ES2265906T3

ES2265906T3 - Nuevo compuesto depsipeptidico.

Info

Publication number: ES2265906T3
Application number: ES00900351T
Authority: ES
Inventors: Koji c/o Astellas Pharma Inc. NAGAI; Nakako c/o Astellas Pharma Inc. ARAO; Kinya c/o Astellas Pharma Inc. SOHDA; Kazuma c/o Astellas Pharma Inc. KAMIGIRI; Masamichi c/o Astellas Pharma Inc. MORI; Nobuaki c/o Astellas Pharma Inc. SHINDO; Haruo Seto; Kazuo Shin-Ya
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 1999-01-13
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2020-01-12
Also published as: ATE331730T1; EP1142905A4; US20040082054A1; EP1142905A1; CN1335852A; CA2356845A1; JP3554707B2; DE60029084D1; KR20010101443A; US6670326B1; DE60029084T2; EP1142905B1; US7098024B2; AU2002700A; KR100611265B1; DK1142905T3; PT1142905E; CN1173990C; CA2356845C; WO2000042062A1

Abstract

Un compuesto depsipeptídico representado por la siguiente fórmula general (donde R representa un grupo isopropilo, un grupo sec- butilo o un grupo isobutilo) o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Description

Nuevo compuesto depsipeptídico.

Campo técnico

La presente invención se relaciona con un nuevo compuesto o con una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que tiene actividad citotóxica y actividad de tipo TGF-\beta para las células cancerosas humanas y que es útil como medicamento, particularmente como agente antitumoral, y con una composición farmacéutica que contiene dicho compuesto como ingrediente activo.

Técnica anterior

Es sabido que la mitomicina C, la bleomicina, la adriamicina o compuestos similares derivados de un metabolito microbiano muestran actividad citotóxica para las células cancerosas humanas y estos compuestos son convencionalmente utilizados como agentes antitumorales en el campo clínico. Además, se describe un compuesto depsipeptídico como substancia antitumoral (Publicación de Patente Europea Nº 352646).

Incluso actualmente, la creación de agentes antitumorales con una estructura química no convencional y un nuevo esqueleto está bajo examen.

Por otra parte, el TGF-\beta está atrayendo la atención primeramente como factor que acelera la proliferación de las células y también acelera la transformación; se ha revelado ahora que el TGF-\beta actúa como factor que inhibe el crecimiento de diversas células animales por estudios sobre su mecanismo de acción (Cell, Vol. 63, pp. 245-247, 1990). Además, se ha hecho un gran número de publicaciones en cuanto a su relación con las células tumorales (Br. Med. J., Vol. 296, pp. 1621-1624, 1988; Br. J. Cancer, Vol. 61, pp. 612-617, 1990; Br. J. Cancer, Vol. 69, pp. 1006-1009, 1994; J. Cell Physiol., Vol. 172, pp. 1-11, 1997; Growth Factors, Vol. 7, pp. 207-213, 1992; J. Biol. Chem., Vol. 272, pp. 3967-3972, 1997; Nature, Vol. 360. pp. 361-364, 1992). Además, se ha descrito que el receptor de TGF-\beta actúa como gen supresor de tumores en diversos tumores (International J. Hematology, Vol. 65, pp. 97-104, 1997). Por consiguiente, un compuesto que exhiba actividad de tipo TGF-\beta tiene posibilidad de convertirse en un agente terapéutico para enfermedades relacionadas con dicha actividad, tal como un agente
antitumoral.

Descripción de la invención

La invención tiene como objeto proporcionar un nuevo compuesto que tiene una actividad citotóxica y una actividad de tipo TGF-\beta para células cancerosas humanas y que es útil como agente antitumoral y como medicamento que lo contiene.

Como resultado de estudios intensivos sobre compuestos naturales producidos por muchos microorganismos, los presentes inventores han encontrado un microorganismo de una nueva especie perteneciente al género Pseudomonas, que tiene la capacidad de producir un compuesto con excelente actividad citotóxica y actividad de tipo TGF-\beta para células cancerosas humanas. A continuación, los presentes inventores cultivaron dicho microorganismo y consiguieron aislar un nuevo compuesto depsipeptídico a partir de dicha mezcla de cultivo, el cual tiene una estructura completamente diferente de la del compuesto depsipeptídico conocido antes mencionado (Publicación de Patente Europea Nº 352646) en términos de la siguiente estructura química, que tiene un grupo hidroxilo en la posición 3, un grupo R (un grupo seleccionado entre cualquiera de un grupo isopropilo, un grupo sec-butilo o un grupo isobutilo) en la posición 4 y un grupo metilo en la posición 8, consiguiendo así la invención.

En consecuencia, la invención se relaciona con (1) un compuesto depsipeptídico representado por la siguiente fórmula general

1

(donde R representa un grupo isopropilo, un grupo sec-butilo o un grupo isobutilo) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La invención se relaciona también con una composición farmacéutica que incluye el compuesto depsipeptídico antes mencionado o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable como principio activo; preferiblemente dicha composición farmacéutica es un agente antitumoral.

Lo que sigue describe la invención con detalle. El compuesto depsipeptídico de la invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable pueden ser obtenidos cultivando dicha bacteria productora de compuesto perteneciente al género Pseudomonas en un medio nutriente y recogiendo el dicho compuesto acumulado de la mezcla de cultivo en la forma habitual. Se puede usar cualquier microorganismo como microorganismo para uso en el método de producción de dicho compuesto, con la condición de que sea un microorganismo que pertenezca al género Pseudomonas y que tenga la capacidad de producir dicho compuesto. Como tal microorganismo, se puede citar una cepa bacteriana Pseudomonas sp. Q71576 perteneciente al género Pseudomonas aislada de una muestra de suelo recogida en Mochizuki-cho, KItasaku-gun, Nagano Prefecture, por ejemplo. Las propiedades bacterianas de esta cepa son las siguientes.

1) Propiedades morfológicas

Esta cepa es un bacilo Gram-negativo y tiene motilidad por flagelos polares. El tamaño de la célula es de 0,7 a 0,9 \mum x 1,0 a 1,4 \mum. No se ve formación de esporas.

2) Propiedades de cultivo

Forma colonias marrón claro en medio de agar caldo. La colonia es circular y su superficie es lisa. Mediante un cultivo en caldo líquido, formaba una película sobre la superficie del medio y la totalidad del medio estaba turbia. Mediante un cultivo de incisión en caldo de gelatina, licuaba la gelatina. Mediante un cultivo en leche tornasol, no se vieron coagulación ni peptonización después de 1 semana de cultivo.

3) Propiedades fisiológicas TABLA 1 Propiedades fisiológicas de la cepa Q71576 (1)

Reducción de nitrato	negativa
Reacción de desnitrificación	negativa
Prueba MR	negativa
Prueba VP	negativa
Formación de indol	negativa
Formación de sulfuro de hidrógeno	negativa
Hidrólisis de almidón	negativa
Utilización de ácido cítrico	positiva
Utilización de nitrato	positiva
Utilización de sal de amonio	positiva
Formación de fluorocromo hidrosoluble	positiva

TABLA 1 (continuación)

Ureasa	negativa
Oxidasa	positiva
Catalasa	positiva
Rango de temperatura de crecimiento	3 a 32ºC
Temperatura óptima de crecimiento	10 a 24ºC
Rango de pH de crecimiento	pH 5 a 9
pH óptimo de crecimiento	pH 6 a 8
Crecimiento en condiciones anaerobias	negativo
Prueba OF	tipo de
	oxidación
Reacción de degradación de arginina	positiva
Crecimiento en medio de caldo con adición de NaCl al 3%	positivo

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TABLA 2 Propiedades fisiológicas de la cepa Q71576 (2)

Producción de ácidos a partir de sacáridos

\hskip0,5cm L-Arabinosa	positiva
\hskip0,5cm D-xilosa	positiva
\hskip0,5cm D-Glucosa	positiva
\hskip0,5cm D-Manosa	positiva
\hskip0,5cm D-Fructosa	negativa
\hskip0,5cm Sacarosa	negativa
\hskip0,5cm Inositol	negativa
\hskip0,5cm D-Manitol	negativa
\hskip0,5cm D-Galactosa	negativa
\hskip0,5cm Maltosa	negativa
\hskip0,5cm Trehalosa	negativa
\hskip0,5cm Lactosa	negativa
\hskip0,5cm D-Sorbitol	negativa
\hskip0,5cm Glicerol	negativa
\hskip0,5cm Almidón	negativa

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TABLA 3 Propiedades fisiológicas de la cepa Q71576 (3)

Asimilación de sacáridos

\hskip0,5cm L-Arabinosa	negativa
\hskip0,5cm D-Xilosa	negativa
\hskip0,5cm D-Glucosa	positiva
\hskip0,5cm D-Manosa	positiva
\hskip0,5cm D-Fructosa	positiva
\hskip0,5cm Sacarosa	negativa
\hskip0,5cm Inositol	positiva
\hskip0,5cm Ramnosa	negativa
\hskip0,5cm Rafinosa	negativa
\hskip0,5cm D-Manitol	positiva
\hskip0,5cm D-Galactosa	positiva

TABLA 3 (continuación)

Asimilación de sacáridos

\hskip0,5cm Maltosa	negativa
\hskip0,5cm Trehalosa	positiva
\hskip0,5cm Lactosa	negativa
\hskip0,5cm D-Sorbitol	positiva
\hskip0,5cm Salicina	negativa
\hskip0,5cm Melibiosa	negativa
\hskip0,5cm Glicerol	positiva
\hskip0,5cm Almidón	negativa
\hskip0,5cm Xantina	positiva
\hskip0,5cm Quitina	negativa

Resumiendo las propiedades microbiológicas anteriores, esta cepa es un bacilo aerobio Gram-negativo y tiene motilidad. Su rango de temperatura de crecimiento es de 3 a 32ºC, su prueba de oxidasa, prueba de catalasa, reacción de licuación de la gelatina, utilización del ácido cítrico, utilización de fuentes de nitrógeno inorgánico y reacción de degradación de la arginina son positivas; forma ácido a partir de L-arabinosa, D-xilosa, D-glucosa y D-manosa, y el resultado de la prueba OF es de tipo oxidación. Por otra parte, los resultados de la formación de sulfuro de hidrógeno, de la formación de indol, de la prueba VP, de la reducción del nitrato y de la reacción de desnitrificación son negativos.

Cuando se refirieron las propiedades antes mencionadas al Manual of Systematic Bacteriology de Bergey (1989) y a otra literatura, esta cepa fue identificada como una bacteria perteneciente al género Pseudomonas y denominada Pseudomonas sp. Q71576.

En este sentido, esta cepa, llamada Pseudomonas Sp. Q71576, ha sido internacionalmente depositada como FERM BP-6944 (depositada el 8 de Enero de 1999) en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture, Japón, código postal 305-8566). Además, como los microorganismos son aptos para producir mutación artificial o espontánea, el Pseudomonas sp. Q71576 incluye no sólo los microorganismos aislados de la naturaleza, sino también aquéllos que son mutados artificialmente con rayos ultravioleta, rayos X, fármacos químicos y similares y sus mutantes espontáneos.

Método de producción

El compuesto de la invención es obtenido por cultivo de un microorganismo perteneciente al género Pseudomonas y que tiene capacidad para producir el compuesto de la invención. Se realiza el cultivo según un método de cultivo de microorganismos general.

El medio que se ha de usar en el cultivo puede ser cualquier medio que contenga fuentes nutrientes utilizadas por Pseudomonas sp. Q71576 y se usa un medio sintético, un medio semisintético o un medio natural. En general, se pueden utilizar materiales conocidos como nutrientes para añadir al medio. En cuanto a la composición del medio, se pueden citar D-glucosa, D-manosa, D-fructosa, inositol, D-manitol, D-galactosa, trehalosa, xantina, almidón, glucosa, dextrina, glicerol, aceite vegetal y similares como ejemplos de la fuente e carbono. Como fuente de nitrógeno, se usan extracto de carne, peptona, harina de gluten, torta de semillas de algodón, levadura desecada, extracto de levadura, cloruro de amonio, sulfato de amonio, nitrato de amonio, ácido úrico y otras fuentes de nitrógeno orgánicas e inorgánicas. Además, se añaden sulfato, nitrato, carbonato, fosfato y similares de sodio, potasio, magnesio, calcio, zinc, hierro, cobalto y similares como sales metálicas según lo requiera la ocasión. Además, según lo requiera la ocasión, se pueden añadir también metionina, cisteína, cistina, tiosulfato, oleato de metilo, aceite de manteca, aceite de silicio, agentes tensoactivos y compuestos aceleradores de la formación similares o agentes antiespumantes.

En cuanto a las condiciones de cultivo, el cultivo en condiciones aerobias es generalmente ventajoso y el cultivo es realizado a una temperatura de 3 a 32ºC (cf. La descripción antes mencionada sobre las propiedades fisiológicas), preferiblemente de 20 a 25ºC. Se obtienen buenos resultados cuando se ajusta el pH del medio a un margen de aproximadamente 4,5 a 9, preferiblemente de aproximadamente 5 a 7,5. El período de cultivo es eventualmente decidido en respuesta a la composición del medio y a las condiciones de temperatura, pero es generalmente de aproximadamente 1 a 7 días, preferiblemente de aproximadamente 2 a 4 días.

Para aislar el compuesto de interés de la invención de la mezcla de cultivo, se pueden emplear eventualmente técnicas normalmente usadas para la extracción y purificación de metabolitos producidos por microorganismos. Por ejemplo, se extrae dicho compuestos entre los compuestos de la mezcla de cultivo añadiendo acetato de etilo o un solvente orgánico similar, que no se mezcla con agua directamente en el caldo de cultivo o un filtrado de cultivo obtenido por centrifugación o por filtración después de añadir una ayuda de filtro a la mezcla de cultivo. Dicho compuesto puede ser también extraído dejando que el caldo de cultivo contacte con un soporte apropiado, efectuando así la adsorción del compuesto producido en el caldo de cultivo en el soporte y eluyendo después el compuesto con un solvente apropiado. Por ejemplo, dicho compuesto es adsorbido dejando que contacte con una resina de adsorción porosa, tal como Amberlite XAD-2, Diaion HP-20, Diaion CHP-20 o Diaion SP-900. A continuación, dicho compuesto es eluido usando un solvente orgánico, tal como metanol, etanol, acetona, butanol, acetonitrilo o cloroformo, solos o como una mezcla, o una solución mixta de dicho solvente con agua. En este último caso, se puede obtener una fracción que contenga una razón mayor de dicho compuesto aumentando la razón de mezcla del solvente orgánico desde una concentración baja hasta una concentración alta por etapas o de manera continua. Cuando se extrae con acetato de etilo, cloroformo y solventes orgánicos similares, dicho compuesto es extraído añadiendo estos solventes al filtrado de cultivo y agitando bien la mezcla. A continuación, dicho compuesto contenido en la fracción así obtenida usando la técnica anterior puede ser separado y purificado con una pureza mayor empleando un método normalmente utilizado, tal como una cromatografía en columna que utiliza gel de sílice, ODS o similar, una cromatografía de reparto líquido-líquido centrífuga o una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), que utiliza ODS.

Por otra parte, también se puede separar y purificar usando la actividad de tipo TGF-\beta como marcador, por determinados medios usados en la producción de compuestos fisiológicamente activos generales, haciendo uso, por ejemplo, de la diferencia en su capacidad solubilizante o solubilidad en solventes apropiados. Según lo requiera la ocasión, estos métodos pueden ser usados solos o repetidamente combinándolos en un orden eventual.

La sal farmacéuticamente aceptable del compuesto depsipeptídico de la invención es una sal con una base inorgánica orgánica y es deseable una sal farmacéuticamente aceptable. Como ejemplos ilustrativos de estas sales, se incluyen sales con bases inorgánicas, tales como de sodio, potasio, magnesio, calcio y aluminio, de bases orgánicas tales como metilamina, etilamina y etanolamina y de aminoácidos básicos como lisina y ornitina.

Además, como el compuesto de la invención tiene átomos de carbono asimétricos y dobles enlaces, están presentes en base a esto los estereoisómeros (cueros racémicos, isómeros ópticos, diastereómeros y similares) y los isómeros geométricos (formas cis o formas trans). En consecuencia, se incluyen mezclas o productos aislados de estos estereoisómeros o isómeros geométricos en el compuesto de la invención.

Además, también se incluyen en la invención hidratos o diversos solvatos de dicho compuesto y el polimorfismo de dicho compuesto.

El método de formulación y el método de administración del compuesto de la invención son descritos con detalle en lo que sigue.

La composición farmacéutica que contiene uno o dos o más de los compuestos depsipeptídicos de la invención o sus sales farmacéuticamente aceptables como principio activo es preparada en tabletas, polvos, subtilas finas, gránulos, cápsulas, píldoras, soluciones, inyecciones, supositorios, ungüentos, preparaciones adhesivas y similares usando soportes, rellenantes y otros aditivos farmacéuticos generalmente utilizados y se administra oral o parenteralmente.

La dosis clínica del compuesto de la invención en humanos es eventualmente decidida considerando los síntomas, el peso, la edad, el sexo y similares de cada paciente que haya de ser tratado.

La composición sólida para uso en la administración oral según la invención es usada en forma de tabletas, polvos, gránulos y similares. En dicha composición sólida, se mezclan uno o más compuestos activos con al menos un diluyente inerte, tal como lactosa, manitol, glucosa, hidroxipropilcelulosa, celulosa microcristalina, almidón, polivinilpirrolidona o silicato de aluminio y de magnesio. Según el modo habitual, la composición puede contener otros aditivos distintos del diluyente inerte, tales como estearato de magnesio o un lubricante similar, glicolato de calcio y celulosa o un agente desintegrante similar, lactosa o un agente estabilizador similar y un agente de ayuda a la solubilización. Si es necesario, las tabletas o las píldoras pueden ir revestidas de un azúcar, tal como sacarosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa o similar o de una película de un compuesto gástrico o entérico.

La composición líquida para administración oral incluye emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires y similares farmacéuticamente aceptables y contiene un diluyente generalmente utilizado, tal como agua o alcohol etílico. Además del diluyente inerte, esta composición puede contener también un agente de ayuda a la solubilización, un agente humectante, un agente suspensor y agentes auxiliares similares, así como edulcorantes, sabores, aromáticos y antisépticos.

Las inyecciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas asépticas. Como ejemplos del diluyente para uso en las soluciones y suspensiones acuosas, se incluyen agua destilada para uso en inyección y solución salina fisiológica. Como ejemplos del diluyente para uso en las soluciones y suspensiones no acuosas, se incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceite de oliva o un aceite vegetal similar, alcohol etílico o un alcohol similar, polisorbato 80 (denominación comercial) y similares. Dicha composición puede contener además agentes aditivos tales como un agente de tonicidad, un antiséptico, un agente humectante, un agente emulsor, un agente dispersante, un agente estabilizador (v.g., lactosa) y un agente de ayuda a la solubilización. Estas composiciones son esterilizadas por filtración a través de un filtro de retención de bacterias, por mezcla de un germicida o por irradiación. Alternativamente, pueden ser usadas convirtiéndolas primeramente en composiciones sólidas estériles y disolviéndolas luego en agua estéril o en un solvente estéril para uso en inyección antes de su uso.

Si la solubilidad del compuesto de la invención es baja, se puede llevar a cabo su tratamiento de solubilización. El tratamiento de solubilización puede ser efectuado por un método conocido que pueda ser aplicado a preparaciones farmacéuticas, tal como un método en el que se añaden agentes tensoactivos (aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado, ésteres de polioxietilensorbitán y ácidos grasos superiores, polioxietilenpoli-oxipropilenglicoles, ésteres de sacarosa y ácidos grasos y similares), o un método en el que se forma una dispersión sólida del fármaco con un agente solubilizante, tal como un polímero (hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG) o polímero hidrosoluble similar o carboximetiletilcelulosa (CMEC), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), un copolímero de metacrilato de metilo-ácido metacrílico (Eudragit L, S, denominación comercial, fabricado por Rohm & Haas) o polímero entérico similar). De ser necesario, también se puede emplear un método para formar una sal soluble o un método para formar un compuesto de inclusión usando ciclodextrina o similar. Los medios para efectuar la solubilización pueden ser eventualmente cambiados en respuesta al fármaco de interés [cf., "Recent Formulation Techniques and Their Application I", I. Utsumi y col., Medical Journal 157-159 (1983), y "Pharmacy Monograph Nº 1, Bioavailability", K. Nagai y col., Soft Science, 78-82
(1988)].

Mejor modo para llevar a cabo la invención

Lo siguiente describe la invención de forma ilustrativa en relación a ejemplos, pero la invención no se limita a ellos.

Ejemplo 1

Se dispensó un medio que contenía 10 g de glucosa, 20 g de almidón de patata, 5 g de polipeptona, 5 g de extracto de levadura, 4 g de carbonato de calcio y 1 litro de agua destilada (pH 7,0) en porciones de 100 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml y se esterilizó a 120ºC durante 20 minutos. Se rasparon células de Pseudomonas sp. Q71576 cultivadas en medio agar de Bennett, se inocularon en el medio y se cultivaron a 28ºC durante 3 días en un agitador en condiciones de 200 revoluciones/min. para uso como caldo de cultivo semilla. A continuación, se dispensó un medio que contenía 30 g de glicerol, 1 g de glucosa, 5 g de polipeptona, 5 g de extracto de carne, 5 g de NaCl, 0,5 g de un agente antiespumante (NKL 5430) y 1 litro de agua destilada (pH 7,0) en porciones de 100 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml y se esterilizó a 120ºC durante 20 minutos. Se inoculó el caldo de cultivo semilla antes mencionado en porciones de 2 ml en este medio y se cultivó a 28ºC durante 3 días en un agitador en condiciones de 200 revoluciones/min.

Se centrifugó una porción de 2,5 litros del caldo así cultivado a 6.000 rpm durante 10 minutos. Se extrajo el sobrenadante con acetato de tilo, se deshidrató añadiendo sulfato de sodio y se concentró después a sequedad bajo presión reducida. Se aplicó el extracto bruto oleoso a cromatografía en columna de gel de sílice (30 d.i. x 200 mm), se lavó con cloroformo-metanol (20:1) y se eluyó después con cloroformo-metanol (5:1) y se concentró la fracción activa. A continuación, se aplicó éste a cromatografía en columna Sephadex LH-20 (20 d.i. x 500 mm) para realizar la filtración por gel con cloroformo-metanol (1:1). Se concentró la fracción activa y se aplicó entonces a CPC (cromatografía de reparto centrífuga) y se eliminaron las impurezas con un sistema solvente de cloroformo-metanol-agua (5:6:4) usando un método ascendente. Después de concentrar finalmente la fracción activa a sequedad, se disolvió ésta en metanol para realizar una HPLC de fase invertida (velocidad de flujo, 10 ml/min.) con una solución acuosa de acetonitrilo al 35% usando una columna PEGASIL ODS (20 d.i. x 250 mm) fabricada por Senshu Scientific. Como resultado, se observó el pico del compuesto A a los 10,8 minutos y el del compuesto B a los 15,4 minutos y se obtuvieron 10 mg de polvo blanco de cada uno de los compuestos A y B fraccionando los picos
respectivos.

Ejemplo 2

Se dispensó un medio que contenía 10 g de glucosa, 20 g de almidón de patata, 5 g de polipeptona, 5 g de extracto de levadura, 4 g de carbonato de calcio y 1 litro de agua destilada (pH 7,0) en porciones de 100 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml y se esterilizó a 120ºC durante 20 minutos. Se rasparon células de Pseudomonas sp. Q71576 cultivadas en medio agar de Bennett, se inocularon en el medio y se cultivaron a 28ºC durante 3 días en un agitador en condiciones de 200 revoluciones/min. Se dispensó el mismo medio en porciones de 400 ml en matraces Erlenmeyer de 2 litros se esterilizó a 120ºC durante 20 minutos y se inocularon entonces 8 ml del caldo de cultivo semilla antes mencionado en este medio y se cultivó a 28ºC durante 3 días en un agitador en condiciones de 200 revoluciones/min. Para uso como caldo de cultivo semilla. A continuación, se dispensó un medio que contenía 30 g de manitol, 5 g de polipeptona, 5 g de extracto de carne, 5 g de cloruro de sodio y 1 litro de agua del grifo (pH 7,0) en porciones de 18 litros en tres fermentadores de jarra de 30 litros de capacidad y se esterilizó a 120ºC durante 20 minutos. Se inoculó el caldo de cultivo semilla anterior en porciones de 360 ml en este medio y se cultivó a 24ºC durante 64 horas en condiciones de 150 revoluciones/min. y 1 vvm.

Se aplicó una porción de 50 litros del caldo de cultivo separado de las células por Sharples a una columna empaquetada con HP-20, lavada con agua, con una solución acuosa de acetona al 20% y con una solución acuosa de metanol al 40% y eluida después con una solución acuosa de acetona al 80%. Se extrajo una solución acuosa obtenida concentrando la fracción eluida con cloroformo y acetato de etilo y se combinaron los extractos, se concentraron y se aplicaron después a una columna empaquetada con gel de sílice. Se eluyó ésta con cloroformo-metanol (50:1), (20:1) y (10:1) y se combinaron porciones predeterminadas de las fracciones de elución de cloroformo-metanol (10:1) y (10:1), se concentraron y se disolvieron después en etanol para llevar a cabo la recristalización, obteniéndose así 776 mg de polvo blanco como una mezcla que contenía los compuestos A, B y C. Llevando a cabo la fraccionación de la fracción de elución del compuesto C a partir del polvo así obtenido usando una columna ODS-HPLC (Cosmosil AR-II, 20 d.i. x 250 mm), se obtuvieron 20 mg del compuesto C como un polvo
blanco.

Propiedades fisicoquímicas de los compuestos de la invención

Los compuestos A, B y C que fueron extraídos, purificados y aislados por las técnicas anteriores mostraron las siguientes propiedades fisicoquímicas.

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TABLA 4 Propiedades fisicoquímicas de los compuestos A, B y C

	Compuesto A	Compuesto B	Compuesto C
Color y forma	Polvo blanco	Polvo blanco	Polvo blanco
Punto de fusión	135-138ºC	132-135ºC	N.E.
Ángulo de rotación	-63,6º	-58,6º	-60,0º
	(c 0,14, MeOH)	(c 0,11, MeOH)	(c 0,10, MeOH)
Fórmula molecular	C_{20}H_{31}N_{3}O_{6}S_{2}	C_{21}H_{33}N_{3}O_{6}S_{2}	C_{21}H_{33}N_{3}O_{6}S_{2}
Espectro de masas FAB
de alta resolución
Encontrado
Calculado	474,1735 (M+H)^{+}	488,1865 (M+H)^{+}	488,1889 (M+H)^{+}
	474,1733	488,1889	488,1889
Espectro de absorción en
la región UV y visible
\lambda_{máx}^{MeOH} nm (\varepsilon)	Absorción final	Absorción final	Absorción final
Espectro de absorción IR	3400, 3350,	3400, 3350,	3400, 3320,
	1720, 1660,	1720, 1660,	1730, 1660,
	1520, 1260, 980	1520, 1260, 980	1550, 1280, 980
\hskip1,5cm \nu_{máx} cm^{-1}	(método KBr)	(método KBr)	(método de reflectancia)
N.E.: no estudiado.

Los valores de desviación química de ^{1}H y ^{13}C RMN (en CDCl_{3}) de los compuestos A, B y C son respectivamente mostrados a continuación.

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TABLA 5 Los valores de desviación química de ^{1}H y ^{13}C RMN (en CDCl_{3}) del compuesto A

Nº	\delta_{C}	\delta_{H}
1	171,3
2	52,2	4,12 (dc, J = 4,0, 7,5 Hz)
3	16,5	1,48 (d, J = 7,5 Hz)
NH		6,28 (m)
1'	169,1
2'	54,9	4,84 (dt, J = 3,5, 9,0 Hz)
3'	40,9	3,13 (m), 3,28 (m)
NH		6,79 (d, J = 9,0 z)

TABLA 5 (continuación)

Nº	\delta_{C}	\delta_{H}
1''	171,7
2''	39,5	2,68 (d, J = 4,0 Hz)
3''	69,1	4,52 (m)
4''	63,4	2,77 (m)
5''	29,7	2,34 (m)
6''	19,7	0,90 (d, J = 7,0 Hz)
7''	20,6	1,00 (d, J = 7,0 Hz)
NH		7,38 (d, J = 7,0 Hz)
OH		3,09 (d, J = 10,0 Hz)
1'''	170,8
2'''	40,3	2,59 (d, J = 13,0 Hz), 3,31 (dd, J = 7,0, 13,0 Hz)
3'''	70,7	5,48 (m)
4'''	128,9	5,68 (d, J = 15,0 Hz)
5'''	133,3	6,31 (m)
6'''	33,1	2,43 (m), 2,68 (m)
7'''	40,0	2,73 (m), 3,24 (m)

El número (Nº) en la tabla indica las posiciones respectivas de los átomos de carbono en la fórmula estructural química del compuesto A mostrado en lo siguiente.

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TABLA 6 Los valores de desviación química de ^{1}H y ^{13}C RMN (en CDCl_{3}) del compuesto B

Nº	\delta_{C}	\delta_{H}
1	171,2
2	52,2	4,22 (dc, J = 4,0, 7,0 Hz)
3	16,5	1,48 (d, J = 7,0 Hz)
NH		6,18 (m)
1'	169,2
2'	54,5	4,87 (dt, J = 3,0, 9,0 Hz)
3'	41,3	3,10 (m), 33, (m)
NH		6,75 (d, J = 9,0 Hz)
1''	171,8
2''	39,5	2,70 (d, J = 4,0 Hz)
3''	68,2	4,60 (m)
4''	61,7	2,94 (m)
5''	36,3	2,05 (m)
6''	27,1	1,21 (m), 1,53 (m)
7''	11,5	0,89 (t, J = 7,5 Hz)
8''	15,4	0,90 (d, J = 7,0 Hz)
NH		7,25 (d, J = 7,0 Hz)
OH		2,93 (m)
1'''	170,6
2'''	40,7	2,58 (d, J = 13, Hz), 3,31 (dd, J = 7,0, 13,0 Hz)
3'''	70,6	5,48 (m)
4'''	128,6	5,67 (d, J = 15,0 Hz)
5'''	133,4	6,36 (m)
6'''	33,3	2,44 (m), 2,71 (m)
7'''	40,5	2,72 (m), 3,20 (m)

El número (Nº) en la tabla indica las posiciones respectivas de los átomos de carbono en la fórmula estructural química del compuesto B mostrado en lo siguiente.

TABLA 7 Los valores de desviación química de ^{1}H y ^{13}C RMN (en CDCl_{3}) del compuesto C

Nº	\delta_{C}	\delta_{H}
1	171,3
2	52,3	4,22 (dc, J = 7,3, 3,7 Hz)
3	16,5	1,50 (d, J = 7,3 Hz)
NH		6,40 (amplio)
1'	168,9
2'	55,1	4,81 (m)
3'	41,1	3,20 (m)
NH		6,82 (d, J = 9,1 Hz)
1''	171,4
2''	38,8	2,68 (m)
3''	70,7	4,35 (m)
4''	56,0	3,08 (m)
5''	38,8	1,51 (m), 2,06 (m)
6''	25,2	1,62 (m)
7''	21,3	0,91 (d, J = 6,7 Hz)
8''	23,4	0,91 (d, J = 6,7 Hz)
NH		7,49 (d, J = 6,7 Hz)
OH		2,96 (amplio)
1'''	170,9
2'''	40,3	2,62 (d, J = 12,8 Hz), 3,36 (d, J = 12,8, 7,3 Hz)
3'''	70,7	5,48 (m)
4'''	129,0	5,72 (d, J = 15,8 Hz)
5'''	133,2	6,29 (m)
6'''	32,7	2,43 (m), 2,72 (m)
7'''	40,5	2,74 (m), 3,31 (m)

El número (Nº) en la tabla indica las posiciones respectivas de los átomos de carbono en la fórmula estructural química del compuesto C mostrado en lo siguiente.

En base a las anteriores propiedades fisicoquímicas, las fórmulas estructurales químicas de los compuestos A, B y C fueron determinadas como sigue.

Compuesto A

2

Compuesto B

3

Compuesto C

4

Aplicabilidad industrial

Como el compuesto de la invención tiene una actividad citotóxica y una actividad de tipo TGF-\beta para las células cancerosas humanas, es útil como agente antitumoral, por ejemplo como fármaco o similar para el cáncer colorrectal, el cáncer de pulmón, el cáncer prostático, el cáncer cervical o similares.

La actividad citotóxica y la actividad de tipo TGF-\beta del compuesto de la invención para las células cancerosas humanas fueron confirmadas por los métodos siguientes.

Medición de la actividad citotóxica para células cancerosas humanas (1)

Se dispensaron células HeLa S3 ajustadas a una densidad de 6 x 10^{4} células/ml en porciones de 200 \mul y se añadieron diversas concentraciones del compuesto A y del compuesto B, respectivamente, en porciones de 4 \mul a una placa de ensayo de 96 pocillos y se cultivaron a 37ºC durante 3 días en una incubadora de CO_{2}. Después del cultivo, se midió el grado de crecimiento celular usando el Kit de Recuento Celular (fabricado por DOJINDO) y se obtuvo la razón de inhibición del crecimiento a cada concentración para calcular el valor de la CI_{50}. Como resultado, el compuesto A y el compuesto B mostraban actividad citotóxica para las células HeLa S3 con valores de CI_{50} de 1,6 \muM y 1,2 \muM, respectivamente.

Medición de la actividad citotóxica para células cancerosas humanas (2)

Se dispensaron células WiDr de cáncer de colon humanas ajustadas a una densidad de 6 x 10^{4} células/ml, células A549 de carcinoma de pulmón de células no pequeñas humanas ajustadas a una densidad de 4 x 10^{4} células/ml o células DU-145 de cáncer de próstata humanas ajustadas a una densidad de 6 x 10^{4} células/ml en una placa de ensayo de 96 pocillos y se cultivaron a 37ºC en una incubadora de CO_{2}. Después de 24 horas, se dispensó una concentración variable del compuesto A, del compuesto B o del compuesto C en porciones de 100 \mul y se cultivaron las células a 37ºC durante 72 horas más en una incubadora de CO_{2}. Después del cultivo, se determinó el número e células usando Sulforrodamina B y se calculó el valor de la CI_{50} de cada compuesto para el crecimiento celular. Como resultado, los compuestos A, B y C mostraron una excelente actividad de inhibición del crecimiento celular para las especies celulares respectivas células WiDr, células A549 o células DU-145. Aunque varía dependiendo de la especie celular, por ejemplo para células A549, los compuestos mostraron una actividad con un valor de CI_{50} de 5,0 nM o menos.

Medición de la actividad de tipo TGF-\beta

Con objeto de detectar la actividad de tipo TGF-\beta, se construyó un sistema de ensayo haciendo uso de la expresión de un gen informador. Se transfectó un gen de luciferasa fluorescente secuencia abajo del gen promotor PAI-1 de células epiteliales de pulmón de visón (Mv1Lu), en donde se induce la expresión del activador-1 del plasminógeno (PAI-1) por el TGF-\beta debido a un exceso en la expresión del receptor de TGF-\beta (Journal of Biological Chemistry, Vol. 262, pp. 17467-17414, 1987), (Analytical Biochemistry, Vol. 216, pp. 276-284, 1994).

Usando las células anteriores, se usó la intensidad luminosa obtenida añadiendo cada compuesto como índice de la actividad de tipo TGF-\beta. Como resultado, el TGF-\beta aumentó la intensidad luminosa inducida por la expresión del gen promotor PAI-1. Del mismo modo, el compuesto A aumentó la intensidad luminosa a una concentración de 26 nM a 100 \muM y el compuesto B a una concentración de 12 nM a 100 \muM.

Claims

1. Un compuesto depsipeptídico representado por la siguiente fórmula general

5

(donde R representa un grupo isopropilo, un grupo sec-butilo o un grupo isobutilo) o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

2. Una composición farmacéutica que contiene el compuesto depsipeptídico o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable descritos en la reivindicación 1 como principio activo.

3. El compuesto depsipeptídico o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable descritos en la reivindicación 1 para uso como fármaco.

4. El uso del compuesto depsipeptídico o de una sal del mismo farmacéuticamente aceptable descritos en la reivindicación 1 para la preparación de un agente antitumoral.

5. Método de producción del compuesto descrito en la reivindicación 1, consistente en la etapa de cultivar un microorganismo perteneciente al género Pseudomonas sp. Q71576 (FERM BP-6944) y de aislar el compuesto de la mezcla de cultivo por extracción y purificación de los metabolitos producidos por el microorganismo.

6. Una cepa de Pseudomonas sp. Q71576 (FERM BP-6944).