm
- Ventilación: 15 l
- min^{-1}
Por adición repetida de disolución etanólica de
poliol se puede reprimir la formación de espuma. La producción
máxima se alcanza después de aproximadamente 96 a 120 horas.
Después de completar la fermentación de
Acremonium tubakii FH 1685 DSM 12774, se filtra el caldo de
cultivo de tres fermentadores, obtenidos de acuerdo con el Ejemplo
3, (90 litros), añadiendo aproximadamente 2% de materias filtrantes
(por ejemplo, Celite®), y se extrae la masa celular (6 litros) con
20 litros de metanol. La disolución metanólica que contiene el
principio activo peptídico se libera del micelio por filtración y se
concentra al vacío. El concentrado se aplica junto con el cultivo
filtrado (83 litros) en una columna CHP20P preparada de 4 litros MCI
GEL. Se eluye con un gradiente de 0,1% de ácido trifluoroacético en
agua, luego 0,1% de ácido trifluoroacético en
propanol-2. El caudal de la columna (12 litros por
hora) se recoge en fracciones (2,5 litros cada una) y las fracciones
que contienen principios activos peptídicos (21 a 24) se concentran.
La concentración al vacío y la liofilización dan como resultado 4 g
en forma de polvo marrón claro.
Se aplican 4 g del producto obtenido de acuerdo
con el Ejemplo 4 en una columna de 3,9 litros llenada con Fractogel®
TSK MW-40 s (ancho x alto = 10 cm x 50 cm). El
eluyente metanol se bombea a una velocidad de flujo de 50 ml por
minuto a través de la columna y se fracciona el efluente de la
columna (65 ml). Fundamentalmente, los cefaiboles se hallan en las
fracciones 28 a 33. Se reúnen y se liberan del metanol al vacío. Dan
como resultado 1,3 g de mezcla de principios activos peptídicos.
Se llena una columna de HPLC preparativa de 500
ml (5,1 cm (ID) x 25 cm H) con ®Nucleosil 100-7 C18
HD y se aplican 1,3 g de la mezcla de principio activo peptídico,
obtenida de acuerdo con el Ejemplo 5. Se eluye con 40% de
acetonitrilo en 0,1% de disolución acuosa de ácido trifluoroacético.
El paso por la columna es de 50 ml / minuto, se recogen fracciones
de 125 ml de contenido cada una. En la fracción 46 se halla el
cefaibol D, en las fracciones 49 y 50 m, el cefaibol C; en la
fracción 51, el cefaibol E; en las fracciones 60 a 64, cefaibol A; y
en la fracción 66 y 67, el cefaibol B así como A1. La fracción 68
contiene una mezcla de cefaiboles. Después de concentrar al vacío y
liofilizar, se pesaron las siguientes cantidades:
- Cefaibol A: 520 mg, ESI+ MS: 1671 Da ( M+H )^{+},
- Cefaibol A1: 4 mg, ESI+ MS: 1685 DA (M+H)^{+},
- Cefaibol B: 38 mg, ESI+ MS: 1685 Da ( M+H )^{+},
- Cefaibol C:195 mg, ESI+ MS: 1657 Da ( M+H )^{+},
- Cefaibol D: 16 mg, ESI+ MS: 1643 Da ( M+H )^{+},
- Cefaibol E: 76 mg, ESI+ MS: 1657 Da ( M+H )^{+}.
La fracción 68, obtenida de acuerdo con el
Ejemplo 6, se aplica después de liofilizar (4,1 mg), disuelto en 20%
de acetonitrilo en agua, en una columna 250/10 Nucleosil C18
300-7®. La elución se realiza con 0,005% de tampón
de acetato de amonio en 40% de acetonitrilo. Además de un poco de
cefaibol B, se obtienen, tras secar, 1 mg de cefaibol P y 1 mg de
cefaibol Q.
Cefaibol P: ESI+ MS se mide un peso molecular de
1873 (M+H)^{+}, cefaibol Q: ESI+ MS se mide un peso
molecular de 1857 (M+H)^{+}.
El sistema descrito más abajo permite la
separación y la cuantificación de los cefaiboles en la mezcla en
bruto o en el cultivo filtrado; los tiempos de retención varían
entre 7,0 minutos (cefaibol D) y 18,8 minutos (cefaibol A1).
- Eluyente:
- 0,1% de ácido trifluoroacético en 40% de acetonitrilo.
- Columna:
- Nucleosil 100C18AB 250/4, Macherey-Nagel.
- Flujo:
- 1,0 ml/min
- Detección:
- absorción con luz ultravioleta a 210 nm.
En las condiciones indicadas, los cefaiboles
tienen los siguientes tiempos de retención:
- Cefaibol A: 12,1 minutos,
- Cefaibol A1: 18,8 minutos,
- Cefaibol B: 16,0 minutos,
- Cefaibol C: 9,0 minutos,
- Cefaibol D: 7,1 minutos,
- Cefaibol E: 7,3 minutos,
- Cefaibol P: 17,3 minutos,
- Cefaibol Q: 17,9 minutos.
Se hidrolizan 10 \mug de cefaibol A en ácido
clorhídrico en ebullición constante y se ensayan en un analizador de
aminoácidos. Se hallaron los siguientes aminoácidos:
| Hidroxiprolina | 11,5 nMol |
| Ácido glutámico | 5,7 nMol |
| Prolina | 5,5 nMol |
| Glicina | 5,5 nMol |
| Leucina | 5,6 nMol |
| Fenilalanina | 5,5 nMol |
Los contenidos de los aminoácidos inusuales ácido
amino-iso-butírico e
iso-valina son eran evaluables.
Los ensayos de espectrometría de masa con un
espectrómetro de masa con trampas iónicas Finnigan MAT LCQ con
ionización por electronebulización (ESI +) dan los siguientes
datos:
El espectro de masa ESI muestra un MH+ intenso a
m/z 1670,7 y un [M+Na]^{+} a m/z 1692,7 correspondiente a
un peso molecular monoisotópico de 1669,7, de conformidad con la
masa calculada (para C_{82}H_{127}N_{17}O_{20},
monoisotópico) de 1669,9 Da. El espectro MS/MS muestra una
fragmentación que está enumerada en la Tabla 9 en negrita. Los
fragmentos escritos en cursiva son fragmentos calculados pero no
observados.
\vskip1.000000\baselineskip
En la primera columna está detallada la
fragmentación B protonada y, en la segunda columna, la fragmentación
B (M+sodio)^{+}. La tercera columna muestra la serie de
fragmentos A en forma Na.
Las propiedades físico-químicas,
así como las propiedades espectroscópicas de los cefaiboles según la
invención se pueden resumir de la siguiente manera:
Cefaibol A:
Aspecto: en disolventes orgánicos polares,
sustancia incolora soluble, pero en agua poco soluble. Es estable en
ambiente neutro, levemente ácido y levemente alcalino.
Fórmula aditiva:
C_{82}H_{127}N_{17}O_{20}
Fórmula estructural:
Cefaibol A
Peso molecular: 1671 Da,
Absorción UV (\lambda_{máx}): 258 nm, log
\varepsilon: 2,62
Datos de RMN: ver la Tabla 1
Cefaibol A1:
Aspecto: en disolventes orgánicos polares,
sustancia incolora soluble, pero en agua poco soluble. Es estable en
ambiente neutro, levemente ácido y levemente alcalino.
Fórmula aditiva:
C_{83}H_{129}N_{17}O_{20}
Cefaibol A1
Peso molecular: 1685 Da,
Absorción UV (\lambda_{máx}): 258 nm, log
\varepsilon: 2,62
Datos de RMN: ver la Tabla 1a
Cefaibol B:
Aspecto: en disolventes orgánicos polares,
sustancia incolora soluble, pero en agua poco soluble. Es estable en
ambiente neutro, levemente ácido y levemente alcalino.
Fórmula aditiva:
C_{83}H_{129}N_{17}O_{20}
Fórmula estructural:
Cefaibol B
Peso molecular: 1685 Da,
Absorción UV (\lambda_{máx}): 258 nm, log
\varepsilon: 2,62
Datos de RMN: ver la Tabla 2
Cefaibol C:
Aspecto: en disolventes orgánicos polares,
sustancia incolora soluble, pero en agua poco soluble. Es estable en
ambiente neutro, levemente ácido y levemente alcalino.
Fórmula aditiva:
C_{81}H_{125}N_{17}O_{20}
Fórmula estructural:
Cefaibol C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Peso molecular: 1657 Da,
Absorción UV (\lambda_{máx}): 258 nm, log
\varepsilon: 2,62
Datos de RMN: ver la Tabla 3
Cefaibol D:
Aspecto: en disolventes orgánicos polares,
sustancia incolora soluble, pero en agua poco soluble. Es estable en
ambiente neutro, levemente ácido y levemente alcalino.
Fórmula aditiva:
C_{80}H_{123}N_{17}O_{20}
Fórmula estructural:
\newpage
Cefaibol D
Peso molecular: 1643 Da,
Absorción UV (\lambda_{máx}): 258 nm, log
\varepsilon: 2,62
Datos de RMN: ver la Tabla 4
Cefaibol E:
Aspecto: en disolventes orgánicos polares,
sustancia incolora soluble, pero en agua poco soluble. Es estable en
ambiente neutro, levemente ácido y levemente alcalino.
Fórmula aditiva:
C_{81}H_{125}N_{17}O_{20}
Fórmula estructural
Cefaibol E
Peso molecular: 1657 Da,
Absorción UV (\lambda_{máx}): 258 nm, log
\varepsilon: 2,62
Datos de RMN: ver la Tabla 5
Cefaibol P:
Aspecto: en disolventes orgánicos polares,
sustancia incolora soluble, pero en agua poco soluble. Es estable en
ambiente neutro, levemente ácido y levemente alcalino.
Fórmula aditiva:
C_{89}H_{137}N_{19}O_{25}
Fórmula estructural:
Cefaibol P
Peso molecular: 1873 Da,
Absorción UV (\lambda_{máx}): 258 nm, log
\varepsilon: 2,62
Datos de RMN: ver la Tabla 6
Cefaibol Q:
Aspecto: en disolventes orgánicos polares,
sustancia incolora soluble, pero en agua poco soluble. Es estable en
ambiente neutro, levemente ácido y levemente alcalino.
Fórmula aditiva:
C_{89}H_{137}N_{19}O_{24}
Fórmula estructural:
Peso molecular: 1857,197 Da,
Absorción UV (\lambda_{máx}): 258 nm, log
\varepsilon: 2,62
Datos de RMN: ver la Tabla 7
| a) En el espectro ^{13}C se observa una separación de las señales. |
| a) En el espectro ^{13}C se observa una separación de las señales. |
Para probar la acción de los cefaiboles sobre
helmintos, se realizó un test in vitro (ensayo de desarrollo
larvario) con larvas de ascáride de gallina Ascaridia galli.
Se esterilizó la superficie de huevos embrionados de A. galli
por tratamiento con disolución de hipoclorito de sodio al 5% y se
abrieron mecánicamente después de retirar esta disolución por medio
de perlas de vidrio en rotación (5 mm). Las larvas L2 que salieron
se acumularon por medio de un procedimiento de acumulación de
larvas, se absorbieron en un medio nutriente y se incubaron a 41ºC y
10% de CO_{2}. 48 horas después de salir, las larvas se incubaron
en placas de microtitulación (96 pocillos) durante 5 días con medio
medicado (200 \mul) en las concentraciones (200,100,50....0.1
\mug/ml) (41ºC, 10% de CO_{2}). Durante el tiempo de incubación
de 5 días, se controlaron microscópicamente y se documentaron a
diario la motilidad, la morfología y la vitalidad. Después de la
medicación, se incubó el cultivo larvario durante 48 horas con rojo
neutro en una concentración del 0,16%; tras eliminar el rojo neutro
por cambio del medio, se evaluó la acumulación del color vital en el
intestino de las larvas como indicio de una absorción activa de
nutrientes y, así, como comprobación de la vitalidad. La medicación
de las larvas con cefaibol A llevó en las concentraciones 200,100,50
y 25 \mug/ml a una mortalidad del 100%; con una concentración de
12,5 \mug/ml y 6,25 \mug/ml, la mortalidad fue del 92% o del
20%.
La acción contra ectoparásitos se verificó en el
ensayo de larvas de pulga (pulga de gato = Ctenocephalides
felis). Se disolvieron 5 mg de cefaibol A en 0,5 ml de acetona y
se mezclaron en 500 mg de harina de sangre (sangre de oveja
defibrinada). Después de haber evaporado el disolvente, se mezclaron
2 g de arena de cuarzo con harina de sangre medicada de modo tal que
resultaron concentraciones de la preparación de 2000, 1000, 500, 250
ppm, etc. A la mezcla de harina de sangre medicada y arena de cuarzo
se añadieron por muestra medicada o control del disolvente 15 huevos
de pulga que luego se incubaron a 37ºC y a elevada humedad ambiente.
El desarrollo larvario, transformación en crisálida y evolución a
estado adulto se controló a intervalos de 3-5 días y
se documentaron los índices de mortalidad. En función de las dosis,
se pudo observar una acción larvicida de > 90% en comparación con
el control del disolvente.
Del espectro antimicrobiano, la Tabla 8 muestra
algunas concentraciones inhibidoras mínimas (CIM).
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Cefaiboles, nuevos antiparasitarios
de Acremonium tubakii, procedimientos para su preparación y
su uso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> HMR 1999/L027
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<140>
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<141>
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<150> 19920816.6
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<151>
1999-05-05
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<160> B
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 16
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<212> PRT
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\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Aib
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Aib
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Hyp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Aib
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Gln Xaa Ile Thr Xaa Leu Xaa Pro Gln
Xaa Xaa Xaa Pro Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipSer
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acremonium tubakii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = AcPhe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Aib
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Iva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Aib
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Hyp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Iva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Hyp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Aib
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Phe-ol
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Xaa Xaa Xaa Gln
Xaa Xaa Xaa Pro Xaa}
Claims (16)
1. Compuesto de la fórmula I,
(I)AcPhe-Aib-Aib-Aib-x-w-Leu-y-Aib-Hyp-Gln-z-Hyp-Aib-Pro-R
en la que R significa
Phe-ol y w, x, y y z tienen el siguiente
significado:
- a)
- w es igual a Gly o Ala; x es igual a Aib e y y z son iguales a Iva;
- b)
- w es igual a Gly; x, y y z son iguales a Iva;
- c)
- w es igual a Gly; x y z son iguales a Aib e y es igual a Iva;
- d)
- w es igual a Gly; x, y y z son iguales a Aib; o
- e)
- w es igual a Gly; x e y son iguales a Aib y z es igual a Iva;
o el compuesto de la fórmula
II
(II)AcPhe-Iva-GIn-Aib-Ile-Thr-Aib-Leu-Aib-x-GIn-Aib-Hyp-Aib-Pro-Phe-Ser
en la que x significa Hyp o
Pro,
así como sus sales fisiológicamente
tolerables.
2. Compuesto de la fórmula I y II de acuerdo con
la reivindicación 1, caracterizado porque son
así como sus sales fisiológicamente
tolerables.
3. Procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula I o II o una de sus sales fisiológicamente
tolerables de acuerdo una o varias de las reivindicaciones
1-2, caracterizado porque se fermenta el
microorganismo Acremonium tubakii FH 1685 DSM 12774 o una de
sus variantes o mutantes en condiciones adecuadas, en un medio de
cultivo, hasta que uno o varios compuestos de fórmula general I o II
se acumulan en el medio de cultivo y a continuación se aíslan del
medio de cultivo y se convierten opcionalmente en sales
fisiológicamente tolerables.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
3, caracterizado porque la fermentación en condiciones
aerobias se realiza a una temperatura entre 18 y 35ºC y a un pH
entre 6 y 8.
5. Compuesto de la fórmula I o II o una de sus
sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-2 para usar como fármaco.
6. Compuesto de la fórmula I o II o una de sus
sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-2 para usar como antibiótico.
7. Compuesto de la fórmula I o II o una de sus
sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-2 para usar como antibiótico
contra parásitos humanos y/o animales.
8. Compuesto de la fórmula I o II o una de sus
sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-2 para usar como antibiótico
contra endoparásitos y/o ectoparásitos patógenos humanos y/o
animales.
9. Compuesto de la fórmula I o II o una de sus
sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-2 para usar como
antihelmíntico.
10. Compuesto de la fórmula I o II o una de sus
sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-2 para usar como antibiótico
contra trematodos y/o nematodos patógenos humanos y/o animales o
contra ectoparásitos patógenos humanos y/o patógenos animales que
pertenecen a la clase de arácnidos o insectos.
11. Compuesto de la fórmula I o II o una de sus
sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-2 para usar como antimicótico,
antiprotozoo o como sustancia de acción antimicrobiana.
12. Compuesto de la fórmula I o II o una de sus
sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-2 para el tratamiento y/o la
prevención de enfermedades bacterianas y/o parasitarias, así como de
infecciones micóticas.
13. Compuesto de la fórmula I o II o una de sus
sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-2 para usar como promotor del
crecimiento en animales útiles, así como mejora del aprovechamiento
del forraje en animales útiles.
14. Preparación farmacéutica con un contenido en
al menos un compuesto de fórmula I o II o una de sus sales
fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1-2.
15. Procedimiento para la producción de
preparaciones farmacéuticas de acuerdo con la reivindicación 14,
caracterizado porque al menos un compuesto de fórmula I o II
o una de sus sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o
varias de las reivindicaciones 1-2 se produce en una
forma adecuada de administración empleando coadyuvantes y/o materias
de soporte adecuados.
16. Preparación farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 14 para usar como antibiótico, en especial como
antibiótico contra parásitos humanos y/o animales, contra
endoparásitos y/o ectoparásitos patógenos humanos y/o patógenos
animales, contra trematodos y/o nematodos patógenos humanos y/o
patógenos animales o contra ectoparásitos patógenos humanos y/o
patógenos animales, que pertenecen a la clase de arácnidos o
insectos, como antihelmíntico, antimicótico, antiprotozoo o para el
tratamiento y/o la prevención de enfermedades bacterianas y/o
parasitarias, así como de infecciones micóticas.
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