PT1468077E

PT1468077E - Estirpe mutante de actinosynnema pretiosum com produção de maitansinóide acrescida

Info

Publication number: PT1468077E
Application number: PT03734944T
Authority: PT
Inventors: Johnson Chung; Graham S Byng
Original assignee: Immunogen Inc
Priority date: 2002-01-29
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2010-10-12
Also published as: CA2474639A1; EP1468077A2; ES2348865T3; DK1468077T3; US6790954B2; JP2005519594A; US7192750B2; WO2003064610A2; EP1468077A4; US20050003513A1; EP1468077B1; SI1468077T1; ATE474043T1; AU2003238752B2; WO2003064610A3; DE60333340D1; JP5840656B2; JP2010110328A; CY1111210T1; JP2013230163A

Description

ΡΕ1468077 1

DESCRIÇÃO

"ESTIRPE MUTANTE DE ACTINOSYNNEMA PRETIOSUM COM PRODUÇÃO DE MAITANSINÓIDE ACRESCIDA"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da invenção

Esta invenção refere-se a um microrganismo que é uma estirpe bacteriana mutante da espécie Actinosynnema pretiosum, designada estirpe PF4-4 (ATCC PTA-3921), capaz de produzir ansamitocinas maitansinóides tais como a ansamitocina P-3 com um rendimento melhorado em comparação com estirpes previamente conhecidas, e métodos para produzir tais ansamitocinas maitansinóides a partir da referida estirpe PF4-4. 2. Antecedentes da invenção

As bactérias da espécie Actinosynnema pretiosum produzem antibióticos maitansinóides (Higashide et al. Nature 270, 721-722, 1977). As bactérias desta espécie foram originalmente classificadas e depositadas como Nocardia sp., no entanto a caracterização subsequente que mostrou a ausência de quaisquer ácidos micólicos, uma parede celular do tipo III/C (ácido meso-diaminopimélico e 2 ΡΕ1468077 ausência de hidratos de carbono de diagnóstico importantes) , a ausência de esporângio, e a formação de elementos para dotação de mobilidade, indicou que estas estirpes são membros do género Actinosynnema (Hasegawa, et al. "Motile Actinomycetes: Actinosynnema pretosium subsp. pretosium sp nov., subsp. nov., and Actinosynnema pretosium subsp. auranticum susp. nov." Int. J. System. Bacteriol. 33(2):314-320, 1983).

Os maitansinóides produzidos por via bacteriana são denominados ansamitocinas, e compreendem um grupo de antibióticos de ansamicina benzenóide antitumorais que se distinguem uns dos outros por intermédio das suas substituições nas posições C-3 e C-14, como ilustrado pelos substituintes R e Ri da fórmula (I).

Foram depositadas várias estirpes de Actinosynnema, tais como ATCC 315651, Actinosynnema pretiosum subsp. auranticum. As propriedades metabólicas, fisiológicas e de produção de maitansanóides da estirpe ATCC 31565 estão descritas nas patentes U.S. 4,331,598 e 4,450,234 de Hasegawa et al., concedidas, respectivamente, a 25 de Maio de 1982, e 22 de Maio de 1984. A estirpe ATCC 31565 é uma bactéria gram-positiva que é capaz de crescer numa gama alargada de fontes de carbono e que produz principalmente uma mistura de maitansinóides e maitansinóides substituídos por C-14-hidroximetilo que podem ser recolhidos do meio de cultura com um baixo rendimento. 3 ΡΕ1468077 WO01/77360 descreve métodos para a produção de ansamitocina utilizando microrganismos produtores de ansamitocina, em particular Actinosynnema pretiosum spp. tais como Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 e 31281.

Os maitansinóides foram originalmente isolados a partir de plantas Africanas (Kupchan et al. J. Amer. Chem. Soc. 94, 5294-5295, 1972). A produção de maitansinóides a partir de tais fontes era difícil dado que estavam presentes em quantidades muito pequenas. Um microrganismo produtor de maitansinóides foi subsequentemente isolado a partir de folhas de carriço, o qual foi classificado como uma nova estirpe do género Nocardia, Nocardia sp. estirpe No. C.15003 (N-l) . Esta estirpe foi depositada como ATCC 31281, e é apresentada na Patente U.S. 4,137,230 de Hashimoto et al., concedida a 30 de Janeiro de 1979, e na Patente U.S. 4,162,940 de Higashide et al., concedida a 31 de Julho de 1979. A purificação do maitansinóide a partir desta bactéria requer menos passos e resulta num rendimento superior em comparação com a purificação a partir de plantas.

Foi isolada uma segunda estirpe produtora de maitansinóides a partir de folhas de carriço, denominada Nocardia sp. Estirpe No. C-14482 (N-1001), depositada como ATCC 31309. Esta estirpe está descrita na Patente U.S. 4,2 92,30 9 de Higashide et al., concedida a 29 de Setembro de 1981. 4 ΡΕ1468077

Uma terceira estirpe foi derivada de ATCC 31309, designada C-14482, através de um processo de mutagénese. Esta terceira estirpe foi denominada Nocardia sp. No. N-1231, e foi depositada como ATCC 31565. As Patentes U.S. 4,331,598 de Hasegawa et al., concedida a 25 de Maio de 1982, e 4,450,234 de Hasegawa et al., concedida a 22 de Maio de 1984, apresentam ATCC 31565.

Todas as três estirpes Nocardia sp. acima mencionadas produzem maitansinóides denominados ansamitocinas em pequenas quantidades. Assim, foram apresentados métodos para a produção de ansamitocina P-3 utilizando Nocardia sp. Estirpe No. C-15003 (ver Patente U.S. No. 4,356,265, de Hatano et al., concedida a 26 de Outubro de 1982; e Hatano et al. "Selective accumulation of ansamitocins P-2, P-3 and P-4, and biosynthetic origins of their acyl moieties" Agric. Biol. Chem. 48, 1721-1729, 1984). De acordo com estes métodos, são obtidas quantidades do produto desejado, ansamitocina P-3, relativamente pequenas, com rendimentos de cerca de 100 mg/L de caldo de fermentação.

Os maitansinóides têm uma potente actividade citotóxica e mostraram uma forte actividade anti-tumoral quando administrados em forma conjugada comum agente de ligação celular. Por exemplo, a Patente U.S. 5,208,020 de Chari et al., submetida a 4 de Maio de 1993, apresenta um agente citotóxico compreendendo um ou mais maitansinóides ligados a um agente de direccionamento celular tal como um anticorpo, em que o maitansinóide é direccionado para a 5 ΡΕ1468077 eliminação de populações celulares seleccionadas através do agente de ligação celular específico. Do mesmo modo, a Patente U.S. 5,416,064, também de Chari et al., concedida a 16 de Maio de 1995 apresenta novos maitansinóides que estão ligados a agentes de ligação celular através de ligações dissulfureto que se podem quebrar, em que o maitansinóide é libertado intracelularmente. Estes conjugados têm potencial farmacêutico para o tratamento de vários cancros.

Devido às várias utilizações terapêuticas dos maitansinóides, existe uma necessidade para novas estirpes de bactérias que são capazes de produzir ansamitocinas com um rendimento melhorado e em quantidades suficientes para facilitar o desenvolvimento comercial, por exemplo, de agentes anti-cancro tal como descritos acima a apresentados nas Patentes U.S. 5,208,020 e 5,416,064. A presente invenção supre esta necessidade e ainda mais, como será evidente a um perito na técnica através da leitura da seguinte apresentação e dos exemplos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma estirpe bacteriana, depositada como ATCC PTA-3921, também aqui denominada "PF4-4", que produz quantidades acrescidas de maitansinóides. A estirpe PF4-4 foi obtida através de uma mutação da estirpe parental N-1231 (ATCC 31565) utilizando luz ultravioleta (luz UV), l-metil-3-nitro-l-nitroso-guanidina (MNNG), e seleccionando-se para uma produção acrescida de maitansinóide. 6 ΡΕ1468077

Assim, numa primeira realização, a invenção proporciona uma estirpe bacteriana mutada (PF4-4) da espécie Actinosynnema pretiosum com um número de acesso ATCC PTA-3921. Esta estirpe produz quantidades de ansamitocinas muito mais elevadas do que a estirpe parental.

Esta realização da invenção é capaz de produzir mais do que 500 mq/L de ansamitocina P-3, o que constitui uma melhoria no rendimento de 5- a 10- vezes em comparação com a estirpe parental.

Esta realização é ainda capaz de produzir quantidades substanciais de outras espécies de ansamitocinas, por exemplo ansamitocinas P-2 e P-4. Além disso, as quantidades especificas das espécies de ansamitocinas que são produzidas por esta realização da invenção são capazes de ser manipuladas de forma racional através da escolha da fonte de carbono utilizada para suportar o crescimento.

Esta realização é capaz de proporcionar crescimento numa elevada diversidade de fontes de carbono, e, com a excepção da sua capacidade de produzir quantidades acrescidas de maitansinóides, é substancialmente semelhante à estirpe parental (ATCC 31565) relativamente às suas caracteristicas morfológicas, fisicas e metabólicas.

Numa segunda realização, a invenção compreende um método para a produção de uma ansamitocina, que compreende 7 ΡΕ1468077 cultivar uma estirpe de Actinosynnema pretiosum tal como definida na reivindicação 1 num meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono adequada.

Assim, um objecto da presente invenção é proporcionar uma estirpe bacteriana que seja capaz de uma produção melhorada de maitansinóide, em que tais maitansi-nóides são altamente citotóxicos e podem ser usados como agentes terapêuticos, por exemplo, na forma de um conjugado com um componente especifico para determinada célula, no tratamento de diversas doenças, incluindo o cancro.

Um segundo objecto da invenção é proporcionar uma estirpe bacteriana que seja capaz de uma produção melhorada de maitansinóide de tal modo que o maitansinóide possa ser produzido em quantidades suficientes para facilitar o desenvolvimento comercial dos referidos agentes terapêuticos.

Um terceiro objecto é proporcionar um método para a produção de ansamitocinas maitansinóides a partir da estirpe PF4-4 através da cultura da referida estirpe num meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono adequada. As proporções de ansamitocinas maitansinóides produzidas por este método podem ser predeterminadas pela escolha da fonte de carbono.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG. 1 é um diagrama que ilustra o titulo de ansamitocina P-3 para 400 re-isolados de ATCC 31565. ΡΕ1468077 FIG. 2 é um diagrama que ilustra um método para a produção de ansamitocina P-3 por fermentação em balão agitado de Actinosynnema pretiosum, estirpe mutante PF4-4. FIG. 3 é um cromatograma de HPLC de uma amostra do extracto de caldo da fermentação de Actinosynnema pretiosum, estirpe mutante PF4-4.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção compreende um microrganismo que é uma estirpe bacteriana mutante da espécie Actinosynnema pretiosum, designada PF4-4 (ATCC PTA-3921), que é capaz de produzir maitansinóides, incluindo ansamitocinas tais como a ansamitocina P-3 e outras ansamitocinas com rendimentos melhorados em comparação com estirpes pre-viamente conhecidas, incluindo a estirpe parental (ATCC 31565). A estirpe bacteriana, PF4-4, da presente invenção foi produzida a partir da estirpe parental ATCC 31565 por mutação utilizando luz UV, l-metil-3-nitro-l-nitroso-guanidina (MNNG) e selecção, para se obter uma estirpe de uma bactéria geneticamente modificada que produz quantidades substancialmente mais elevadas de maitansinóides do que a estirpe parental. Assim, em crescimento fermentativo, PF4-4 é capaz de produzir mais do que 500 mg/L de ansamitocina P-3, que é 5-10 vezes mais do que a quantidade produzida pela estirpe parental sob as mesmas condições. 9 ΡΕ1468077 A estirpe Actinosynnema pretiosum da presente invenção, aqui PF4-4, foi depositada sob as disposições do Tratado de Budapeste, na American Type Culture Collection, Rockville Maryland, a 11 de Dezembro de 2001, e foi acordado o número de Acesso No. ATCC PTA-3921. A estirpe parental ATCC 31565, a partir da qual é derivada por mutação a estirpe Actinosynnema pretiosum PF4-4 da presente invenção, é por sua vez derivada da estirpe Actinosynnema pretiosum ATCC 31309, tal como apresentado na Patente U.S. 4,292,309 de Higashide et al., atribula a 29 de Setembro de 1981. Tal como descrito acima, as bactérias desta espécie foram originalmente classificadas e depositadas como Nocardia sp., no entanto caracterização subsequente indicou que estas estirpes são membros do género Actinosynnema (Hasegawa, T. et al. "Motile Actinomycetes: Actinosynnema pretosium subsp. pretosium sp nov., subsp. nov., and Actinosynnema pretosium subsp. auranticum susp. nov." Int. J. System. Bacteriol. 33(2): 314-320, 1983).

No contexto da presente invenção, o termo "maitansinóide" refere-se à classe de fármacos altamente citotóxicos primeiramente isolados do arbusto do leste de África Maytenus ovatus, e inclui ainda: maitansinol e ésteres C-3 do maitansinol que ocorrem naturalmente (Patente U.S. 4,151,042); análogos sintéticos de ésteres C-3 do maitansinol (Kupchan et al., J. Med. Chem. 21:31-37, 1978; Higashide et al. , Nature 270:721-722, 1977; Kawai et al., Chem. Farm. Buli. 32: 3441-3451; e Patente U.S. 10 ΡΕ1468077 5,416,064); ésteres C-3 de ácidos carboxílicos simples (Patentes U.S. 4,248,870; 4,265,814; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,317,821; 4,322,348; e 4,331,598); e ésteres C-3 com derivados da N-metil-L-alanina (Patentes U.S. 4,137,230; 4,260,608; e Kawai et al., Chem. Pharm Buli. 12: 3441, 1984) .

No contexto da presente invenção, o termo "ansamitocina" refere-se a vários derivados de antibióticos ansamicina (Hasegawa, T. et al. "Motile Actinomycetes: Actinosynnema pretosium subsp. pretosium sp nov., subsp. nov., and Actinosynnema pretosium subsp. auranticum susp. nov." Int. J. System. Bacteriol. 33(2): 314-320, 1983; Tanida et al. "Ansamitocin analogs from a mutant strain of nocardia. I Isolation of the mutant, fermentation and antimicrobial properties." J. Antibiotics 34: 489-495, 1981) representados pela fórmula geral (I) seguinte:

em que R representa, por exemplo, hidrogénio, acetilo, propionilo, isobutirilo, butirilo, isovalerilo, e semelhan- 11 ΡΕ1468077 tes, e em que Ri representa, por exemplo, metilo, hidro-ximetilo, e semelhantes.

Distinguem-se três classes principais de ansami-tocinas por substituintes diferentes na estrutura do anel: compostos ansamitocina P com um grupo metilo em Ri (C-14) na fórmula I; compostos ansamitocina PHM com um grupo hidroximetilo em Ri (C-14) na fórmula I; e compostos ansamitocina PDN com uma estrutura de anel N-desmetilo e um grupo metilo na posição Ri da fórmula I. Em cada classe existem diferentes membros que se distinguem por diferentes substituintes R (C-3) na fórmula I. Originalmente, as ansamitocinas com um grupo metilo em C-14 foram isoladas a partir da estirpe ATCC 31281 tal como descrito na Patente U.S. 4,162,940.

Especificamente, certas ansamitocinas são aqui designadas pelas abreviaturas dadas como se segue: P-0 tem R = hidrogénio e Ri = metilo; também denominado maitansinol P-l tem R = acetilo e Ri = metilo; P-2 tem R = propionilo e Ri = metilo; P-3 tem R = isobutirilo e Ri = metilo; P-3' tem R = butirilo e Ri = metilo; 12 ΡΕ1468077 P-4 tem R = isovalerilo e Ri = metilo; PHM-0 tem R = hidrogénio e Ri = hidroximetilo; PHM-1 tem R = acetilo e Ri = hidroximetilo; PHM-2 tem R = propionilo e Ri = hidroximetilo; PHM-3 tem R = isobutirilo e Ri = hidroximetilo; PHM-3' tem R = butirilo e Ri = hidroximetilo; PHM-4 tem R = isovalerilo e Ri = hidroximetilo; PND-0 tem N-desmetilo, R = hidrogénio e Ri = metilo; PND-1 tem N-desmetilo, R = acetilo e Ri = metilo; PND-2 tem N-desmetilo, R = propionilo e Ri = metilo; PND-3 tem N-desmetilo, R = isobutirilo e Ri = metilo; PND-3' tem N-desmetilo, R = butirilo e Ri = metilo; e PND-4 tem Aí-desmetilo, R = isovalerilo e Ri = metilo. 0 termo "ansamitocina" abrange ainda os seus isómeros, incluindo isómeros que ocorrem nas posições C-3 C-4, C-9 e C-10. 13 ΡΕ1468077 (a) Características Biológicas de Actinosynnema pretiosum, estirpe mutante PF4-4.

As características morfológicas e metabólicas da estirpe PF4-4 da presente invenção são similares àquelas da estirpe parental (ATCC 31565), com a excepção de que a estirpe PF4-4 apresenta uma produção de maitansinóide melhorada. As características morfológicas e metabólicas da estirpe parental são apresentadas na Patente U.S. 4,450,234 de Hasegawa et al., concedida a 22 de Maio de 284. (b) Geração de Actinosynnema pretiosum, estirpe mutante PF4-4. A estirpe PF4-4 é obtida a partir da estirpe parental N-1231, ATCC 31565 através do procedimento seguinte. A produção de ansamitocina P-3 por N-1231 em meio FM4-1 é cerca de 60 mg/L (média de n=400 experiências), tal como apresentado na Tabela 4, que apresenta a produção de ansamitocina P-3 (mg/L) da média de 400 colónias rastreadas individualmente, e de três colónias isoladas da estirpe N-1231 ATCC 31565, tendo a produção de ansamitocina P-3 mais elevada no meio FM4-1. Assim, num rastreio inicial, a estirpe N-1231, ATCC 31565, apresenta uma produção média de ansamitocina P-3 de 60 mg/L, e nenhuma colónia apresenta uma produção superior a 221 mg/L. ΡΕ1468077 14 TABELA 4

Cultura No. ATCC 31565 15-45 15-55 15-64 (número de experiências) (n = 400) (n = 1) (n = 1) (n = 1) Análise por HPLC P-3 (mg/L) 61 ± 35 195 221 208 Título relativo de P-3 1, 00 3,19 3, 62 3,41 A estirpe PF4-4 é preferentemente gerada a partir de ATCC 31565 em sete passos consecutivos. Estes sete passos são: re-isolamento; um primeiro passo de mutagénese; re-isola-mento, preferentemente três vezes; mutagénese com UV, e mutagénese com MNNG.

Estes passos são levados a cabo de acordo com procedimentos convencionais conhecidos pelos peritos na técnica, tal como descrito, por exemplo em Jeffrey Miller, 1992: A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold Spring Laboratory Press, Woodbury, N.Y.

Re-isolamento. A estirpe N-1231, ATCC 31565 é crescida em placas de agar em meio CM4-1 e observam-se dois fenótipos morfológicos: i.e. colónias amarelas e colónias brancas. São re-isoladas quatrocentas colónias de ambos os tipos e a sua produção de ansamitocina P-3 foi avaliada. A distribuição do teor de ansamitocina P-3 das 400 colónias é apresentada na Figura 1. As colónias brancas apresentam consistentemente títulos de AP-3 mais elevados do que as 15 ΡΕ1468077 colónias amarelas. A comparação dos títulos para a estirpe N-1231, ATCC 31565, e as três colónias com os títulos mais elevados é apresentada na Tabela 4. A Colónia No. 15-55 apresenta o título mais elevado (221 mg/L) e é utilizada no passo subsequente.

Mutagénese UV é descrita detalhadamente no EXEMPLO 1 (abaixo). Resumidamente, esporos de uma cultura em rampa com 8 dias da colónia No. 15-55 são recolhidos em água e macerados numa mistura em vórtex. Determina-se o número de unidades formadoras de colónia (ufc) e verifica-se ser tipicamente cerca de 2 x 109. Amostras diluídas em série contendo diferentes números de ufc são então espalhados em placas de agar e expostas a luz UV proveniente de uma lâmpada germicida durante períodos de tempo diferentes. A taxa de morte para uma exposição de 40 segundos a tal luz é tipicamente 99,9%. As placas tratadas durante períodos de tempo variados são incubadas a 28°C durante 5-7 dias e então seleccionam-se colónias e analisam-se para a produção de ansamitocina P-3. A colónia com a produção de ansamitocina P-3 mais elevada é seleccionada para utilização no passo seguinte.

Mutagénese MNNG é descrita em detalhe no EXEMPLO 2 (abaixo). Resumidamente, preparam-se esporos macerados tal como acima, recolhem-se por centrifugação, e são res-suspensos em tampão contendo 100 pg/mL de MNNG. Preferentemente, a reacção de mutagénese é parada após cerca de 30 min através da adição de um excesso de tiossulfato de 16 ΡΕ1468077 sódio e as bactérias são então recolhidas por centrifugação, lavadas, e plaqueadas em placas com agar para determinação da taxa de sobrevivência e para análise posterior. A Tabela 5 apresenta a genealogia da estirpe PF4-4 e a produção da ansamitocina P-3 (mg/L) por isolados intermédios, tal como analisado por HPLC (ver EXEMPLO 6) . Os meios utilizados na Tabela 5 são dados na Tabela 6A. No interior da Tabela 5, a entrada "d/n" representa o tempo de fermentação em dias (d) e o número de culturas testadas (n) . M2ÍO AICC re-i UV re-i re-i re-i UV MIC 31565 15-55 48-315 77-72 106-22 128-18 15-447 EF 4-4 EM 27-44 55 p 16 143 p 15 220 (n = 30) (8 d/n = 10) (8 d/n = 1) EM 112-37 48 p 15 331 p 24 382 (n = 10) (8 d/n = 5) (8 d/n = 1) EM 112-37 49 p 14 305 p 13 435 (n = 10) (8 d/n = 10) (8 d/n = 1) EM 4-4 64 p 26 153 268 (n = 5) (6 d/n = 1) (6 d/n = 1) EM 4-7 152 p 33 325 p 12 401 p 8 (n = 6) (6 d/n = 6) (6 d/n = 6) EM 4-6 187 p 24 369 p 16 (n = 10) (6 d/n = 4) (c) Produção de maitansinóides a partir de Actinosynnema pretiosum estirpe PF4-4 0 crescimento da estirpe bacteriana PF4-4 é levado a cabo sob condições controladas e pode utilizar uma diversidade de meios e condições. Por exemplo, a estirpe 17 ΡΕ1468077 PF4-4 pode ser crescida em condições semelhantes a com um meio semelhante aos descritos para ATCC 31565 ou ATCC 31281 nas Patentes U.S. concedidas 4,137,230; 4,162,940; 4,331,598; 4,356,265; 4,450,234; e tal como descrito em Hatano et al., Agric. Biol. Chem. 48, 1721-1729, 1984. Assim, a estirpe tolera uma grande variedade de fontes de carbono, o que também suporta a produção de maitansinóides por fermentação. São dados exemplos de meios de cultura nas Tabelas 6A e 6B. A Tabela 6A apresenta meios que suportam o crescimento de PF4-4 e que são utilizados na Tabela 5. A Tabela 6B apresenta outros meios adequados para a propagação e/ou o crescimento de PF4-4.

Um meio preferido para a produção de maitansinóides a partir da estirpe PF4-4 é representado no diagrama de fluxo da Figura 2 e é ainda descrito no EXEMPLO 3 (abaixo). TABELA 6A As entradas de composição são em % (p/v). A esterilização foi a 121°C durante 20 minutos. FM 27-44 FM 112-37 FM 4-4 FM 4-6 FM 4-7 Dextrina (Lodex-5) 6 6 5 5 5 Maltose (Difco) 4 4 2 2 2 Proflo (Traders) 2,0 2,5 2,75 Farinha de Soja (ADM) 1,5 2,0 Pharmamedia (Traders) 0,5 CSP (Roquette) 0,5 0,5 0,5 0,15 0,15 Levedura Seca (Difco) 0,25 MgS04-7H20 (Wako) 0, 05 18 ΡΕ1468077 (continuação) FM 27-44 FM 112-37 FM 4-4 FM 4-6 FM 4-7 CaC03 (Hayashi) 0,5 0,5 0,6 (NH4)2S04 (Wako) 0, 05 KH2P04 (Wako) 0, 05 0, 04 K2HP04 (Wako) 0, 05 0, 06 0, 06 0,06 CaCl2·2H20 (Wako) 0,5 0,5 NaHC03 (Wako) 0,2 Zeólito 0,1 FeS04·7H20 (Wako) 0,0002 0,0002 0,0002 0,0002 0,0002 ZnS04·7H20 0,0002 CoCl2·6H20 (Baker) 0, 001 0,0005 0,0005 Ácido nicotínico 0,0002 MnS04·H20 0,0002 Isobutanol1 (Tedoa) 0,1 0,5 0,5 0,3 0,3 SAG471 (Witco) 0 0, 06 0, 04 0,04 pH 6, 8 6, 8 6, 8 7,2 7,35 1 Adicionado em último lugar TABELA 6B Meios Relacionados Cultura em rampa e em placa, Agar CM4-1 (%, p/v)

Extracto de Levedura (Difco) 0,3

Extracto de Malte (Difco) 0,3

Soytone (Difco) 0,5

Glicerol (Difco) 1,0

Bacto Agar (Difco) 2,0

Ajustar o pH a 6,5 antes da esterilização Esterilização: 121°C, 20 minutos 19 ΡΕ1468077

Meio de inoculo, VM4-1 (%, p/v)

Amido solúvel (BDH) 2,0 Glucose (Shuling) 1,0 Farinha de Soja (ADM) 1,0 CSP (Roquette) 0,5 Soytone (Difco) 0,5 NaCl (Wako) 0,3 CaC03 (Hayashi) 0,5 Soytone (Difco) 0,5 pH: 6,5

Esterilização: 121°C, 20 minutos Análise de ansamitocinas

Nas Patentes U.S. 4,331,598 e 4,450,234, a estirpe parental ATCC 31565 é apresentada como produzindo duas classes de ansamitocinas que se distinguem pela presença de um grupo metilo ou hidroximetilo em C-14 (ver fórmula I) . Para ambas as classes, são produzidas várias ansamitocinas diferentes que diferem na sua respectiva cadeia lateral acilo ligada ao grupo hidroxilo C-3, e relativamente a se C-14 suporta um grupo metilo ou hidroximetilo (ou, em estudos subsequentes, N-desmetilo). A nomenclatura aqui utilizada para os compostos permutados é definida acima com referência à fórmula (I). 20 ΡΕ1468077 A ansamitocina P-3 é o produto principal de PF4-4 e a estirpe parental ATCC 31565, sob certas condições de crescimento. Se as bactérias são crescidas na presença de valina ou de ácido isobutirico (ver Patente U.S. 4,228,239) ou álcool isobutilico ou isobutaldeido (ver Patente U.S. 4,356,265), estão presentes em pequenas quantidades outros compostos ansamitocina.

Quando a estirpe PF4-4 é crescida em diferentes meios de fermentações (designados FM na Tabela 6), todos os quais contêm álcool isobutilico, a ansamitocina P-3 é a ansamitocina produzida em predominância. Os meios de fermentação são diluidos com etanol ou acetonitrilo, agitados em vórtex, depois centrifugados e o sobrenadante testado relativamente ao teor em ansamitocina P-3.

As ansatomicinas são preferentemente fraccionadas e analisadas por cromatografia líquida de elevada eficiência (hplc) de fase reversa, mas pode ser utilizada qualquer técnica adequada, tal como, por exemplo, MALDI-TOF ou cromatografia em camada fina. Num método utilizando HPLC, os caldos de fermentação são extraídos com solventes orgânicos, tais como acetato de etilo, cloreto de metileno, ou clorofórmio, e o teor de P-3 no solvente orgânico é determinado por hplc de fase reversa tal como descrito no EXEMPLO 6. 21 ΡΕ1468077

EXEMPLOS A invenção será agora ilustrada por referência a exemplos não limitativos. EXEMPLO 1

Mutagénese por UV

Recolheram-se esporos de uma preparação em rampa com 8 dias da colónia No. 15-55 através da lavagem da rampa [dimensão da rampa: tubo de 2,3 x 18 cm cheio com 16-18 mL de agar CM4-1 (para composição, ver Tabela 6b) ] com 10 mL de água. Colocaram-se cinco mL da água com os esporos em suspensão num tubo com tampa de rosca (tamanho: 1,1 x 11 cm) contendo 10 esferas de vidro de 2,0 mm de diâmetro para maceração. O tubo foi agitado num vórtex durante cinco minutos e a suspensão de esporos macerados foi então diluida em série numa solução aquosa de Tween 60 a 0,1% nas diluições ΙΟ3, 104 e 105. (A suspensão macerada contém tipicamente 2 x 109 ufc) . De cada diluição, plaqueia-se 0,1 mL da suspensão numa placa de agar CM4-1 (9,5 cm de diâmetro) , que foi exposta a uma fonte de luz UV germicida adequada: a placa de agar aberta foi colocada sob uma lâmpada germicida de 15 W a cerca de uma distância de 20 cm e exposta durante 20-40 segundos à luz UV. (A taxa de morte para uma exposição de 40 segundos era cerca de 99, 9%) . As placas expostas foram cultivadas a 28°C durante 5-7 dias, e foram então transferidas colónias isoladas para outra placa 22 ΡΕ1468077 de agar CM4-1 e crescidas em grelhas de 16 colónias por placa. As colónias foram então escolhidas para avaliação suplementar. EXEMPLO 2

Mutagénese MNNG

Recolheram-se esporos de uma preparação em rampa com 8 dias através da lavagem da rampa (dimensão da rampa: tubo de 2,3 x 18 cm cheio com 16-18 mL de agar CM4-1) com 10 mL de água. Colocaram-se cinco mL da água com os esporos em suspensão num tubo com tampa de rosca (tamanho: 1,1 x 11 cm) contendo 10 esferas de vidro de 2,0 mm de diâmetro para maceração. O tubo foi agitado num vórtex durante cinco minutos e os esporos foram recolhidos por centrifugação a 2100 x g durante 15 min. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspendido em 4 mL de tampão de ácido maléico tris a 0,05 M estéril, pH 8,0 contendo (p/v) 0,1% de sulfato de amónio, 0,01% de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 0,005% de cloreto de cálcio di-hidratado, 0,00025% de sulfato ferroso hepta-hidratado, e 100 pg de MNNG. A suspensão foi agitada sob vórtex durante 30 min, a reacção foi parada pela adição de 3 mL de uma solução saturada de tiossulfato de sódio. Os esporos foram recolhidos por centrifugação, depois ressuspenso em 5 mL de água. Esta suspensão foi usada para selecção e uma diluição apropriada foi esfregada numa placa de agar CM4-1 para determinar a taxa de sobrevivência. 23 ΡΕ1468077 EXEMPLO 3

Fermentação em balão agitado para produzir ansamitocina a partir de PF4-4.

Uma cultura PF4-4 armazenada, por exemplo uma cultura liofilizada ou congelada, foi crescida em placas de agar CM4-1 a 28°C durante 5-7 dias. Depois transferiram-se colónias isoladas para uma segunda placa de agar CM4-1 com grelha (tipicamente, transferiram-se 16 colónias para uma placa com um diâmetro de 9,5 cm), e a placa foi incubada a 28°C durante 7 dias, período durante o qual cresceram colónias com um diâmetro de 6-15 mm. Macerou-se então uma única colónia através da agitação com vórtex durante 10 minutos num tubo fechado contendo dez esferas de vidro com um diâmetro de 2 mm e 2 mL de água. Parte da suspensão da colónia (0,5 mL) foi então transferida para um balão de cultura de 250 mL contendo 30 mL de meio de preparação de inoculo, VM4-1 (para composição, ver a Tabela 6b) . O balão de inoculo foi incubado num agitador orbital (220 rpm, órbita de 70 mm) a 28°C durante 48 horas, após o que se transferiu 1 mL da suspensão crescida de inoculo para um balão de cultura de 250 mL contendo 20 mL de meio de fermentação FM4-4. 0 balão de fermentação foi incubado sob as mesmas condições que o balão de inoculo durante 6 dias, após o que a produção de ansamitocina foi testada tal como descrito no EXEMPLO 6 e verificou-se ser 268 mg/L. 24 ΡΕ1468077

Podem ser utilizados meios de fermentação diferentes. Exemplos de meios de cultura preferidos e dos niveis de produção de ansamitocina P-3 correspondentes são listados na Tabela 5 e as composições dos meios de cultura são apresentados na Tabela 6a. EXEMPLO 4

Preparação de culturas PF4-4 congeladas para armazenamento de longa duração.

Preparou-se uma suspensão de colónia macerada em 2 mL de água tal como descrito no EXEMPLO 3, depois inoculou-se 0,2 mL da suspensão numa cultura em rampa (dimensão da rampa: 2,3 x 18 cm cheia com 16-18 mL de agar CM4-1) e incubou-se a 28°C durante 7 dias. A rampa foi lavada com 10 mL de solução criogénica (10% de glicerol e 5% de lactose em água) , a qual foi então submetida ao procedimento de maceração descrito acima. A suspensão macerada foi dividida em aliquotas (1,5 mL) em criotubos e congelada a 75°C ou em azoto liquido. EXEMPLO 5

Preparação de bactérias PF4-4 liofilizadas para armazenamento de longa duração.

Uma cultura em rampa de 8 dias (dimensão da rampa: 2,3 x 18 cm cheia com 16-18 mL de agar CM4-1) foi raspada para 3 mL de uma solução de leite desnatado (5% 25 ΡΕ1468077 (p/v) de leite desnatado em pó em água) . A suspensão foi então macerada num tubo fechado contendo dez esferas de vidro com um diâmetro de 2 mm por agitação em vórtex durante 5 min. Distribuíram-se alíquotas de 0,5 mL em tubos e liofilizou-se. Cada tubo continha preferentemente cerca de 1,2 x 108 ufc. EXEMPLO 8

Análise de ansamitocina P-3 no caldo de fermentação

Transferiu-se caldo de fermentação (0,25 mL) para um tubo com tampa de rosca contendo etanol (4,75 mL) . (Alternativamente, misturou-se 0,25 mL do meio de fermentação completo com 2,25 mL de etanol). A solução foi agitada em vórtex durante dez minutos e depois centrifugada a 2100 x g durante dez minutos. O sobrenadante foi removido e submetido a análise por hplc de fase reversa. Preferentemente, utilizou-se uma coluna Symmetry Sheild C8 (3, 6 x 150 mm). A fase móvel foi preferentemente água/acetoni-trilo/metanol a uma razão (v/v) de 55/35/10 e foi preferentemente utilizada a um caudal de 1,0 mL/min. A cromato-grafia foi monitorizada medindo a absorção UV a 252 nm. Um cromatograma típico de hplc de um extracto de caldo é apresentado na Figura 3, na qual a ansamitocina P-3 elui a cerca de 12,2 minutos após a injecção.

Lisboa, 30 de Setembro de 2010

Claims

ΡΕ1468077 1 REIVINDICAÇÕES 1. A estirpe Actinosynnema pretiosum com um número de acesso ATCC PTA-3921.
2. Um método para a produção de uma ansamito-cina, compreendendo a cultura de uma estirpe Actinosynnema pretiosum tal como definida na reivindicação 1 num meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono adequada.
3. O método da reivindicação 2, em que a referida ansamitocina é uma ou mais ansamitocinas de fórmula (I) ou os seus isómeros:

em que R é seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, acetilo, propionilo, isobutirilo, butirilo, e isovalerilo, e Ri é seleccionado do grupo que consiste em metilo e hidroximetilo. 2 ΡΕ1468077
4. O método a reivindicação 2, em que a ansami-tocina é ansamitocina P-3.
5. 0 método da reivindicação 2, em que a referida ansamitocina é predominantemente ansamitocina P-3 e a referida fonte de carbono compreende uma ou mais fontes de carbono seleccionadas do grupo que consiste em valina, ácido isobutirico, álcool isobutilico, e isobutaldeido. Lisboa, 30 de Setembro de 2010