ES2317066T3 - Produccion de tacrolimus (fk-506)utilizando nuevas especies de streptomyces. - Google Patents
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Abstract
Microorganismo Streptomyces glaucescens MTCC 5115 aislado.
Description
Producción de tacrolimus
(FK-506) utilizando nuevas especies de
Streptomyces.
El sector de la invención se refiere a un nuevo
microorganismo Streptomyces glaucescens MTCC 5115 y a un
proceso para la producción del agente inmunosupresor tacrolimus
(FK-506) utilizando el nuevo microorganismo
Streptomyces glaucescens MTCC 5115. La presente invención
también se refiere a un proceso para la producción de composiciones
farmacéuticas que incluyen el tacrolimus (FK-506) y
que se pueden utilizar para el tratamiento o prevención del rechazo
al transplante de órganos o tejidos, tales como corazón, riñón,
hígado, médula ósea, piel, etc.
Recientemente, se han utilizado diversos
compuestos macrólidos como agentes inmunosupresores para la
prevención del rechazo de injerto en transplantes de médula ósea y
de órganos y en el tratamiento de diversas enfermedades
autoinmunes. Un inmunosupresor ampliamente aceptado para la
prevención del rechazo de injerto es la ciclosporina. Aunque la
ciclosporina se utiliza ampliamente en terapia inmunosupresora, su
utilización, particularmente en concentraciones más altas, a menudo
está acompañada de efectos secundarios, tales como nefrotoxicidad,
hepatotoxicidad y trastornos del sistema nervioso central.
A la luz de lo anteriormente mencionado, se
están investigando constantemente fármacos más nuevos y más seguros
que presenten menos efectos secundarios y una mayor eficacia. Como
resultado, se han descubierto como inmunosupresores nuevos
compuestos, tales como rapamicina y su derivado ascomicina o
análogos sintéticos, denominados colectivamente ascomicinas. Entre
las Ascomicinas, el FK-506, denominado comúnmente
tacrolimus, de fórmula I, se ha demostrado que es un eficaz
inmunosupresor.
Además, se ha demostrado que el tacrolimus y sus
derivados son eficaces en el tratamiento de muchas enfermedades,
tales como Asma (Solicitud de Patente PCT WO 90/14826), enfermedad
inflamatoria e hiperproliferativa de la piel y manifestaciones
cutáneas de enfermedades inducidas inmunológicamente (Patente
Europea No 315.978). A pesar de su extrema utilidad y de su
eficacia superior en la prevención del rechazo de injerto, la
producción del tacrolimus presenta sus propios inconvenientes,
tales como baja productividad debido a la producción de diversos
compuestos relacionados durante el proceso.
En las Patentes U.S.A. Nos. 4.894.366;
5.116.756; 5.264.355; 5.496.727 y 5.624.842, por ejemplo, se ha
informado sobre diversos procesos para la producción del
tacrolimus. En general, estos procesos implican la utilización de
diversas cepas de especies de Streptomyces para la producción del
tacrolimus.
El producto obtenido mediante los procesos que
se han dado a conocer, también da como resultado diversos compuestos
relacionados no deseados. A efectos de aumentar la productividad
del tacrolimus con la reducción simultánea de diversas impurezas
relacionadas producidas durante el proceso de fermentación, los
presentes inventores emprendieron el aislamiento de una nueva cepa
de especie Streptomyces capaz de producir el tacrolimus.
Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que la
nueva cepa da como resultado sólo pequeñas cantidades de compuestos
relacionados durante la bioconversión.
En un aspecto general se da a conocer un nuevo
microorganismo, Streptomyces glaucescens MTCC 5115, en forma
biológicamente pura.
En otro aspecto general se da a conocer un nuevo
microorganismo, Streptomyces glaucescens MTCC 5115, capaz de
producir el tacrolimus mediante fermentación. El compuesto producido
posee y manifiesta todas las características físicas y químicas del
tacrolimus (FK-506), tal como se describe en la
Publicación EPO No. 0184162.
En otro aspecto general se da a conocer un
proceso para la producción del inmunosupresor tacrolimus. El
proceso incluye la etapa de cultivo de una cepa de Streptomyces
glaucescens MTCC 5115, utilizando métodos convencionales, bajo
condiciones de fermentación aeróbica sumergida en un medio acuoso de
hidratos de carbono, que contiene el nutriente nitrógeno, durante
un tiempo suficiente para producir el producto tacrolimus.
En otro aspecto se da a conocer un proceso para
la producción de una composición farmacéutica que incluye una
cantidad de tacrolimus terapéuticamente eficaz y uno o más
transportadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente
aceptables.
En la siguiente descripción se exponen los
detalles de una o más realizaciones de las presentes invenciones. A
partir de la descripción y de las reivindicaciones resultarán
evidentes otras características, objetivos y ventajas de las
presentes invenciones.
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Los presentes inventores han descubierto un
nuevo microorganismo, Streptomyces glaucescens MTCC 5115,
que se ha aislado a partir de muestras de suelo recogidas en
Narnaul, (Haryana), India.
El Streptomyces glaucescens aislado a
partir de muestras de suelo recogidas en Narnaul, Haryana, India,
se ha depositado bajo el tratado de Budapest con el número de acceso
MTCC 5115 en la Colección de Cultivos Microbianos Tipo
("Microbial Type Culture Collection") (MTCC), Chandigarh,
India.
Los presentes inventores también han descubierto
que el nuevo microorganismo Streptomyces glaucescens MTCC
5115, bajo condiciones de fermentación adecuadas, es capaz de
producir el tacrolimus en un grado elevado, mientras que los
compuestos relacionados no deseados se obtienen sólo en pequeñas
cantidades durante la bioconversión.
El Streptomyces glaucescens MTCC 5115
tiene las siguientes características morfológicas, de cultivo,
biológicas y fisiológicas.
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El análisis de la pared celular se llevó a cabo
mediante los métodos de Becker y otros. El análisis de los
hidrolizados de células completas de la cepa mostró la presencia de
ácido LL-diaminopimélico. Por consiguiente, se cree
que la pared celular de esta cepa es del tipo I (Becker, B. y otros,
"Microbiología Aplicada" ("Applied Microbiology"), 12
421-423, 1964).
Se realizaron observaciones morfológicas según
los métodos descritos por Shirling y Gottlieb (Shirling E.B. y D.
Gottlieb, International Journal of Systemic Bacteriology, 16,
313-340, 1966). El cultivo se hizo crecer a 28ºC
durante 11 días en agar extracto de levadura - extracto de malta
(YMA). Se descubrió que la morfología de la cadena de esporas era
del tipo espiral/retina, el sustrato del micelio era blanco hueso y
el micelio aéreo era naranja grisáceo. Las colonias eran opacas,
crecieron en el centro con bordes irregulares y tenían una
consistencia rugosa y dura.
Los estudios microscópicos y el análisis de la
pared celular de la cepa revelaron que esta cepa pertenece al
género Streptomyces. Sin embargo, los resultados muestran
algunas diferencias severas entre los productores del nuevo aislado
y el tacrolimus conocido (FK-506) (Tablas 1 y
2).
Las características de cultivo se observaron en
diferentes tipos de medio sólido, por ejemplo, agar harina de
avena, YMA, agar con agua del grifo, agar mineral basal, agar
mineral con almidón sal inorgánica, agar glicerol asparagina y agar
Czapek. El cultivo se incubó a 28ºC durante 11 días. El cultivo
mostró un crecimiento muy bueno en agar Czapek, agar nutritivo,
agar dextrosa de patata y agar asparagina glucosa. En el agar con
sal mineral basal, agar con agua del grifo y agar harina de avena el
crecimiento fue escaso. En YMA se observó la producción de pigmento
soluble, al contrario de la cepa de Merck ATCC 55098, un productor
de tacrolimus (FK-506) conocido. La coloración del
micelio vegetativo de Streptomyces glaucescens MTCC 5115
oscila entre blanco y blanco hueso, mientras que en el caso
Streptomyces tsukubaensis 9993, otra cepa productora de
FK-506, oscila desde rosa pálido a naranja rojizo
hasta marrón pálido (Tablas 1 y 2).
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En la Tabla 2 se muestran los resultados. La
formación de pigmento melanoide en Streptomyces glaucescens
MTCC 5115 fue positiva mientras que se descubrió que era negativa en
el productor de FK-506 conocido anteriormente. El
intervalo de temperatura para el crecimiento sobre YMA se descubrió
que era 22-35ºC, siendo la temperatura óptima
28ºC.
El patrón de utilización de azúcares de MTCC
5115 frente a las cepas productoras de FK-506
conocidas mostró una fácil utilización de fructosa, galactosa,
glucosa, manitol, sacarosa; una escasa utilización de ramnosa y
ninguna utilización de arabinosa, m-inositol,
rafinosa, salicina y xilosa (Tabla 3). Streptomyces
glaucescens MTCC 5115 utilizó de forma muy escasa fenilalanina
y prolina pero utilizó fácilmente histidina.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La comparación de diversas características
morfológicas, biológicas y fisiológicas mostró que Streptomyces
glaucescens MTCC 5115 es una cepa diferente a los productores de
FK-506 conocidos anteriormente. Una comparación del
análisis del fragmento de restricción del ADNr 16s de
Streptomyces glaucescens MTCC 5115 con los productores de
FK-506 conocidos (Streptomyces tsukubaensis
9993) mostró una clara diferencia de corte confirmando de este
modo ser una cepa diferente.
Por consiguiente, se hizo una comparación de
esta cepa con diversas especies de Streptomyces a la luz de
la descripción publicada ("Manual de Bergy de Bacteriología
Determinativa" ("Bergy's Manual of Determinative
Bacteriology") 8ª edición, 1974). Como resultado de la
comparación, la cepa Streptomyces glaucescens MTCC 5115 se
considera que tiene un íntimo parecido a Streptomyces
glaucescens.
Los presentes inventores también han
desarrollado un proceso para la producción del tacrolimus utilizando
el nuevo microorganismo Streptomyces glaucescens MTCC 5115.
Este también incluye la utilización de cualquiera de sus
mutantes/variantes que sea capaz de producir la sustancia
tacrolimus, incluyendo tanto mutantes naturales como artificiales,
que se pueden obtener a partir del organismo descrito mediante
medios convencionales, tales como irradiación con UV, rayos X,
rayos gamma y tratamiento con
N-Metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG), etil metanosulfonato (EMS), metil metanosulfonato (MMS) y
similares o mediante manipulación genética.
El proceso implica el cultivo (fermentación) de
Streptomyces glaucescens MTCC 5115 bajo condiciones aeróbicas
sumergidas en un medio nutritivo acuoso que contiene fuentes de
carbono y nitrógeno asimilables; y el aislamiento del tacrolimus a
partir de dicho medio.
Entre los ejemplos de fuentes de carbono en el
medio nutritivo se incluyen hidratos de carbono, tales como
glucosa, xilosa, galactosa, dextrosa, glicerol, almidón, dextrina,
maltosa, polietilen glicol, aceite de semilla de soja y similares.
Otras fuentes pueden incluir ramnosa, rafinosa, arabinosa, manosa,
salicina, succinato sódico y similares.
Entre los ejemplos de fuentes de nitrógeno se
incluyen extracto de levadura, peptona de soja, harina de semilla
de soja, harina de semilla de algodón, licor de maíz fermentado,
peptona de trigo, gluten de maíz, polvo de leche, germen de trigo y
similares.
Las fuentes de carbono y nitrógeno, aunque se
utilizan de forma ventajosa combinadas, no necesitan utilizarse en
su forma pura.
Además, al medio de cultivo también se pueden
añadir sales minerales de calcio, magnesio, sodio, cobalto, cobre y
potasio. Si fuese necesario, especialmente cuando en el medio de
cultivo se forma espuma de forma abundante, se puede añadir un
agente desespumante, tal como parafina líquida, aceite graso, aceite
vegetal, aceite mineral o silicona.
Además, cuando el crecimiento se realiza en
tanques grandes, se puede utilizar la forma vegetativa de los
microorganismos, a efectos de evitar la fase de retardo "lag
phase" en la producción del tacrolimus. La forma vegetativa del
organismo se puede producir mediante la inoculación del medio con
esporas o micelios del organismo a partir del medio de cultivo
inclinado y el cultivo de dicho medio inoculado, también denominado
medio de sembrado (fase I) y, a continuación, la transferencia del
sembrado de la fase I a un medio de sembrado de la fase II (fase
II). Este sembrado se puede utilizar para inocular el medio de
producción.
Durante la fermentación el cultivo crece en
forma de gránulos y, por lo tanto, requiere una agitación baja para
satisfacer la demanda de oxígeno del cultivo. Esto aporta una
ventaja sobre las otras especies de Streptomyces que crecen
en forma filamentosa. Esto a menudo provoca escasez de oxígeno en el
cultivo. A efectos de aumentar la aportación de oxígeno se aumenta
la velocidad de agitación, que a su vez provoca una gran cantidad de
rotura de hifas y la actividad del microorganismo tiende a
disminuir.
El medio nutritivo se puede mantener a un pH de
aproximadamente 6-8 en el inicio y al final
(recolección). En particular, el pH se puede mantener
aproximadamente a 6,8-7,5.
La fermentación se puede realizar bajo
condiciones aeróbicas sumergidas a una temperatura de
aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 40ºC, por ejemplo, a una
temperatura de aproximadamente 24ºC hasta aproximadamente 35ºC. La
fermentación se puede llevar a cabo durante un periodo de
aproximadamente 120 horas hasta aproximadamente 400 horas, que
puede variar según las condiciones de fermentación y las escalas de
producción. En particular, los cultivos de producción se pueden
incubar durante aproximadamente 240 hasta 310 horas a 27ºC a un pH
de aproximadamente 6,8-7,5.
El medio para el cultivo y para llevar a cabo la
fermentación incluye los siguientes componentes:
Este medio de cultivo aporta una ventaja, dado
que en él se utilizan todas las materias primas de origen vegetal
y, por lo tanto, está exento de todas las consecuencias relacionadas
con la Encefalitis Espongiforme Transmisible (TSE)/Encefalitis
Espongiforme Bovina (BSE).
El producto tacrolimus obtenido se puede
recuperar a partir del medio de cultivo mediante medios
convencionales, por ejemplo, cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC). La sustancia tacrolimus producida se encuentra
en el medio de cultivo y el filtrado, y se puede aislar y purificar
a partir del micelio y del filtrado.
El aislamiento del tacrolimus a partir del medio
comprende una o más etapas de filtración, centrifugación,
concentración, concentración bajo presión reducida, liofilización,
acidificación, extracción con un disolvente adecuado, tratamiento
con adsorbentes, tratamiento con resinas, purificación y
cristalización.
El término "disolvente adecuado" comprende
cualquier disolvente o mezcla de disolventes, en el que se puede
solubilizar el tacrolimus, entre los que se incluyen, por ejemplo,
acetato de etilo, metanol, tolueno y similares. Se puede tratar con
adsorbentes, tales como carbón vegetal activado, gel de sílice,
alúmina o similares. Entre los ejemplos de resinas se incluyen
resinas de intercambio aniónico y catiónico.
El producto obtenido se puede recristalizar una
o más veces para obtener una pureza superior.
El tacrolimus se puede administrar para la
prevención y tratamiento del rechazo al transplante de órganos o
tejidos, tales como corazón, riñón, hígado, médula ósea, piel, etc.
en un animal de sangre caliente.
Para el objetivo de la presente descripción, un
animal de sangre caliente es un miembro del reino animal que posee
un mecanismo homeostático y que incluye mamíferos y aves.
En la siguiente sección se describen
realizaciones a modo de ejemplos para ilustrar el proceso de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se aisló Streptomyces glaucescens MTCC
5115 a partir de suelo utilizando la técnica de dilución en placa,
tal como se describe a continuación.
Se recogieron muestras de suelo de diferentes
zonas geográficas de la India, a efectos de aislar nuevos
microorganismos productores del tacrolimus. Las muestras se secaron
al aire y se pretratraron calentando a 90ºC durante 1 hora. Se tomó
un gramo de la muestra pretratada en un tubo de ensayo estéril y se
completó con agua destilada estéril hasta un volumen de 10 ml. La
mezcla se combinó durante 10 segundos y se dejó reposar durante 1
hora. Se realizaron diluciones en serie en agua destilada
preesterilizada y se colocaron en placas sobre un medio
asparagina-glicerol que comprendía 50 \mug/ml
tanto de cloranfenicol como de nistatina/cicloheximida. Se utilizó
un ml de suspensión para colocar en placas. Las placas se incubaron
a 28ºC durante 7-10 días.
Las colonias aisladas se recogieron sobre placas
con YMA fresco. Las placas se incubaron a 28ºC durante 10 días. El
crecimiento sobre las placas se recogió sobre medios de cultivo
inclinados de YMA y se cultivó durante 10-11 días a
28ºC. Estos medios de cultivo inclinados se almacenaron para su
utilización posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se preparó una suspensión de esporas/micelios de
cada aislado con 2,5 ml de una solución de cloruro sódico al 0,85%
obtenida a partir del medio de cultivo inclinado sobre YMA de 11
días de antigüedad. La suspensión se utilizó para inocular 35 ml de
medio de sembrado KE estéril, tal como se describe en la Patente
U.S.A. No. 5.194.378.
El pH del medio de sembrado se ajustó a 6,9
antes de la esterilización. El cultivo se incubó durante
44-48 horas en un agitador rotativo a 28ºC, a
continuación se utilizaron 2 ml de cultivo de sembrado para inocular
25 ml de medio de producción de FKA y se llevó a cabo la
fermentación según las condiciones descritas en la Patente U.S.A.
No. 5.194.378.
Se ensayó la actividad antifúngica de los
extractos de metanol de los caldos de fermentación frente a una
cepa mutante de Aspergillus terreus utilizando el
FK-506 como patrón. Veintidós cepas mostraron una
zona clara, mostrando por lo tanto actividad antifúngica frente a
Aspergillus terreus. Se confirmó la presencia de
FK-506 en los extractos de estas cepas mediante
HPLC. Una de las cepas, Streptomyces glaucescens MTCC 5115,
mostró un pico muy pequeño en el mismo tiempo de retención que el
del patrón FK-506.
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Ejemplo
3
Se realizó una comparación del patrón del
fragmento de restricción de ADNr 16s entre Streptomyces
glaucescens MTCC 5115 y Streptomyces tsukubaensis 9993
utilizando diferentes endonucleasas de restricción (BamH1, BgI1,
Nco1, Sma1, EcoR1, HindIII, EcoRV, Stu1 y Psn AI). Estos
experimentos revelaron que Streptomyces glaucescens MTCC
5115 presenta un prototipo diferente.
Ejemplo
4
Se preparó una suspensión de esporas/micelios de
la cepa Streptomyces glaucescens MTCC 5115 con 2,5 ml de una
solución de cloruro sódico al 0,85% obtenida a partir del medio de
cultivo inclinado sobre YMA de 11 días de antigüedad. El sembrado
se hizo crecer en la Fase I/II durante 44-48 horas a
28ºC. A continuación se muestra la composición del medio de
sembrado.
Se utilizaron dos ml de cultivo de sembrado para
inocular el medio de producción que tenía la siguiente
composición.
El pH del medio nutritivo se ajustó a
7,0-7,2 antes de la esterilización y el medio se
esterilizó a 121ºC durante 25 minutos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la fermentación durante
290-310 horas a 240 rpm y 24ºC y se realizó el
análisis del tacrolimus mediante HPLC. El pico del tacrolimus
(FK-506) fue muy marcado y claro.
El análisis por adición ("spiking") de este
pico de HPLC utilizando el patrón de trabajo de
FK-506 confirmó la presencia del producto
tacrolimus (FK-506) en el caldo. El título más alto
del FK-506 fue 5-10 \mug/ml
después de aproximadamente 300 horas a partir del medio de
producción mencionado anteriormente.
Ejemplo
5
Se acidificaron seis litros de caldo de
fermentación hasta pH 4,0 y se extrajeron dos veces con un volumen
igual de acetato de etilo. La capa de acetato de etilo se reservó (6
litros) y se concentró hasta 100 ml a 40ºC al vacío. Se volvió a
purificar mediante técnicas conocidas de cromatografía en columna y
se ensayó el MASS del producto aislado mediante LCMS.
Los resultados analíticos demostraron que el
compuesto aislado era similar al tacrolimus
(FK-506), tal como se describe en la Patente
europea No. 184162 y la Patente U.S.A. No. 4.894.366.
Claims (18)
1. Microorganismo Streptomyces
glaucescens MTCC 5115 aislado.
2. Proceso de fermentación para la producción
del tacrolimus (FK-506) de Fórmula I,
comprendiendo el proceso la
utilización del Streptomyces glaucescens MTCC 5115
aislado.
3. Proceso para la producción del tacrolimus,
comprendiendo el proceso las etapas de cultivo de una cepa de
Streptomyces glaucescens MTCC 5115 bajo condiciones de
fermentación aeróbica sumergida en un medio nutritivo acuoso; y
aislamiento del tacrolimus de dicho medio.
4. Proceso, según la reivindicación 3, en el que
el medio nutritivo comprende una o más fuentes de carbono, fuentes
de nitrógeno y sales minerales.
5. Proceso, según la reivindicación 4, en el que
la fuente de carbono es un medio de hidratos de carbono.
6. Proceso, según la reivindicación 5, en el que
la fuente de hidratos de carbono comprende uno o más componentes de
glucosa, xilosa, galactosa, glicerol, dextrosa, almidón, dextrina,
maltosa, polietilen glicol, aceite de semilla de soja, ramnosa,
rafinosa, arabinosa, manosa, salicina y succinato sódico.
7. Proceso, según la reivindicación 4, en el que
la fuente de nitrógeno comprende uno o más de los componentes
extracto de levadura, peptona de soja, harina de semilla de soja,
harina de semilla de algodón, licor de maíz fermentado, peptona de
trigo, gluten de maíz, polvo de leche y germen de trigo.
8. Proceso, según la reivindicación 4, en el que
las sales minerales comprenden una o más sales de calcio, magnesio,
sodio, cobalto, cobre y potasio.
9. Proceso, según la reivindicación 4, en el que
el medio nutritivo comprende adicionalmente un agente
desespumante.
10. Proceso, según la reivindicación 3, en el
que durante la fermentación la temperatura se mantiene desde
aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 40ºC.
11. Proceso, según la reivindicación 10, en el
que la temperatura se mantiene desde aproximadamente 24ºC hasta
aproximadamente 35ºC.
12. Proceso, según la reivindicación 3, en el
que durante la fermentación el pH se mantiene aproximadamente entre
6,0-8,0.
13. Proceso, según la reivindicación 12, en el
que el pH se mantiene aproximadamente entre
6,8-7,5.
14. Proceso, según la reivindicación 3, en el
que el medio de cultivo es un caldo de cultivo líquido.
15. Proceso, según la reivindicación 3, en el
que el aislamiento del tacrolimus comprende una o más etapas de
filtración, centrifugación, concentración, concentración bajo
presión reducida, liofilización, acidificación, extracción con un
disolvente adecuado, tratamiento con adsorbentes, tratamiento con
resinas, purificación, y cristalización.
16. Proceso, según la reivindicación 15, que
comprende adicionalmente la recristalización del tacrolimus
aislado.
17. Proceso, según la reivindicación 16, que
comprende adicionalmente la formación a partir del producto obtenido
en una forma de dosificación acabada.
18. Proceso para la producción de una
composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz
terapéuticamente de tacrolimus (FK-506) y uno o más
transportadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente
aceptables, que comprende la producción del tacrolimus mediante el
proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17.
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