KR100429162B1 - 신규한 퓨로마이신 유도체, 미생물을 이용하여 이를제조하는 방법, 이를 함유하는 약학 조성물 및 이로부터퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드를 제조하는 방법 - Google Patents

신규한 퓨로마이신 유도체, 미생물을 이용하여 이를제조하는 방법, 이를 함유하는 약학 조성물 및 이로부터퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 활성을 가진 신규한 퓨로마이신(puromycin) 유도체, 더욱 상세하게는 시스토신(Cystocin)으로 명명된, 항박테리아, 항종양 및 항바이러스 활성을 가진 하기 화학식 1의 퓨로마이신 유도체 화합물, 이 화합물을 생산하는 방선균 계열의 신균주 미생물, 이 미생물로부터 상기 퓨로마이신 유도체를 제조하는 방법, 상기 퓨로마이신 유도체를 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물 및 상기 퓨로마이신 유도체로부터 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다:

Description

신규한 퓨로마이신 유도체, 미생물을 이용하여 이를 제조하는 방법, 이를 함유하는 약학 조성물 및 이로부터 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드를 제조하는 방법{A novel puromycin derivative, a method for its preparation using a microorganism, a pharmaceutical composition comprising it and a method for preparation of puromycin aminonucleoside from it}
본 발명은 생물학적 활성을 가진 신규한 퓨로마이신(puromycin) 유도체, 더욱 상세하게는 시스토신(Cystocin)으로 명명된, 항박테리아, 항종양 및 항바이러스 활성을 가진 하기 화학식 1의 퓨로마이신 유도체 화합물, 이 화합물을 생산하는 방선균 계열의 신균주 미생물, 이 미생물로부터 상기 퓨로마이신 유도체를 제조하는 방법, 상기 퓨로마이신 유도체를 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물 및 상기 퓨로마이신 유도체로부터 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
퓨로마이신은 1952년 방선균의 일종인 스트렙토마이세스 알보니거(Streptomyces alboniger)에서 처음 발견된 고분자 물질로서, 그 구조가 하기 화학식 2에 제시된 바와 같이 단백질 합성에 관여하는 아미노아실-tRNA의 3' 말단과 매우 유사하여(참고문헌: Porter, J. N. 등Antibiot. and Chemother., 2, 409, 1952; Yarmolinsky, M. B. 등,Proc. U.S. Nat. Acad. Sci., 45, 1721, 1959), 생체내에서 리보솜과의 상호작용에 의해 폴리펩티드 사슬의 신장(elongation)을 조기 종결함으로써 단백질의 합성을 방해하는 대표적인 항생 물질로 오랫동안 널리 사용되어 왔다(참고문헌: Nathans, D. 등,Nature, 197, 1076, 1963):
일반적으로, 퓨로마이신은 상기 화학식 2에 제시된 구조와 같이, 아미노뉴클레오사이드 부위와 타이로신 유도체인 아미노산 부위로 이루어져 있어, 아미노산이 결합된 tRNA 분자의 아미노아실 부위와 화학적으로 유사한 구조를 가지고 있다. 따라서 생체내에서 단백질 합성체인 리보솜의 A 부위에 대해 아미노아실 tRNA 분자와 경쟁적으로 결합한다. 퓨로마이신은 또한 tRNA의 아미노아실과 마찬가지로, 성장하는 펩티드 사슬의 카르복실기와 펩티드 결합을 형성할 수 있는 α-아미노기를 포함하고 있어서, 리보솜 A 부위에 퓨로마이신이 결합하게 되면, 리보솜 P 부위에 있는 tRNA로부터 유리된 펩티드가 A 부위에 있는 퓨로마이신과 펩티드 결합을 하게 되고, 결과적으로 카르복실 말단에 퓨로마이신 잔기가 공유 결합된 폴리펩티드가 생성된다. 그러나, 퓨로마이신은 구조상 리보솜 P 부위에는 결합을 할 수 없기 때문에, 말단에 퓨로마이신을 가지고 있는 상기 폴리펩티드 생성물은 리보솜으로부터 분리되며, 따라서 폴리펩티드 사슬의 신장이 조기 종결되는 결과가 초래된다. 이러한 퓨로마이신의 존재에 의해 단백질 합성이 저지되며, 최종적으로는 세포의 성장을 방해하는 작용을 하게 되는 것이다.
이러한 퓨로마이신의 단백질 합성 방해 작용에 따른 생체내 항박테리아, 항종양 및 항바이러스 활성과 관련하여, 다양한 아미노산으로 치환된 퓨로마이신 유도체들의 합성과 이들을 사용한 각종 실험을 통해, 전체 구조중 아미노산 부위가 퓨로마이신의 상기한 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 왔다. 특히, 페닐 고리를 가진 아미노산으로 치환된 퓨로마이신 유도체들이 그렇지 않은 다른 퓨로마이신 유도체들에 비해 뛰어난 단백질 합성 방해 활성을 가진다는 사실이 여러 실험 결과들을 통해 보고되어 왔다(참고문헌: Waller, J. P. 등,Biochimica Et Biophysica Acta,119, 566, 1966; Symons, R. H. 등,Biochimica Et Biophysica Acta, 179, 248, 1969; Harris, R. J. 등,Biochimica Et Biophysica Acta, 240, 244, 1971; H. P. M. de Leeuw 등,Eur. J. Biochem., 76, 209, 1977).
그러나, 1997년 퐁(Fong)과 빈스(Vince)에 의해 아미노산 부위가 시스테인(cystein) 유도체로 치환된 즉, 페닐 고리를 가지지 않는 퓨로마이신 유도체들도 단백질 합성 방해 작용을 나타냄이 관련 실험을 통해 입증됨으로써, 퓨로마이신 유도체가 상기한 활성을 갖기 위하여 아미노산 부위에 반드시 페닐 고리를 가질 필요는 없음이 새로이 밝혀졌다(참고문헌: Fong, K. L. 등,Journal of Medicinal Chemistry, 21, 792, 1978).
본 발명의 제1의 목적은 생물학적 활성 즉, 항박테리아, 항종양 및 항바이러스 활성을 가진 신규한 퓨로마이신(puromycin) 유도체를 제공하는데 있다.
본 발명의 제2의 목적은 상기한 신규 퓨로마이신 유도체를 생산하는 방선균 계열의 신균주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제3의 목적은 상기 신균주를 이용하여 본 발명의 퓨로마이신 유도체를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 제4의 목적은 상기 신규 퓨로마이신 유도체를 유효 성분으로 함유하는 항박테리아, 항종양 및 항바이러스성 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제5의 목적은 본 발명의 퓨로마이신 유도체로부터 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 생물학적 활성을 가진 하기 화학식 1의 신규한 퓨로마이신 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매화물에 관한 것이다:
[화학식 1]
화학식 1의 구조로 표시되는 본 발명의 화합물은 아미노산 부위에 S-메틸시스테인 그룹을 포함하는 퓨로마이신 유도체로, 전술한 퐁(Fong)과 빈스(Vince)가 합성한 퓨로마이신 유도체에 포함되어 있지 않은 화합물이다. 이 화합물의 화학적 정식 명칭은 [3'-(S-메틸-L-시스테이닐)-3'-아미노-3'-데옥시-N,N-디메틸아데노신]이나, 이하 본 명세서에서는 간략하게 시스토신(cystocin)이라 지칭하기로 한다.
본 발명의 시스토신 화합물은 퓨로마이신과 마찬가지로, 단백질 합성시 폴리펩티드 사슬의 신장을 조기 종결하는 작용을 함으로써, 결과적으로 생체내에서 항박테리아, 항종양 및 항바이러스 활성을 나타낸다.
본 발명의 시스토신 화합물은 유기 합성에 의하여 화학적으로 만들어진 물질이 아니라, 방선균 계열의 신균주로부터 생산, 추출, 분리 및 정제된 화합물이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 화학식 1의 시스토신 화합물을 생산하는 방선균 계열의 신균주 및 이로부터 시스토신 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 시스토신 생산 신균주는 클로로트리신(chlorothricin) 생합성 유전자를, 아프라마이신(apramycin) 내성 유전자를 포함하고 있는 방선균(Streptomyces) 발현 벡터 pKC1218내로 도입시켜 제조한 재조합 플라스미드 pBS601을 사용하여 방선균 계열의 균주를 형질전환시킨 변이주로서, 2001년 1월 5일자로 국제 기탁 기관인 KCTC(한국 유전자 은행)에 기탁번호 KCTC 0930BP로 기탁되어 있으며, 이하 본 명세서에서는 약칭하여 GCA0001로 지칭된다.
본 발명의 시스토신 화합물은 방선균을 형질전환시켜 작제한 신규한 균주 GCA0001을 배지중에서 배양한 후, 이로부터 시스토신 화합물을 추출, 분리 및 정제함으로써 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 신규한 시스토신 화합물은 아미노산 부위에 페닐 고리를 포함하고 있지는 않지만, 생물학적 활성면에서 퓨로마이신보다 뛰어난 생체내 단백질 합성 방해 효과를 지니고 있으며, 전술한 바와 같이 미생물을 이용하여 생산된 자연 선택의 과정을 거친 물질이므로, 항생제, 항암제 및 항바이러스제로서 박테리아성, 바이러스성 질환 및 암 질환의 치료 및 예방에 임상적으로 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 유효 성분으로 상기 화학식 1의 시스토신 화합물, 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 그들의 용매화물을 포함하는 항박테리아, 항종양 및 항바이러스성 약학 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 언급된 약학적으로 허용되는 염에는, 본 발명의 시스토신 화합물이 적합한 산, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 할로겐화수소산 등과 같은 무기산, 또는 포름산, 시트르산, 아세트산, 벤조산, 메탄설폰산 등과 같은 유기산 등과 형성할 수 있는 약학적으로 허용되는 무독성 산부가염 등이 포함된다.
또한, 본 명세서에서 언급된 본 발명의 시스토신 화합물이 형성할 수 있는 용매화물의 예로는 수화물, 알코올레이트 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 시스토신 화합물을 유효 성분으로 함유하는 항박테리아, 항종양 및 항바이러스성 약학 조성물은 투여 목적에 따라 다양한 약제학적 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 제조하기 위해서는 활성 성분으로서 화학식 1로 표시되는 본 발명의 시스토신 화합물, 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 그들의 용매화물을, 약학 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 함께 배합함으로써, 약학 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구 투여용 제제, 주사용 용액이나 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉석 주사용 건조 분말 등의 형태로 된 주사용 제제, 연고제, 크림제, 액제 등의 국소적용형 제제 등의 다양한 형태의 제제로 제형화할 수 있다.
본 발명의 조성물내에서 사용될 수 있는 담체는 약학적 분야에서 허용되는 통상적인 것으로, 예를 들어, 경구 투여용 제제의 경우에는 결합제, 윤활제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을, 주사제의 경우에는 보존제, 가용화제, 안정화제 등을, 그리고 국소 투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등의 보조제를 투여 형태 및 제형화 종류에 따라 적절히 선택하여 사용한다.
이렇게 제조된 약학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로, 예를 들면 정맥내, 피하, 복강내 주사 등의 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 시스토신 화합물의 투여 방식이나 투여량, 투여 횟수 등은 환자의 연령, 체중, 성별 및 치료할 질환의 종류와 증상 정도 등에 따라 전문가의 판단하에 적절히 선택하여 투여한다.
본 발명은 또한 화학식 1의 시스토신 화합물을 프로테아제(protease)의 존재하에서 반응시킴으로써 하기 화학식 3의 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드를 제조하는 신규한 방법에 관한 것이다:
이하, 하기의 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하도록 한다. 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕고, 본 발명을 구체적으로 예시하고자 제시된 것으로, 이들 실시예에 의해 어떠한 식으로든 본 발명이 한정되어서는 안된다.
실시예 1 : 본 발명의 시스토신 화합물을 생산하는 신균주 GCA0001의 제조
(1) 토양으로부터 방선균의 분리
전국 40여 지역에서 채취한 토양을 40℃에서 건조시킨 후, 80℃에서 1시간 동안 열처리하고 각각 토양 3g에 대하여 멸균 증류수 20㎖를 첨가 혼합하여 교반하였다. 슈크로즈 103g, 글루코즈 10g, 카자미노산(casamino acid) 0.1g 및 효모 추출물 5g을 총 부피가 888㎖로 되도록 증류수중에 용해시킨 후, 박토 아가(bacto agar) 15g을 첨가하여 121℃에서 20분 동안 멸균시킨 다음, R 용액(K2SO40.25g, MgSO410.12g, KH2PO40.05g, CaCl20.36g) 100㎖, 20% L-프롤린 1.5㎖, 5.73% TES 완충액 10㎖, 1N NaOH 0.5㎖, 1 ×미량 원소 용액(ZnCl20.04g, FeCl20.2g,CuCl2ㆍ2H2O 0.01g, MnCl2ㆍ4H2O 0.01g, Na2B4O7ㆍ10H2O 0.01g, (NH4)MO7O24ㆍ4H2O 0.01g 및 증류수 100㎖) 0.2㎖를 첨가하여 제조한 R2YE 아가 배지를 기본 배지로 하여 항생제를 첨가한 배지상에, 상기에서 교반후 수득한 상등액을 접종하고, 28℃에서 10 내지 15일 동안 배양하였다. 이 때 항생제는 진균류의 성장을 억제함으로써 방선균만을 선택적으로 분리하기 위한 것으로, 아프라마이신(Apramycin), 티오스트렙톤(Thiostrepton) 및 네오마이신(Neomycin)을 사용하였다. 성장한 방선균들은 R2YE 아가 배지상에 재접종하여 배양하는데, 토양 채취 장소, 성장 형태, 색소 형성능 등에 따라 최종 6종으로 분류하였다. 배양된 각 방선균의 포자를 50% 글리세롤 튜브에 취해 초저온 냉동기(-70 ℃)에 보관하였다.
(2) 항생 효과를 갖는 방선균의 선별
본 단계에서는 목적하는 형질전환의 효율을 높이기 위하여, 피검균으로 스타필로코쿠스 아우레우스(Stapylococcus aureus) 균주와 다재 내성균 AG4410을 사용하여 상기 (1)에서 분리해낸 방선균 균주중에서 항생 효과를 갖는 방선균만을 선별하였다.
우선, 박토 트립톤(Bacto Trypton) 10g, 박토 효모 추출물 5g, 염화 나트륨 10g을 총 부피가 1,000㎖로 되도록 증류수중에 용해시키고 121℃에서 20분간 멸균하여 제조한 LB 배지 50㎖에 스타필로코쿠스 아우레우스 균주와 AG4410균을 접종한 후, 38℃ 교반 배양기에서 8시간 교반하였다. 교반이 끝난 균체를 50㎖ 튜브에 옮겨 원심분리(4℃, 4000rpm, 10분)한 후, 상등액은 버리고, 균체는 2㎖의 LB 배지중에 용해시켰다. LB 배지로 만든 0.5% 소프트 아가 6㎖ 정도를 멸균해 10㎖ 튜브에 넣고 흔들어 냉각시켰다. 약 40℃ 정도로 냉각된 0.5% 소프트 아가에, 앞서 LB 배지중에 용해시켜 두었던 피검균 100㎕를 넣고 여러 번 흔든 후, LB 고형 배지(상기 멸균전 LB 액상 배지에 박토 아가 15g을 첨가하여 멸균한 후, 지름이 100mm인 페트리 디쉬에 20㎖씩 부어 굳혀서 제조)에 일정한 두께로 붓고, 약 30분 정도 굳혔다. 상기 단계 (1)에서 토양으로부터 분리해낸 시검하고자 하는 방선균의 고형 배지를 직경 약 0.5㎝의 원형으로 자른 후, 상기의 굳힌 피검균 고형 배지 위에 올려 놓고, 38℃ 배양기에서 8시간 배양하였다. 피검균의 생육 저지대를 관찰하고, 피검균에 대해 항생 효과를 나타내는 방선균을 선별하여 다음 단계에서 사용하였다.
(3) 재조합 플라스미드 pBS601의 제조
스트렙토마이세스 안티바이오틱스(Streptomyces antibiotics) Tu99 균주로부터 마크로라이드(macrolide)와 디데옥시슈가(dideoxysugar)로 이루어져 있는 클로로트리신(chlorothricin) 생합성 유전자를 분리해낸 후, 이를 아프라마이신 내성 유전자 포함 방선균 발현 벡터인 pKC1218(Eli Lilly Co.(Indianapolis.Ind)사에서 시판)내로 도입시켜 재조합 플라스미드 pBS601을 작제하였다.
(4) pSB601을 사용한 방선균 균주의 형질전환
슈크로즈 340g, 글루코즈 10g, 박토-펩톤(bacto-peptone) 5g, 말트(Malt) 추출물 3g 및 효모 추출물 3g을 혼합하여 121℃에서 20분 동안 멸균시킨 후, 멸균된 2.5M MgCl2ㆍ6H2O 2㎖ 및 20% 글리신 25㎖를 첨가하여 제조한 YEME(Yeast ExtractMalt Extract) 배지를 진탕 플라스크에 채우고, 배지상에 이쑤시개 4개를 넣은 후, 플라스크 입구를 거즈와 호일로 싸서 멸균하였다. 여기에, 멸균된 1M MgCl2250㎕와 20% 글리신 1㎖를 첨가하였다. 상기 단계 (2)에서 준비한 방선균 균주의 고형 배지 표면을 긁어, 전술한 바와 같이 제조한 YEME 액상 배지상에 접종하고, 교반 배양기(29℃, 250rpm)에서 3일 동안 배양하였다. 3일 후, 배양액에 0.5M EDTAㆍ2Na 34㎕를 첨가하고 다시 교반 배양기(29℃, 250rpm)에서 3일 동안 재배양하였다. 이렇게 배양한 균주를 50㎖ 튜브에 담아 원심분리(4℃, 4000rpm, 10분)하여 상등액을 완전히 제거하고, 수득된 펠릿은 멸균 증류수 0.5 내지 1㎖중에 용해시켰다. 멸균된 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 상기 단계 (3)에서 제조한 재조합 플라스미드 pBS601 용액 50㎕(TE 완충액 45㎕ + pBS601 5㎕)을 넣고, 0.5M HEPES 및 5M CsCl2/50mM MgCl2를 50㎕씩 첨가하였다. 여기에, 상기에서 멸균 증류수에 용해시킨 방선균 균주 100㎕를 넣고, 50% PEG 3350 250㎕를 첨가하여 잘 혼합하였다. 이를 42℃에서 5분 동안 열처리한 후, 30℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양한 균주를 R2YE 배지 플레이트상에 250㎕와 100㎕씩 도말하여 30℃ 배양기에서 1 내지 2일 동안 배양하였다.
(5) 형질전환된 방선균 균주의 선별
상기 단계 (4)에서 수득한 배양물에서 형질전환된 균주만을 선별하기 위해, 항생제로서 12.5 내지 50㎕/㎖의 아프라마이신이 포함된 0.3% 소프트 아가 4 내지 5㎖로 고형 배지를 덮은 후, 30℃ 배양기에서 배양하면서 항생제가 포함된 아가 층을 뚫고 나오는 콜로니를 관찰하였다. 항생제가 포함된 아가 층을 뚫고 나온 콜로니만을 다시 선별하기 위하여, 멸균된 이쑤시개를 사용해서 이들 콜로니를 취하여 아프라마이신 항생제가 첨가된 R2YE 고형 배지상에 접종하였다. 이들 R2YE 고형 배지를 다시 30℃ 배양기에서 재배양하면서 관찰하였다. 아프라마이신 항생제가 첨가된 R2YE 배지에서 균체가 성장할 경우에는, 이를 각각 12.5㎍/㎕, 25㎍/㎕ 및 50㎍/㎕의 아프라마이신을 포함하고 있는 별도의 R2YE 고형 배지에서 재배양하여 성장 정도를 최종 확인한 후, 50㎍/㎕ 이상의 항생제를 포함하고 있는 고형 배지에서 성장하는 균체를 선택하여 멸균 증류수를 사용하여 30℃ 배양기에서 대량으로 배양하였다. 마지막으로 형질전환된 균주의 포자를 저장하였다.
실시예 2 : 형질전환된 신균주 GCA0001의 동정
상기 실시예 1을 통해 재조합 플라스미드 pSB601에 의해 방선균 균주를 형질전환시켜 수득한 시스토신 생산 방선균 신균주를 GCA0001라 명명하였다(KCTC 0930BP).
이 균주 GCA0001은 현미경 관찰 결과, 흰색을 띄고 있는 포자 사슬을 보여주고 있으며, 아프라마이신 및 네오마이신(neomycin) 등의 항생물질에 대해 내성을 나타내었다.
또한 외형적인 형태상 방선균으로 추정되어 16S rRNA 유전자 염기서열을 조사하여 균주 동정을 실시하였다. 분석 결과, 본 명세서에 첨부된 서열 목록에 제시된 바와 같은 16S rRNA의 염기 서열을 얻을 수 있었다.
분석된 염기서열에 대해 디스턴스 모델(Distance model; Jukes and Cantor)을 이용하여 그들간의 유전적 유사값과 진화거리를 분석하고, 또한 네이버-조이닝(Neighbor-Joining) 방법을 이용하여 계통도 분석을 실시하였다. 이를 토대로 유전학적 계통도를 측정한 결과, 본 발명의 신균주 GCA0001은 스트렙토마이세스 리디쿠스(Streptomyces lydicus) ATCC25470T와 가장 유사하였으며(유사성: 98.62%, nt difference 8/580), 스트렙토마이세스 마슈엔세(Streptomyces mashuense) DSM 40221T, 스트렙토마이스세스 알부스 아종(Streptomyces albus subsp.) DSM 40313T, 스트렙토마이세스 알불러스(Streptomyces albulus) ISP 5492T 및 스트렙토마이세스 더모코프로필러스(Streptomyces thermocoprophilus) DSM41700T의 표준 균주와는 97% 이상의 16S rRNA 유사도를 보여주고 있으나, 현재 발견된 방선균속에 속하는 균주중에서 본 발명의 균주 GCA0001과 동일한 종은 없는 것으로 보인다.
실시예 3 : GCA0001 균주로부터 시스토신의 제조
(1) GCA0001의 배양 및 시스토신의 생산
상기 실시예 1에 의해 형질전환하여 수득한 본 발명의 균주 GCA0001로부터 시스토신을 얻기 위해, 균주를 R2YE 아가 고형 배지상에 접종하여 29℃에서 5일 동안 배양한 후, 생성된 콜로니를 종자 배양을 위하여 각기 150㎖의 액상 배지(효모 추출물 0.75g, 비프 추출물 0.45g, 트립토즈(tryptose) 0.75g, 가용성 전분 3.6g, 덱스트로즈 0.75g, 탄산 칼슘 0.6g 및 증류수 150㎖)를 함유하는 3개의 1ℓ 버블어렌마이어 플라스크(bubbled Erlenmyer flask)에 접종하여 29℃에서 3일 동안 교반 배양기에서 진탕(250rpm) 배양하였다. 시스토신의 대량 생산을 위해, 14ℓ용량의 배양기내 멸균 처리된 생산용 배지 9ℓ(박토-소이톤(bacto-soyton) 315g, 덱스트린 450g, 탄산 칼슘 63g, 염화 코발트 0.216g, 증류수 9ℓ표선까지)에 상기 종자 배양된 균체 450㎖(5%(v/v))를 접종하였다. 교반 속도는 300rpm으로 하고, 통기량은 0.5vvm으로 하여 30℃에서 4일간 배양하였다. 배양 도중 거품이 생겨 배양액이 넘치는 것을 방지하기 위해서, 48시간 경과 후에 소포제 5㎖를 첨가하였다. 배양후 48시간 경과시부터 MgSO4를 첨가하기 시작하여 최종 농도가 0.5M이 되도록 페드-배치(Fed-batch) 발효를 하여 시스토신의 수율을 높여 주었다. MgSO4첨가시, 탄소원으로는 덱스트린 10g을, 그리고 질소원으로는 효모 추출물 5g도 같이 첨가하였다.
(2) 시스토신의 분리 및 정제
배양액 9ℓ를 원심분리(4000rpm, 10분)하여 상등액을 취하고, 동부피의 클로로포름을 사용하여 세 차례에 걸쳐 추출하여 감압 건조시킨 후, 5g의 추출물을 수득하였다. 수득된 추출물을, 전개 용매로 9:1의 클로로포름:메탄올을 사용하여 실리카 겔(100g)상에서 크로마토그래피하여 600mg의 시스토신 목적물을 수득하였다. 이 시스토신 화합물은 전개 용매로 5:1의 클로로포름:메탄올을 사용하여 TLC(Thin layer chromatography, 0.2% 닌히드린으로 발색)한 결과, Rf 수치가 0.5임을 확인할 수 있었다. 불순물이 함유된 상기 600㎎의 시스토신 목적물을 전개 용매로 9:1의 클로로포름:메탄올을 사용하여 실리카 겔(20g)상에서 재차 크로마토그래피하여순수한 220mg의 시스토신 화합물을 분리 및 수득하였다. 분리된 시스토신을 5㎖의 클로로포름에 용해시킨 후, 흰 침전이 생길 때까지 헥산을 서서히 첨가하여 시스토신을 침전시켰다. 침전물이 포함된 용액을 감압 여과하여 정제된 형태의 시스토신 분말 200㎎을 수득하였다. 이 화합물을 대상으로 화학적 및 물리적 특성을 분석한 결과, 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다:
형태 : 흰색의 분말
분자식 : C16H25N7O4S1
분자량 : 411.1689
FAB+ : (M+H) 412.1750
원소 분석치:C (46.7%), H (6.17%), N (23.81%), S (7.76%)
계산치 : C (46.7%), H (6.13%), N (23.83%), S (7.78%)
융점 : 156 ∼ 158℃
UV : λmax274.4 nm
H1NMR(CDCl3):δ2.082(s, 3H), 2.65∼2.72(dd, 1H), 2.94∼3.00(dd, 1H),
3.4∼3.7(m, 7H), 3.77∼4.02(qq, 2H), 4.24(m, 1H), 4.46(q,
1H), 4.71(m, 1H), 5.91(d, 1H), 8.08(s, 1H), 8.16(s, 1H),
8.21(d, 1H)
C13NMR(CDCl3):δ15.455, 38.531, 39.506, 51.054, 53.489, 62.206, 73.928,
77.213, 85.169, 91.309, 121.003, 137.186, 148.621, 151.574,
154.867, 175.034
실시예 4 : 시스토신의 생물학적 활성
(1) 항균 효과
시스토신의 항균 활성 검사는 표 1에 제시된 20종의 그램-양성 및 그램-음성 균주를 대상으로 항생 물질로서 본 발명의 시스토신 화합물외에, 종래의 항생 물질인 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 스파플록사신(Sparfloxacin) 및 퓨로마이신을 사용하여 아가 희석법에 의해 수행하였다.
우선, 표 1에 제시된 균주를 각각 상기 항생 물질을 함유하는 별도의 뮐러(Mueller) 아가 배지상에서 37℃로 18시간 동안 배양함으로써 항균 효과를 나타내기 위한 각 항생 물질의 최소 억제 농도(Minimum inhibitory concentration; MIC; ㎍/㎖)를 측정하였다. 그 결과가 하기 표 1로서 제시되어 있다.
하기 표 1에 의하면, 본 발명의 시스토신 화합물은 기존의 퓨로마이신 화합물과 비교하여 시험된 모든 균주에 대해 2배 이상의 뛰어난 항균 효과를 나타내었으며, 특히 스트렙토코쿠스(Streptococcus)균에 대해서는 3 내지 6㎍/㎖ 정도의 MIC 수치를 나타내는 등 비교적 강한 항균력을 보여주고 있다.
균주 시스토신 시프로플록사신 스파플록사신 퓨로마이신
1 스트렙토코쿠스 피오제네스 308A(Streptococcus pyogenes 308A) 3.125 3.125 0.781 6.250
2 스트렙토코쿠스 피오제네스 77A(Streptococcus pyogenes 77A) 3.125 0.391 0.195 6.250
3 스트렙토코쿠스 파에시움 MD8b(Streptococcus faecium MD8b) 6.25 0.391 0.391 6.250
4 스타필로코쿠스 아우레우스 SG511(Staphylococcus aureus SG511) 6.250 0.195 0.049 6.250
5 스타필로코쿠스 아우레우스 285(Staphylococcus aureus 285) 6.250 0.781 0.049 12.500
6 스타필로코쿠스 아우레우스 503(Staphylococcus aureus 503) 6.250 0.391 0.049 6.250
7 에쉐리치아 콜리 0786.250(Escherichia coli 0786.250) 12.500 0.004 0.007 25.000
8 에쉐리치아 콜리 DC O(Escherichia coli DC O) 50.000 0.195 0.195 100.000
9 에쉐리치아 콜리 DC 2(Escherichia coli DC 2) 1.563 0.098 0.049 1.563
10 에쉐리치아 콜리 TEM(Escherichia coli TEM) 50.000 0.013 0.013 100
11 에쉐리치아 콜리 1507 E(Escherichia coli 1507 E) 50.000 0.013 0.013 100
12 슈도모나스 아에루지노사 9027(Pseudomonas aeruginosa 9027) 100 0.195 0.781 100
13 슈도모나스 아에루지노사 1592E(Pseudomonas aeruginosa 1592E) 100 0.195 0.781 100
14 슈도모나스 아에루지노사 1771(Pseudomonas aeruginosa 1771) 100 0.195 0.781 100
15 슈도모나스 아에루지노사 1771M(Pseudomonas aeruginosa 1771M) 25.000 0.049 0.195 100.000
16 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 25.000 0.007 0.013 50.000
17 클래브시엘라 옥시토카 1082E(Klebsiella oxytoca 1082E) 3.125 <0.002 <0.002 3.125
18 클레브시엘라 아에로제네스 1522E(Klebsiella aerogenes 1522E) 100.000 0.013 0.025 100.000
19 엔테로박터 클로아카에 P 99(Enterobacter cloacae P 99) 50.000 0.013 0.007 100.000
20 엔테로박터 클로아카에 1321 E(Enterobacter cloacae 1321 E) 25.000 0.004 0.004 25.000
(2) 항암 효과
본 발명의 시스토신 화합물에 대한 항암 효과를 조사하기 위하여, 암 세포A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF-498 및 HCT-15를 각각 시스토신 화합물 및 퓨로마이신과 함께 배양하여 상기 암 세포의 성장을 관찰하였다.
시험 결과, 표준 세포에 대한 암 세포의 성장 정도는 하기 표 2에 제시된 바와 같았다. 표 2에 의하면, 본 발명의 시스토신 화합물이 종래의 퓨로마이신에 비해 모든 암 세포에서 월등히 뛰어난 암 세포 억제 효능을 나타냄을 알 수 있다.
샘플 ED50(㎍/㎖)
A549 SK-OV-3 SK-MEL-2 XF-498 HCT-15
퓨로마이신 0.31 0.38 0.16 0.28 1.08
시스토신 0.14 0.10 0.11 0.13 0.14
실시예 5 : 시스토신으로부터 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드의 제조
본 실시예에서는 본 발명의 신균주 GCA0001을 배양하고, 이로부터 추출, 분리 및 정제 과정을 통해서 얻은 본 발명의 시스토신 화합물로부터 또다른 퓨로마이신 유도체인 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드를 제조하고자 한다.
상기 실시예 3에서 수득한 시스토신 380㎎을 0.041M KH2PO4(pH=7.5) 3㎖와 메탄올 2㎖중에 용해시킨 후, 프로테아제(활성도 : 4.3 유니트/㎎) 17㎎을 첨가하여 38℃의 항온조에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 진공 건조기를 사용하여 건조시킨 다음, 메탄올 20㎖를 사용하여 용매 추출하였다. 추출후, 용매를 감압 건조시켜 제거한 후, 전개 용매로 3:1의 클로로포름:메탄올을 사용하여 TLC(5% 황산으로 발색)하여, Rf수치가 0.26 및 0.12인 것을 확인하였다. TLC 확인후 반응물을,전개 용매로 각기 50㎖씩의 10% 메탄올, 20% 메탄올, 40% 메탄올 및 50% 메탄올를 사용하여 역상 실리카 컬럼(15㎖)에 의해 분리하였다. 10% 메탄올 및 20% 메탄올의 전개 용매를 사용하여 용출시키는 과정에서 원하는 목적물을 TLC로 확인할 수 있었다. 분석 결과, 이렇게 해서 수득된 목적물중 Rf수치가 0.26인 물질이 상용화된 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드와 물리적 및 화학적 특성면에서 동일한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 퓨로마이신 유도체인 시스토신 화합물은 유기 합성에 의해 제조된 물질이 아니라 방선균 계열의 신균주인 GCA0001로부터 추출된 신규한 물질로서, 항박테리아, 항종양 및 항바이러스 활성 등의 생물학적 활성면에서 종래의 퓨로마이신 화합물에 비해 현저히 뛰어난 효과를 지니고 있으며, 미생물로부터 추출, 분리 및 정제 과정을 통해 제조된 자연 선택의 과정을 거친 화합물이므로, 퓨로마이신을 대체할 수 있는 획기적인 물질로 볼 수 있다.
따라서, 본 발명의 시스토신 화합물은 이러한 생물학적 활성을 이용하여 이를 유효 성분으로 하는 항생제, 항암제 또는 항바이러스제 약학 조성물로도 효과적으로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 방선균 신균주 GCA0001을 이용하여 본 발명의 시스토신 화합물의 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라, 이로부터 생물학적으로 중요한 물질인 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드도 용이하게 제조할 수 있어, 이들 물질을활용한 치료적 효과가 기대되어 진다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 [3'-(S-메틸-L-시스테이닐)-3'-아미노-3'-데옥시-N,N-디메틸아데노신]의 퓨로마이신 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 그들의 용매 화합물:
    [화학식 1]
  2. 클로로트리신(chlorothricin) 생합성 유전자를, 아프라마이신(apramycin) 내성 유전자를 포함하고 있는 방선균 발현 벡터 pKC1218내로 도입시켜 제조한 재조합 플라스미드 pSB601.
  3. 제 2 항의 재조합 플라스미드 pSB601로 형질전환시킨 방선균 균주(KCTC 0930BP).
  4. 제 3 항의 방선균 균주를 배지중에서 배양한 후, 추출, 분리 및 정제함으로써 하기 화학식 1의 구조를 갖는 퓨로마이신 유도체를 제조하는 방법:
    [화학식 1]
  5. 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 유효 성분으로서 제 1 항에 따른 하기 화학식 1의 퓨로마이신 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 그들의 용매 화합물을 포함하는 항박테리아, 항종양 및 항바이러스성 약학 조성물:
    [화학식 1]
  6. 제 1 항에 따른 퓨로마이신 유도체를 프로테아제(protease)의 존재하에서 반응시켜 하기 화학식 3의 퓨로마이신 아미노뉴클레오사이드를 제조하는 방법:
    [화학식 3]
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