ES2348865T3 - Cepa de actinosynnema pretiosum mutante con aumento de la produccion de maitansinoide. - Google Patents
Cepa de actinosynnema pretiosum mutante con aumento de la produccion de maitansinoide. Download PDFInfo
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Abstract
Cepa de Actinosynnema pretiosum que tiene el número de registro de ATCC PTA-3921.
Description
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0001] Esta invención se refiere a un microorganismo que
es una cepa bacteriana mutante de la especie Actinosynnema
pretiosum, designada cepa PF4-4 (ATCC PTA-3921), que puede
producir maitansinoides ansamitocinas tales como ansamitocina
P-3 con rendimiento mejorado en comparación con cepas
conocidas anteriores, y a métodos de producción de tales
ansamitocinas maitansinoides a partir de dicha de cepa PF4-4.
[0002] Las bacterias de la especie Actinosynnema pretiosum
producen antibióticos maitansinoides citotóxicos (Higashide et
al. Nature 270, 721-722, 1977). Las bacterias de esta especie
originalmente se clasificaron y depositaron como Nocardia sp.,
sin embargo, la caracterización posterior que demostró la
ausencia de cualquier ácido micólico, pared celular de tipo
III/C (ácido meso-diaminopimélico y sin hidratos de carbono
importantes en el diagnóstico), una falta de esporangios y la
formación de elementos móviles, indicó que estas cepas son
miembros del género Actinosynnema (Hasegawa, et al. “Motile
Actinomycetes: Actinosynnema pretosium subsp. pretosium sp
nov., subsp. nov., y Actinosynnema pretosium subsp. auranticum
susp. nov.” Int. J. Sistem. Bacteriol. 33(2):314-320, 1983).
[0003] Los maitansinoides producidos por bacterias se
denominan ansamitocinas, y comprenden un grupo de antibióticos
de ansamicinas bencenoides antitumorales que se distinguen
entre sí por sus sustituciones en las posiciones C-3 y C-14,
tal como se muestra mediante los sustituyentes R y R1 de la
fórmula (I).
[0004] Se han depositado varias cepas de Actinosynnema,
tales como ATCC 315651, Actinosynnema pretiosum subsp.
auranticum. Las propiedades metabólicas, fisiológicas y de
producción de maitansanoide de ATCC 31565 se describen en las
patentes estadounidenses 4.331.598 y 4.450.234 concedidas a
Hasegawa et al., expedidas el 25 de mayo de 1982 y el 22 de
mayo de 1984, respectivamente. ATCC 31565 es una bacteria
gram-positiva que puede crecer en una amplia gama de fuentes
de carbono y que produce principalmente una mezcla de
maitansinoides y de maitansinoides sustituidos con C-14hidroximetilo que puede recogerse del medio de crecimiento con
bajo rendimiento.
[0005] El documento WO01/77360 describe métodos para la
producción de ansamitocina usando microorganismos productores
de ansamitocina, en particular Actinosynnema pretiosum spp.
tal como Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 y 31281.
[0006] Los maitansinoides se aislaron originalmente de
plantas africanas (Kupchan et al. J. Amer. Chem. Soc. 94,
5294-5295, 1972). La producción de maitansinoides a partir de
tales fuentes era difícil porque estaban presentes en
cantidades muy pequeñas. Posteriormente se aisló un
microorganismo productor de maitansinoide de hojas de junco,
que se clasificó como una nueva cepa del género Nocardia,
Nocardia sp. cepa n.º C-15003 (N-1). Esta cepa se depositó
como (ATCC 31281, y se da a conocer en la patente
estadounidense 4.137.230 concedida a Hashimoto et al.,
expedida el 30 de enero de 1979, y la patente estadounidense
4.162.940 concedida a Higashide et al., expedida el 31 de
julio de 1979. La purificación de maitansinoide a partir de
esta bacteria requiere menos etapas y da como resultado un
aumento del rendimiento en comparación con la purificación a
partir de fuentes vegetales.
[0007] Se aisló una segunda cepa productora de
maitansinoide de hojas de junco, denominada Nocardia sp. cepa
n.º C-14482 (N-1001), depositada como ATCC 31309. Esta cepa se
da a conocer en la patente estadounidense 4.292.309 concedida
a Higashide et al., expedida el 29 de septiembre de 1981.
[0008] Se derivó una tercera cepa de ATCC 31309, designada
C-14482, mediante un procedimiento de mutagénesis. Esta
tercera cepa se denominó Nocardia sp. n.º N-1231, y se
depositó como ATCC 31565. Las patentes estadounidenses
- 4.331.598
- concedida a Hasegawa et al., expedida el 25 de mayo de 1982, y 4.450.234 concedida a Hasegawa et al., expedida el 22 de mayo de 1984, dan a conocer ATCC 31565. [0009] Las tres cepas de Nocardia sp. anteriormente mencionadas producen maitansinoides denominados ansamitocinas en pequeñas cantidades. Por tanto, se han dado a conocer métodos para la producción de ansamitocina P-3 usando Nocardia sp. cepa n.º C-15003 (véase, patente estadounidense n.º 4.356.265, concedida a Hatano et al., expedida el 26 de octubre de 1982; y Hatano et al. “Selective accumulation of ansamitocins P-2, P-3 y P-4, and biosynthetic origins of their acyl moieties” Agric. Biol. Chem. 48, 1721-1729, 1984). Según estos métodos, se obtienen cantidades relativamente pequeñas del producto deseado, ansamitocina P-3, con rendimientos de aproximadamente 100 mg/l de caldo de fermentación. [0010] Los maitansinoides tienen potente actividad citotóxica y han demostrado fuerte actividad antitumoral cuando se administran en forma de conjugado con un agente de unión a células. Por ejemplo, la patente estadounidense
- 5.208.020
- concedida a Chari et al., expedida el 4 de mayo de 1993, da a conocer un agente citotóxico que comprende uno o más maitansinoides unidos a un agente de direccionamiento celular tal como un anticuerpo, mediante el cual el maitansinoide se dirige hacia poblaciones de células seleccionadas para su destrucción mediante el agente de unión a células específico. Asimismo, la patente estadounidense 5.416.064, concedida también a Chari et al., expedida el 16 de mayo de 1995, da a conocer nuevos maitansinoides que se unen a agentes de unión a células mediante enlaces disulfuro escindibles, mediante los cuales se libera el maitansinoide intracelularmente. Estos conjugados tienen potencial farmacéutico para el tratamiento de diversos cánceres.
[0011] Debido a los muchos usos terapéuticos de los
maitansinoides, existe una necesidad de nuevas cepas de
bacterias que puedan producir ansamitocinas con rendimiento
mejorado y en cantidades suficientes para facilitar el
desarrollo comercial, por ejemplo, de tales agentes
anticancerígenos tal como se describieron anteriormente y se
dieron a conocer en las patentes estadounidenses 5.208.020 y
5.416.064. La presente invención satisface esta necesidad y
más, tal como resultará evidente para un experto en la técnica
al leer la descripción y los ejemplos siguientes.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0012] La presente invención proporciona una cepa
bacteriana, depositada como ATCC PTA-3921, también denominada
en el presente documento “PF4-4,” que produce cantidades
aumentadas de maitansinoides. Se obtuvo PF4-4 mediante
mutación de la cepa original N-1231 (ATCC 31565) usando luz
ultravioleta (luz UV), 1-metil-3-nitro-1-nitroso-guanidina
(MNNG) y selección para detectar la producción de
maitansinoide potenciada.
[0013] Por tanto, en una primera realización, la invención
comprende una cepa bacteriana mutada (PF4-4) de la especie
Actinosynnema pretiosum que tiene el número de registro de
ATCC PTA-3921. Esta cepa produce cantidades mucho más altas de
ansamitocinas que la cepa original.
[0014] Esta realización de la invención puede producir más
de 500 mg/l de ansamitocina P-3, que es una mejora del
rendimiento de 5 a 10 veces en comparación con la cepa
original.
[0015] Esta realización además puede producir cantidades
sustanciales de otras especies de ansamitocinas, por ejemplo
ansamitocinas P-2 y P-4. Además, las cantidades relativas de
las especies de ansamitocinas específicas que se producen
mediante esta realización de la invención pueden manipularse
de manera racional mediante la elección de la fuente de
carbono usada para sustentar el crecimiento.
[0016] Esta realización puede crecer con una amplia
variedad de fuentes de carbono y, con la excepción de su
capacidad para producir cantidades aumentadas de
maitansinoides, es sustancialmente similar a la cepa original
(ATCC 31565) con respecto a sus características morfológicas,
físicas y metabólicas.
[0017] En una segunda realización, la invención comprende
un método para producir un ansamitocina, que comprende
cultivar una cepa de Actinosynnema pretiosum tal como se
define en la reivindicación 1 en un medio de cultivo que
comprende una fuente de carbono adecuada.
[0018] Por tanto, un objeto de la presente invención es
proporcionar una cepa bacteriana que puede potenciar la
producción de maitansinoide, mediante lo cual tales
maitansinoides son altamente citotóxicos y pueden usarse como
agentes terapéuticos, por ejemplo en forma de un conjugado con
un componente específico de células, en el tratamiento de
muchas enfermedades, incluyendo cáncer.
[0019] Un segundo objeto de la invención es proporcionar
una cepa bacteriana que puede potenciar la producción de
maitansinoides de manera que puede producirse maitansinoide en
cantidades suficientes para facilitar el desarrollo comercial
de dichos agentes terapéuticos.
[0020] Un tercer objeto es proporcionar un método para la
producción de maitansinoides ansamitocinas a partir de la cepa
PF4-4 cultivando dicha cepa en un medio de crecimiento que
comprende una fuente de carbono adecuada. Las proporciones de
maitansinoides ansamitocinas producidos mediante este método
pueden predeterminarse mediante la elección de la fuente de
carbono.
La figura 1 es un diagrama que muestra el título de
ansamitocina P-3 para 400 reaislados de ATCC
31565.
La figura 2 es un diagrama que muestra un método para la
producción de ansamitocina P-3 mediante
fermentación en matraz con agitación de
Actinosynnema pretiosum, cepa mutante PF4-4.
La figura 3 es un cromatograma de HPLC de una muestra de
extracto de caldo de la fermentación de
Actinosynnema pretiosum, cepa mutante PF4-4.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0022] La presente invención comprende un microorganismo
que es una cepa bacteriana mutante de la especie Actinosynnema
pretiosum, designada PF4-4 (ATCC PTA-3921), que puede producir
maitansinoides, incluyendo ansamitocinas tales como
ansamitocina P-3 y otras ansamitocinas con rendimientos
mejorados en comparación con las cepas anteriormente
conocidas, incluyendo la cepa original (ATCC 31565).
[0023] La cepa bacteriana, PF4-4, de la presente invención
se produjo a partir de la cepa original ATCC 31565 mediante
mutación usando luz UV, 1-metil-3-nitro-1-nitroso-guanidina
(MNNG) y selección, para derivar una cepa de bacterias
genéticamente alteradas que produce cantidades sustancialmente
superiores de maitansinoides que la cepa original. Por tanto,
en crecimiento fermentativo, PF4-4 puede producir más de 500
mg/l de ansamitocina P-3, que es 5-10 veces más que la
cantidad producida por la cepa original en las mismas
condiciones.
[0024] La cepa de Actinosynnema pretiosum de la presente
invención, en el presente documento PF4-4, se depositó según
las disposiciones del Tratado de Budapest en la Colección
Americana de cultivos tipo (American Type Culture Colletion),
Rockville Maryland, el 11 de diciembre de 2001, y se le ha
concedido el n.º de registro de ATCC PTA-3921.
[0025] La propia cepa original ATCC 31565, de la que se
deriva la cepa de Actinosynnema pretiosum PF4-4 de la presente
invención mediante mutación, se deriva de la cepa de
Actinosynnema pretiosum ATCC 31309, tal como se da a conocer
en la patente estadounidense 4.292.309, concedida a Higashide
et al., expedida el 29 de septiembre de 1981. Tal como se
describió anteriormente, las bacterias de esta especie
originalmente se clasificaron y depositaron como Nocardia sp.,
sin embargo la caracterización posterior indicó que estas
cepas son miembros del género Actinosynnema (Hasegawa, T. et
al. “Motile Actinomycetes: Actinosynnema pretosium subsp.
pretosium sp nov., subsp. nov., y Actinosynnema pretosium
subsp. auranticum susp. nov.” Int. J. Sistem. Bacteriol.
33(2): 314-320, 1983).
[0026] En el contexto de la presente invención, el término
“maitansinoide” se refiere a la clase de fármacos altamente
citotóxicos aislados por primera vez del arbusto de África
oriental Maytenus ovatus, e incluye además: maitansinol y
ésteres C-3 de maitansinol que se producen de manera natural
(patente estadounidense 4.151.042); análogos de éster C-3 de
maitansinol sintéticos (Kupchan et al., J. Med. Chem. 21:3137, 1978; Higashide et al., Nature 270:721-722, 1977; Kawai et
al., Chem. Farm. Bull. 32:3441-3451; y patente estadounidense
5.416.064); ésteres C-3 de ácidos carboxílicos sencillos
(patentes estadounidenses 4.248.870; 4.265.814; 4.308.268;
4.308.269; 4.309.428; 4.317.821; 4.322.348; y 4.331.598); y
ésteres C-3 con derivados de N-metil-L-alanina (patentes
estadounidenses 4.137.230; 4.260.608; y Kawai et al., Chem.
Pharm Bull. 12:3441, 1984).
[0027] En el contexto de la presente invención, el término
“ansamitocina” se refiere a diversos derivados de antibióticos
de ansamicina (Hasegawa, T. et al. “Motile Actinomycetes:
Actinosynnema pretosium subsp. pretosium sp nov., subsp. nov.,
y Actinosynnema pretosium subsp. auranticum susp. nov.” Int.
J. Sistem. Bacteriol. 33(2):314-320, 1983; Tanida et al.
“Ansamitocin analogs from a mutant strain of nocardia. I
Isolation of the mutant, fermentation and antimicrobial
properties.” J.Antibiotics 34: 489-495, 1981) representados
mediante la siguiente fórmula general (I):
en la que R representa, por ejemplo, hidrógeno, acetilo,
propionilo, isobutirilo, butirilo, isovalerilo y similares, y
10 en la que R1 representa, por ejemplo, metilo, hidroximetilo y similares. [0028] Se distinguen tres clases principales de ansamitocinas mediante diferentes sustituyentes en la estructura de anillo: compuestos de ansamitocina P con un
15 grupo metilo en R1 (C-14) en la fórmula I; compuestos de ansamitocina PHM con un grupo hidroximetilo en R1 (C-14) en la fórmula I; y compuestos de ansamitocina PDN con una estructura de anillo de N-desmetilo y un grupo metilo en la posición R1 de la fórmula I. En cada clase, existen varios miembros que se
20 distinguen mediante diferentes sustituyentes R (C-3) en la fórmula I. Originalmente, se aislaron las ansamitocinas con un grupo metilo en C-14 de la cepa ATCC 31281, tal como se describe en la patente estadounidense 4.162.940. [0029] Específicamente, se designan determinadas
25 ansamitocinas en el presente documento mediante las
abreviaturas facilitadas a continuación:
P-0 tiene R = hidrógeno y R1 = metilo; también denominada
maitansinol
P-1 tiene R = acetilo y R1 = metilo;
30 P-2 tiene R = propionilo y R1 = metilo;
P-3 tiene R = isobutirilo y R1 = metilo;
P-3’ tiene R = butirilo y R1 = metilo;
P-4 tiene R = isovalerilo y R1 = metilo;
PHM-0 tiene R = hidrógeno y R1 = hidroximetilo;
PHM-1 tiene R = acetilo y R1 = hidroximetilo;
PHM-2 tiene R = propionilo y R1 = hidroximetilo;
PHM-3 tiene R = isobutirilo y R1 = hidroximetilo;
PHM-3’ tiene R = butirilo y R1 = hidroximetilo;
PHM-4 tiene R= isovalerilo y R1 = hidroximetilo;
PND-0 tiene N-desmetilo, R = hidrógeno y R1 = metilo;
PND-1 tiene N-desmetilo, R = acetilo y R1 = metilo;
PND-2 tiene N-desmetilo, R = propionilo y R1 = metilo;
PND-3 tiene N-desmetilo, R = isobutirilo y R1 = metilo;
PND-3’ tiene N-desmetilo, R = butirilo y R1 = metilo; y
PND-4 tiene N-desmetilo, R = isovalerilo y R1 = metilo.
[0030] El término “ansamitocina” abarca además isómeros de
la misma, incluyendo isómeros que se producen en las
posiciones C-3, C-4, C-9 y C-10.
- (a)
- Características biológicas de Actinosynnema pretiosum, cepa mutante PF4-4. [0031] Las características morfológicas y metabólicas de la cepa PF4-4 de la presente invención son similares a las de la cepa original (ATCC 31565, con la excepción de que la cepa PF4-4 presenta una producción de maitansinoide potenciada. Las características morfológicas y metabólicas de la cepa original se dan a conocer en la patente estadounidense 4.450.234 concedida a Hasegawa et al., expedida el 22 de mayo de 1984.
- (b)
- Generación de Actinosynnema pretiosum, cepa mutante PF4-4. [0032] La cepa PF4-4 se obtiene a partir de la cepa original N-1231, ATCC 31565, mediante el siguiente procedimiento. La producción de ansamitocina P-3 por N-1231 en el medio FM4-1 es de aproximadamente 60 mg/l (promedio de n=400 experimentos), tal como se muestra en la tabla 4, que muestra la producción de ansamitocina P-3 (mg/l) del promedio
de 400 colonias examinadas individualmente, y las tres
colonias aisladas de la cepa N-1231, ATCC 31565, que tienen la
producción de ansamitocina P-3 más alta en el medio FM4-1. Por
tanto, en el examen inicial, la cepa N-1231, ATCC 31565,
presenta una producción promedio de ansamitocina P-3 de 60
mg/l, y ninguna colonia presenta una producción mayor de 221
mg/l.
TABLA 4
- Cultivo n.º (número de experimentos)
- ATCC 31565 (n = 400) 15-45 (n = 1) 15-55 (n = 1) 15-64 (n = 1)
- Ensayo de HPLC
- P-3 (mg/l) 61 ± 35 195 221 208
- Título de P-3 relativo
- 1,00 3,19 3,62 3,41
10 [0033] La cepa PF4-4 se genera preferiblemente a partir de ATCC 31565 en siete etapas consecutivas. Estas siete etapas son: reaislamiento; una primera ronda de mutagénesis; reaislamiento, preferiblemente tres veces; mutagénesis con UV y mutagénesis con MNNG.
15 [0034] Estas etapas se realizan según procedimientos convencionales conocidos para los expertos en la técnica, tal como se describen, por ejemplo, en Jeffrey Miller, 1992: A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold
20 Spring Laboratory Press, Woodbury, N.Y. [0035] Reaislamiento. Se hace crecer la cepa N-1231, ATCC 31565 en placas de agar en medio CM4-1 y se observan dos fenotipos morfológicos: a saber, colonias de color amarillo y colonias de color blanco. Se reaíslan cuatrocientas colonias
25 de ambos tipos y se somete a ensayo su producción de ansamitocina P-3. En la figura 1 se muestra la distribución del título de ansamitocina P-3 de las 400 colonias. Las colonias de color blanco dan de manera constante títulos de
AP-3 superiores a los de las colonias de color amarillo. En la
tabla 4 se muestra la comparación del título para la cepa N1231, ATCC 31565, y las tres colonias con los títulos más
altos. La colonia n.º 15-55 presenta el título más alto (221
mg/l) y se usa en la etapa posterior.
[0036] La mutagénesis con UV se describe en detalle en el
EJEMPLO 1 (a continuación). En resumen, se recogen esporas de
un cultivo en agar inclinado de 8 días de la colonia n.º 15-55
en agua y se maceran en una mezcla sometida a agitación con
vórtex. Se determina el número de unidades formadoras de
colonias (ufc) y normalmente se encuentra que es de
aproximadamente 2 x 109. Entonces se extienden las muestras
diluidas en serie que contienen números de ufc variables sobre
placas de agar y se exponen a luz UV de una lámpara germicida
durante periodos de tiempo variables. La tasa de destrucción
para una exposición de 40 segundos a tal luz normalmente es
del 99,9%. Se incubaron las placas tratadas durante diferentes
periodos de tiempo a 28ºC durante 5-7 días y entonces se
seleccionan las colonias y se analizan para determinar la
producción de ansamitocina P-3. Se selecciona la colonia que
tiene la producción de ansamitocina P-3 más alta para su uso
en la siguiente etapa.
[0037] La mutagénesis con MNNG se describe en detalle en
el EJEMPLO 2 (a continuación). En resumen, se preparan esporas
maceradas como anteriormente, se recogen mediante
centrifugación y se resuspenden en tampón que contiene MNNG
100 µg/ml. Preferiblemente, se detiene la reacción de mutagénesis tras aproximadamente 30 min. mediante la adición de tiosulfato de sodio en exceso y entonces se recogen las bacterias mediante centrifugación, se lavan y se siembran en placa en placas de agar para la determinación de la tasa de supervivencia y para análisis adicional. [0038] La tabla 5 muestra la genealogía de la cepa PF4-4 y la producción mediante aislados intermedios de ansamitocina P3 (mg/l) tal como se sometió a ensayo mediante HPLC (véase el
EJEMPLO 6). Los medios usados en la tabla 5 se facilitan en la
tabla 6A. Dentro de la tabla 5, la entrada “d/n” representa el
tiempo de fermentación en días (d) y el número de cultivos
sometidos a prueba (n).
TABLA 5
- Medio
- → → → → → → → →
- ATCC
- re-i UV re-i re-i re-i UV MNNG
- 31565
- 15-55 48-315 77-72 106-26 128-18 15-447 PF 4-4
- FM 27-44
- 55 ρ 16 (n = 30) 143 ρ 15 (8 d/n = 10) 220 (8 d/n = 1)
- FM 112-37
- 48 ρ 15 (n = 10) 331 ρ 24 (8 d/n = 5) 382 (8 d/n = 1)
- FM 112-37
- 49 ρ 14 (n = 10) 305 ρ 13 (8 d/n = 10) 435 (8 d/n = 1)
- FM4-4
- 64 ρ 26 153 268
- (n = 5)
- (6 d/n (6 d/n
- = 1)
- = 1)
- FM 4-7
- 152 ρ 33 325 ρ 401 ρ 8
- (n = 6)
- 12 (6 d/n (6 d/n = 6)
- = 6)
- FM 4-6
- 187 ρ 24 369 ρ
- (n = 5)
- 16 (6 d/n = 4)
10 [0039] Se realiza el crecimiento de la cepa bacteriana PF4-4 en condiciones controladas y puede emplearse una amplia variedad de medios y condiciones. Por ejemplo, PF4-4 puede hacerse crecer en condiciones similares y con medios similares a los descritos para ATCC 31565 o ATCC 31281 en las patentes
15 estadounidenses expedidas 4.137.230; 4.162.940; 4.331.598;
4.356.265; 4.450.234; y tal como se describe en Hatano et al.,
Agric. Biol. Chem. 48, 1721-1729, 1984. Por tanto, la cepa
PF4-4 tolera una amplia variedad de fuentes de carbono, que
también sustentan la producción fermentativa de
5 maitansinoides. En las tablas 6A y 6B se facilitan medios de crecimiento a modo de ejemplo. La tabla 6A muestra medios que sustentan el crecimiento de PF4-4 y que se utilizan en la tabla 5. La tabla 6B muestra medios adicionales adecuados para la propagación y/o el crecimiento de PF4-4.
10 [0040] En el diagrama de flujo de la figura 2, se representa un método preferido para la producción fermentativa de maitansinoides de la cepa PF4-4 y se describe adicionalmente en el EJEMPLO 3 (a continuación).
15 TABLA 6A Las entradas de las composiciones están en % (p/v). La esterilización fue a 121ºC durante 20 minutos.
- FM 27-44
- FM 112-37 FM 4-4 FM 4-6 FM 4-7
- Dextrina (Lodex5)
- 6 6 5 5 5
- Maltosa (Difco)
- 4 4 2 2 2
- Proflo (Traders)
- 2,0 2,5 2,75
- Harina de soja (ADM)
- 1,5 2,0
- Pharmamedia (Traders)
- 0,5
- CSP (Roquette)
- 0,5 0,5 0,5 0,15 0,15
- Levadura seca en polvo (Difco)
- 0,25
- MgSO4·7H2O (Wako)
- 0,05
- CaCO3 (Hayashi)
- 0,5 0,5 0,6
- (NH4)2SO4 (Wako)
- 0,05
- KH2PO4 (Wako)
- 0,05 0,04
- K2HPO4 (Wako)
- 0,05 0,06 0,06 0,06
- CaCl2·2H2O (Wako)
- 0,5 0,5
- NaHCO3 (Wako)
- 0,2
- Zeolita
- 0,1
- FeSO4·7H2O (Wako)
- 0,0002 0,0002 0,0002 0,0002 0,0002
- ZnSO4·7H2O
- 0,0002
- CoCl2·6H2O (Baker)
- 0,001 0,0005 0,0005
- Ácido nicotínico
- 0,0002
- MnSO4·H2O
- 0,0002
- Isobutanol1 (Tedoa)
- 0,1 0,5 0,5 0,3 0,3
- SAG471 (Witco)
- 0 0,06 0,04 0,04
- pH
- 6,8 6,8 6,8 7,2 7,35
- 1 Añadido el último.
TABLA 6B Medios relacionados
Cultivo en agar inclinado y en placa, agar CM4-1
- (%, p/v)
- Extracto de levadura (Difco)
- 0,3
- Extracto de malta (Difco)
- 0,3
- Soytone (Difco)
- 0,5
- Glicerol (Difco)
- 1,0
- Bacto-agar (Difco)
- 2,0
Ajustar el pH a 6,5 antes de la esterilización.
Esterilización: 121ºC, 20 minutos
Esterilización: 121ºC, 20 minutos
Medio de siembra, VM4-1
- (%, p/v)
- Almidón soluble (BDH)
- 2,0
- Glucosa (Shuling)
- 1,0
- Harina de soja (ADM)
- 1,0
- CSP (Roquette)
- 0,5
- Soytone (Difco)
- 0,5
- NaCl (Wako)
- 0,3
- CaCo3
- (Hayashi) 0,5
pH: 6,8
Esterilización: 121ºC, 20 minutos
Análisis de ansamitocinas
[0041] En las patentes estadounidenses 4.331.598 y
4.450.234, se da a conocer que la cepa original ATCC 31565
5 produce dos clases de ansamitocinas que se distinguen por la presencia de un grupo metilo o hidroximetilo en C-14 (véase la fórmula I). Para ambas clases, se producen varias ansamitocinas diferentes que difieren en su cadena lateral de acilo respectiva unida al grupo hidroxilo en C-3, y con
10 respecto a si C-14 lleva un grupo metilo o hidroximetilo (o, en estudios posteriores, N-desmetilo). La nomenclatura usada en el presente documento para los compuestos permutados se definió anteriormente haciendo referencia a la fórmula (I). [0042] La ansamitocina P-3 es el producto principal de
15 PF4-4 y la cepa original ATCC 31565, en determinadas condiciones de crecimiento. Si se hacen crecer las bacterias en presencia de valina o ácido isobutírico (véase la patente estadounidense 4.228.239) o alcohol isobutílico o isobutilaldehído (véase la patente estadounidense 4.356.265),
20 están presentes otros compuestos de ansamitocina en cantidades menores. [0043] Cuando se hace crecer la cepa PF4-4 en medios de fermentación diferentes (designados FM en la tabla 6), que contienen todos alcohol isobutílico, la ansamitocina P-3 es la
25 ansamitocina predominante producida. Se diluyen los caldos de fermentación con etanol o acetonitrilo, se someten a agitación con vórtex, entonces se centrifugan y se somete a ensayo el sobrenadante para determinar el contenido de ansamitocina P-3. [0044] Preferiblemente, las ansatomicinas se fraccionan y
30 se analizan mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en fase inversa, pero puede usarse cualquier técnica adecuada, tal como, por ejemplo, MALDI-TOF o cromatografía en capa fina. En un método que emplea HPLC, se
extraen los caldos de fermentación con disolventes orgánicos,
tales como acetato de etilo, cloruro de metileno o cloroformo,
y se determina el contenido de P-3 en el disolvente orgánico
mediante HPLC en fase inversa tal como se describe en el
EJEMPLO 6.
EJEMPLOS
[0045] A continuación se ilustrará la invención haciendo
referencia a ejemplos no limitativos.
EJEMPLO 1
Mutagénesis con UV
[0046] Se recogieron esporas de una preparación en agar
inclinado de 8 días de la colonia n.º 15-55 lavando el agar
inclinado [tamaño del agar inclinado: tubo de 2,3 x 18 cm
relleno de 16-18 ml de agar CM4-1 (para su composición véase
la tabla 6b)] con 10 ml de agua. Se colocaron cinco ml de agua
con las esporas suspendidas en un tubo con tapa de rosca
(tamaño: 1,1 x 11 cm) que contenía 10 perlas de vidrio de 2,0
mm de diámetro para su maceración. El tubo se sometió a
agitación con vórtex durante cinco minutos y entonces se
diluyó en serie la suspensión de esporas maceradas en una
disolución de Tween 60 acuosa al 0,1% en diluciones de 103,
104, y 105 veces. (La suspensión macerada contiene normalmente
2 x 109 ufc). De cada dilución, se sembraron en placa 0,1 ml
de la suspensión en una placa de agar CM4-1 (9,5 cm de
diámetro), que se expuso a una fuente de luz UV germicida
adecuada: se colocó la placa de agar abierta bajo una lámpara
germicida de 15 W a aproximadamente 20 cm de distancia y se
expuso durante 20-40 segundos a la luz UV. (La tasa de
destrucción para una exposición de 40 segundos fue de
aproximadamente el 99,9%.) Se cultivaron las placas expuestas
a 28ºC durante 5-7 días, y entonces se transfirieron colonias
individuales a otra placa de agar CM4-1 y se cultivaron en
rejillas de 16 colonias por placa. Entonces se eligieron las
colonias para su evaluación adicional.
EJEMPLO 2
Mutagénesis con MNNG
[0047] Se recogieron esporas de una preparación en agar
inclinado de 8 días lavando el agar inclinado (tamaño del agar
inclinado: tubo de 2,3 x 18 cm relleno de 16-18 ml de agar
CM4-1) con 10 ml de agua. Se colocaron cinco ml del agua con
la esporas suspendidas en un tubo con tapa de rosca (tamaño:
1,1 x 11 cm) que contenía 10 perlas de vidrio de 2,0 mm de
diámetro para su maceración. El tubo se sometió a agitación
con vórtex durante cinco minutos y se recogieron las esporas
mediante centrifugación a 2100 x g durante 15 min. Se desechó
el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 4 ml de
tampón de tris-ácido maleico 0,05 M estéril, pH 8,0 que
contenía sulfato de amonio al 0,1% (p/v), sulfato de magnesio
heptahidratado al 0,01%, cloruro de calcio dihidratado al
0,005%, sulfato ferroso heptahidratado al 0,00025% y 100 µg/ml de MNNG. Se sometió la suspensión a agitación con vórtex durante 30 min., entonces se detuvo la reacción mediante la adición de 3 ml de una disolución de tiosulfato de sodio saturada. Se recogieron las esporas mediante centrifugación, entonces se resuspendieron en 5 ml de agua. Se usó esta suspensión para la selección y se extendió una dilución apropiada en una placa de agar CM4-1 para determinar la tasa de supervivencia. EJEMPLO 3
Fermentación en matraz con agitación para producir
ansamitocina a partir de PF4-4.
[0048] Se hizo crecer un cultivo de PF4-4 almacenado, por
ejemplo un cultivo liofilizado o congelado, en placas de agar
CM4-1 a 28ºC durante 5-7 días. Entonces se transfirieron
colonias individuales a una segunda placa de agar CM4-1 con
rejilla, (normalmente se transfirieron 16 colonias a una placa
de 9,5 cm de diámetro), y se incubó la placa a 28ºC durante 7
días, periodo durante el cual crecieron colonias de 6-15 mm de
diámetro. Entonces se maceró una única colonia sometiéndola a
agitación con vórtex durante 10 minutos en un tubo cerrado que
contenía diez perlas de vidrio de 2 mm de diámetro y 2 ml de
agua. Entonces, se transfirió parte de la suspensión de
colonias (0,5 ml) a un matraz de cultivo de 250 ml que
contenía 30 ml de medio de siembra, VM4-1 (para la
composición, véase la tabla 6b). Se incubó el matraz de
siembra en un agitador rotatorio (220 rpm, alcance de 70 mm) a
28ºC durante 48 horas, tras lo cual se transfirió 1 ml de la
suspensión de crecimiento de siembra a un matraz de cultivo de
250 ml que contenía 20 ml de medio de fermentación FM4-4. Se
incubó el matraz de fermentación en las mismas condiciones que
el matraz de siembra durante 6 días, tras lo cual se sometió a
ensayo la producción de ansamitocina tal como se describe en
el EJEMPLO 6 y se encontró que era de 268 mg/l.
[0049] Pueden usarse diferentes caldos de fermentación. En
la tabla 5 se enumeran ejemplos de caldos preferidos y los
niveles de producción de ansamitocina P-3 correspondientes
obtenidos y en la tabla 6a se muestran las composiciones de
los caldos.
EJEMPLO 4
Preparación de cultivos de PF4-4 congelados para su
almacenamiento a largo plazo.
[0050] Se preparó una suspensión de colonias maceradas en
2 ml de agua tal como se describió en el EJEMPLO 3, entonces
se inocularon 0,2 ml de la suspensión en un cultivo en agar
inclinado (tamaño del agar inclinado: tubo de 2,3 x 18 cm
relleno de 16-18 ml de agar CM4-1) y se incubaron a 28ºC
durante 7 días. Entonces se lavó el agar inclinado con 10 ml
de disolución criogénica (glicerol al 10% y lactosa al 5% en
agua), que entonces se sometió al procedimiento de maceración
descrito anteriormente. Se separó en alícuotas la suspensión
macerada (1,5 ml) en crioviales y se congeló a 75ºC o en
nitrógeno líquido.
EJEMPLO 5
Preparación de bacterias PF4-4 liofilizadas para su
almacenamiento a largo plazo.
[0051] Se recogió por raspado un cultivo en agar inclinado
de 8 días (tamaño del agar inclinado: tubo de 2,3 x 18 cm
relleno de 16-18 ml de agar CM4-1) en 3 ml de disolución de
leche desnatada (leche desnatada en polvo al 5% (p/v) en
agua). Entonces se maceró la suspensión en un tubo cerrado que
contenía diez perlas de vidrio de 2 mm de diámetro
sometiéndola a agitación con vórtex durante 5 min. Se
distribuyeron alícuotas de 0,5 ml en viales y se liofilizaron.
Preferiblemente, cada vial contenía aproximadamente 1,2 x 108
ufc.
EJEMPLO 6
Análisis de ansamitocina P-3 en caldo de fermentación
[0052] Se transfirió caldo de fermentación (0,25 ml) a un
tubo con tapa de rosca que contenía etanol (4,75 ml).
(Alternativamente, se mezclaron 0,25 ml del caldo de
fermentación completo con 2,25 ml de etanol.) Se sometió la
solución a agitación con vórtex durante diez minutos, entonces
se centrifugó a 2100 x g durante diez minutos. Se retiró el
sobrenadante y se sometió a análisis de HPLC en fase inversa.
Preferiblemente, se usó una columna Symmetry Shield C8 (3,6 x
150 mm). Preferiblemente, la fase móvil fue
agua/acetonitrilo/metanol a una razón (v/v) de 55/35/10 y se
usó preferiblemente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Se
monitorizó la cromatografía midiendo la absorción UV a 252 nm.
En la figura 3 se muestra una señal de HPLC típica de un
extracto de caldo, en el que la ansamitocina P-3 eluye a
aproximadamente 12,2 minuto tras la inyección.
Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo
para la comodidad del lector. No forma parte del documento de
patente europea. Aunque se ha tomado especial cuidado en la
compilación de las referencias, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este
respecto.
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- US 4248870 A [0026]
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- US 4265814 A [0026]
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- US 4308268 A [0026]
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- US 4308269 A [0026]
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- US 4309428 A [0026]
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- US 4317821 A [0026]
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- US 4322348 A [0026]
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- US 4260608 A [0026]
- •
- US 4228239 A [0042]
Documentos no de patentes citados en la descripción
• Higashide et al. Nature, 1977, vol. 270, 721-722 [0002]
•Hasegawa et al. Motile Actinomycetes: Actinosynnemapretosium
subsp. pretosium sp nov., subsp. nov., and Actinosynnema
pretosium subsp. Auranticum susp. nov. Int. J. System.
Bacteriol., 1983, vol. 33 (2), 314-320 [0002]
5 •Kupchan et al. J. Amer. Chem. Soc., 1972, vol. 94, 5294-5295 [0006]
•Hatano et al. Selective accumulation of ansamitocins P-2, P3 and P-4, and biosynthetic origins of their acyl moieties.
Agric. Biol. Chem., vol. 48, 1721-1729 [0009]
10 •Hasegawa, T. et al. Motile Actinomycetes: Actinosynnema pretosium subsp. pretosium sp nov., subsp. nov., and Actinosynnema pretosium subsp. Auranticum susp. nov. Int. J. System. Bacteriol., 1983, vol. 33 (2), 314-320 [0025] [0027]
•Kupchan et al. J. Med. Chem., 1978, vol. 21, 31-37 [0026] 15 •Higashide. Nature, 1977, vol. 270, 721-722 [0026]
- •
- Kawai et al. Chem. Farm. Bull., vol. 32, 3441-3451 [0026]
- •
- Kawai et al. Chem. Pharm Bull., 1984, vol. 12, 3441 [0026]
- •
- Tanida et al. Ansamitocin analogs from a mutant strain of nocardia. I Isolation of the mutant, fermentation and
20 antimicrobial properties. J.Antibiotics, 1981, vol. 34, 489 495 [0027]
•Hatano et al. Agric. Biol. Chem., 1984, vol. 48, 1721-1729
[0039]
25
Claims (5)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Cepa de Actinosynnema pretiosum que tiene el número de registro de ATCC PTA-3921.
-
- 2.
- Método para producir una ansamitocina, que comprende
5 cultivar una cepa de Actinosynnema pretiosum según la reivindicación 1 en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono adecuada. - 3. Método según la reivindicación 2, en el que dichaansamitocina es una o más ansamitocinas de fórmula (I) o 10 isómeros de la misma:
imagen1 en la que R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, acetilo, propionilo, isobutirilo, butirilo e isovalerilo, y R1 se selecciona del grupo que consiste en15 metilo e hidroximetilo. -
- 4.
- Método según la reivindicación 2, en el que la ansamitocina es ansamitocina P-3.
-
- 5.
- Método según la reivindicación 2, en el que dicha ansamitocina es predominantemente ansamitocina P-3 y
20 dicha fuente de carbono comprende una o más fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en valina, ácido isobutírico, alcohol isobutílico e isobutilaldehído.
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