ES2244956T3

ES2244956T3 - Composicion farmaceutica comprendiendo fosfatasa o su derivado.

Info

Publication number: ES2244956T3
Application number: ES94927860T
Authority: ES
Inventors: Klaas Poelstra; Machiel Josephus Hardonk; Winston Willem Bakker; Dirk Klaas Fokke Meijer
Original assignee: PHARMAAWARE IP BV
Current assignee: PHARMAAWARE IP BV
Priority date: 1993-08-13
Filing date: 1994-08-10
Publication date: 2005-12-16
Anticipated expiration: 2014-08-10
Also published as: AU7710194A; DK0721501T3; WO1995005455A1; EP0721501A1; AU4835693A; AU698331B2; EP0721501B1; JPH09502342A; JP3835811B2; PT721501E; AU1424399A; WO1995005456A1; ATE298790T1; DE69434414T2; US6290952B1; DE69434414D1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES FARMACEUTICAS UTILES PARA TRATAR O CURAR COMPLICACIONES CLINICAS MEDIADAS POR LA ENDOTOXINA, INCLUYENDO LA SEPSIS. LAS COMPOSICIONES CONTIENEN COMPONENTES UTILES PARA DESTOXIFICAR LA ENDOTOXINA HACIENDOLA MENOS PERJUDICIAL PARA LOS MAMIFEROS COMO EL SER HUMANO, EN PARTICULAR PARA PACIENTES CON UNA RESISTENCIA A LA DEFENSA DE ANFITRION REDUCIDA. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A COMPOSICIONES FARMACEUTICAS UTILES PARA ESTIMULAR LA FORMACION OSEA POR EJEMPLO PARA ARREGLAR HUESOS ROTOS O PARA LA PROFILAXIS O TERAPIA DE ENFERMEDADES OSEAS METABOLICAS, COMO LA OSTEOPOROSIS Y LA OSTEOMALACIA Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS PARA REDUCIR O INHIBIR LA FORMACION OSEA NO DESEADA. LAS COMPOSICIONES DE ACUERDO CON LA INVENCION VAN DIRIGIDAS A LA MODULACION DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA IN VIVO.

Description

Composición farmacéutica comprendiendo fosfatasa o su derivado.

Campo de la invención

La invención se refiere a composiciones farmacéuticas apropiadas para tratar o curar complicaciones clínicas inducidas por infecciones con bacterias gramnegativas, incluyendo septicemia. En particular la invención se dirige a composiciones sistémicamente aplicables. Las composiciones contienen componentes adecuados para desintoxicar lipopolisacáridos derivados de la pared bacteriana (también conocidos como endotoxinas) haciendo estos productos menos deletéreos para los mamíferos tales como los seres humanos, en particular a pacientes con septicemia, opcionalmente en combinación con una menor resistencia de las defensas del huésped, es decir después de transplantes de órganos, durante la leucopenia (ref. 1) asociada con cáncer o tratamiento quimioterapéutico contra el cáncer o durante el SIDA y enfermedades relacionadas con el SIDA (ref. 2).

Antecedentes

La endotoxina es una lipopolisacárido cargado negativamente presente en la cápsula de bacterias gramnegativas (ref. 3). Las endotoxinas son complejos de fosfolípido (lípido A) y polisacárido. Las endotoxinas producidas por diferentes bacterias difieren en su antigenicidad pero todas tienen los mismos efectos biológicos que son principalmente debidos al lípido A. Para los objetivos de esta descripción el término endotoxina también comprende enterotoxinas. Además de los grupos azúcar cargados negativamente, una endotoxina contiene dos grupos fosfato que son esenciales para su toxicidad (ref. 3. 4).

Aunque es una molécula ubiquitina en el ambiente externo al igual que en el tracto gastro-intestinal de muchas especies, una endotoxina puede ser extremadamente deletérea para estas especies una vez deja el tracto gastrointestinal p. ej provocando septicemia e inflamación tal como en un abceso incluso en cantidades tan bajas como 10 picogramos. Aún hasta ahora, ningún mecanismo de desintoxicación de endotoxinas importante ha sido encontrado in vivo (ref. 5).

Se sabe que la endotoxina induce complicaciones serias e incluso letales (ref. 5 y 6). De hecho, a pesar del uso de antibióticos, este producto bacteriano es la causa principal de muerte en unidades de cuidado intensivo de la sociedad Occidental.

Hay numerosas endotoxinas diferentes producidas por varios microorganismos y consecuentemente las acciones de la endotoxina in vivo son numerosas como son las formas en la que ésta puede entrar en el organismo. Los síntomas asociados con infecciones gramnegativas en consecuencia también varían mucho entre pacientes (ref.7). Estos síntomas pueden complicarse más por un shock séptico de los cuales la hipotensión, vasodilatación periférica y coagulación intravascular diseminada son las características principales (ref. 8). Posteriormente órganos tales como corazón (insuficiencia cardiaca aguda), pulmones (síndrome de insuficiencia respiratoria adulta), riñón (necrosis tubular aguda) y cerebro puede ser afectados (Ref. 8). La patología por endotoxina también comprende el síndrome de alteración multiorgánica y cualquier otro síndrome generalmente aceptado en la técnica que sea provocado directa o indirectamente por la endotoxina.

Hasta la fecha, los anticuerpos dirigidos contra la endotoxina son las únicas proteínas de desintoxicación de endotoxinas conocidas para reducir la toxicidad irreversiblemente, pero el valor clínico de estos anticuerpos están por establecer. Otras sustancias que son capaces de enlazar la endotoxina, tal como la proteína de enlace de lipopolisacáridos y lipoproteínas de alta densidad (HDL) (ref. 9), tienen el principal inconveniente de formar complejos reversibles in vivo. Tras la disociación de estos complejos se produce de nuevo la molécula nativa (tóxica). Además aunque se consideró durante algún tiempo la actividad de desintoxicación del plasma (ref. 10) los esfuerzos para aislar o caracterizar la(s) substancia(s) responsables de esta actividad no han dado buenos resultados. Otros procedimientos experimentales para tratar la septicemia incluyen la aplicación de preparaciones que antagonizan las actividades de citoquinas (p. ej. TNF-\alpha), que son mediadores importantes del shock inducido por endotoxinas, agravando los efectos de la endotoxina in vivo. Una desventaja importante de este procedimiento es que estas preparaciones no desintoxican el agente causante sino que más bien bloquean una de las reacciones del cuerpo a esta toxina. Además, antagonizar citoquinas de origen natural puede causar múltiples efectos secundarios.

La fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1) es una enzima común presente en muchas especies, incluyendo el hombre, y ha sido estudiada extensamente. Incluso se ha obtenido la secuencia de ADN que codifica la fosfatasa alcalina, pero hasta ahora no ha sido explotada comercialmente. Aunque la enzima es automáticamente aplicada como marca de anticuerpos o como un marcador para la función del hígado y neutrófila, aún se desconoce su relevancia biológica. Las enzimas fosfatasas alcalinas recombinantes con actividad específica mejorada usadas como reactivos indicadores están descritas, p. ej. en EP-A-0 441 252. Sin embargo esta solicitud de patente no menciona nada en relación a la actividad antiendotoxina o formación de huesos de la fosfatasa alcalina. La solicitud de patente europea citada describe un número de derivados donde un aminoácido difiere del tipo salvaje. Los sustituyentes incluyen sustitución de Thr 100 por Val o Ile, sustitución de Lys 328 por Arg, sustitución de Val 99 por Ala, sustitución de Thr 107 por Val, sustitución de Asp 101 por Ser, sustitución de Val 377 por Ala y sustitución de Ser 115 por Gly al igual que sustitución de Ala 103 por Asp. Otros derivados descritos en la solicitud de patente citada son los derivados con éster M maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida para llevar a cabo un enzimoinmunoanálisis tipo sándwich y un mutante tiolado de fosfatasa alcalina que puede derivar usando ciclohexanocarboxilato de succinimidil-4-N-maleimidometil-1-ticapramida. De todos estos derivados no se menciona la carga llevada por el derivado de fosfatasa alcalina. Se señala que todos los derivados mencionados con la excepción de la sustitución de Ala 103 por Asp han sido calculados por nosotros como aquellos que dan como resultado una carga neta más positiva o una carga neta igual en comparación con la fosfatasa alcalina nativa correspondiente.

La fosfatasa alcalina es una ectoenzima ligada a las membranas que es conocida por defosforilar moléculas extracelulares La enzima está presente en muchos órganos, incluyendo intestino, riñón, osteoblastos y neutrófilos (ref. 11, 12 y 13). In vitro, exhibe un pH óptimo de aproximadamente 10.5. (ref. 12). Este pH óptimo extremadamente alto ha dificultado el reconocimiento de su relevancia biológica (ref. 12-14), porque se creyó que este nivel de pH no se encuentra en tejidos biológicos del organismo intacto.

En un número de publicaciones se describe un derivado de fosfatasa alcalina y colágeno, particularmente colágeno fibrilar. No se menciona nada sobre la carga negativa neta de tal derivado, no obstante, nosotros hemos calculados que la carga neta es positiva en comparación con una fosfatasa alcalina no derivatizada.

En US 4 409 332 (1983) se describe que las suturas de colágeno derivatizadas con fosfatasa alcalina reducen las características inflamatorias del colágeno. La inflamación inducida por el colágeno no es una reacción inflamatoria debido a endotoxinas, es una inflamación generalmente causada por un daño del tejido que ha sucedido porque el colágeno es una proteína heteróloga que es extraña al cuerpo y porque el colágeno siempre induce coagulación in vivo que puede posteriormente activar células inflamatorias en un número de maneras. Una inflamación por infecciones de la herida no es posible ya que los propios autores frecuentemente indican que trabajaron en un ambiente estéril, usando soluciones estériles. Un experto en la materia no puede deducir de esta publicación de patente citada cómo la fosfatasa alcalina acoplada al colágeno puede inhibir la inflamación normalmente provocada por el colágeno. No obstante se puede postular un número de maneras tal como, por ejemplo por protección de antígenos de las células de la inmunorreacción específica, impidiendo de ese modo el reconocimiento o enlazando mediadores cargados positivamente de la reacción inmune no específica pues la fosfatasa alcalina contiene grupos azúcar cargados negativamente. Otra posibilidad es la inhibición de la cascada de coagulación enmascarando el colágeno o la defosforilación de mediadores, tal como ATP, ADP y factor activante de plaquetas o enlazando mediadores y cofactores cargados positivamente.

En el documento citado se indica que aunque las funciones de hidrólisis de la fosfatasa perfil han sido intensivamente estudiadas durante más de 50 años, no ha surgido ninguna imagen clara en lo que se refiere al valor de la enzima para el organismo. En definitiva la actividad de la fosfatasa alcalina in vivo no está clara. No se hace ninguna conexión en el documento citado entre la fosfatasa alcalina y la formación de huesos o actividad antiendotoxinas. No se da ningún antecedente teórico a la actividad antiinflamatoria del acoplamiento de la fosfatasa alcalina al colágeno. Es de hecho cuestionable si un experto en la materia atribuiría la actividad antiinflamatoria a la presencia de fosfatasa alcalina o si el hecho de que los grupos específicos de colágeno están protegidos por la presencia de un derivado aleatorio proporciona la acción anti-inflamatoria. Esto puede deducirse del hecho de que se describe que el uso de agente de reticulación, tal como glutaraldehido u otros medios de reticulación parece que aumenta las características antiinflamatorias del material.

Descripción de la invención

El objeto de la presente invención se basa en nuestro descubrimiento de que la fosfatasa alcalina como tal está dotada de actividad fosfatasa que regula algunas funciones vitales del cuerpo, incluso a niveles de pH fisiológico, es decir in vivo sin tener que ser derivatizada.

La base de esta conjetura fue proporcionada por la idea de que a nivel molecular in vivo, un micromedio alcalino se podría presentar él mismo de formas distintas a las soluciones acuosas in vitro. Las moléculas cargadas negativamente in vivo pueden actuar como bases débiles por su capacidad para enlazar H^{+}. Consecuentemente estos aniones inducen un aumento local en el nivel de pH proporcionando así un micromedio con un valor de pH suficiente para que la fosfatasa alcalina funcione como fosfatasa.

La adición de cargas negativas pueden ser proporcionadas in vivo en tres formas diferentes: adición de sustratos de carga neta negativa a la enzima, en segundo lugar suministrando la fosfatasa con un soporte de membrana con cargas negativas y en tercer lugar cambiando la ionización de grupos cargados en la propia proteína y/o introduciendo grupos cargados negativamente en el esqueleto de la proteína o eliminando grupos potencialmente cargados positivamente en la proteína.

Estos mecanismos diferentes bien sólos o combinados pueden explicar el pH óptimo alto inusual de la enzima in vitro.

Se podrían aplicar consideraciones similares para otros tipos de fosfatasas.

Otro aspecto de la presente invención se basa en el descubrimiento incluso más específico de que la fosfatasa alcalina como tal también está dotada de actividad de desintoxicación de la endotoxina, incluso a niveles de pH fisiológico.

La endotoxina con sus grupos cargados negativamente pueden así por ejemplo suministrar residuos cargados negativamente necesarios en el micromedio de la fosfatasa alcalina. De esta manera, esta enzima ubiquina puede proporcionar protección in vivo contra la endotoxina, el producto ubiquino de bacterias gramnegativas.

El uso de preparaciones enzimáticas para desintoxicar la propia endotoxina tiene la ventaja de que es posible el tratamiento de la enfermedad en la fase temprana y tiene además la ventaja de reducir la toxicidad de la endotoxina irreversiblemente. Además como la actividad de las enzimas es específica del sustrato, se limitan los efectos secundarios usando una enzima tal como la fosfatasa alcalina.

Los grupos fosfato en el grupo lipido A de la endotoxina determina la toxicidad de este componente bacteriano. Como las moléculas de lipido A defosforilado retienen alguna de sus actividades inmunoestimuladoras es posible hacer una vacuna.

Una vacuna para prevenir una patología por endotoxinas de bacterias gramnegativas, dicha vacuna comprendiendo fosfatasa como tal o un derivado de fosfatasa, dicho derivado teniendo actividad fosfatasa como componente activo y cualquier adyuvante comúnmente usado en una vacuna es una forma de realización de la invención objeto. Puede utilizarse cualquier tipo de derivado generalmente aceptable en el campo de las vacunas.

Para probar la hipótesis de que la fosfatasa alcalina es una enzima protectora del sistema de defensas del huésped por su capacidad de desintoxicar lipopolisacáridos, investigamos si la fosfatasa alcalina es capaz de defosforilar endotoxina de Escherichia coil a niveles de pH fisiológico. La actividad fosfatasa alcalina fue explorada en secciones criostáticas fijas con formalina al 4% (4 \muM) de intestino, riñón y bazo según métodos histoquímicos estándares a niveles de pH alcalinos (ref. 20) y fisiológico (ref. 21), usando bien el sustrato convencional 8-glicerofosfato (6.0 mg/ml) o endotoxina de Escherichia coli (0.55 mg/ml; serotipo 0.55:B5. Sigma Chemical Co, St.Louis. E.E.U.U.). A nivel de pH alcalino, se aplicó el método histoquímico de Gomori (ref. 20), mientras que se usó el método de Wachstein y Meisel (ref. 21) a nivel más bajo de pH. Las secciones fueron incubadas con sustrato durante una hora a 37°C. A pH 7.4 y 9.0 se encontraron precipitados de fosfato, indicando actividad enzimática en secciones de intestino y de riñón cuando se usó endotoxina como sustrato (fig. 1). En el bazo, se hallaron células muy positivas dispersas por toda la pulpa roja. La distribución del producto de reacción fue idéntica para ambos sustratos. Todas las secciones incubadas sin sustrato estaban completamente desprovistas de producto de reacción. Además, el inhibidor selectivo de fosfatasa alcalina Levamisol (1.0 mM) (ref. 20) inhibió completamente la liberación de fosfato de la endotoxina en secciones de riñón, mientras que en secciones de intestino esta actividad fue atenuada por el inhibidor bien conocido de fosfatasa alcalina intestinal, L-fenilalanina (5 mM) (ref. 22), pero no por el estereoisómero D-fenilalanina (5 mM). Así, tanto la distribución de actividad enzimática en varios órganos, como los resultados obtenidos con inhibidores selectivos demuestran que la endotoxina es defosforilada por fosfatasa alcalina a niveles de pH fisiológico.

El pH óptimo de actividad de la fosfatasa alcalina fue estudiado de una manera más cuantitativa usando células tubulares en cepillo de riñón de rata. Esta preparación enzimática particular tiene la ventaja de que puede ser estudiada en asociación con la membrana plasmática. Además, se puede inhibir completamente con Levamisol. Se añadieron preparaciones de fragmentos tubulares en cepillo (aislados del cortex de riñones de rata PVG usando un tamiz de malla de 180 y enjuagados en solución salina 0.9%) que contenían 12 \mug de proteína (actividad específica de fosfatasa: 86 U/mg, según se constató a pH 9.8) a 250 \mul de tampón de 2-amino-2-metil-1,3-propanediol de varios niveles de pH. El tampón contenía o la endotoxina de E. coli (1.25 mg/ml) o para-nitrofenolfosfato (0.5 mg/ml; pNPP). 2 mM de MgCl_{2} fue añadido poco antes del inicio del periodo de incubación. Después de una hora de incubación a 37°C, se constataron concentraciones de fosfato inorgánico según el método de Chandrarajan (ref. 23). Con el sustrato convencional pNPP se observó un aumento estable en la liberación de fosfato junto con el pH (fig.2, esquina superior izquierda); no obstante, cuando se aplicó la endotoxina como sustrato, la actividad enzimática alcanzó un máximo a pH 8.8 y permaneció estable a ese nivel. La defosforilación de endotoxina así como de pNPP fue inhibida por el inhibidor de fosfatasa alcalina Levamisol (0.2 mM). La actividad a niveles altos de pH no se vió obstaculizada por la deacetilación de cadenas de ácilo graso de la endotoxina que tiene lugar en condiciones alcalinas (ref. 24), puesto que una preincubación de una hora de endotoxina a pH 9.8 no inhibió la defosforilación a pH 7.4 como se probó histoquímicamente. Así, en contraste al alto pH óptimo encontrado con el sustrato pNPP, la fosfatasa alcalina alcanza actividad máxima a un nivel menos extremo de pH cuando se usa endotoxina como sustrato. Puede especularse que el pH óptimo es incluso inferior cuando la enzima es estudiada in vivo dentro de su micromedio apropiado comprendiendo las cargas negativas adicionales necesarias para imitar el pH alcalino óptimo observado in vitro.

Para estudiar el efecto de la fosfatasa alcalina sobre la toxicidad de la endotoxina, se realizaron ensayos de Limulus. Este ensayo de Limulus es el método estándar para evaluar concentraciones de endotoxina in vitro en base a la toxicidad de la molécula hacia el cangrejo de herradura Limulus polyphemus (ref. 25). Se incubó endotoxina (2.0 ng/ml) durante una hora a 37°C en tampón 1640 RPMI (pH 7.6), junto con fragmentos tubulares (0.8 \mug proteína/ml, actividad fosfatasa específica 86 U/mg). Las muestras de control no tenían ni endotoxina ni fragmentos tubulares en cepillo. Posteriormente se realizó el ensayo de Limulus. Los resultados muestran una reducción significante en concentraciones de endotoxina como se puede medir por este método en suspensiones conteniendo actividad de endotoxina y de fosfatasa alcalina, en comparación a suspensiones conteniendo cantidades iguales de endotoxina sin la enzima (Tabla 1). Puede concluirse que la fosfatasa alcalina es capaz de atenuar la toxicidad de las moléculas de endotoxina a niveles de pH fisiológico, como se constató in vitro.

Otro método de la invención es un método para hacer una sustancia libre de efectos tóxicos de endotoxina comprendiendo someter el producto a la actividad fosfatasa de fosfatasa, p. ej. fosfatasa alcalina o un derivado de fosfatasa con actividad fosfatasa. Tal derivado puede por ejemplo ser un derivado según cualquiera de las reivindicaciones 1-12. La sustancia que debe ser desentoxicada debe ser sometida a la presencia de la actividad fosfatasa durante un tiempo lo suficiente largo para desintoxicar cualquier endotoxina presente. Un experto en la materia será capaz de averiguar cuánto tiempo puede ser idóneo sin experimentación excesiva.

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TABLA 1 Concentraciones de endotoxina medidas por el ensayo de Limulus con y sin pretratamiento con fosfatasa alcalina

muestra	[endotoxina] pg/ml
Endotoxina	34.0 \pm 13.0
Endotoxina + fosfatasa alcalina	< 0.05 \pm 0
Tampón	11.3 \pm 9.8

La toxicidad de endotoxina tratada con fosfatasa alcalina fue también estudiada in vivo, tomando ventaja del hecho de que la inflamación local que sigue a dos inyecciones de endotoxina sucesivas (Reacción local de Shwartzman (ref.26)) puede ser cuantificada fácilmente. Si la hipótesis de desintoxicación fuera válida, esta reacción inflamatoria debería reducirse tras la administración de preparaciones de endotoxina tratada previamente con fosfatasa alcalina. En consecuencia, provocamos una Reacción de Shwartzman intradérmica local y tratamos la segunda dosis de endotoxina con fragmentos tubulares en cepillo a pH fisiológico. El flujo de células productoras de radicales libres de oxígeno, una característica importante de la Reacción de Shwartzman, fue posteriormente examinado histoquímicamente. Así, la Reacción de Shwartzman fue provocada por dos inyecciones sucesivas de endotoxina (de E. Coli 055:B5) dividida por 20 horas en ratas PVG hembras (200 g). La primera inyección de endotoxina (1 mg/kg peso corporal) fue administrada por vía intravenosa, mientras que la segunda inyección consistente en una administración intradérmica de una mezcla de 70 \mul de medio RPMI 1640 (pH 7.6) completada con 2 mM de MgSO_{4} y 40 \mug de endotoxina (E) o sólo MgSO_{4} (C). Antes de la inyección, se incubaron los medios (1 hora, 37°C) con 6 \mug de fragmentos tubulares en cepillo conteniendo 86 U/mg de actividad fosfatasa alcalina (A), con o sin el inhibidor de fosfatasa alcalina Levamisol (L; concentración final 1.0 mM). Se complementaron los medios de control con solución salina (S) y sin endotoxina, o fosfatasa alcalina, o ambas. Dos horas después de las inyecciones intradérmicas, se analizó el flujo de células productoras de radicales libres de oxígeno en las localizaciones dérmicas, demostrado histoquímicamente con 3.3'-diaminobenzidina (DAB) en un microscopio óptico (ref. 27). Se observó un flujo significante de células productoras de radicales libres de oxígeno en localizaciones dérmicas inyectadas con endotoxina no tratada en comparación con controles (E/S versus C/S p < 0.01, Wilcoxon; figura 4). Esta respuesta inflamatoria fue atenuada en las localizaciones dérmicas inyectadas con endotoxina pretratada con fragmentos tubulares en cepillo (E/S versus E/A, P < 0.05, Wilcoxon), mientras que la endotoxina pretratada con fragmentos tubulares más Levamisol mostraron un incremento de la actividad proinflamatoria en comparación con la endotoxina pretratada sólo con fragmentos tubulares (E/A versus E/A/L, p < 0.025, Wilcoxon). Cada prueba fue realizada por duplicado en la misma rata y los resultados son expresados como la media aritmética (+/ SD) de 6 ratas. Estos datos demuestran que la endotoxina tratada con fosfatasa alcalina exhibe una toxicidad reducida in vivo y que la fosfatasa alcalina puede ser capaz de desintoxicar la endotoxina in vivo.

Para examinar la aportación de actividad fosfatasa alcalina endógena en la desintoxicación de endotoxina in vivo, constatamos el efecto del Levamisol sobre la sensibilidad a las endotoxinas en ratas, una especie relativamente resistente a los lipopolisacáridos gramnegativos. Ratas PVG hembras, de 6 meses, recibieron el inhibidor de fosfatasa alcalina Levamisol (Sigma Chemical Co, St.Louis, EEUU) intraperitonealmente (10 mg/kg peso corporal), o solución salina a t = -24 y t = -1 hora. A t = 0, ratas recibieron un provocador i.v. de 0.5 Mg de endotoxina, y se tomó sangre inmediatamente antes de y a t = 3, 6, 24 y 48 horas después de esta inyección.

Se constató actividad glutamato-piruvato transaminasa en suero, reflejando un daño del hígado (un factor patógeno importante en la muerte inducida por endotoxinas) en estas muestras según el método de Wroblewski y LaDue. Los resultados mostraron que no hubo cambios en la actividad transaminasa en suero después del tratamiento con Levamisol solo en comparación con las ratas tratadas con solución salina mientras que se encontró un aumento después del provocador de endotoxina (fig.5). No obstante, a diferencia del aumento menor observado en las ratas que recibieron sólo endotoxina, las ratas tratadas previamente con Levamisol mostraron un fuerte incremento en actividad transaminasa en suero (P < 0.001), demostrando la involucración de la actividad fosfatasa alcalina endógena en la desintoxicación de la actividad de endotoxina de ratas in vivo.

La actividad de desintoxicación de fosfatasa alcalina fue también estudiada en un modelo experimental de shock séptico en ratas y ratones. Así, las ratas recibieron una inyección intraperitoneal de 1.0 x 10^{10} unidades formadoras de colonias (CFU) de una cepa bien caracterizada de bacterias de Escherichia coli (ATCC 25922) mientras que los ratones recibieron 0.2 x 10^{10} unidades formadoras de colonias. La inoculación de esta dosis conduce al síndrome del shock séptico total, caracterizado por trombocitopenia, leucopenia, alteración de las funciones del hígado y temperatura corporal (rectal) reducida, en aproximadamente 6 horas.

La mayoría de las ratas, siendo relativamente resistentes a la endotoxina, sobrevivieron a la inyección de bacterias de E. coli (fig.7A). No obstante, en combinación con el inhibidor de fosfatasa alcalina Levamisol (50 mg/kg peso corporal administrado subcutáneamente 2 horas antes de las bacterias) la inoculación de bacterias gramnegativas fue letal. Nueve de diez ratas murieron con síntomas clínicos de shock. Los niveles de actividad fosfatasa alcalina en suero en ratas tratadas con Levamisol fueron reducidos al 50% seis horas después de la inyección. El Levamisol no influyó en la supervivencia de las ratas que recibieron una dosis subletal de bacterias grampositivas; las ratas que recibieron 50 mg/kg peso corporal de Levamisol 2 horas antes de la administración de 1.0 x 10^{10} CFU de Staphylococcus aureus sobrevivieron casi todas (8 ratas por grupo, fig. 7B). Esto demuestra que la actividad fosfatasa alcalina endógena en ratas está implicada en la resistencia hacia la endotoxina de bacterias gramnegativas.

A diferencia de las ratas, nueve de diez ratones murieron por la dosis de 0.2 x 10^{10} CFU de E. Coli (fig. 8). No obstante, los animales que recibieron una única inyección intraperitoneal de 0.15 U de fosfatasa alcalina de placenta humana purificada 2 horas antes de la administración de bacterias sobrevivieron todos a la inoculación de esta dosis letal (n=10). Se extrajo fosfatasa alcalina de placenta humana con butanol (50% v/v) y se purificó usando una columna de dietilaminoetilcelulosa y una columna de afinidad (una columna de CNBr-sefarosa4B con anticuerpos de fosfatasa alcalina de placenta humana anticonejo acoplados a ello). Así, parece ser que la fosfatasa alcalina es capaz de desintoxicar endotoxina in vivo y parece aplicable para el tratamiento de shock endotóxico.

La vida media circulante de la fosfatasa alcalina de placenta es aproximadamente 7 días en sangre humana (ref. 31). En ratas la fosfatasa alcalina de placenta humana es detectable en sangre durante aproximadamente tres días (observaciones personales), a diferencia de la fosfatasa alcalina intestinal que tiene una vida media circulante de 71/2 minutos (ref. 28). En base a estos datos y en base a los resultados de estudios en ratones (véase arriba), se puede concluir que la fosfatasa alcalina de placenta es particularmente adecuada para servir como componente activo en una composición farmacéutica, en particular una composición sistémicamente aplicable tal como para la prevención de septicemia.

Al basarse la actividad antiendotoxinas en la actividad defosforilizadora exhibida por la fosfatasa alcalina no puede excluirse naturalmente otras fosfatasas, en particular fosfatasas con pH óptimo in vitro a pH alcalino o derivados de fosfatasas con actividad fosfatasa. La invención objeto se dirige en consecuencia al uso de una fosfatasa como tal o un derivado con actividad fosfatasa como componente activo para la preparación de una composición farmacéutica para la profilaxis o terapia de una patología por endotoxina o por un derivado de endotoxina con actividad endotóxica. Una composición farmacéutica comprendiendo al menos una fosfatasa como tal o un derivado con actividad fosfatasa adecuado para la aplicación sistémica o comprendiendo un vehículo capaz de producir fosfatasa como tal o un derivado de fosfatasa con actividad fosfatasa adecuado para la aplicación sistémica como componente activo, dicha fosfatasa o dicho derivado teniendo actividad de desintoxicación para una endotoxina o para un derivado de endotoxina con actividad endotóxica y además comprendiendo un soporte farmacéuticamente aceptable, se encuentra incluida en el campo de la invención. En particular una composición farmacéutica comprendiendo fosfatasa alcalina como tal o un derivado con actividad fosfatasa o un vehículo capaz de producir fosfatasa alcalina como tal forma una forma de realización preferida de la invención. Para el uso en una composición farmacéutica la fosfatasa debe ser obtenible de una forma substancialmente pura. En general las técnicas de ADN recombinantes pueden proporcionar una fosfatasa adecuada para el uso en una composición farmacéutica según la invención.

Hasta la fecha cuatro isoenzimas codificadas por cuatro genes diferentes han sido descritas. Estas incluyen la forma intestinal, el tipo hígado/hueso/riñón (también presente en neutrófilos), el tipo placenta, y la isoenzima similar a la placentaria (presente en células germinales). La fosfatasa alcalina tanto de forma intestinal como el tipo hígado/hueso/riñón exhibe actividad de desintoxicación de endotoxina, aunque no hay razones para creer que las otras isoenzimas de fosfatasa alcalina no son capaces de degradar la endotoxina. En consecuencia la invención objeto comprende una composición farmacéutica que comprende cualquier isoenzima tal. En particular una fosfatasa alcalina del tipo placentario es conveniente debido a su larga vida media in vivo.

El siguiente caso clínico ilustra las consecuencias deletéreas de una actividad fosfatasa alcalina reducida en un mamífero tal como un humano. Una niña de un año de edad padecía endotoxinemia recurrente. Estos períodos fueron acompañados con síntomas de shock que ponían en peligro su vida. Tras el tratamiento se consiguió su recuperación pero a menudo seguida de una recaída a las pocas semanas cuando la endotoxinemia aparecía nuevamente. En un periodo de 10 meses, ocurrieron 12 recaídas y finalmente la niña murió a la edad de un año. La causa de la muerte fue diagnosticada como shock séptico inducido por bacterias gramnegativas. Se desconoció la causa de la propia endotoxinemia recurrente. Nuestros recientes estudios mostraron que en hígado y bazo, la fosfatasa alcalina parecía normal, pero la actividad enzimática estaba casi ausente en el ileum, un órgano que normalmente expresa la mayor actividad enzimática del cuerpo humano. A la luz de nuestros resultados, una actividad fosfatasa alcalina reducida en un órgano tan crucial puede explicar la causa de la muerte. Es fácilmente concebible que el defecto de un mecanismo de desintoxicación endógena en el intestino ocasione endotoxinemia recurrente, considerando el alto contenido de E. coli en el lumen intestinal. Tal deficiencia puede ser adecuadamente tratada según la invención objeto.

Estudios retrospectivos en pacientes que padecían de endotoxinemia recurrente (sin complicaciones subyacentes tal como malignidades o enfermedades hepáticas) mostró que la actividad fosfatasa alcalina o de un derivado de ésta en suero está en correlación con la condición clínica. Así, cuando ocurrió la septicemia, se podía medir invariablemente una fuerte reducción de la actividad fosfatasa alcalina o de un derivado de ésta en suero, un fenómeno también encontrado en ratas, seguido de un aumento de actividad fosfatasa alcalina o de un derivado de ésta en suero en pocos días. En un caso particular, el tejido inflamatorio fue extraído (parcial resección de ileum) durante un periodo de enfermedad grave. Esto provocó un aumento inmediato de actividad fosfatasa alcalina o de un derivado de ésta en suero a niveles normales. Estas observaciones apuntan a un aumento de la circulación de la enzima durante las infecciones bacterianas gramnegativas y respaldan la noción de que la fosfatasa alcalina o un derivado de ésta administrado a pacientes con septicemia puede ser de ayuda.

Un método para la terapia o profilaxis de patología mediada por endotoxina o por un derivado de endotoxina con actividad endotóxica comprendiendo la administración a un sujeto de una cantidad terapéutica de una fosfatasa o derivado de fosfatasa con actividad fosfatasa en consecuencia también se encuentra dentro del campo de la invención. Los derivados con actividad óptima alrededor del pH in vivo serán los preferidos. Naturalmente el uso de derivados de fosfatasa en un método para preparar una composición farmacéutica para la profilaxis de terapia de una patología mediada por endotoxina o un derivado de endotoxina en consecuencia también se encuentra dentro del campo de la invención. Se prefiere expresamente los derivados sistémicamente aplicables como tales, derivados que pueden ser aplicados en la corriente sanguínea del sujeto que debe ser tratado como ya se dilucidó para la fosfatasa como tal. Para la efectividad contra infecciones bacterianas gramnegativas el componente activo debe preferiblemente llegar a cualquier ubicación donde pueda encontrarse una bacteria gramnegativa o su endotoxina.

Otro aspecto de la invención reside en el conocimiento de que conforme a la clasificación de ácidos y bases de Bronsted-Lowry, los polianiones pueden actuar como bases débiles puesto que pueden enlazar H^{+}. Así, extrapolando esto al hecho de que el funcionamiento óptimo de proteínas o polipéptidos suele depender del pH y que en particular se ha ilustrado in vitro que el medio de incubación tiene que ser alcalino para la actividad óptima de dichas proteínas o polipéptidos, en particular para la fosfatasa alcalina, hemos concluido que los lugares polianiónicos in vivo, por ejemplo sialoglicoproteinas cargadas negativamente asociadas con membranas celulares, pueden cumplir las demandas de pH de tal enzima o polipéptido.

La fosfatasa alcalina se encuentra predominantemente en asociación con membranas de plasma. Por ejemplo, los neutrófilos presentan la enzima contra el fondo de su membrana celular cargada negativamente en vez de liberarla en el micromedio inflamatorio. Por esta razón se cree que los sustratos polianiónicos podrían contribuir aún más a condiciones aniónicas favorables in vivo para la actividad fosfatasa de fosfatasas y derivados de ésta normalmente con un pH óptimo alcalino, en particular para actividad fosfatasa de fosfatasa alcalina.

Si los grupos azúcar cargados negativamente de endotoxina influyen en el pH óptimo de esta actividad enzimática, cabría esperar que los policationes interfieran en esta reacción. En consecuencia, tratamos los sustratos con los cationes polietilenoimina (PEI) o poli-L-lisina (Lys). Los sustratos fueron preincubados durante 30 minutos con bien 0.5% PEI, 0.75% poli-L-lisina o agua destilada (C). Posteriormente, se realizaron incubaciones del modo descrito anteriormente y se constató liberación de fosfato. Ambos cationes afectaron fuertemente la defosforilación de endotoxina neutralizando las cargas negativas, mientras que ninguno de ellos influyó significativamente en la degradación de pNPP (fig. 3). El efecto profundo de PEI sobre la degradación de endotoxina puede ser provocado por neutralización de cargas negativas mientras que la inhibición estérica se puede añadir también a este efecto. Interesadamente, la poli-L-lisina provocó un cambio del pH óptimo a un nivel más alto, respaldando la idea de que los residuos cargados negativamente en el micromedio determinan el pH óptimo.

Se obtuvo ulterior confirmación de la noción de que las moléculas cargadas negativamente en el micromedio influyen en el pH óptimo de la fosfatasa alcalina por experimentos con enzimas intestinales. La valoración histoquímica del pH óptimo de la fosfatasa alcalina en secciones criostáticas (4 \muM) de intestino de rata aplicando el método de Gomori con el sustrato pNPP, no reveló ningún cambio significante en la intensidad de coloración cuando se varió el nivel de pH del medio de incubación de 7.8 a 9.8. No obstante, la actividad fosfatasa alcalina en suero, que se muestra que es de origen intestinal, muestra un pH óptimo de 9.8 o superior. Una diferencia importante entre fosfatasa alcalina intestinal in situ y en suero es su contenido en sialoglicoproteina. Aunque las enzimas intestinales son introducidas en membranas plasmáticas con sialato, la fosfatasa alcalina en suero no es rodeada por estos polianiones.

La invención objeto se dirige también en consecuencia a un derivado de una fosfatasa con actividad fosfatasa y que comprende un contenido neto más alto de grupos cargados negativamente que la fosfatasa nativa correspondiente. En particular la invención se dirige a tal derivado proveniente de una fosfatasa con un pH óptimo alcalino tal como la fosfatasa alcalina.

Un derivado de una fosfatasa según la invención comprendiendo un contenido más alto de grupos cargados negativamente puede comprender un contenido más alto de grupos amino alcalinos derivatizados que la fosfatasa nativa correspondiente. Esto por ejemplo se puede conseguir por dicho derivado comprendiendo un contenido más alto de grupos de ácido N-acetilneuramínico cargados negativamente (= grupos ácidos siálicos) que la fosfatasa nativa correspondiente. Otra posibilidad reside en que el derivado comprenda un contenido más alto de ácido cargado negativamente y/o un número de grupos básicos inferior que la fosfatasa nativa correspondiente como tal o en combinación con la forma de realización mencionada. En aún otra forma de realización de la invención el derivado de fosfatasa puede comprender un grupo fosfatasa conectado a una proteína o polipéptido cargado negativamente. Un ejemplo adecuado de tal proteína cargada negativamente es una albúmina cargada negativamente modificada, p. ej. una albúmina con succinilato . Se reitera que los derivados de fosfatasa descritos de WO 93/00935, US 4394370, US 4409332 y EP-A-0441252 no son derivados con una carga negativa neta aumentada. El único derivado más cargado negativamente descrito en dicha literatura es la fosfatasa alcalina de E. coli recombinante con sustitución de Ala 103 por Asp. Además, ninguno de los derivados descritos son sistémicamente aplicables. Un experto en la materia sabrá qué tipo de derivados están implícitos en el término sistémicamente aplicables. Son particularmente interesantes los derivados que pueden ser usados en formas de dosificación oral, o soluciones intravenosas o cualquier dosificación unitaria medicinal de manera que introduzca los componentes activos en la corriente sanguínea. Los derivados tóxicos tal como derivados de colágeno no son aceptables.

En otro aspecto de la invención un derivado de fosfatasa puede comprender al menos una modificación para aumentar la vida media de dicho derivado in vivo, p. ej. para prevenir el enlace a receptores de galactosa, dicha modificación p. ej. estando localizada en el residuo de galactosa terminal de una fosfatasa tal como la fosfatasa alcalina. Ya se sabe que la eliminación de por ej. fosfatasa alcalina en suero es mediada por receptores de galactosa hepática (ref. 28) pero no se pensó o sugirió antes ningún intento por modificar un sustrato de tal receptor. La modificación puede p. ej. ser el resultado de una oxidación o reducción.

La invención no sólo cubre los derivados como tal en las distintas formas de realización anteriormente descritas sino que también comprende combinaciones de los distintos aspectos de tales formas de realización.

Con respecto a las distintas formas de realización posibles para un derivado de fosfatasa WO 92/15316 da ejemplos de cómo modificar proteínas y polipéptidos para proporcionar sustancias modificadas con una carga negativa neta adicional por derivación de sus grupos amino y/u otros grupos funcionales básicos con un reactivo que impida la protonización de grupos amino básicos y/u otros grupos funcionales básicos o reemplace dichos grupos básicos por uno o más grupos funcionales teniendo una carga negativa. Los grupos que deben ser derivados pueden ser residuos de histidina y/o de lisina. El reactivo puede ser elegido de aldehidos, anhídridos, cloruros ácidos y isotiocianatos. Para la albúmina en suero un reactivo adecuado es anhídrido de cis-aconitato. Otra proteína adecuada que puede ser modificada y enlazada a fosfatasa para formar un derivado según la invención es una glicoproteina \alpha-ácida.

Es también posible crear un derivado de fosfatasa alcalina con actividad fosfatasa óptima a pH fisiológico, derivado que es en consecuencia adecuado para el uso in vivo y tal derivado se encuentra también dentro del campo de la invención.

La invención objeto no sólo cubre los derivados como se describe arriba en las distintas formas de realización sino también cubre una composición farmacéutica que comprende al menos un derivado tal de fosfatasa con actividad fosfatasa o un vehículo capaz de producir un derivado tal de fosfatasa con actividad fosfatasa como componente activo y comprendiendo además un soporte farmacéuticamente aceptable.

En particular una composición farmacéutica, donde el componente activo como se describe, es decir, la fosfatasa como tal, el derivado de fosfatasa que es sistémicamente aplicable y/o comprende una carga negativa neta más grande que la de la fosfatasa nativa correspondiente o un vehículo capaz de producir la fosfatasa o el derivado con actividad fosfatasa, es introducido en la doble capa Iípida de un liposoma, preferiblemente en combinación con componentes de membrana cargados negativamente es una forma de realización preferida de la invención. En tal composición la fosfatasa es una fosfatasa con actividad fosfatasa con actividad de desintoxicación para una endotoxina o un derivado.

El uso de un derivado de fosfatasa en cualquiera de las formas de realización anteriormente descritas como componente activo para la preparación de una composición farmacéutica para profilaxis o terapia de una patología mediada por endotoxina o por un derivado de endotoxina con actividad endotóxica está también en consecuencia cubierto por la invención objeto. En particular una composición farmacéutica comprendiendo un derivado cargado negativamente y/o sistémicamente aplicable de fosfatasa alcalina o un vehículo capaz de liberar y/o inducir síntesis de la fosfatasa alcalina del derivado en cualquiera de las formas de realización descritas forma una forma de realización preferida de la invención. Se prefiere una composición farmacéutica sistémicamente aceptable.

Un método para la terapia o profilaxis de una patología mediada por endotoxina o por un derivado con actividad endotóxica que comprende la administración a un sujeto de una cantidad terapéutica de tal composición farmacéutica o cualquier derivado de una fosfatasa con actividad fosfatasa y un soporte farmacéuticamente aceptable también se encuentra dentro del campo de la invención. En particular la invención objeto también se dirige a un método para evitar que ocurra una patología mediada por endotoxina o un derivado de ésta con actividad endotóxica tras un transplante o transfusión, dicho método comprendiendo someter el material que debe ser transplantado o transfundido a tratamiento antes y/o durante el y/o después de transplante o transfusión con uno de los componentes siguientes:

-: fosfatasa como tal con actividad desintoxicadora para una endotoxina o para un derivado de endotoxina con actividad endotóxica, dicha fosfatasa preferiblemente siendo fosfatasa alcalina, más preferiblemente fosfatasa alcalina humana;

-: un derivado de una fosfatasa con actividad fosfatasa según al menos una de las formas de realización de la invención en el modo descrito anteriormente;

-: un vehículo capaz de liberar y/o inducir síntesis o actividad fosfatasa de la fosfatasa o el derivado de fosfatasa con actividad de desintoxicación para una endotoxina o para un derivado de endotoxina con actividad endotóxica, dicha fosfatasa preferiblemente siendo fosfatasa alcalina;

-: un vehículo capaz de liberar y/o inducir síntesis o actividad fosfatasa de un derivado de fosfatasa según la invención en el modo descrito anteriormente, como tal o como componente activo de una composición farmacéutica. Preferiblemente la composición farmacéutica tiene un forma que hace el componente activo capaz de entrar en el flujo sanguíneo.

Para probar si el mecanismo de desintoxicación de endotoxina se refuerza ante este producto bacteriano, se aislaron neutrófilos humanos, se preincubaron con endotoxina y se evaluó su actividad fosfatasa alcalina. Así, se aislaron neutrófilos de voluntarios humanos normales según métodos estándares y se recogieron en un medio estéril. Los neutrófilos no fueron activados durante el procedimiento de aislamiento como se constató por medidas de producción de aniones superóxido por estas células. Posteriormente se incubaron células (0.9x10^{7} células/ml) a 37°C en tampón completado con endotoxina (20 pg/ml) o solución salina. Después de 30 minutos, se evaluó la actividad fosfatasa alcalina en estas muestras según métodos estándares a pH 9.8 con pNPP como sustrato. La actividad fosfatasa fue medida con y sin Levamisol (1 mM) añadido al medio. Los resultados muestran un aumento del 335% en actividad fosfatasa alcalina neutrofílica inducida por endotoxina (fig. 6), que es conforme a la función propuesta de esta enzima.

Un método para evitar que ocurra una patología mediada por endotoxina o un derivado con actividad endotóxica, dicho método comprendiendo la estimulación en particular de la actividad fosfatasa mediante el aumento de actividad fosfatasa alcalina endógena, por ejemplo aumentando su producción en un sujeto administrando al menos uno de los componentes mencionados como tal o como componente activo de una composición farmacéutica al sujeto también se encuentra dentro del campo de la invención. Lo mismo rige para un método para evitar que ocurra una patología mediada por endotoxina o un derivado con actividad endotóxica tras un transplante o transfusión, dicho método comprendiendo someter el material que debe ser transplantado o transfundido a tratamiento estimulando la actividad fosfatasa, en particular aumentando la actividad fosfatasa alcalina endógena, por ejemplo aumentando su producción de dicho material administrando al menos uno de los componentes siguientes:

-: una sustancia para estimular la actividad fosfatasa, en particular mediante el aumento de la actividad fosfatasa endógena o un derivado con actividad de desintoxicación para una endotoxina o para un derivado de una endotoxina con actividad endotóxica;

-: un vehículo capaz de liberar y/o inducir síntesis de la sustancia para estimular actividad fosfatasa como tal o como componente activo de una composición farmacéutica al sujeto. Una forma de realización adecuada de este aspecto de la invención puede ser hallada en un método para aumentar la presencia de fosfatasa alcalina, fosfatasa alcalina preferiblemente endógena en el cuerpo, el tejido o el líquido biológico de un animal o humano comprendiendo la aplicación de al menos uno de los componentes mencionados para estimular actividad fosfatasa como tal o como componente activo de una composición.

En definitiva, de los experimentos descritos anteriormente se puede concluir que las preparaciones enzimáticas basadas en la actividad fosfatasa alcalina son capaces de defosforilar la endotoxina atenuando así la toxicidad de esta molécula in vitro e in vivo. La actividad fisiológica de esta enzima es más prominente cuando se asocia con residuos cargados negativamente que proporcionan las condiciones apropiadas para el micromedio. Además, la actividad fosfatasa alcalina puede ser reforzada en células del sistema de defensas del huésped, proporcionando una barrera natural contra la endotoxina.

Leyenda de las Figuras

Figura 1

Actividad fosfatasa alcalina en secciones criostáticas de intestino (A) y riñón (B) de rata como de demostró a pH 9.0 con el sustrato \beta-glicerofosfato. Figuras C y D muestran actividad fosfatasa en secciones de intestino (C) y riñón (D) como se demostró con endotoxina como sustrato a pH 7.4. Se encuentra defosforilación significante de endotoxina a lo largo de las criptas intestinales (fig. C) y en fragmentos tubulares en cepillo del riñón (figura. D), correspondiente a la localización de actividad fosfatasa alcalina (fig. A y B). Además, en secciones intestinales esta actividad es reducida por adición de L-fenil-alanina (fig. E), mientras que la defosforilación de endotoxina en secciones de riñón es completamente inhibida por Levamisol (fig. F). Abreviatura: m = médula. Ampliación: 35x (A,B), 140x (C,E) y 56x (D,F).

Figura 2

Actividad fosfatasa, expresada como liberación por hora de fosfato inorgánico (Pi), en suspensiones de fragmentos tubulares en cepillo a diferentes niveles de pH con endotoxina como sustrato. Se muestra actividad fosfatasa con el sustrato de para-nitrofenolfosfato (pNPP) en la esquina superior izquierda. Se aislaron fragmentos tubulares en cepillo del cortex de riñones de rata PVG y se añadió a un tampón de 250 \mul de 2-amino-2-metil-1,3-propanediol a diferentes niveles de pH, conteniendo endotoxina de E. coli (1.25 mg/ml) o pNPP (0.5 mg/ml). Se añadió 2 mM de MgCl_{2} inmediatamente antes de la incubación. Las líneas discontinuas indican actividad fosfatasa ante Levamisol (0.2 mM). Después de una incubación de una hora a 37°C, se constataron concentraciones de fosfato inorgánico como se ha descrito previamente (ref. 29). Los resultados están expresados como media aritmética (\pm SD) de 6 ensayos, cada ensayo fue realizado por duplicado. Los resultados muestran que la defosforilación máxima de endotoxina ocurre a pH 8.8, mientras que la defosforilación de pNPP muestra un aumento estable a pH 9.8.

Figura 3

Actividad fosfatasa, expresada como liberación de fosfato (Pi) por hora, en suspensiones de fragmentos tubulares en cepillo a diferentes niveles de pH con endotoxina (fig. A) o pNPP (fig. B). Se preincubaron los sustratos durante 30 minutos con bien 0.5% polietilenoimina (PEI), 0.75% poli-L-lisina (Lys) o agua destilada (C). Posteriormente se realizaron incubaciones como se describe en la figura 2. Los resultados están expresados como media aritmética de 4 ensayos, cada ensayo fue realizado por duplicado (\pm SD). Se preincubaron los sustratos durante 30 minutos con bien 0.5% polietilenoimina (PEI), 0.75% poli-L-lisina (Lys) o agua destilada (C). Posteriormente se realizaron incubaciones como se describe en la figura 2. Los resultados están expresados como media aritmética de 4 ensayos, cada ensayo fue realizado por duplicado (\pm SD).

Figura 4

Para evaluar la toxicidad de endotoxina in vivo, se provocó una reacción de Shwartzman localizada (ref. 16) en la piel de ratas PVG en distintos lugares de la espalda. Antes de la inyección se incubaron todos los medios (1 hora, 37°C) con 6 \mug de fragmentos tubulares en cepillo conteniendo actividad fosfatasa alcalina (A), o con 0.9% solución salina (S). Cuando era indicado, se añadió el inhibidor de fosfatasa alcalina Levamisol (L) (concentración final 1.0 mM). Dos horas después de las inyecciones intradérmicas, se analizó el flujo de células productoras de radicales libres de oxígeno en los lugares dérmicos, demostrado histoquímicamente con 3.3'-diaminobenzidina (DAB) en el nivel^{17} microscópico óptico. Cada prueba fue realizada por duplicado en la misma rata y los resultados están expresados como la media aritmética (\pm SD) de 6 ratas.

Figura 5

Efecto de endotoxina sobre niveles de actividad en suero de glutamato-piruvato transaminasa (GPT), que refleja daño de células hepáticas, en ratas PVG. Parte de los animales fueron tratados previamente con Levamisol (L; 10 mg/kg peso corporal) a t = -24 y -1 hr. A t = 0 las ratas recibieron bien 0.5 Mg de endotoxina de E. coli (e) por vía intravenosa o 0.5 ml de solución salina. Los resultados están expresados como media aritmética (\pm SD de 4 ratas) por grupo.

Figura 6

Efecto de la endotoxina sobre la actividad fosfatasa alcalina (AP) de neutrófilos humanos. Se aislaron neutrófilos de sangre según procedimientos estáhdares y se incubaron en 0.9% solución salina con o sin endotoxina de E. coli (20 pg/ml) durante 30 minutos a 37°C. Posteriormente se midió la actividad fosfatasa de estas células usando paranitrofenol fosfato como sustrato a pH 9.8. Se añadió Levamisol (1 mM) para confirmar la involucración de fosfatasa alcalina en la liberación de fosfato.

Figura 7A

Ilustra el porcentaje de supervivencia de ratas tras inyección de E. coli (línea continua). Levamisol (Le) (línea discontinua con triángulos) o ambos (línea discontinua con círculos) a lo largo del eje X en función del tiempo expresado en horas a lo largo del eje Y.

Figura 7B

Ilustra el porcentaje de supervivencia de ratas tras inyección de Estafilococo aureus (línea continua), Levamisol (Le) (línea discontinua con triángulos) o ambos (línea discontinua con círculos).

Figura 8

Ilustra la supervivencia de ratones tras inyección de E. coli con tratamiento de fosfatasa alcalina (línea discontinua) y sin fosfatasa alcalina (línea continua).

Referencias

1. Gajewski, J.L. et al . Transplantation 50, 244-249 (1990).

2. Lau, A.S. & Williams. B.R. J. Exp. Pathol. 5. 111-22 (1990).

3. Rietschel, E. Th. et al. en Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions (eds Nowothy, A., Spitzer, J.J. & Ziegler, E.J.) 15-32 (Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1990).

4. Peterson. A.A. & Munford, R.S. Infection and Immunity 55, 974-978 (1987).

5. Parrillo, J.E. et al. Ann. Intern. Med. 113, 227-242 (1990).

6. Ohlsson. K. et al. Nature 348. 550-552 (1990).

\global\parskip0.950000\baselineskip

7. MacSween. R.N.M., Whaley, K., (eds.): Muir's Textbook of Pathology, 13ª edición, Edward Arnold, London. Melbourne Auckland, capítulo 8, p. 279-337 (1992).

8. MacSween, R.N.M., Whaley, J. (eds).: Muir's Textbook of Pathology, 13ª edición. Edward Arnold, London, Melbourne Auckland, capítulo 3, p. 73-111 (1992).

9. Skarnes, R.C. en Handbook of Endotoxin. Vol. 3: Cellular Biology of Endotoxins (ed. Berry, L.J.), 56-81 (Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1985).

10. Johnson, K.J. et al. Am.J.Pathot. 88: 559-574, 1977.

11. Matsuura, S., Kishi, F. & Kajii, T. Biochem. and Biophys. Res. Comm. 168, 993-1000 (1990).

12. McComb, R.B., Bowers Jr. G.N. & Posen S. in Alkaline Phosphatase 865-902 (Plenum Press, New York, London, 1979).

13. Chikkappa, G. Exp. Hematol. 20. 388-390 (1992).

14. Kaplan, M.M. Hepatology 6. 526-528 (1986).

15. Stryer L., in Biochemistry (3ª ed.), p.275-277 (W.H. Freeman and Company, New York, 1988).

16. McComb, R.B. Bowers, G.N., Posen, S, en Alkaline Phosphatase, p.64-67 (Plenum Press, New York, London, 1979).

17. McComb, R.B., Bowers. G.N., Posen, S., en Alkaline Phosphatase, p.589-590 (Plenum Press, New York, London, 1979).

18. Chikkappa, G., Exp. Hematol. 20, 388-390, 1992.

19. Ashley, B.J.B., en Evans' Histological Appearances of Tumours (tercera edición), p.117-118 (Churchill Livingstone, Edinburgh, London, New York, 1978).

20. Goor van, H., Gerrits, P.O. & Hardonk, M.J. J. Histochem. and Cytochem. 37, 399-403 (1989).

21. Wachstein, M. & Meisel, E. Am. J. Clin. Pathol. 27, 13-23 (1957).

22. Brock, D.J. Lancet ii , 941-943 (1983).

23. Chandrarajan J., Klein L., Anal. Biochem. 72, 407-412 (1976).

24. Somlyo, B. et al. Int. J. Immureopharmacol. 14, 131-142 (1992).

25. Levin, J., Bang, F.B., Butt. Johns Hopkins Hosp. 115, 265-274 (1964).

26. Brozna, J.P. Semin. Thromb. Hemost. 16, 326-332 (1990).

27. Poelstra, K., Hardonk, M.J., Koudstaal, J. & Bakker, W.W. Kidney Int. 37. 1500-1508 (1990).

28. Scholtens. H.B., Hardonk, M.J., Meijer, D.K.F., Liver, 2, 1-13, (1982).

29. Rambaldi. A. et al. en Blood, Vol. 76, No. 12 (December 15), 1990: p. 2565-2571.

30. Yuo, A. et al., en Blood. Vol. 70, No. 2 (August), 1987: p.404-411.

31. Clubb, J.S., Neale, F.C. & Posen S. J. Lab. & Clin. Med. 66, 493-507 (1965).

32. Bos van den. T. & Beertsen, W. J. Biomed. Mat. Res. en press (1994).

33. Ecarot, B., et al. J. Bone Miner. Res. 7, 523-530 (1992).

34. McComb, R.B., Bowers, G.N., & Posen. S. en Alkaline phosphatase. Ch. 9 Clinical utilization of alklaline phosphatase measurements. p. 525-786 (Plenum Press, New York, London, 1979).

35. Ross, M.H. J. Nutr. 97, 565 (1969).

36. Kaplow. L.S. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2, 243, (1971).

37. Mueller, M., Kappas, A., & Damgaard, E. J. Clin. Invest. 43, 1905 (1964).

Claims

1. Uso de una proteína que exhibe actividad fosfatasa alcalina y capaz de desintoxicar endotoxinas, para la producción de un medicamento para el tratamiento o prevención de una condición patológica resultante de actividad endotóxica.

2. Uso según la reivindicación 1, donde la proteína que exhibe actividad fosfatasa alcalina es una fosfatasa alcalina de mamífero.

3. Uso según las reivindicaciones 1 o 2, donde la proteína que exhibe actividad fosfatasa alcalina es una fosfatasa alcalina humana.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la proteína que exhibe actividad fosfatasa alcalina es seleccionada del grupo consistente en fosfatasa alcalina placentaria, fosfatasa alcalina similar a la placentaria, fosfatasa alcalina intestinal y fosfatasa alcalina de hígado/hueso/riñón.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la proteína que exhibe actividad fosfatasa alcalina es una fosfatasa recombinante.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la proteína que exhibe actividad fosfatasa alcalina es químicamente modificada para incrementar su vida media en suero en comparación con una proteína no modificada correspondiente que exhiba actividad fosfatasa alcalina, por lo cual la vida media aumentada en suero es el resultado de una modificación química que impide su enlace a receptores de galactosa por reducción u oxidación de la galactosa terminal en la fosfatasa.

7. Método para desintoxicar endotoxina en una preparación in vitro, el método comprendiendo la fase de llevar la preparación en contacto con una proteína que exhibe actividad fosfatasa alcalina tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Método según la reivindicación 7, donde la preparación in vitro es una vacuna.