ES2248654T3 - Compuestos antibacterianos. - Google Patents

Compuestos antibacterianos.

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ES2248654T3 ES03004404T ES03004404T ES2248654T3 ES 2248654 T3 ES2248654 T3 ES 2248654T3 ES 03004404 T ES03004404 T ES 03004404T ES 03004404 T ES03004404 T ES 03004404T ES 2248654 T3 ES2248654 T3 ES 2248654T3
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Kaneko Masakatsu
Takatsu Toshio
Hotoda Hitoshi
Arai Masatoshi
Miyakoshi Shunichi
Kizuka Masaaki
Ogawa Yasumasa
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Sankyo Co Ltd
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Abstract

Un compuesto que se selecciona a partir del grupo que consiste en: (i) El Compuesto A-500359E representado por la fórmula (XI) siguiente: o una sal o solvato del mismo; (ii)El Compuesto A-500359F representado por la fórmula (XII) siguiente: o una sal o solvato del mismo; (iii) Un derivado amida del Compuesto A-500359F representado por la fórmula (XIII) siguiente: o una sal o solvato del mismo; (iv)Un compuesto A-500359H representado por la fórmula (XIV) siguiente: o una sal o solvato del mismo; (v) El Compuesto A-500359J representado por la fórmula (XV) siguiente: o una sal o solvato del mismo; y (vi)Un compuesto A-500359M-3 representado por la fórmula (XVI) siguiente: o una sal o solvato del mismo;

Description

Compuestos antibacterianos.
Campo técnico
La presente invención se refiere a compuestos de fórmulas (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) y (XVI) que tienen excelente actividad antibiótica o a una sal farmacéuticamente aceptable de ellos.
La presente invención también es una composición farmacéutica que comprende un compuesto que se ha descrito arriba como ingrediente activo efectivo para tratar o prevenir enfermedades infecciosas.
La presente invención incluye un uso de un compuesto que se describió arriba para preparar un medicamento efectivo para tratar o prevenir enfermedades infecciosas.
La presente invención también incluye un proceso para preparar un compuesto de fórmula (XI), (XII), (XIV) o (XV).
Antecedentes de la invención
Se ha usado convencionalmente un antibiótico de tipo \beta-lactama, un amino-glicósido, isoniazida o rifampicina en el tratamiento o profilaxis de infecciones microbianas incluyendo el bacilo del tubérculo. Recientemente han habido muchas bacterias resistentes a estos antibióticos. Es deseable desarrollar nuevos compuestos que son agentes antimicrobianos de diferentes tipos a partir de los convencionales.
Por otra parte se ha sabido que la capuramicina que tiene una fórmula que se muestra abajo exhibe actividad anti-bacilo del tubérculo (J. Antibiotics 1986, 29 (8), 1047-1053).
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1 
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Hallamos nuevos compuestos de fórmulas (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) y (XVI), que no muestran ninguna resistencia cruzada a medicamentos convencionales, en los productos de cultivo de un microorganismo. Preparamos los derivados de los compuestos que se han descrito arriba y la capuramicina. Estudiamos la actividad fisiológica de estos derivados durante varios años y encontramos que estos derivados exhiben una actividad antibiótica excelente.
Los compuestos de la presente invención pueden proporcionar un método efectivo para tratar y prevenir las enfermedades infecciosas incluyendo aquéllas que surgen de bacterias resistentes a los antibióticos convencionales. Los compuestos de fórmulas (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) y (XVI) también son materiales de partida útiles para la preparación de los compuestos de la presente invención teniendo una actividad antibiótica excelente.
La presente invención proporciona un compuesto que se selecciona a partir del grupo que consiste en:
(i) El Compuesto A-500359E representado por la siguiente fórmula (XI):
2 
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o una sal de ello;
(ii) El Compuesto A-500359F representado por la siguiente fórmula (XII):
3 
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o una sal de ello;
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(iii) un derivado amida del Compuesto A-500359F representado por la siguiente fórmula (XIII):
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o una sal de ello;
(iv) El Compuesto A-500359H representado por la siguiente fórmula (XIV):
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o una sal de ello;
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(v) El Compuesto A-500359J representado por la siguiente fórmula (XV):
6
o una sal de ello; y
(vi) El Compuesto A-500359M-3 representado por la siguiente fórmula (XVI):
7
o una sal de ello;
(2) un proceso para preparar el compuesto tal como se ha descrito en (i), (ii), (iv) o (v) cultivando un microorganismo capaz de producir dicho compuesto y que pertenece al Streptomyces spp. y recuperando el compuesto del caldo de cultivo;
(3) un proceso tal como se ha descrito en (2), donde el microorganismo perteneciente al Streptomyces spp. y que es capaz de producir el compuesto es Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) y es capaz de producir los compuestos tal como se ha descrito en (i), (ii), (iii) o (iv);
(4) una composición para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas que contiene el compuesto tal como se ha descrito en (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi) o una sal farmacéuticamente aceptable de ello como ingrediente efectivo;
(5) uso del compuesto tal como se ha descrito en (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi) o una sal farmacéuticamente aceptable de ello para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir enfermedades infecciosas; y
(6) un compuesto tal como se ha descrito en (i), (ii), (iii), (iv), (v) o (vi) o una sal farmacéuticamente aceptable de ello para el uso como un medicamento, particularmente para el uso en el tratamiento o la prevención de una infección bacteriana.
Se producen los compuestos de la presente invención representados por cualquiera de las fórmulas (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) y (XVI) en el caldo de cultivo de la Cadena de Streptomyces griseus SANK60196 que pertenece al Streptomyces spp. y que se ha separado a partir de la tierra que se recogió en el monte Tsukuba/Igaraki-ken; o que se produjo por conversión microbiana en el proceso de cultivo o por conversión química en el proceso de aislamiento y purificación.
El Compuesto A-500359E de la fórmula (XI), el Compuesto A-500359F de la fórmula (XII), el derivado Amida del Compuesto A-500359F de la fórmula (XIII), el Compuesto A-500359H de la fórmula (XIV), el Compuesto A-500359J de la fórmula (XV) y el Compuesto A-500359M-3 de la fórmula (XVI) de la presente invención contienen cada uno carbonos asimétricos, y por ello cada uno puede existir como varios isómeros ópticos. En la presente invención, se representan los isómeros de cada caso del Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el derivado Amida del Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3 por la misma fórmula, pero la siguiente invención abarca todos los isómeros incluyendo los compuestos racémicos y también sus mezclas. Cuando se adopta un proceso de síntesis estereoespecífico o se utiliza un compuesto ópticamente activo como compuesto de partida, se puede preparar directamente el isómero de cada caso del Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el derivado Amida del Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3 o, si se prepara en forma de una mezcla, se puede obtener cada isómero de una manera que conocen aquéllos con habilidad en la técnica.
Se puede convertir el Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3 de la presente invención en la sal correspondiente por un método que conocen aquéllos con habilidad en la técnica. La presente invención abarca tales sales del Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3. No existe ninguna restricción particular en la naturaleza de la sal de cualquiera de los casos de Compuesto A-500359F, Compuesto A-500359H, Compuesto A-500359J y Compuesto A-500359M-3, con tal de que se use médicamente y que sea farmacológicamente aceptable. Cuando se usa la sal del Compuesto A-500359F, del Compuesto A-500359H, del Compuesto A-500359J o del Compuesto A-500359M-3 para otro propósito que no sea un medicamento, por ejemplo, se ha usado como intermedio, no se impone ninguna limitación. Los ejemplos preferidos de tal sal incluyen sales de metales alcalinos tales como una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de litio, sales de metales alcalinotérreos tales como una sal de calcio o una sal de magnesio, sales de metales tales como una sal de aluminio, una sal de hierro, una sal de zinc, una sal de cobre, una sal de níquel o una sal de cobalto, sales inorgánicas tales como una sal de amonio, sales de aminas orgánicas tales como una sal de t-octilamina, una sal de dibencilamina, una sal de morfolina, una sal de glucosamina, una sal del éster de alquilo de la fenilglicina, una sal de etilendiamina, una sal de N-metilglucamina, una sal de guanidina, una sal de dietilamina, una sal de trietilamina, una sal de diciclohexilamina, una sal de N,N'-dibenciletilendiamina, una sal de cloroprocaína, una sal de procaína, una sal de dietanolamina, una sal de N-bencilfenetilamina, una sal de piperazina y una sal de tetrametilamonio, o una sal de tris(hidroximetil)aminometano, y sales de aminoácidos tales como una sal de glicina, una sal de lisina, una sal de arginina, una sal de ornitina, o una sal de asparagina. Más preferidas son las sales que son preferiblemente utilizables como una sal farmacológicamente aceptable tal como una sal de sodio, una sal de potasio y una sal de amonio.
El Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el derivado Amida del Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3 de la presente invención y las sales de ello pueden existir como un solvato. Por ejemplo, cuando se permite que estén al aire o se recristalicen, se adsorbe agua a ellos por absorción o se puede formar un hidrato. También se abraza tal solvato en la presente invención.
El Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3 de la presente invención que se representan por las fórmulas (XI), (XII), (XIV), (XV) y (XVI) respectivamente están disponibles cultivando, en un medio adecuado, un microorganismo perteneciente al Streptomyces spp. y la recuperación a partir del caldo de cultivo. Se recoge y se aísla la Cadena de Streptomyces griseus SANK 60196 (que se llamará a partir de ahora "Cepa SANK60196"), preferido como el microorganismo capaz de producir el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3, tal como se ha descrito arriba, a partir de la tierra de la Prefectura Tsukubasan/Ibaraki de una manera convencional. La Cepa SANK60196 tiene las siguientes características biológicas.
Las propiedades micológicas de la Cepa SANK60196 son tal como sigue:
1) Apariencia morfológica
La Cepa SANK60196 mostró una apariencia morfológica tal como se describe abajo después del cultivo a 28ºC durante 14 días en un medio especificado por el Internacional Streptomyces Project (que se abreviará a partir de ahora como "ISP") [referirse a Shirling, E.B. y Gottlieb, D., "Int. J. Syst. Bacteriol. 1996, 16, 313-340".]. La observación a través de un microscopio óptico indica que se hacen crecer favorablemente las micelias sustrato de SANK60196 y que se ramifican y muestran un color gris amarillento, marrón amarillento u oliva pálido, pero a diferencia de la cadena perteneciente a Nocardia spp., no muestran ruptura o extensión del zigzag. Las micelias aéreas muestran una ramificación sencilla. La forma de la cadena de esporas es recta o curvada y su cadena está formada por 10 hasta 50 o más esporas. La observación a través de un microscopio electrónico de barrido muestra que la espora tiene una forma ovalada y que tiene una estructura de superficie lisa. La espora es de 0,6-0,8 x 0,7-1,2 mm de dimensión. Se forma la espora sólo en las micelias aéreas. No se reconoce la formación de esporangios, la división axial de las micelias aéreas, la ruptura de las micelias aéreas ni la esclerotia.
2) Características de crecimiento en varios medios de cultivo
Las características de crecimiento de la Cepa SANK60196 en un medio de agar después del cultivo a 28ºC durante 14 días es tal como se describe abajo en la Tabla 3. En la Tabla, la composición del medio que se vincula a un Núm. de ISP es la misma que especifica el ISP. En el inventario, las abreviaturas G, AM, R y SP significan crecimiento, micelia aérea, color inverso y pigmento soluble, respectivamente. Se describe el tono de color de acuerdo con "Colour Standards, ed. por Japan Colour Laboratory". La indicación del tono de color entre paréntesis es un número de color de acuerdo con el sistema de color de Munsell. El pigmento soluble amarillo pálido producido en un medio de agua-agar cambia a incoloro mediante ácido clorhídrico 0,05 N, pero no muestra ningún cambio mediante hidróxido de sodio 0,05 N.
TABLA 3 
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Naturaleza del Medio;
Inventario: características.
Agar de extracto de levadura-extracto de malta (ISP 2);
G: excelente, plano, marrón amarillento (10YR 5/6).
AM: formado abundantemente, aterciopelado, marrón pálido (2.5Y 8/2).
R: marrón amarillento (10YR 5/8).
SP: marrón amarillento (10YR 6/8).
Agar de harina de avena (ISP 3);
G: excelente, plano, marrón amarillento (2.5Y 6/6).
AM: formado abundantemente, aterciopelado, naranja amarillento pálido (5Y 9/2).
R: amarillo oscuro (2.5Y 8/8).
SP: no producido.
Agar de sal inorgánica-almidón (ISP 4);
G: bueno, plano, marrón amarillento (2.5Y 6/4).
AM: formado abundantemente, aterciopelado, gris amarillento (7.5Y 9/2).
R: marrón amarillento (2.5Y 6/4).
\newpage
TABLA 3 (continuación)
\vskip1.000000\baselineskip
Agar de asparagina-glicerina (ISP 5);
G: excelente, plano, marrón amarillento pálido (2.5Y 7/6).
AM: formado abundantemente, aterciopelado, gris amarillento (5Y 8/2).
R: marrón amarillento pálido (2.5Y 8/6).
SP: no producido.
Agar de hierro-extracto de levadura-peptona (ISP 6);
G: excelente, plano, cloro oliva pálido (5Y 8/3).
AM: ligeramente producido, aterciopelado, gris amarillento (5Y 9/1).
R: amarillo pálido (5Y 8/6).
SP: no producido.
Agar de tirosina (ISP 7);
G: bueno, plano, marrón amarillo grisáceo (2.5Y 5/4).
AM: formado abundantemente, aterciopelado, gris oliva claro (7Y 8/2).
R: marrón amarillento (10YR 5/4).
SP: marrón amarillo grisáceo (2.5Y 4/3).
Agar de nitrato-sucrosa;
G: no tan bueno, plano, amarillo pálido (5Y 8/6).
AM: formado abundantemente, aterciopelado, gris oliva claro (7.5Y 8/2).
R: amarillo oscuro (5Y 8/8).
SP: amarillo pálido (5Y 9/6).
Agar de asparagina-glucosa;
G: bueno, plano, amarillo pálido (5Y 9/3).
AM: no tan bueno, aterciopelado, gris amarillento (5Y 9/1).
R: gris amarillento (7.5Y 9/3).
SP: no producido.
Agar de nutriente (producto de Difco Laboratories);
G: bueno, plano, marrón amarillento pálido (2.5Y 8/3).
AM: bueno, aterciopelado, gris amarillento (5Y 9/1).
R: gris amarillento (5Y 9/4).
SP: no producido.
\newpage
TABLA 3 (continuación)
\vskip1.000000\baselineskip
Agar de extracto de zanahoria-extracto de patata;
G: no tan bueno, plano, gris amarillento (7.5Y 9/2).
AM: no tan bueno, aterciopelado, gris amarillento (5Y 9/2).
R: gris amarillento (7.5Y 9/3).
SP: gris amarillento (7.5Y 9/3).
Agar de agua;
G: no tan bueno, plano, gris amarillento (5Y 9/1).
AM: no tan bueno, aterciopelado, gris amarillento (5ZY 9/1).
R: gris amarillento (7.5Y 9/4).
SP: amarillo pálido (5Y 9/6).
3) Características fisiológicas
Las características fisiológicas de la cadena presente observadas durante 2 hasta 21 días después del cultivo a 28ºC son tal como se muestra en la Tabla 4. En la tabla, el Medio 1 es un medio de agar de extracto de levadura-extracto de malta (ISP 2).
TABLA 4 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Hodrólisis del almidón \+  \hskip4cm   \+ positivo\cr 
Licuefacción de la gelatina \+ \+ positivo\cr  Reducción de nitratos
\+ \+ positivo\cr  Coagulación de la leche \+ \+ negativo\cr 
Peptonización de la leche \+ \+ positivo\cr  Formación de pigmento
tipo melamina \+ \+ positivo\cr  Descomposición del sustrato:
caseína \+ \+ positivo\cr   \hskip4.2cm  tirosina \+ \+
positivo\cr   \hskip4.2cm  xantina \+ \+ negativo\cr  Rango
de temperatura de crecimiento (Medio 1) \+ \+ 6 hasta 35ºC\cr 
Temperatura de crecimiento óptimo (Medio 1) \+ \+ 18 hasta 30ºC\cr 
Crecimiento en presencia de sal (Medio 1) \+ \+
10%\cr}
La utilización de una fuente de carbón por la Cepa SANK60196 observada después del cultivo a 28ºC durante 14 días sobre un medio de agar Pridham-Gottlieb (ISP 9) es tal como se describe en la Tabla 5.
En la tabla, "+" significa utilizable, mientras que "-" significa no utilizable.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 D-glucosa \+  \hskip5cm  \+ +\cr 
L  -  arabinosa \+ \+ -\cr  D  -  xilosa \+
\+ +\cr  Inositol \+ \+ -\cr  D  -  manitol \+ \+ +\cr 
D  -  fructosa \+ \+ +\cr  L  -  ramnosa \+
\+ -\cr  Sucrosa \+ \+ -\cr  Rafinosa \+ \+ -\cr  Control \+ \+
-\cr}
4) Propiedades quimiotaxonómicas
Se investigó la pared celular de la presente cadena de acuerdo con el método de Hasegawa, et al. [referirse a Hasegawa, T., et al., "The Journal of General and Applied Microbiology 1983, 29, 319-322"], resultando en la detección del ácido LL-diaminopimélico. Se investigó el principal componente de azúcar en todas las células de la presente cadena de acuerdo con el método de M. P. Lechevalier [referirse a Lechevalier, M.P., "Journal of Laboratory and Clinical Medicine 1968, 71, 934-944"]. Como resultado, no se detectó ningún componente característico.
Las propiedades micológicas que se han descrito arriba han revelado que la presente cadena pertenece a Streptomyces spp. entre los actinomicetes. Se ha aclarado que la presente cadena está marcadamente relacionada con Streptomyces griseus, como resultado de la comparación con el microorganismo que describieron en las cadenas de ISP Shirling y Gottlieb [referirse a Shirling, E.B. y Gottlieb, D., "International Journal of Systematic Bacteriology 1968, 18, 68-189 y 279-392; 1969, 19, 391-512; 1972, 22, 265-394"], el microorganismo que se describió en "The actinomycetes Vol.2" escrito por Waksman [referirse a Waksman, S.A., "The actinomycetes 2 (1961)"], con el microorganismo que se describió en Bergey's Manual editado por Buchanan y Gibbons [referirse a R.E. Buchanan y N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8ª edición (1974)], con el microorganismo que se describió en "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", editado por Williams [referirse a Williams, S.T. et al., "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 4 (1989)"] y con el microorganismo que se describió en la literatura reciente sobre actinomicetes pertenecientes a Streptomyces spp. Se ha reconocido, sin embargo, que es diferente al Streptomyces griseus, porque produce un pigmento soluble gris amarillento en un medio de agar de glicerina - asparagina y un pigmento soluble marrón amarillento pálido en un medio de agar de peptona - extracto de levadura - hierro pero no produce un pigmento soluble ni en un medio de agar de extracto de patata - extracto de zanahoria ni en un medio de agar de agua; la temperatura de crecimiento máximo es de 40ºC; y crece en presencia de un 7% de sal.
Se considera que la cadena presente que tiene tales características micológicas es una cadena nueva diferente a Streptomyces griseus, pero es imposible distinguirlas basándose sólo en las diferencias que se han descrito arriba. Los presentes inventores por lo tanto identificaron la presente cadena como Streptomyces griseus SANK60196.
Se depositó internacionalmente esta cadena en la Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, JAPÓN) como del 22 de febrero de 1996, con el número de acceso de FERM BP-5420.
Las características varias de los actinomicetes pertenecientes a Streptomyces spp. tales como la Cepa SANK60196 no son estables, pero tal como se conoce bien, cambian fácilmente natural o artificialmente. Las cadenas utilizables en la presente invención incluyen todas estas variantes. La presente invención abarca todas las cadenas que pertenecen al Streptomyces spp. y que son capaces de producir el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J o el Compuesto A-500359M-3.
Cualquier medio sintético o natural es utilizable como medio para cultivar el microorganismo capaz de producir el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J o el Compuesto A-500359M-3, en la medida en que contenga una fuente que se selecciona a partir de fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, iones inorgánicos y fuentes de nutrición orgánicas como sea necesario.
Los ejemplos de fuente de nutrición utilizables aquí incluyen fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y sales inorgánicas conocidas que se usan convencionalmente para el cultivo de una cadena micótica o actinomiceta y son utilizables por microorganismos.
Los ejemplos específicos de la fuente de carbono incluyen la glucosa, la fructosa, la maltosa, la sucrosa, el manitol, el glicerol, la dextrina, las avenas, el centeno, el almidón de maíz, la patata, la harina de maíz, la harina de soja, el aceite de semilla de algodón, el jarabe de malta glutinosa, el jarabe, el aceite de soja, el ácido cítrico y el ácido tartárico. Se pueden usar ya sea separadamente o en combinación. La cantidad de la fuente de carbono que se va a añadir normalmente varía, pero no se limita a, dentro de un rango de 1 hasta un 10% en peso de la cantidad del medio.
Se utiliza generalmente una sustancia que contenga una proteína o un hidrolizado de ello como la fuente de nitrógeno. Los ejemplos preferidos de la fuente de nitrógeno incluyen la harina de soja, el salvado de trigo, la harina de cacahuete, la harina de semilla de algodón, la leche desnatada, el hidrolizado de caseína, Pharmamine (producto de Sheffield Chemical), la harina de pescado, el licor de maíz macerado, la peptona, el extracto de maíz, la levadura prensada, la levadura seca, el extracto de levadura, el extracto de malta, la patata, el sulfato de amonio, el nitrato de amonio y el nitrato de sodio. Se prefiere usar las fuentes de nitrógeno que se han ejemplificado arriba ya sea separadamente o en combinación en una cantidad que oscila entre un 0,2 y un 6% en peso de la cantidad del medio.
Se puede usar cualquier sal empleada ordinariamente que contenga un ión tal como fosfato, sulfato, cloruro o carbonato de sodio, de amonio, o de calcio como la sal inorgánica nutriente. Además, las trazas de metales tales como el potasio, el calcio, el cobalto, el manganeso, el hierro y el magnesio son utilizables.
La adición de cobalto, leche desnatada o extracto de levadura es particularmente efectiva en la producción del Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, o el Compuesto A-500359J.
Cultivando el microorganismo, se puede añadir un inhibidor de la biosíntesis de los antibióticos para producir el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F y el Compuesto A-500359H. Se puede producir el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F y el Compuesto A-500359H, por ejemplo, usando la S-(2-aminoetil)-L-cisteína o la sal de ello que es un inhibidor de la aspartato quinasa separadamente o en combinación con cobalto, leche desnatada o extracto de levadura, como un aditivo del medio. Por ejemplo, el uso del aditivo que se ha descrito arriba en combinación con la leche desnatada mejora la productividad del Compuesto A-500359E, del Compuesto A-500359F y del Compuesto A-500359H. Se puede añadir el aditivo para darle su concentración final que oscila entre 1 y 100 mM. Para la producción del Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, y el Compuesto A-500359H, se prefiere la concentración final de 10 mM.
El uso del aditivo que se ha descrito arriba en combinación con un aminoácido o una sal de ello hace posible producir compuestos útiles que se relacionan con el Compuesto A-500359F, y el Compuesto A-500359H. En particular, por el uso en combinación con la L-alilglicina o una sal de ello, el Compuesto A-500359M-3 (XVI) está disponible. Se puede añadir la L-alilglicina a una concentración final que oscila entre 1 y 100 mM. A la concentración final de 10 mM, se puede producir preferiblemente la sustancia A-500359M-3.
Con el cultivo líquido, se puede usar un antiespumante tal como el aceite de silicona, el aceite vegetal, un surfactante o similar.
El medio para el cultivo de la Cepa SANK60196 para producir el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, o el Compuesto A-500359J tiene preferiblemente un pH que oscila entre el 5,0 hasta el 8,0.
Aunque la temperatura que permite el crecimiento de la Cepa SANK60196 oscila entre 12 y 36ºC, se cultiva preferentemente la cadena entre 18 y 28ºC, más preferiblemente entre 19 y 23ºC, para producir el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H y el Compuesto A-500359J.
Se puede usar un cultivo aeróbico de la Cepa SANK60196 para obtener el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3. Los ejemplos de tal método decultivo incluyen los cultivos aeróbicos que se emplean ordinariamente tales como el cultivo sólido, el cultivo agitado, y el cultivo de agitación ventilación.
Para un cultivo a pequeña escala, se prefiere el cultivo agitado durante varios días desde 19 hasta 23ºC. Se comienza el cultivo haciendo crecer un paso de cultivo de semillas en un proceso de primera o segunda etapa en un matraz Erlenmeyer con deflector (equipado con una pared de ajuste de flujo de agua) o un matraz Erlenmeyer que se emplea ordinariamente. Se puede usar una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno en combinación como un medio en el cultivo de semillas. Se puede agitar el cultivo de semillas desde 19 hasta 23ºC durante 5 días en un incubador termostato o se puede agitar hasta que el cultivo de semillas crezca suficientemente. Se usa el cultivo de semillas que se ha hecho crecer así para la inoculación en el segundo medio de cultivo de semillas o en un medio de producción. Cuando se usan los cultivos de semillas bajo un paso de crecimiento intermedio, se permite que crezcan de una manera similar, seguido de la inoculación parcial en un medio de producción. Se somete el matraz en el que se inoculan las semillas al cultivo con agitación a una temperatura constante durante varios días, y después de la realización del cultivo, se centrífuga o se filtra el medio de cultivo en el matraz.
Para un cultivo a gran escala, por otra parte, se prefiere el uso de un fermentador o un tanque de jarra equipados con un agitador y un aparato de ventilación. Antes del cultivo en tal contenedor, un medio nutriente se calienta a una temperatura desde 121 hasta 130ºC para su esterilización. Después de enfriarse, se inoculan en el medio esterilizado, los cultivos de semillas que se ha permitido que crecieran con antelación mediante el método comentado con anterioridad. Entonces, se llevó a cabo el cultivo con ventilación y agitación desde 19 hasta 23ºC. Este método es adecuado para preparar una gran cantidad de compuestos.
También se puede producir el Compuesto A-500359E, A-500359F, o A-500359H añadiendo, como un inhibidor de la aspartato quinasa, una solución acuosa de la S-(2-aminoetil)-L-cisteína o una sal de ello que se ha filtrado-esterilizado previamente de antemano hasta un medio esterilizado al principio de, o durante, el cultivo.
Se puede producir el Compuesto A-500359M-3 añadiendo separada o simultáneamente soluciones acuosas de la S-(2-aminoetil)-L-cisteína o la sal de ello, y la L-alilglicina o la sal de ello que se han filtrado-esterilizado de antemano en el medio esterilizado al principio de, o durante, el cultivo.
Se puede medir el producto del Compuesto A-500359E, del A-500359F, del A-500359H, del A-500359J y del A-500359M-3 mediante cultivo sometiendo una porción del caldo de cultivo a análisis por HPLC. El titrado del Compuesto A-500359E, del A-500359F, del A-500359H, del A-500359J y del A-500359M-3 alcanza normalmente un pico a los 3 hasta 15 días.
Después de la realización del cultivo, se separa el componente celular a partir del caldo de cultivo mediante filtración con la ayuda de las tierras de diatomeas o centrifugación, y se purifica el Compuesto A-500359E, el A-500359F, el A-500359H, el A-500359J y el A-500359M-3 presentes en el filtrado o en el sobrenadante utilizando sus propiedades físico-químicas con los datos analíticos de HPLC como índice. Como tierra de diatomeas, se prefiere "Celite 545" (producto de Celite Corporation). Se puede purificar el Compuesto A-500359E, el A-500359F, el A-500359H, el A-500359J y el A-500359M-3 presentes en el filtrado usando adsorbentes separadamente o en combinación, por ejemplo, carbón activado o una resina adsorbente tal como "Amberlite XAD-2 o XAD-4" (producto de Rohm & Haas), y "Diaion HP-10, HP-20, CHP-20P, HP-50 o SP-207" (cada uno, producto de Mitsubishi Chemical). Se puede separar el Compuesto A-500359E, el A-500359F, el A-500359H, el A-500359J y el A-500359M-3 de las impurezas pasando una solución que contiene el Compuesto A-500359E, el A-500359F, el A-500359H, el A-500359J y el A-500359M-3 a través de la capa de tal adsorbente tal como se ha descrito arriba, y eliminando las impurezas que se han adsorbido a ella de la solución; o eluyendo el Compuesto A-500359E, el A-500359F, el A-500359H, el A-500359J y el A-500359M-3 adsorbidos con metanol acuoso, acetona acuosa, n-butanol acuoso, amoníaco acuoso, metanol acuoso que contiene amoníaco o acetona acuosa que contiene amoníaco. Cuando se utiliza una solución que contiene amoníaco como eluyente, sucede que el derivado amida del compuesto A-500359F se produce durante la elución de la columna o concentración.
Se puede purificar el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el derivado amida del Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J o el Compuesto A-500359M-3 que se han obtenido así mediante cromatografía en columna de adsorción usando gel de sílice, "Florisil", "Cosmosil" (producto de Nacalai Tesque), o "Diaion CHP-20P o SP207" (producto de Mitsubishi Chemical); cromatografía de filtración en gel con "Sephadex G-10" (producto de Pharmacia Biotech) o "Toyopearl HW40F" (producto de TOSOH Corporation); cromatografía de intercambio aniónico con "Dowex 1 o SBR-P" (producto de Dow Chemical) o "Diaion PA316" (producto de Mitsubishi Chemical); HPLC de fase normal y fase inversa; o similares.
Se puede separar el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el derivado amida del Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3 de la presente invención y purificarlos usando los medios de separación y de purificación que se han ejemplificado arriba separadamente o en combinación tal como se necesita, o en algunos casos, usando uno de ellos en repetición.
Se puede obtener el compuesto A-500359F mediante hidrólisis del Compuesto A-500359E. Por ejemplo, se lleva a cabo la hidrólisis preferiblemente bajo condiciones básicas, preferiblemente en solución acuosa básica.
Los ejemplos del compuesto básico utilizables para la hidrólisis incluyen los hidróxidos de metal alcalino y las sales de ácidos débiles de ello tales como el hidróxido de sodio, el hidróxido de potasio, el hidróxido de litio, el acetato de sodio, el carbonato de sodio, el carbonato de potasio y el bicarbonato de sodio; los hidróxidos de metales alcalinotérreos y las sales de ácidos débiles de ello tales como el hidróxido de calcio, el hidróxido de magnesio y el acetato de magnesio; los compuestos básicos inorgánicos o las sales básicas de ello tales como amoníaco; las aminas orgánicas y las sales básicas de ellos tales como la t-octilamina, la dibencilamina, la morfolina, la glucosamina, el éster de alquilo de la fenilglicina, la etilendiamina, la N-metilglutamina, la guanidina, la dietilamina, la trietilamina, la diciclohexilamina, la N,N'-dibenciletilendiamina, la cloroprocaína, la procaína, la dietanolamina, la N-bencilfenetilamina, la piperazina, el tetrametilamoníaco y el tris(hidroximetil)aminometano. También se puede utilizar un tampón básico que contenga un ión metálico alcalino, un ión metálico alcalinotérreo, un ión inorgánico tal como el amoníaco, o un ión amina orgánica de los compuestos básicos que se han ejemplificado arriba. Entre ellos, se prefieren los hidróxidos de metal alcalino, de los cuales se prefiere particularmente el hidróxido de sodio. En particular, la hidrólisis del Compuesto A-500359E usando hidróxido de sodio puede producir fácilmente el Compuesto A-500359F.
La concentración del compuesto básico que se ha usado en la reacción que se ha descrito arriba oscila preferiblemente desde 0,001 hasta 1N, más preferiblemente desde 0,3 hasta 0,1 N. La temperatura de reacción es preferiblemente -20 hasta 40ºC, más preferiblemente 0 hasta 30ºC. El tiempo de reacción es preferiblemente 30 segundos hasta 15 horas, más preferiblemente 30 minutos hasta 2 horas.
El uso de amoníaco acuoso como base produce el derivado amida del Compuesto A- 500359F junto con el Compuesto A-500359F, pero se pueden separar y purificar estos compuestos mediante el método que se ha descrito arriba.
Se puede producir el derivado amida del Compuesto A-500359F por reacción del Compuesto A-500359E con amoníaco en un disolvente.
Los ejemplos de disolvente incluyen agua y alcoholes tales como el etanol y el metanol, de los cuales se prefieren el agua y el metanol.
Se puede introducir amoníaco gaseoso en la solución del compuesto, pero se usa normalmente una solución de amoníaco en agua o en un alcohol tal como el metanol o el etanol. Preferiblemente, se utiliza una solución acuosa o metanólica.
Cuando se usa amoníaco acuoso, su concentración oscila preferiblemente entre 0,1 y 1N, más preferiblemente desde 0,3 hasta 0,7N. La temperatura de reacción es preferiblemente de -20 hasta 40ºC, más preferiblemente 0 hasta 30ºC. El tiempo de reacción son preferiblemente 30 minutos hasta 15 horas, más preferiblemente 1 hasta 4 horas.
Cuando se usa amoníaco acuoso, además del derivado amida que se desea del Compuesto A-500359F, se produce el Compuesto A-500359F por la hidrólisis del éster. Sin embargo se pueden separar y purificar estos compuestos mediante los métodos que se han descrito arriba.
También se puede producir el derivado amida del Compuesto A-500359F haciendo reaccionar el Compuesto A-500359F con un reactivo metilante en un disolvente, convirtiéndolo de este modo en el derivado metil éster, es decir, el Compuesto A-500359E, y haciendo reaccionar entonces el compuesto resultante con amoníaco tal como se ha descrito arriba.
Los ejemplos de reactivo metilante incluyen el diazometano y el ácido dimetilsulfúrico, de los cuales se prefiere el diazometano. Se añade preferiblemente el reactivo metilante para la conversión del Compuesto A-500359F en el Compuesto A-500359E en una cantidad de 1 hasta 5 equivalentes, preferiblemente de 1,5 hasta 2 equivalentes.
Los ejemplos de disolvente utilizable para la reacción de arriba incluyen el agua y alcoholes tales como el metanol y el etanol, de los cuales se prefieren el agua y el metanol.
La temperatura de reacción es preferiblemente -20 hasta 40ºC, más preferiblemente 0 hasta 30ºC. El tiempo de reacción es preferiblemente 30 minutos hasta 15 horas, preferiblemente 1 hasta 2 horas.
Después de la realización de la reacción, se puede aislar el Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359E y el derivado amida del Compuesto A-500359F a partir de la mezcla de reacción por los medios que se seleccionan tal como se ha necesitado a partir de aquéllos que se han descrito arriba en los medios de separación y purificación para el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el derivado amida del Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3.
Se describen aquí arriba los procesos de preparación típicos para el Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el derivado amida del Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3, pero no se limitan los procesos de preparación a ello y también se pueden utilizar otros procesos que ya conocen aquéllos con habilidad en la técnica.
El Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el derivado amida del Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3 de la presente invención así disponibles son nuevos compuestos que no se han descrito en la literatura. Se puede determinar su actividad inhibitoria de crecimiento frente a bacterias gram positivas generales o bacterias gram negativas mediante el método de ensayo de disco usando un medio de agar normal (producto de Eiken Chemical) o un medio de agar de infusión de corazón (producto de Difco Laboratorios). Se puede determinar similarmente la actividad inhibitoria de crecimiento frente a Mycobacteria, bacterias gram positivas que pertenecen al Actinomycetales, en el medio que se ha descrito arriba al que se ha añadido además glicerina.
Se describieron hasta ahora métodos de evaluación típicos de actividad biológica del Compuesto A-500359E, el Compuesto A-500359F, el derivado amida del Compuesto A-500359F, el Compuesto A-500359H, el Compuesto A-500359J y el Compuesto A-500359M-3, pero no se limita el método de evaluación a ello, sino que también se pueden utilizar otros métodos de evaluación que ya conocen aquéllos con habilidad en la técnica.
Se pueden administrar los compuestos de la presente invención o las sales farmacológicamente aceptables de ello a través de varias rutas. Los ejemplos incluyen la administración oral usando pastillas, cápsulas, gránulos, polvos, jarabes o similares; y la administración parenteral usando inyecciones (intravenosas, intramusculares o subcutáneas), gotas, supositorios o similares. Se pueden preparar estas formulaciones de una manera convencional añadiendo a un medicamento portadores que se utilizan ordinariamente que se conocen en el campo de la técnica de la formulación farmacéutica tal como un excipiente, un aglutinante, un desintegrador, un lubricante, un corrigente, un adyuvante para la solubilización, un agente de suspensión, un agente de recubrimiento y/o similares.
Para la formación de las pastillas, se pueden utilizar varios portadores que se conocen convencionalmente en este campo. Los ejemplos incluyen excipientes tales como la lactosa, la sucrosa, el cloruro de sodio, la glucosa, la urea, el almidón, el carbonato de calcio, el caolín, la celulosa cristalina y el ácido silícico; aglutinantes tales como el agua, el etanol, el propanol, el jarabe simple, la solución de glucosa, la solución de almidón, la solución de gelatina, la carboximetilcelulosa, el shellac, la metilcelulosa, el fosfato de potasio y la polivinipirrolidona; desintegrantes tales como el almidón seco, el alginato de sodio, el polvo de agar, el polvo de laminaran, el bicarbonato de sodio, el carbonato de calcio, el éster del ácido graso del polioxietilensorbitán, el laurilsulfato de sodio, el monoglicérido esteárico, el almidón y la lactosa; supresores de la desintegración tales como la sucrosa, la estearina, la mantequilla de cacao y el aceite hidrogenado; facilitadores de la absorción tales como las sales de amonio cuaternarias y el laurilsulfato de sodio; humectantes tales como la glicerina y el almidón; adsorbentes tales como el almidón, la lactosa, el caolín, la bentonita y el ácido silícico coloidal; y lubricantes tales como el talco purificado, los estearatos, el polvo de ácido bórico y el polietilenglicol. Se pueden formar pastillas como aquéllas que tienen un recubrimiento ordinario según se ha necesitado tal como las pastillas recubiertas de azúcar, las pastillas encapsuladas con gelatina, las pastillas recubiertas entéricas, las pastillas recubiertas en lámina, o las pastillas de doble o múltiple capa.
Para la formulación de las píldoras, se pueden usar varios portadores que se conocen convencionalmente en este campo. Los ejemplos incluyen excipientes tales como la glucosa, la lactosa, la mantequilla de cacao, el almidón, el aceite vegetal endurecido, el caolín y el talco; aglutinantes tales como el polvo de goma arábiga, el polvo de tragacanto, la gelatina y el etanol; y desintegradores tales como el agar de laminaran.
Para la formación de los supositorios, se pueden usar varios portadores que se conocen convencionalmente en este campo. Los ejemplos incluyen el polietilenglicol, la mantequilla de cacao, alcoholes mayores y ésteres de ellos, la gelatina y el glicérido semi-sintético.
Para la formulación como inyecciones, se prefiere que las soluciones o suspensiones estén esterilizadas y se hacen isotónicas con la sangre. Se pueden formar soluciones, emulsiones o suspensiones usando cualquier diluyente que se use convencionalmente en este campo. Los ejemplos incluyen el agua, el etanol, el propilenglicol, el alcohol isostearílico etoxilado, el alcohol isostearílico polietoxilado y los ésteres de polioxietilensorbitan de ácido graso. También es posible incorporar, en una preparación farmacéutica, sal, glucosa o glicerina en una cantidad suficiente para preparar una solución isotónica, o para añadir un adyuvante que se emplea ordinariamente para la solubilización, un tampón, un agente calmante y/o similares.
Si es necesario, se puede incorporar un colorante, un conservante, un sabor, un endulzante u otros medicamentos.
No existe ninguna limitación particular en el contenido del compuesto que se incorpora como ingrediente efectivo en la preparación farmacéutica que se describe arriba. Se puede escoger adecuadamente a partir de un amplio rango. En general, se desea que esté contenido en una cantidad de 1 hasta 70% en peso, preferiblemente de 1 hasta 30% en peso de la composición completa.
No existe ninguna limitación particular en el método de administración de la preparación farmacéutica que se ha descrito arriba y se determina dependiendo de la forma de dosificación o edad, del sexo o de otras condiciones de un paciente para ser administrado o de la seriedad de la enfermedad del paciente. Por ejemplo, se administran oralmente las pastillas, píldoras, soluciones, suspensiones, emulsiones, gránulos o cápsulas. Se administran las inyecciones intravenosamente ya sea separadamente o como una mezcla con un sustitutivo de fluido que se emplea ordinariamente tal como la glucosa o un aminoácido. Si es necesario, se administran por separado intramuscularmente, subcutáneamente, intracutáneamente o intraperitonealmente. Se administra un supositorio rectalmente.
Aunque la dosis de la composición farmacéutica difiere según las condiciones, edad y peso del paciente, la ruta de administración o la forma de dosificación, la dosis diaria oscila normalmente entre 2000 mg (preferiblemente 100 mg) como el límite superior hasta 0,1 mg (preferiblemente 1 mg, más preferiblemente 10 mg) como el límite inferior para adulto. Se puede administrar una vez o en varias porciones al día de acuerdo con las condiciones.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
Se describirá la presente invención más específicamente de ahora en adelante con Ejemplos, Pruebas y Ejemplos de Formulación. Sin embargo se debe tener en mente que no se limita la presente invención a ello o por ello.
Ejemplo 43 Cultivo de la Cepa SANK60196 de Streptomyces griseus (FERM BP-5420)
Se inocularon asépticamente cuatro loopfuls (medida estándar contenida en un bucle de cuatro milímetros) de la Cepa SANK60196 en cada uno de cuatro matraces Erlenmeyer de 2 l (matraces de sembrado), conteniendo cada uno 500 ml del medio de cultivo de semillas que se describe abajo, seguido de la agitación en un agitador rotatorio a 23ºC y 210 rpm, y se llevo a cabo así el cultivo de semillas durante 3 días.
Medio para el cultivo de semillas: contiene los siguientes componentes en 1000 ml de agua del grifo:
\vskip1.000000\baselineskip
Maltosa 30 g
Extracto de carne 5 g
Cloruro de sodio 5 g
Carbonato de calcio 3 g
Antiespumante "CB442" (Producto de NOF Corporation) 50 mg 
\vskip1.000000\baselineskip
Después del ajuste del pH hasta 7,4, se llevó a cabo la esterilización a 121ºC durante 30 minutos.
Se llevó a cabo el cultivo tal como se describe abajo. Descrito específicamente, se inoculó el cultivo de semillas al 3% (volumen/volumen: que se abreviará a partir de ahora como "v/v") en dos fermentadores de jarra de 30 l, conteniendo cada uno 15 l de un medio de cultivo. Seis horas después del inicio del cultivo a 23ºC, se añadió hidrocloruro de S-(2-aminoetil)-L-cisteína filtrado-esterilizado para proporcionar una concentración final de 10 mM, seguido del cultivo con ventilación y agitación durante 6 días.
\newpage
Medio para el cultivo: contiene los siguientes componentes en 1000 ml de agua del grifo:
Maltosa 30 g
Extracto de levadura (producto de Difco Laboratories) 5 g
Extracto de carne 5 g
Polipeptona 5 g
Cloruro de sodio 5 g
Carboonato de calcio 3 g
Antiespumante "CB442" (Producto de NOF Corporation) 50 mg
Después del ajuste del pH hasta 7,4, se llevó a cabo la esterilización a 125ºC durante 30 minutos.
Ejemplo 44 Purificación del Compuesto A-500359E
Se filtró el caldo de cultivo (30 l) que se obtuvo en el Ejemplo 43 con la ayuda de "Celite 545" (producto de Celite Corporation).
Durante la purificación tal como se describe después, se monitorizó la fracción activa por HPLC usando las condiciones de columna y analíticas que se describen abajo.
Columna: "Senshu Pak ODS-H-2151" 6\phi x 150 mm (producto de Senshu Scientific Co., Ltd.).
Disolvente: ácido trifluoroacético acuoso al 0,04% que contiene un 4% de acetonitrilo.
Velocidad de flujo: 1,0 ml/min.
Detección: UV 210 nm.
Tiempo de retención: 21,2 minutos.
Se cargaron 30 l del filtrado resultante en una columna (6 l) empaquetada con "Diaion HP-20" (producto de Mitsubishi Chemical). Después de lavar la columna con 12 l de agua desionizada, se combinaron la fracción no adsorbida y la fracción de lavado (se llamará a partir de ahora la fracción combinada "fracción de lavado no adsorbida"). Se eluyó la sustancia adsorbida con 12 l de acetona acuosa al 10%. Se concentró el eluato para eliminar la acetona y se liofilizó, por lo cual se obtuvieron 39 g de un producto polvoriento crudo.
Se disolvió el producto polvoriento crudo resultante en 200 ml de agua desionizada y se cargó en una columna (2 l) empaquetada con "Diaion CHP-20P" (producto de Mitsubishi Chemical). Se lavó entonces la columna con 4 l de agua desionizada y 4 l de metanol acuoso al 10%, mientras que se eluyó la sustancia adsorbida con 4 l de metanol acuoso al 15% y 4 l de metanol acuoso al 20%. Se combinó una porción de eluato de metanol acuoso al 15% de 2 hasta 4 l y el metanol acuoso al 20%, seguido de concentración. Después de la eliminación del metanol por destilación, se liofilizó el residuo hasta proporcionar 8,9 g de un polvo.
Se disolvió el polvo resultante en 200 ml de agua desionizada y se cargó la solución resultante en una columna (1 l) empaquetada con "Toyopearl HW40F" (producto de TOSOH Corporation), seguido del desarrollo de la columna con agua desionizada. Como resultado del fraccionamiento del eluato en porciones de 100 ml cada una, se eluyó la sustancia activa que tenía un tiempo de retención de 21,2 minutos en el HPLC que se describió arriba en las Fracciones Núm. 5 hasta 10. Se concentraron las fracciones resultantes y se liofilizaron para proporcionar 2,7 g de un
polvo.
Se disolvió el polvo resultante en 200 ml de agua desionizada y se cargó en una columna de HPLC ("YMC-Pack ODS-1050-20-SR": 100\phi x 500 mm; producto de YMC) equilibrada con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04% que contenía un 4% de acetonitrilo. Se desarrolló la columna a una velocidad de flujo de 208 ml/min con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04% que contenía un 4% de acetonitrilo. Se eluyó la sustancia activa en las Fracciones Núm. 6 y 7, como resultado del fraccionamiento del eluato en porciones de 1 l cada una.
Se combinaron estas fracciones, seguido de la concentración hasta 200 ml por "Evapor" (producto de Okawara Seisakujo) y liofilización, por medio de lo que se obtuvieron 99 mg de un polvo. Se suspendió el polvo resultante en 5 ml de agua destilada y se separó por filtración la materia insoluble. Se concentró el filtrado hasta 2 ml mediante un evaporador giratorio, seguido de liofilización, por medio de lo que se obtuvieron 87 mg del Compuesto A-500359E como un producto puro.
\newpage
El compuesto A-500359E tiene las siguientes propiedades físico-químicas:
1) Apariencia de la sustancia: polvo blanco.
2) Solubilidad: soluble en agua, ligeramente soluble en metanol, insoluble en hexano normal y cloroformo.
3) Fórmula molecular: C_{18}H_{23}N_{3}O_{12}.
4) Peso molecular: 473 (tal como se midió por espectrometría de masas FAB).
5) La masa exacta, [M+H]^{+}, tal como se midió por espectrometría de masas FAB de alta resolución es tal como sigue:
Hallado: 474,1349.
Calculado: 474,1359.
6) Espectro de absorción ultravioleta: el espectro de absorción ultravioleta medido en agua exhibe el siguiente máximo de absorción:
251 nm (\varepsilon 10.000).
7) Rotación óptica: la rotación óptica medida en agua exhibe el siguiente valor:
[\alpha]_{D}^{20}: +115º (c 0,28).
8) Espectro de absorción infrarroja: el espectro de absorción infrarroja tal como se midió por el método del disco de bromuro de potasio (KBr) exhibe los siguientes máximos de absorción:
3410, 2955, 1683, 1464, 1441, 1396, 1309, 1267, 1206, 1138, 1115, 1088, 1062, 1023 cm^{-1}.
9) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H en dimetilsulfóxido deuterado con tetrametilsilano como una sustancia estándar interno. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H es tal como sigue:
3,24 (3H, s), 3,52 (1H, dd, J = 4,5; 6,1 Hz), 3,72 (3H, s), 3,98 (1H, m), 4,10 (1H, m), 4,25 (1H, m), 4,29 (1H, d, J = 2,0 Hz), 4,33 (1H, dd, J = 2,0; 6,1 Hz), 5,05 (1H, d, J = 3,9 Hz), 5,16 (1H, d, J = 6,8 Hz), 5,45 (1H, d, J = 4,2 Hz), 5,54 (1H, d, J = 5,9 Hz), 5,61 (1H, d, J = 3,3 Hz), 5,61 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,93 (1H, dd, J = 1,3; 2,9 Hz), 7,56 (1H, señal ancha), 7,69 (1H, señal ancha), 7,74 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.
10) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C en dimetilsulfóxido deuterado con tetrametilsilano como una sustancia estándar interno. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C es tal como sigue:
52,0 (q); 57,3 (q); 61,5 (d); 64,9 (d); 72,1 (d); 75,4 (d); 78,2 (d); 81,3 (d); 89,0 (d); 99,2 (d); 101,2 (d); 114,2 (d); 139,2 (s); 139,8 (d); 150,3 (s); 161,8 (s); 163,1 (s); 170,1 (s) ppm.
11) Análisis por cromatografía líquida de alta resolución (que se abreviará de aquí en adelante como "HPLC"):
Columna: "Senshu Pak ODS-H-2151"
6\phi x 150 mm (producto de Senshu Scientific Co., Ltd.).
Disolvente: ácido trifluoroacético acuoso al 0,04% que contiene un 4% de acetonitrilo.
Velocidad de flujo: 1,0 ml/min.
Detección: UV 210 nm.
Tiempo de retención: 21 minutos.
Ejemplo 45 Purificación de los Compuestos A-500359F y A-500359H
En la purificación que se describe abajo, se monitorizó la fracción activa por HPLC usando las siguientes condiciones de columna y analíticas.
Columna: "Senshu Pak ODS-H-2151" 6\phi x 150 mm (producto de Senshu Scientific Co., Ltd.).
Disolvente: ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%.
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min.
Detección: UV 210 nm.
Tiempo de retención: 8 minutos (Compuesto A-500359H)
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18 minutos (Compuesto A-500359F)
Después de que se ajustaron 42 l de la fracción de lavado no adsorbida en el Ejemplo 44 hasta pH 9 con hidróxido de sodio 6N, se cargó esta fracción en una columna (8,5 l) empaquetada con "Diaion PA316" (Cl^{-}) (producto de Mitsubishi Chemical). Se lavó la columna con 27 l de agua desionizada y entonces se eluyó la sustancia adsorbida con 27 l de ácido clorhídrico 0,1N.
Se ajustó el eluato hasta pH 7 con hidróxido de sodio 6N y se cargó entonces en una columna de carbono activado (2 l). Se lavó la columna con 8 l de agua desionizada y se eluyó entonces la sustancia activa con 8 l de amoníaco acuoso al 0,5N que contenía un 10% de acetona. La concentración y la liofilización del eluato resultante proporcionó 28 g de un polvo.
Se disolvió el polvo resultante en 400 ml de agua destilada. Después del ajuste hasta pH 3,0, se cargó la solución resultante en una columna (2 l) que se había ajustado con agua y se había empaquetado con "Diaion CHP-20P" (producto de Mitsubishi Chemical). Se recogieron el líquido no adsorbido y las fracciones de lavado, se concentraron y se liofilizaron, por medio de lo cual se obtuvieron 12 g de una sustancia viscosa.
Se disolvió la sustancia viscosa en 200 ml de agua destilada. Después del ajuste hasta pH 3,3 con ácido trifluoroacético, se cargó entonces la solución resultante en una columna (1 l) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04% y se empaquetó con "Diaion CHP-20P" (producto de "Mitsubishi Chemical"). Después del desarrollo de la columna con 2 l de ácido trifluoroacético acuoso al 0,04% y la concentración de la fracción (Fracción H) que se eluyó entre 0,8 y 1,4 l, se cambió la solución eluyente a 2 l de agua destilada. La concentración y la liofilización de 2 l de la fracción (Fracción F) que se eluyó con agua destilada proporcionó 605 mg de un
polvo.
Se diluyeron 600 ml de la Fracción H con agua destilada hasta 1 l y se ajustó su pH hasta 2,8 con ácido trifluoroacético, y entonces se cargó de nuevo la solución resultante en una columna (1 l) que se empaquetó con "Diaion CHP-20P" (producto de Mitsubishi Chemical) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%. Se eluyó la columna con 2,2 l de ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%. Se concentraron las fracciones de la 8 hasta la 11 que se obtuvieron por fraccionamiento del eluato en porciones de 200 ml cada una y se liofilizaron, por medio de lo cual se obtuvieron 233 mg de un polvo.
Se disolvió una porción de 100 mg del polvo resultante en 5 ml de agua y se cargaron porciones de 1 ml de la solución resultante en una columna de HPLC ("Senshu Pak ODS-H-5251": 20\phi x 250 mm; producto de Senshu Scientific) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%. Se desarrolló la columna a una velocidad de flujo de 10 ml/min. Se detectó la absorción ultravioleta de la fracción activa a 210 nm y se recogió un pico que se eluyó durante un tiempo de retención de 14 hasta 16 minutos, llevándose a cabo el proceso 5 veces. Se concentraron las fracciones que se obtuvieron así mediante un evaporador giratorio, seguido de liofilización, por medio de lo cual se obtuvieron 23 mg del Compuesto A-500359H como un producto puro.
Se disolvieron 605 mg de polvo liofilizado de la Fracción F en 15 ml de agua y se cargaron porciones de 1 ml de la solución resultante en una columna de HPLC ("Senshu Pak ODS-H-5251": 20\phi x 250 mm; producto de Senshu Scientific) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%. Se desarrolló la columna a una velocidad de flujo de 10 ml/min. Se detectó la absorción de la fracción activa en la porción ultravioleta de 210 nm y se recogió un pico que se eluyó durante un tiempo de retención de 29 hasta 31 minutos 15 veces por fraccionamiento. Se concentraron las fracciones que se obtuvieron así mediante un evaporador giratorio, seguido de liofilización, por medio de lo cual se obtuvieron 134 mg del Compuesto A-500359F como un producto puro.
El compuesto A-500359F tiene las siguientes propiedades físico-químicas:
1) Apariencia de la sustancia: polvo blanco.
2) Solubilidad: soluble en agua, ligeramente soluble en metanol, insoluble en hexano normal y cloroformo.
3) Fórmula molecular: C_{17}H_{21}N_{3}O_{12}.
4) Peso molecular: 459 (tal como se midió por espectrometría de masas FAB).
\newpage
5) La masa exacta, [M+H]^{+}, tal como se midió por espectrometría de masas FAB de alta resolución es tal como sigue:
Hallado: 460,1201.
Calculado: 460,1203.
6) Espectro de absorción ultravioleta: el espectro de absorción ultravioleta medido en agua exhibe el siguiente máximo de absorción:
262 nm (\varepsilon 7.000).
7) Rotación óptica: la rotación óptica medida en agua exhibe el siguiente valor:
[\alpha]_{D}^{20}: +111º (c 0,41).
8) Espectro de absorción infrarroja: el espectro de absorción infrarroja tal como se midió por el método del disco de bromuro de potasio (KBr) exhibe los siguientes máximos de absorción:
3391, 2941, 1684, 1466, 1400, 1333, 1269, 1205, 1137, 1115, 1062, 1020 cm^{-1}.
9) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H en óxido de deuterio con la señal de agua como 4,75 ppm. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H es tal como sigue:
3,37 (3H, s), 3,79 (1H, dd, J = 5,1; 6,4 Hz), 4,17 (1H, ddd, J = 1,6; 3,4; 4,6 Hz), 4,38 (1H, dd, J = 3,5; 5,1 Hz), 4,48 (1H, dd, J = 2,4; 6,4 Hz), 4,49 (1H, ddd, J = 0,6; 2,7; 4,6 Hz), 4,69 (1H, d, J = 2,4 Hz), 5,32 (1H, dd, J = 0,6; 3,4 Hz), 5,77 (1H, d, J = 3,5 Hz), 5,90 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,11 (1H, dd, J = 1,6; 2,7 Hz), 7,75 (1H, d, J = 8,1 Hz), ppm.
10) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C en óxido de deuterio con 1,4-dioxano (67,4 ppm) como una sustancia estándar interno. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C es tal como sigue:
58,6 (c); 62,7 (d); 65,5 (d); 72,7 (d); 76,3 (d); 78,8 (d); 91,2 (d); 100,0 (d); 102,7 (d); 114,8 (d); 140,7 (s); 141,9 (d); 152,1 (s); 165,4 (s); 167,0 (s); 173,9 (s) ppm.
11) Análisis por HPLC:
Columna: "Senshu Pak ODS-H-2151"
6\phi x 150 mm (producto de Senshu Scientific Co., Ltd.).
Disolvente: ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%.
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min.
Detección: UV 210 nm.
Tiempo de retención: 18 minutos.
El compuesto A-500359H tiene las siguientes propiedades físico-químicas:
1) Apariencia de la sustancia: polvo blanco.
2) Solubilidad: soluble en agua, ligeramente soluble en metanol, insoluble en hexano normal y cloroformo.
3) Fórmula molecular: C_{16}H_{19}N_{3}O_{12}.
4) Peso molecular: 445.
5) La masa exacta, [M+H]^{+}, tal como se midió por espectrometría de masas FAB de alta resolución es tal como sigue:
Hallado: 446,1025.
Calculado: 446,1047.
\newpage
6) Espectro de absorción ultravioleta: el espectro de absorción ultravioleta medido en agua exhibe el siguiente máximo de absorción:
262 nm (\varepsilon 7.400).
7) Rotación óptica: la rotación óptica medida en agua exhibe el siguiente valor:
[\alpha]_{D}^{20}: +115º (c 0,33).
8) Espectro de absorción infrarroja: el espectro de absorción infrarroja tal como se midió por el método del disco de bromuro de potasio (KBr) exhibe los siguientes máximos de absorción:
3361, 2934, 1683, 1467, 1403, 1336, 1270, 1206, 1114, 1090, 1058, 1021 cm^{-1}.
9) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H en óxido de deuterio con la señal de agua como 4,75 ppm. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H es tal como sigue:
4,13 (triplete ancho, J = 5,4 Hz), 4,15-4,19 (2H), 4,43 (1H, dd, J = 2,5; 5,8 Hz), 4,48 (1H, dd, J = 2,9; 4,7 Hz), 4,72 (1H, d, J = 2,5 Hz), 5,31 (1H, d, J = 4,0 Hz), 5,80 (1H, d, J = 4,0 Hz), 5,89 (1H, d, J = 8,3 Hz), 6,12 (1H, dd, J = 1,4; 2,9 Hz), 7,75 (1H, d, J = 8,3 Hz) ppm.
10) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C en óxido de deuterio con 1,4-dioxano (67,4 ppm) como una sustancia estándar interno. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C es tal como sigue:
62,8 (d); 65,8 (d); 70,3 (d); 74,6 (d); 77,0 (d); 84,2 (d); 90,3 (d); 100,3 (d); 102,9 (d); 113,9 (d); 141,2 (s); 141,9 (d); 152,2 (s); 165,9 (s); 167,0 (s); 174,2 (s) ppm.
11) Análisis por HPLC:
Columna: "Senshu Pak ODS-H-2151"
6\phi x 150 mm (producto de Senshu Scientific Co., Ltd.).
Disolvente: ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%.
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min.
Detección: UV 210 nm.
Tiempo de retención: 8 minutos.
Ejemplo 46 Cultivo de la Cepa SANK 60196 (FERM BP-5420) de Streptomyces griseus
Se inocularon asépticamente cuatro loopfuls de la Cepa SANK60196 en cada uno de tres Matraces Erlenmeyer de 2 l, que contenían cada uno 500 ml del medio de cultivo de sembrado que tenía la composición que se describe abajo. Se agitaron los matraces en un agitador rotatorio a 23ºC y a 210 rpm y así, se llevó a cabo el cultivo de sembrado inicial durante 3 días.
El medio de cultivo de sembrado contiene los siguientes componentes en 1000 ml de agua del grifo:
Glucosa 20 g
Almidón soluble 10 g
Levadura prensada 9 g
Extracto de carne 5 g
Polipeptona 5 g
Cloruro de sodio 5 g
Carbonato de calcio 3 g
Antiespumante "CB442" (Producto de NOF Corporation) 50 mg
Después del ajuste del pH hasta 7,4, se llevó a cabo la esterilización a 121ºC durante 20 minutos.
Se inoculó el primer cultivo de sembrado que se obtuvo así al 3% en un tanque de 60 l que contenía 30 l del mismo medio de precultivo, y se llevó a cabo el segundo cultivo de sembrado con ventilación y agitación a 23ºC durante 24 horas.
Se llevó a cabo el cultivo tal como se describe abajo. Descrito específicamente, se inoculó el segundo caldo de cultivo de sembrado al 3% (v/v) en dos tanques de 600 l, que contenían cada uno 400 l del medio de cultivo que se describe abajo y entonces se llevó a cabo el cultivo con ventilación y agitación a 23ºC durante 6 días.
El medio para el cultivo: contiene los siguientes componentes en 1000 ml de agua del grifo.
Glucosa 20 g
Almidón soluble 10 g
Levadura prensada 9 g
Extracto de carne 5 g
Polipeptona 5 g
Cloruro de sodio 5 g
Carbonato de calcio 3 g
Antiespumante "CB442" (Producto de NOF Corporation) 50 mg
Después del ajuste del pH hasta 7,4, se añadieron 3 g de carbonato de calcio y se esterilizó la mezcla a 125ºC durante 20 minutos.
Ejemplo 47 Purificación del Compuesto A-500359E
Se filtró el caldo de cultivo (810 l) que se obtuvo en el Ejemplo 46 con la ayuda de "Celite 545" (producto de Celite Corporation).
Tras la purificación posterior, se monitorizó la fracción activa por HPLC usando las siguientes condiciones de columna y analíticas.
Columna: "YMC-Pak ODS-A A-312" 6\phi x 150 mm (producto de YMC).
Disolvente: ácido trifluoroacético acuoso al 0,04% que contiene un 4% de acetonitrilo.
Velocidad de flujo: 1,0 ml/min.
Detección: UV 210 nm.
Tiempo de retención: 19,8 minutos.
Se cargó el filtrado resultante (800 l) en una columna (160 l) empaquetada con "Diaion HP-20P" (producto de Mitsubishi Chemical). Se lavó la columna con 640 l de agua desionizada y entonces se combinaron la fracción no adsorbida y la fracción de lavado (fracción de lavado no adsorbida). Se eluyó la sustancia adsorbida con 348 l de acetona acuosa al 10%.
Después de la concentración de la fracción que se eluyó hasta 10 l, se cargó el residuo en una columna (45 l) empaquetada con "Diaion CHP-20P" (producto de Mitsubishi Chemical). Se lavó entonces la columna con 90 l de agua desionizada, 100 l de metanol acuoso al 10% y 100 l de metanol acuoso al 15%. Se eluyó la sustancia adsorbida con 100 l de metanol acuoso al 20%.
Después de la concentración de la fracción del metanol acuoso al 20% hasta 5 l, se cargó el concentrado en una columna (22 l) empaquetada con "Toyopearl HW40F" (producto de TOSOH Corporation). Se desarrolló la columna con agua desionizada y se recogió el eluato por fraccionamiento en porciones de 5 l cada una. Se eluyó la sustancia activa que tenía un tiempo de retención de 19,8 minutos en el HPLC que se ha descrito arriba en las Fracciones Núm. 3 hasta 6. Se concentraron estas fracciones hasta 5,8 l y se liofilizaron para proporcionar 55,8 g de un polvo.
Se disolvió el polvo resultante en 1,2 l de agua desionizada. Se cargó una porción de 200 ml de la solución resultante en una columna de HPLC ("YMC-Pak ODS-1050-20-SR"; 100\phi x 500 mm; producto de YMC) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04% que contenía acetonitrilo al 4%. Se desarrolló la columna a una velocidad de flujo de 200 ml/min con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04% que contenía acetonitrilo al 4%. La sustancia activa tenía un tiempo de retención de 105 hasta 124 minutos. Se repitió esa operación 6 veces. Se combinaron las fracciones que se obtuvieron así, se concentraron hasta 5 l mediante "Evapor" y entonces se liofilizaron, por medio de lo cual se obtuvieron 24,2 g del Compuesto A-500359E como un producto puro.
Ejemplo 48 Purificación de los Compuestos A-500359F y A-500359H
Tras la purificación posterior, se monitorizó la fracción activa por HPLC usando las siguientes condiciones de columna y analíticas.
Columna: "YMC-Pak ODS-A A-312" 6\phi x 150 mm (producto de YMC).
Disolvente: ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%.
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min.
Detección: UV 210 nm.
Tiempo de retención: 7,7 minutos (Compuesto A-500359H).
\hskip3cm
16,6 minutos (Compuesto A-500359F).
Se cargó la fracción de lavado no adsorbida (1370 l) que se obtuvo en el Ejemplo 47 en una columna de carbono activado (65 l). Después de que se lavó la columna con 260 l de agua desionizada, se eluyó la sustancia activa con 270 l de amoníaco acuoso 0,5N que contenía un 10% de acetona. Después de la concentración del eluato hasta 40 l y del ajuste del concentrado hasta pH 2,4 con ácido trifluoroacético, se cargó en una columna (45 l) empaquetada con "Diaion CHP-20P" (producto de Mitsubishi Chemical) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%. Se desarrolló la columna con ácido trifluoroacético al 0,04% para proporcionar una fracción (Fracción H) que se eluyó en 0 hasta 47 l y otra fracción (Fracción F) que se eluyó en 47 hasta 91 l. Se concentró la fracción H hasta 1,5 l, mientras que se obtuvo la fracción F como 287 g de un polvo después de la concentración y la liofilización.
Se diluyó el concentrado de la Fracción H con agua desionizada hasta 3,2 l. Se cargó una porción de 160 ml de ello en una columna de HPLC ("YMC-Pak ODS-1050- 20-SR": 100\phi x 500 mm; producto de YMC) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%, seguido del desarrollo a una velocidad de flujo de 200 ml/min. Se detectó la absorción ultravioleta de la fracción activa a 210 nm y se recogió un pico que se eluyó a un tiempo de retención de 67 hasta 72 minutos por fraccionamiento. Se repitió esta operación 20 veces. Se concentraron las fracciones que se obtuvieron así mediante "Evapor" (producto de Okawara Seisakujo) y se liofilizaron para proporcionar 5,9 g del Compuesto A-500359H como un producto puro.
Se disolvió una porción de 277 g de la Fracción F en forma de polvo en 50 l de agua desionizada y se ajustó la solución resultante hasta pH 2,2 con ácido trifluoroacético. Se cargó la solución de nuevo en una columna (45 l) empaquetada con "Diaion CHP-20P" (producto de Mitsubishi Chemical) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%. Después de lavar la columna con 97 l de ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%, se eluyó la sustancia activa con 120 l de agua desionizada. Se concentró la fracción eluida con agua desionizada y se liofilizó, por medio de lo cual se obtuvieron 75,6 g de la Fracción F como un polvo liofilizado.
Se disolvió el polvo resultante liofilizado de la Fracción F en 4 l de agua. Se cargó una porción de 150 ml de la solución en una columna de HPLC ("YMC-Pak ODS-1050-20-SR", 100\phi x 500 mm; producto de YMC) que se equilibró con una mezcla de acetonitrilo al 0,5% y ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%, seguido del desarrollo con el mismo sistema de disolventes a una velocidad de flujo de 200 ml/min. Se detectó la absorción de la fracción activa en la porción ultravioleta a 210 nm y se recogió un pico que se eluyó a un tiempo de retención de 88 hasta 97 minutos por fraccionamiento. Se repitió esta operación 27 veces. Se concentraron las fracciones que se obtuvieron así y se liofilizaron, por medio de lo cual se obtuvieron 19,2 g del Compuesto A-500359F como un producto
puro.
Ejemplo 49 Proceso de preparación del Compuesto A-500359F y del derivado amida del Compuesto A-500359F (conversión química del Compuesto A-500359E mediante amoníaco acuoso)
Se disolvió el Compuesto A-500359E (75 mg) que se obtuvo en el Ejemplo 44 en 2 ml de amoníaco acuoso 0,5N. Se permitió que la solución resultante se mantuviera a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la realización de la reacción, se liofilizó la mezcla de reacción para proporcionar 78 mg de un polvo.
Se disolvió el polvo resultante en 1 ml de TFA acuoso al 0,04%. Se cargó una porción de 100 \mul de la solución resultante en una columna de HPLC ("Capcellpak UG 120\ring{A}", 20\phi x 250 mm; producto de Shiseido) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%, seguido de la elución con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04% a una velocidad de flujo de 10 ml/min. Se detectó la absorción ultravioleta de la fracción activa a 210 nm y se recogieron los picos que se eluyeron a un tiempo de retención de 21 hasta 22 minutos y a un tiempo de retención de 31 hasta 33 minutos mediante fraccionamiento, llevándose a cabo el proceso 10 veces.
Se concentraron las fracciones que se eluyeron a un tiempo de retención de 21 hasta 22 minutos mediante un evaporador giratorio y se liofilizaron, por medio de lo cual se obtuvieron 14 mg del derivado amida del compuesto A-500359F en forma pura.
Se concentraron las fracciones que se eluyeron a un tiempo de retención de 31 hasta 33 minutos mediante un evaporador giratorio y se liofilizaron, por medio de lo cual se obtuvieron 50 mg del Compuesto A-500359F en forma pura.
El derivado amida del compuesto A-500359F tiene las siguientes propiedades físico-químicas:
1) Apariencia de la sustancia: polvo blanco.
2) Solubilidad: soluble en agua, ligeramente soluble en metanol, insoluble en hexano normal y cloroformo.
3) Fórmula molecular: C_{17}H_{22}N_{4}O_{11}.
4) Peso molecular: 458 (tal como se midió por espectrometría de masas FAB).
5) La masa exacta, [M+H]^{+}, tal como se midió por espectrometría de masas FAB de alta resolución es tal como sigue:
Hallado: 459,1328.
Calculado: 459,1364.
6) Espectro de absorción ultravioleta: el espectro de absorción ultravioleta medido en agua exhibe el siguiente máximo de absorción:
258 nm (\varepsilon 7.500).
7) Rotación óptica: la rotación óptica medida en agua exhibe el siguiente valor:
[\alpha]_{D}^{25}: +119º (c 0,87).
8) Espectro de absorción infrarroja: el espectro de absorción infrarroja tal como se midió por el método del disco de bromuro de potasio (KBr) exhibe los siguientes máximos de absorción:
3339, 2943, 1686, 1598, 1495, 1402, 1337, 1272, 1205, 1136, 1115, 1060, 1019 cm^{-1}.
9) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H en óxido de deuterio con la señal de agua como 4,75 ppm. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H es tal como sigue:
3,30 (3H, s), 3,67 (1H, dd, J = 5,0; 6,8 Hz), 4,17 (1H, ddd, J = 1,8; 2,9; 4,4 Hz), 4,35 (1H, dd, J = 3,2; 5,0 Hz), 4,43 (1H, dd, J = 2,3; 6,8 Hz), 4,45 (1H, dd, J = 2,4; 4,4 Hz), 4,66 (1H, d, J = 2,3 Hz), 5,35 (1H, d, J = 2,9 Hz), 5,71 (1H, d, J = 3,2 Hz), 5,85 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,97 (1H, dd, J = 1,8; 2,4 Hz), 7,71 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.
10) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C en óxido de deuterio con 1,4-dioxano (67,4 ppm) como una sustancia estándar interno. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C es tal como sigue:
58,6 (c); 62,7 (d); 65,3 (d); 72,6 (d); 75,7 (d); 78,7 (d); 82,3 (d); 91,3 (d); 99,8 (d); 102,7 (d); 110,8 (d); 141,9 (d); 142,3 (s); 152,1 (s); 166,0 (s); 167,0 (s) ppm.
11) Análisis por HPLC:
Columna: "Senshu Pak ODS-H-2151", 6\phi x 150 mm (producto de Senshu Scientific Co., Ltd.).
Disolvente: ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%.
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min.
Detección: UV 210 nm.
Tiempo de retención: 11 minutos.
Ejemplo 50 Preparación del Compuesto A-500359F (hidrólisis del Compuesto A-500359E mediante hidróxido de sodio)
Se disolvió el Compuesto A-500359E (4,4 mg) que se obtuvo en el Ejemplo 44 en 0,5 ml de agua destilada. Después de la adición gota a gota de 0,5 ml de hidróxido de sodio acuoso 0,02N, se añadió gota a gota 1 ml de hidróxido de sodio acuoso 0,1N. Se permitió que la mezcla resultante se mantuviera a temperatura ambiente durante 50 minutos. Se neutralizó la mezcla de reacción con ácido clorhídrico 1N y entonces se cargó en 2 ml de una columna de carbono activado. Se lavó la columna con 8 ml de agua destilada y entonces se eluyó la sustancia de reacción con 8 ml de amoníaco acuoso 0,5N que contenía un 10% de acetona.
Después de la concentración del eluato hasta 700 \mul, se cargó el concentrado en una columna de HPLC ("Senshu Pak ODS-H-4251"; 10\phi x 250 mm; producto de Senshu Scientific) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%, seguido de la elución a una velocidad de flujo de 4 ml/min. Se detectó la absorción ultravioleta de la sustancia activa a 210 nm y se recogió un pico que se eluyó a un tiempo de retención de 25 hasta 30 minutos mediante fraccionamiento. Se repitió esta operación tres veces. Se concentraron las fracciones que se obtuvieron así en un evaporador giratorio y se liofilizaron, por medio de lo cual se obtuvieron 2,6 mg del Compuesto A-500359F en forma pura.
Ejemplo 51 Cultivo de la Cepa SANK60196 (FERM BP-5420) de Streptomyces griseus
Se esterilizó un loopful de la Cepa SANK60196 antes de ser inoculado en un matraz Erlenmeyer de 500 ml (matraz de sembrado) que contenía 100 ml de un medio que tenía la composición que se describe abajo. Se llevó a cabo un cultivo de sembrado durante 3 días agitando el matraz en un agitador rotatorio a 23ºC y 210 rpm.
El medio de cultivo de sembrado contiene los siguientes componentes en 1000 ml de agua del grifo:
Maltosa 30 g
Extracto de carne 5 g
Polipeptona 5 g
Cloruro de sodio 5 g
Carbonato de calcio 3 g
Antiespumante "CB442" 50 mg
Después del ajuste hasta pH 7,4, se llevó a cabo la esterilización a 121ºC durante 30 minutos.
Se llevó a cabo el cultivo tal como se describe abajo. Descrito específicamente, se inoculó el cultivo de sembrado al 3% (V/V) en cada uno de diez matraces Erlenmeyer de 500 ml, que contenían cada uno 100 ml de un medio esterilizado que tiene la composición que se describe abajo.
Se llevó a cabo el cultivo durante 11 días agitando los matraces en un agitador rotatorio a 23ºC y 210 rpm.
Medio de cultivo: contiene los siguientes componentes en 1000 ml de agua del grifo:
Glucosa 50 g
Extracto de carne 4 g
Polipeptona 3 g
Leche desnatada 10 g
Licor macerado de maíz 10 g
Cloruro de sodio 5 mg
Antiespumante "CB442" 50 mg
Después del ajuste hasta pH 7,4, se llevó a cabo la esterilización a 125ºC durante 30 minutos.
Ejemplo 52 Purificación del Compuesto A-500359J
Después de la purificación posterior, se monitorizó la fracción activa por HPLC usando las siguientes condiciones de columna y analíticas.
Columna: "Pegasil ODS", 6\phi x 150 mm (producto de Senshu Scientific Co., Ltd.).
Disolvente: ácido trifluoroacético acuoso al 0,04%.
Velocidad de flujo: 1,0 ml/min.
Detección: UV 260 nm.
Tiempo de retención: 5,57 minutos.
Se filtró el caldo de cultivo que se obtuvo en el Ejemplo 51 con la ayuda de "Celite 545" que se añadió al 5% (peso/volumen). Se cargó el filtrado que se obtuvo así (1 l) en una columna (200 ml) de "Diaion HP-20". Entonces se lavó la columna con agua destilada (500 ml). Después del ajuste del pH de 1,5 l de fracción de lavado no adsorbida hasta 9 con hidróxido de sodio 6N, se cargó la fracción en una columna (100 ml) de "Dowex SBR-P (OH^{-})". Se lavó la columna con agua destilada (300 ml) y se eluyó la sustancia adsorbida con 300 ml de ácido clorhídrico acuoso 1N.
Después del ajuste del pH después de la elución hasta 7 con hidróxido de sodio, se cargó el eluato en una columna de carbono activo (50 ml). Se lavó la columna con agua destilada (100 ml) y se diluyó la sustancia activa con acetona acuosa al 60% (200 ml).
La concentración y la liofilización del eluato proporcionaron 558 mg de un polvo.
Se disolvió el polvo en 5 ml de agua destilada y se cargaron porciones de 500 \mul de la solución resultante en una columna de HPLC ("Senshu Pack Pegasil ODS"; 20\phi x 250 mm; producto de Senshu Scientific) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,05%. Se desarrollaron a una velocidad de flujo de 10,0 ml/min. Se detectó la absorción ultravioleta de la sustancia activa a 260 nm y se recogió un pico que se eluyó a un tiempo de retención de 11,1 minutos mediante fraccionamiento, llevándose a cabo el proceso 10 veces. Se concentraron las fracciones resultantes mediante un evaporador giratorio y entonces se liofilizaron, por medio de lo cual se obtuvieron 16,2 mg de la Sustancia A-500359J en forma pura.
El compuesto A-500359J tiene las siguientes propiedades físico-químicas:
1) Apariencia de la sustancia: polvo blanco.
2) Solubilidad: soluble en agua, ligeramente soluble en metanol, insoluble en hexano normal y cloroformo.
3) Fórmula molecular: C_{16}H_{21}N_{3}O_{13}.
4) Peso molecular: 463 (tal como se midió por espectrometría de masas FAB).
5) La masa exacta, [M+H]^{+}, tal como se midió por espectrometría de masas FAB de alta resolución es tal como sigue:
Hallado: 462,0996.
Calculado: 462,1006.
6) Espectro de absorción ultravioleta: el espectro de absorción ultravioleta medido en agua exhibe los siguientes máximos de absorción:
194 (\varepsilon 8.800), 262 (\varepsilon 10.000) nm.
7) Rotación óptica: la rotación óptica medida en agua exhibe el siguiente valor:
[\alpha]_{D}^{28}: +83º (c 0,1; H_{2}O).
8) Espectro de absorción infrarroja: el espectro de absorción infrarroja tal como se midió por el método del disco de bromuro de potasio (KBr) exhibe los siguientes máximos de absorción:
3372, 2931, 1684, 1467, 1407, 1273, 1204, 1107, 1058 cm^{-1}.
9) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H en óxido de deuterio con 1,4-dioxano (3,53 ppm) como una sustancia estándar interno. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H es tal como sigue:
3,75 (1H, t, J = 3,4 Hz), 3,83 (1H, ddd, J = 1,4; 1,9; 3,4 Hz), 4,02 (1H, ddd, J = 1,4; 1,7; 3,4 Hz), 4,05 (1H, dd, J = 5,3; 5,6 Hz), 4,11 (1H, t, J = 5,6 Hz), 4,13 (1H, dd, J =3,1; 5,6 Hz), 4,30 (1H, d, J = 5,3 Hz), 4,33 (1H, d, J = 1,7 Hz), 4,90 (1H, d, J = 1,9 Hz), 5,50 (1H, d, J =3,1 Hz), 5,7 (1H,d, J = 8,2 Hz), 7,6 (1H, d, J = 8,2 Hz) ppm.
\newpage
10) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C en óxido de deuterio con 1,4-dioxano (67,4 ppm) como una sustancia estándar interno. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C es tal como sigue:
64,4 (d); 68,8 (d); 68,9 (d); 69,7 (d); 71,4 (d); 73,0 (d); 75,4 (d); 82,8 (d); 90,7 (d); 99,2 (d); 101,7 (d); 141,6 (d); 151,0 (s); 165,9 (s); 171,9 (s); 172,6 (s) ppm.
11) Análisis por HPLC:
Columna: "Senshu Pak ODS-H-2151", 6\phi x 150 mm (producto de Senshu Scientific Co., Ltd.).
Disolvente: ácido trifluoroacético acuoso al 0,05%.
Velocidad de flujo: 1,0 ml/min.
Detección: UV 260 nm.
Tiempo de retención: 5,57 minutos.
Ejemplo 53 Cultivo de la Cepa SANK60196 (FERM BP-5420) de Streptomyces griseus
Se esterilizó un loopful de la Cepa SANK60196 antes de la inoculación en un matraz Erlenmeyer (matraz de sembrado) de 500 ml que contiene 100 ml de un medio que tenga la composición que se describe abajo. Se llevó a cabo el precultivo durante 3 días agitando el matraz en un agitador rotatorio a 23ºC y 210 rpm.
Medio para el precultivo: contiene los siguientes componentes en 1000 ml de agua del grifo.
Maltosa 30 g
Extracto de carne 5 g
Polipeptona 5 g
Cloruro de sodio 5 g
Carbonato de calcio 3 g
Antiespumante "CB442" 50 mg
Después del ajuste hasta pH 7,4, se llevó a cabo la esterilización a 121ºC durante 30 minutos.
Se llevó a cabo el cultivo tal como se describe abajo. Descrito específicamente, se inoculó el caldo de precultivo al 3% (V/V) en cada uno de diez matraces Erlenmeyer de 500 ml, que contenían cada uno 100 ml de un medio esterilizado que tiene la composición que se describe abajo. Se llevó a cabo el cultivo agitando los matraces en un agitador rotatorio a 23ºC y 210 rpm. Seis horas después de la iniciación del cultivo, se añadió el hidrocloruro de S-(2-aminoetil)-L-cisteína filtrado-esterilizado y la L-alilglicina para proporcionar una concentración final de 10 mM. Entonces se continuó el cultivo durante 7 días.
Medio de cultivo: contiene los siguientes componentes en 1000 ml de agua del grifo.
Maltosa 30 g
Extracto de levadura (producto de Difco Laboratories) 5 g
Extracto de carne 5 g
Polipeptona 5 g
Cloruro de sodio 5 g
Carbonato de calcio 3 g
Antiespumante "CB442" 50 mg
Después del ajuste hasta pH 7,4, se llevó a cabo la esterilización a 125ºC durante 30 minutos.
Ejemplo 54 Purificación de la Sustancia A-500359M-3
Se centrifugó el caldo de cultivo (1 l) que se obtuvo en el Ejemplo 53 a 3000 rpm durante 20 minutos y se purificó el sobrenadante resultante.
\newpage
Después de la purificación posterior, se monitorizó la fracción activa por HPLC usando las siguientes condiciones de columna y analíticas.
Columna: "Pegasil ODS" 6\phi x 150 mm (producto de Senshu Scientific).
Disolvente: 7,2% de acetonitrilo - ácido trifluoroacético acuoso al 0,05%.
Velocidad de flujo: 1,0 ml/min.
Detección: UV 260 nm.
Tiempo de retención: 10,1 minutos.
Después del ajuste del sobrenadante hasta pH 3 con ácido trifluoroacético, se cargó la solución resultante (1 l) en una columna "Diaion HP-20" (200 ml) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,05%. Se lavó la columna con ácido trifluoroacético acuoso al 0,05% (500 ml), seguido de la elución con agua destilada (500 ml). Se concentró el eluato de agua destilada (500 ml) que se obtuvo así y se liofilizó para proporcionar 230 mg de un producto polvoriento crudo.
Se disolvió el producto polvoriento crudo en 2 ml de agua destilada y se cargó una porción de 500 \mul de la solución resultante en una columna de HPLC ("Pegasil ODS", nombre comercial; 20\phi x 250 mm; producto de Senshu Scientific) que se equilibró con ácido trifluoroacético acuoso al 0,05% que contenía un 7% de acetonitrilo.
Se desarrolló la columna con el mismo disolvente a una velocidad de flujo de 10,0 ml/min y se monitorizó la absorción ultravioleta a 210 nm, resultando en la elución de la sustancia activa a un tiempo de retención de 28,0 minutos. Se repitió esta operación cuatro veces y se combinaron los eluatos, se concentraron y se liofilizaron, por medio de lo cual se obtuvieron 11,1 mg de la Sustancia A- 500359M-3 en forma pura.
El compuesto A-500359M-3 tiene las siguientes propiedades físico-químicas:
1) Apariencia de la sustancia: polvo blanco.
2) Solubilidad: soluble en agua y metanol, insoluble en hexano normal y cloroformo.
3) Fórmula molecular: C_{22}H_{28}N_{4}O_{13}.
4) Peso molecular: 556 (tal como se midió por espectrometría de masas FAB).
5) La masa exacta, [M+H]^{+}, tal como se midió por espectrometría de masas FAB de alta resolución es tal como sigue:
Hallado: 557,1754.
Calculado: 557,1731.
6) Espectro de absorción ultravioleta: el espectro de absorción ultravioleta medido en agua exhibe el siguiente máximo de absorción:
236 nm (\varepsilon 10.000).
7) Rotación óptica: la rotación óptica medida en agua exhibe el siguiente valor:
[\alpha]_{D}^{26}: +92º (c 0,1; H_{2}O).
8) Espectro de absorción infrarroja: el espectro de absorción infrarroja tal como se midió por el método del disco de bromuro de potasio (KBr) exhibe los siguientes máximos de absorción:
3407, 2938, 1684, 1524, 1465, 1399, 1385, 1335, 1268, 1205, 1139, 1118, 1095, 1063, 1021 cm^{-1}.
9) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H en óxido de deuterio con 1,4-dioxano (3,53 ppm) como una sustancia estándar interno. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{1}H es tal como sigue:
2,44 (1H, ddd, J = 4,3; 7,3; 13,3 Hz), 2,52 (1H, ddd, J = 4,3; 7,5; 13,3 Hz); 3,27 (3H, s), 3,66 (1H, t, J = 5,5 Hz), 4,17 (1H, ddd, J = 1,1; 2,5; 3,1 Hz), 4,32 (1H, dd, J = 3,7; 5,5 Hz), 4,33 (1H, t, J = 4,3 Hz), 4,45 (1H, m), 4,46 (1H, m), 4,73 (1H solapado con HDO), 5,07 (1H, d, J = 10,2 Hz), 5,36 (1H, d, J = 3,1 Hz), 5,51 (1H, d, J = 17,1 Hz), 5,58 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,73 (1H, m), 5,74 (1H, d, J = 3,7 Hz), 5,95 (1H, dd, J = 1,1; 1,9 Hz), 7,72 (1H, d, J = 8,1 Hz) ppm.
10) Se midió el espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C en óxido de deuterio con 1,4-dioxano (67,4 ppm) como una sustancia estándar interno. El espectro de resonancia magnética nuclear de ^{13}C es tal como sigue:
37,1 (t); 55,4 (d); 58,6 (c); 62,6 (d); 65,3 (d); 72,6 (d); 75,7 (d); 78,9 (d); 82,4(d); 90,6 (d); 99,8(d); 102,6 (d); 109,9 (d); 119,0 (t); 134,0 (d); 141,7 (d); 142,2 (s); 152,0 (s); 162,3 (s); 166,8 (s); 173,6 (s); 177,6 (s) ppm.
11) Análisis por HPLC:
Columna: "Pegasil ODS", 6\phi x 150 mm (producto de Senshu Scientific Co., Ltd.).
Disolvente: 7,2% de acetonitrilo - ácido trifluoroacético acuoso al 0,05%.
Velocidad de flujo: 1,0 ml/min.
Detección: UV 260 nm.
Tiempo de retención: 10,1 minutos.
Prueba 1
Actividad antibacteriana Ensayo de Disco
Se llevó a cabo dicho ensayo de Disco ("Experimental Agricultural Chemistry", editado por Agricultural Chemistry Class/Agriculture Dept./Tokyo Univ., 3ª edición, Volumen II, publicado por Asakura Shoten en 1978) usando 40 \mug de una sustancia de prueba por disco de papel de 8 mm. El Compuesto A-500359E exhibió un círculo inhibitorio de 12 mm de diámetro frente a Mycobacterium smegmatis SANK 75075, el derivado amida del Compuesto A-500359F exhibió un círculo inhibitorio de 12 mm de diámetro y el Compuesto A-500359M-3 también exhibió un círculo inhibitorio de 12 mm de diámetro.
Ejemplo de Preparación
Se obtuvo cada cápsula mezclando 100 mg del Compuesto A-500359E, del Compuesto A-500359F, del derivado amida del Compuesto A-500359F, del Compuesto A-500359H, del Compuesto A-500359J o del Compuesto A-500359M-3, 100 mg de lactosa respectivamente, 148,8 mg de almidón de maíz y 1,2 mg de estearato de magnesio (totalmente, 350 mg) en la forma polvorienta, tamizando la mezcla resultante a través de un tamiz de 60 de malla y cargando el polvo en una cápsula de gelatina.
Los resultados que se describen abajo muestran que los compuestos de la invención que representan las fórmulas (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV) y (XVI) respectivamente, y las sales farmacéuticamente aceptables de ello exhiben actividades antibacterianas excelentes frente a varias bacterias incluyendo la Mycobacteria de modo que son útiles en la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por tal bacteria. El Streptomyces griseus SANK60196 (FERM BP-5420) es útil como una bacteria que produce el compuesto representado por la fórmula (XI), (XII), (XIV), (XV) o (XVI). Los compuestos de la invención representados por las fórmulas (XI), (XIII), (XIV), (XV) o (XVI) también son útiles como material de partida para la síntesis de un derivado para la preparación de una prevención o el tratamiento de varias enfermedades infecciosas por conversión química o microbiológica orgánica.

Claims (7)

1. Un compuesto que se selecciona a partir del grupo que consiste en:
(i) El Compuesto A-500359E representado por la fórmula (XI) siguiente:
2
o una sal o solvato del mismo;
(ii) El Compuesto A-500359F representado por la fórmula (XII) siguiente:
3
o una sal o solvato del mismo;
(iii) Un derivado amida del Compuesto A-500359F representado por la fórmula (XIII) siguiente:
4
o una sal o solvato del mismo;
(iv) Un compuesto A-500359H representado por la fórmula (XIV) siguiente:
5
o una sal o solvato del mismo;
\newpage
(v) El Compuesto A-500359J representado por la fórmula (XV) siguiente:
6
o una sal o solvato del mismo; y
(vi) Un compuesto A-500359M-3 representado por la fórmula (XVI) siguiente:
7
o una sal o solvato del mismo;
2. Un proceso para preparar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1(i), (ii), (iv) o (v) mediante un procedimiento de cultivo que comprende cultivar una cadena de microorganismo del género Streptomyces, y aislar el compuesto de los productos de cultivo.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2 donde la cadena de microorganismo es Streptomyces griseus (SANK 60196; FERM BP-5420).
4. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un compuesto farmacológicamente activo junto con un portador o un diluyente para eso, donde dicho compuesto farmacológicamente activo es un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
5. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquier reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección bacteriana.
6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso como medicamento.
7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el tratamiento o la prevención de una infección bacteriana.
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