ES2240434T3

ES2240434T3 - Tripropaptinas antibioticas y procedimiento para producir las mismas.

Info

Publication number: ES2240434T3
Application number: ES01917554T
Authority: ES
Inventors: Tomio Takeuchi; Hideki Hashizume; Masayuki Igarashi; Hiroshi Naganawa; Masa Hamada
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2021-03-28
Also published as: AU2001244594A1; WO2001074850A1; EP1285928A1; DE60110908D1; US20030162697A1; ATE295852T1; DE60110908T2; EP1285928A4; EP1285928B1; US7271147B2; JP4054576B2

Abstract

Antibiótico, tripropeptina Z, tripropeptina A, tripropeptina B, tripropeptina C o tripropeptina D, que es un compuesto representado por la fórmula (I) general: en la que R es un grupo 7-metil-octilo para tripropeptina Z; un grupo 8-metil-nonilo para tripropeptina A; un grupo 9-metil-dodecilo para tripropeptina B; un grupo 10-metil-undecilo para tripropeptina C; y un grupo 11-metil-dodecilo para tripropeptina D, o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.

Description

Tripropeptinas antibióticas y procedimiento para producir las mismas.

Campo técnico

Esta invención se refiere a nuevos antibióticos, concretamente las tripropeptinas Z, A, B, C y D o sales farmacéuticamente aceptables de las mismas, que tienen cada una excelentes propiedades antibacterianas. Esta invención también se refiere a un procedimiento para producir una tripropeptina. Además, esta invención se refiere a una composición farmacéutica, particularmente una composición antibacteriana, que comprende una tripropeptina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma como principio activo. Todavía adicionalmente, esta invención se refiere a Lysobacter sp. BMK333-48F3, como nuevo microorganismo, que tiene la naturaleza característica de que puede producir una tripropeptina.

Antecedentes de la técnica

Como los antibióticos se utilizaron comúnmente, han aparecido ampliamente bacterias resistentes a múltiples fármacos, particularmente bacterias resistentes a meticilina y estas bacterias resistentes han provocado un problema clínico. Las bacterias resistentes a meticilina pueden mostrar una resistencia no sólo frente a meticilina sino también frente a muchos antibióticos, tales como antibióticos de aminoglucósidos, tetraciclinas, \beta-lactamas y macrólidos.

En los últimos años, han aparecido bacterias resistentes a fármacos incluso frente a vancomicina, que es un antibiótico conocido como la última carta que queda para el tratamiento de infecciones de las bacterias resistentes a meticilina. Por tanto, ahora existe una petición entusiasta para encontrar y proporcionar un compuesto novedoso que pueda mostrar excelentes actividades antibacterianas frente a las bacterias resistentes a fármacos, particularmente las bacterias resistentes a meticilina y las bacterias resistentes a vancomicina.

Un objeto de esta invención es proporcionar un antibiótico novedoso que tenga excelentes actividades antibacterianas y pueda cumplir los requisitos mencionados anteriormente.

Descripción de la invención

Los inventores de esta invención han llevado a cabo sus investigaciones con la intención de descubrir antibióticos útiles. Como resultado, se ha encontrado inicialmente que una nueva cepa bacteriana, Lysobacter sp. BMK333-48F3, que pertenece al género Lysobacter y que se ha aislado de una muestra de suelo, puede producir un antibiótico novedoso que tiene elevadas actividades antibacterianas frente a bacterias gram-positivas y sus bacterias resistentes a fármacos. Se ha designado este antibiótico novedoso como tripropeptina. Aunque esta tripropeptina está en la forma de polvos incoloros cuya estructura química no se ha determinado, la tripropeptina se ha aislado como una sustancia que tiene una fórmula molecular de C_{51}H_{83}N_{11}O_{19} (solicitud de patente japonesa 2000-93405 presentada el 30 de marzo de 2000). Se ha avanzado adicionalmente con los estudios y se ha encontrado ahora que, además de la tripropeptina mencionada anteriormente, dicha cepa Lysobacter sp. BMK333-48F3 produce cuatro antibióticos más. Se han designado ahora estos cinco antibióticos, incluyendo la tripropeptina y los cuatro últimos antibióticos, colectivamente, como tripropeptina. Se ha encontrado ahora que una tripropeptina muestra elevadas actividades antibacterianas frente a bacterias gram-positivas y sus bacterias resistentes a fármacos. Se ha avanzado adicionalmente con los estudios y se ha confirmado ahora, a partir del análisis fisicoquímico de las tripropeptinas, que hay cinco compuestos que se engloban en una clase de tripropeptinas. Como resultado se le ha dado un nuevo nombre a la tripropeptina obtenida previamente, como tripropeptina C y también se han designado éstos cuatro compuestos obtenidos ahora, como tripropeptinas Z, A, B y D, respectivamente. Se han determinado ahora las estructuras químicas de estos cinco compuestos. Además, se ha confirmado y encontrado ahora que las tripropeptinas Z, A, B, C y D son compuestos novedosos que están representados colectivamente por una fórmula (I) general facilitada más adelante. Además, se revela que estas tripropeptinas tienen una estructura principal común y básica, tal como se muestra en la fórmula (I) general, en la que el grupo R de cadena lateral indica grupos alquilo ramificados de 8 a 12 átomos de carbono, distintos entre sí.

Por tanto, según un primer aspecto de esta invención, se proporciona un antibiótico, tripropeptina Z, tripropeptina A, tripropeptina B, tripropeptina C o tripropeptina D, que es un compuesto representado por la siguiente fórmula (I) general

1

en la que R es un grupo 7-metil-octilo para tripropeptina Z; un grupo 8-metil-nonilo para tripropeptina A; un grupo 9-metil-dodecilo para tripropeptina B; un grupo 10-metil-undecilo para tripropeptina C; y un grupo 11-metil-dodecilo para tripropeptina D, o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.

Una tripropeptina de la fórmula (I) general según el primer aspecto de esta invención engloba tripropeptina Z de fórmula (Iz), tripropeptina A de fórmula (Ia), tripropeptina B de fórmula (Ib), tripropeptina C de fórmula (Ic) y tripropeptina D de fórmula (Id), tal como se muestra a continuación:

(1) Tripropeptina Z representada por la fórmula (Iz):

2

[Compuesto de la fórmula (I) general en el que R es un grupo 7-metil-octilo];

(2) Tripropeptina A representada por la fórmula (Ia):

3

[Compuesto de la fórmula (I) general en el que R es un grupo 8-metil-nonilo];

(3) Tripropeptina B representada por la fórmula (Ib):

4

[Compuesto de la fórmula (I) general en el que R es un grupo 9-metil-decilo];

(4) Tripropeptina C representada por la fórmula (Ic):

5

[Compuesto de la fórmula (I) general en el que R es un grupo 10-metil-undecilo]; y

(5) Tripropeptina D representada por la fórmula (Id):

6

[Compuesto de la fórmula (I) general en el que R es un grupo 11-metil-dodecilo].

Las propiedades fisicoquímicas de la tripropeptina Z de fórmula (Iz) según el primer aspecto de esta invención son las siguientes:

(1): Aspecto

: Polvo incoloro

(2): Fórmula molecular

: C_{48}H_{77}N_{11}O_{19}

(3): Espectrometría de masas de alta resolución (HRFABMS: modo catiónico)

: Hallado: 1112,5475 (M + H)^{+}

: Calculado: 1112,5490

(4): Rotación específica

: [\alpha]_{D}^{24} -14,0º (c 1, CH_{3}OH)

(5): Espectro de absorción ultravioleta (en metanol)

: \lambda_{max} nm (\varepsilon): absorción final

(6): Espectro de absorción infrarroja

: Tal como se muestra en la figura 1 de los dibujos adjuntos.

(7): Espectro de resonancia magnética nuclear de protón

: El espectro de RMN de protón medido en DMSO-d_{6} - D_{2}O (20 : 1) a 500 MHz, a temperatura ambiente, se muestra en la figura 2 de los dibujos adjuntos.

(8): Espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C

: El espectro de RMN de ^{13}C medido en DMSO-d_{6} - D_{2}O (20 : 1) a 125 MHz, a temperatura ambiente, se muestra en la figura 3 de los dibujos adjuntos.

(9): Solubilidad

: Soluble en metanol, dimetilsulfóxido (DMSO) y agua, pero insoluble en acetona, acetato de etilo y cloroformo.

(10): CCF

: Cuando se somete a una cromatografía en capa fina sobre gel de sílice 60F_{254} (un producto de Merck % Co.), desarrollado con un disolvente que consiste en butanol-metanol-agua (4 : 1 : 2), el valor de R_{f} es de 0,25.

La tripropeptina Z según el primer aspecto de esta invención es una sustancia anfótera y pueden ponerse como ejemplos de las sales farmacéuticamente aceptables de la misma sus sales con bases orgánicas tales como sales de amonio cuaternario, sus sales con diversos metales, por ejemplo, sus sales con metales alcalinos tales como la sal de sodio, o sus sales de adición de ácido con ácidos orgánicos tales como ácido acético o con un ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico.

Las propiedades fisicoquímicas de la tripropeptina A de fórmula (Ia) según el primer aspecto de esta invención son las siguientes:

(1): Aspecto

: Polvo incoloro

(2): Fórmula molecular

: C_{49}H_{79}N_{11}O_{19}

: Hallado: 1126,5632 (M + H)^{+}

: Calculado: 1126,5657

(4): Rotación específica

: [\alpha]_{D}^{24} -7,8º (c 1, CH_{3}OH)

(5): Espectro de absorción ultravioleta (en metanol)

: \lambda_{max} nm (\varepsilon): absorción final

(6): Espectro de absorción infrarroja

: Tal como se muestra en la figura 4 de los dibujos adjuntos.

(7): Espectro de resonancia magnética nuclear de protón

: El espectro de RMN de protón medido en una mezcla de disolventes de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20 : 1) a 500 MHz, a temperatura ambiente, se muestra en la figura 5 de los dibujos adjuntos.

(8): Espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C

: El espectro de RMN de ^{13}C medido en una mezcla de disolventes de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20 : 1) a 125 MHz, a temperatura ambiente, se muestra en la figura 6 de los dibujos adjuntos.

(9): Solubilidad

: Soluble en metanol, DMSO y agua, pero insoluble en acetona, acetato de etilo y cloroformo.

(10): CCF

La tripropeptina A según el primer aspecto de esta invención es una sustancia anfótera y pueden ponerse como ejemplos de las sales farmacéuticamente aceptables de la misma sus sales con bases orgánicas tales como sales de amonio cuaternario, sus sales con diversos metales, por ejemplo, sus sales con metales alcalinos tales como la sal de sodio, o sus sales de adición de ácido con ácidos orgánicos tales como ácido acético o con un ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico.

Las propiedades fisicoquímicas de la tripropeptina C de fórmula (Ib) según el primer aspecto de esta invención son las siguientes:

(1): Aspecto

: Polvo incoloro

(2): Fórmula molecular

: C_{50}H_{81}N_{11}O_{19}

: Hallado: 1140,5588 (M + H)^{+}

: Calculado: 1140,5776

(4): Rotación específica

: [\alpha]_{D}^{24} -7,9º (c 1, CH_{3}OH)

(5): Espectro de absorción ultravioleta (en metanol)

: \lambda_{max} nm (\varepsilon): absorción final

(6): Espectro de absorción infrarroja

: Tal como se muestra en la figura 7 de los dibujos adjuntos.

(7): Espectro de resonancia magnética nuclear de protón

: El espectro de RMN de protón medido en una mezcla de disolventes de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20 : 1) a 500 MHz, a temperatura ambiente, se muestra en la figura 8 de los dibujos adjuntos.

(8): Espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C

: El espectro de RMN de ^{13}C medido en una mezcla de disolventes de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20 : 1) a 125 MHz, a temperatura ambiente, se muestra en la figura 9 de los dibujos adjuntos.

(9): Solubilidad

(10): CCF

La tripropeptina B según el primer aspecto de esta invención es una sustancia anfótera y pueden ponerse como ejemplos de las sales farmacéuticamente aceptables de la misma sus sales con bases orgánicas tales como sales de amonio cuaternario, sus sales con diversos metales, por ejemplo, sus sales con metales alcalinos tales como la sal de sodio, o sus sales de adición de ácido con ácidos orgánicos tales como ácido acético o con un ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico.

Las propiedades fisicoquímicas de la tripropeptina C de fórmula (Ic) según el primer aspecto de esta invención son las siguientes:

(1): Aspecto

: Polvo incoloro

(2): Fórmula molecular

: C_{51}H_{83}N_{11}O_{19}

: Hallado: 1154,5927 (M + H)^{+}

: Calculado: 1154,5945

(4): Rotación específica

: [\alpha]_{D}^{24} -8,4º (c 1, CH_{3}OH)

(5): Espectro de absorción ultravioleta (en metanol)

: \lambda_{max} nm (\varepsilon): absorción final

(6): Espectro de absorción infrarroja

: Tal como se muestra en la figura 10 de los dibujos adjuntos.

(7): Espectro de resonancia magnética nuclear de protón

: El espectro de RMN de protón medido en una mezcla de disolventes de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20 : 1) a 500 MHz, a temperatura ambiente, se muestra en la figura 11 de los dibujos adjuntos.

(8): Espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C

: El espectro de RMN de ^{13}C medido en una mezcla de disolventes de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20 : 1) a 125 MHz, a temperatura ambiente, se muestra en la figura 12 de los dibujos adjuntos.

(9): Solubilidad

(10): CCF

La tripropeptina C según el primer aspecto de esta invención es una sustancia anfótera y pueden ponerse como ejemplos de las sales farmacéuticamente aceptables de la misma sus sales con bases orgánicas tales como sales de amonio cuaternario, sus sales con diversos metales, por ejemplo, sus sales con metales alcalinos tales como la sal de sodio, o sus sales de adición de ácido con ácidos orgánicos tales como ácido acético o con un ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico.

Las propiedades fisicoquímicas de la tripropeptina D de fórmula (Id) según el primer aspecto de esta invención son las siguientes:

(1): Aspecto

: Polvo incoloro

(2): Fórmula molecular

: C_{52}H_{85}N_{11}O_{19}

: Hallado: 1168,6101 (M + H)^{+}

: Calculado: 1168,6074

(4): Rotación específica

: [\alpha]_{D}^{24} -13,8º (c 1, CH_{3}OH)

(5): Espectro de absorción ultravioleta (en metanol)

: \lambda_{max} nm (\varepsilon): absorción final

(6): Espectro de absorción infrarroja

: Tal como se muestra en la figura 13 de los dibujos adjuntos.

(7): Espectro de resonancia magnética nuclear de protón

: El espectro de RMN de protón medido en una mezcla de disolventes de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20 : 1) a 500 MHz, a temperatura ambiente, se muestra en la figura 14 de los dibujos adjuntos.

(8): Espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C

: El espectro de RMN de ^{13}C medido en una mezcla de disolventes de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20 : 1) a 125 MHz, a temperatura ambiente, se muestra en la figura 15 de los dibujos adjuntos.

(9): Solubilidad

(10): CCF

La tripropeptina D según el primer aspecto de esta invención es una sustancia anfótera y pueden ponerse como ejemplos de las sales farmacéuticamente aceptables de la misma sus sales con bases orgánicas tales como sales de amonio cuaternario, sus sales con diversos metales, por ejemplo, sus sales con metales alcalinos tales como la sal de sodio, o sus sales de adición de ácido con ácidos orgánicos tales como ácido acético o con un ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico.

A propósito, la expresión "una tripropeptina" dada sencillamente en esta descripción puede significar algunas veces o bien cualquiera de tripropeptina Z, tripropeptina A, tripropeptina B, tripropeptina C y tripropeptina D, o bien una mezcla de dos o más o una mezcla de todas ellas.

Las tripropeptinas que tienen la fórmula (I) general anterior según esta invención tienen propiedades biológicas que se facilitan más adelante en el presente documento.

Por tanto, la tripropeptina Z, tripropeptina A, tripropeptina B, tripropeptina C y tripropeptina D muestran cada una actividades antibacterianas frente a bacterias gram-positivas, incluyendo cepas resistentes a fármacos (cepas resistentes a meticilina y otras). Las actividades antibacterianas de una tripropeptina frente a estas bacterias se prueban mediante los procedimientos siguientes.

Ejemplo 1 de prueba

Se midieron las concentraciones inhibitorias mínimas del crecimiento (\mug/ml) de tripropeptina Z frente a una variedad de microorganismos en un medio agar Mueller-Hinton (fabricado por Difco Laboratories) o en un medio agar Mueller-Hinton complementado con un 5% de sangre de oveja (fabricado por Difco Laboratories) para Enterococcus, mediante un método de dilución en serie, según el método habitual proporcionado por la Sociedad Japonesa de Quimioterapia. Los espectros antibacterianos resultantes se muestran en la tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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Ejemplo 2 de prueba

Se midieron las concentraciones inhibitorias mínimas del crecimiento (\mug/ml) de tripropeptina A frente a una variedad de microorganismos en un medio agar Mueller-Hinton (fabricado por Difco Laboratories) o en un medio agar Mueller-Hinton complementado con un 5% de sangre de oveja (fabricado por Difco Laboratories) para Enterococcus, mediante un método de dilución en serie, según el método habitual proporcionado por la Sociedad Japonesa de Quimioterapia. Los espectros antibacterianos resultantes se muestran en la tabla 2.

TABLA 2

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Ejemplo 3 de prueba

Se midieron las concentraciones inhibitorias mínimas del crecimiento (\mug/ml) de tripropeptina B frente a una variedad de microorganismos en un medio agar Mueller-Hinton (fabricado por Difco Laboratories) o en un medio agar Mueller-Hinton complementado con un 5% de sangre de oveja (fabricado por Difco Laboratories) para Enterococcus, mediante un método de dilución en serie, según el método habitual proporcionado por la Sociedad Japonesa de Quimioterapia. Los espectros antibacterianos resultantes se muestran en la tabla 3.

TABLA 3

9

Ejemplo 4 de prueba

Se midieron las concentraciones inhibitorias mínimas del crecimiento (\mug/ml) de tripropeptina C frente a una variedad de microorganismos en un medio agar Mueller-Hinton (fabricado por Difco Laboratories) o en un medio agar Mueller-Hinton complementado con un 5% de sangre de oveja (fabricado por Difco Laboratories) para Enterococcus, mediante un método de dilución en serie, según el método habitual proporcionado por la Sociedad Japonesa de Quimioterapia. Los espectros antibacterianos resultantes se muestran en la tabla 4.

TABLA 4

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Ejemplo 5 de prueba

Se midieron las concentraciones inhibitorias mínimas del crecimiento (\mug/ml) de tripropeptina D frente a una variedad de microorganismos en un medio agar Mueller-Hinton (fabricado por Difco Laboratories) o en un medio agar Mueller-Hinton complementado con un 5% de sangre de oveja (fabricado por Difco Laboratories) para Enterococcus, mediante un método de dilución en serie, según el método habitual proporcionado por la Sociedad Japonesa de Quimioterapia. Los espectros antibacterianos resultantes se muestran en la tabla 5.

TABLA 5

11

Además, según un segundo aspecto de esta invención, se proporciona un procedimiento para la producción de los antibióticos, tripropeptina Z, tripropeptina A, tripropeptina B, tripropeptina C y/o tripropeptina D, representados por la fórmula (I) general facilitada anteriormente, caracterizado porque el procedimiento comprende cultivar una cepa bacteriana que pertenezca al género Lysobacter y que pueda producir al menos una de tripropeptina Z, tripropeptina A, tripropeptina B, tripropeptina C y tripropeptina D, representadas por la fórmula (I) general, y recuperar al menos una de las tripropeptinas Z, A, B, C y D del cultivo resultante.

El microorganismo o cepa microbiana, que puede producir el antibiótico, una tripropeptina y puede utilizarse en el procedimiento según el segundo aspecto de esta invención, puede ser cualquier cepa de aquellos microorganismos que tienen la capacidad de producir dichos antibióticos que poseen las propiedades fisicoquímicas y las propiedades biológicas mencionadas anteriormente, y puede elegirse de entre una amplia variedad de microorganismos. Entre tales microorganismos que pueden utilizarse, puede citarse una cepa bacteriana a la que se adjudica un número de cepa BMK333-48F3 y que se aisló de una muestra de suelo de Naha-city, Okinawa-ken, Japón, por su Instituto de Investigación de Química Microbiana en diciembre de 1994, como un ejemplo concreto preferido del microorganismo que puede producir los antibióticos, tripropeptinas.

Las propiedades microbiológicas de la cepa BMK333-48F3 se describirán ahora a continuación.

1. Morfología

La cepa BMK333-48F3 eran bastones gram-negativos de los cuales las dimensiones de la célula eran de aproximadamente 0,5 a 0,8 x 1,6 a 2,0 \mum. No se observó polimorfismo de la célula. La célula no tenía flagelos. Pero la célula tenía una motilidad deslizante.

2. Características de crecimiento en diversos medios de cultivo

Todas las pruebas se llevaron a cabo a 30ºC, excepto en el cultivo por picadura en caldo de gelatina.

(1) Cultivo en placa en caldo agar

Las colonias eran sumamente viscosas, translúcidas y brillantes, y mostraban un color amarillo pálido. No se observó pigmento difusible.

(2) Caldo de cultivo líquido

Un día después del inicio del cultivo, se observó un ligero crecimiento de la cepa, pero dos días después del inicio del cultivo, se observó la precipitación de la cepa en el fondo del tubo de ensayo.

(3) Cultivo por picadura en caldo de gelatina

En el cultivo a 20ºC, la licuación comenzó desde aproximadamente tres días después del inicio del cultivo y fue casi completa en 37 días tras el inicio del cultivo. En el cultivo a 30ºC, la licuación comenzó desde las 24 horas tras el inicio del cultivo y se completó en 7 días tras el inicio del cultivo.

(4) Leche

Se observó coagulación desde aproximadamente 7 días tras el inicio del cultivo, y la peptonización fue completa en 20 días tras el inicio del cultivo. La coagulación avanzó en condiciones ácidas.

3. Propiedades fisiológicas (la temperatura de cultivo fue de 30ºC en todos los casos, a menos que se especifique lo contrario)

(1): Tinción Gram: negativa

(2): Reducción de nitrato: positiva

(3): Desnitrificación (según un método de Kogamata et al.,: Classification and Identification of Microorganisms, editado por Takeji Hasegawa, página 223, editorial de la Universidad de Tokio, 1975): negativa

(4): Prueba MR (rojo de metilo): negativa

(5): prueba V-P (de Voges-Proskauer): negativa

(6): Producción de indol: negativa

(7): Producción de sulfuro de hidrógeno: negativa

(8): Utilización de ácido cítrico:

: En medio de Koser, negativa

: En medio de Christensen, negativa

(9): Utilización de fuentes de nitrógeno inorgánico:

: Para nitrato de sodio, negativa

: Para sulfato de amonio, negativa

(10): Formación de pigmento:

: No se observó pigmento soluble ni en medio King A ni en medio King B.

(11): Ureasa (en un medio de urea, proporcionado por Eiken Chemical): negativa

(12): Oxidasa: positiva

(13): Catalasa: positiva

(14): Intervalo de crecimiento:

: Se observó el crecimiento de la cepa a un pH en el intervalo de 6,0 a 9,0 y el pH óptimo es de 6,0 a 8,0. Además, se observó el crecimiento de la cepa a una temperatura en el intervalo de 27ºC a 37ºC, y la temperatura de crecimiento óptima fue de 24ºC a 30ºC.

(15): Comportamiento para el oxígeno: aerobia

(16): Prueba O-F (oxidación-fermentación, según el método de Hugh Leifson):

: Forma ligeramente oxidativa

(17): La formación de ácidos y gases procedentes de sacáridos (en el medio basal):

: A partir de glucosa, arabinosa, maltosa y trehalosa, se observó la producción de una pequeña cantidad de ácidos. Sin embargo, a partir de D-xilosa, D-manosa, D-fructosa, D-galactosa, sacarosa, D-sorbitol, D-manitol, inositol, glicerol y almidón, no se observó la producción de ningún ácido. Además, no se observó la producción de gases a partir de ninguno de los sacáridos.

(18): Hidrólisis de caseína: positiva

(19): Hidrólisis de esculina: positiva

(20): Resistencia al ácido: no resistente al ácido

4. Propiedades quimiotaxonómicas (1) Composición de bases (contenido G + C) del ADN: 70,5%

Resumiendo las propiedades mencionadas anteriormente de la cepa BMK333-48F3, esta cepa se caracterizó porque eran bastones aerobios gram-negativos, no tenía flagelos ni esporas, tenía una motilidad deslizante y no era resistente al ácido; porque el crecimiento de la cepa en medio agar era translúcido y sumamente viscoso; porque las dimensiones de la célula eran de aproximadamente 0,5 a 0,8 x 1,6 a 2,0 \mum; porque la cepa creció en un pH en el intervalo de pH 6 a 9; porque la cepa creció a una temperatura en el intervalo de 27ºC a 37ºC, y la temperatura de crecimiento óptima fue de 24ºC a 30ºC; y porque la cepa tenía un contenido de (G + C) de su ADN que era del 70,5%.

En vista de estas propiedades anteriores, se supone que la cepa BMK333-48F3 pertenece al género Lysobacter. Así, se ha designado la cepa BMK333-48F3 como Lysobacter sp. BMK333-48F3.

Además, la cepa BMK333-48F3 se ha depositado en el depósito japonés autorizado, el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Tecnología y Ciencia Industrial Avanzada, Agencia del Ministerio de Economía, Comercio e Industria, situado en nº 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-City, Ibaraki-ken, Japón, con el número de depósito FERMP-17741 el 22 de febrero de 2000. Esta cepa se ha depositado ahora con el número de depósito "FERM BP-7477" desde el 2 de marzo de 2001 en dicho Instituto Nacional, transferida bajo los términos del tratado de Budapest.

Según el procedimiento del segundo aspecto de esta invención, la producción del antibiótico, una tripropeptina, puede llevarse a cabo tal como se describe a continuación.

Por tanto, la producción del antibiótico, una tripropeptina, puede llevarse a cabo inoculando una cepa microbiana que pueda producir una tripropeptina, preferiblemente la cepa Lysobacter sp. BMK333-48F3 en un medio de nutrientes, y cultivando dicha cepa microbiana a una temperatura de 27ºC con agitación, en condiciones aerobias, para producir el cultivo que contiene las tripropeptinas antibióticas. Como el medio de nutrientes que va a utilizarse para este fin, puede utilizarse cualquier medio de nutrientes que pueda usarse para el cultivo de microorganismos. Como fuentes de nutrientes, pueden utilizarse fuentes de nitrógeno tales como peptona, extracto de levadura, extracto de carne, harina de semilla de algodón y sulfato de amonio que están disponibles comercialmente. Como fuentes de carbono, pueden utilizarse hidratos de carbono tales como glicerina, almidón, glucosa, galactosa, dextrina y grasas. Además, pueden utilizarse sales inorgánicas como cloruro de sodio y carbonato de calcio, como aditivos. Si es necesario, pueden añadirse otros aditivos, por ejemplo, sales metálicas en cantidades muy pequeñas. Estas sustancias de aditivo pueden ser cualquiera de aquellos materiales que se utilizan para una cepa que produce tripropeptina y son útiles para la producción de tripropeptinas antibióticas, y que se sabe que pueden utilizarse en los medios de cultivo para el cultivo de microorganismos.

Para la producción de tripropeptinas antibióticas, puede utilizarse un microorganismo que tenga capacidad para producir tripropeptinas antibióticas. Específicamente, se ha confirmado que la cepa Lysobacter sp. BMK333-48F3 como aislado produce las tripropeptinas antibióticas. Es posible aislar cualquier otra cepa que pueda producir dichos antibióticos, de la naturaleza empleando cualquier técnica de aislamiento conocida que esté disponible para el aislamiento de las cepas que producen antibióticos. Todavía está disponible una técnica tal, mediante la cual se mejora la capacidad de una cepa que produce tripropeptina, incluyendo la cepa Lysobacter sp. BMK333-48F3, para producir tripropeptinas antibióticas, sometiendo a tal cepa a un tratamiento de mutación con una radiación radiactiva u otras. Además, las tripropeptinas antibióticas pueden producirse mediante una técnica de ingeniería genética.

Los antibióticos, tripropeptinas, se producen cultivando aeróbicamente una cepa que produce tripropeptina que pertenece al género Lysobacter en un medio de cultivo adecuado y recogiendo la(s) tripropeptina(s) deseada(s) del caldo de cultivo resultante. La temperatura de cultivo puede estar en el intervalo de temperaturas a las que pueden producirse los antibióticos deseados sin evitar sustancialmente el crecimiento de la cepa que produce la tripropeptina utilizada. La temperatura de cultivo puede elegirse apropiadamente dependiendo de la naturaleza de la cepa que produce tripropeptina utilizada, y una temperatura de cultivo preferida está en un intervalo de 25 a 30ºC.

La producción de las tripropeptinas antibióticas por la cepa Lysobacter sp. BMK333-48F3 puede alcanzar normalmente un máximo en de 2 a 4 días de cultivo de la cepa. Sin embargo, en general, el cultivo de la cepa se continúa hasta que se confiere una actividad antibacteriana suficiente al menos de cultivo. El cambio dependiente del tiempo en el título de las tripropeptinas en el caldo de cultivo resultante puede medirse mediante un método de HPLC o mediante un método de placa de cilindros en el que se utiliza Staphylococcus aureus o Bacillus stearothermophilus como cepa de ensayo.

En el procedimiento del segundo aspecto de la invención, las tripropeptinas se recuperan del caldo de cultivo que se ha obtenido como anteriormente, y en el que se han producido y acumulado las tripropeptinas. Como el método para recuperar y aislar la(s) tripropeptina(s) deseada(s), puede utilizarse apropiadamente cualquiera de los métodos de rutina que se usan convencionalmente para el aislamiento de metabolito(s) producidos por microorganismos. Por ejemplo, un método para la extracción con un disolvente orgánico inmiscible con agua y un método para utilizar la diferencia de afinidades de adsorción de las tripropeptinas sobre diversos adsorbentes, tal como un método para la filtración en gel y un método cromatográfico con distribución a contracorriente, etc., individualmente o en combinación, con el fin de recuperar tripropeptina(s) del sobrenadante del caldo de cultivo. Además, a partir de las células microbianas de la cepa así separada del caldo de cultivo, es posible recuperar tripropeptina(s) sometiendo las células microbianas a una extracción con disolventes con un disolvente orgánico adecuado, o mediante un método que comprenda la ruptura de las células microbianas y la elución de la(s) tripropeptina(s) deseada(s) desde las células rotas mediante extracción; y luego es posible aislar y purificar la(s) tripropeptina(s) así recuperada(s). Por tanto, pueden recogerse una o más de las tripropeptinas antibióticas. Casualmente, puede realizarse el aislamiento de las tripropeptinas Z, A, B, C y D unas de otras mediante una cromatografía en columna (véase el ejemplo 1 descrito anteriormente).

Además, según un tercer aspecto de esta invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende como principio activo al menos una de las tripropeptinas Z, A, B, C y D representadas por la fórmula (I) general o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas, en mezcla con un vehículo o vehículos farmacéuticamente acepta-
bles.

La composición farmacéutica según el tercer aspecto de esta invención puede estar en la forma de una composición que comprende como principio activo un compuesto de la fórmula (I) general, en mezcla con un vehículo convencional, sólido o líquido, farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, almidón, azúcar, etanol, agua, solución salina fisiológica, etcétera.

Las tripropeptina(s) de fórmula (I) general o una sal de las mismas, que va o van a utilizarse en la composición farmacéutica según el tercer aspecto de esta invención, puede administrarse por vía oral o por vía parenteral mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o mediante administración intraperitoneal o intrarrectal, etcétera.

Para las administraciones orales, la composición farmacéutica según el tercer aspecto de esta invención puede formularse en la forma de preparaciones tales como polvo, comprimidos, cápsulas, suspensión, jarabe y similares, mezclando el principio activo, concretamente una tripropeptina de fórmula (I) general o una sal de la misma, con un vehículo convencional, sólido o líquido, farmacéuticamente aceptable.

La proporción del compuesto de fórmula (I) general que se incorpora como principio activo en la composición farmacéutica del tercer aspecto de esta invención puede variar dependiendo del tipo de las preparaciones, pero una proporción conveniente de una tripropeptina puede estar en el intervalo de aproximadamente el 2 al 90%, basado en el peso de la unidad de dosificación individual de la composición.

En los casos en los que la composición farmacéutica del tercer aspecto de esta invención se formula en inyecciones, una forma preferible de preparaciones inyectables puede incluir una disolución acuosa esterilizada o una preparación esterilizada y liofilizada que contiene el compuesto de la fórmula (I) general como principio activo. Como ejemplos de los vehículos líquidos que pueden utilizarse para este fin, se prefieren agua, solución salina fisiológica, etanol acuoso, glicerol, propilenglicol, aceite vegetal y similares.

La dosis de una tripropeptina de la fórmula (I) general o una sal de la misma utilizada como principio activo en la composición de esta invención, puede variar dependiendo de la naturaleza de las infecciones bacterianas que vayan a tratarse, el fin del tratamiento terapéutico, el grado de los estados del paciente, etcétera. Sin embargo, una dosis óptima de una tripropeptina puede decidirse por los expertos a través de pruebas preliminares adecuadas. A propósito, la tripropeptina C no muestra ninguna toxicidad en ratones (tipo ICR, 4 semanas de edad, machos), cuando se administra por vía intravenosa a una dosis de 300 mg/kg.

Según un cuarto aspecto de esta invención, se proporciona además, como microorganismo novedoso, una cepa Lysobacter sp. BMK333-48F3 que tiene la naturaleza característica de que puede producir tripropeptinas de fórmula (I) general anterior, y que puede identificarse como la cepa que se ha depositado en un depósito japonés, el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Tecnología y Ciencia Industrial Avanzada, Agencia del Ministerio de Economía, Comercio e Industria, con el número de depósito de FERM BP-7477, bajo los términos del tratado de Budapest.

Breve descripción de los dibujos adjuntos

La figura 1 es un espectro de absorción infrarroja de tripropeptina Z medido mediante el método de la pastilla de KBr.

La figura 2 es un espectro de resonancia magnética nuclear de protón de tripropeptina Z medido en una disolución de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20: 1), a 500 MHz, a temperatura ambiente.

La figura 3 es un espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C de tripropeptina Z medido en una disolución de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20: 1), a 125 MHz, a temperatura ambiente.

La figura 4 es un espectro de absorción infrarroja de tripropeptina A medido mediante el método de la pastilla de KBr.

La figura 5 es un espectro de resonancia magnética nuclear de protón de tripropeptina A medido en una disolución de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20: 1), a 500 MHz, a temperatura ambiente.

La figura 6 es un espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C de tripropeptina A medido en una disolución de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20: 1), a 125 MHz, a temperatura ambiente.

La figura 7 es un espectro de absorción infrarroja de tripropeptina B medido mediante el método de la pastilla de KBr.

La figura 8 es un espectro de resonancia magnética nuclear de protón de tripropeptina B medido en una disolución de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20: 1), a 500 MHz, a temperatura ambiente.

La figura 9 es un espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C de tripropeptina B medido en una disolución de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20: 1), a 125 MHz, a temperatura ambiente.

La figura 10 es un espectro de absorción infrarroja de tripropeptina C medido mediante el método de la pastilla de KBr.

La figura 11 es un espectro de resonancia magnética nuclear de protón de tripropeptina C medido en una disolución de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20: 1), a 500 MHz, a temperatura ambiente.

La figura 12 es un espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C de tripropeptina C medido en una disolución de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20: 1), a 125 MHz, a temperatura ambiente.

La figura 13 es un espectro de absorción infrarroja de tripropeptina D medido mediante el método de la pastilla de KBr.

La figura 14 es un espectro de resonancia magnética nuclear de protón de tripropeptina D medido en una disolución de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20: 1), a 500 MHz, a temperatura ambiente.

La figura 15 es un espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C de tripropeptina D medido en una disolución de DMSO-d_{6} - D_{2}O (20: 1), a 125 MHz, a temperatura ambiente.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Esta invención se ilustra ahora con más detalle con referencia al siguiente ejemplo.

Ejemplo 1

Se inoculó una cepa, Lysobacter sp. BMK333-48F3 (depositada con el número de registro de FERM BP-7477), que se había cultivado en medio de cultivo inclinado de agar, en un medio de cultivo estéril. El medio de cultivo estéril utilizado en el presente documento se había preparado colocando en matraces Erlenmeyer (de 500 ml de capacidad cada uno) porciones de 110 ml de un medio de cultivo líquido que comprende un 1,5% de glicerina, un 1,5% de harina de semilla de algodón, un 0,3% de cloruro de sodio y un 0,5% de L-glutamato sódico (ajustado a un pH de 7,4) y esterilizando el medio de cultivo en los matraces de la manera habitual, antes de que se realizara la inoculación de la cepa BMK333-48F3. Entonces, se incubó el medio de cultivo líquido así inoculado, con agitación a 27ºC, durante 24 horas, para producir así un caldo de cultivo de siembra pretendido.

Además, en matraces Erlenmeyer (de 500 ml de capacidad cada uno) se colocaron porciones de 110 ml de un medio de cultivo líquido que comprende un 1,5% de glicerina, un 1,5% de harina de semilla de algodón, un 0,3% de cloruro de sodio y un 0,5% de L-glutamato sódico (ajustado a un pH de 7,4) seguido por y esterilizando de la manera habitual. El medio de cultivo líquido así preparado se utilizó como medio de cultivo productivo. A 50 litros de este medio de cultivo productivo, se inoculó una proporción del 2% del medio de cultivo de siembra mencionado anteriormente, y luego se realizó un cultivo con agitación, con rotación a 27ºC, durante 2 días.

El caldo de cultivo así obtenido se centrifugó para separarlo en el filtrado del caldo de cultivo y las células microbianas cultivadas. Las células microbianas cultivadas se extrajeron con 10 litros de metanol y, posteriormente, el extracto metanólico se concentró a presión reducida. La disolución concentrada resultante se combino junto con dicho filtrado del caldo de cultivo y se hicieron pasar 50 litros de la mezcla resultante a través de una columna que comprendía 6 litros de una resina adsorbente sintética compuesta por un copolímero de poliestireno-divinilbenceno poroso, concretamente resina "Diaion HP-20" (un producto de Mitsubishi Chemical Co., Japón), mediante lo cual se adsorbieron las tripropeptinas en la resina Diaion HP-20. A través de esta columna de resina Diaion HP-20 que contenía las tripropeptinas adsorbidas, se hicieron pasar 18 litros de agua desionizada, metanol acuoso al 50% y acetona acuosa al 65%, en orden. El eluato obtenido eluyendo dicha columna con la acetona acuosa al 65%, es una fracción activa y este eluato se concentró hasta sequedad a presión reducida, mediante lo cual se obtuvieron 30 g de un extracto sólido que contiene las tripropeptinas. Este extracto sólido bruto que contiene las tripropeptinas se colocó en la parte superior de una columna de gel de sílice (disponible comercialmente de Merck Co., EE.UU.) (1500 ml) y se cromatografió sucesivamente con las mezclas de disolventes de cloroformo-metanol-agua (10 : 5 : 1) y butanol-metanol-agua (4 : 1 : 2). Estas fracciones activas se recogieron y concentraron, mediante lo cual se obtuvieron 10,8 g de un producto sólido parcialmente purificado que contiene las tripropeptinas. Este producto parcialmente purificado se llevó a metanol acuoso al 50% y la disolución resultante se hizo pasar a través de una columna (250 ml) que comprendía una resina adsorbente sintética, aromática, resina "Diaion CHP20P" (un producto de Mitsubishi Chemical Co., Japón), mediante lo cual se adsorbieron las tripropeptinas en la resina Diaion CHP20P. A través de esta columna de resina Diaion CHP20P que contenía las tripropeptinas adsorbidas, se hicieron pasar sucesivamente 750 ml de cada uno de acetona acuosa al 20%, acetona acuosa al 30%, acetona acuosa al 35%, acetona acuosa al 40%, acetona acuosa al 45%, acetona acuosa al 50%, acetona acuosa al 55% y acetona acuosa al 60%.

La fracción obtenida eluyendo dicha columna con la acetona acuosa al 40% se concentró a presión reducida para dar 65,7 mg de tripropeptina Z. La fracción obtenida eluyendo dicha columna con la acetona acuosa al 45% se concentró a presión reducida para dar 189,7 mg de tripropeptina A. Algunas de las fracciones obtenidas eluyendo dicha columna con la acetona acuosa al 45% a la acetona acuosa al 50% se concentraron a presión reducida para dar 210,6 mg de tripropeptina B. De manera similar, algunas otras de las fracciones obtenidas eluyendo dicha columna con la acetona acuosa al 45% a la acetona acuosa al 50% se concentraron a presión reducida para dar 1,0 g de tripropeptina C. La fracción obtenida eluyendo dicha columna con la acetona acuosa al 50% se concentró a presión reducida para dar 50,1 mg de tripropeptina D.

Aplicabilidad industrial

Tal como se describió anteriormente en el presente documento, las tripropeptinas Z, A, B, C y D que tienen la fórmula (I) general, se proporcionan cada una como los antibióticos novedosos según esta invención. Las tripropeptinas tienen excelentes actividades antibacterianas frente a diversas bacterias gram-positivas y sus cepas resistentes a los fármacos. Por tanto, una tripropeptina según esta invención es útil como agentes antibiótico eficaz para el tratamiento de infecciones bacterianas, incluyendo sus cepas resistentes a los fármacos.

Claims

1. Antibiótico, tripropeptina Z, tripropeptina A, tripropeptina B, tripropeptina C o tripropeptina D, que es un compuesto representado por la fórmula (I) general:

12

2. Antibiótico según la reivindicación 1, que es tripropeptina Z representada por la fórmula (Iz):

13

es decir, el compuesto de la fórmula (I) general mostrado en la reivindicación 1, en el que R es un grupo 7-metil-octilo.

3. Antibiótico según la reivindicación 1, que es tripropeptina A representada por la fórmula (Ia):

14

es decir, el compuesto de la fórmula (I) general mostrado en la reivindicación 1, en el que R es un grupo 8-metil-nonilo.

4. Antibiótico según la reivindicación 1, que es tripropeptina B representada por la fórmula (Ib):

15

es decir, el compuesto de la fórmula (I) general mostrado en la reivindicación 1, en el que R es un grupo 9-metil-decilo.

5. Antibiótico según la reivindicación 1, que es tripropeptina C representada por la fórmula (Ic):

16

es decir, el compuesto de la fórmula (I) general mostrado en la reivindicación 1, en el que R es un grupo 10-metil-undecilo.

6. Antibiótico según la reivindicación 1, que es tripropeptina D representada por la fórmula (Id):

17

es decir, el compuesto de la fórmula (I) general mostrado en la reivindicación 1, en el que R es un grupo 11-metil-dodecilo.

7. Procedimiento para la producción de un antibiótico, tripropeptina Z, tripropeptina A, tripropeptina B, tripropeptina C y/o tripropeptina D, representado por la fórmula (I) general facilitada en la reivindicación 1, caracterizado porque el procedimiento comprende cultivar una cepa microbiana que pertenece al género Lysobacter y que puede producir al menos uno de los antibióticos, tripropeptina Z, tripropeptina A, tripropeptina B, tripropeptina C y tripropeptina D, y recuperar al menos una de las tripropeptinas Z, A, B, C y D de cultivo resultante.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que, como la cepa microbiana que puede producir al menos una de las tripropeptinas Z, A, B, C y D, se utiliza una cepa Lysobacter sp. BMK333-48F3 que se ha depositado en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Tecnología y Ciencia Industrial Avanzada, Agencia del Ministerio de Economía, Comercio e Industria, con el número de depósito de FERM BP-7477.

9. Composición farmacéutica que comprende, como principio activo, al menos una de las tripropeptinas Z, A, B, C y D que tienen la formula (I) general facilitada en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas, en mezcla con un vehículo o vehículo farmacéuticamente aceptables.

10. Composición según la reivindicación 9, que es una composición antibacteriana.

11. Como microorganismo novedoso, cepa Lysobacter sp. BMK333-48F3 que tiene la naturaleza característica de que puede producir las tripropeptinas Z, A, B, C y D que tienen la formula (I) general facilitada en la reivindicación 1, y que se ha depositado en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Tecnología y Ciencia Industrial Avanzada, Agencia del Ministerio de Economía, Comercio e Industria, con el número de depósito de FERM BP-7477, bajo los términos del tratado de Budapest.