KR20010101443A

KR20010101443A - 신규 뎁시펩티드 화합물

Info

Publication number: KR20010101443A
Application number: KR1020017008693A
Authority: KR
Inventors: 코지 나가이; 나까꼬 아라오; 가즈마 가미기리; 긴야 소다; 마사미찌 모리; 노부아끼 신도; 하루오 세또; 가즈오 신야
Original assignee: 오노다 마사요시; 야마노우치세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 1999-01-13
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2001-11-14
Also published as: US20040082054A1; CN1335852A; CA2356845C; PT1142905E; DK1142905T3; US7098024B2; ATE331730T1; KR100611265B1; JP3554707B2; EP1142905A4; CA2356845A1; EP1142905B1; CN1173990C; EP1142905A1; DE60029084T2; AU2002700A; WO2000042062A1; ES2265906T3; DE60029084D1; US6670326B1

Abstract

인간 암세포에 대한 세포 독성 활성 및 TGF-β 유사 작용을 가지며, 항종양제로서 유용한 신규 화합물 또는 그를 함유하는 의약 조성물을 제공한다.

Description

신규 뎁시펩티드 화합물 {Novel Depsipeptide Compound}

미생물 대사 산물 유래의 화합물인 마이토마이신 C, 프레오마이신, 또는 아드리아마이신 등이 인간 암세포에 대하여 세포 독성 활성을 나타낸다는 것이 알려져 있고, 이들 화합물은 종래 종양제로서 임상에서 사용되고 있다. 또한, 뎁시펩티드 화합물이 항종양 물질로서 개시되고 있다 (유럽 특허 공개 공보 제352646호).

현재에 있어서도 종래에 없는 화학 구조, 즉 신규 골격을 갖는 항종양제의 개발이 검토되고 있다.

한편, TGF-β는 세포의 증식을 촉진하고 또한 형질 전환을 촉진하는 인자로서 주목되어, 그 기능을 밝히기 위한 연구가 시작되었지만, TGF-β는 현재 각종 동물 세포의 생육 저해 화합물로서 작용하는 것으로 밝혀졌다 (Cell, 제63권 245-247면, 1990년). 또한, 종양 세포와의 관련에 대해서도 다수 보고되고 있다 (Br. Med. J., 제296권, 1621-1624면, 1988년; Br. J. Cancer, 제61권, 612-617면, 1990년; Br. J Cancer, 제69권 1006-1009면, 1994년; J. Cell Physiol., 제172권, 1-11면, 1997년; Growth-Factors., 제7권, 207-213면, 1992년; J. Biol. Chem., 제272권, 3967-3972면, 1997년; Nature, 360권, 361-364면, 1992년). 또한, TGF-β 수용체는, 여러가지 종양에 있어서 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene)로서 작용한다고 보고되고 있다 (International J. Hematology, 제65권, 97-104면, 1997년). 따라서, TGF-β 유사 작용을 갖는 화합물은 해당 작용에 관련된 질환의 치료제, 예를 들면 항종양제가 될 가능성이 있다.

본 발명은 인간 암세포에 대한 세포 독성 활성 및 TGF-β 유사 작용을 가지며, 의약, 특히 항종양제로서 유용한 신규 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염 및 상기 화합물을 유효 성분으로 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 인간 암세포에 대한 세포 독성 활성 및 TGF-β 유사 작용을 가지며 항종양제로서 유용한 신규 화합물 및 그것을 함유하는 의약의 제공을 목적으로 하는 것이다.

본 발명자들은 천연에 존재하는 많은 미생물이 생산하는 화합물에 관하여 예의 검토한 결과, 슈도모나스속에 속하는 신종의 미생물로, 인간 암세포에 대한 우수한 세포 독성 활성 및 TGF-β 유사 작용을 갖는 화합물을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 미생물을 배양하여, 상술한 공지 뎁시펩티드 화합물 (유럽 특허 공개 공보 제352646호)과 비교할 때 하기 화학 구조식의 3 위치에 수산기를, 4 위치에 R기 (이소프로필기, sec-부틸기 또는 이소부틸기 중 어느 하나에서 선택된 기)를, 8 위치에 메틸기를 갖는 점에서 전혀 구조를 달리하는 신규 뎁시펩티드 화합물을 상기 배양물로부터 단리하는 것에 성공하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 뎁시펩티드 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.

식 중에서, R은 이소프로필기, sec-부틸기 또는 이소부틸기를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 뎁시펩티드 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 하는 의약 조성물, 바람직하게는 항종양제인 상기 의약 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 관하여 상술한다. 본 발명의 뎁시펩티드 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염은, 슈도모나스속 (Pseudomonas)에 속하는 해당 화합물 생산균을 영양 배지에서 배양하고 해당 화합물을 축적시킨 배양물로부터 통상의 방법에 의해서 얻을 수 있다. 해당 화합물의 제조 방법에 사용하는 미생물은, 슈도모나스속에 속하고 해당 화합물의 생산능을 갖는 미생물이면 모두 사용할 수 있다. 이러한 미생물로서는 예를 들면 일본 나가노껭 기따사꾸군 모찌즈끼마찌에서 채집된 토양으로부터 분리된 슈도모나스속에 속하는 세균 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) Q71576주를 들 수 있다. 본 균주의 균학적 성질은 다음과 같다.

1) 형태적 성질

본 균주는, 그램 음성의 간균이고, 극편모에 의해 연동성을 갖는다. 세포의 크기는 0.7 내지 0.9 ㎛ ×1.0 내지 1.4 ㎛이다. 포자의 형성은 확인되지 않는다. 2) 배양적 성질

육즙 한천 배지상에서 엷은 밤색의 콜로니를 형성한다. 콜로니는 원형으로 표면이 매끄럽다. 육즙 액체 배양에서는 배지 표면에 피막이 형성되엇고 배지 전체가 혼탁하였다. 육즙 젤라틴 천자 배양에서는 젤라틴이 액화되었다. 리트머스밀크에서의 배양에서는 1 주간 배양 후, 응고 및 펩톤화가 확인되지 않았다.

3) 생리학적 성질

Q71576주의 생리적 성질 (1)
질산염의 환원	음성
탈질소 반응	음성
MR 테스트	음성
VP 테스트	음성
인돌의 생성	음성
황화수소의 생성	음성
전분의 가수분해	음성
시트르산의 이용	양성
질산염의 이용	양성
암모늄염의 이용	양성
수용성 형광 색소의 생성	양성
우레아제	음성
옥시다제	양성
카탈라제	양성
생육 온도 범위	3 내지 32℃
최적 생육 온도	10 내지 24℃
생육 pH 범위	pH 5 내지 9
최적 생육 pH	pH 6 내지 8
혐기 조건에서의 생육	음성
OF 테스트	산화형
아르기닌 분해반응	양성
3% NaCl 첨가 육즙 배지에서의 생육	양성

Q71576주의 생리적 성질 (2)
당으로부터 산의 생산
L-아라비노스	양성
D-크실로스	양성
D-글루코스	양성
D-만노스	양성
D-프럭토스	음성
슈크로스	음성
이노시톨	음성
D-만니톨	음성
D-갈락토스	음성
말토스	음성
트레할로스	음성
락토스	음성
D-소르비톨	음성
글리세린	음성
전분	음성

Q71576주의 생리적 성질 (3)
당의 자화성
L-아라비노스	음성
D-크실로스	음성
D-글루코스	양성
D-만노스	양성
D-프럭토스	양성
슈크로스	음성
이노시톨	양성
람노스	음성
라피노스	음성
D-만니톨	양성
D-갈락토스	양성
말토스	음성
트레할로스	양성
락토스	음성
소르비톨	양성
살리신	음성
멜리비오스	음성
글리세린	양성
전분	음성
크산틴	양성
키틴	음성

이상의 미생물학적 성질을 정리하면, 본 균주는 그램 음성 호기성의 간균으로 운동성을 갖는다. 생육 온도 범위는 3 내지 32 ℃이고, 옥시다제 시험, 카탈라제 시험, 젤라틴의 액화 반응, 시트르산의 이용성, 무기 질소원의 이용성, 아르기닌 분해 반응이 양성이고, L-아라비노스, D-크실로스, D-글루코스, D-만노스에서 산을 생산하고, OF 테스트 결과는 산화형이다. 한편, 황화수소의 생성, 인돌의 생성, VP 시험, 질산염의 환원, 탈질소 반응 결과는 음성이다.

상기한 성질에 의하여 버지즈 매뉴얼 오브 시스테마틱 박테리올로지 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1989) 및 그 밖의 문헌에 의해서 검색한 결과, 본 균주는 슈도모나스 (Pseudomonas) 속에 속하는 세균이라 판단하고 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) Q71576이라 명명하였다. 또한, 본 균주는 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) Q71576으로서 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소 (일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고 (우편 번호 305-8566))에 수탁 번호 FERM BP-6944호 (기탁일 1999년 1월 8일)로서 국제 기탁되어 있다. 또한, 미생물은 인공적으로 또는 자연으로 변이를 일으키기 쉽기 때문에, 본 발명에 사용되는 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) Q71576 주는 천연으로부터 분리된 미생물 이외에 여기에 자외선, X선, 화학 약제 등으로 인공적으로 변이시킨 것 및 이들 천연 변이주도 포함한다.

<제조 방법>

본 발명의 화합물은 슈도모나스속에 속하고, 본 발명의 화합물의 생산능을 갖는 미생물을 배양함으로써 얻을 수 있다. 배양은 일반 미생물의 배양 방법에 준하여 이루어진다.

배양에 사용되는 배지로서는 슈도모나스 종 Q71576 주가 이용하는 영양원을 함유하는 배지일 수 있으며, 합성 배지, 반합성 배지 또는 천연 배지가 사용된다.배지에 첨가하는 영양물로서 공지된 것을 사용할 수 있다. 배지의 조성은 예를 들면 탄소원으로서는 D-글루코스, D-만노스, D-프럭토스, 이노시톨, D-만니톨, D-갈락토스, 트레할로스, 크산틴, 전분, 포도당, 덱스트린, 글리세린, 식물 오일 등을 들 수 있다. 질소원으로서는 육즙 엑기스, 펩톤, 글루텐밀, 면실박, 대두분, 낙화생분, 어분, 콘스티브리커, 건조 효모, 효모 엑기스, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 요산 그 밖의 유기, 무기의 질소원이 사용된다. 또한, 금속염으로서는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 아연, 철, 코발트 등의 황산염, 질산염, 탄산염, 인산염 등이 필요에 따라 첨가된다. 또한, 필요에 따라 메티오닌, 시스테인, 시스틴, 티오황산염, 올레인산메틸, 라아드 오일, 실리콘 오일, 계면 활성제 등의 생성 촉진 화합물 또는 소포제를 첨가할 수도 있다.

배양 조건으로서는 호기적 조건하에서 배양하는 것이 일반적으로 유리하고, 배양 온도는 3 내지 32 ℃ (상기 생리학적 성질의 기재 참조)의 범위, 바람직하게는 20 내지 25 ℃ 부근에서 이루어진다. 배지의 pH는 약 4.5 내지 9, 바람직하게는 약 5 내지 7.5의 범위로 조정하면 좋은 결과를 얻을 수 있다. 배양 기간은 배지의 조성, 온도 조건에 따라 적절하게 설정되지만 통상 1 내지 7 일 정도, 바람직하게는 2 내지 4 일 정도이다.

배양물에서 목적으로 하는 본 발명의 화합물을 단리하기 위해서는 미생물이 생산하는 대사산물에 사용하는 통상의 추출, 정제의 수단을 적절하게 이용할 수 있다. 예를 들면 배양 화합물 중의 상기 화합물은 배양액을 그대로 또는 원심 분리 또는 배양물에 여과 조제를 첨가하여 여과하고 얻어진 배양액에 아세트산에틸 등의물과 혼화하지 않은 유기 용제를 첨가하여 추출한다. 또한, 배양액을 적절한 담체에 접촉시켜 여액 중의 생산된 화합물을 흡착시켜, 계속해서 적당한 용매로 용출시킴으로써 상기 화합물을 추출할 수 있다. 예를 들면, 안바라이트 XAD-2, 다이아이온 HP-20, 다이아이온 CHP-20, 또는 다이아이온 SP-900과 같은 다공성 흡착 수지에 접촉시켜 상기 화합물을 흡착시킨다. 계속해서 메탄올, 에탄올, 아세톤, 부탄올, 아세토니트릴 또는 클로로포름 등의 유기 용매를 단독 또는 혼합한 용매를 또는 해당 용매와 물의 혼합액을 사용하여 상기 화합물을 용출시킨다. 이 때의 유기 용매의 혼합 비율을 저농도에서 단계적으로 또는 연속적으로 고농도까지 올려감으로써 상기 화합물이 포함되는 비율이 보다 높은 분획을 얻을 수 있다. 아세트산에틸, 클로로포름 등의 유기 용매로 추출할 경우에는, 배양 여액에 이들 용매를 첨가하여 잘 진탕하고 상기 화합물을 추출한다. 다음으로 상기 각 조작법을 사용하여 얻은 상기 화합물 함유 분획은 실리카 겔, ODS 등을 사용한 칼럼 크로마토그래피, 원심액 분배 크로마토그래피, ODS를 사용한 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등의 정법에 의해, 또한 순수하게 분리 정제할 수가 있다.

한편, TGF-β 유사 작용을, 지표로서 적당한 용제에 대한 용해성 및 용해도의 차 등을 이용하는 일반적인 생리 활성 화합물의 제조에 사용하는 수단에 의해서 분리 정제할 수 있다. 이들 방법은 필요에 따라서 단독으로 사용되고 또는 임의의 순서로 조합하여 반복하여 적용할 수 있다.

본 발명의 뎁시펩티드 화합물의 제약학적으로 허용되는 염은, 무기 또는 유기 염기와의 염이고, 제약학적으로 허용될 수 있는 염이 바람직하다. 이들 염으로서는 구체적으로는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 알루미늄 등 무기 염기, 메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민 등의 유기 염기, 리진, 오르니틴 등의 염기성 아미노산과의 염 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 부제 (asymmetric) 탄소 원자 및 이중 결합을 갖기 때문에 이에 의한 입체 이성체 (라세미체, 광학 이성체, 디아스테레오머 등) 및 기하 이성체 (시스체 또는 트랜스체)가 존재한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 이들의 입체 이성체 또는 기하 이성체의 혼합물 또는 단리된 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 해당 화합물의 수화물 또는 각종 용매화물, 또는 해당 화합물의 결정 다형도 포함한다.

이하에 본 발명의 화합물의 제제화법 및 투여 방법을 상술한다.

본 발명의 뎁시펩티드 화합물이나 그의 제약학적으로 허용되는 염의 1종 또는 2종 이상을 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물은 통상 사용하고 있는 제제용의 담체나 부형제, 그 밖의 첨가제를 사용하여 정제, 산제, 세립제, 과립제, 캡슐제, 환제, 액제, 주사제, 좌제, 연고, 첩부제 등으로 조제되고 경구적 또는 비경구적으로 투여된다.

본 발명의 화합물의 인간에 대한 임상 투여량은 적용되는 환자의 증상, 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정된다.

본 발명에 의한 경구 투여를 위한 고체 조성물로서는 정제, 산제, 과립제 등이 사용된다. 이러한 고체 조성물에 있어서는 하나 또는 그 이상의 활성 화합물이 적어도 하나의 불활성 희석제, 예를 들면 유당, 만니톨, 포도당, 히드록시프로필셀룰로스, 미결정 셀룰로스, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산마그네슘과 혼합된다. 조성물은 통상의 방법에 따라서 불활성 희석제 이외의 첨가제, 예를 들면 스테아린산마그네슘과 같은 윤활제나 섬유소 글리콜산칼슘과 같은 붕괴제, 락토스와 같은 안정화제, 용해 보조제를 함유할 수 있다. 정제 또는 환제는 필요에 따라 자당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스프탈레이트 등의 당의 또는 위용성 또는 장용성 화합물의 필름으로 피막시킬 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 조성물은, 약제학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭서제 등을 포함하고, 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면 정제수, 에틸알코올을 포함한다. 이 조성물은 불활성 희석제 이외에 용해 보조제, 습윤제, 현탁제와 같은 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제를 함유할 수 있다.

비경구 투여를 위한 주사제로서는 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 유탁제를 포함한다. 수성의 용액제, 현탁제의 희석제로서는 예를 들면 주사제용 증류수 및 생리 식염수가 포함된다. 비수용성의 용액제, 현탁제의 희석제로서는 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유 같은 식물 오일, 에틸 알코올과 같은 알코올류, 폴리솔베이트 80 (상품명) 등이 있다. 이러한 조성물은 또한 등장화제, 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제 (예를 들면 락토스), 용해 보조제와 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 이들은 예를 들면 박테리아 보유 필터를 통과시키는 여과, 살균제의 배합 또는 조사에 의해서 무균화된다. 이들은 무균의 고체 조성물을 제조하고, 사용 전에 무균수 또는 무균의 주사용 용매에 용해시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물의 용해성이 낮은 경우에는 가용화 처리를 실시할 수 있다. 가용화 처리로서는 의약제제에 적용할 수 있는 공지의 방법, 예를 들면 계면 활성제 (폴리옥시에틸렌 경화 피마자 오일류, 폴리옥시에틸렌소르비탄 고급 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류, 자당 지방산 에스테르류 등)을 첨가하는 방법, 약물과 가용화제 예를 들면 고분자 (히드록시프로필메틸셀룰로스 (HPMC), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 수용성 고분자, 카르복시메틸에틸셀룰로스 (CMEC), 히드록시프로필메틸셀룰로스프탈레이트 (HPMCP), 메타크릴산메틸-메타크릴산 공중합체 (오이드라깃트 L, S, 상품명 ; 롬ㆍ앤드ㆍ하스사 제조) 등의 장용성 고분자)와의 고체 분산체를 형성하는 방법을 들 수 있다. 또한, 필요에 따라 가용성의 염으로 하는 방법, 시클로덱스트린 등을 사용하여 포접 화합물을 형성시키는 방법 등도 이용할 수 있다. 가용화의 수단은 목적으로 하는 약품에 따라서 적절하게 변경할 수 있다 [「최근의 제제 기술과 그 응용 Ⅰ」, 우찌미 이사무 등, 의약 저널 157-159 (1983) 및 「약학 모노그래프 No. 1, 생물학적 이용능」, 나가이 히사시 등, 소프트 사이언스사, 78-82] (1988) 참조].

<발명을 실시하기 위한 최량의 형태>

이하, 실시예로서 구체적으로 본 발명을 설명하지만 본 발명은 이들에 한정되는 것이 아니다.

<실시예 1>

글루코스 10 g, 감자전분 20 g, 폴리펩톤 5 g, 효모 엑기스 5 g, 탄산칼슘 4 g, 증류수 1 L를 포함하는 배지 (pH 7.0) 100 mL을, 500 mL 들이 삼각 플라스크에 나누어 넣고, 120 ℃에서 20 분간 멸균하였다. 베네트 한천 배지에서 잘 생육시킨 슈도모나스 종 Q71576 주를 긁어 취하여 접종하고, 28 ℃, 200 회전/분의 조건으로 3 일간 진탕 배양하여 종 배양액으로 하였다. 다음으로 글리세롤 30 g, 글루코스 1 g, 폴리펩톤 5 g, 육즙 엑기스 5 g, NaCl 5 g, 소포제 (NKL5430) 0.5 g, 증류수 1L를 포함하는 배지 (pH 7.0)를 100 mL씩 50O mL 들이 삼각 플라스크에 나누어 넣고, 120 ℃에서 20 분간 멸균하였다. 이 배지에 상기 종 배양액을 2 mL씩 접종하고 28 ℃, 200 회전/분의 조건으로 3 일간, 진탕 배양하였다.

이렇게 하여 배양한 배양액 2.5 L에 대해서, 600O rpm에서 10 분간 원심 분리를 하였다. 상청액을 아세트산에틸로 추출하고 황산나트륨을 첨가하여 탈수한 후 감압하에서 농축 건고시켰다. 유상의 조추출물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (30 i.d.×200 mm)에 제공하고 클로로포름-메탄올 (20:1)로 세정 후, 클로로포름-메탄올 (5:1)로 용출하여, 활성 분획을 농축시켰다. 다음으로, 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피 (20 i.d.× 500 mm)에 제공하고, 클로로포름-메탄올(1:1)로 겔 여과를 하였다. 활성 분획을 농축시킨 후, CPC (centrifugal partition chromatography)에 제공하고 클로로포름-메탄올-물 (5:6:4)의 용매계에서 상승법을 사용하여 불순물을 제거하였다. 최종적으로 활성 분획을 농축 건고시킨 후, 메탄올에 용해하고 센슈 과학사 제조 PEGASIL ODS 칼럼 (20 i.d.×250 mm)을 사용하고,35 % 아세토니트릴 수용액으로써 역상 HPLC (유속 10 mL/분)를 행하였다. 그 결과, 화합물 A는 10.8 분에, 화합물 B는 15.4 분에 피크가 확인되고, 각각의 피크를 분취함으로써 화합물 A 및 B의 백색 분말을 각 10 mg 얻었다.

<실시예 2>

글루코스 10 g, 감자전분 20 g, 폴리펩톤 5 g, 효모 엑기스 5 g, 탄산칼슘 4 g, 증류수 1 L를 포함하는 배지 (pH 7.0)를 100 mL씩 500 mL 들이의 부착된 삼각 플라스크에 나누어 넣고, 120 ℃에서 20 분간 멸균하였다. 베네트 한천 배지에서 잘 생육시킨 슈도모나스 종 Q71576주를 긁어 취하여 접종하고, 28 ℃, 200 회전/분의 조건으로 3 일간 진탕 배양하였다. 동 배지 400 mL를 2 L 들이 삼각 플라스크에 나누어 넣고, 120 ℃에서 20 분간 멸균한 후, 상기 배양액 8 mL를 접종하고, 28 ℃에서, 200 회전/분의 조건으로 3 일간 진탕 배양하여, 종배양액으로 하였다. 다음으로 만니톨 30 g, 폴리펩톤 5 g, 육즙 엑기스 5 g, 염화나트륨 5 g, 수도물 1 L를 포함하는 배지 (pH 7.0)를 18 L씩 30 L 들이 쟈퍼멘터 3개에 나누어 넣고, 120 ℃에서 20 분간 멸균하였다. 이 배지에 상기 종 배양액을 360 mL 씩 접종하고 24 ℃, 150 회전/분, 1 vvm으로 64 시간 배양하였다.

샤플레스를 사용하여 균체와 분리시킨 배양액 50 L을 HP-20을 충전한 칼럼에 제공하고, 물, 20 % 아세톤 수용액, 40 % 메탄올 수용액으로 세정 후, 80 % 아세톤 수용액으로 용출하였다. 용출 분획을 농축하여 얻은 수용액에 대해 클로로포름, 아세트산에틸로 추출하여, 각 추출물을 혼합하여 농축 후, 실리카 겔을 충전한 칼럼에 제공하였다. 클로로포름-메탄올 (50:1), (20:1), (10:1)로 용출시키고, 클로로포름-메탄올 (20:1) 및 (10:1) 용출 분획의 일부를 혼합하여 농축 후, 에탄올에 용해시켜 재결정화를 행하고, 화합물 A, B 및 C를 포함하는 혼합물로서, 백색 분말 776 mg을 얻었다. 얻어진 분말에 대하여 ODS-HPLC 칼럼 (cosmosil AR-Ⅱ 20 i.d.×250 mm)에의한 화합물 C 용출 분획을 분취하여, 화합물 C의 백색 분말로서 20 mg를 얻었다.

<본 발명의 화합물의 물리화학적 성상>

상기 방법으로 추출, 정제 및 단리한 화합물 A, B 및 C는 하기의 물리 화학적 성상을 나타낸다.

화합물 A, B 및 C의¹H 및¹³C NMR 화학시프트값 (중클로로포름 중)은 각각하기와 같다.

상기한 물리화학적 성상으로 화합물 A, B 및 C의 화학 구조식을 이하와 같이 결정하였다.

본 발명의 화합물은 인간의 암세포에 대한 세포 독성 활성 및 TGF-β 유사작용을 갖기 때문에, 항종양제, 예를 들면 대장암, 폐암, 전립선암 또는 자궁 경부암 등에 대한 약제 등으로 유용하다.

본 발명의 화합물의 인간 암세포에 대한 세포 독성 활성 및 TGF-β 유사 작용을 이하의 방법으로 확인하였다.

인간 암세포에 대한 세포 독성 활성 측정법 (1)

96 구멍 테스트 플레이트 중에 6×10⁴개/mL로 조제한 HeLa S3 세포를 200 μL, 여러가지 농도의 화합물 A 및 화합물 B를 4 μL 첨가하여, CO₂인큐베이터 중에서 37 ℃, 3 일간 배양하였다. 배양 후, 세포 증식도를 Cell Countinght Kit (DOJINDO 제조)를 사용하여 측정하고 각 농도에 있어서의 증식 억제율을 구하여 IC₅₀값을 산출하였다. 그 결과, 화합물 A 및 화합물 B는 HeLa S3 세포에 대하여 각각 IC₅₀값 1.6 μM, 1.2 μM의 값으로 세포 독성 활성을 나타내었다.

인간 암세포에 대한 세포 독성 활성 측정법 (2)

96 구멍 테스트 플레이트 중에, 6×10⁴개/mL로 조제한 인간 대장암 WiDr 세포, 4×10⁴개/mL로 조제한 인간 비소세포 폐암 A549 세포, 또는 6×10⁴개/mL로 조제한 인간 전립선암 DU-145 세포를 CO₂인큐베이터 중에서 37 ℃에서 배양하였다. 24 시간 후, 여러가지의 농도의 화합물 A, 화합물 B 또는 화합물 C를 100 μL 첨가하여, CO₂인큐베이터 중에서 37 ℃에서 또한 72 시간 배양하였다. 배양 후, 술포로더민 B로 세포수를 정량하고 세포 증식에 대한 각 화합물의 IC₅₀값을 산출하였다. 그 결과, 화합물 A, B 및 C는 WiDr 세포, A549 세포, 또는 DU-145 세포에 대하여 각각의 세포종으로 우수한 세포 증식 억제 활성을 나타냈다. 세포종에 따라다르지만 예를 들면 A549 세포에 대하여 IC₅₀값은 5.0 nM 이하의 활성을 나타내었다.

TGF-β 유사 작용 측정법

TGF-β 유사 활성을 검출하기 위해 리포터 유전자 발현을 이용한 스크리닝계를 구축하였다. TGF-β 수용체를 지나치게 발현하여 TGF-β에 의해 플라스미노겐 활성화 인자-1(PAI-1)의 발현을 야기시키는 밍크 폐상피 세포 (Mv1Lu) (Journal of Biological Chemistry 제262권, 17467-17414면, 1987년)의 PAI-1 프로모터유전자의 하류에 형광 루시페라제 유전자를 트랜스펙션시켰다 (Analytical Biochemistry 제216권 ; 276-284면, 1994년).

상기 세포를 사용하여, 화합물을 첨가하였을 때 얻어지는 형광도를 TGF-β 유사 활성의 지표로 하였다. 그 결과, TGF-β는 PAI-1 프로모터 유전자 발현의 유도에 의한 형광도를 증가시켰다. 마찬가지로, 화합물 A는 26 nM 내지 100 μM의 농도로, 화합물 B는 12 nM 내지 100 μM의 농도로 형광도를 증가시켰다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 뎁시펩티드 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염.

<화학식 1>

식 중에서, R은 이소프로필기, sec-부틸기 또는 이소부틸기를 의미한다.
제1항에 기재된 뎁시펩티드 화합물 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 의약 조성물.
제2항에 있어서, 항종양제인 의약 조성물.