CN1335852A - 新颖的缩肽化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对人体癌细胞具有细胞毒作用和TGF-β样作用,可作为抗肿瘤药的新颖化合物,以及含有该化合物的医药组合物。

Description

新颖的缩肽化合物
技术领域
本发明涉及对人体癌细胞具有细胞毒作用和TGF-β样作用的医药，特别涉及可作为抗肿瘤药使用的新颖化合物或其制药学上允许的盐及以该化合物为有效组分的医药组合物。
背景技术
已知来源于微生物代谢产物的化合物丝裂霉素C、博来霉素或阿霉素等对人体癌细胞具有细胞毒作用，这些化合物一直作为抗肿瘤药用于临床。此外，还揭示了缩肽化合物作为抗肿瘤药使用(欧洲专利公开公报第352646号)。
目前，正进行具有以往所没有的化学结构和新颖骨架的抗肿瘤药的研制。
另一方面，着眼于TGF-β作为促进细胞增殖和转化的因子已开始对其机理进行研究，但现在仅明确TGF-β能够阻碍各种动物细胞的繁殖(Cell，第63卷，245-247页，1990年)。此外，还有许多与肿瘤细胞有关的报道(Br.Med.J.，第296卷：1621-1624页，1988年；Br.J.Cancer，第61卷：612-617页，1990年；Br.J.Cancer，第69卷：1006-1009页，1994年；J.Cell Physiol.，第172卷：1-11页，1997年；Growth-Factors.，第7卷：207-213页，1992年；J.Biol.Chem.，第272卷：3967-3972页，1997年；Nature，第360卷：361-364页，1992年)。此外，还有TGF-β受体作为各种肿瘤的肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)的报道(International J.Hematology，第65卷：97-104页，1997年)。因此，具有TGF-β样作用的化合物可能作为与该作用有关的疾病的治疗药，例如，作为抗肿瘤药。
发明的揭示
本发明的目的是提供对人体癌细胞具有细胞毒作用和TGF-β样作用的可作为抗肿瘤药使用的新颖化合物及含有该化合物的医药。
本发明者们对天然存在的多种微生物产生的化合物进行研究后，在属于假单胞菌属的新微生物中发现了可产生对人体癌细胞具有良好细胞毒作用及TGF-β样作用的化合物的微生物。此外，本发明者们对该微生物进行培养后发现，和上述公知的缩肽化合物(欧洲专利公开公报第352646号)相比，该培养物能够分离出化学结构完全不同的下列新颖的缩肽化合物，即3位上具有羟基、4位上具有R基(R基为选自异丙基、仲丁基或异丁基的任1种基团)、8位上具有甲基，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下通式(1)表示的缩肽化合物或其制药学上允许的盐。式中，R表示异丙基、仲丁基或异丁基。本发明还涉及以上述缩肽化合物或其制药学上允许的盐为有效成分的医药组合物，更具体涉及作为抗肿瘤药的医药组合物。
以下，对本发明进行详细说明。在营养培养基中培养属于假单胞菌属(Pseudomonas)的可产生上述化合物的产生菌，然后通过常规方法从蓄积了上述化合物的培养液中获得本发明的缩肽化合物或其制药学上允许的盐。在上述化合物的制备方法中所用的微生物只要是属于假单胞菌的可产生上述化合物的微生物即可。这类微生物包括从日本长野县北佐久郡望月町采集到的土壤中分离出的属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)的Q71576菌株。本菌株的细菌学性状如下所述。
1)形态
本菌株为革兰氏阴性杆菌，因极生鞭毛而具有游动性。细胞的大小为0.7～0.9μm×1.0～1.4μm。未见胞子形成。
2)培养情况
在肉汁琼脂培养基中形成淡茶色的菌落。该菌落为圆形，其表面光滑。在进行肉汁液体培养时，培养基表面形成了皮膜，整个培养基是混浊的。在肉汁明胶穿刺培养时，明胶液化。在石蕊牛乳中培养时，培养1周后，未出现凝固和胨化现象。
3)生理学性质
                  表1
          Q71576株的生理性质(1)
    硝酸盐的还原     阴性
    脱氮反应     阴性
    MR试验     阴性
    VP试验     阴性
    吲哚的生成     阴性
    硫化氢的生成     阴性
    淀粉的水解     阴性
    柠檬酸的利用     阳性
    硝酸盐的利用     阳性
    铵盐的利用     阳性
    水溶性荧光色素的生成     阳性
    尿酸酶     阴性
    氧化酶     阳性
    过氧化氢酶     阳性
    培养温度范围   3～32℃
    最适培养温度范围   10～24℃
    培养pH范围   pH5～9
    最适培养pH范围   pH6～8
    厌氧条件下的培养     阴性
    OF试验     氧化型
    精氨酸分解反应     阳性
在添加了3％NaCl的肉汁培养基中的培养     阳性
          表2
  Q71576株的生理性质(2)
         由糖产生酸
    L-阿拉伯糖     阳性
    D-木糖     阳性
    D-葡萄糖     阳性
    D-甘露糖     阳性
    D-果糖     阴性
    蔗糖     阴性
    肌醇     阴性
    D-甘露糖醇     阴性
    D-半乳糖     阴性
    麦芽糖     阴性
    海藻糖     阴性
    乳糖     阴性
    D-山梨糖醇     阴性
    甘油     阴性
    淀粉     阴性
         表3
 Q71576株的生理性质(3)
         糖的利用
    L-阿拉伯糖     阴性
    D-木糖     阴性
D-葡萄糖 阳性
    D-甘露糖     阳性
    D-果糖     阳性
    蔗糖     阴性
    肌醇     阳性
    鼠李糖     阴性
    棉子糖     阴性
    D-甘露糖醇     阳性
    D-半乳糖     阳性
    麦芽糖     阴性
    海藻糖     阳性
    乳糖     阴性
    D-山梨糖醇     阳性
    水杨苷     阴性
    蜜二糖     阴性
    甘油     阳性
    淀粉     阴性
    黄嘌呤     阳性
    甲壳质     阴性
总结以上微生物学性质可知，本菌株为革兰氏阴性好氧杆菌，具有游动性。其培养温度范围为3～32℃，氧化酶试验、过氧化氢酶试验、明胶的液化反应、柠檬酸的利用、无机氮源的利用、精氨酸分解反应都呈阳性。L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖可产生酸，OF试验的结果为氧化型。另外，硫化氢的生成、吲哚的生成、VP试验、硝酸盐的还原和脱氮反应的结果都为阴性。
根据上述性质，检索Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，1989及其他文献后可判定本菌株是属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌，命名为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)Q71576菌株。此外，本菌株作为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)Q71576菌株，以FERM BP-6944号(保藏日1999年1月8曰)保藏于工业技术院生命工程技术研究所(日本国茨城县っくば市东1丁目1番3号(邮编305-8566))内。此外，由于微生物容易发生人工或自然变异，所以，本发明所用的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)Q71576菌株除了天然分离出的微生物之外，还包括通过紫外线、X射线和化学试剂等人工变异而获得的菌株及他们的天然变异菌株。
(制备方法)
对属于假单胞菌属的能够产生本发明化合物的微生物进行培养，就可获得本发明的化合物。培养时可采用普通微生物培养方法。
培养时所用的培养基只要为含有假单胞细菌属Q71576菌株能利用的营养源的培养基即可，包括合成培养基、半合成培养基或天然培养基。在培养基中添加的是公知营养物质。培养基的组成是，碳源为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、肌醇、D-甘露糖醇、D-半乳糖、海藻糖、黄嘌呤、淀粉、葡萄糖、糊精、甘油、植物油等；氮源为肉膏、胨、麦麸粉、棉籽饼、大豆粉、花生粉、鱼粉、玉米浆、干酵母、酵母浸膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、尿酸及其他有机和无机碳源。此外，还可根据需要添加金属盐，例如，钠、钾、镁、钙、锌、铁、钴等的硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐和磷酸盐等。另外，根据需要还可添加甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、硫代硫酸盐、油酸甲酯、猪油、硅油、表面活性剂等生成促进化合物或消泡剂。
培养一般在好氧条件下进行。培养温度为3～32℃(参考上述生理学性质)，较好为20～25℃。培养基的pH一般约为4.5～9，较好约为5～7.5，这样能够获得较理想的结果。培养时间可根据培养基的组成和温度条件适当设定，一般为1～7天左右，较好为2～4天左右。
从培养物中分离出本发明化合物时，可采用对微生物产生的代谢产物常用的萃取和精制方法。例如，直接或通过离心分离或在培养物中添加过滤助剂过滤而获得的培养液中添加不与水混溶的乙酸乙酯等有机溶剂再萃取培养物中的该化合物。此外，也可使培养液和适当的载体接触，使滤液中的化合物被吸附，然后用适当的溶剂进行洗脱处理而萃取出该化合物。例如，使培养液和阿姆伯拉特离子交换树脂XAD-2、迪阿翁离子交换树脂HP-20、迪阿翁离子交换树脂CHP-20或迪阿翁离子交换树脂SP-900等多孔性吸附树脂接触而吸附该化合物，然后用选自甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙腈或氯仿等的1种或多种有机溶剂，或上述溶剂和水的混合液使该化合物洗脱。此时有机溶剂的混合比例阶段性地或连续地由低浓度向高浓度上升，这样就能够获得该化合物包含比例更高的流分。用乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂进行萃取时，在培养滤液中加入这些溶剂，充分振荡后，就可萃取出该化合物。然后，通过使用了硅胶、ODS等的柱色谱法，离心液液分配色谱法，使用了ODS的高速液相色谱法(HPLC)等常规方法，进一步对通过上述各操作法而获得的含有该化合物的部分进行分离精制。
另外，也可以TGF-β样作用为指标，通过利用对适当溶剂的溶解性及溶解度的差异等一般生理活性化合物的制备用手段，进行分离和精制。根据需要这些方法可单独使用，也可按照任意顺序组合使用或反复使用。
本发明的缩肽化合物的制药学上允许的盐包括和无机或有机碱形成的盐，较好为制药学上允许的盐。这些盐具体包括和钠、钾、镁、钙、铝等无机碱，甲胺、乙胺、乙醇胺等有机碱，赖氨酸和鸟氨酸等碱性氨基酸形成的盐等。
此外，由于本发明化合物具有手性碳原子及双键，所以，存在立体异构体(外消旋体、旋光异构体和非对映立体异构体等)及几何异构体(顺式体或反式体)。因此，本发明化合物还包括这些立体异构体或几何异构体的混合物或分离物。
此外，本发明还包括该化合物的水合物或各种溶剂合物，或该化合物的多晶型物质。
以下，对本发明化合物的制剂法和给药方法进行详细说明。
混合以1种或2种以上本发明的缩肽化合物及其制药学上允许的盐为有效成分的医药组合物，使用常用于制剂的药用载体，赋形剂和其他添加剂，就可调制出片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏和贴附剂等，这些药物可通过经口给药方式或非经口给药方式给药。
本发明化合物对人的临床给药量可根据患者的症状、体重、年龄和性别等适当决定。
本发明的经口给药的固体组合物包括片剂、散剂和颗粒剂等。这种固体组合物中将至少1种活性物质，与至少1种惰性稀释剂，例如，乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸铝镁相混合。按照常规方法，组合物中还可包含惰性稀释剂以外的添加剂，例如，硬脂酸镁等润滑剂，纤维素乙醇酸钙等崩解剂，乳糖等稳定剂及助溶剂。根据需要，片剂或丸剂可被蔗糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等形成的糖衣，或胃溶性及肠溶性化合物薄膜包衣。
经口给药的液体组合物包括药剂学上允许的乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂等。常用惰性稀释剂包括精制水和乙醇。这种组合物除了惰性稀释剂之外，其中还可包含助溶剂、润湿剂和悬浮剂等助剂，甜味剂、矫味剂、芳香剂和防腐剂。
非经口给药的注射剂包括无菌的水性或非水性溶液剂，悬浮剂和乳剂。水性溶液剂、悬浮剂的稀释剂包括注射用蒸馏水及生理盐水。非水性溶液剂、悬浮剂的稀释剂包括丙二醇、聚乙二醇和橄榄油等植物油，乙醇等醇类，吐温80(商品名)等。这类组合物中还可包含等渗剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如，乳糖)和助溶剂等添加剂。使这些组合物通过除菌过滤器，配合使用杀菌剂或光照就可使它们无菌化。也可将它们制成无菌的固体组合物，在使用前用无菌水或无菌注射用溶剂溶解就可使用。
当本发明化合物的溶解性较低时，还可进行增溶化处理。增溶化处理是指利用适合医药制剂的公知方法，例如，添加表面活性剂(聚氧乙烯硬化蓖麻油类，聚氧乙烯山梨糖醇酐高级脂肪酸酯类，聚氧乙烯聚丙二醇类，蔗糖脂肪酸酯类)的方法；形成药物和高分子(羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)等水溶性高分子，羧甲基乙基纤维素(CMEC)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物(Eudragit L，S，商品名，Rhm and Hüls公司制)等肠溶性高分子)等增溶剂的固体分散体的方法。根据需要，还可采用形成可溶性盐的方法，利用环糊精等形成包合化合物的方法等。增溶化方法可根据目的药物作适当改变[参考《最新制剂技术及其应用I》内海勇等，医药杂志157-159(1983)及《药学专论No.1，生物学的利用度》永井恒司等，Soft Science株式会社，78-82(1988)]。
实施发明的最佳状态
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不仅限于此。
实施例1
将包含10g葡萄糖、20g马铃薯淀粉、5g细菌培养基用胨、5g酵母浸膏、4g碳酸钙和1L蒸馏水的培养基(pH7.0)分注入500mL的三角烧瓶中，每个100mL，于120℃进行20分钟的灭菌处理。然后刮取经过贝内特琼脂培养基的良好培养的假单胞菌属Q71576菌株，在其中接种，在28℃的温度下，以200转/分钟的速度振荡培养3天，获得种子培养液。接着，将包含30g甘油、1g葡萄糖、5g细菌培养基用胨、5g肉膏、5gNaCl、0.5g消泡剂(NKL5430)和1L蒸馏水的培养基(pH7.0)分注入500mL三角烧瓶中，每个100mL，于120℃进行20分钟的灭菌处理。在该培养基中接种前述种子培养液，每个2mL，在28℃的温度下，以200转/分钟的速度振荡培养3天。
以6000rpm对2.5L通过以上培养获得的培养液进行10分钟的离心分离，用乙酸乙酯萃取上清液后，添加硫酸钠脱水，在减压下浓缩至干。将油状粗萃取物进行硅胶柱色谱分析(30i.d.×200mm)，用氯仿-甲醇(20∶1)洗净后，用氯仿-甲醇(5∶1)洗脱，浓缩活性流分。然后，将其进行葡聚糖凝胶LH-20柱色谱分离(20i.d.×500mm)，用氯仿-甲醇(1∶1)进行凝胶过滤，浓缩活性流分后，进行CPC(centrifugal partition chromatography)，用上升法通过氯仿-甲醇-水(5∶6∶4)的溶剂系统除去杂质。最后将活性流分浓缩至干后，将其溶于甲醇，再用センシ，-科学株式会社制PEGASIL ODS柱(20i.d.×250mm)，用35％的乙腈水溶液进行反相HPLC(流速10mL/分钟)。其结果是，确认在10.8分钟时有化合物A峰，在15.4分钟时有化合物B，分取各峰，获得化合物A及B的白色粉末各10mg。
实施例2
将包含10g葡萄糖、20g马铃薯淀粉、5g细菌培养基用胨、5g酵母浸膏、4g碳酸钙和1L蒸馏水的培养基(pH7.0)分注入500mL的三角烧瓶中，每个100mL，于120℃进行20分钟的灭菌处理。然后刮取经过贝内特琼脂培养基的良好培养的假单胞菌属Q71576菌株在其中接种，在28℃的温度下，以200转/分钟的速度振荡培养3天。将400mL同样的培养基分注入2L的三角烧瓶中，于120℃进行20分钟的灭菌处理后，在其中接种8mL前述培养液，于28℃，以200转/分钟的条件振荡培养3天，获得种子培养液。然后，将包含30g甘露糖醇、5g细菌培养基用胨、5g肉膏、5gNaCl和1L自来水的培养基(pH7.0)分注入30L发酵罐中，每个18L，于120℃进行20分钟的灭菌处理后，在该培养基中接种前述种子培养液，每个360mL，在24℃的温度下，以150转/分钟的速度，在1vvm下培养64小时。
在填充HP-20的柱子中通过经夏普勒斯离心机分离除去菌体的培养液50L，用水、20％丙酮水溶液和40％甲醇水溶液洗净后，用80％的丙酮水溶液洗脱。浓缩所得流分，用氯仿、乙酸乙酯对所得水溶液进行萃取，混合各萃取物浓缩后，装入填充有硅胶的柱子中。用氯仿-甲醇(50∶1)(20∶1)(10∶1)洗脱后，混合氯仿-甲醇(20∶1)及(10∶1)的部分洗脱流分，浓缩后，用乙醇溶解，并重结晶，获得包含化合物A、B及C的混合物的白色粉末776mg。用ODS-HPLC柱(cosmosil AR-II 20i.d.×250mm)对所得粉末进行处理，获得化合物C的洗脱流分，即获得20mg化合物C的白色粉末。
本发明化合物的物理化学性质
用上述方法萃取、精制和分离出的化合物A、B和C显现以下物理化学性质。
                                表4
                    化合物A、B和C的物理化学性质
    化合物A     化合物B     化合物C
  颜色及形状    白色粉末    白色粉末     白色粉末
    熔点   135～138℃   132～135℃       N.T.
  旋光度[α]D 25     -63.6°(c0.14，MeOH)     -58.6°(c0.1l，MeOH)      -60.0°(c0.10，MeOH)
    分子式   C20H31N3O6S2   C21H33N3O6S2     C21H33N3O6S2
高分辨FAB质谱FoundCalcd 474.1735(M+H)+474.1733 488.1865(M+H)+488.1889 488.1889(M+H)+488.1889
紫外可见吸收光谱λmax MeoHnm(ε)     末端吸收     末端吸收      末端吸收
  红外吸收光谱νmaxcm-1  3400，3350，1720，1660，1520，1260，980(KBr法)  3400，3350，1720，1660，1520，1260，980(KBr法)  3400，3320，1730，1660，1550，1280，980(反射测定法)
  N.T.：未试验
化合物A、B和C的1H及13C NMR的化学位移值(氘代氯仿中)分别如下所示。
                                表5
            化合物A的1H及13C NMR的化学位移值(氘代氯仿中)
  No.     δC                       δH
  1     171.3
  2     52.2              4.21(dq，J＝4.0，7.5Hz)
  3     16.5                 1.48(d，J＝7.5HZ)
  NH                       6.28(m)
  1’     169.1
  2’     54.9              4.84(dt，J＝3.5，9.0Hz)
  3’     40.9                 3.13(m)，3.28(m)
  NH                 6.79(d，J＝9.0Hz)
  1”     171.7
  2”     39.5                 2.68(d，J＝4.0Hz)
  3”     69.1                       4.52(m)
  4”     63.4                       2.77(m)
  5”     29.7                       2.34(m)
  6”     19.7                 0.90(d，J＝7.0Hz)
  7”     20.6                 1.00(d，J＝7.0Hz)
  NH                 7.38(d，J＝7.0Hz)
  OH                 3.09(d，J＝10.0Hz)
  1     170.8
  2     40.3     2.59(d，J＝13.0Hz)，3.31(dd，J＝7.0，13.0Hz)
  3     70.7                       5.48(m)
  4     128.9                 5.68(d，J＝15.0Hz)
  5     133.3                       6.31(m)
  6     33.1                 2.43(m)，2.68(m)
  7     40.9                 2.73(m)，3.24(m)
表中编号(No.)表示以下化合物A的化学结构式中的碳原子位置
                                表6
            化合物B的1H及13C NMR的化学位移值(氘代氯仿中)
No. δC δH
  1     171.2
  2     52.2             4.22(dq，J＝4.0，7.0Hz)
  3     16.6                1.48(d，J＝7.0Hz)
  NH                     6.18(m)
  1’     169.2
  2’     54.5             4.87(dt，J＝3.0，9.0Hz)
  3’     41.3                3.10(m)，3.33(m)
  NH                6.75(d，J＝9.0Hz)
  1”     171.8
  2”     39.5                2.70(d，J＝4.0Hz)
  3”     68.2                     4.60(m)
  4”     61.7                     2.94(m)
  5”     36.3                     2.05(m)
  6”     27.1                1.21(m)，1.53(m)
  7”     11.5                0.89(t，J＝7.5Hz)
  8”     15.4                0.90(d，J＝7.0Hz)
  NH                7.25(d，J＝7.0Hz)
  OH                     2.93(m)
  1     170.6
  2     40.7   2.58(d，J＝13.0Hz)，3.31(dd，J＝7.0，13.0Hz)
  3     70.6                     5.48(m)
  4     128.6                5.67(d，J＝15.0Hz)
  5     133.4                     6.36(m)
  6     33.3                2.44(m)，2.71(m)
  7     40.5                2.72(m)，3.20(m)
表中编号(No.)表示以下化合物B的化学结构式中的碳原子位置
                                表7
            化合物C的1H及13C NMR的化学位移值(氘代氮仿中)
  No.     δC                       δH
  1    171.3
  2    52.3             4.22(dq，J＝7.3，3.7Hz)
  3    16.5                1.50(d，J＝7.3Hz)
  NH                      6.40(br)
  1’    168.9
  2’    55.1                      4.81(m)
  3’    41.1                      3.20(m)
  NH                6.82(d，J＝9.1Hz)
  1”    171.4
  2”    38.8                      2.68(m)
  3”    70.7                      4.35(m)
  4”    56.0                      3.08(m)
  5”    38.8                1.51(m)，2.06(m)
  6”    25.2                      1.62(m)
  7”    21.3                0.91(d，J＝6.7Hz)
  8”    23.4                0.91(d，J＝6.7Hz)
  NH                7.49(d，J＝6.7Hz)
  OH                      2.96(br)
  1    170.9
  2    40.3    2.62(d，J＝12.8Hz)，3.36(d，J＝12.8，7.3Hz)
  3    70.7                      5.48(m)
  4    129.0                5.72(d，J＝15.8Hz)
  5    133.2                      6.29(m)
  6    32.7                2.43(m)，2.72(m)
  7    40.5                2.74(m)，3.31(m)
表中编号(No.)表示以下化合物C的化学结构式中的碳原子位置
具备上述物理化学性质的化合物A、B和C的化学结构式如下所示。
化合物A
化合物B
化合物C
Figure A0080251000163
产业上利用的可能性
由于本发明化合物对人体癌细胞具有细胞毒作用及TGF-β样作用，所以，可作为抗肿瘤药使用，例如，作为大肠癌、肺癌、前列腺癌或宫颈癌等的治疗药物是有效的。
本发明化合物对人体癌细胞的细胞毒作用及TGF-β样作用可通过以下方法确认。
对人体癌细胞的细胞毒作用的测定法(1)
在96孔板中注入调制成6×104个/mL的HeLa S3细胞200μL及4μL各种浓度的化合物A和化合物B，在CO2培养箱中于37℃培养3天。培养结束后，用Cell Counting Kit(DOJINDO制)测定细胞增殖程度，求出各浓度的增殖抑制率，算出IC50值。其结果是，化合物A及化合物B对HeLa S3细胞的IC50值分别为1.6μM和1.2μM，显现出细胞毒作用。
对人体癌细胞的细胞毒作用的测定法(2)
在96孔板中注入调制成6×104个/mL的人大肠癌WiDr细胞、调制成4×104个/mL的人非小细胞肺癌A549细胞或调制成6×104个/mL的人前列腺癌DU-145细胞，在CO2培养箱中于37℃进行培养。24小时后，添加100μL各种浓度的化合物A、化合物B或化合物C，再在CO2培养箱中于37℃培养72小时。培养后，利用Sulforhodamine(スルフォロ-ダミン)B测定细胞数，算出对细胞增殖的各化合物的IC50值。其结果是，化合物A、B及C对WiDr细胞、A549细胞或DU-145细胞等各种不同的细胞都显现出良好的细胞增殖抑制活性。由于细胞种类不同所以抑制活性不同，例如，对A549细胞显现出IC50值为5.OnM以下的活性。
TGF-β样作用的测定法
为了检测TGF-β样活性，构建了利用报道基因的表达的筛选系统。在过量表达TGF-β受体，会引起由TGF-β引起的纤维蛋白溶酶原活性化因子-1(PAI-1)表达的水貂肺上皮细胞(MvlLu)(Journal of Biologicai Chemistry第262卷：17467-17414页，1987年)的PAI-1启动子基因的下游转染荧光素酶基因(Analytical Biochemistry第216卷：276-284页，1994年)。
采用上述细胞，添加化合物时获得的荧光强度即为TGF-β样活性的指标。其结果是，TGF-β因PAI-1启动子基因表达的诱导作用而使其荧光强度有所增加。同样，化合物A的浓度为26nM～100μM、化合物B的浓度为12nM～100μM时，荧光强度也有所增加。

Claims (3)

1.缩肽化合物或其制药学上允许的盐，其特征在于，由以下通式表示，式中，R表示异丙基、仲丁基或异丁基。
2.医药组合物，其特征在于，以权利要求1所述的缩肽化合物或其制药学上允许的盐为有效成分。
3.如权利要求2所述的医药组合物，其特征还在于，所述医药组合物是一种抗肿瘤药。
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